VILNIAUS GEDIMINO TECHNIKOS UNIVERSITETAS

Aušra MAŽEIKIENĖ

VANDENS MIKROBIOLOGIJA

Laboratorinių darbų metodikos nurodymai

Vilnius 2009

2

UDK 579(076) Ma734

A. Mažeikienė. Vandens mikrobiologija: laboratorinių darbų metodikos nurodymai. Vilnius: Technika, 2009. 76 p.

Leidinys skirtas Aplinkos inžinerijos fakulteto studentams, studijuojantiems pa-

gal studijų programą vandentvarka. Nurodymuose pateikiamos vandens mikrobiolo-gijos srities laboratorinių darbų atlikimo metodikos. Laboratorinių darbų tematika yra parinkta siekiant praplėsti pasirinkusių vandentvarkos sritį studentų žinias. Leidinyje pateikiami pagrindiniai vandens mikroorganizmų tyrimo metodai, preparatų paruo-šimo, auginimo laboratorinėmis sąlygomis būdai. Vadovaudamiesi šiais nurodymais, studentai įgis gebėjimų naudoti mikrobiologinę laboratorinę įrangą ir galės atlikti pagrindinius vandens mikroorganizmų tyrimus.

Leidinys skirtas VGTU Aplinkos inžinerijos fakulteto studentams, studijuojan-tiems pagal vandentvarkos studijų programą.

Leidinį rekomendavo VGTU Aplinkos inžinerijos fakulteto studijų komitetas

Recenzavo: doc. dr. G. Gedminienė, VGTU Chemijos ir bioinžinerijos katedra doc. dr. R. Dauknys, VGTU Vandentvarkos katedra

http://leidykla.vgtu.lt VGTU leidyklos TECHNIKA 1047-S mokomosios metodinės literatūros knyga

ISBN 978-9955-28-352-2

© Mažeikienė, A., 2009 © VGTU leidykla TECHNIKA, 2009

3

Turinys

Įvadas ...................................................................................................... 4

1 laboratorinis darbas. Gyvųjų mikroorganizmų mikroskopinis tyrimas ............................................................................ 5

2 laboratorinis darbas. Gamtinio vandens ir dumblo mikrofloros mikroskopinis tyrimas .......................................................................... 13

3 laboratorinis darbas. Veikliojo dumblo, naudojamo nuotekoms valyti, biocenozės tyrimas .................................................. 18

4 laboratorinis darbas. Veikliojo dumblo tūrio rodiklio nustatymas .... 27

5 laboratorinis darbas. Bakterijų skaičiaus vandenyje nustatymas ...... 30

6 laboratorinis darbas. Katalazinio aktyvumo nustatymas veikliajame dumble .............................................................................. 35

7 laboratorinis darbas. Geležį ir manganą oksiduojančių bakterijų tyrimas ................................................................................... 40

8 laboratorinis darbas. Gelžbakterijų, aptinkamų dumble, pagausinimas ........................................................................................ 45

Literatūra .............................................................................................. 48

Priedai .................................................................................................. 50

4

Įvadas

Vandens mikrobiologijos srities laboratorinių darbų atlikimo me-todikos nurodymai sudaryti pagal vandens chemijos ir mikrobiologi-jos modulio (APVTB 05203) programą ir yra skirti Aplinkos inžineri-jos fakulteto studentams, pasirinkusiems studijas pagal vandentvarkos studijų programą.

Dvi pagrindinės vandentvarkos vystymo kryptys – vandens ruo-šimas (gėrimui, pramonei) ir nuotekų valymas – šiandien glaudžiai siejamos su vandenyje gyvenančių mikroorganizmų veikla. Labiau-siai išsivysčiusios pasaulio šalys kuria ir naudoja biologiniais proce-sais pagrįstas technologijas. Vandens mikrobiologijos paskaitų metu studentai įgyja žinių apie gyvojoje gamtoje vykstančių procesų me-chanizmus, apie biologinio vandens valymo mikrobiologinius proce-sus ir biocheminio organinių medžiagų skaidymo dėsningumus. La-boratorinių darbų tematika ir yra parinkta siekiant praplėsti šios srities studentų teorines žinias. Yra svarbu, kad studentai įgytų gebėjimų naudoti mikrobiologinę laboratorinę įrangą, praktiškai atliktų pagrin-dinius vandens mikroorganizmų tyrimus.

Rengiant leidinį naudotasi vandens mikrobiologijos disciplinos dėstymo studentams VGTU Vandentvarkos katedros praktika ir šios katedros darbuotojų atliekamo mokslinio darbo patirtimi.

Šie metodiniai nurodymai gali būti naudingi ir magistrantūros studijų studentams, kurie pasirinko vandentvarkos sritį ir pagal aplin-kos inžinerijos studijų programą ruošia magistro baigiamojo darbo eksperimentinę dalį.

5

1 laboratorinis darbas

Gyvųjų mikroorganizmų mikroskopinis tyrimas

Darbo trukmė – 4 val. Darbo tikslas – susipažinti su optinio mikroskopo konstrukcija,

jo veikimo principu. Išmokti tinkamai dirbti mikroskopu. Pasinaudo-jant optiniu mikroskopu, susipažinti su įvairių sistematinių grupių eukariotiniais ir prokariotiniais mikroorganizmais, panagrinėti jų formas, palyginti tarpusavyje jų dydžius.

Bendrosios žinios Mikroskopas (kilęs iš graikų žodžių mikros – mažas, skopeo –

žiūriu) yra optinis prietaisas, skirtas tirti akimi nematomiems objek-tams. Tai sudėtingas prietaisas, su kuriuo elgtis reikia atsargiai. Mik-roskopai turi būti laikomi sudėti į medines dėžutes arba apgaubti gaubtuvais, kurie juos apsaugo nuo dulkių ir sutrenkimų. Negalima mikroskopo palikti saulėje arba labai šiltoje vietoje, nes genda balza-mas, kuriuo suklijuoti lęšiai (Bliuzmanas 1970).

Optinio mikroskopo konstrukcija pateikta 1.1 pav. Pagrindinės mikroskopo dalys yra: a) mechaninės: stovas, objektinis stalelis, tu-busas, revolveris, sraigtai (makrometrinis, mikrometrinis); b) optinės: objektyvai, okuliarai, kondensorius, diafragma ir veidrodėlis.

Stovas yra mikroskopo konstrukcinių dalių laikiklis. Jis sudarytas iš pagrindo ir rankenos, kuri naudojama mikroskopui perkelti iš vie-nos vietos į kitą. Objektinis stalelis pritvirtintas žemutinėje stovo da-lyje. Ant stalelio dedamas objektinis stiklelis su preparatu, skaičiavi-mo kamera arba Petri lėkštelė su mikroorganizmų kolonijomis. Objektiniam stikleliui prie stalelio prispausti yra dvi spyruoklės. Ste-bint preparatas turi būti fiksuotas tam tikroje padėtyje, nes jam suju-dėjus, galima pamesti tiriamąją preparato vietą. Stalelio viduryje yra apvali anga. Pro ją veidrodėliu šviesa nukreipiama į objektą. Perėjusi pro jį šviesa patenka į padidinamuosius lęšius ir stebėtojo akį. Padidi-namųjų stiklų (okuliarai) rinkiniai yra įtvirtinti mikroskopo tubuse.

6

Tubusas sraigtais sujungtas su stovo viršutine dalimi (rankena). Yra du sraigtai. Didysis (makrometrinis) sraigtas sparčiai kelia arba nulei-džia tubusą. Jis naudojamas stebėjimo pradžioje, kai nedaug arba vidutiniškai didiname objektą, kol gauname jo apytikrį vaizdą.

Tiksliam objekto vaizdui nustatyti reikalingas mažasis (mikro-metrinis) sraigtas. Jį visiškai apsukus, tubusas pakeliamas arba nu-

1.1 pav. Optinis mikroskopas MOTIC: 1 – tubusas su okuliaru, 2 – tubuso pa-grindas, 3 – stovas (rankena), 4 – makrometrinis sraigtas, 5 – mikrometrinis sraigtas, 6 – apšvietimo šaltinis, 7 – diafragma, 8 – kondensorius, 9 – objektinis stalelis, 10 – objektyvai, 11 – revolveris

7

leidžiamas 0,1 mm. Po tubusu pritvirtintas revolveris. Revolveris (lot. revolvere – sukti) yra besisukantis apie savo ašį diskas su skylėmis, skirtomis objektyvams įsukti. Paprastai mikroskopai turi 3–4 objek-tyvus. Objektyvai yra lęšių sistemos metaliniame vamzdelyje. Tai svarbiausioji mikroskopo dalis. Priekinis (frontinis) objektyvo lęšis yra visų mažiausias ir svarbiausias. Jo paskirtis – didinti vaizdą. To-liau už jo objektyve įtvirtinti lęšiai šalina optinio vaizdo trūkumus; jie vadinami korekciniais. Visi padidinti sferinį paviršių turinčio lęšio vaizdai yra su dviem stambiais defektais: 1) kiekvienas objekto taško vaizdas yra ratuko išvaizdos, 2) objekto vaizde matome spalvas, kurių jis neturi. Pirmasis defektas vadinamas sferine aberacija, antrasis – chromatine oberacija. Sferinė oberacija susijusi su lęšio savybe stip-riau laužti pro jo kraštus praeinančius spindulius negu tuos, kurie praeina pro centrinę jo dalį. Dėl to taško, matomo pro lęšį, vaizdas išsidėsto erdvėje tarp tų dviejų vietų, kur susikerta pakraščių ir centro spinduliai. Chromatinė aberacija susidaro nevienodai lūžtant einan-tiems pro lęšį įvairaus bangos ilgio spinduliams. Stipriausiai stiklas laužia trumpabangius (mėlynuosius, violetinius), o silpniausiai – tu-rinčius ilgesnę bangą spindulius (raudonuosius). Dėl to vietoj vieno stebimo taško pro lęšį matome keletą spalvotų taškų, išsidėsčiusių erdvėje, kurią riboja išilginė ir skersinė chromatinė aberacija. Lęšių trūkumams pašalinti mikroskopų objektyvai gaminami iš keleto lęšių, įvairiai išlenktais paviršiais ir skirtingos stiklo rūšies, bet proporcin-gais spektrais. Šiuo metu gaminami objektyvai be chromatinės abera-cijos (apochromatai, achromatai, fluoritiniai). Objektyvai skirstomi į sausuosius ir imersinius arba įmerkiamuosius. Pirmųjų tarpą tarp frontinio lęšio ir preparato užpildo oras. Šviesos spinduliai, perei-dami iš tankesnės medžiagos (stiklas, ant kurio uždėtas preparatas) į ne tokią tankią (oras), lūžta toldami nuo nuleisto į lūžimo tašką stat-mens. Dėl to dalis spindulių, perėjusių pro preparatą, išsisklaido ir nepatenka į objektyvą. Imersiniai objektyvai įmerkiami į lašą alie-jaus (dažniausiai kedro), kuris laužia šviesą panašiai kaip stiklas. Tuomet visi spinduliai, nelūždami ir nekeisdami krypties, patenka iš

8

objektinio stiklelio į objektyvą ir geriau apšviečia smulkiuosius ob-jektus. Ant objektyvo metalinio aptaiso yra skaičius, nurodantis, kiek kartų objektyvai didina: 4, 8, 10, 20, 40, 90, 100. Okuliaras (lot. okulus – akis) yra lęšių sistema, įtvirtinta metaliniame vamzde-lyje virš tubuso pagrindo. Okuliaro vamzdelyje yra du lęšiai: viršu-tinis, vadinamas akies (okuliarinis), ir apatinis – glaudžiamasis. Kuo mažesnis atstumas tarp šių lęšių, tuo stipresni okuliarai. Okuliarai dažniausiai žymimi pagal tai, kiek kartų jie didina, pavyzdžiui, 5, 7, 10, 12, 15, 20. Sudauginus objektyvo ir okuliaro padidinimus, gau-namas bendras mikroskopo didinimas.

Kondensorius, diafragma ir veidrodėlis yra skirti preparatui apšviesti. Kondensoriaus paskirtis yra suglausti nuo veidrodėlio einančius spindulius ir nukreipti juos į objektyvą. Jį sraigtu galima kilnoti aukštyn ir žemyn. Kondensoriuje įrengta diafragma, skirta reguliuoti iš veidrodėlio einančio šviesos spindulių srauto intensy-vumui. Kuo švelnesnė tiriamojo objekto struktūra, tuo daugiau reikia pridaryti diafragmą (tiriant nedažytus preparatus, diafrag-mos anga susiaurinama, o tiriant dažytus, kurie yra kontrastiškes-ni – atidaroma). Veidrodėlis reikalingas šviesos spindulių pluoštui nukreipti pro kondensorių, preparatą, objektyvą ir okuliarą į stebė-tojo akį. Viena veidrodėlio pusė yra plokščia (geriau naudotis dir-bant dienos šviesoje), kita – įgaubta (geriau naudotis dirbant dirb-tinėje šviesoje). Daugelyje šiuolaikinių mikroskopų veidrodėlius pakeičia speciali apšvietimo įranga (Bliuzmanas 1987).

Medžiagos ir priemonės: mikroskopas, dengiamieji ir objekti-niai stikleliai, pipetės, mikrobiologinė kilpelė, minkšto audinio serve-tėlės, šieno mirkalas, grynos mielių, pelėsinių grybų ir bakterijų kul-tūros, cianobakterijų ir dumblių preparatai. Mikrobiologiniam tyrimui pateikiami mikroorganizmai:

9

A. Eukariotiniai mikroorganizmai

1. Pirmuonys. Pirmuonių lengva rasti šiltoje vietoje pastovėjusio šieno mirkale. Šio mirkalo suspausto lašo preparate gerai matomos įvairios infuzorijos, kurios greitai plaukioja, gaudydamos bakterijas. Norint, kad infuzorijos plaukiotų lėčiau, reikia labiau suploti lašą. Šie-no mirkale dažniausiai randamos infuzorijos: Paramecium caudatum, Colpidium colpoda. Tame pačiame preparate galima aptikti ir žiuželi-nių (pvz., žaliąją eugleną – Euglena viridis), bet jie daug mažesni, todėl ir suspaustame laše jie išlieka labai judrūs (Beržinskienė 1999; Beržinskienė, Četkauskaitė 1995; Bliuzmanas, Ragavičius 1987).

