Vector NTI AdvanceVector NTI Advance · Vector NTI AdvanceVector NTI Advance クイックスタートガイドクイックスタートガイド ... `abckl opn,01

VectorVectorVectorVector NTI Advance NTI Advance NTI Advance NTI Advance

Vector NTI AdvanceVector NTI AdvanceVector NTI AdvanceVector NTI Advance

クイックスタートガイドクイックスタートガイドクイックスタートガイドクイックスタートガイド

2004/8/12 ライフテクノロジーズジャパン株式会社テクニカルサポート TEL: 03-6832-9490 FAX: 03-6832-9581 Mail: [email protected] Web: http://www.invitrogen.jp DOC-037

AkutsuY1

タイプライターテキスト

BLANK PAGE

＝＝＝＝目次目次目次目次＝＝＝＝ 1111 VECTOR NTI VECTOR NTI VECTOR NTI VECTOR NTI データベースエクスプローラデータベースエクスプローラデータベースエクスプローラデータベースエクスプローラのののの起動起動起動起動........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 1111 2222 データベースデータベースデータベースデータベースバックアップリマインダーバックアップリマインダーバックアップリマインダーバックアップリマインダーについてについてについてについて ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 1111 3333 データベースエクスプローラデータベースエクスプローラデータベースエクスプローラデータベースエクスプローラ内内内内でのでのでのでのデータデータデータデータのののの取扱取扱取扱取扱いいいい ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 2222 4444 VECTOR NTI VECTOR NTI VECTOR NTI VECTOR NTI 基本画面基本画面基本画面基本画面 (DNA) (DNA) (DNA) (DNA) ............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 3333 1) 配列の準備・作成 .......................................................................... 4 2) 表示設定（DISPLAY SETUP） ................................................................... 5 3) 配列の編集 (EDIT SEQUENCE) ................................................................. 6 4) データの保存 (SAVE AS) ..................................................................... 6 5) 配列の検索 (FIND SEQUENCE) ................................................................. 6 6) アミノ酸への翻訳 (TRANSLATION)............................................................... 7 7) データ/グラフィックのコピー (CAMERA) .......................................................... 7 8) グラフィックの編集 (EDIT PICTURE).............................................................. 7 9) FEATURE情報の付加 (ADD FEATURE) ............................................................ 8 10) PCRプライマーの設計 (PRIMER DESIGN) ......................................................... 9 11) BLAST検索 (BLAST SEARCH) ................................................................ 10 12) 制限酵素を用いたクローニング (MOLECULAR CONSTRUCTION) ....................................... 11 13) 制限酵素切断フラグメント (RESTRICTION FRAGMENTS) .............................................. 13 14) 制限酵素切断リストの作成 (RESTRICTION MAP) .................................................. 13 5555 VECTOR NTI VECTOR NTI VECTOR NTI VECTOR NTI 基本画面基本画面基本画面基本画面 (PROTEIN) (PROTEIN) (PROTEIN) (PROTEIN) ........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 14141414 1) 生化学的な解析 (STANDARD ANALYSIS) ......................................................... 14 2) 逆翻訳 - 1 (BACK TRANSLATION) .............................................................. 14 3) 逆翻訳 - 2 (REGENERATOR).................................................................. 14 4) 疎水性等のグラフ表示 (BIOANNOTATOR) ....................................................... 15 5) モチーフ検索 (RUN ANALYSIS MONITOR) ......................................................... 15 6666 ALIGN X ALIGN X ALIGN X ALIGN X （（（（マルチプルアラインメントマルチプルアラインメントマルチプルアラインメントマルチプルアラインメント）））） .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 17171717 7777 CONTIG EXPRESS CONTIG EXPRESS CONTIG EXPRESS CONTIG EXPRESS （（（（フラグメントフラグメントフラグメントフラグメントののののアッセンブルアッセンブルアッセンブルアッセンブル）））） ................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 20202020 8888 ENTREZ ENTREZ ENTREZ ENTREZ 検索検索検索検索（（（（GENBANK GENBANK GENBANK GENBANK やややや PUBMED PUBMED PUBMED PUBMED のののの検索検索検索検索）））） .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 24242424 9999 GATEWAY GATEWAY GATEWAY GATEWAY クローニングクローニングクローニングクローニング ............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 26262626 エントリークローンの作成 ........................................................................ 26 発現クローンの作成 ............................................................................ 27 10101010 TOPOTOPOTOPOTOPO クローニングクローニングクローニングクローニング .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................... 28282828 PCRプライマー設計を行う場合.................................................................... 28 遺伝子データから直接行う場合 ................................................................... 30 11111111 GENEARTGENEARTGENEARTGENEART クローニングクローニングクローニングクローニング........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................ 31313131 はじめに...................................................................................... 31 SEAMLESS CLONINGについて ....................................................................... 32

