Vanessa Marques Alvarez - Livros Grátislivros01.livrosgratis.com.br/cp025203.pdf · 6.1. Isolamento de bactérias halofílicas ou halotolerantes degradadoras de hidrocarbonetos 48

Vanessa Marques Alvarez

BIOPROSPECÇÃO DA POPULAÇÃO BACTERIANA

HALOTOLERANTE E BIODEGRADADORA DE ÓLEO

PRESENTE EM SOLO IMPACTADO NA REGIÃO DE

PANELAS, SE

INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF. PAULO DE GÓES

UNIVERSIDADE DE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

RIO DE JANEIRO

2007

Tese apresentada ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Microbiologia

Livros Grátis

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2

FICHA CATALOGRÁFICA

_________________________________________________________________________

ALVAREZ, Vanessa Marques

Bioprospecção da população bacteriana halotolerante e biodegradadora

de óleo presente em solo impactado na região de Panelas, SE

Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/ UFRJ,

2007.

96 fls

Dissertação: Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia)

1. Biodegradação

2. Bactérias Halotolerantes

3. Diversidade

I. Universidade Federal do Rio de Janeiro – Tese

II. Título

_______________________________________________________________

3

Tese realizada no Laboratório de

Genética Microbiana, Departamento de

Microbiologia Geral, Instituto de

Microbiologia Prof. Paulo de Góes, da

Universidade Federal do Rio de Janeiro sob

a orientação da Profa. Lucy Seldin.

4

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer a todos que contribuíram para a realização do

meu trabalho de alguma forma.

A Deus por ter me dado o maior presente de todos: a vida.

À minha orientadora, Dra. Lucy Seldin, pela amizade, dedicação e pelo grande

exemplo como pesquisadora e professora. Muito obrigada pelo incentivo,

pelas oportunidades e pelo carinho!

Aos meus pais, Luiz Felippe e Maria Alice, por serem pessoas tão especiais!

Por me amarem muito e incondicionalmente! Sem a força que vocês me

transmitem a cada dia seria impossível realizar mais esta conquista.

Obrigada mesmo por vocês me ajudarem a superar obstáculos e por

acreditarem em mim SEMPRE! Amo vocês!

Ao meu namorado, Rafael, pelo companheirismo, cumplicidade e

compreensão. Obrigada por sempre me motivar nos momentos difíceis e

comemorar as minhas conquistas como se fossem as suas vitórias! O seu

apoio foi fundamental para a conclusão desta tese, em TODOS os

momentos. Espero conseguir retribuir à altura! Te amo muito!

À minha família, pela união e por todos os momentos maravilhosos que

passamos juntos!

Aos meus amigos do laboratório: Renata, Janinha, Silvia, Marcinha, Elisa,

Fábio, Luciano, Diogo Bastos, Diogo Jurelevicius, Joana, Natalie, Simone,

Natália (obrigada pela ajuda com os experimentos de antagonismo e

degradação) e também Irene. Obrigada por estarem sempre prontos a

ajudar e por comemorarem comigo cada resultado novo!

5

Aos meus amigos Raquel e Renato, Fernanda e Gustavo, Lívia e Daniel,

Renata e Felipe, Mariana e Adriano, Margareth, Lilian, Juliana, Débora,

Amanda e Renato, Vanessa Pio, Renata e Alexandre, Carla, Sheila e

Waleska. Obrigada pelos risos, pelas festas, pelas viagens e pelo apoio de

sempre.

À Silvia, pela atenção, por compartilhar seus conhecimentos e pela ajuda

durante os meus experimentos.

À Renata. Muito obrigada! Enfrentar os desafios do mestrado seria muito mais

difícil sem a sua amizade! Conte comigo para o que der e vier!

Ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes na pessoa de sua diretora,

Dra. Agnes Marie Sá Figueiredo, aos professores e ao pessoal técnico e

administrativo pelas facilidades oferecidas.

À Petrobras, pelo auxílio financeiro e pelo apoio logístico em todas as etapas

deste trabalho, permitindo a realização do mesmo.

À equipe da Petrobras/CENPES/PDEDS/Biotecnologia e Tratamentos

Ambientais (BTA), em especial, à Gina V. Sebastián, ao Ronalt Leite Vital

e à Renata Casella, que sempre se mostraram dispostos a discutir os

resultados e oferecer meios para a concretização dos objetivos propostos

neste estudo.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),

pela bolsa de estudos concedida pelo Programa Taxonomia.

6

ÍNDICE

LISTA DE ABREVIAÇÕES 8

RESUMO 9

SUMMARY 10

INTRODUÇÃO 11

1. O petróleo 11

2. O impacto do petróleo no meio ambiente 12

3. Microrganismos degradadores de óleo 14

4. Biorremediação 19

5. A água de produção 22

6. Biorremediação de solos contaminados com óleo e água de produção 23

7. Isolamento e detecção de bactérias degradadoras de óleo no ambiente 25

JUSTIFICATIVA 30

OBJETIVOS 32

MATERIAIS E MÉTODOS 34

1. Amostragem 34

2. Meios de cultura 36

3. Soluções 38

4. Tampões 42

5. Avaliação direta da diversidade bacteriana em ambientes

contaminados com óleo e água de produção 43

5.1. Extração de DNA total da comunidade microbiana 43

5.2. Amplificação do gene que codifica o rRNA 16S por PCR 44

5.3. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) 45

5.4. Análise estatística dos perfis de DGGE 46

7

5.5. Clonagem e seqüenciamento do DNA presente

nas bandas de DGGE 46

5.6. Análise das seqüências clonadas 47

6. Avaliação indireta da diversidade bacteriana em ambientes


6.1. Isolamento de bactérias halofílicas ou halotolerantes

degradadoras de hidrocarbonetos 48

6.2. Teste de degradação de hidrocarbonetos 49

6.3. Testes fenotípicos 49

6.4. ARDRA (Amplified Ribossomal DNA Restriction analysis) 50

7. Teste de antagonismo 51

8. Análise das diferentes amostras do solo 52

RESULTADOS 53

1. Análise das diferentes amostras do solo 53

2. Avaliação direta da diversidade bacteriana em ambientes


3. Avaliação indireta da diversidade bacteriana em ambientes


4. Teste de antagonismo 74

DISCUSSÃO 75

REFERÊNCIAS 82

8

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ARDRA – Análise da restrição do DNA 16S amplificado

DGGE – Eletroforese em gel de gradiente desnaturante

DNA – Ácido desoxirribonucléico

HPA – Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

PCR – Reação da polimerase em cadeia

RAPD – DNA polimórfico amplificado randomicamente

rDNA 16S – DNA ribossomal 16S

RNA – Ácido ribonucléico

rRNA 16S – RNA ribossomal 16S

SSCP – Polimorfismo da conformação da fita simples

TGGE – Eletroforese em gel de gradiente de temperatura

TPH – Hidrocarbonetos totais do petróleo

T-RFLP – Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminal

q.s.p. – Quantidade Suficiente Para

9

RESUMO

Com intuito de avaliar um possível processo de biorremediação em uma

área impactada do campo petrolífero de Carmópolis denominada Panelas,

contaminada por uma mistura de óleo com água de produção (com uma

salinidade de 7%), durante o processo de recuperação secundária do petróleo,

este estudo teve como objetivos principais a avaliação de modo direto e

indireto da diversidade da comunidade bacteriana do local contaminado e de

uma área não contaminada (controle), além do isolamento de estirpes

halofílicas e/ou halotolerantes com capacidade de degradar óleo. A análise

direta da diversidade das comunidades bacterianas presentes nos locais citados

foi realizada através de técnicas moleculares como PCR, DGGE 16S,

clonagem e seqüenciamento. Devido à alta salinidade da água de produção e

ao efeito tóxico do óleo cru, a comunidade bacteriana sofreu alterações

significativas que foram visualizadas na comparação dos perfis das amostras

de solo contaminado com os perfis das amostras do solo controle na DGGE

16S. Duas bandas do gel da DGGE foram seqüenciadas e identificadas como

Paenibacillus sp. e Frankia sp. Além disso, foi realizado o isolamento de 131

estirpes bacterianas a partir de culturas de enriquecimento das amostras de

solo contaminado. Estas estirpes foram testadas quanto à capacidade de

degradar óleo cru e tolerar altas concentrações de NaCl. Os referidos testes

resultaram na seleção de 22 estirpes halotolerantes degradadoras de

hidrocarbonetos que foram submetidas ao teste de ARDRA. Quinze grupos

genotípicos foram formados e estes estão sendo avaliados quanto a sua

possível utilização na forma de consórcios para a biorremediação da área

contaminada de Panelas.

10

SUMMARY

Considering the use of a bioremediation process in an area of

Carmópolis oil field named Panelas, contaminated by a mix of oil and

production water (salinity of 7%), during the secondary recovery process, this

study aimed to determine the diversity of the bacterial community from this

contaminated compared to a non-contaminated soil area. For this purpose,

molecular methods based on PCR-DGGE followed by cloning and sequencing

were used. Furthermore, halophilic and/or halotolerant strains capable to

degrade crude oil were isolated. Significant changes in the DGGE profiles

were observed mainly because of the high salinity present in the production

water and the toxic effect from the crude oil. Two bands were extracted from

DGGE, sequenced and they were identified as Paenibacillus sp. and Frankia

sp. Moreover, 131 bacterial strains were isolated from enrichment cultures

obtained from the contaminated soil samples. These strains were further tested

for their ability to degrade crude oil and tolerate high NaCl concentrations.

Twenty-two strains showing these characteristics were submitted to ARDRA

analyses. Fifteen genotypic groups were formed and they are being evaluated

for their application in bioremediation as a consortium in the contaminated

area of Panelas.

11

INTRODUÇÃO

1. O petróleo

O petróleo é uma substância oleosa, inflamável, menos densa que a água, com

cheiro característico e de cor variando entre o negro e o castanho escuro

(www.petrobras.com.br). Este é composto de uma mistura complexa de hidrocarbonetos e

outros compostos orgânicos, incluindo alguns constituintes organometálicos como, por

exemplo, vanádio e níquel (Chang, 1994; Van Hamme, Singh & Ward, 2003).

Os hidrocarbonetos são quantitativamente os mais importantes constituintes do

petróleo, podendo ser classificados em três grupos: alifáticos, alicíclicos e aromáticos. Os

hidrocarbonetos alifáticos são compostos de cadeias abertas e estão subdivididos em

alifáticos saturados (hidrocarbonetos mais estáveis conhecidos como parafinas ou alcanos)

e alifáticos insaturados (hidrocarbonetos menos estáveis conhecidos como oleofinas ou

alcenos). Os hidrocarbonetos alicíclicos (cicloalcanos) têm alguns ou todos os átomos

arranjados em uma estrutura em anel e podem ser saturados ou insaturados. Os

hidrocarbonetos aromáticos (arenos) contêm ao menos um anel de benzeno e são chamados

de hidrocarbonetos monocíclicos, enquanto os que possuem mais de um deste tipo de anel

são chamados de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs) (Leythaeuser &

Rückheim, 1989).

O petróleo também é constituído por compostos sulfurosos (ex: sulfetos,

polissulfetos, benzotiofenos), compostos nitrogenados (ex: piridinas, quinolinas, indóis),

compostos oxigenados (ex: ácidos carboxílicos, fenóis, ésteres), resinas e asfaltenos

(Leythaeuser & Rückheim, 1989; Huang et al., 2004).

12

Um reservatório de petróleo, por definição, é formado por 3 elementos: a rocha

matriz, a rocha impermeável e a rocha reservatório.

A rocha matriz é a rocha na qual o óleo cru é formado e da qual, posteriormente, o

mesmo é expulso. Alguns pesquisadores defendem que os fluidos do petróleo são

produzidos pela quebra térmica do material orgânico fóssil contido nos sedimentos e que

este processo é, provavelmente, a fonte dos depósitos mais significantes descobertos até o

momento. Além disso, acreditam também que alguns fluidos são diluídos por compostos de

origem inorgânica (Planckaert, 2005). Entretanto, Chang (1994) defende que os

reservatórios de petróleo formaram-se na crosta terrestre como resultado da decomposição

anaeróbica de matéria animal, vegetal e planctônica por bactérias.

A rocha reservatório funciona como uma esponja, pois ela pode armazenar e expelir

o fluido. Normalmente, esta rocha possui uma grande capacidade de estocar fluidos ricos

em hidrocarbonetos. Já o papel da rocha impermeável é conter a migração dos

hidrocarbonetos, permitindo assim a formação dos reservatórios de petróleo (Planckaert,

2005).

