Varijacije u broju

kopija u genomu

čoveka

Koje su razlike između individua ?

Koje su razlike između vrsta ?

Projekat “Genom čoveka”

Genomika

Komparativna genomika

Komparativna

genomika

• Sajt http:// https://gold.jgi.doe.gov/

• 11. januar 2017. godine - sekvencirano 10.625 (kompletno)

+ 72.007 genoma (draft) + 45.678 započetih projekata

• 28. februar 2018. godine - sekvencirano 12.832 (kompletno)

+ 107.124 genoma (draft) + 66.370 započetih projekata

Inventar

genoma čoveka

• Broj gena za proteine

• 1991. godine - 100.000 gena

• 2001. godine - 30.000 gena

- 1.000 gena za RNK

- 1.947 pseudogena

Vrste gena Broj gena

Geni za proteine 19797

Geni za duge nekodirajuće RNK 15931

Geni za male nekodirajuće RNK 9882

Psudogeni 14477

Ukupan broj gena 60498

The Encyclopedia of DNA Elements

(ENCODE)

• Cilj projekta – registrovati sve funkcionalne elemente genoma čoveka:

• Segmenti genoma koji kodiraju za definisani produkt (RNK i/ili protein)

• Elementi genoma koji pokazuju “reproducible biochemical signature" (sekvence za vezivanje proteina ili sekvence odgovorne za specifične strukture hromatina)

ENCODE

funkcije genoma čoveka

• 399.124 regiona koji po svojim karakteristikama

odgovaraju pojačivačima i 70.292 regiona koji po svojim

karakterisitkama odgovaraju promotorima.

• Procena da se dve trećine genoma čoveka prepisuje.

Projekat “Genom čoveka“

(Human Genome Project) Preliminarna procena - Homo sapiens 99.9% identični

Razlike u genomima ljudi

• Prvi eksperimentalni dokazi o postojanju značajnih

razlika u genomima (zdravih) individua dobijeni su

zahvaljujući razvoju novih tehnika…..

• Iafrate et al, 2004

• Sebat et al., 2004

Metodologija istraživanja

odnosno detekcije CNV

Metodologija istraživanja

odnosno detekcije CNV

• Komparativna genomska hibridizacija

Genski čip

• Na osnovu količine probe koja hibridizuje za svaku tačku

(“spot”) na array-u dobija se informacija o specifičnom

sastavu nk u ispitivanom uzorku.

Representational Oligonucleotide

Microarray Analysis

• Konstruisana 2003. godine

• Michael H. Wigler i Rob Lucito

• Cold Spring Harbor Laboratory

Komparativna genomska hibridizacija

bazirana na genskom čipu (aCGH)

aCGH

• Metodološke kritike

- Šta je referentni genom

- Kako je “istačkan” genski čip

- Analiza dobijenih rezultata

- Tehnika se definiše kao “prljava”

Metode dubinskog sekvenciranja

• Danas najmanje 12 platformi za analizu CNV

Provera rezultata

• FISH

• qPCR

• Metoda multipleks

amplifikacije

ligiranih proba (MLPA)

• Sekvenciranje po Sangeru

MLPA

• Jedan oligonukleotid svake

MLPA probe na 3’ kraju sadrži

sekvencu komplementarnu

specifičnoj ciljnoj sekvenci,

dok na 5’ kraju sadrži sekvencu

koja je zajednička za sve MLPA

probe i identična je

fluorescentno obeleženom

PCR prajmeru.

MLPA

• Drugi oligonukleotid svake MLPA

probe na 5’ kraju poseduje

sekvencu komplementarnu

specifičnoj ciljnoj sekvenci, na 3’

kraju sadrži sekvencu zajedničku za

sve MLPA probe dužine koja je

komplementarna neobeleženom

prajmeru.

• Između ova dva kraja nalazi se

insert ili “stuffer” sekvenca različite

dužine.

MLPA

• Ligacijom oligonukleotida MLPA probe formiraju se

uspešno ligirane probe koje imaju identične sekvence na

5’ i 3’ krajevima.

• Zahvaljujući ovoj njihovoj osobini omogućena je

istovremena amplifikacija i do 50 različitih MLPA proba

korišćenjem samo jednog para prajmera.

MLPA

• Kao rezultat procesa

amplifikacije ligiranih MLPA

proba, nastaju PCR produkti

jedinstvene dužine, odnosno

kombinacija jedinstvenih,

PCR-om umnoženih

fragmenata čiji je opseg

dužina od nekoliko desetina

do nekoliko stotina nt.