BLANK PAGE


1

1111 VectVectVectVectorororor NTI NTI NTI NTI データベースエクスプローラデータベースエクスプローラデータベースエクスプローラデータベースエクスプローラのののの起動起動起動起動 Windowsスタートメニュー＞[すべてのプログラム]＞[Invitrogen]＞[Vector NTI Advance 11]＞[Vector NTI

Explorer]を選択、起動して下さい。

※インストール後、初めてプログラムを立ち上げるとデータベースのインストールを行うかどうか尋ねてくるので[はい] あるいは [OK]ボタンを押して下さい。制限酵素サイト、各種サンプルデータがインストールされます。途中に確認画面が何度か表示されますが、全て [OK] あるいは [はい] をクリックして下さい。登録には通常 2～3分かかります。 ※同様に、はじめての起動の場合 Author Information の入力画面 (右図) が表示されます。データの作成者を登録して下さい。・各データを登録・修正される時にこの情報が使われます。・ライセンス登録時の情報と揃える必要はありません。・後から変更も可能です。その際は VNTI Explorerのメニューバーの [View]＞[Author Info] を選択して下さい。

2222 データベースデータベースデータベースデータベースバックアップリマインダーバックアップリマインダーバックアップリマインダーバックアップリマインダーについてについてについてについて ※メニューバー＞[Database]＞[Database Backup]＞[Database Backup Reminder] を選択すると、定期的にバックアップを促すメッセージを表示できるように設定できます。この表示はあくまで「バックアップを忘れないようにする」ためです。実際実際実際実際にはにはにはにはバックアップバックアップバックアップバックアップいたしませんいたしませんいたしませんいたしませんのでご注意ください。バックアップは、メニューバー＞[Database]＞[Database Backup]＞[Database Backup Now] を選択し、適当なフォルダを選んでバックアップを行ってください。


2

3333 データベースエクスプローラデータベースエクスプローラデータベースエクスプローラデータベースエクスプローラ内内内内でのでのでのでのデータデータデータデータのののの取扱取扱取扱取扱いいいい登録できる情報： Vector NTI Explorer の左下のナビゲーションから選択して下さい。・ DNA/RNA Molecules 核酸配列・ Protein Molecules アミノ酸配列・ Enzymes 制限酵素切断サイト・ Oligos オリゴDNA、オリゴペプチド配列 (プライマーやモチーフ配列の登録に用います）・ Gel Markers 分子量マーカー（電気泳動シミュレーションの際に用います）・ Citations 文献 (Abstract などを保存します）・ BLAST Results BLAST検索結果・ Analysis Results 解析結果 (プライマー設計、モチーフ検索結果の保存に用います）利用方法：・データの閲覧閲覧・編集したいファイルをダブルクリックして下さい。複数のファイルを同時に開きたい場合は、それらのファイルを選択後、メニューバーの

[DNA/RNA]＞[Open] をクリックして下さい。・ Subset の利用ツールバーの New Subset のアイコン（）をクリックしてください (右図)。新しいSubsetが表示され、利用できるようになります。 ※ 全てのデータはMAINに格納されており、Subsetの中に見えているものは全てショートカットです。あるデータを複数の

Subsetに登録した場合、一つを変更すると全てに影響します。・データの作成メニューバーの [Table]＞[New]＞[Molecule (Using Sequence Editor...)] を実行して下さい。・データのインポートファイルを直接 VectorNTI Explorer 上へ Drag&Dropして下さい (右図)。または、メニューバーの [Table]＞[Import]より目的のものを選んで下さい。 ※ 単純なシークエンスファイル、FASTA、GenBank, EMBL,

GenPept, Swiss-Protフォーマットに対応しています。・データの削除完全にデータを削除したい時は、データを選択し、Deleteキーを押して下さい。一旦確認画面が表示されるので [OK]をクリックして下さい。 Subsetから除くだけの場合は、該当データを右クリックし、表示されたメニューから

[Exclude from Subset] を選択して下さい。


3

4444 VectorVectorVectorVector NTI NTI NTI NTI 基本画面基本画面基本画面基本画面 (DNA) (DNA) (DNA) (DNA) ・データベースエクスプローラより、閲覧したいデータをダブルクリックすると自動的に立ち上がります。・直接立ち上げたい時は、Windowsスタートメニュー＞[プログラム]＞[Invitrogen]＞[Vector NTI Advance 11]＞[Vector NTI] を選択、起動して下さい。・ GenBank に登録されているデータを閲覧するときは、ステップ７を参照してください。

・画面は３つのペインによって構成されています。ツールバーのをクリックしてどのペインをアクティブな状態にするかを変更できます。・グラフィックペインの表示サイズは、ツールバーのをクリックして変更してください。微妙な調整は [Shift] キーを押しながら、をクリックしてください。