2. O impacto do petróleo no meio ambiente

O petróleo é uma das fontes de energia mais importantes no mundo industrial

moderno. Os impactos ambientais causados pela indústria do petróleo são provenientes da

exploração, transporte, refino e utilização dos seus produtos (Prince, 1993; Balba, Al-

Awandi & Al-Daher, 1998; Wei, Mather & Fotheringham, 2005). Estas atividades estão

envolvidas em 90% dos acidentes resultantes da exploração e utilização do petróleo, e

somente os 10% restantes são atribuídos às catástrofes de derrames de óleo em alto mar

13

resultando na contaminação de regiões costeiras (Balba, Al-Awandi & Al-Daher, 1998;

Prince, 1993).

Em várias operações de produção, processamento e armazenamento, grandes

volumes de resíduos são gerados sob forma de lamas oleosas (Manning & Thompson,

1995). A contaminação dos solos pelo petróleo e seus derivados pode ser distribuída pelas

três fases do solo (gasosa, líquida e sólida), devido à volatilidade, à solubilidade e à carga

iônica do contaminante gerando grande impacto ambiental (Cacciatore & McNeil, 1995).

Os hidrocarbonetos ligam-se fortemente a superfícies sólidas, incluindo os solos, e a

remediação destes materiais representa um desafio significante. Os hidrocarbonetos mais

leves, além de tóxicos, tendem a volatilizar na atmosfera, reduzindo a qualidade do ar e

prejudicando a saúde dos seres humanos e animais. Compostos com altas concentrações de

enxofre também fazem parte dos resíduos petrolíferos necessitando de tratamento

específico (Van Hamme, Singh & Ward, 2003).

Visando tornar o processo de descontaminação acessível economicamente, os

pesquisadores vêm testando estratégias tecnológicas, que incluem esquemas

biotecnológicos, para tratar locais contaminados. Nestes tratamentos, os microrganismos

podem representar uma alternativa eficaz na recuperação do ambiente atingido (Singh,

Mullin & Ward, 2001).

Atualmente, as tecnologias mais utilizadas para a remediação do solo incluem o

aterro dos resíduos, emulsificação, evaporação, solidificação, dispersão, lavagem, adsorção

térmica, nitrificação, incineração e remoção mecânica. Entretanto, muitas destas

tecnologias são caras ou não levam à decomposição completa dos contaminantes. O

tratamento biológico, conhecido como biorremediação, tem sido reconhecido como uma

tecnologia promissora para lidar com ambientes poluídos por vários contaminantes

14

orgânicos, principalmente os hidrocarbonetos do petróleo (Medina-Bellver et al., 2005;

Shuhong et al., 2005).

3. Microrganismos degradadores de óleo

Muitos microrganismos são eficientes na degradação de hidrocarbonetos (Bouwer

& Zehnder, 1993) e possuem uma maquinaria metabólica que permite a utilização do

petróleo como única fonte de carbono (Van Hamme, Singh & Ward, 2003). A explicação

para a sua gama extraordinária de capacidades degradadoras está na coexistência dos

microrganismos, por bilhões de anos, com uma variedade imensa de compostos orgânicos

muito antes da época em que os seres humanos apareceram no planeta. Esta grande

diversidade de substratos com os quais os microrganismos entraram em contato passaram a

ser utilizados no seu crescimento levando à seleção de enzimas capazes de transformar os

novos compostos naturais orgânicos (Butler & Manson, 1997; Ellis, 2000).

Uma grande quantidade de microrganismos com capacidade de degradar diversos

compostos, como benzeno, fenol e naftaleno, já foi isolada e caracterizada (Dickel, Haug &

Knackmus, 1993; Faison, 2001). Dentre eles, as bactérias são as mais estudadas para a

aplicação na biorremediação. Este fato se deve à facilidade de cultivo e manipulação

genética, capacidade de metabolizar organo-clorados, capacidade de mineralização de

diversos compostos químicos e a utilização dos mesmos como fonte de energia (Bouwer &

Zehnder, 1993). A Tabela 1 exemplifica os gêneros de bactérias que estão presentes no

solo e são capazes de degradar hidrocarbonetos do petróleo.

15

Gênero Substrato

Achromobacter Óleo combustível

Acidocella Naftaleno

Acidovorax Fenantreno

Acinetobacter Óleo combustível

Actinomyces Óleo cru

Aeromonas Óleo Diesel

Agrobacterium Aromáticos da gasolina

Alcaligenes Óleo combustível

Alcanivorax Alcanos

Alkanindiges Alcanos

Alteromonas Óleo cru

Arthrobacter Óleo combustível

Aureobacterium Óleo cru

Azoarcus Tolueno

Azospirillum Combustível de avião

Azotobacter Óleo cru

Bacillus Tolueno

Beijerinckia Fenantreno

Blastoclhoris Tolueno

Tabela 1 - Gêneros de bactérias capazes de crescer utilizando

hidrocarbonetos como única fonte de carbono e energia (Prince, 2005)

16

Gênero Substrato

Brevibacterium Alcanos

Brevundimonas Óleo combustível

Burkholderia Tolueno

Clavibacter Naftaleno

Comamonas Fenantreno

Corynebacterium Óleo combustível

Cycloclasticus Bifenil

Cytophaga Óleo cru

Dechloromonas Benzeno

Desulfatibacillum Alcanos

Desulfobacterium Xileno

Desulfobacula Tolueno

Desulfosarcina Xileno

Desulfosporosinus Gasolina

Dietzia Alcanos

Enterobacter Alcanos

Erwinia Alcanos

Flavobacterium Óleo Diesel

Geobacillus Óleo cru

Geobacter Tolueno

Gordonia Alcanos

Klebsiella Óleo cru

17

Gênero Substrato

Lactobacillus Óleo cru

Leclercia Pireno

Leucotrix Óleo cru

Lutibacterium Fenantreno

Marinobacter Óleo cru

Micrococcus Hexadecano

Moraxella Bifenil

Mycobacterium Fenantreno

Neptunomonas Naftalenos

Nocardia Alcanos

Nocardioides Fenantreno

Ochrobactrum Diesel

Oleiphilus Alcanos

Oleispira Alcanos

Paenibacillus Fenantreno

Pasteurella Fluoranteno

Peptococcus Óleo cru

Planococcus Alcanos

Polaromonas Naftaleno

Proteus Óleo cru

Pseudomonas Óleo combustível

Ralstonia Tolueno

18

Gênero Substrato

Rhodococcus Fenantreno

Sarcina Óleo cru

Serratia Óleo cru

Sphaerotilus Óleo cru

Sphingomonas Tolueno

Spirillum Óleo cru

Staphylococcus Diesel

Stenotrophomonas Pireno

Streptomyces Alcanos

Thalassolituus Alcanos

Thauera Tolueno

Thermoleophilum Alcanos

Thermus Pireno

Vibrio Fenantreno

Xanthobacter Dibenzotiofeno

Xanthomonas Fenantreno

19

4. Biorremediação

O conceito de biorremediação foi introduzido no fim da década de 80. Esta

tecnologia envolve microrganismos participando de diversas reações físicas e químicas em

solos poluídos. Os poluentes são degradados através do metabolismo microbiano (Shuhong

et al., 2005) resultando na redução da concentração e/ou a toxicidade de várias substâncias

químicas como derivados do petróleo, hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos (incluindo

hidrocarbonetos poliaromáticos), entre outros (Korda et al., 1997).

A remediação de solos contaminados com óleo através dos microrganismos

representa um caminho rápido para a degradação dos hidrocarbonetos do petróleo e

também diminui o risco da contaminação dos lençóis d’água. A degradação microbiana

natural é a primeira opção para os tratamentos do meio ambiente (Alexander, 1994).

Comparada aos métodos físico-químicos, a biorremediação oferece uma alternativa

eficiente para o tratamento da poluição pelo petróleo, já que a maioria das moléculas

encontradas no óleo cru e nos produtos refinados é biodegradável e os microrganismos

degradadores de óleo são ubiquitários (Fayad & Overton, 1995; Aislabie, McLeod &

Fraser, 1998; Chaineau et al., 2000).

Diferentes técnicas são utilizadas no processo de biorremediação, dentre elas

podemos citar: (1) a bioatenuação, que consiste em monitorar o progresso natural da

degradação para assegurar que a concentração de contaminantes diminuiu ao longo do

tempo; (2) a bioestimulação, que ocorre através do estímulo intencional das bactérias

indígenas degradadoras de xenobiontes pela adição de aceptores de elétrons, água,

nutrientes ou doadores de elétrons; ou (3) bioaumento, no qual realiza-se a adição de

20

bactérias crescidas em laboratório que possuem características apropriadas para a

degradação dos compostos poluentes (Widada, Nojiri & Omori, 2002).

A atenuação natural se concentra na capacidade de biodegradação intrínseca das

comunidades microbianas indígenas. Através dela o movimento do contaminante e o

declínio lento e progressivo da concentração do mesmo são monitorados. Este

monitoramento é válido quando não existem grandes ameaças à saúde humana e onde o

impacto não está se espalhando rapidamente (Philp & Atlas, 2005).

A bioestimulação envolve a adição de oxigênio, água e nutrientes minerais

(geralmente combinações de nitrogênio, fósforo e elementos traço) e resulta na aceleração

da reprodução dos microrganismos presentes no local em até cem vezes, necessitando de

um monitoramento ecológico constante (Orzech, Solyst & Thompson, 1991).

O bioaumento é um método que envolve a aplicação direta no solo de

microrganismos provenientes do local de contaminação, comercializados por grandes

empresas ou geneticamente modificados. Muitos microrganismos são submetidos a uma

seleção induzida com o objetivo de aumentar a sua capacidade de degradar contaminantes

específicos e melhorar a adaptação às condições do local. Entretanto, a possibilidade de

efeitos ecológicos adversos a partir da introdução de microrganismos exógenos ou

geneticamente modificados deve ser examinada e minimizada (Orzech, Solyst &

Thompson, 1991; Leavitt & Brown, 1994).

Utilizando as técnicas descritas acima, diversos métodos biológicos já foram

descritos para o processamento dos resíduos petrolíferos em solos contaminados com óleo.

Como exemplo, podemos citar o ‘landfarming’, a biopilha, a bioventilação e a utilização de

biorreatores (Ward, 1991; Prince, 1993; Atlas & Cerniglia, 1995; Korda et al., 1997).

21

Como exposto anteriormente, a contaminação por hidrocarbonetos do petróleo

ocorre como uma mistura complexa de hidrocarbonetos. Embora o potencial dos

microrganismos em degradar compostos orgânicos sob condições favoráveis seja elevado,

nenhuma espécie sozinha tem a capacidade de degradar todos os componentes de um

determinado óleo (Office of Technology Assessment, 1991), e nenhum “super organismo”

degradador de óleo foi desenvolvido pela engenharia genética. Atualmente, vários

organismos são conhecidos pela capacidade de degradar, normalmente, um ou poucos

hidrocarbonetos do petróleo de cada vez. Dessa forma, a biodegradação eficaz da

contaminação do petróleo requer uma mistura de populações compostas de diversos

gêneros, cada qual capaz de metabolizar seus respectivos compostos (Korda et al., 1997).

Algumas estirpes comerciais são utilizadas para a realização do bioaumento, como por

exemplo: Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1339D (Anonymous, 1993a), Bacillus sp.

BKPM B-5467 (Anonymous, 1992), Pseudomonas putida CCM 4307 (Anonymous,

1993b), Candida sp. M23-2 (Anonymous, 1994a) e Trichoderma sp. AP-5 (Anonymous,

1994b).

Embora excelentes resultados tenham sido obtidos em experimentos de

biorremediação em laboratório, não existe garantia de que os microrganismos terão o

mesmo comportamento em campo. Muitos compostos que são facilmente metabolizados in

vitro não são degradados eficientemente em solos contaminados e aqüíferos. Isto pode

estar relacionado à diminuição da biodisponibilidade causada pela adsorção dos compostos

nas partículas do solo ou em soluções de fase líquida não-aquosas (Alexander, 1991) e à

distribuição das populações bacterianas no solo. Dessa forma, muitos pesquisadores vêm

ressaltando que a comunidade científica deve prestar atenção aos fatores que controlam a

biodisponibilidade dos contaminantes orgânicos e aos métodos para aumentar a viabilidade

22

e atividade microbiana, além de monitorar a biorremediação, a ecologia e o destino de

microrganismos eventualmente introduzidos no ambiente (Korda et al., 1997).

5. Água de produção

A indústria do petróleo é uma grande consumidora e produtora de água. Ao final do

tempo de vida (útil) de um campo petrolífero, os poços podem produzir mais de 95% de

água (ex.: 95m3 de água para cada metro cúbico de fluido produzido que possui 0,05 m3 de

óleo) (Planckaert, 2005). No Brasil, por exemplo, em 1998, um volume estimado de 9,3 x

106 m3 de água de produção foi liberado no mar por 7 plataformas fixadas na Bacia de

Campos (Jerez Vegueria, Godoy & Miekeley, 2002).

A água de produção gerada durante o processo de extração, muitas vezes, é utilizada

na recuperação secundária do petróleo. Para tal, ocorre a injeção da mesma no aqüífero do

reservatório de petróleo para manter a pressão e empurrar o óleo até os poços de produção (

Planckaert, 2005).