2. Grybai (mikromicetai). Mažuoju mikroskopo objektyvu pelė-sinius grybus galima stebėti tiesiog Petri lėkštelėje. Tiriant pelėsinius grybus, reikia stengtis nesuardyti jų grybienos šakojimosi ir sporų išsidėstymo, nes tai yra svarbūs jų sistematikos požymiai. Vienų grybų grybiena nesusiskirsčiusi į ląsteles, kitų grybienos hifai suda-ryti iš daugybės ląstelių. Svarbus sistematinis požymis – sporų išsi-dėstymas. Paprastojo pelėsio (Mucor mucedo) sporos uždarytos tam tikrose pūslelėse – sporangėse, jas vadiname endosporomis. Asper-gillus, Penicillium genčių grybų sporos yra atviros, vadinamos koni-dijomis. Jos susidaro atskiriems grybienos hifų galiukams šakojantis į šakutes, kurios virsta konidijų grandinėlėmis. Mieliagrybiai savo išvaizda smarkiai skiriasi nuo pelėsinių grybų, nes nesudaro grybie-nos, o yra pavienės ląstelės, kurios dauginasi pumpuravimosi būdu. Skirtingų rūšių mieliagrybių ląstelės skiriasi savo dydžiu ir forma: jos gali būti apvalios, elipsiškos ir ištįsusios. Daugiau padidinus (naudojant 40 kartų didinantį objektyvą) galima įžiūrėti ir vidinę ląstelių sandarą: pamatyti branduolį ir kitus ląstelės organus. Prakti-koje plačiausiai naudojamos Saccharomyces genties mielės (tešlai išpurenti, vyno, alaus gamybai), taip pat gana svarbi yra Candida gentis, nes kai kurios šios genties rūšys yra patogeninės (pvz. Candi-da albicans), kitos naudojamos pašarinių baltymų gamybai (pvz., Candida scottii) (Beržinskienė, Četkauskaitė 1995; Tumas 2003).

10

3. Dumbliai. Tai autotrofiniai organizmai, vykdantys fotosinte-zę ir pasižymintys didele formų bei dydžių įvairove. Be bendrųjų organoidų, būdingų visiems eukariotams, dumblių ląstelės turi chlo-roplastus, kurių skaičius, forma ir dydis labai skiriasi. Vienų dum-blių ląstelėse būna tik vienas didelis chloroplastas, kitose jie mažes-ni ir jų gali būti šimtai. Chloroplastai būna įvairių formų: taurelės, plokštelės, žvaigždutės, juostelės, tinklelio, spiralės, lęšiuko ir kt. Dumblių sistematika remiasi sandaros (sienelės sudėtis, branduolių skaičius ir forma, chloroplastų skaičius, forma, išsidėstymas) ir pigmentų rinkinio skirtumais.

Žaliadumblių (Chlorophyta) skyriui priklausančių dumblių ląs-telės turi iš celiuliozės ir pektinų sudarytą sienelę, branduolį, vakuo-lę ir žalios spalvos chloroplastus. Tai – mikroskopiniai ir makrosko-piniai, vienaląsčiai, kolonijiniai ir daugialąsčiai, judrūs ir nejudrūs, prisitvirtinę ir neprisitvirtinę prie substrato dumbliai. Skyrius skirs-tomas į tris klases: maurakulainių (Volvocophyceae, atstovai: valk-čiadumblis – Chlamydomonas, maurakulis – Volvox), žalėsainių (Chlorococcophyceae, atstovai: reketės – Pediastrum, pūslius – Oo-cystis, scenedesmas – Scenedesmus) ir jungadumblainių (Conjuga-tophyceae, atstovai: mauragimbės – Spirogyra, zignemos – Zygne-ma, linkstės – Closterium).

Titnagdumbliams (Bacillariophyta) būdinga šviesiai ruda ar gelsva spalva ir specifinis ląstelių apvalkalėlis – skaidrus, taisyklin-gos geometrinės formos silicio oksido šarvelis. Šarvelis iš dviejų pu-selių, kurios susideda kaip dėžutė su dangteliu. Šarvelio forma labai įvairi: disko, būgno, cilindro, plokščios dėžutės, lazdelės ir kt. Vieni šio skyriaus dumbliai vienaląsčiai, kiti sudaro kolonijas. Skyrius skirstomas į dvi klases: centradumblių (Centrophyceae, atstovai: ap-skrituolės – Cyclotella, melioziros – Melosira) ir plunksnadumblių (Pennatophyceae, atstovai: dvikiautės – Diatoma, sinedros – Synedra, žvaigždutės – Asterionella, valtelės – Navicula) (Beržinskienė, Čet-kauskaitė 1995; Bliuzmanas, Ragavičius 1987; Gedminienė 2006).

11

B. Prokariotiniai mikroorganizmai

Stambiausi prokariotiniai mikroorganizmai yra melsvabakterės (Cianobacteria). Jų ląstelės neturi membraninių organoidų, būdingų eukariotams: branduolio, chloroplastų, mitochondrijų, endoplazminio tinklo ir kt.

Melsvabakterės gali būti vienaląstės ir kolonijinės (siūlų ir kamuolė-lių pavidalo). Melsvabakterių skyriuje yra dvi klasės: chrookokainių (Croococcophyceae (Microcystis)) ir hormogonainių (Hormogoniophy-ceae, atstovai: vybrūnės – Oscillatoria, vingrūnės – Spirulina, gleivėčiai – Nostoc, žvynakrėčiai – Aphanizomenon, vandenkrėčiai – Anabaena).

Bakterijos – daug mažesnės, jas galima pamatyti tik padidinus 400 ar daugiau kartų. Bakterijų atstovas: žarninė lazdelė (Escherichia coli) (Bergey’s ... 1994; Bliuzmanas, Ragavičius 1987).

Darbo eiga Išimtas iš spintos mikroskopas pastatomas ant stalo, tada nuima-

mas gaubtas. Mikroskopas apžiūrimas, susipažįstama su jo sandara ir veikimo principu. Minkšto audinio servetėle nuo mikroskopo korpuso ir išorinių detalių nuvalomos dulkės. Rankena turi būti atkreipta į stebėtoją. Tubusas pasukamas taip, kad į stebimą objektą būtų nu-kreiptas mažiausias objektyvas (4 kartus padidinus), jo frontinė linzė pakeliama apie 1,5 cm nuo objektinio stalelio. Pažvelgus pro okulia-rą, šviesos pluoštas taip nukreipiamas į objektyvą, kad matymo laukas atrodytų ryškiai ir vienodai apšviestas.

Pipete paimamas šieno mirkalo lašelis, jis užlašinamas ant objek-tinio stiklelio ir uždengiamas dengiamuoju stikleliu, gaunamas ,,suspausto lašo“ preparatas. Ruošiant preparatą turi nesusidaryti oro burbulų, todėl dengiamąjį stiklelį reikia dėti ne iš viršaus, bet statyti prie lašo krašto ir pamažu nuleisti. Paruoštas šieno mirkalo preparatas stebimas pro mikroskopą iš pradžių pro mažiausiai didinantį objekty-vą. Jei infuzorijos plaukioja labai greitai, reikia labiau suploti lašą. Tuo tikslu prie dengiamojo stiklelio krašto priglaudžiamas filtrinio popieriaus gabalėlis, kuris nutraukia skysčio perteklių. Cianobakterijų ir dumblių preparatai pipete arba vielos kilpele uždedami ant švarių

12

objektyvinių stiklelių ir uždengiami dengiamaisiais stikleliais. Taip gaunami ,,suspausto lašo“ pavyzdžiai, kurie iš pradžių stebimi pro mikroskopą 40 kartų padidinus. Pelėsiniai grybai stebimi Petri lėkšte-lėje pro mikroskopą 40 kartų padidinus. Grynos bakterijų kultūros lašelis vielos kilpele paskleidžiamas ant objektyvinio stiklelio ir už-dengiamas dengiamuoju stikleliu.

Ant mikroskopo stalelio dedami objektiniai stikleliai su preparatais (jie prispaudžiami spyruoklėmis) ir Petri lėkštelės su užaugintomis kultūromis (nuėmus dangtelį). Žiūrint iš šono, makrometriniu sraigtu objektyvas nuleidžiamas kuo arčiau objektinio stalelio. Stebint pro okuliarą, diafragma ir kondensorius taip sureguliuojami, kad preparatas būtų labiausiai apšviestas. Objektyvą keliame į viršų tol, kol pamatysi-me mikroorganizmų ląsteles. Vaizdo ryškumas nustatomas lėtai sukio-jant mikrometrinį sraigtą, o reguliuojamas uždengiant diafragmą arba kilnojant kondensorių. Stumdant sraigtais stalelį, apžiūrimas visas pre-paratas. Detalesnio tyrimo vieta turi būti pačiame matymo lauko centre. Norint padidinti vaizdą, pasukamas revolveris ir pakeičiamas objekty-vas. Keičiant objektyvą stebima, kad šis nepaliestų preparato ir jo nesu-traiškytų. Naudojant vidutinį (10 kartų didinantį) objektyvą, geriau matoma infuzorijų, dumblių ir grybų sandara. Bakterijos įžiūrimos tik padidinus 400 ar daugiau kartų. Surasti ryškūs objektų vaizdai nupie-šiami laboratorinių darbų sąsiuvinyje ir palyginami su prieduose (1–20 priedai) pateiktais mikroorganizmų piešiniais.

Baigus darbą, nuimamas objektyvinis stiklelis, švaria minkšta servetėle nušluostoma objektyvų apatinė dalis, tubusas makrosraigtu nuleidžiamas žemyn, mikroskopas uždengiamas ir paliekamas saugio-je vietoje.

Klausimai

1. Iš ko sudarytos mikroskopo mechaninė ir optinė dalys? 2. Kaip nustatomas bendras mikroskopo didinimas? 3. Kiek kartų reikia padidinti vaizdą, kad galėtume stebėti

bakterijas?

13

2 laboratorinis darbas

Gamtinio vandens ir dumblo mikrofloros mikroskopinis tyrimas

Darbo trukmė – 4 val. Darbo tikslas – pasigaminti ,,suspausto“ ir ,,kabančiojo“ lašo

preparatus iš gamtinio vandens telkinio (ežero ar upės) vandens bei dumblo. Preparatus ištirti morfologiškai optiniu mikroskopu. Pagal aptiktus ir atpažintus hidrobiontus nustatyti vandens telkinio sapro-biškumą.

Bendrosios žinios Vanduo – daugelio mikroorganizmų gyvenamoji aplinka. Vandens

organizmai (hidrobiontai) sudaro sudėtingas biocenozes, kurių kiekybi-nė ir kokybinė sudėtis priklauso nuo daugelio fizinių, cheminių ir biolo-ginių veiksnių. Kuo daugiau vandenyje organinių medžiagų, tuo dau-giau ir mikroorganizmų. Didžiausias mikroorganizmų kiekis vandenyje paprastai būna birželio–rugpjūčio mėnesiais (dėl aukštesnės temperatū-ros). Mikroorganizmų padaugėja lietui lyjant, o sumažėja saulėtą dieną. Vandens telkinio dumble paprastai būna daugiau bakterijų nei vandeny-je. Ypač daug bakterijų būna viršutiniame dumblo sluoksnyje (viename grame dumblo paprastai būna 100 tūkst.–1 mln. bakterijų, oksiduojančių sierą ir jos junginius iki sulfatų (iš jų apie 10–100 tūkst. Tiobacillus genties bakterijų); apie 1000 nitrifikuojančių bakterijų; apie 10 000 de-nitrifikuojančių bakterijų; po 100 tūkst. anaerobinių ir aerobinių bakteri-jų, t. y. ląstelienos skaidytojų; kartais aptinkama metanogeninių bakteri-jų ir anaerobinių azotą fiksuojančių mikroorganizmų). Vandenyje vyrauja nesporinės bakterijos (apie 97 %), o dumble – sporas sudaran-čios bacilos (100 %). Kuo gilesnis dumblo sluoksnis, tuo daugiau jame bakterijų. Lietuvos paviršiniuose gėluosiuose vandenyse fitoplanktoną paprastai sudaro titnaginiai ir žalieji dumbliai bei melsvabakterės. Pa-grindiniai zooplanktono atstovai: verpetės, žemesnieji vėžiagyviai ir pirmuonys. Vandens telkinio dugne jo nuogulų sluoksnyje gyvena kir-

14

mėlės, vabzdžių lervos, moliuskai (Bergey’s ... 1994; Beržinskienė 1999; Tortora, Funke, Case 2004; Wetzel 1969).

Norint įvertinti vandens telkinio užterštumą, reikia žinoti, kad van-dens užterštumas organinėmis medžiagomis vadinamas saprobiškumu, o organizmai, gyvenantys užterštuose vandenyse, vadinami saprobiontais. Vandens telkinio užterštumui įvertinti dažnai neužtenka nustatyti tik saprobiškumą. Išsamiau vertinant vandens kokybę, reikia nagrinėti ne tik hidrobiologinės, bet ir sanitarinės bei cheminės analizių duomenis.

Pagal užterštumą vandens telkiniai skirstomi į penkias zonas: po-lisaprobinę, -mezosaprobinę, -mezosaprobinę, oligosaprobinę ir ksenosaprobinę (Beržinskienė, Četkauskaitė 1995; Wetzel 1969).

Polisaprobinė – tai stipriai užteršta zona. Tokiame vandenyje daug organinių medžiagų (BDS > 18 mg/l, čia BDS – biocheminis de-guonies suvartojimas, matuojamas mg O2/l), ištirpusio deguonies be-veik nėra ([O2] < 2 mg/l), todėl čia vyrauja anaerobiniai procesai, ku-riems vykstant išsiskiria metanas, sieros vandenilis, anglies dioksidas. Mikroorganizmų skaičius gali siekti keletą milijonų viename mililitre. Masiškai vystosi siūlinės bakterijos Sphaerotillus natans, gleives išski-riančios Zoogloea ramigera, Beggiatoa ir Thiothrix genčių sieros bak-terijos, tarp pirmuonių daug bespalvių žiuželinių, infuzorijų Colpidium colpoda, Vorticella microstoma, Paramecium putrinum, amebų Pelo-myxa palustris, dumble randama žieduotųjų kirmėlių Tubifex tubifex, uodo Chironomus plumosus lervų.