MLPA

• Umnoženi fragmenti se analiziraju fragment analizom,

metodom za razdvajanje fragmenata molekula DNK na

osnovu njihovih dužina sa senzitivnošću od 1bp.

CNV analizirane MLPA metodom

Godina Naučnici Otkrića

2003. Wigler i Lucito Otkriće tehnike ROMA (genski čip reprezentativnih oligonukleotida)

2004. Iafrate i saradnici 255 duplikacija i delecija između genoma 55 nesrodnih individua

2004. Sebat i saradnici 221 razlika između genoma 20 nesrodnih individua

2005. Tuzin i saradnici 241 razlika i 56 inverzija između genoma datog od strane internacionalnog

konzorcijuma „Genom čoveka“ (HGP) i genoma anonimnog muškarca

2005. Conrad i saradnici Upoređivanjem dva genoma identifikovali 586 delecionih varijanti veličine od 300bp do

1,2Mb, pri čemu su 92 gena bilo kompletno deletirana dok su 109 gena bila delimično

deletirana

2006. Hinds i saradnici Identifikovali 215 potencijalnih delecionih varijanti veličine od 70bp do 10kb kod 24

nesrodnih individua

2006. Redon i saradnici Identifikovali 1,447 CNVs koje zauzimaju veličinu od 360Mb (12% genoma) i sadrže

hiljade gena (3000), lokuse povezane sa bolestima čoveka, funkcionalne elemente i

segmetne duplikacije tokom analize genoma 270 individua iz 4 evropske populacije

2007. Lipson i saradnici Optimizacija metode aCGH i unapređenje matematičkog algoritma za analizu dobijenih

rezultata

Varijacije u broju kopija (eng. Copy number variations, CNVs)

• Termin CNV objedinjuje i pojmove:

• LSV – large–scale CNV (Iafrate et al.,2004)

• CNP – copy number polymorphism (Sebat et

al, 2004)

• ISV – intermediate – sized variants (Tuzun et

al., 2005)

Polimorfizmi DNK lokusa

• Razlike u sekvenci DNK koje postoje u određenom DNK

lokusu između individua jedne vrste označene su kao

polimorfizmi DNK.

• Postoje dva tipa DNK polimorfizama:

1. Polimorfizmi nukleotidne sekvence, koji su vezani za

- varijabilnost tipa bazne zamene (tačkasti polimorfizmi)

- za inserciju ili deleciju određenog niza nukleotida

(inserciono-delecioni prolimorfizmi)

2. Polimorfizmi dužina sekvence, koji su vezani za različiti

broj ponovaka u mini- i mikro-satelitskim lokusima.

Varijacije u broju kopija - CNVs

• Termin polimorfizam zamenjen

terminom varijanta jer se

polimorfizam definiše kao genetička

varijanta sa učestalošću ređeg alela

≥ 1%.

Samo 37 CNVRs (5%) prisutan u sve tri

izolovane populacije sa frekvencom >1%

2012. godina

Novo pitanje

• Genom čoveka ili genomi ljudi

Genomi

ljudi

Jedna vrsta jedan genom

Genom čoveka NE genomi ljudi

Varijacije u broju kopija - CNVs

• Varijacije u broju kopija su segmenti molekula DNK veličine od 50bp do 1Mb ili veći koji se u jednom genomu pojavljuje u različitom broju kopija u odnosu na referentni genom.

• Po svojoj prirodi, CNV mogu biti:

• duplikacije,

• triplikati,

• delecije,

• insercije, ili

• kompleksne CNV.

Varijacije u broju kopija - CNVs

• STRUKTURNE VARIJANTE GENOMA

• CNV su kvantitativne strukturne varijante genoma.

• Pored kvantitativnih, razlikuju se i pozicione strukturne varijante (translokacije) i orijentacione strukturne varijante (inverzije).

Varijacije u broju kopija - CNVs

• CNV treba razlikovati od mikro-delecija i mikro-duplikacija hromozoma koje su vidljive tehnikom bojenja traka i koje se, kao takve, ubrajaju u hromozomske aberacije.

• CNV po tipu duplikacija treba razlikovati od mikro-satelita i mini-satelita kao i triplikate od trinukleotidnih ponovaka.

CNV po tipu duplikacija

• Tandemske duplikacije podrazumevaju duplikacije

određenog segmenta molekula DNK koji se u svim

analiziranim genomima dupliciraju na isti način.

• Multialelske duplikacije podrazumevaju duplikacije čiji

se broj dupliciranih segmenata molekula DNK razlikuje

između analiziranih genoma.