Essa água de produção (ou água produzida) pode ser muito salina e contém

componentes tóxicos indesejáveis, além de uma grande quantidade de hidrocarbonetos. Ela

pode ser caracterizada da seguinte forma: ausência de oxigênio dissolvido, salinidade

significativa de mais de 300 g/ l (cloretos, sulfatos ou bicarbonatos), alta temperatura (40 a

90°C), pequena quantidade de partículas em suspensão, uma grande concentração e

variedade de hidrocarbonetos, alguns álcoois (fenóis), alguns metais, como zinco, chumbo

ou cobre, e alguns ácidos. Outros compostos, como compostos orgânicos e fontes de

nitrogênio e fósforo, são encontrados na água e podem servir de nutrientes para as bactérias

(Planckaert, 2005).

23

O derrame da água de produção sem tratamento no ambiente, com quantidades

variadas de sal, inibe o crescimento das plantas, leva ao aumento da erosão e perda da

superfície do solo e gera a contaminação dos lençóis d’água por sais e hidrocarbonetos

(Nicholson & Fathepure, 2004).

6. Biorremediação de solos contaminados com óleo e água de produção

Como os processos convencionais de tratamento microbiológico não funcionam em

altas concentrações de sal, a biorremediação de campos petrolíferos impactados com água

de produção somente pode ser realizada através do bioaumento utilizando-se bactérias

indígenas ou bactérias halofílicas e/ou halotolerantes (que sejam capazes de degradar os

compostos do petróleo) (Nicholson & Fathepure, 2004).

Os microrganismos halofílicos e halotolerantes – que possuem a capacidade de

crescer em ambientes salinos – são encontrados nos três domínios da vida: Archaea,

Bacteria e Eukarya (Oren, 1999). Como resultado da sua adaptação a esses ambientes, tais

microrganismos desenvolveram propriedades únicas que podem ser aplicadas em vários

campos da biotecnologia: na degradação ou transformação de poluentes orgânicos, na

produção e fermentação de alimentos e na produção de biopolímeros (como

biossurfactantes e enzimas) entre outros (Margesin & Schinner, 2001; Oren 2002; Sánchez-

Porro et al., 2003; Garcia, Ventosa & Mellado, 2005).

Os microrganismos dependentes de sal para crescer são denominados halofílicos,

enquanto os microrganismos que são capazes de crescer tanto na ausência quanto na

presença de sal são chamados de halotolerantes. Os microrganismos halotolerantes que

possuem a capacidade de crescer acima de 15% (w/v) NaCl, são considerados

24

halotolerantes extremos (Margesin & Schinner, 2001). A definição mais utilizada para os

microrganismos halofílicos é a de Kushner (1978), que classifica os microrganismos como:

ligeiramente halofílicos, quando apresentam a concentração ótima de NaCl para

crescimento em torno de 3% (0,5 M); halofílicas moderadas, quando os microrganismos

apresentam o crescimento ótimo em meio contendo de 3 – 15% (0,5 – 2,5 M) de NaCl;

halofílicas extremas, quando os microrganismos apresentam ótimo crescimento em meio

contendo de 15 – 30% (2,5 – 5,2 M) de NaCl. Estes organismos halofílicos moderados e

extremos são de grande interesse no tratamento de efluentes hipersalinos. As bactérias

halotolerantes crescem em ambientes contendo menos de 3% de NaCl, mas também podem

resistir a altas concentrações de sal, coexistindo com bactérias halofílicas em ambientes

hipersalinos (Marquez, Ventosa & Ruiz-Barraquero, 1987).

Diversos estudos indicam o envolvimento de bactérias halofílicas e halotolerantes

na degradação de poluentes. Oren e colaboradores (1992) demonstraram a capacidade de

uma arquea halofílica (estirpe EH4) em degradar um amplo espectro de n-alcanos e

hidrocarbonetos aromáticos na presença de altas quantidades de sal. Gauthier e

colaboradores (1992) descreveram a bactéria halotolerante extrema Marinobacter

hydrocarbonoclasticus, que possui a capacidade de degradar uma variedade de

hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos. Em 1992, uma estirpe de Streptomyces sp.

halotolerante foi isolada de um campo petrolífero na Rússia por Kuznetnov e

colaboradores e foi observado, no mesmo estudo, que este microrganismo degradava óleo

cru. Além disso, Plotnikova e colaboradores (2001) verificaram que bactérias isoladas de

um local impactado com altas concentrações de sal eram capazes de degradar

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs).

25

7. Isolamento e detecção de bactérias degradadoras de óleo no ambiente

Ecologicamente, os microrganismos capazes de metabolizar hidrocarbonetos estão

amplamente distribuídos no ambiente. Dessa forma, muitas dificuldades foram encontradas

durante as tentativas de caracterizar as comunidades microbianas naturais impactadas com

hidrocarbonetos do petróleo. Apesar das dificuldades, muitas ferramentas estão sendo

desenvolvidas, na tentativa de melhorar os estudos que visam quantificar os

microrganismos e verificar a sua distribuição no ambiente natural, na esperança de associar

essas comunidades com funções do ecossistema (Van Hamme, Singh & Ward, 2003).

As razões para tentar realizar tais análises incluem: descrever o papel dos

microrganismos na gênese do petróleo através do tempo geológico (Omori et al., 1992;

Margot, Ollivier & Patel, 2000), avaliar os efeitos a longo-prazo da poluição pelo petróleo

(Lindstrom, Barry & Braddock, 1999), desenvolver e avaliar a remediação dos resíduos

gerados (Ka, Yu & Mohn, 2001; Siciliano et al., 2003), rastrear o enriquecimento de

microrganismos patogênicos durante a remediação (Berg, Roskot & Smalla, 1999; Foght et

al., 1996) e controlar atividades microbianas deletérias durante a produção de petróleo

(Eckford & Fedorack, 2002).

Os métodos para analisar a diversidade microbiana e a função da comunidade

podem ser divididos em métodos dependentes de cultivo e independentes de cultivo, sendo

que ambos devem incluir técnicas de caracterização genética (Van Hamme, Singh & Ward,

2003).

Os métodos tradicionais, dependentes de cultivo, são os mais comuns e estão

baseados nas diferenças morfológicas, metabólicas e fisiológicas dos microrganismos. Isto

inclui o isolamento e cultivo em meio sólido, ensaios em meio líquido como o NMP

26

(Número Mais Provável) e a utilização de substrato em placas Biolog (Van Hamme, Singh

& Ward, 2003). Entretanto, utilizando estes métodos, a enumeração e o monitoramento de

populações bacterianas degradadoras de xenobiontes em ambientes contaminados pode

levar um tempo longo e, na maioria das vezes, subestima os números como resultado da

dificuldade existente em cultivar a maioria dos microrganismos do solo (Lloyd-Jones et al.,

1999).

Atualmente, técnicas moleculares vêm sendo utilizadas para caracterizar os ácidos

nucléicos dos microrganismos contidos na comunidade microbiana das amostras

ambientais. O principal benefício dessas análises moleculares é a possibilidade de estudar

comunidades microbianas sem cultivar bactérias e fungos, enquanto as análises usando

incubação no laboratório (microbiologia clássica) são indiretas e produzem mudanças

artificiais na estrutura e na atividade metabólica da comunidade microbiana. Além disso,

métodos moleculares diretos preservam o ‘status’ metabólico in situ e a composição da

comunidade microbiana, porque as amostras são congeladas imediatamente após a coleta.

Também, a extração direta dos ácidos nucléicos de amostras ambientais conta com uma

proporção muito grande de microrganismos (90-99,9%) que não são cultiváveis em

laboratório, mas podem ser responsáveis pela maioria da atividade biodegradadora de

interesse (Brockman, 1995).

Dentre os métodos para avaliar os perfis das comunidades podemos citar a

eletroforese em gel de gradiente desnaturante ou DGGE (Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis), a eletroforese em gel de gradiente de temperatura ou TGGE (Temperature

Gradient Gel Electrophoresis), o polimorfismo da conformação da fita simples ou SSCP

(Single Strand Conformation Polymorphism), a técnica de DNA polimórfico amplificado

randomicamente ou RAPD (Random Amplified polymorphic DNA), a análise de restrição

27

do DNA ribossomal amplificado ou ARDRA (Amplified Ribossomal DNA Restriction

Analysis) (Kent & Triplett, 2002).

A separação de seqüências específicas de DNA, ou a detecção de pequenas

diferenças existentes entre elas, pode fornecer informações importantes sobre a estrutura da

comunidade e a diversidade dos microrganismos contendo o gene procurado. Geralmente

essas técnicas são acopladas com a reação de PCR para amplificar seqüências que não são

abundantes. Os produtos de PCR amplificados podem ser examinados utilizando técnicas,

como o DGGE e o TGGE, que detectam substituições únicas na seqüência de nucleotídeos

(Schneegurt-Mark & Kulpa-Chaler, 1998).

O DGGE e o TGGE são métodos pelos quais fragmentos de DNA do mesmo

tamanho, mas que apresentam seqüências diferentes, podem ser separados por eletroforese

(Muyzer, 1999). A separação é baseada no decréscimo da mobilidade eletroforética da

dupla fita desnaturada parcialmente em géis de poliacrilamida contendo um gradiente linear

de agentes desnaturantes (uma mistura de uréia e formamida) ou um gradiente linear de

temperatura (Muyzer,Waal & Uitterlinden, 1993). Estas técnicas são importantes na

separação e identificação de produtos de PCR amplificados que possam ter o mesmo

tamanho, porém pequenas diferenças nas seqüências nucleotídicas e são freqüentemente

utilizadas para avaliar a diversidade microbiana em amostras ambientais (Schneegurt-Mark

& Kulpa-Chaler, 1998).

Um estudo realizado por Watanabe e colaboradores (1998) usou uma combinação

de métodos microbiológicos e moleculares para detectar e caracterizar as bactérias

degradadoras de fenol em lodo ativado. As análises de TGGE dos produtos da PCR do gene

rrs (que codifica o rRNA 16S) e do gene que codifica a fenol hidroxilase (LmPH)

demonstraram poucas populações bacterianas dominantes após 20 dias de incubação

28

utilizando fenol como fonte de carbono. Comparações das seqüências de isolados

bacterianos diferentes e de bandas extraídas do gel de TGGE revelaram duas espécies

bacterianas dominantes responsáveis pela degradação do fenol.

A análise do polimorfismo do tamanho dos fragmentos terminais (T-RFLP) é um

método que também contribui para o rastreamento dos microrganismos degradadores de

hidrocarbonetos e muitos estudos utilizando esta técnica já foram utilizados com este

propósito. O T-RFLP mede o polimorfismo dos fragmentos de restrição terminais de um

marcador de PCR amplificado. A digestão subseqüente com endonucleases selecionadas

produz fragmentos terminais apropriados que são separados por tamanho, com uma alta

resolução (+ 1 base), em géis de seqüênciamento (Marsh, 1999).

Em 2001, Watts e colaboradores fizeram uma análise comparativa de comunidades

degradadoras de PCB (bifenilas policloradas) em culturas de enriquecimento utilizando três

técnicas diferentes de ‘screening’ molecular: ARDRA, DGGE e T-RFLP. Eles concluíram

que a interpretação dos resultados apresentados pelos diferentes métodos era realizada de

modos distintos, porém todos estes métodos foram úteis para a análise qualitativa e

identificaram o mesmo microrganismo, sendo considerado o DGGE o mais rápido e

eficiente para o monitoramento dos microrganismos de uma cultura enriquecida.

Outra técnica que pode ser aplicada na investigação da comunidade degradadora de

hidrocarbonetos presente em locais que sofreram derrame de óleo é a hibridização de

sondas com genes microbianos envolvidos no catabolismo dos contaminantes. Estas sondas

são desenhadas a partir de genes específicos envolvidos nas etapas enzimáticas chave das

vias microbianas de degradação de poluentes ambientais e podem ser usadas para examinar

tanto ambientes virgens quanto ambientes contaminados (Atlas et al., 1992; Greer et al.,

2001). Margesin e colaboradores (2003) verificaram a prevalência de sete genótipos

29

(Pseudomonas putida Gpo1 alkB, Acinetobacter spp. alkM, Rhodoccocus spp. alkB1,

Rhodoccocus spp. alkB2, P. putida xylE, P. putida ndoB e Mycobacterium sp. estirpe

PYR-1nidA) envolvidos na degradação de n-alcanos, hidrocarbonetos aromáticos e HPAs

(hidrocarbonetos aromáticos policíclicos) em solos Alpinos Europeus virgens e

contaminados com óleo, através de ensaios de PCR combinados à hibridização com as

sondas específicas alkB, alkM, alkB1, alkB2, xylE, ndoB e nidA.