-mezosaprobinėje zonoje dar gana didelė organinių medžiagų koncentracija (BDS = 10–18 mg/l), ištirpusio deguonies yra nepakan-kamai ([O2] = 2–3 mg/l), tačiau jau vyksta aerobinis organinių medžia-gų skaidymas, susidaro amoniakas, CO2, o metano ir H2S jau nėra. Šios zonos gyventojai atsparūs deguonies trūkumui. Vyrauja heterotrofinės bakterijos, atsiranda grybų, dumblių (pvz.: Navicula viridula, Synedra ulna, Closterium acerosum), melsvabakterių (pvz., Oscillatoria formo-sa), daug prisitvirtinusių (pvz., Carchesium polypinum) ir laisvai plau-kiojančių (pvz.: Paramecium caudatum, Aspidisca costata) infuzorijų, žaliųjų ir bespalvių žiuželinių, pasitaiko verpečių.

15

-mezosaprobinėje zonoje organinių medžiagų kiekis daug ma-žesnis (BDS = 4–8 mg/l), beveik nėra lengvai oksiduojamų medžiagų, vandenyje yra daugiau ištirpusio deguonies ([O2] > 3 mg/l), tik tam-siuoju paros metu jo smarkiai sumažėja, taip pat yra amoniako ir jo oksidacijos produktų – nitritų ir nitratų. Vandenyje gausu autotrofinių organizmų – įvairių dumblių (pvz.: Scenedesmus quadricauda, Pe-diastrum boryanum, Melosira granulata), nitrifikuojančiųjų bakterijų; įvairus ir zooplanktonas: infuzorijos (pvz.: Vorticella companula, Euplotes patella), verpetės (pvz., Encentrum mustella), žemesnieji vėžiagyviai. Saprofitinių bakterijų skaičius siekia keletą tūkstančių mililitre. Dumble gausu kirmėlių, vabzdžių lervų, moliuskų, pakran-tėse auga aukštesnieji augalai.

Oligosaprobinė zona – tai mažai užteršta zona. Ištirpusių orga-ninių medžiagų labai mažai (BDS 2 mg/l), vanduo beveik prisotin-tas deguonies. Bakterijų mažai (keletas dešimčių ar šimtų viename mililitre), daug autotrofinių organizmų: dumblių, cianobakterijų; zo-oplanktoną sudaro infuzorijos (pvz., Vorticella picta), verpetės (pvz., Philodina citrina) bei irklakojai ir šakotaūsiai vėžiagyviai.

Ksenosaprobinė zona – tai labai švaraus vandens zona. Čia vy-rauja fotosintezę vykdantys mikroorganizmai: dumbliai, melsvabakte-rės, pasitaiko stambių verpečių.

Siekiant kokybiškai įvertinti saprobiškumą, taikomi keli metodai. Pavyzdžiui, saprobiškumo indekso S apskaičiavimas naudojant biolo-ginės analizės rezultatus:

,/)( hhsS (2.1)

čia: s – organizmų saprobiškumo reikšmė; h – santykinis rūšies apti-kimo dažnis.

Kiekviena saprobiškumo zona žymima tam tikru indeksu: poli-saprobinė zona – p; -mezosaprobinė zona – a; -mezosaprobinė

16

zona – b; oligosaprobinė – o; ksenosaprobinė – x. Šių zonų saprobiš-kumo reikšmės: p – 4, a – 3, b – 2, o – 1, x – 0.

Santykinio rūšies aptikimo dažnio reikšmės nustatomos pagal 2.1 lentelę.

2.1 lentelė. Santykinio rūšies aptikimo dažnio (h) įvertinimas

Dažnumo skalė Rūšies individų skaičius nuo bendro skaičiaus

Santykinio dažnio įvertinimas (h)

Labai retas 1 1

Retas 2–3 2

Neretas 4–10 3

Dažnas 10–20 5

Labai dažnas 20–40 7

Masiškas 40–100 9

Medžiagos ir priemonės: mikroskopas, dengiamieji ir objekti-

niai stikleliai, pipetės, mikrobiologinė kilpelė, minkšto audinio serve-tėlės, gamtinio vandens telkinio (ežero ar upės) vanduo bei dumblas.

Darbo eiga Iš atsivežto gamtinio vandens telkinio (ežero ar upės) vandens ir

dumblo pasigaminami preparatai: 1) Vandens ar dumblo suspensijos lašas pipete arba vielos kilpele

uždedamas ant švaraus objektyvinio stiklelio ir uždengiamas dengia-muoju stikleliu – gaunamas ,,suspausto lašo“ preparatas.

2) Galima tiriamojo skysčio lašelį uždėti ant dengiamojo stikle-lio, paskui dengiamasis stiklelis staigiu judesiu apverčiamas ir užde-damas ant specialaus objektyvinio stiklelio su duobute, kurios kraštai patepami plonu vazelino sluoksniu, kad lašas neišsilietų: taip gauna-mas ,,kabančio lašo“ preparatas (Beržinskienė, Četkauskaitė 1995; Bliuzmanas 1970; Gedminienė 2006).

Preparatai tyrinėjami optiniu mikroskopu, surasti ryškūs objektų vaizdai nupiešiami laboratorinių darbų sąsiuvinyje. Aptikti mikroor-ganizmai palyginami su 13–20 prieduose parodytais mikroorganiz-

17

mais. Biologinės analizės rezultatai surašomi į 2.2 lentelę, apskaičiuo-jamas saprobiškumo indeksas.

Skaičiavimo pavyzdys:

2.2 lentelė. Biologinės analizės rezultatai ir saprobiškumo indekso apskaičiavimas

Rūšių, rastų vandenyje, saprobiškumas s h sh

Euglena viridis (p) 4 1 4

Closterium acerosum (a) 3 1 3

Cymbella ventricosa (b) 2 5 10

Diatoma vulgare (b) 2 7 14

Melosira italica (b) 2 5 10

Navicula viridula (a) 3 2 6

Colpoda cucullus (a) 3 1 3

Surirella ovata (b) 2 5 10

= 27 = 60 S = 60 : 27 = 2,2 Kaip matyti iš skaičiavimo rezultatų, S = 2,2. Šį skaičių suapvalinę

iki 2 (sveiko skaičiaus), gauname atsakymą, kad tiriamasis vanduo priklauso -mezosaprobinei zonai.

Klausimai

1. Nuo ko priklauso gamtiniame vandens telkinyje esančių mik-roorganizmų skaičius ir rūšių įvairovė?

2. Kokie yra pagrindiniai gyvųjų mikroorganizmų preparatų pa-ruošimo būdai?

3. Kaip pagal užterštumą skirstomi gamtinio vandens telkiniai? 4. Kaip apskaičiuojamas vandens saprobiškumo indeksas?

18

3 laboratorinis darbas

Veikliojo dumblo, naudojamo nuotekoms valyti, biocenozės tyrimas

Darbo trukmė – 4 val. Darbo tikslas – pasinaudojant optiniu mikroskopu, ištirti pasiga-

mintą veikliojo dumblo preparatą. Identifikuoti, suskaičiuoti pastebėtus mikroorganizmus ir įvertinti veikliojo dumblo fiziologinį būvį.

Bendrosios žinios Nuotekų valymo įrenginių darbo efektyvumui užtikrinti didelę

reikšmę turi jų eksploatacijos kontrolė (Dauknys 2006; Standart ... 1987; Water 1991). Kartu su nuotekų užterštumo rodiklių (BDS, ChDS (cheminis deguonies suvartojimas, t. y. deguonies kiekis, reikalingas visiškai suoksiduoti vandens mėginyje esančias organines medžiagas iki mineralinių komponentų), suspenduotų medžiagų ir t. t.) nustatymu atliekama ir hidrobiologinė analizė, kurios rezultatai leidžia daryti iš-vadas apie veikliojo dumblo biocenozės būvį ir sugebėjimą ardyti ter-šalus, esančius nuotekose (Горленко, Дубинина, Кузнецов 1997; Кульский, Строкая 1986).

Biologiniai indikatoriai yra saviti kiekvienai vandens rūšiai, nuo-tekų tipui, atskiriems įrenginiams, atskiroms technologijoms. Taigi negalima jų bendrai apibūdinti. Be to, ir tų pačių mikroorganizmų morfologinės ir fiziologinės savybės priklauso nuo vandens rūšies. Nustatant, charakterizuojant valymo stadijas, rekomenduojama skai-čiuoti mikroorganizmus pagal sistematines grupes (bakterijos, ame-bos, infuzorijos, verpetės, helmintai).

Biologiniams indikatoriams priskiriami šie mikroorganizmai:

1. Bakterijos A) Zoogloea ramigera – ,,bakterinis medelis“. Kolonijos iki 35 mm,

,,medelį“ sudaro įvairios rutulinės ir lazdelinės bakterijos, sujungtos glei-

19

vėta kapsule. Tai normalus subrendusio dumblo komponentas, tačiau masinis jų vystymasis liudija apie sutrikimus valymo procese.

B) Siūlinės bakterijos Sphaerotilus natans lėtai tekančiame van-denyje, nepakankamo maišymo zonose turi ilgų siūlų pluoštų pavida-lą, o esant stipriam maišymui susmulkėja, sutrūkinėja. Dažnai vystosi nuotekose, kuriose gausu angliavandenių. Masinis jų paplitimas suke-lia dumblo purumą, jį sunku atskirti nuo valytų nuotekų.

C) Siūlinės sierbakterijos Beggiatoa, Thiotrix dalyvauja valant nuotekas, kuriose yra H2S arba pūvančių baltymų, valyme. Siūliniai dumbliai, melsvabakterės ir mikroskopiniai grybai masiškai vystosi, esant toksiškoms nuotekoms.

2. Amebos A) Tikrosios amebos. Sąlygiškai jas galima suskirstyti į dvi gru-

pes: stambios amebos, kurios puikiai matomos pro mikroskopą padidi-nus 40–50 kartų, ir smulkios amebos, matomos tik padidinus 100 ir daugiau kartų. Stambios amebos – įprastiniai veikliojo dumblo gyven-tojai. Smulkių amebų buvimas rodo technologinio režimo sutrikimus.

B) Kiautinės amebos skiriamos į dvi ekologines grupes: plankto-nines ir bentosines. Palikus dumblą nusistovėti, planktoninės amebos nusėda lėčiau už pagrindinę dumblo masę. Planktoninės amebos prade-da smarkiai vystytis sutrikus flokuliacijai, kai pablogėja dumblo sėdi-mo savybės. Dauguma amebų priskiriama bentosinėms. Bentosinių amebų populiacija didėja, kai didėja veikliojo dumblo apkrova organi-nėmis medžiagomis. Daugiausia bentosinių kiautinių amebų aptinkama valymo įrenginiuose, priimančiuose nuotekas iš kiaulių fermų.

3. Infuzorijos Kaip veikliojo dumblo indikatorius infuzorijas galima suskirstyti

į dvi pagrindines grupes: laisvai plaukiojančias ir prisitvirtinusias. Jei valymo įrenginiai dirba gerai, dumblo cirkuliacija tinkama, tai laisvai plaukiojančių infuzorijų skaičius apytikriai lygus prisitvirtinusių skai-čiui. Sutrikus dumblo cirkuliacijos procesui, itin padaugėja laisvai plaukiojančių infuzorijų. Laisvai plaukiojančių infuzorijų Parame-cium caudatum padaugėja esant deguonies trūkumui. Iš prisitvirtinu-

20

sių infuzorijų gerai dirbančio dumblo indikatoriais laikomos Opercu-laria, Vorticella, Carchesium, Epistylis. Esant deguonies trūkumui, vorticelos atitrūksta nuo kotelių ir sudaro laisvai plaukiojančią formą. Staigiai pasikeitus vandens sudėčiai, trūkstant maisto ar deguonies, infuzorijos (kaip ir kiti pirmuonys) sudaro cistas.

4. Verpetės Philodina, Monostyla, Cathypna kokybiškame veikliajame dum-

ble, kuriame gausu deguonies, yra aktyvios, o esant deguonies trūku-mui arba apnuodytam dumblui – nejudrios. Verpečių buvimas veik-liajame dumble rodo, kad vyksta intensyvi nitrifikacija.

5. Helmintai A) Apvaliosios kirmėlės dažniau sutinkamos biofiltruose, bet pa-

sitaiko ir aerotankuose (trūkstant deguonies). B) Žieduotosios kirmėlės Aelosoma, Nais būna vykstant pasto-

viai nitrifikacijai. Suminė indikatorinių organizmų charakteristika pagal nuotekų ko-

kybę pateikta O. Nikitinos (Никитина, Жмур, Горбань 1982) darbuose. Indikatoriniai mikroorganizmai identifikuojami ir skaičiuojami

naudojantis mikroskopu. Veikliojo dumblo fiziologiniam būviui įver-tinti nustatomi šie parametrai:

1. Vyraujančios organizmų grupės ir rūšys. Patikimais indikato-riais gali būti tik tie organizmai, kurių dumble yra dideli kiekiai. Mik-roorganizmams identifikuoti naudojamos lentelės ir piešiniai, pateikti specialiuose žinynuose (Bergey’s ... 1994; Dauknys 2006; Sakalaus-kas, Šulga, Diliūnas 2000; Viesturs, Tzonkov, Vanags 2006).

2. Organizmų dydžiai (normalūs, stambūs, smulkūs). 3. Įmitimo laipsnis (geras, vidutinis, silpnas). Svarbiausi įmitimo

kriterijai: virškinančių vakuolių skaičius ir citoplazmos skaidrumas. 4. Pulsuojančių vakuolių būvis. Nepalankiomis sąlygomis pulsa-

vimo ritmas sulėtėja ir osmoreguliacija sutrinka. 5. Kūno forma. Šio požymio kaita ypač būdinga prisitvirtinusioms

aplinkblakstienėms infuzorijoms. Esant geram įmitimo laipsniui, kūno

21

forma beveik apvali, silpnai įmitusių – kūnai ištįsę, išplatėjusi priešburni-nė sritis. Trūkstant deguonies, organizmai išsipučia (net iki susprogimo).

6. Organizmų judrumas (labai judrūs, silpnai judrūs, nejudrūs). 7. Prisitvirtinusių infuzorijų blakstienėlių oralinės zonos būvis

(atvira, uždara). Normaliai būna atvira, esant toksikantams ar padidin-tam organikos kiekiui – užsidaro.

8. Dauginimosi būdas (ypač infuzorijų). Normaliomis sąlygomis infuzorijos dauginasi nelytiniu būdu, pablogėjus sąlygoms, padaugėja besidauginančių lytiniu būdu.