Delecije i insercije

Kompleksne CNV

• Kompleksna CNV podrazumeva segment molekula

DNK koji u jednom genomu može biti dupliciran a u

drugom deletiran.

Triplikati

• Triplikati tipa I su segmenti molekula DNK koji predstavljaju tandemski ponovljene triplikate.

• Triplikati tipa II su triplikati koji su međusobno invertni i razdvojeni segmentima molekula DNK koji su duplicirani.

CNV u genomu čoveka

• 300.000 CNV regiona

• Pericentromerni i subtelomerni regioni

• Prosečna veličina CNV iznosi 2,9 kb

• Oko 100 gena deletirano bez efekta na fenotip

• CNV se nasleđuju

• De novo CNV registrovane kod jednojajčanih blizanaca

• Česte (eng. common CNV) čine preko 80% svih CNV

• Retke (eng. rare CNV) koje su obično povezuju sa

bolestima čoveka

CNV češće pogađaju 3 kategorije

gena za proteine

1) Proteine signalnih puteve imunskog sistema i međućelijske

komunikacije

2) Proteine uključene u interakcija sa spoljašnom sredinom

(imunski odgovor i čulo mirisa, npr.)

3) Proteine retrovirusa i proteine povezane sa mehanizmima

transpozicije.

Efekat CNV na ekspresiju

genoma

CNV u drugim vrstama

• Primati, psi, miševi, konji, krave,

kokoške, kukuruz, Arabidopsis

thaliana, Vinska mušica, pivski

kvasac, C. Elegans....

• 331 CNVs kod 20 šimpanza od

toga 74 CNVs detektovane u istim

regionima kao i kod čoveka

• Distribucija CNV kod šimpanze i

čoveka u prilog hipotezi o

dupliciranju gena kao mehanizmu

povećanja genoma tokom

evolucije

Molekularni mehanizmi nastanka CNV

Nealelska homologna rekombinacija

Molekularni mehanizmi nastanka CNV

• Dvolančani prekidi u molekulu

DNK čoveka najčešće se

repariraju nehomologim

spajanjem krajeva. Ovaj

mehanizam može biti uzrok

delecije određenog segmenta

molekula DNK.

• Tokom transpozicije moguće je

“nastanak” CNV po tipu

duplikacije - retro CNV.

Mehanizam FoSTeS (eng. fork stalling and template switching)

• Kompleksne CNV

• To je mehanizam reparacije

jednolančanih prekida u molekulu DNK

tokom procesa replikacije.

• Zaostajući lanac, na osnovu

mikrohomologije nastavlja replikaciju

korišćenjem druge replikacione viljuške

koja se nalazi u blizini.

• U zavisnosti da li se nova replikaciona

viljuška nalazi uzvodno ili nizvodno,

nastavak replikacije dovodi do delecije ili

duplikacije.

CNV i bolesti ljudi

• Dosadašnja istraživanja pokazala su snažnu asocijaciju

pojedinih CNV koje obuhvataju gene za proteine sa

razvojem psihijatrijskih bolesti (uključujući i autizam),

gojaznosti, psorijaze, šećerne bolesti, zapaljenskih

bolesti creva, itd.

CNV i bolesti ljudi

• Poslednjih godina istražuje se moguća uloga CNV u

procesima neoplastične transformacije koji su

odogovorni za razvoj karicinoma debelog creva, pluća i

prostate.

Oboljenja broja kopija

(eng. copy-number disorder)

• Za neke bolesti čoveka molekularno-biološkim

analizama pokazano je da su jedini do sada utvrđeni

genetički uzročnici razvoja bolesti CNV.

• Određene kongentalne bolesti srca ili bubrega su neke

od njih.

CNV i bolesti ljudi

• Protektivna uloga tokom infekcije HIV-om ili malarije

• Milanese M. i sarad., 2009

• Ispitivanje infekcije HIV

• Upoređivanje CNVs u 13 gena kod HIV+ i HIV- dece u

populaciji Brazila

• Gen DEFB104

• Pozitivna korelacija između

broja kopija ovog gena i

rezistentnosti na infekciju HIV

CNV i bolesti ljudi

• Personalna medicina

• Farmakogenomika

• Uloga CNV u individualnim odgovorima

na primenjenu terapiju u lečenju brojnih

bolesti čoveka

Budućnost

• Copy Number Variation Project

• Analiza genoma 269 nasumično izabranih individua

iz svih krajeva sveta

• Otkriće uloge CNV u fenomenima odgovornim za

ekspresiju

• Ključno pitanje – značaj CNV u evoluciji genoma