A análise das variações que ocorrem na população de um local contaminado pelos

métodos descritos acima, acompanhada por uma mudança na função de uma comunidade,

auxilia na identificação das populações funcionalmente dominantes (Bond et al., 1995;

Borneman & Triplett, 1997). Entretanto, os pesquisadores têm enfatizado que experimentos

de cultura pura são indispensáveis para a análise detalhada das funções de cada população e

que o isolamento das populações funcionalmente dominantes em uma comunidade

microbiana é muito importante (Watanabe et al., 1998).

Portanto, é válido ressaltar que os métodos microbiológicos clássicos combinados

aos métodos moleculares contribuem para uma melhor avaliação da comunidade

microbiana do local estudado e sua resposta aos processos de biorremediação utilizando-se

o bioaumento, a bioestimulação e/ou atenuação natural (Brockman, 1995).

30

JUSTIFICATIVA

O campo petrolífero de Carmópolis, em Sergipe, foi descoberto em 1963, e

representa a maior acumulação de óleo bruto em terra da Petrobras. Devido a sua grande

importância econômica, a Diretoria Executiva da Petrobras aprovou, em dezembro de 2006,

o investimento de US$ 314 milhões no campo de Carmópolis, visando o aumento da

produção diária atual. Os investimentos consistem em aumentar os níveis de injeção de

água, e em aumentar, centralizar e racionalizar as instalações de injeção, produção e

tratamento (www.petrobras.com.br).

Em agosto de 2004, durante o processo de recuperação secundária do petróleo no

campo de Carmópolis (SE), na área de Panelas, ocorreu um derrame acidental que

acarretou a destruição da área atingida (perda da flora/fauna original) pela contaminação do

solo com uma mistura, na proporção de 1:3, de óleo e água de produção. A presença dessa

água de produção é um problema adicional na contaminação com óleo, pois a mesma

contém uma grande quantidade de sal (em torno de 7%).

Considerando-se que a biodegradação é um processo eficiente na descontaminação

de ambientes poluídos com óleo, a prospecção de novas estirpes bacterianas provenientes

do derrame de petróleo e água de produção neste local, que sejam eficientes na degradação

de hidrocarbonetos e resistentes a elevadas concentrações de sal, é de suma importância.

Entretanto, até o início deste trabalho, não haviam sido realizados estudos (na área

destruída) para analisar as populações que apresentassem estas características.

Apesar das técnicas microbiológicas tradicionais (ex: plaqueamento, isolamento de

diferentes morfotipos coloniais e identificação dos isolados por testes bioquímicos) serem

usadas com grande sucesso na caracterização de espécies microbianas isoladas, elas não são

31

consideradas suficientes, pois apenas uma pequena fração (aproximadamente 1 a 10%) dos

microrganismos presentes no ambiente pode ser isolada e caracterizada. A grande maioria é

considerada não cultivável. Além disso, sabe-se pouco a respeito do que realmente ocorre

com a comunidade microbiana do ambiente ao longo do processo de contaminação e

degradação do óleo, e quais as populações que permanecem e/ou são selecionadas nestas

novas condições.

Sendo assim, os dados que foram gerados durante o presente estudo, combinados

com informações como: o tipo de solo, o tipo de óleo e a salinidade da água de produção

que contaminaram o local, são importantes para definir com mais precisão o melhor

processo de biorremediação a ser implementado.

32

OBJETIVOS

Este projeto teve como objetivos (i) estudar a estrutura da comunidade bacteriana

(cultivável e não cultivável) de Panelas, no campo petrolífero de Carmópolis (SE),

comparando-se as populações das áreas contaminadas pelo derrame de óleo com a área

controle (sem contaminação) através de métodos moleculares, (ii) isolar estirpes halofílicas

e/ou halotolerantes com capacidade de degradar óleo que possam apresentar uma possível

aplicação na biorremediação do solo contaminado.

Etapas do projeto

I. Avaliação direta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo

através de métodos moleculares:

� Extração mecânica do DNA total do solo (amostras de três diferentes pontos da

contaminação e amostra controle)

� Amplificação via PCR da região codificadora do rRNA 16S da comunidade

bacteriana presente nas amostras coletadas na região impactada e controle

� Análise, através da técnica de DGGE, da variação dos perfis das comunidades dos

diferentes locais de coleta, para verificar o impacto na diversidade bacteriana

gerado pelo derrame de óleo e água de produção

� Extração, clonagem e seqüenciamento de bandas importantes do gel de DGGE

para a identificação das populações alteradas (selecionadas ou extintas) nos três

pontos analisados.

33

II. Avaliação indireta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo

através de:

� Pré-enriquecimento em meio Bushnell-Haas (preparado com água destilada ou

água de produção utilizada na extração de petróleo em Panelas-SE) contendo o

óleo extraído na região de Panelas (SE) como única fonte de carbono

� Isolamento de estirpes bacterianas

� Seleção de diferentes morfotipos

� Teste de degradação de óleo (na presença e na ausência de água de produção

utilizada na extração de petróleo em Panelas-SE)

� Identificação fenotípica das estirpes de interesse (ex: coloração de Gram e curva

de halofilia)

� Identificação molecular das estirpes de interesse através da amplificação da região

codificadora do rRNA 16S via PCR, seguida da análise de restrição do DNA

ribossomal amplificado, clonagem dos produtos de PCR de cada grupo

geneticamente distinto, extração plasmidial dos transformantes e seqüenciamento

� Teste de antagonismo entre as estirpes halotolerantes e degradadoras de óleo

isoladas neste estudo.

34

MATERIAIS E MÉTODOS

1.Amostragem

Como explicado anteriormente, em 2004, em Panelas (área localizada no campo

petrolífero de Carmópolis – SE), um acidente aconteceu devido ao rompimento de uma

tubulação utilizada durante a recuperação secundária do petróleo. A tubulação rompida

passava por um local apresentando um pequeno declive. Portanto, a mistura do óleo e água

de produção migrou a partir do ponto mais alto (origem da contaminação), passando pela

região de maior inclinação, e acumulou-se na região mais baixa (onde o declive diminui).

Como a região contaminada apresentava estes pontos com diferentes concentrações da

mistura de óleo e água de produção, foram coletadas três amostras de solo do local

impactado, em três pontos diferentes a partir do ponto de origem do derrame. A primeira

amostra foi retirada no ponto mais alto (Ponto 1 - início da contaminação), a segunda no

ponto intermediário (Ponto 2 - por onde os contaminantes passaram) e a terceira no ponto

mais baixo onde a mistura água de produção e óleo pôde atingir e ficar acumulada (Ponto

3). De cada ponto, foram coletadas, com o auxílio de espátulas estéreis, três amostras de

aproximadamente 150 g cada e estas foram misturadas em sacos estéreis para dar origem a

uma amostra composta de aproximadamente 500 g de solo. Estas amostras de solo foram

coletadas até 20 cm de profundidade a partir da superfície. A distância entre os pontos de

coleta estudados (pontos 1, 2, 3 e controle) variou de 10 a 20 m. As amostras de solo foram

transportadas para o Rio de Janeiro de avião em isopor contendo gelo. As amostras de solo

foram estocadas no freezer imediatamente após o seu recebimento a -20°C. O esquema do

local contaminado e os pontos de coletas das amostras de solo encontram-se na figura 1.

35

Além disso, foi feita uma amostragem do solo não contaminado (sem água de

produção e óleo), utilizado neste estudo como o controle negativo. Todas as amostras foram

recolhidas 8 meses após o incidente e tanto as amostras de solo contaminadas com óleo e

água de produção quanto a amostra de solo controle foram mantidas no freezer a -20 °C. As

figuras 2 e 3 representam, respectivamente, o local de Panelas de onde foi coletado o solo

controle e a região contaminada pela mistura de poluentes onde foi coletada a amostra de

solo do ponto 3.

Figura 1 – Migração da mistura de óleo e água de produção pela

região de declive a partir do local do derrame.

Local do Derrame

Figura 2 – Área não contaminada. Local

onde a amostra de solo controle foi coletada

Figura 3 – Área contaminada. Local onde

a amostra de solo do ponto 3 foi coletada

36

2.Meios de cultura

2.1. Para seleção de microrganismos

2.1.1. Bushnell-Haas (Difco) pH 7,0

Sulfato de Magnésio 0,2 g

Cloreto de Cálcio 0,02 g

Fosfato de Monopotássio 1 g

Fosfato de hidrogênio diamônio 1 g

Nitrato de potássio 1 g

Cloreto Férrico 0,05 g

Água destilada / Água produzida * (q.s.p.) 1000 ml

*Água produzida utilizada na extração de petróleo em Panelas (SE)

2.2. Para isolamento de estirpes degradadoras e/ou halotolerantes

As estirpes foram semeadas em seis meios distintos: LB (‘Luria-Bertani Broth’;

Schleif & Wensink,1981), LB acrescido de 7% de NaCl, TBN (Seldin & Penido, 1986),

TBN acrescido de 7% de NaCl, TSB (‘Trypticase Soy Broth’ – Difco) e TSB acrescido de

7% de NaCl. As estirpes foram estocadas em tubos de agar inclinado contendo o meio no

qual foram isoladas.

2.2.1. Meio LB (‘Luria-Bertani Broth’) pH 7,2

37

2.2.2. Meio TBN (Tiamina/Biotina/Nitrogênio) pH 7,2

Glicose 10 g

Extrato de Levedura 1 g

MgSO4 .7 H2O (10% em H2O) 2 ml

Tiamina (0,1% em H2O) 1 ml

Biotina (0,1% em H2O) 1 ml

Solução de Micronutrientes 1 ml

NaOH, 2N 2 ml

Azul de bromotimol (0,5% em etanol) 1 ml

Água destilada q.s.p. 1000 ml

A solução de micronutrientes foi preparada em água destilada contendo H3BO3 a

0,29%, ZnSO4.7H2O a 0,022%, MnCl2.4H2O a 0,18% e CuSO4.5H2O a 0,008%. Após a

autoclavação a 121°C por 15 min, foi adicionado ao meio uma solução de K2HPO4 a 8%,

pH 8,0, na proporção de 10 ml/l (1% do volume do meio).

Triptona 10 g

Extrato de levedura 5 g

NaCl 5 g


38

2.2.3. Meio TSB (‘Trypticase Soy Broth’ – Difco) pH 7,3

Trypticase Soy Broth 30 g


Para a confecção dos meios LB/ NaCl 7%, TSB/ NaCl 7% e TBN/ NaCl 7% , os

meios LB, TSB e TBN, respectivamente, foram acrescidos de 70 g de NaCl e, então,

avolumados para 1000 ml.

Para a solidificação dos meios de cultura, foram acrescentados 12 g de ágar para

cada 1000 ml de meio.

3.Soluções

3.1. Solução de Acrilamida/ Bis-acrilamida 40%

Acrilamida 38,93 g

Bis-acrilamida 1,07 g

Água Milli-Q q.s.p. 100 ml

A acrilamida foi dissolvida em 30% do volume final de água Milli-Q. A bis-

acrilamida foi acrescentada aos poucos, e o volume completado com água Milli-Q. A

39

solução foi filtrada em membrana Millipore de 0,45 µm e estocada a 4°C em frasco

âmbar.

3.2. Solução corante de corrida para eletroforese de DNA em gel de agarose

Glicerol 50 ml

EDTA, pH 7,5 20 mM

Azul de bromofenol 0,05 g

Xileno cianol 0,05 g


3.3. Solução corante de corrida para DGGE

Glicerol 70% (v/v)

Azul de bromofenol 0,05% (p/v)

Xileno cianol 0,05% (p/v)


40

3.4. Solução corante de gradiente para DGGE

Azul de bromofenol 0,5% (p/v)

Xileno cianol 0,5% (p/v)

Tampão TAE 50x 2 ml


3.5. Solução 0% desnaturante – gel de acrilamida 6%

Solução de Acrilamida/Bis-acrilamida 40% 15 ml



A solução foi filtrada em membrana Millipore de 0,45 µm e estocada a 4°C em

frasco âmbar.

3.6. Solução 100% desnaturante– gel de acrilamida 6%

Solução de Acrilamida/Bis-acrilamida 40% 15 ml


Formamida deionizada 40 ml

Uréia 42 g


41

A solução foi filtrada em membrana Millipore de 0,45 µm e estocada a 4°C em

frasco âmbar.

3.7. Solução de persulfato de amônio

A solução de persulfato de amônio foi preparada em água Milli-Q em uma

concentração final de 100 mg/ml e estocada a -20°C.

3.8. Solução de formamida deionizada

Resina AG501-X8 da (Bio-Rad) 5 g

Formamida 100 ml

A resina foi adicionada à formamida e colocada sob agitação em placa por

aproximadamente 1 h. Em seguida, a solução foi filtrada em papel de filtro Whatman n° 4 e

estocada em frasco âmbar a temperatura ambiente.