9. Cistų buvimas. Cistos susidaro nepalankiomis sąlygomis (mi-tybos pablogėjimas, temperatūros nukritimas ir pan.).

10. Žuvusių organizmų kiekis. Organizmų žuvimą dažniausiai sukelia staigūs terpės (valomo vandens) pakitimai, kada hidrobiontai nespėja incistuotis. Dažniausiai tai būna susiję su avariniais gamybi-nių nuotekų išleidimais.

Veikliojo dumblo biologinių indikatorių nuotraukos pateiktos 3.1 ir 3.2 pav.

Pastaba. Veikliojo dumblo organizmai jautriai reaguoja į aplinkos sąlygų pasikeitimus. Todėl tam, kad būtų teisingai įvertintas jų būvis, reikia: analizę atlikti greitai, mėginius prieš tyrimą laikyti aerobinėmis sąlygomis, pastovioje temperatūroje, toli nuo cheminių reagentų.

Darbo eiga Mikroskopinio preparato paruošimas: A) Kokybinei veikliojo dumblo analizei paruošiamas ,,suspausto

lašo“ arba ,,kabančio lašo“ preparatas. Ruošiant preparatą, veiklusis dumblas gerai išmaišomas, gaunama suspensija.

B) Kiekybinei veikliojo dumblo organizmų apskaitai naudojama skaičiavimo kamera, kurios tūris 0,5 ml (plokštelėje iš organinio stik-lo išrėžiama 20 mm gylio ir 4 mm skersmens vagelė). Naudojamas ir paprastas objektyvinis stiklelis, ant kurio uždedamas tikslaus tūrio gerai išmaišytos veikliojo dumblo suspensijos lašas. Lašas uždengia-mas dengiamuoju stikleliu, kurio plotas 99 mm2 arba 2424 mm2.

22

3.1 pav. Veikliojo dumblo mikroorganizmai: 1, 2 – Aphanizomenon genties melsvabakterės (1 – padidinta 100 kartų, 2 – padidinta 400 kartų), 3 – bakterijų sankaupa (padidinta 400 kartų), 4 – veikliojo dumblo dribsniai (padidinta 400 kartų), 5–7 – apvaliosios kirmėlės (5 – Rhabditis genties, padidinta 400 kartų; 6 – Rhabditis genties, padidinta 100 kartų; 7 – Monhystera genties, padidinta 100 kartų), 8 – mikroorganizmų cistos (padidinta 100 kartų)

Preparato mikroskopavimas: 1. Jei darbo tikslas tėra apibūdinti aktyvaus dumblo dribsnius (jų

dydį, formą, tankumą), pamatyti gyvus organizmus, jų judėjimą, ,,suspausto“ ar ,,kabančio“ lašo preparatas stebimas per mikroskopą 50–100 kartų padidinus. Surastas ryškus objekto vaizdas nupiešiamas laboratorinių darbų sąsiuvinyje. Veikliojo dumblo preparatas aprašo-mas: charakterizuojami dribsniai, įvertinamas veikliojo dumblo fizio-loginis būvis, atsižvelgiant į anksčiau minėtus parametrus. Mikroor-ganizmų kiekio apytikriam įvertinimui taikoma 5 balų sistema: 1 – pavieniai mikroorganizmai, 2 – mažai, 3 – vidutiniškai, 4 – daug, 5 – masiškai.

23

3.2 pav. Veikliojo dumblo biologiniai indikatoriai: 1, 2 – Zoothaminium genties infuzorijos, 3 – Carchesium genties infuzorija, 4 – Epistylis genties infuzorija, 5, 6 – Vorticella genties infuzorija, 7, 8 – laisvai plaukiojančios infuzorijos (7 – Glaucoma genties, 8 – Tetrahymena genties), 9 – Opercularia genies infuzorijos, 10, 11 – Arcella genties kiautinės amebos, 12 – Amaeba genties ameba, 13 – Navicula genties titnagdumbliai, 14 – Eosphora genties verpetė, 15 – Cepha-lodella genties verpetė

24

Mikroskopuojama 10 matymo laukų. Iš jų išvedamas vidutinis, kuris įvertinamas minėta 5 balų sistema.

2. Kiekybinei veikliojo dumblo organizmų apskaitai paruošiama mikroorganizmų apskaitos lentelė. Viršutinėje lapo dalyje nurodoma dumblo paėmimo vieta ir laikas: pirmame stulpelyje užrašomi pava-dinimai visų organizmų, kurie buvo rasti tirtame nuotekų valymo įrenginių veikliajame dumble.

Kiekybinei analizei paruoštas preparatas įtvirtinamas laikiklyje. Pradedant nuo kairiojo viršutinio kampo preparatas peržiūrimas vie-noje linijoje iš kairės į dešinę ir suskaičiuojami visi organizmai. Tada paslenkama vienu matymo lauku žemyn ir iš dešinės į kairę vėl skai-čiuojama. Būtina atidžiai sekti, kad nebūtų praleistas nė vienas ma-tymo laukas. Nutraukti skaičiavimą, kol nėra peržiūrėtas visas prepa-ratas, negalima, nes vanduo jame greitai džiūsta ir tai gali lemti skaičiavimo klaidas. Jeigu į matymo lauką pakliūna neaiškūs objek-tai, jie nupiešiami ir pažymimi graikiško alfabeto raidėmis tam, kad paskui, kai jie bus identifikuoti, jų pavadinimus galima būtų įrašyti į lentelę.

Siūlinių formų mikroorganizmai skaičiuojami taip: siūlinės for-mos vienetu laikoma siūlų atkarpa, kurios ilgis yra lygus 100 kartų padidinto mikroskopo didinimo lauko skersmeniui; mažesnio ilgio siūlinės bakterijos įvertinamos vieneto dalimis.

Kiekybinė veikliojo dumblo organizmų apskaita paprastai vyk-doma keliais etapais, didinant tiriamo dumblo lašo tūrį:

I-as etapas: imamas 0,01 ml tūrio lašas ir 99 mm2 dengiamasis stiklelis;

II-as etapas: imamas 0,1 ml tūrio lašas ir 2424 mm2 dengiama-sis stiklelis;

III-as etapas: veikliojo dumblo lašas (0,5 ml) dedamas į skaičia-vimo kamerą ir peržiūrint preparatą skaičiuojami visi anksčiau nerasti organizmai: galima pasinaudoti preparavimo adata dumblo dribs-niams išskirstyti: šiame etape paprastai pastebimi tokie organizmai kaip erkės, kirmėlės, verpetės, vėžiukai;

25

IV-as etapas: iš stiklinės dugno paimamas didesnis nusėdusio dumblo tūris (1–2 ml), dumblas dedamas ant objektyvinio stiklelio ir uždengiamas kitu objektyviniu stikleliu: gaunamas didelis preparatas, kurį peržiūrint įvertinamas organizmų būvis, dribsnių dydis, forma ir tankumas, pašalinių priemaišų buvimas, pastebimi reti pavieniai or-ganizmai.

Gautus rezultatus galima perskaičiuoti į koncentraciją, t. y. orga-nizmų skaičių 1 g (ar 1 mg) sausos veikliojo dumblo medžiagos. Šis dydis leidžia spręsti apie organizmų kiekio pakitimą nepriklausomai nuo valymo įrenginių hidraulinio režimo. Operatyviai kontrolei už-tenka ir pirmų dviejų etapų.

Skaičiuojant indikatorinius organizmus, nustatoma: M – bioindikatorių vidutinis skaičius (aritmetinis duomenų vidurkis):

n

xM , (3.1)

čia x – eksperimentiškai nustatytas bioindikatorių kiekis; n – atskirų stebėjimo duomenų skaičius; – vidutinis kvadratinis nukrypimas.

2σ

1a

n

, (3.2)

čia a – atskirų tyrimo duomenų nukrypimas nuo vidurkio.

Skaičiavimo pavyzdys: 3.1 lentelėje surašyti dumblo lašo (0,1 ml) preparate pastebėti ir

suskaičiuoti biologiniai indikatoriai. Apskaičiuojame, pavyzdžiui, verpečių vidutinį skaičių ir vidutinį

kvadratinį nukrypimą: M = (10 + 5 + 7 + 8) : 4 = 7,5; = ((10 – 7,5)2 + (5 – 7,5)2 + (7 – 7,5)2 + (8 – 7,5)2) :

(4 – 1) = 2,08.

26

3.1 lentelė. Biologinių indikatorių apskaitos duomenys

Atskirų stebėjimų duomenys Biologiniai indikatoriai

I II III IV

Bakterijos (Zoogloea ramigera) 30 45 27 48

Bakterijos (Sphaerotilus natans) 23 19 32 29

Amebos 3 2 0 4

Infuzorijos 15 18 13 20

Verpetės 10 5 7 8

Klausimai

1. Kokie vandens mikroorganizmai priskiriami biologiniams in-dikatoriams?

2. Kokių infuzorijų padaugėja sutrikus veikliojo dumblo cirku-liacijos procesui?

3. Pagal kokius požymius vertinamas veikliojo dumblo fiziolo-ginis būvis?

4. Kaip atliekama veikliojo dumblo mikroorganizmų kiekybinė analizė?

27

4 laboratorinis darbas

Veikliojo dumblo tūrio rodiklio nustatymas

Darbo trukmė – 4 val. Darbo tikslas – įvertinti veikliojo dumblo sėdimo savybes, ap-

skaičiuoti jo tūrio rodiklį.

Bendrosios žinios Veikliojo dumblo reaktoriuose veiklusis dumblas sudaro pilkos,

šviesiai ar tamsiai rudos spalvos dribsnių pavidalo masę. Dribsnių sudė-tyje daugybė bakterinių ląstelių, panirusių į gleives. Dribsnių susidary-mą, t. y. bioflokuliaciją, lemia tai, kad bakterinių ląstelių paviršiuje su-sikaupia egzopolimerai, turintys jonaktyvias ir nejonogenines funkcines grupes ir galintys funkcionuoti kaip polielektrolitai. Šių polimerų sąvei-kos gale tarp atskirų bakterinių ląstelių atsiranda tilteliai ir susidaro su-dėtinga dribsnių struktūra. Nustatyta, kad nuotekų valymo procese dau-giausia egzopolimerų susidaro per endogeninio kvėpavimo stadiją. Pagrindinę egzopolimerų masę sudaro polisacharidai ir baltymai. Bakte-rijų egzopolisacharidai egzistuoja kapsulės ar laisvų gleivių pavidalu. Atskiroms bakterijų rūšims būdingi ir specifiniai egzopolimerai. Pvz., Zoogloea ramigera ląstelės gamina daug poli--hidroksisviesto rūgšties, kuri svarbi dribsnių susidarymui.

Dribsnius sudaro daugybės genčių bakterijos. Tai Zoogloea, Bacil-lus, Pseudomonas ir kt. Mišriose kultūrose bioflokuliacija intensyvesnė. Heterotrofinės bakterijos, pačios nesudarančios dribsnių, taip pat aptin-kamos dribsnių sudėtyje.

Veikliojo dumblo įrenginių technologijose svarbu ne tik greitas veikliojo dumblo dribsnių susidarymas, bet ir greitas jų atsiskyrimas nuo valyto vandens, greita sedimentacija. Dribsnių sedimentacija pri-klauso jų tankumo, lyginamojo svorio, gyvų organizmų skaičiaus ir nuo jų masės bei formos. Dribsnių tankumui reikšminga mikroorganizmų rūšinė sudėtis, o ji savo ruožtu priklauso nuo nuotekų kokybės rodiklių, nuo nuotekų tiekimo greičio, nuo aeracijos.

28

Kiekybiniam dumblo sedimentacijos įvertinimui plačiai naudo-jamas dumblo tūrio rodiklis, kuris apskaičiuojamas pagal formulę:

m

VTR , (4.1)

čia: V – tūris (ml), kurį užima per 30 min. nusėdęs veiklusis dumblas; m – nusėdusio per 30 min. veikliojo dumblo masė (iki pastovaus svorio išdžiovinta 105 oC temperatūroje).

Kitaip tariant, dumblo tūrio rodiklis – tai tūris, kurį užima 1 g (sauso svorio) dumblo, nusėdusio per 30 min. Tūrio rodiklis išreiškiamas ml/g.

Darbo priemonės: pastovios temperatūros (105 oC) kaitinimo krosnis, eksikatorius, analitinės svarstyklės, filtravimo sistema: Bun-zeno kolba, Biuchnerio piltuvas, vandens siurbliukas, popieriniai fil-trai, 1 l (ar 100 ml) ir 25 ml talpos cilindrai, veidrodiniai stikliukai ar biuksai, pincetas, stiklinė lazdelė.

Darbo eiga Į 1 l talpos cilindrą pripilama 1 l gerai išmaišytos aktyvaus dumblo

suspensijos ir paliekama nusėsti (galima naudoti 100 ml cilindrą). Po 30 min. nustatomas nusėdusio dumblo tūris. Šį tūrį padalinus iš 1 l (ar 100 ml) dumblo suspensijos sauso svorio, gaunamas dumblo indeksas.

Dumblo suspensijos sausas svoris nustatomas taip: išdžiovintas iki pastovaus svorio filtras (džiovinama 105 oC temperatūros krosnyje, at-vėsinama eksikatoriuje ir pasveriama) įdedamas į Biuchnerio piltuvą, piltuvas įstatomas į Bunzeno kolbą ir prijungiama prie vandens siur-bliuko. Gerai išmaišyto žinomo tūrio (20–25 ml ar daugiau) dumblas nufiltruojamas per šį filtrą. Surinktas ant filtro dumblas kartu su filtru pernešamas ant veidrodinio stikliuko arba į biuksiuką ir išdžiovinamas 105 oC temperatūroje iki pastovaus svorio.