42

4.Tampões

4.1. Tampão TAE 50x

Tris 2M

Ácido acético glacial 1M

EDTA 0,5 M pH 8,0 50 mM

pH 7,8

4.2. Tampão TEB

Tris 89 mM

EDTA 2,5 mM

H3BO3 89 mM

pH 7,8

43

5.Avaliação direta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo e

água de produção

5.1. Extração de DNA total da comunidade microbiana

Triplicatas de 0,5 g de solo dos diferentes pontos e do solo controle foram

submetidas ao método direto de extração de DNA total através de lise mecânica. Para tal,

foi utilizado o “kit” de extração de DNA para solo (FastDNA Spin Kit for Soil) da

BIO101 (Califórnia, EUA).

As triplicatas de DNA extraídas do solo de cada amostra foram aplicadas a um gel

de agarose 0,8% (p/v) em tampão TEB (Tris-EDTA-ácido bórico) para a realização de uma

eletroforese horizontal. Foi utilizada uma corrente elétrica de 8 V por cm em tampão TEB,

durante aproximadamente 2 horas, com o objetivo de analisar a pureza e qualidade das

amostras de DNA extraídas. As amostras foram misturadas a uma solução corante para

eletroforese de DNA em gel de agarose na proporção de 1:3 antes da aplicação no gel. O

marcador de peso molecular utilizado foi o “1Kb Plus DNA Ladder” (Promega ).

Ao final da corrida eletroforética, o gel foi incubado à temperatura ambiente durante

aproximadamente 20 minutos em uma solução de brometo de etídio (2 µg/ml) para ser

corado e, em seguida, observado e fotografado sob luz UV no sistema de análise de

imagens IMAGO (B &L, Holanda).

44

5.2. Amplificação do gene que codifica o rRNA 16S por PCR

Os fragmentos do DNA ribossomal 16S, amplificados a partir das amostras de DNA

total extraídas do solo, foram obtidos através da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)

usando um par de iniciadores baseados no gene de E. coli, sendo o U968f-GC1 (grampo

GC + 5’ ACC GCG AAG AAC CTT AC 3’) homólogo à região 968-984 do gene para

rRNA 16S e o L1401r (5’ GCG TGT GTA CAA GAC CC 3’) homólogo à região 1384-

1401 do mesmo gene (Heuer & Smalla, 1997). As reações de amplificação foram realizadas

em tubos, com o volume final de 50 µl, contendo uma mistura de tampão da enzima Taq-

polimerase 1x [10 mmol de tampão Tris-HCl (pH 8,3) e 10 mmol de KCl], 5 mM de

MgCl2, 200 µmol de cada desoxinucleotídeo trifosfato (dNTP), 20 ρmol de cada iniciador,

5 µg de BSA, 2,5 U da enzima Taq-polimerase, 1µl (50 a 100 ng) de DNA e água Milli-Q

estéril. O ciclo aplicado foi: um ciclo de desnaturação de 3 min a 94°C, seguido de 35

ciclos de 1 min a 94°C, 1 min e 30 s a 55°C e 1 min a 72°C e da extensão a 72°C por 10

min (Heuer & Smalla, 1997).

Para confirmar se o rDNA foi efetivamente amplificado na reação de PCR, os

fragmentos obtidos foram aplicados em gel de agarose 1,2% (p/v) em tampão TEB para a

realização de uma eletroforese horizontal. Foi utilizada uma corrente elétrica de 8V por cm

em tampão TEB durante aproximadamente 2 horas. Os produtos de PCR foram misturados

a uma solução corante para eletroforese de DNA em gel de agarose na proporção de 1:3

antes da aplicação no gel. O marcador de peso molecular utilizado foi o “1Kb Plus DNA

Ladder” (Promega).

45

Ao final da corrida eletroforética, o gel foi incubado à temperatura ambiente

durante, aproximadamente, 20 minutos em uma solução de brometo de etídio (2 µg/ml)

para ser corado e, em seguida, observado e fotografado sob luz UV no sistema de análise de

imagens IMAGO (B&L, Holanda).

5.3. Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE)

Para estimar e avaliar a estrutura da comunidade bacteriana presente nos solos dos

pontos 1, 2, 3 e controle, foi realizada a eletroforese em gradiente de gel desnaturante

(DGGE) dos produtos do PCR- rDNA 16S obtidos.

Os fragmentos de PCR preparados com grampos GC foram separados em um gel de

poliacrilamida 6%, com um gradiente linear de 40-70% dos agentes desnaturantes uréia e

formamida (100% de desnaturantes correspondem a 7 M de uréia e 40% de formamida

deionizada). Foram aplicados 20 µl da amostra de PCR, adicionada de 10 µl de corante de

corrida para DGGE, em cada poço do gel e a corrida foi realizada a 60°C no sistema

“Dcode Universal Mutation Detection System” da Bio-Rad (Richmond, USA) a 75 V por

aproximadamente 16 h. O gel foi corado por aproximadamente 40 min com SYBR Green I

(Molecular Probes) na ausência de luz, exposto à luz UV e digitalizado em sistema IMAGO

(B&L).

46

5.4. Análise estatística dos perfis de DGGE

Os perfis de bandas obtidos nos géis de DGGE foram analisados com o auxílio do

programa “Image Quant” a partir da imagem digitalizada pelo sistema IMAGO (B&L).

Para a comparação entre as bandas presentes nas diferentes amostras, foram construídas

matrizes baseadas na presença e ausência de bandas nos perfis de DGGE. A partir destas

matrizes, foram construídos dendrogramas através do “software” NTSYS – 2.02,

utilizando-se o coeficiente de similaridade de Pearson e o método UPGA.

5.5. Clonagem e seqüênciamento do DNA presente nas bandas de DGGE

Bandas importantes do gel de DGGE foram retiradas do gel com o auxílio de

ponteiras estéreis e os DNAs presentes nas bandas foram eluídos em 50 µl de água

destilada estéril a 4°C durante uma noite. Foi realizado, posteriormente, o DGGE das

amostras dos DNAs obtidos a partir das bandas eluídas, que foram reamplificadas por PCR

nas mesmas condições descritas anteriormente. Os produtos de PCR que apresentaram

bandas individuais foram purificados com a utilização do kit de purificação comercial

“WizardTM Rapid PCR Purification System” (Promega®). Posteriormente, 3 µl dos

produtos purificados foram então ligados ao vetor pGEM-T Easy, a 4ºC durante uma noite,

segundo as recomendações do fabricante do kit “pGEM-T Easy Vector Systems”

(Promega®). Em seguida, células competentes de Escherichia coli JM109 foram

transformadas de acordo com as instruções do mesmo fabricante. Após a transformação, as

células foram mantidas em meio LB por 1,5 h, a 37ºC sob agitação. Uma quantidade de 70

47

µl de cada cultura foi semeada em placas contendo meio LB com ampicilina (100 µg/ml),

nas quais foram previamente espalhados sobre a superfície 100 µL da solução de IPTG (24

µg/ml) e 20 µL da solução de X-gal (50 mg/ml). Em seguida, as placas foram incubadas a

37ºC por 24 horas. Após este período as colônias brancas (contendo os insertos de rDNA

16S) foram selecionadas. Para a confirmação da presença do inserto nos clones, foi feita

uma reação de PCR diretamente da colônia, utilizando-se os iniciadores M13f (5’ GTA

AAA CGA CGG CCA G 3’) e M13r (5’ CAG GAA ACA GCT ATG AC 3’). Após a

confirmação, os produtos da reação foram seqüenciados em um seqüenciador automático

ABI Prism 3100. O seqüenciamento foi realizado por membros da EMBRAPA/CNPMS,

Sete Lagoas, MG.

5.6. Análise das seqüências clonadas

Após o seqüenciamento dos clones, as seqüências obtidas foram comparadas com as

presentes no GenBank e foi feita a análise filogenética para a determinação dos parentes

evolucionários mais próximos das seqüências parciais do gene que codifica o rRNA 16S.

Para tal, foi realizada uma busca no Banco de Dados (GenBank) usando-se o programa

BLAST (Altschul et al., 1997).

48

6.Avaliação indireta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo

e água de produção

6.1. Isolamento de bactérias halofílicas ou halotolerantes degradadoras de

hidrocarbonetos

Para isolar bactérias degradadoras de óleo halotolerantes ou halofílicas, 5 g de solo

das amostras dos pontos 1, 2 e 3 foram adicionados, separadamente, em Erlenmeyers

contendo 45 ml de meio Bushnell-Haas preparado com água de produção (a mesma

utilizada na recuperação secundária de petróleo na área de Panelas) ou água destilada e

suplementado com aproximadamente 500 µl de óleo extraído no campo petrolífero de

Carmópolis (SE). Esses sistemas foram incubados durante 7 dias e sob agitação a 28°C.

Ao término do período de incubação, foi feita outra cultura de enriquecimento. Para

tal, 1 ml proveniente do enriquecimento com água de produção ou água destilada de cada

local foi adicionado em diferentes Erlenmeyers contendo meio Bushnell-Haas, preparado

com água de produção ou água destilada, suplementado com 500 µl de óleo extraído na

região de Carmópolis (SE). Esses sistemas foram incubados também durante 7 dias e sob

agitação a 28°C.

Concluídas as etapas de enriquecimento, cada amostra foi plaqueada em seis

diferentes meios de cultura: TSB, TSB + 7% de NaCl, LB, LB + 7% de NaCl, TBN e TBN

+ 7% de NaCl. As amostras plaqueadas nos dois últimos meios foram pasteurizadas (a

80°C/ 10 min) para selecionar bactérias formadoras de endósporos. Todas as placas de Petri

foram incubadas a 32°C por 48-72 h.

49

Após o período de incubação, as colônias crescidas nos diferentes meios,

provenientes de cada ponto, foram testadas em relação ao potencial de degradação e

halotolerância. Aquelas que apresentaram o perfil desejado foram identificadas fenotipica e

genotipicamente.

6.2. Teste de degradação de hidrocarbonetos

Após o isolamento das colônias de cada ponto do local contaminado nos diferentes

meios foi realizado o teste de degradação de óleo em microplacas de 24 poços. Em cada

poço foram adicionados: 1800 µl de meio Bushnell-Haas (preparado em água destilada),

200 µl da cultura da amostra bacteriana a ser testada e 20 µl de óleo. Sistemas semelhantes

foram feitos utilizando 1800 µl do meio Bushnell-Haas preparado com água de produção,

200 µl da cultura da estirpe a ser testada e 20 µl de óleo a fim de testar também a

halotolerância das estirpes isoladas.

6.3. Testes fenotípicos

As estirpes isoladas com capacidade de degradar hidrocarbonetos e capazes ou não

de tolerar a salinidade da água de produção foram identificadas fenotipicamente através da

coloração de Gram e da curva de halofilia.

Para a realização da curva de halofilia foi testada a capacidade das amostras

isoladas de crescer em concentrações diferentes de NaCl. Para tal, as amostras pré-

selecionadas de acordo com a capacidade de degradar óleo foram crescidas inicialmente em

50

5 ml de meio LB, que contém 0,5% de NaCl, durante 48 h a 32°C para a obtenção do pré-

inóculo. Em seguida, 100 µl do pré-inóculo foram transferidos para tubos de ensaio

contendo 5 ml do meio LB com diferentes concentrações de NaCl ( 2; 4; 5,5; 7; 10; 12; 15 e

17 %) e incubados a 32°C/ 48h. A turvação do meio observada após o período de incubação

foi interpretada como crescimento positivo da amostra testada. Todas as amostras

selecionadas para este experimento foram comparadas com um controle negativo

representado por um tubo de ensaio contendo somente o meio LB na concentração de NaCl

a ser testada, incubado sob as mesmas condições de tempo e temperatura das amostras.

6.4. Análise da restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA)

Além dos testes fenotípicos, foi realizada uma análise da diversidade entre as

estirpes selecionadas através da análise da restrição do DNA ribossomal amplificado

(ARDRA). Para isso, o DNA dessas estirpes foi extraído de acordo com Seldin & Dubnau

(1985). Em seguida, o gene que codifica o rRNA 16S (gene rrs) de cada estirpe foi

amplificado utilizando-se os iniciadores universais pA (5’AGA GTT TGA TCC TGG

CTC AG 3’) e pH (5’ AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA 3’) descritos por Massol-

Deya e colaboradores (1995).

Cada reação foi realizada em um volume final de 50 µl em tubo contendo 10 µl do

tampão de PCR 10x da Promega, 1,5 mM de MgCl2, 1,5 mM de cada um dos quatro

desoxinucleotídeos trifosfatados, 1 µM de cada iniciador, 2,5 U de Taq DNA polimerase,

1 µl de DNA e água bidestilada estéril q.s.p. 50 µl. O ciclo aplicado foi: 1x (2 min a

51

94°C); 35x (1 min e 10 seg a 92°C; 30 seg a 48°C; 2 min e 10 seg a 72°C); 1x (2 min a

72°C) ; 4°C.

Após a amplificação, a digestão dos produtos de PCR foi feita com as seguintes

enzimas de restrição: HinfI, HaeIII e RsaI. Os produtos foram incubados com as enzimas

por 24 h na temperatura ótima de cada enzima, conforme o protocolo do fabricante.

Transcorrido o tempo de incubação, foi realizada uma eletroforese em gel de agarose

1,4% do produto da digestão por 4 h a 80 V.

Ao final da corrida eletroforética, o gel foi incubado à temperatura ambiente

durante, aproximadamente, 20 minutos em uma solução de brometo de etídio (2 µg/ml)

para ser corado e, em seguida, observado e fotografado sob luz UV no sistema de análise de

imagens IMAGO (B&L, Holanda).

A partir do perfil de restrição das bandas foi construída uma matriz de presença e

ausência. Esta matriz deu origem a um dendrograma, através do auxílio do “software”

NTSYS – 2.02, para permitir a visualização de grupos distintos entre as amostras de cultura

pura.

7.Teste de antagonismo

Para verificar se as amostras bacterianas halotolerantes degradadoras de óleo, que

foram isoladas a partir do solo contaminado de Panelas, eram capazes de produzir

substâncias antimicrobianas que pudessem ocasionar a inibição umas das outras foi

realizado o teste de antagonismo. Para tal, ao menos uma amostra bacteriana de cada grupo

foi crescida por 48 h a 32°C em 5 ml de meio LB líquido. Em seguida, foram feitos ‘spots’

52

de 5 µl das amostras a serem testadas como produtoras de substâncias antimicrobianas em

placas de Petri de vidro contendo meio LB sólido. Então, após a incubação durante 48 h a

32°C, as bactérias foram mortas com vapor de clorofórmio colocando-se algodões

embebidos em clorofórmio durante 20 minutos na tampa das placas inoculadas. Decorridos

os 20 minutos, os algodões foram retirados e as placas ficaram abertas durante 15 minutos

para que o clorofórmio evaporasse completamente.

Na etapa seguinte, 3 ml do meio LB semi-sólido (0,6% de agar) foi adicionado de

200 µl da amostra bacteriana indicadora previamente crescida e vertido sobre as placas de

Petri contendo os ‘spots’ das bactérias mortas. Posteriormente, estas mesmas placas foram

incubadas durante 48 h a 32°C e foi observada a formação de halos de inibição quando a

estirpe indicadora foi inibida pela amostra produtora da substância antimicrobiana que se

difundiu no ágar.

8.Análise das diferentes amostras do solo

Para estabelecer uma correlação entre o nível de contaminação e a prevalência de

diferentes populações bacterianas foi realizado o teste dos hidrocarbonetos totais do

petróleo (TPH) utilizando as amostras de solo de cada um dos três pontos da região

contaminada de Panelas (Carmópolis – SE). Os testes de TPH foram realizados por

membros da EMBRAPA solos e do CENPES/ Petrobras. Além disso, testes de

caracterização do solo (classe textural, micronutrientes, fertilidade e os teores totais de

diversos elementos) foram realizados por membros do Laboratório de Análise de Solo,

Planta e Resíduos (LABFER) no Departamento de Solos da Universidade Federal Rural do

Rio de Janeiro.

53

RESULTADOS

Inicialmente, foram realizadas as análises do solo do local afetado pelos poluentes.

Esta avaliação foi importante para correlacionar a presença da mistura de óleo cru com

água de produção no solo de Panelas com as mudanças ocorridas na diversidade da

comunidade bacteriana do local.

1.Análise das diferentes amostras do solo

Para quantificar o óleo presente nas amostras de solo dos pontos 1, 2 e 3 e do solo

controle foi realizada a dosagem dos Hidrocarbonetos Totais do Petróleo (TPH) por

membros do CENPES/ Petrobras. O solo do ponto 3 foi aquele no qual a maior

concentração de hidrocarbonetos foi detectada e o controle apresentou as menores

concentrações do poluente. Os valores de TPH de cada amostra de solo podem ser

observados na Tabela 2.

Local TPH 2 (ppm)

Controle 81,3

Ponto 1 182,0

Ponto 2 259,2

Ponto 3 285,0

Tabela 2 – TPH das amostras de solo dos diferentes pontos e controle.

54

Além disso, o solo da região de Panelas foi caracterizado, por membros da

EMBRAPA solos, quanto à sua classe textural como franco-argiloarenoso tendo como base

as porcentagens de areia, silte argila total e argila natural (Tabela 3).

Outras características analisadas foram: micronutrientes (Tabela 4), os teores totais

de diversos elementos (Tabela 5) e fertilidade (Tabela 6) do solo de Panelas (Carmópolis –

SE).

Componentes %

Areia 66

Silte 12

Argila total 22

Argila natural 7

Elementos Micronutrientes (mg/kg)

Fe 312

Cu 0,8

Zn 2

Mn 3,8

Tabela 3 – Análise dos componentes do solo

Tabela 4 – Teores trocáveis - Micronutrientes do solo de Panelas (SE)

55

Elementos g/kg

N 3,18

P2O5 0,69

P 0,3

K2O 1,2

K 1

Ca 1,04

Mg 0,63

Fe 5,52

Cu 0,004

Zn 0,016

Mn 0,020

Tabela 5 – Teores totais dos elementos presentes no solo de Panelas (SE)

56

pH do solo: 4,6

Elementos Cmolc/ dm³ mg/l %

Na 0,17 - -

Ca 2,7 - -

Mg 1,2 - -

K 0,22 - -

H+Al 8,5 - -

Al 0,3 - -

S 4,29 - -

T 12,79 - -

V - - 34

P - 6 -

K - 86 -

Carbono orgânico - - 2,53

Saturação por Al - - 2,345

Saturação por Na - - 1

Tabela 6 – Fertilidade do solo de Panelas (SE)

57

2. Avaliação direta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo e

água de produção

2.1. Avaliação da estrutura da comunidade bacteriana presente nos solos através

da técnica de DGGE

Como descrito anteriormente, foram realizadas: a extração direta de DNA dos solos

(com e sem contaminação), a amplificação do material genético obtida com iniciadores

universais para o gene que codifica o rRNA 16S e a eletroforese em gel de gradiente

desnaturante (DGGE) para a comparação da diversidade bacteriana existente entre as

comunidades das amostras de solo dos pontos 1, 2 e 3 e do solo controle (Figura 4).

58

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Figura 4 – Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) para avaliação das

comunidades bacterianas presentes nos solos. Solo controle [2, 3 e 4], solos dos pontos 1

[5, 6 e 7], 2 [8, 9 e 10] e 3 [11, 12 e 13]. Kb Ladder [1 e 14]. As setas indicam as bandas

que foram cortadas para posterior seqüenciamento.

1

2

3

4

5

6

59

Através da visualização dos perfis de bandas apresentados no DGGE (Figura 4) é

possível observar que as comunidades bacterianas dos solos contaminados variaram em

relação às do solo controle. Além disso, no mesmo gel, nota-se o desaparecimento de

algumas bandas, bem como a seleção de outras.

As bandas 1 e 3, apresentadas na figura 4, foram cortadas do gel de DGGE e

eluídas. Os DNAs eluídos a partir das bandas foram amplificados através de PCR utilizando

o par de iniciadores pA e pH e os produtos obtidos foram clonados em vetor pGEM-T Easy

e seqüenciados. Em seguida, as seqüências obtidas foram comparadas a seqüências pré-

existentes no GenBank e com o auxílio do programa BLAST foi realizada a análise

filogenética para identificação do parente evolucionário mais próximo.

A banda 1 apresentou uma similaridade de 98% com Paenibacillus sp. Esta banda

foi também observada no perfil de DNA amplificado das triplicatas da amostra de solo

controle, no qual não havia o impacto da mistura de óleo e água de produção. Entretanto,

esta mesma banda não foi detectada nos perfis das amostras dos solos de diferentes pontos

de contaminação.

A banda 3 apresentou similaridade de 93% com Frankia sp. sendo detectada nos

perfis das amostras de solo dos pontos 1 e 2, que apresentaram respectivamente,

concentrações de TPH (Tabela 2) equivalentes a 182 ppm e 259,2 ppm. Entretanto, a banda

3 não apareceu nos perfis das triplicatas da amostra de solo do ponto 3 e nem nos perfis da

amostra do solo controle.

As bandas 2, 4, 5 e 6 encontram-se em fase de seqüenciamento e, portanto, ainda não

foram identificadas. Apesar disso, é possível observar na Figura 2, que as bandas 2 e 4

estão presentes nos perfis das amostras do solo controle e dos solos dos pontos 1 e 2,

desaparecendo, entretanto, nos perfis das amostras do solo 3. Já a banda 5 pôde ser

60

observada nos perfis das amostras de solo dos pontos 2 e 3 e a banda 6 aparece somente nos

perfis das triplicatas da amostra de solo do ponto 3.

2.2. Análise estatística dos perfis de DGGE

Com base nos perfis de DGGE das comunidades bacterianas de cada ponto de coleta,

utilizando 21 marcadores correspondentes ao número de bandas diferentes encontradas no

gel, foi construído um dendrograma (figura 5) no qual foi possível observar que as

triplicatas de cada ponto são mais próximas entre si formando subgrupos. O ponto 3

apresentou uma comunidade menos diversa o que pôde ser observado no perfil das

amostras do ponto 3, que apresentaram um menor número de bandas e agruparam-se, no

dendrograma, separadamente das amostras do controle e do ponto 1. O ponto 2 foi aquele

que apresentou amostras com o maior número de bandas e, por tal razão foi o que ficou

mais distante dos outros perfis apresentando maior diversidade. Vale ressaltar, que o ponto

2 foi o local de coleta onde o terreno era inclinado e que, possivelmente, este ponto ficou

menos tempo sob a influência dos contaminantes. Assim, a presença de um maior numero

de bandas nos perfis da amostra do ponto 2 em relação aos demais perfis pode estar

relacionado a esta característica física do local.

61

Figura 5 – Dendrograma construído pelo método de UPGA. A escala representa

o coeficiente de similaridade de Pearson, baseando-se na presença e na ausência

de bandas nos perfis de DGGE das comunidades bacterianas presentes no solo

controle e nos solos dos pontos 1, 2 e 3.

Tree Diagram for Variables

Unweighted pair-group average1-Pearson r

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Linkage Distance

P2(2)

P2(3)

P2(1)

P3(3)

P3(2)

P3(1)

P1(2)

P1(3)

P1(1)

Cont(3)

Cont(2)

Cont(1)

62

3.Avaliação indireta da diversidade bacteriana em ambientes contaminados com óleo

e água de produção

3.1. Isolamento de bactérias halofílicas ou halotolerantes degradadoras de

hidrocarbonetos

Em relação à avaliação indireta das comunidades presentes nas amostras de solo

foram isoladas 131 amostras, representadas por colônias morfologicamente distintas ou

isoladas de locais diferentes (pontos 1, 2 ou 3), que foram selecionadas em diferentes meios

(LB, LB + 7% NaCl, TSB, TSB + 7% NaCl, TBN e TBN + 7% NaCl). Estas colônias

foram obtidas após o plaqueamento das culturas de enriquecimento em meio Bushnell-Haas

preparado com água destilada ou meio Bushnell-Haas preparado com água de produção

(adicionados de óleo). Na Tabela 7, pode-se observar o número de amostras isoladas, a

partir do plaqueamento das culturas de enriquecimento das amostras de solo dos pontos de

coleta 1, 2 e 3, nos diferentes meios de cultura.

63

Tabela 7 - Amostras dos diferentes pontos de coleta

Meio de isolamento Ponto de coleta N° de amostras isoladas

1 18

2 10 TSB

3 13

1 3

2 8 TSB + 7% NaCl

3 8

1 21

2 21 LB

3 18

1 2

2 3 LB + 7% NaCl

3 2

1 2

2 1 TBN

3 1

Do total de 131 amostras bacterianas, 46, 43 e 42 foram isoladas a partir das

culturas de enriquecimento dos pontos 1, 2 e 3, respectivamente. Além disso, mais amostras

foram isoladas quando plaqueadas em meios contendo baixa concentração de NaCl. O meio

LB foi o mais eficiente no isolamento de amostras bacterianas morfologicamente

diferentes, apresentando um número de 60 isolados (45,8% do total).

64

3.2. Teste de degradação de hidrocarbonetos

Todas as 131 amostras isoladas foram submetidas ao teste de degradação do óleo de

Carmópolis em microplacas de 24 poços. Neste teste, as amostras foram inoculadas em

meio Bushnell-Haas, preparado com água destilada ou água de produção, adicionado de

óleo. Após uma semana, foi possível observar o crescimento bacteriano e a degradação do

óleo por amostras capazes de degradar hidrocarbonetos presentes no óleo cru extraído no

campo de Carmópolis. A Figura 6 exemplifica uma microplaca contendo óleo que foi

degradado por diferentes isolados.