Bandymų įvertinimas Dumblo sedimentacija laikoma gera, kada dumblo tūrio rodiklio

reikšmė neviršija 100 ml/g (Beržinskienė 1999; Никитина, Жмур, Горбань 1982). Jeigu valymo įrenginių eksploatacijos procese pavyksta palaikyti optimalų dumblo tūrio rodiklį ir optimalią veikliojo dumblo koncentraciją (1,5–2,0 g/l), indikatorinius veikliojo dumblo organizmus

29

pakanka skaičiuoti tik kartą per savaitę. Jei veikliajame dumble pradeda masiškai vystytis siūlinės bakterijos ir kai kurie mikroskopiniai grybai, dribsniai padidėja, darosi šakoti, purūs. Ilgos siūlinės formos jungia daugelį dribsnių, juos perpindamos. Toks veiklusis dumblas blogai nu-sėda, sunkiai atsiskiria nuo išvalyto vandens. Šis reiškinys vadinamas dumblo išbrinkimu. Išbrinkęs veiklusis dumblas išnešamas iš antrinių nusodintuvų, todėl pablogėja valytų nuotekų kokybė. Išbrinkimo atveju sunku palaikyti reikalingą veikliojo dumblo koncentraciją įrenginiuose, o tai turi įtakos valymo kokybei. Išbrinkimą gali sukelti: 1) anglia-vandenių perteklius vandenyje; 2) biogeninių elementų trūkumas; 3) nepakankama aeracija; 4) staigus nuotekų užterštumo padidėjimas. Esant dideliam siūlinių organizmų kiekio padidėjimui tikslinga suma-žinti apkrovimą, pailginti aeraciją, pašarminti vandenį iki pH 9,0–9,4 (Viesturs, Tzonkov, Vanags 2006; Никитина, Жмур, Горбань 1982).

Skaičiavimo pavyzdys

100 ml gerai išmaišytos veikliojo dumblo suspensijos buvo supilta į 100 ml talpos matavimo cilindrą. Po 30 minučių nusėdęs dumblas už-ėmė 80 ml. 20 ml šio dumblo buvo nufiltruota per pastovaus svorio popierinį filtrą (išdžiovintas 105 oC temperatūros krosnyje, atvėsintas eksikatoriuje ir pasvertas). Filtro masė – 0,298 g. Surinkto ant filtro dumblo kartu su filtru masė (išdžiovinto 105 oC temperatūroje iki pasto-vaus svorio) – 0,467 g. Apskaičiuojamas dumblo tūrio rodiklis:

TR = 80 : (0,467 – 0,298) × 5 = 94,67 ml/g. Apskaičiuotas veikliojo dumblo tūrio rodiklis yra mažesnis nei

100 ml/g, taigi jo sedimentacija laikoma gera.

Klausimai

1. Kas lemia veikliojo dumblo dribsnių bioflokuliaciją? 2. Kokių genčių bakterijų dažniausiai pasitaiko veikliojo dum-

blo dribsniuose? 3. Koks rodiklis naudojamas kiekybiniam dumblo sedimentaci-

jos įvertinimui? 4. Kada dumblo sedimentacija laikoma gera?

30

5 laboratorinis darbas

Bakterijų skaičiaus vandenyje nustatymas

Darbo trukmė – 6 val. Darbo tikslas – išmokti suskaičiuoti bakterijas nešvariame van-

denyje.

Bendrosios žinios Mikroorganizmų ląstelių skaičiui nustatyti dažniausiai taikomi du

metodai: 1) ląstelių skaičiavimas stebint per mikroskopą ir 2) tiriamųjų mėginių išsėjimas į agarizuotas mitybines terpes, kuriose užauga mikroorganizmų kolonijos. Pastaruoju metodu nustatomas gyvybingų, t. y. sugebančių daugintis, ląstelių skaičius. Reikia atsi-minti, kad nėra tokių terpių ir tokių sąlygų, kuriose ir kuriomis vieno-dai gerai augtų visi mikroorganizmai. Todėl šiuo metodu galima nu-statyti mikroorganizmų, augančių tam tikroje terpėje bei tam tikroje temperatūroje, skaičių. Pavyzdžiui, nustatyta, kad daugelis vandens mikroorganizmų neauga klasikinėse gausiose organinių medžiagų terpėse (mėsos peptono agaras ir pan.), o gerai vystosi terpėse, kurio-se yra minimalus organinių medžiagų kiekis, t. y. terpėse, kurių sudė-tis panaši į gamtinių vandenų. Augimas šiose terpėse daug lėtesnis, gerai matomos kolonijos susiformuoja tik per 7–10 dienų (Beržins-kienė 1999; Juhna, Birzniece, Larsson et.al 2007; Кузнецов, Дубинина, Кузнецов 1997).

Metodo esmė: tam tikras tiriamo vandens tūris išsėjamas į Petri lėkšteles su agarizuota mitybine terpe, po tam tikro inkubacijos peri-odo skaičiuojamos kolonijos. Manoma, kad kiekviena kolonija – tai vienos ląstelės palikuonys.

Apibūdinti vandens kokybę pagal mikrobiologinius rodiklius ga-lima dviem būdais – pagal bakterijų kiekį ir pagal bakterinių procesų intensyvumą. Pirmuoju atveju svarbu žinoti bendrą bakterijų kiekį arba atskirų fiziologinių grupių bakterijų kiekį. Pagal bakteriologinius

31

rodiklius upių ir ežerų vanduo skirstomas į keletą kokybės klasių (5.1 lentelė) (Beržinskienė, Četkauskaitė 1995).

5.1 lentelė. Upių ir ežerų vandens kokybės klasės (pagal bakteriologinius rodiklius)

Užterštumo kriterijai

Koli indek-sas

Entero- kokai

Heterotrofinė mezofilinė mikroflora

Heterotrofinė psichrofilinė mikroflora

Vandens kokybės

klasė

Kolonijų skaičius mililitre vandens

I – švarus 1000 10 300 2300

II – silpnai užterštas

100 000 100 2000 10 000

II–III – vidutiniškai užterštas

1000 000 500 7000 30 000

III – smar-kiai užterš-tas

10 000 000 2000 20 000 200 000

IV – labai smarkiai užterštas

10 000 000 2000 20 000 200 000

Darbo priemonės: sterilizavimo krosnelė, autoklavas, termosta-

tas, mėgintuvėliai su vatiniais kamščiais, Petri lėkštelės, pipetės ir lenktos lazdelės, kolbos mitybinei terpei ruošti, sausa mitybinė terpė, vandentiekio vanduo.

Darbo eiga Darbas susideda iš penkių etapų: 1) indų sterilinimo; 2) mitybinės

terpės paruošimo; 3) vandens mėginių praskiedimo; 4) išsėjimo ir 5) rezultatų skaičiavimo.

1. Indų sterilinimas Išplauti ir išdžiovinti indai suvyniojami į popierių, mėgintuvėliai

užkemšami vatos kamščiais: paruošti indai sudedami į sterilizavimo

32

krosnelę. Sterilizavimo trukmė priklauso nuo temperatūros: 150 oC temperatūroje laikoma 2 val., 160 oC – 1 val. (esant 170 oC tempera-tūrai, popierius ir vata gelsta, o aukštesnėje kaip 170 oC – anglėja). Sterilizacijos pradžia laikomas tas momentas, kai termometro stulpe-lis pakyla iki nustatytos temperatūros. Pasibaigus sterilizavimo laikui, krosnelė išjungiama, o indai išimami tik ataušę.

2. Mitybinės terpės paruošimas Pasveriamas reikiamas kiekis mitybinės terpės, supilamas į kolbą,

užpilama distiliuotu vandeniu, tirpinama vandens vonioje tol, kol ištirps. Dalis terpės išpilstoma į mėgintuvėlius (po 20 ml), kita dalis paliekama kolboje. Mėgintuvėliai ir kolba užkemšami vatiniais kamščiais, aprišami popieriumi ir statomi į autoklavą. Autoklavuojama 1 atm. slėgyje 30 min. Išautoklavuota terpė iš kolbos išpilstoma į sterilias Petri lėkšteles (po 20 ml). Lėkštelės paliekamos tol, kol terpė sustings, paskui apver-čiamos dugnu į viršų ir statomos į termostatą (nustatoma 20–21 oC tem-peratūra), kad išgaruotų kondensacinis vanduo.

3. Skiedimo vandens paruošimas Bakterijų skaičius nešvariame vandenyje gana didelis, todėl

tam, kad terpėje būtų gautos izoliuotos kolonijos, prieš išsėjant mė-ginius reikia praskiesti. Skiesti naudojamas sterilus vandentiekio vanduo arba 0,85 % NaCl tirpalas. Paruošiami mėgintuvėliai su 9 ml sterilaus vandens kiekviename. Mėgintuvėliai numeruojami. Sterilia pipete imama 1 ml tiriamo vandens ir pernešama į mėgintu-vėlį Nr. 1 su 9 ml sterilaus vandens (praskiedimas bus 1:10). Sumai-šius mėgintuvėlio turinį, nauja sterilia pipete imamas 1 ml iš mėgin-tuvėlio Nr. 1 ir pernešama į mėgintuvėlį Nr. 2 (praskiedimas 1:100) ir t. t. Atvirų telkinių vandenį reikia skiesti ne mažiau kaip 1:1000.

4. Išsėjimas Mėginius galima išsėti paviršiniu arba giluminiu būdu. Sėjant

paviršiniu būdu sterilia pipete imamas reikiamai praskiestas vanduo ir į Petri lėkštelę ant mitybinės terpės paviršiaus užpilama 0,1–0,2 ml. Steriliu glaistytuvu mėginys paskirstomas po terpės paviršių (išsėja-ma iš paskutinių dviejų praskiedimų, kiekvienas išsėjimas kartojamas 3 kartus). Lėkštelės paliekamos pastovėti 5–10 min. (kad vanduo su-

33

sigertų į terpę), paskui apverčiamos dugnais į viršų ir dedamos į ter-mostatą (nustatoma 20–21 oC temperatūra).

Sėjant giluminiu būdu tiksliai nustatytas mėginio tūris (paprastai 1 ml) sterilia pipete pernešamas į mėgintuvėlį su sterilia išlydyta mi-tybine terpe (temperatūra neturi viršyti 45 oC). Užkimšus mėgintuvėlį, jo turinys gerai sumaišomas sukant tarp delnų ir išpilamas į Petri lėkš-telę. Lėkštelę uždengus, terpė paskirstoma po lėkštelę. Terpei sustin-gus, lėkštelės dedamos į termostatą.

5. Rezultatų skaičiavimas Bakterijų kolonijos paprastai skaičiuojamos po 24 val. ar 48 val.

inkubacijos termostate. Gauti duomenys surašomi į lentelę (5.2 lentelė) ir apskaičiuojamas bakterijų kiekis 1 ml tiriamojo van-dens. Šis kiekis palyginamas su 5.1 lentelėje pateiktais duomenimis ir nustatoma tiriamojo vandens kokybės klasė.

Skaičiavimo pavyzdys:

5.2 lentelė. Duomenys bakterijų skaičiui nustatyti

Kolonijų skaičius lėkštelėje Tiriamo

mėginio Nr.

Praskie-dimas

(kartai)

Į lėkštelę išsėto

mėginio tūris (ml) I II III Vid.

Bakterijų skaičius

1 ml

1 10 0,1 Masiškai

2 100 0,1 140 124 156 140 1,4×105

3 1000 0,1 16 14 12 14 1,4×105

Pastaba. Jei kolonijų skaičius viršija 500, jos paprastai neskai-

čiuojamos. Bakterijų skaičius viename mililitre vandens nustatomas apskai-

čiavus vidutinį kolonijų lėkštelėse skaičių ir įvertinus praskiedimą. Pavyzdžiui, jei trečiojo mėginio trijose lėkštelėse išaugusių kolonijų vidutinis skaičius yra 14, vanduo atskiestas 1000 kartų ir į lėkštelę išsėto mėginio tūris yra 0,1 ml, tai bakterijų skaičius viename mililitre tiriamojo vandens bus lygus:

34

14 × 1000 × 10 = 1,4×105, taigi tiriamasis vanduo yra vidutiniš-kai užterštas (II–III klasė).

Klausimai

1. Kokie metodai dažniausiai taikomi nustatant vandenyje esan-čių mikroorganizmų ląstelių skaičių?

2. Kaip sterilizuojami indai? 3. Kas yra autoklavas? 4. Kodėl tiriamąjį vandenį reikia skiesti, kai norima nustatyti

jame esančių mikroorganizmų skaičių mėginius išsėjant į mi-tybines terpes?

5. Kiek laiko reikia auginti terpėse gamtinio vandens mikroor-ganizmus?

35

6 laboratorinis darbas

Katalazinio aktyvumo nustatymas veikliajame dumble

Darbo trukmė – 6 val. Darbo tikslas – apskaičiuoti katalazinį aktyvumą veikliajame

dumble iš veikliojo dumblo reaktoriaus aeracijos kameros.

Bendrosios žinios Veikliojo dumblo sugebėjimas surišti ir oksiduoti nuotekų orga-

nines medžiagas vadinamas biocheminiu aktyvumu. Dumblo bioche-minis aktyvumas įvertinamas pagal ištirpusio deguonies sunaudojimo greitį ir pagal fermentų kiekį veikliajame dumble (Standart ... 1989; Water ... 1991). Iš 6 pagrindinių fermentų klasių būtent oksidoreduk-tazės ir hidrolazės įneša didžiausią indėlį į teršalų biodegradaciją. Oksidoreduktazės skirstomos į 2 grupes: dehidrogenazes ir oksidazes. Iš oksidazių labiausiai paplitusios peroksidazės, polifenoloksidazės ir katalazės. Dėl katalazės aerobinės ląstelės sugeba gintis nuo kenks-mingo vandenilio peroksido (H2O2) poveikio (H2O2 sąveikauja su nesočiomis riebalų rūgštimis, todėl pažeidžiamos ląstelių membranos. Be to, H2O2 gali oksiduoti SH grupes ir taip slopinti fermentų akty-vumą). H2O2 ląstelėse susidaro gliukozooksidazių, aminorūgščių ok-sidazių ir citochromoksidazių katalizuojamų reakcijų metu. Dėl kata-lazės poveikio H2O2 suskaidomas:

2 2 2 22H O 2H O O , (6.1)

šios reakcijos greičio konstanta K = 107 mol–1. Vandens užterštumui organinėmis medžiagomis įvertinti daž-

niausia naudojamas BDS5 (biologinis deguonies suvartojimas), kurio nustatymas užtrunka 5 paras. Tyrimais įrodyta, kad tarp veikliojo dumblo katalazinio aktyvumo ir nuotekų BDS5 yra tiesioginė priklau-somybė (Кулъский, Строкая 1986). Todėl, nustačius katalazinį ak-tyvumą tiriamajame vandenyje, galima apytikriai įvertinti BDS5 (ne-laukiant 5 parų), t. y. greičiau gauti informaciją: pasinaudojant šia

36

informacija galima operatyviai valdyti nuotekų valymo įrenginių dar-bą. Pagal katalazės aktyvumą galima įvertinti nuotekų kokybę bei savaiminio vandens apsivalymo upėse greitį (maksimalus katalazės aktyvumas randamas zonose, kurių aukštas BDS ir didelis bakterijų kiekis, todėl sumažėjęs katalazės aktyvumas gali būti laikomas upių apsivalymo rodikliu).