Figura 6 -Teste de degradação de hidrocarbonetos presentes no óleo cru de

Carmópolis. [A1] Controle negativo; [A2] LBO 2.15; [A3] LBO 2.17; [A4] LBO a;

[A5] LBO 3.25; [A6] DLB 1.4; [B1] DLB 1.5; [B2] DLB 1.7; [B3] DLB 2.1; [B4]

DLB 2.6; [B5]DLB 3.4; [B6] DTSB 1.1; [C1] DTSB 1.2; [C2] DTSB 1.3; [C3]

DTSB 1.5; [C4] DTSB 1.6; [C5] DTSB 1.7; [C6] DTSB 2.3; [D1] DTSB 2.6; [D2]

DTSB 3.1; [D3] DTSB 3.3; [D4] DTSB 3.6; [D5] DTSB 3.8; [D6] TSBP 1.6.

1 2 3 4 5 6

A B C D

65

Após os testes de degradação, concluiu-se que 22 amostras isoladas a partir dos

diferentes pontos de coleta e em diferentes meios de cultura foram capazes de degradar o

óleo na presença da água de produção (com salinidade de aproximadamente 7%) (Tabela

8). A Figura 7 resume o processo de triagem das 22 amostras capazes de degradar óleo na

presença da água de produção.

Enriquecimento usando meio BH + água produzida

57 74

Teste de degradação utilizando meio BH + água produzida

7 15

Enriquecimento usando meio BH + água destilada

Figura 7 – Esquema da triagem das 22 amostras degradadoras de óleo e tolerantes à água de

produção que foram isoladas a partir de duas culturas de enriquecimento diferentes.

22

66

3.3. Testes fenotípicos

As amostras bacterianas que apresentaram capacidade de degradar óleo na presença

da água de produção foram selecionadas para o estudo fenotípico. Estas amostras foram

nomeadas de acordo com as culturas de enriquecimento de origem (‘D’ para os isolados da

cultura em meio Bushnell-Haas preparado em água destilada e ‘P’ para os isolados da

cultura em meio Bushnell-Haas preparado em água de produção) e também de acordo com

os meios dos quais foram isoladas (TSB e LB). A numeração que segue o nome das

amostras representa o ponto de coleta do solo e a colônia isolada a partir do plaqueamento

(Ex: DLB 1.1 – colônia 1 isolada a partir da cultura de enriquecimento do solo do ponto 1

em meio Bushnell-Haas preparado com água destilada). Os testes utilizados para a análise

fenotípica foram a coloração de Gram e a curva de halofilia. Somente um bastonete Gram-

negativo, amostra DLB 1.7 (Figura 8), foi encontrado dentre as amostras isoladas. Além

disso, foram encontrados cocos, como, por exemplo, na amostra DLB 1.4 (Figura 9),

cocobacilos e bastonetes Gram-positivos. Mais detalhes sobre a classificação morfo-

tintorial das amostras degradadoras de óleo resistentes a altas concentrações de sal podem

ser encontrados na Tabela 8.

67

Figura 8 – Bastonetes Gram-

negativos. Amostra bacteriana DLB

1.7 corada pelo método de Gram e

visualizada ao microscópio óptico

com o aumento de 100 x.

Figura 9 – Cocos Gram-positivos.

Amostra bacteriana DLB 1.4

corada pelo método de Gram e

visualizada ao microscópio óptico

com o aumento de 100 x.

68

Crescimento em diferentes concentrações de NaCl Degradadoras Gram

2% 4% 5,5% 7% 10% 12% 15% 17%

DTSB 1.1 Cocos Gram + + + + + + + - -

DTSB 1.6 Cocos Gram + + + + + + w - -

DTSB 2.3 Cocos Gram + + + + + + w - -

DTSB 2.5 Bastonetes Gram + + + + + + w - -

DTSB 3.4 Bastonetes Gram + + + + + + + w -

DTSB 3.5 Bastonetes Gram + + + + + + + w -

DTSB 3.6 Bastonetes Gram + + + + + + w - -

DLB 1.1 Cocos Gram + + + + + + w - -

DLB 1.2 Cocos Gram + + + + + + w - -

DLB 1.4 Cocos Gram + + + + + + - - -

DLB 1.7 Bastonetes Gram - + + + + + w - -

DLB 1.8 Cocos Gram + + + + + + w - -

DLB 1.9 Cocos Gram + + + + + + w - -

DLB 1.10 Cocos Gram + + + + + + w - -

DLB 1.11 Cocos Gram + + + + + + w - -

DLB 2.6 Cocos Gram + + + + + + - - -

DLB 3.4 Cocobacilo Gram + + + + + + - - -

PTSB 1.6 Cocobacilo Gram + + + + + + - - -

PLB 1.1 Cocos Gram + + + + + + - - -

PLB 1.2 Cocos Gram + + + + + + - - -

PLB 3.1 Cocos Gram + + + + + + - - -

PLB 3.4 Cocos Gram + + + + + + - - -

Tabela 8 – Características fenotípicas das amostras degradadoras de óleo halotolerantes.

Quando observado o crescimento das amostras foi utilizado o símbolo [+] e a ausência de

crescimento das amostras pode ser interpretado na tabela com o símbolo [-]. O símbolo [w]

foi utilizado quando o crescimento das amostras foi observado, porém de forma mais fraca.

69

As amostras DLB 1.1, DLB 1.2, PTSB 1.6, PLB 1.1, PLB 1.2, PLB 3.1 e PLB 3.4

foram isoladas a partir do plaqueamento das culturas de enriquecimento que foram

preparadas com meio Bushnell-Haas em água de produção e adicionadas de óleo. Dentre

elas, três (PTSB 1.6, PLB 1.1 e PLB 1.2) foram isoladas a partir da cultura de

enriquecimento do solo do ponto 1, sendo que a amostra PTSB 1.6 foi obtida após o

plaqueamento em meio TSB e as outras duas em meio LB. Já as amostras PLB 3.1 e PLB

3.4 foram obtidas após o plaqueamento da cultura de enriquecimento do solo do ponto 3 em

meio LB.

As demais amostras foram todas isoladas a partir das culturas de enriquecimento

adicionadas de óleo que foram preparadas com meio Bushnell-Haas em água destilada.

Ainda observando a tabela 8, é possível verificar que a maioria das amostras foram isoladas

a partir deste tipo de cultura de enriquecimento (Bushnell-Haas + água destilada) utilizando

os solos dos três pontos (1, 2 ou 3).

Comparando o número de amostras isoladas a partir das diferentes culturas de

enriquecimento realizadas com os solos de cada ponto é possível verificar que, do total de

22 amostras, 11 foram provenientes do ponto 1, 3 do ponto 2 e 8 do ponto 3. Outro dado

importante que pode ser visualizado na Tabela 8 é a faixa de crescimento, em diferentes

concentrações de NaCl, obtida por cada amostra. A maioria das amostras (14) foi capaz de

crescer em uma faixa de concentração de NaCl que variou de 2 a 12%. Entretanto, dois

bastonetes Gram-positivos foram capazes de crescer em uma concentração de NaCl

correspondente a 15% e as demais amostras, em sua maioria cocos Gram-positivos,

cresceram em concentrações de NaCl de até 10%.

70

3.4. Testes genotípicos

Para separar as amostras bacterianas selecionadas devido a sua capacidade de

degradar óleo na presença da água de produção em grupos distintos, foi realizado um

ARDRA, como descrito anteriormente. Nas Figuras 10, 11 e 12 podem ser observados os

perfis das digestões do gene que codifica o rRNA 16S das 22 amostras. Essas digestões

foram realizadas utilizando três diferentes enzimas de restrição, HaeIII, HinfI e Rsa I, e

geraram diferentes padrões na corrida eletroforética.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Figura 10 – ARDRA/ HaeIII. Perfis da digestão com a endonuclease HaeIII do gene que

codifica o rRNA 16S bacteriano amplificado por PCR. [1] Kb Ladder, [2] DLB 1.1, [3]

DLB 1.2, [4] DLB 1.4, [5] DLB 1.7, [6] DLB 1.8, [7] DLB 1.9, [8] DLB 1.10, [9] DLB

1.11, [10] DLB 2.6, [11] DLB 3.4, [12] DTSB 1.1, [13] DTSB 1.6, [14] DTSB 2.3, [15]

DTSB 2.5, [16] DTSB 3.4, [17] DTSB 3.5, [18] DTSB 3.6, [19] PTSB 1.6, [20] PLB 1.1,

[21] PLB 1.2, [22] PLB 3.1, [23] PLB 3.4.

71

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Figura 11 – ARDRA/ HinfI. Perfis da digestão com a endonuclease HinfI do gene que




DTSB 2.5, [16] DTSB 3.4, [17] DTSB 3.5, [18] DTSB 3.6, [19] PTSB 1.6, [20] PLB

1.1, [21] PLB 1.2, [22] PLB 3.1, [23] PLB 3.4.

72

Usando 29 marcadores, correspondentes a todas as bandas diferentes observadas

após a digestão com as três endonucleases de restrição, uma análise de similaridade foi

realizada baseada no UPGMA (‘unweighted pair group method with aritmetic mean’), com

o auxílio do programa NTSYS – 2.02. Esta análise deu origem a um dendrograma

apresentado na Figura 13. Neste dendrograma, 15 grupos genotípicos diferentes de rDNA

16S foram detectados em 100% de similaridade. O bastonete Gram-negativo (amostra DLB

1.7) foi o grupo que ficou mais afastado dos demais, separando-se em 59% similaridade.

Também em 59% de similaridade, o grupo das bactérias Gram-positivas dividiu-se em

outros dois grupos. Um destes grupos foi formado em 100% de similaridade somente por

quatro estirpes (PLB 1.1, PLB 1.2, PLB 3.1 e PLB 3.4) classificadas como cocos Gram-

positivos. Já o outro grupo, formado por cocos, cocobacilos e bastonetes Gram-positivos

Figura 12 – ARDRA/ RSAI. Perfis da digestão com a endonuclease RSAI do gene que




DTSB 2.5, [16] DTSB 3.4, [17] DTSB 3.5, [18] DTSB 3.6, [19] PTSB 1.6, [20] PLB 1.1,

[21] PLB 1.2, [22] PLB 3.1, [23] PLB 3.4.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

73

subdividiu-se em 65% de similaridade, formando um grupo composto por dois bacilos

Gram-positivos (DTSB 3.4 e DTSB 3.5) e um cocobacilo Gram-positivo. O grupo maior

subdividiu-se em dois subgrupos em 72% de similaridade. Nesta subdivisão, um subgrupo

foi separado em 88% de similaridade e constituído por dois cocos Gram-positivos (DLB

1.1 e DLB 1.2) e dois bacilos Gram-positivos (DTSB 2.5 e DTSB 3.6). O outro subgrupo

separado em 86% de similaridade foi formado por amostras Gram-positivas classificadas

como cocos (em sua maioria) e um cocobacilo (PTSB 1.6). Dentre os cocos do grupo

citado, as amostras DLB 1.9, DLB 1.10 e DLB 1.11 apresentaram 100% de similaridade,

assim como as amostras DTSB 1.1 e DTSB 1.6.

DLB 1.1 DLB 1.2

74

4.Teste de antagonismo

No teste de antagonismo foi escolhida uma amostra bacteriana para representar cada

grupo genotípico gerado pelo ARDRA. Portanto, como foram formados 15 grupos, 15

amostras bacterianas foram testadas quanto à produção e susceptibilidade a substâncias

antimicrobianas. Apenas três estirpes produziram substâncias antimicrobianas que foram

capazes de inibir uma ou mais amostras bacterianas dentre as 14 restantes. A amostra

DTSB 1.6 produziu uma substância antimicrobiana que foi capaz de inibir 7 amostras,

sendo elas: DLB 1.4, DLB 1.8, DLB 2.6, DLB 3.4, DTSB 2.3, DTSB 3.4 e DTSB 3.5. A

amostra DLB 1.9 foi capaz de inibir o crescimento das amostras DLB 1.4 e DLB 1.8. Já a

amostra DLB 1.4 produziu uma substância que inibiu somente a amostra DLB 1.7. A

inibição foi interpretada como um halo transparente formado ao redor da amostra

bacteriana produtora da substância antimicrobiana difundida no ágar. Na Figura 14 é

possível observar a inibição da amostra indicadora DTSB 3.5 pela amostra produtora DTSB

1.6.

Figura 14 – Teste de antagonismo. Um halo transparente indicado pela seta é

observado à volta da amostra produtora de substância antimicrobiana DTSB 1.6

como resultado da inibição da amostra indicadora DTSB 3.5.