Antra vertus, pagal katalazės aktyvumą galima įvertinti bioce-nozės (veikliojo dumblo ar bioplėvelės) fiziologinę būklę. Daugelis toksiškų medžiagų slopina katalazės veiklą, pavyzdžiui, pastebėta tiesioginė priklausomybė tarp sieros vandenilio (H2S) koncentraci-jos ir katalazinio aktyvumo sumažėjimo. Todėl katalazės aktyvumo veikliajame dumble sumažėjimas gali būti valomų nuotekų toksiš-kumo rodikliu.

Katalazės aktyvumas gali būti matuojamas keliais būdais: 1) mikrokolorimetriniu – matuojant katalazinėje reakcijoje išsiskyrusią šilumą; 2) manometriniu – matuojant deguonies, išsiskyrusio skaidant H2O2, kiekį; 3) elektrocheminiu – matuojant nesuskaidyto H2O2 kiekį platinos elektrodu; 4) titrometriniu – titruojant nesuskaidytą H2O2 kalio permanganatu (KMnO4) rūgštinėje terpėje; 5) spektrofotometriniu – matuojant H2O2 tirpalo šviesos absorbciją (skaidant H2O2 absorbcija mažėja) 230–250 m bangos ilgio intervale.

Veikliojo dumblo katalaziniam aktyvumui nustatyti patogiau-sias – titrometrinis metodas. Jo esmė: į tiriamą mėginį pridedama tikslus kiekis H2O2, po tam tikro laiko nesuskaidyto H2O2 kiekis nu-statomas titruojant KMnO4:

4 2 2 2 4

2 4 4 2 2

2KMnO 5H O 3H SO

K SO 2MnSO 5O 8H O.

(6.2)

Darbo priemonės: 15–20 ml talpos stikliniai mėgintuvėliai, 5 ml stiklinės graduotos pipetės, 100 ml Erlenmejerio kolbutės, stiklinės biuretės, skirtos titruoti; H2O2 1 % tirpalas, H2SO4 10 % tirpalas, 20 mM KMnO4 tirpalas, 20 mM natrio fosfatinis buferis (pH – 6,75).

37

Darbo eiga Mėginių paruošimas. Priklausomai nuo darbo uždavinių katala-

zinis aktyvumas gali būti nustatomas tiesiog veikliojo dumblo su-spensijoje arba jo homogenate. Naudojant homogenatą gaunami tiks-lesni rezultatai, tačiau jo paruošimas užima daugiau laiko. Veikliojo dumblo homogenatas ruošiamas taip: imama 200 ml veikliojo dumblo suspensijos ir filtruojama per stambiaporį popierinį filtrą (balta juos-ta); dumblo nuosėdos pernešamos į grūstuvėlį, pridedama kvarcinio smėlio ir trinama 5 min. (šaltai). Paskui pripilama 30–40 ml 20 mM natrio fosfatinio buferio (pH – 6,75), išlaikoma šaldytuve 2 val., vė-liau nufiltruojama ir filtrate matuojamas katalazės aktyvumas bei bal-tymo kiekis.

Katalazės aktyvumui nustatyti į mėgintuvėlį įpilama 5 ml gerai išmaišytos veikliojo dumblo suspensijos ar homogenato filtrato, pride-dama 1,7 ml 1 % H2O2 tirpalo ir išlaikoma 30 min. kambario tempera-tūroje. Paskui pridedama 5 ml 10 % H2SO4 tirpalo ir kiekybiškai per-nešus mišinį į Erlenmejerio kolbutę titruojama su 20 mM KMnO4 tirpalu tol, kol tirpalas įgauna šiek tiek rožinę spalvą (kuri neišnyksta per 30 sek.): pasižymimas titruoti sunaudoto KMnO4 tirpalo tūris. Taip paruošiame ir titruojame 2–3 tos pačios dumblo suspensijos mėginius, kad įsitikintume gaunamo rezultato pasikartojimu. Analogiškai titruo-jamas kontrolinis mėginys su inaktyvuotu fermentu. Fermento inakty-vacijos metu į mėgintuvėlį su 5 ml veikliojo dumblo suspensijos iš karto įpilama 5 ml 10 % H2SO4 tirpalo (paskui dedama H2O2).

Katalazės aktyvumas išreiškiamas M/(ml × min.) arba M/(mg × min.) ir apskaičiuojamas pagal formulę (Beržinskienė, Četkauskaitė 1995):

1 2 50V VA

C t

, (6.3)

čia: V1 ir V2 – 20 mM KMnO4 tirpalo tūriai, sunaudoti kontroliniam ir bandomajam mėginiui nutitruoti (ml); 50 – koeficientas, parodan-tis H2O2 kiekį (mol), atitinkantį 20 mM KMnO4 tirpalo 1 ml; C –

38

dumblo mėginio tūris (ml) arba baltymo kiekis mėginyje (mg); t – inkubacijos laikas (min.)).

Darbo aptarimas Daugelis tyrinėtojų pažymi tą faktą, kad katalazinis aktyvumas

vandenyje ar veikliajame dumble koreliuoja su BDS. Tačiau konkre-čios katalazės aktyvumo ir jo koreliacijos su BDS reikšmės labai pri-klauso nuo valomo vandens teršalų sudėties. Pavyzdžiui, popieriaus ir celiuliozės kombinatų aerotankuose katalazinis dumblo aktyvumas svyruoja nuo 20 iki 100 M/(ml × min.), esant didelei koncentracijai (BDS5 – 250 mg O2/l), ir nuo 10 iki 50 M/(ml × min.), esant mažai koncentracijai (BDS5 – iki 60–90 mg O2/l). Koreliacija tarp katalazi-nio aktyvumo ir BDS pastebėta ir paviršiniuose vandenyse. Pvz., In-dijos upės Tungbhadra mažai užterštose vietose (BDS – 15,6 mg O2/l) išmatuotas katalazinis aktyvumas siekė 22 M/(ml × min.), o toje srityje, kur į upę patenka popieriaus fabriko nuotekos (BDS – 87,6 mg O2/l), jis siekė 82,5 M(ml × min.) (Beržinskienė, Četkaus-kaitė 1995).

Skaičiavimo pavyzdys

Pagal darbo aprašymą pasiruošiama po tris darbinius veikliojo dumblo suspensijos bei homogenato mėginius, jie išlaikomi 30 min. kambario temperatūroje. Pasiruošiamas vienas kontrolinis mėginys.

Kontroliniam mėginiui titruoti sunaudota 29,5 ml 20 mM KMnO4 tirpalo.

Trims darbiniams (dumblo suspensijos) mėginiams titruoti su-naudota: V1 = 1,6 ml, V2 = 1,4 ml, V3 = 1,5 ml 20 mM KMnO4 tirpalo.

Trims darbiniams (dumblo homogenato) mėginiams titruoti su-naudota: V1 = 0,3 ml, V2 = 0,4 ml, V3 = 0,2 ml 20 mM KMnO4 tirpalo.

Apskaičiuojami vidutiniai darbiniams mėginiams titruoti sunau-doto KMnO4 tūriai:

Vvid. 1 (mėginiams su suspensija) = (1,6 + 1,4 + 1,5) : 3 = 1,5 ml; Vvid. 2 (mėginiams su homogenatu) = (0,3 + 0,4 + 0,2) : 3 = 0,3 ml.

39

Apskaičiuojamas katalazės aktyvumas: A1 – bandymams naudo-jant veikliojo dumblo suspensiją bei A2 – veikliojo dumblo homoge-natą:

A1 = (29,5 – 1,5) × 50/(5 × 30) = 9,3 M/(ml × min.); A2 = (29,5 – 0,3) × 50/(5 × 30) = 9,7 M/(ml × min.). Išvada: naudojant veikliojo dumblo homogenatą, gautas didesnis

katalazės aktyvumas.

Klausimai

1. Kas yra biocheminis aktyvumas? 2. Į kokius produktus katalazė skaido vandenilio peroksidą? 3. Kodėl valant nuotekas svarbu žinoti veikliojo dumblo kata-

lazės aktyvumą? 4. Kodėl nustatant dumblo katalazinį aktyvumą sieros rūgštis į

kontrolinį mėginį pilama pirmiausiai, o į kitus mėginius ji pilama tik po 30 minučių?

40

7 laboratorinis darbas

Geležį ir manganą oksiduojančių bakterijų tyrimas

Darbo trukmė – 4 val. Darbo tikslas – susipažinti su bakterijomis, dalyvaujančiomis

geležies ir mangano junginių apykaitoje. Pasigaminti dažytus geležį ir manganą oksiduojančių bakterijų preparatus ir juos ištirti optiniu mik-roskopu.

Bendrosios žinios Požeminiame vandenyje dažnai pasitaikantys geležies ir manga-

no junginiai sukelia vandentiekio gedimus, blogina geriamojo van-dens skonį, spalvą bei kvapą. Ištirpusi geležis dažnai būna komplek-sinių junginių (bikarbonatų, rečiau sulfatų arba organinių rūgščių) sudėtyje. Ištirpęs manganas dažniausiai būna oksidų arba karbonatų formos. Šių tirpių arba koloidinių junginių skaidymas ir virtimas ne-tirpiais junginiais glaudžiai susijęs su mikrobiologiniais procesais. Iš šiuo metu žinomų apie 60 rūšių geležies bakterijų vienos gyvena au-totrofiškai, t. y. jų gyvybinei veiklai nereikalingi organiniai anglies junginiai, kitos pasirinktinai kaip anglies šaltinį naudoja anglies dvi-deginį arba organinę anglį (miksotrofinės gelžbakterės), o trečios yra heterotrofiniai organizmai, kurie be organinių junginių iš viso negy-vena. Anglies junginių biologiniam pakeitimui reikalinga energija gaunama chemosintetiškai iš autotrofinio gyvenimo būdo, būtent Fe2+ į Fe3+ oksidacijos metu, o Mn2+ į Mn4+ oksidacijos metu. Vykstant šiems procesams aplinkoje turi būti bent nedideli (apie 0,2 mg/l) de-guonies kiekiai.

Gelžbakterėmis Rusijos mikrobiologas S. Vinogradskis 1952 m. pirmą kartą pavadino chemolitoautotrofiškai egzistuojančius orga-nizmus, oksiduojančius geležį, kad įsisavintų anglies dvideginį. Da-bar gelžbakterėms priskiriama daug autotrofinių ir heterotrofinių or-ganizmų, susijusių su geležies ar mangano oksidavimo procesais. Kartu su ,,klasikinėmis“ geležies bakterijų rūšimis (Gallionella, Lep-

41

tothrix, Sphaerotilus, Siderocapsa, Metallogenium, Ochrobium ir kt.) geležies bei mangano oksidus kaupia daugiau kaip 20 rūšių bakterijų, dumbliai ir mikromicetai. Metalų junginių kaupimą lemia oksiduotos dvivalentės geležies ar mangano sąveika su bakterijos kapsulėje ar apvalkalėlyje susikaupusiais medžiagų apykaitos produktais. Šių me-talų oksidų sankaupos kartais dešimtis kartų viršija ląstelių svorį. Ge-ležį ir manganą oksiduojančios bakterijos nesudaro specializuotos fiziologinės grupės. Pats Mn ir Fe oksidavimo procesas apima nespe-cifines (nors ir fiziologiškais reikšmingas) reakcijas, kuriose sąvei-kauja nepastovaus valentingumo metalų jonai su toksiniais metabo-lizmo produktais. Kadangi metabolizmo produktas H2O2 susidaro daugelyje biologinių reakcijų, tai paaiškina didelį gelžbakterių išpli-timą skirtinguose biotopuose. Pagal turimus duomenis, šių organizmų kiekis vandens telkiniuose gali siekti 70–90 % viso bakterijų plankto-no. Akivaizdu, kad jų geocheminė veikla yra milžiniško masto gele-žies bei mangano apykaitoje ir susidarant rūdims (Sakalauskas, Šulga, Diliūnas et al. 2000).

Pastaruoju metu daugelyje šalių (JAV, Kanada, Vokietija, Dani-ja, Suomija, Japonija ir kt.) pradėta naudoti nauja biologinio geležies ir mangano šalinimo iš požeminio vandens technologija. Ši technolo-gija užtikrina labai geras natūralias gamtines geriamojo vandens sa-vybes ir sutaupo lėšas jam paruošti, todėl ji yra perspektyvesnė už visas kitas taikomas technologijas. Minėta technologija pagrįsta mik-roorganizmų (gelžbakterių) gyvybine veikla, kuri reikšminga geležies bei mangano formų ir koncentracijos vandenyje kitimui. Požeminia-me vandenyje ištirpę dvivalentės geležies ir dvivalenčio mangano junginiai gelžbakterių veiklos metu oksiduojami iki trivalentės gele-žies bei keturvalenčio mangano junginių, kurie išsiskiria nuosėdų pavidalu ir sulaikomi filtrų smėlio užpilduose. Gelžbakterės auga prisitvirtinusios prie smėlio užpildų grūdelių, sudarydamos bioplėve-lę. Šalinant iš vandens geležį bei manganą biologiniu būdu, svarbu sudaryti gelžbakterių veiklai tinkamas sąlygas, todėl išlieka technolo-

42

ginių parametrų tobulinimo būtinybė (Sakalauskas, Šulga, Diliūnas et al. 2000; Šaltenienė 2005).

Vilniaus mieste Antaviliuose 2001 metais pastatyta 60 tūkst. m3/d našumo vandens ruošykla, skirta geležiai ir manganui šalinti iš požeminio vandens. Dabar Antavilių vandentiekio mazgas tiekia Vil-niui apie 60 tūkst. m3/d geriamojo vandens. Mazgo aptarnaujama miesto zona: dalis Antakalnio, Valakupiai, Baltupiai, Šeškinė, Fabi-joniškės, Santariškės, Pašilaičiai, Justiniškės, Viršuliškės. Šioje van-dens ruošykloje įrengti smėlio filtrai, kuriuose sulaikomos trivalentės geležies ir keturvalenčio mangano nuosėdos. Nuosėdų susidarymą veikia fiziniai ir biologiniai veiksniai.

Darbo priemonės: smėlio grūdelių su apnašomis mėginiai, mik-roskopas „MOTIC“ B 1223 A, imersinis aliejus, membraniniai „MILIPOR“ filtrai (akučių dydis 0,2 m), filtravimo įranga, geltonoji kraujo druska (K4Fe(CN)6), 1 % druskos rūgšties (HCl) tirpalas, 5 % eritrozino tirpalas, distiliuotas vanduo, benzolas, benzidino tirpalas, mėgintuvėliai, Petri lėkštelės, pipetės, pincetas, minkšto audinio ser-vetėlės.

Darbo eiga Į sterilius mėgintuvėlius pincetu įdedama apie 10 smėlio grūdelių

su apnašomis, įpilama 10 ml distiliuoto vandens. Mėgintuvėliai užda-romi kamšteliais ir plakami 30 sekundžių. Į filtravimo aparatą įdeda-mas membraninis filtras, skystis iš mėgintuvėlių atsargiai nufiltruoja-mas. Membraniniai filtrai paimami pincetu ir padedami į Petri lėkštelę su 5 % geltonosios kraujo druskos tirpalu. Šiame tirpale filtrai išlai-komi 2–3 minutes. Toliau nepraplauti filtrai 1–2 minutėms pamerkia-mi į 1 % druskos rūgšties (HCl) tirpalą. Praplauti distiliuotu vandeniu filtrai dažomi 5 % eritrozino tirpalu, jo perteklius nuplaunamas disti-liuotu vandeniu. Apdžiūvę filtrai suvilgomi imersiniu aliejumi, dedami ant objektyvinio stiklelio ir tiriami mikroskopu (vaizdą didinant 1000 kartų). Ant filtro paviršiaus sukauptos gelžbakterės nusidažo raudona spalva, o jų apvalkalai bei kapsulės, kuriuose yra Fe3+ oksidų,

43

7.1 pav. Kirtimų vandentiekio mazgo eksperimentiniame filtre aptiktos gelžbakte-rės: 1 – Gallionella ferruginea, 2 – Leptothrix oxracea, 3–4 – Leptothrix disopho-ra, 5 – Leptothrix oxracea, 6 – Sideobacter latum, 7 – Leptothtix disophora, 8 – Leptothrix lopholea, 9 – Clonothrix fusca, 10 – Leptothrix lopholea, 11 – Sidero-capsa botryoides, 12 – Leptothrix exinata. Mikroskopo didinimas – 1000 kartų

44

nusidažo mėlyna spalva. Mn2+ oksiduojantys ir adsorbuojantys mikro-organizmai tiriami benzidino testu.

Tiriamasis vanduo, kuriame gali būti manganą oksiduojančių bakterijų, filtruojamas pro membraninius filtrus (porų dydis 0,2 m). Filtrai su sulaikytomis gelžbakterėmis pirmiausia dažomi eritrozinu, paskui išdžiovinami ir suvilgomi benzolu. Galiausiai ant drėgno filtrų paviršiaus užpilamas benzidino tirpalas, kurio perteklius po 2–3 sekundžių pašalinamas sugeriančiuoju popieriumi. Gelžbakterių ląstelių kapsulės, kuriose sukaupti Mn4+ oksidai, nusidažo melsva arba violetine spalva.

Filtrams, ant kurių paviršiaus sukaupti manganą oksiduojantys mikroorganizmai, dažyti skirtas benzidino tirpalas ruošiamas taip: 1 g benzidino ištirpinamas 10-tyje ml 50 % acto rūgšties ir tirpalas pra-skiedžiamas iki 100 ml distiliuotu vandeniu.

Per tyrimą mikroskopu rasti ryškūs gelžbakterių vaizdai palygi-nami su pateiktomis nuotraukomis (7.1 pav.).

Klausimai

1. Koks ryšys tarp geriamojo vandens kokybės ir geležį bei manganą oksiduojančių bakterijų?

2. Kokias žinote gelžbakterių rūšis? 3. Kodėl geležies bei mangano biologinio šalinimo iš požemi-

nio vandens technologija yra perspektyvi? 4. Kaip dažomi membraniniai filtrai su gelžbakterėmis?

45

8 laboratorinis darbas

Gelžbakterių, aptinkamų dumble, pagausinimas

Darbo trukmė – 6 val. Darbo tikslas – laboratorinėmis sąlygomis užsiauginti gelžbak-

terių kultūrą.

Bendrosios žinios Chemolitotrofams priskiriamos geležies bakterijos vykdo reakciją:

2+ + 3+2 244Fe 4H O Fe 2H O , (8.1)

pavyzdžiui, geležies karbonatą šios bakterijos oksiduoja iki triva-lentės geležies hidroksido:

3 2 2 234FeCO 6H O O 4Fe OH 4CO 58 cal. (8.2)

Tiriamosios gelžbakterės yra autotrofiniai organizmai. Oksiduo-jant dvivalentės geležies junginius ir verčiant juos trivalentės geležies junginiais, išlaisvinama cheminė energija, kurią šios bakterijos pa-naudoja anglies dioksido asimiliacijai.

Medžiagos ir priemonės: žiupsnelis šieno ir sauja nukritusių medžių lapų, trupinėlis dumblo iš gamtinio vandens telkinio, keli gramai geležies drožlių, aukštas stiklinis cilindrinis indas, Erlenmeje-rio kolbos, geležies (III) hidroksidas, amonio sulfatas, kalio chloridas, magnio sulfatas, kalio hidrofosfatas, kalcio nitratas, geležies karbona-tas, mikroskopas, objektiniai ir dengiamieji stikleliai.

Darbo eiga A. Gelžbakterių užsiauginimas Vinogradskio metodu (Bliuzma-

nas 1970)

Žiupsnelis šieno gerai išvirinamas. Geležies hidroksidas nuso-dinamas ir nufiltruojamas. Į aukštą stiklinį cilindrinį indą įmetamas gerai išvirintas šienas ir šviežiai nusodintas geležies hidroksidas.

46

Organinės medžiagos įdedamos tik tam, kad susidarytų anglies dioksidas ir kai kurie produktai, geležies hidroksidą oksiduojantys iki geležies karbonato. Gelžbakterių būna gamtinio vandens telki-nio dumble, todėl į cilindrinį indą įdedamas tokio dumblo trupinė-lis. Paskui į indą pripilama vandentiekio vandens ir jis pastatomas kambario temperatūroje. Vandens paviršiuje padedamas kamštis su įsmeigtais dengiamaisiais stikleliais. Dengiamieji stikleliai turi būti vandenyje. Maždaug po savaitės ant dengiamųjų stiklelių išauga gelžbakterės, iš jų paruošiami preparatai mikroskopiniam tyrimui. Dažniausiai pasitaiko Cladothrix, Crenothrix ir Clamydothrix gen-čių atstovai. Preparatai tiriami mikroskopu, naudojant imersinį alie-jų; bendras didinimas – 1000 kartų.

B. Spirophyllum ir Gallionella genties bakterijų užsiauginimas (Bliuzmanas 1970)

Pasiruošiama geležies drožlių. Pasigaminamas nukritusių medžių lapų ekstraktas arba tokios sudėties sintetinis mitybinis tirpalas:

(NH4)2SO4 1,5 g, KCl 0,05 g, MgSO4 0,05 g, K2HPO4 0,05 g, Ca(NO3)2 0,01 g, distiliuoto vandens 1000 ml. Į platų indą pripilama vandentiekio vandens, pridedama stambių

geležies drožlių ir truputį nukritusių lapų ekstrakto (iki tirpalas įgaus šviesiai gelsvą spalvą). Bakterijomis terpė užkrečiama, įdedant į ją truputį dumblo. Geležies bakterijos Spirophyllum ferrugineum pradės augti po 4–5 dienų.

Vietoje nukritusių lapų ekstrakto galima naudoti pasigamintą sin-tetinį mitybinį tirpalą. Į Erlenmejerio kolbą įpilama šio tirpalo ir jis užkrečiamas dumblo trupinėliu. Įdedama geležies karbonato (tiek, kad litrui terpės tektų 10 mg geležies). Geležies karbonatas naudoja-mas kaip energetinė žaliava.

47

Iš pagausintos bakterijų populiacijos gaminamas preparatas ir analizuojamas mikroskopu. Rasti ryškūs gelžbakterių vaizdai nupie-šiami sąsiuvinyje ir palyginami su septintame darbe (7.1 pav.) pateik-tomis fotonuotraukomis.

Klausimai

1. Kokie produktai susidaro gelžbakterėms oksiduojant gele-žies karbonatą?

2. Koks turi būti mikroskopo didinimas stebint gelžbakteres? 3. Kokios sudėties sintetinis mitybinis tirpalas naudojamas pa-

gausinant Spirophyllum ir Gallionella genties bakterijas?

48

Literatūra

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 1994 Ninth Edition, Baltimore: Williams and Wilkins: 448–453.

Beržinskienė, J. 1999. Vandens mikrobiologija: mokomoji knyga. Vilnius: Technika. 144 p.

Beržinskienė, J.; Četkauskaitė, A. 1995. Vandens mikrobiologijos la-boratoriniai darbai. Vilnius: Technika. 30 p.

Bliuzmanas, P. 1970. Mikrobiologinė technika. Vilnius: Mintis. 207 p.

Bliuzmanas, P.; Ragavičius, A. 1987. Mikrobiologija ir virusologijos pagrindai. Vilnius: Mokslas. 262 p.

Dauknys, R. 2006. Nuotekų valymas: laboratorinių darbų metodikos nurodymai. Vilnius: Technika. 74 p.

Gedminienė, G. 2006. Mikrobiologijos pagrindų laboratoriniai dar-bai. Vilnius: Technika. 88 p.

Jankavičiūtė, G. 1996. Lietuvos vandenų vyraujantys dumbliai. Vil-nius: Mokslo ir enciklopedijų leidykla. 265 p.

Juhna, T.; Birzniece, D.; Larsson, S.; et al. 2007. Detection of Esche-richia coli in Biofilms from Pipe Samples and Coupons in Drinking Water Distribution Networks, Appl Environ Microbiol 73(22): 7456–7464.

Pečiulis, J. 1990. Vandens mikrobiologijos ir chemijos pagrindai. Vilnius: Mokslas. 148 p.

Sakalauskas, A.; Šulga, V.; Diliūnas, J. ir kt. 2000. Geležies ir man-gano šalinimas iš vandens. R17–00. Vilnius: Rekona. 39 p.

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 17 th ed. Baltimore: Port City Press, 1989. 1724 p.

Šaltenienė, A. 2005. Gelžbakterių veiklos intensyvinimas eksperi-mentiniuose smėlio koštuvuose ruošiant geriamąjį vandenį, Ekologija 1: 51–60.

49

Tortora, G. J.; Funke, B. R.; Case, C. L. 2004. Microbiology: An intro-duction. 8th ed. San Francisco: Pearson Benjamin Cummings. 35 p.

Tumas, R. 2003. Vandens ekologija. Kaunas: Technologija. 10–55 p.

Viesturs, U.; Tzonkov S.; Vanags, U. 2006. Bioprocess engineering. Sofia: Avangard Prima. 249–250 p.

Water treatment handbook. 1991. Sixth edition, vol. 1. Degrement. 592 p.

Wetzel, A. 1969. Technische hydrobiologie. Leipzig: Akademische Verlagsgesellschaft Geest & Portig. 407 p.

Горленко, В. М.; Дубинина, Г. А.; Кузнецов, С. И. 1997. Экология водных микрооргaнизмов. Москва: Наука. 261 с.

Кузнецов, С. И.; Дубинина, Г. А. 1989. Методы изучения водных микроорганизмов. Академия наук СССР. Институт микро-биологии. Москва: Наука. 288 с.

Кульский, Л. А.; Строкая, М. М. 1986. Технология очистки природных вод. Киев: Виша школа. 352 с.

Никитина, О. Г.; Жмур, Н. С.; Горбань, Н. С. 1982. Гидро-биологический контроль работы городских очистных соору-жений, в кн. Контроль качества природных и сточных вод. Харьков, 44–51 .

50

Priedai

1 priedas. Bakterijų formos (1–14), aktinomicetų sandara (15–19)

2 priedas. Melsvabakterės

3 priedas. Titnagdumbliai

4 priedas. Žalieji dumbliai (Chlorophyta)

5 priedas. Mikromicetai (mikroskopiniai grybai)

6 priedas (A). Kiautinės amebos

7 priedas (A). Laisvai plaukiojančios infuzorijos

7 priedas (B). Laisvai plaukiojančios infuzorijos

8 priedas (A). Sėslios infuzorijos

8 priedas (B). Sėslios infuzorijos

9 priedas. Siurbiančios infuzorijos

10 priedas (A). Verpetės

10 priedas (B). Verpetės

11 priedas. Apvaliosios (1–4) ir žieduotosios (5–8) kirmėlės

12 priedas. Vėžiagyviai

13 priedas. Polisaprobinės zonos bakterijos, dumbliai bei pirmuonys

14 priedas. Polisaprobinės zonos infuzorijos

15 priedas. Polisaprobinės zonos verpetės, kirmėlės, titnaginiai

dumbliai ir kiti smulkūs vandens organizmai

16 priedas. -mezosaprobinės zonos dumbliai ir pirmuonys

17 priedas. -mezosaprobinės zonos infuzorijos, dumbliai,

vabzdžių lervos (1–11) ir -mezosaprobinės zonos dumbliai

18 priedas. -mezosaprobinės zonos infuzorijos, dumbliai,

vabzdžių lervos

19 priedas. Oligosaprobinės zonos dumbliai ir pirmuonys

20 priedas. Oligosaprobinės zonos pirmuonys

51

1 priedas. Bakterijų formos (1–14), aktinomicetų sandara (15–19): 1 – monokokas, 2 – diplokokas, 3 – tetrakokas, 4 – stafilokokas, 5 – streptokokas, 6 – sarcina, 7 – lazdelės, 8 – spirilės, 9 – vibrionai, 10 – spirocheta, 11 – bakterijos, sudarančios ataugas, 12 – kirmėliškos bakterijos, 13 – toroidai, 14 – žvaigždiškos bakterijos, 15–17 – konidijakočiai, 18–19 – micelis