75

DISCUSSÃO

A maioria das pesquisas sobre biodegradação de hidrocarbonetos em ambientes que

possuem condições extremas, como, por exemplo, alta salinidade, tem se concentrado nos

hidrocarbonetos do petróleo. Na literatura científica já foi demonstrado que uma grande

quantidade de poluentes orgânicos é mineralizada ou transformada por microrganismos

capazes de crescer na presença de sal (Oren et al., 1992).

O uso de microrganismos capazes de degradar rejeitos orgânicos na presença de sal

poderia diminuir os gastos muitas vezes destinados aos processos de diluição para diminuir

a salinidade dos locais afetados pelo contaminante, ou à remoção do sal por osmose

reversa, troca iônica ou eletrodiálise antes do tratamento biológico (Margesin & Schinner,

2001).

Como citado anteriormente, as bactérias halotolerantes e halofílicas são

microrganismos promissores nos processos de biorremediação de ambientes contaminados

e que apresentam alta salinidade (Oren et al., 1992). Dessa forma, neste estudo, um dos

principais objetivos foi isolar bactérias capazes de degradar o óleo extraído na região de

Panelas (SE) que também apresentassem tolerância à concentração de sais de 7%. Esta

característica revelou-se importante, pois a concentração de sais presente na água de

produção resultante da atividade exploratória do local era equivalente a 7%.

O isolamento de 15 grupos de bactérias genotipicamente diferentes (do total de 22

amostras bacterianas analisadas pelo método de ARDRA) e com as características

explicitadas no parágrafo anterior gerou novas perspectivas para a recuperação biológica da

76

área de Panelas (Carmópolis – SE), que foi degradada pelo impacto do derrame da mistura

de óleo e água de produção.

De acordo com a análise dos componentes do solo, observada na Tabela 3, o solo da

área atingida foi classificado texturalmente como franco-argiloarenoso. Neste caso, a

porcentagem de areia (66%) é maior do que a de outros componentes apresentando uma

alta permeabilidade e proporcionando aos contaminantes uma mobilidade maior. Apesar

disso, o solo também apresentou um percentual de argila total significante (22%) não

permitindo a migração vertical do poluente a uma profundidade maior do que 20 cm. Dessa

forma, conclui-se que a inclinação do local influenciou na movimentação do poluente para

o ponto mais baixo.

Existem vários relatos de microrganismos que possuem a capacidade de oxidar os

hidrocarbonetos do petróleo até mesmo na presença de 30% de sal. Dentre eles podemos

citar o Streptomyces albaxialis degradador de óleo cru (Kuznetsov et al., 1992) e um

membro do grupo Halobacterium capaz de degradar n-alcanos (Kulichevskaya et al.,

1992). Além disso, Ashok, Saxena e Musarrat isolaram, em 1995, quatro estirpes

bacterianas pertencentes aos gêneros Micrococcus, Pseudomonas e Alcaligenes, que foram

capazes de degradar dois tipos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (naftaleno e

antraceno) na presença de uma concentração de 7,5% de NaCl. Alguns pesquisadores

como, por exemplo, Nicholson e Fathepure (2004) empenharam-se no estabelecimento de

consórcios de bactérias indígenas para a biorremediação de solos com alta salinidade e que

foram contaminados por hidrocarbonetos do petróleo. Em 2004, eles demonstraram a

capacidade de um consórcio de bactérias halotolerantes e halofílicas em degradar os

compostos presentes no BTEX (benzeno, tolueno, etil-benzeno e xileno) sob condições

aeróbicas.

77

Estudos como o de Bento e colaboradores (2005), que comparam diferentes técnicas

de biorremediação como atenuação natural, bioestimulação e bioaumento, comprovam que

o bioaumento com bactérias indígenas é o mais apropriado em processos de biorremediação

de solos contaminados.

Esse dado reforça a importância do isolamento, neste trabalho, das 15 estirpes

bacterianas a partir do local onde ocorreu o derrame acidental, pois as comunidades

bacterianas presentes em solos contaminados tendem a ser dominadas por estirpes que

sejam capazes de sobreviver à toxicidade, utilizar o poluente para o seu crescimento

(Zucchi et al., 2003) e, no caso da presença de grandes quantidades de sal, resistir à

salinidade do ambiente (Margesin & Schinner, 2001).

As estirpes isoladas neste estudo foram classificadas como halotolerantes devido

aos resultados dos testes de tolerância a diferentes concentrações de NaCl. Nestes testes,

diferentes amostras foram capazes de crescer em concentrações distintas que variaram de

2% a 15% de NaCl. Todas as amostras foram capazes de crescer na concentração de 0,5%

de NaCl caracterizando-as como halotolerantes segundo a classificação de Kushner (1978).

As bactérias halofílicas dependem de uma concentração de NaCl igual ou superior a 3%

para o seu crescimento, comportamento que não foi observado em nenhuma das amostras

isoladas. Além disso, todas as amostras foram capazes de crescer, pelo menos, a uma

concentração de 10% de NaCl, que corresponde à uma concentração de sais maior do que a

presente na água de produção derivada do processo de extração de petróleo em Panelas

(SE), que foi derramada acidentalmente no solo junto ao óleo cru. Embora a concentração

exata de sais presente no solo após o acidente seja desconhecida e que fatores climáticos

(ex: períodos de chuva e seca) possam ter alterado a salinidade do local, o isolamento de

bactérias halotolerantes é de grande importância, pois derrames acidentais no ambiente

78

envolvendo água de produção contendo salinidade alta (maiores que 7%) são uma realidade

nos processos de extração e transporte do petróleo.

Diversos pesquisadores, como Ijah e Ukpe (1992), Nazina e colaboradores (2001) e

Cunha e colaboradores (2006), têm relatado a importância do gênero Bacillus, e de gêneros

relacionados, em relação à degradação de hidrocarbonetos do petróleo. Devido ao fato

destas bactérias formarem endosporos resistentes a condições ambientais adversas (ex:

aridez, temperaturas altas e pH baixo) (Nicholson, 2002) esperava-se o isolamento de um

número maior de bacilos neste estudo. Entretanto, apenas 4 bacilos Gram-positivos foram

isolados em meio TSB. Mesmo após a pasteurização (para eliminar as células vegetativas) e

plaqueamento das diferentes culturas de enriquecimento em meio TBN, somente quatro

colônias (crescidas após a germinação de esporos que resistiram à pasteurização) foram

isoladas, porém as mesmas não foram capazes de degradar o óleo cru em microplacas.

É importante ressaltar que foram isoladas, dentre as 15 estirpes bacterianas,

predominantemente bactérias Gram-positivas. Somente uma das estirpes foi classificada

como bastonete Gram-negativo, permanecendo, inclusive, separada em 59% de

similaridade das demais no dendrograma gerado pela análise estatística do perfil de

restrição obtido no teste de ARDRA (Figura 13). Estas 15 estirpes bacterianas encontram-

se ainda em fase de seqüenciamento, razão pela qual não foi possível realizar a análise

filogenética das mesmas.

Complementando o estudo, foi possível determinar também quais das amostras

bacterianas halotolerantes degradadoras de óleo que foram isoladas produziram substâncias

antimicrobianas capazes de inibir as demais. Estes dados são importantes para a obtenção

de um consórcio bacteriano estável onde estes microrganismos possam crescer e atuar em

sinergismo a favor da degradação do óleo e conseqüente descontaminação do ambiente.

79

Amostras como a DTSB 1.6, DLB 1.9 e DLB 1.4 não podem ser combinadas com algumas

das outras amostras isoladas a fim de formar um consórcio e serem utilizadas em processos

de biorremediação. As amostras bacterianas sensíveis às substâncias produzidas e liberadas

pelas amostras citadas acima podem ter o crescimento inibido durante o cultivo em

conjunto inviabilizando a sua aplicação tanto in vitro quanto no meio ambiente.

No presente estudo, foi realizada também a análise direta da comunidade bacteriana

das amostras de solo contaminadas com diferentes concentrações de hidrocarbonetos totais

do petróleo (TPHs). Técnicas microbiológicas tradicionais (ex: plaqueamento, isolamento

de diferentes morfotipos coloniais e identificação dos isolados por testes bioquímicos) têm

sido usadas com grande sucesso na caracterização de espécies microbianas isoladas, mas

não são consideradas suficientes já que apenas uma pequena fração (aproximadamente 1 a

10%) dos microrganismos presentes no ambiente pode ser isolada e caracterizada. A grande

maioria é considerada não cultivável. Além disso, sabe-se pouco a respeito do que

realmente ocorre com a comunidade microbiana do ambiente ao longo do processo de

contaminação e degradação do óleo, e quais as populações que permanecem e/ou são

selecionadas nestas novas condições (Philp et al., 2005).

Através da análise dos perfis do DGGE das comunidades do solo controle e dos

solos dos pontos 1, 2 e 3 foi possível estabelecer uma relação entre concentração de óleo e

diversidade bacteriana. A amostra do solo controle apresentou o menor teor de TPH (81,3

ppm) enquanto as amostras de solo dos pontos 1, 2 e 3 apresentaram valores crescentes de

TPH (respectivamente, 182; 259,2 e 285 ppm). Embora o percentual de óleo presente nas

amostras de solo não tenham sido altos e discrepantes entre si e uma análise estatística não

tenha sido realizada na dosagem do TPH das amostras de solo dos diferentes pontos,

coincidentemente, nos perfis do DGGE que representavam as triplicatas do DNA total do

80

solo controle amplificado através de PCR 16S, a diversidade foi, em geral, maior do que

nos locais contaminados e com teores mais altos de TPH. As triplicatas do DNA total do

solo do ponto 3, também amplificado através de PCR 16S, apresentaram a redução mais

significativa da diversidade. Além disso, a intensidade das bandas nos diferentes perfis do

DGGE foi analisada visualmente e determinadas populações foram selecionadas com o

aumento do teor de TPH do local, gerando bandas fortes nas triplicatas das amostras de

DNA amplificado dos pontos 2 e 3 (ex: bandas 5 e 6 da Figura 4). Outras bandas não

puderam ser mais visualizadas com o aumento do TPH. Acredita-se, portanto, que as

populações selecionadas foram aquelas que apresentaram a capacidade de degradar o óleo

cru, ou sobreviver na sua presença, e que também foram capazes de tolerar a alta salinidade

da água de produção que contaminou o local.

Muitos estudos que utilizaram o DGGE para monitorar a comunidade microbiana

em solos contaminados por hidrocarbonetos do petróleo revelaram resultados que não

seriam obtidos através de métodos convencionais usadas em microbiologia. Por isso, o

DGGE é considerado um método eficiente e econômico para analisar a estrutura e a

diversidade dessas comunidades. Outra vantagem do DGGE é que ele possui uma resolução

maior do que outros métodos para análise de comunidades e, além disso, possibilita o corte

das bandas do gel para fins de seqüenciamento (Philp et al., 2005).

Neste estudo, através do DGGE foi possível identificar a banda 1 do DGGE (Figura

4) e observar que a população de Paenibacillus sp. representada pela mesma apareceu

somente nos perfis das triplicatas de solo controle. Apesar do gênero Paenibacillus estar

comprovadamente relacionado à degradação de hidrocarbonetos do petróleo como, por

exemplo, o fenantreno (Meyer et al., 1999), a população de Paenibacillus sp. foi afetada

negativamente pela contaminação do solo dos pontos 1, 2 e 3 com a mistura de óleo e água

81

de produção. Inclusive não existem evidências, apesar da análise filogenética das culturas

puras não estar concluída, de isolamento de bacilos Gram-positivos que possam ser

identificados como pertencentes ao gênero Paenibacillus a partir das culturas de

enriquecimento dos pontos 1, 2 e 3.

A banda 3, presente na Figura 4 (DGGE), não pode ser identificada pois não

apresentou similaridade maior ou igual a 97% com nenhuma das seqüências presentes no

GenBank. Entretanto, o parente evolucionário mais próximo encontrado foi Frankia sp.,

apresentando 93% de similaridade. Esta banda somente foi encontrada nos perfis das

triplicatas dos solos contaminados com óleo e água de produção (pontos 1 e 2). Embora a

banda 3 não apareça na amostra do solo controle, este fato não significa a inexistência deste

actinomiceto no mesmo, pois esta população pode estar presente em quantidade pequena no

solo não contaminado impedindo a sua detecção pelo método utilizado. Entretanto, após um

estímulo, como a contaminação do solo por hidrocarbonetos que possam ser utilizados

como fonte de carbono, a mesma população passa a ser mais abundante e,

conseqüentemente, detectada pelos métodos moleculares utilizados neste trabalho.

Através dos resultados apresentados podemos concluir que os métodos

convencionais de microbiologia aliados aos métodos moleculares foram importantes tanto

na avaliação nas mudanças ocorridas na comunidade bacteriana do solo de Panelas afetado

pela mistura de óleo e água de produção, quanto no isolamento de estirpes bacterianas com

um grande potencial para o desenvolvimento de consórcios bacterianos que possam ser

utilizados na biorremediação do local contaminado.

82

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