52

2 priedas. Melsvabakterės: 1 – Aphanizomenon flosaquae, 2 – Calothrix brau-nii, 3 – Tolypothrix tenuis, 4 – Calothrix braunii, 5 – Tolypothrix distoria, 6 – Rivu-laria aquatica (mikroskopinė kolonijos forma ant vandens augalo kamieno), 7, 8 – R. planctonica: 7 – kolonija, 8 – siūlų bazinė dalis, 9, 10 – R. aquatica (bazinės trichomų dalys), 11 – Oscillatoria acuminata, 12– O. agardhii, 13 – O. planctonica, 14 – O. mougeotti, 15 – O. nitida, 16 – O. princeps, 17 –- O. limosa, 18 – O. ornata, 19 – O. sancta, 20 – O. irrigua , 21 – O. limnetica, 22 – Nodularia spumigena, 23 – Oscillatoria lacustris, 24 – O. granulata, 25 – O. subtillissima, 26 – O. brevis, 27 – O. chalybea, 28 – O. curviceps, 29 – O. geminata, 30 – O. prolitica, 31 – O. tenuis, 32 – O. terebriformis

53

3 priedas. Titnagdumbliai: 1 – Melosira arenaria, 2 – M. varians, 3 – M. itali-ca, 4 – M. distans, 5 – M. granulata, 6 – M. islandica, 7 – M. binderana, 8 – Synedra berolinensis, 9 – Asterionella, 10 – Diatoma vulgare, 11 – Cocconeis, 12 – Cymbella, 13 – Navicula, 14 – Achnanthes, 15 – Surirella, 16 – Nitzschia, 17 – Synedra ulna

54

4 priedas. Žalieji dumbliai (Chlorophyta): 1 – Spirogyra, 2 – Hyalotheca, 3 – Oedogonium, 4 – Zygnema, 5 – Stichococcus, 6 – Schizomeris, 7 – Pithophora, 8 – Microthamnion, 9 – Dichotomosiphon, 10 – Ulotrix, 11 – Hormidium, 12 – Chlamydomonus, 13–15 – Chlorella vulgaris (13 – suaugusios ląstelės, 14 – auto-sporų susidarymas, 15 – autosporos išeina iš motininės ląstelės apvalkalėlio), 16–18 – Chlorococcum humicola (16 – suaugusios ląstelės, 17 – sporų susidarymas, 18 – zoospora)

55

5 priedas. Mikromicetai (mikroskopiniai grybai): 1–3 – Mieliagrybiai (Saccharomyces cerevisiae, S. ellipsoideus, padidinta mieliagrybio ląstelė), 4 – Mu-cor mucedo, 5 – Fusarium, 6 – Penicillum,7 – Aspergillus, 8 – Mucor, 9 – Leptomitus lacteus

56

6 priedas (A). Kiautinės amebos: 1 – Trinema lineare, 2 – Pamphagus hyali-num, 3 – Euglypha acanthophora, 4 – Centropyxis aculeata, 5 – Euglypha ciliata, 6 – Gromia fluviatilis, 7 – Centropyxis plagiostoma, 8 – C. aerophyta, 9 – Centropyxis sphaerothillus, 10 – Trinema enchelys

57

6 priedas (B). Kiautinės amebos: 1 – Arcella vulgaris, 2 – A. discoides, 3 – A. dentata, 4 – A. hemisphaerica, 5 – A. catinus, 6 – Centropyxis aculeata, 7 – Dif-flugia oblonga, 8 – D. globulosa, 9 – D. corona, 10 – Euglypha acanthophora

58

7 priedas (A). Laisvai plaukiojančios infuzorijos: 1 – Paramecium cauda-tum, 2 – P .bursar ia, 3– Acineria incu rvata, 4– Litonotus lamella, 5 – Colpidium campylum, 6– Amphilepius claparedei, 7 – Trachelaphyllum pusillum, 8 – Chaenea teres, 9 – Uronema nigricans, 10 – Holophrya simplex, 11 – Tetrahymena pyriformis, 12 – Glaucoma scintillans

59

7 priedas (B). Laisvai plaukiojančios infuzorijos: 1– Stentor polymorphus, 2 – Stentor roeseli, 3 – Metopus es., 4 – Aspidisca costata, 5 – A. lynceus, 6 – Euplo-tes affinis, 7 – E. patella

60

8 priedas (A). Sėslios infuzorijos: 1 – Epistylis plicatilis, 2 – E. urceolata, 3 – E. polenici, 4 – Carchesium batorligetiense, 5 – Opercularia coarciata, 6 – C. poly-pinum, 7 – Zoothamnium parasiticum, 8 – E. thienemanni, 9 – C. polypinum, 10 – Z. carinogammari, 11 – E. bimarginata, 12 – C. batorligetiense

61

8 priedas (B). Sėslios infuzorijos: 1 – Vorticella campanula, 2 – V. picta, 3 – V. nutans, 4 – V. alba (a-typica, b-hyans), 5 – V. hyalina, 6 – V. extensa, 7– V. hyali-na, 8 – V. microstoma, 9 – V. striata, 10 – V. aequilata, 11– V. communis, 12 – V. convallaria, 13 – V. nutans, 14 – V. aerotenci

62

9 priedas. Siurbiančios infuzorijos: 1 – Mucophrya pelagica, 2–3 – Podoph-rya fixa, 4 – Tokophrya moltis, 5 – T. quadripartita, 6 – T. moltis, 7 – Sphaerophrya magna, 8 – P. carchesii, 9 – Discophrya ertangensis

63

10 priedas (A). Verpetės: 1 – Rotaria trisecata, 2 – Philodina citrina, 3–4 – P. acuticornis, 5 – Cephalodella catellina, 6 – C. gibba, 7 – Encentrum putorius, 8 – Cephalodella gracilis, 9 – Eosphora najas, 10 – Dicranophorus forcipatus

64

10 priedas (B). Verpetės: 1 – Rotaria citrina, 2 – R. triescata, 3 – Adineta vaga, 4 – Rotaria tardigrada, 5 – R. rotatoria, 6 – Colurella obtusa, 7 – C. colurus, 8 – Lepadella ovali, 9 – L. acuminata, 10–11 – L. stichaea, 12 – L.tenuiseta, 13 – L. inermis

65

11 priedas. Apvaliosios (1–4) ir žieduotosios (5–8) kirmėlės: 1 – Rhab-ditis, 2 – Achromadora, 3 – Monhystera, 4 – Diplogasteroides, 5 – Tubifex tubifex, 6 – Aelosoma, 7 – Stylaria lacustris, 8 – Nais

66

12 priedas. Vėžiagyviai: 1 – Moina (1,5 mm), 2 – Alona (0,4 mm), 3 – Daphnia 2 mm), 4 – Diaptomus (2 mm), 5 – Cyclops (1 mm), 6 – Polyphemus (1,5 mm), 7 – Bosmina (0,4 mm)

67

13 priedas. Polisaprobinės zonos bakterijos, dumbliai bei pirmuonys: 1 – Zoogloea ramigera, 2 – Spirillum undulans, 3 – Chromatium okeni, 4 – Lampro-cystis roseo-persicina, 5 – Achromatium oxaliferum, 6 – Chlorochromatium aggre-gatum, 7 – Beggiatoa alba, 8 – Peloploca undulata, 9 – Streptococcus margarita-ceus, 10 – Str. Mesenterioides, 11 – Sarcina paludosa, 12 – Sphaerotillus natans, 13 – Oscillatoria putrida, 14 – O. chlorina, 15 – O. lauterborni, 16 – Spirulina jen-neri, 17 – Anabaena constricta, 18 – Pelomyxa palustris, 19 – Amoeba chlorochla-mys, 20 – Euglena viridis, 21 – E. acus, 22 – E. gracilis, 23 – E. prochima, 24 – E. deses, 25 – Bodo putrinus, 26 – Cercobodo longicauda, 27 – Oicomonas mutabi-lis, 28 – Tetramitus pyriformis, 29 – Trigonomonas compressa, 30 – Trepomonas agilis, 31 – Hexamitus inflatus

68

14 priedas. Polisaprobinės zonos infuzorijos: 1 – Vorticella microstoma, 2 – Paramecium putrinum, 3 – Urozona butschlii, 4 – Epalchis striatum, 5 – Colpi-dium campylum, 6 – Dexiotricha centralis, 7 – Colpidium colpoda, 8 – Lagynus elegans, 9 – Metopus contortus, 10 – Pelodinium reniforme, 11 – Tillina magna, 12 – Hexotricha caudate, 13 – Trimyema compressa, 14 – Glaucoma scintillans, 15 – Glaucoma pyriformis, 16 – Caenomorpha medusula, 17 – Plagiopyla nasuta, 18 – Metopus sigmoides, 19 – Saprodinium dentatum, 20 – Discomorpha pectinata

69

15 priedas. Polisaprobinės zonos verpetės, kirmėlės, titnaginiai dumbliai ir kiti smulkūs vandens organizmai: 1 – Rotaria neptunius, 2 – Tubifex tubifex, 3 – Eristalis tenax, 4 – Chironomus plumosus, 5 – Leptomitus lac-teus, 6 – Sphaerophrya soliformis, 7 – Fusarium aquaeductuum, 8 – Closterium leibleini, 9 – C. acerosum, 10 – Phormidium autumnale, 11 – Oscillatoria princeps, 12 – Diplax trigona, 13 – Navicula cryptocephala, 14 – Hantzschia amphioxys, 15 – Nitzschia palea, 16 – Cyclotella meneghiniana, 17 – Stephanodiscus hantzschi, 18 – Oscillatoria tenuis, 19 – O. formosa, 20 – O. chalybea

70

16 priedas. -mezosaprobinės zonos dumbliai ir pirmuonys: 1 – Ant-hophysa vegetans, 2 – Spondylomorum quaternarium, 3 – Oicomonas termo, 4 – Astasia klebsi, 5 – Chlamydomonas ehrenbergi, 6 – Chilomonas paramecium, 7 – Cryptomonas ovata, 8 – Bodo saltans, 9 – Cyclidium lanuginosum, 10 – Podophrya fixa, 11 – Gonium pectorale, 12 – Cyclidium citrullus, 13 – Colpoda cucullus, 14 – Urocentrum turbo, 15 – Spirostomum ambiguum, 16 – Uronema marinum, 17 – Lionotus fasciola, 18 – Chilodonella cucullulus, 19 – Lembus pusillus, 20 – Chilodo-nella uncinatus, 21 – Paramecium caudatum

71

17 priedas. -mezosaprobinės zonos infuzorijos, dumbliai, vabzdžių lervos (1–11) ir -mezosaprobinės zonos dumbliai: 1 – Stentor coeruleus, 2 – Urostyla weissei, 3 – Ochytrixa fallax, 4 – Urotrixa farcta, 5 – Opercularia co-arctata, 6 – Vorticella convallaria, 7 – Herpobdella atomaria, 8 – Sphaerium cor-neum, 9 – Melosira granulata, 10 – Carchesium polypinum, 11 – Stratiomys chamae-leon, 12 – Microcystis flos-aquae, 13 – Aphanizomenon flos-aquae, 14 – Anabaena flos-aquae, 15 – A. spiroides, 16 – Oscillatoria redeckei, 17 – O. agardhi, 18 – O. rubescens, 19 – Melosira varians, 20 – Diatoma vulgare, 21 – D. elongatum, 22 – Fragilaria crotonensis, 23 – Synedra ulna, 24 – S. acus, 25 – Tabellaria fenestrata, 26 – Asterionella formosa, 27 – Navicula rhynchocephala, 28 – N. cuspidate, 29 – Nitzschia acicularis, 30 – Stauroneis phoenicenteron

72

18 priedas. -mezosaprobinės zonos infuzorijos, dumbliai, vabzdžių lervos: 1 – Pinnularia viridis, 2 – Surirella biseriata, 3 – Cymatopleura solea, 4 – Closterium moniliferum, 5 – Pediastrum boryanum, 6 – Selenastrum bibraianum, 7 – Ankistrodesmus falcatus, 8 – Scenedesmus quadricauda, 9 – S. acuminatus, 10 – Dictyosphaerium pulchellum, 11 – Chaetophora elegans, 12 – Microthamnium kutzingianum, 13 – Vaucheria sessilis, 14 – Cladophora crispate, 15 – Chantransia chalybea, 16 – Amoeba proteus, 17 – A. radiosa, 18 – Synura uvella, 19 – Uroglena volvox, 20 – Euglypha alveolata, 21 – Actinosphaerium eichhorni, 22 – Cloeon dip-terum, 23 – Polycelis cornuta, 24 – Dendrocoelum lacteum, 25 – Stylaria lacustris, 26 – Brachionus urceolaris

73

19 priedas. Oligosaprobinės zonos dumbliai ir pirmuonys: 1 – Phormi-dium inundatum, 2 – Calothrix parietina, 3 – Cyclotella comta, 4 – C. bodanica, 5 – Synedra acus var. radians, 6 – Nitzschia linearis, 7 – Meridion circulare, 8 – Surirel-la spiralis, 9 – Staurastrum gracile, 10 – St. tetracerum, 11 – Micrasterias papillife-ra, 12 – Pinnularia maior, 13 – P. nobilis, 14 – Micrasterias crux-melitensis, 15 – Euastrum oblongum, 16 – Ulotrix zonata, 17 – Drapalnaldija glomerata, 18 – Bul-bochaeta mirabilis, 19 – B. nana, 20 – Cladophora glomerata, 21 – Lemanea fluvia-tilis, 22 – Batrachospermum moniliforme, 23 – Fontinals antipyretica, 24 – Mallo-monas caudata, 25 – Diplosiga socialis, 26 – Chromulina rosanoffi, 27 – Acanthocystis turfacea

74

20 priedas. Oligosaprobinės zonos pirmuonys: 1 – Tintinnidium fluviatile, 2 – Didinium cinctum, 3 – Marituja pelagica, 4 – Halteria grandinella, 5 – Codonel-la lacustris, 6 – Strombidinopsis gyrans, 7 – Strobilidium gyrans, 8 – Mucophrya pelagica

75

Aušra MAŽEIKIENĖ

VANDENS MIKROBIOLOGIJA

Laboratorinių darbų metodikos nurodymai Redagavo Vilmantė Levanavičiūtė, Dalia Markevičiūtė Maketavo Viktorija Šakalienė 2009 05 05. 4,61 aut. l., 4,75 sp. l. Vilniaus Gedimino technikos universiteto leidykla „Technika“ Saulėtekio al.11, 10223 Vilnius, http://leidykla.vgtu.lt Spausdino UAB „Baltijos kopija“ Kareivių g. 13B, 09109 Vilnius, www.kopija.lt