テキストペイン

グラフィックペイン

シークエンスペイン

1

4

3

6

5

7 8

9

10


4

1) 配列の準備・作成大きく分けて、下記の５つの方法があります。 a) VectorNTI Explorer へ登録する。確実にデータベースへ保存されます。基本的にはこの方法をお勧めします。２ページのデータのインポートをご覧ください。 b) ファイルを VectorNTIで直接開く。拡張子が gb形式などとなっているファイルは、ファイルをダブルクリックすると直接 VectorNTIで開く事ができます。 c) VectorNTIで PubMedを検索し、そのままインポートする。

VectorNTIより NCBIへ検索を行い、その検索結果からデータを取り出すことができます。第７章をご覧ください。 d) Webで GenBankなどを検索し、表示データをコピー後、VectorNTIで表示する。

i) Webで遺伝子を検索・表示してください。 ii) 遺伝子情報の該当部分を選択し、ブラウザの[メニューバー]＞[編集]＞[コピー] を選んでください。例えば GenBank形式の場合、遺伝子情報は LOCUS から // までです。 iii) VectorNTI の[メニューバー]＞[編集]＞[Open from

clipboard] を選んでください。 iv) データ形式の選択画面が表示されますので、適切なものを選んで [OK] をクリックしてください。

e) 直接作成する。 i) VectorNTI の[メニューバー]＞[File]＞[Create New Sequence]＞[Using Sequence Editor (DNA/RNA)] を選んでください。 ii) 右図のようなメッセージが表示されます。 iii) Generalタブにて遺伝子の名前をつけてください。 iv) DNA/RNA Moleculeタブにて基本情報を入力してください。 v) Sequence and Mapsタブにて [Edit Sequence] をクリックし、配列を入力してください。他のファイルからのコピー＆ペーストも可能です。 vi) その他入力が終了したら、[OK] ボタンをクリックしてください。


5

2) 表示設定（Display Setup）前ページの図の 1 のアイコンをクリックすると、Display Setup画面（下図）が表示されます。ここで、制限酵素マップ、ORF予測などの表示/非表示を設定することができます。それぞれの詳細については、さらに各Setupボタンをクリックして設定します。

a) シークエンスペインの表示 (Sequence) シークエンスペインの表示方法を変更します。例）画面が小さい場合： Blocks per Line を [6] [ ] Prefer Single-Stranded Display にチェック

b) 制限酵素マップ (Restriction Map) 制限酵素切断サイトを表示します。表示したい制限酵素を変更する場合は[RMap Setup] をクリックし、[Add]や[Remove] ボタンをクリックして調節してください。右下の [Ignore RENs having]＞[...more than] のところで、1 と入力すると、１ヶ所のみ切断する制限酵素だけが画面に表示されます。

c) ORF予測 (ORFs) 開始コドン(ATG) と終止コドン(TGA, TAA, TAG)を検索し、その間をORF領域として表示します。

d) 表示設定の保存 (Save Setting As) 各種設定を変更後、その設定をプロファイルとして保存しておく事ができます。 Save Setting As をクリックすると、プロファイル名の入力画面が表示されます（上図↑）。適当な名前をつけて [OK] をクリックして下さい。保存したプロファイルは、プルダウンメニューから選択することができます。

c b

a

d


6

3) 配列の編集 (Edit Sequence) a) 配列の編集は、シークエンスペイン上で行います。配列の入力を行おうとするとポップアップ画面（下図）が表示されますので、そこで入力・内容確認の上 [OK] をクリックして下さい。

b) 配列の編集により、Featureの配列にも変更がある場合、Feature情報を消去するかどうかのメッセージが表示されます。編集する配列によって、[Delete] [Keep] を使い分けてください。

c) Copy&Pasteで配列を追加する場合も、(a)と同じ画面が表示されます。他の遺伝子データを一旦VectorNTIで表示した後にコピーする場合、配列だけでなく Feature情報も同時にコピーすることができます。その際は、ペースト時に [Ctrl] + [V] を使用するのではなく、メニューバー＞

[Edit]＞[Paste with Features...] を選択してください。 d) 配列を削除する場合は、一旦削除したい部分を選択後、[Delete] をクリックして下さい。確認画面が表示されますので、[OK] をクリックして下さい。この場合も、(b) に記した Feature情報の確認メッセージが表示されますので、

[Delete] [Keep] を使い分けてください。 4) データの保存 (Save As) データを保存する際は、ツールバーのフロッピーディスクのアイコンをクリックして下さい。保存先の確認画面（右図→）が表示されます。 [Save in DNA/RNAs Dabatase As] のタブをクリックし、データベース内に保存してください。 5) 配列の検索 (Find Sequence) ・検索はメニューバーの Edit＞Find Sequence をご利用ください。


7

6) アミノ酸への翻訳 (Translation) アミノ酸翻訳には以下の２つの方法があります。翻訳したい配列を選択してからいずれかを行ってください。

a) 現在の画面上に表示したい場合・メニューバー＞[Analyses]＞[Translation]＞[In Sequence

Pane] を選択して下さい。・シークエンスペインに翻訳されたアミノ酸が表示されます。・ 1文字/3文字表記はステップ (1)-a で変更できます。

b) アミノ酸配列として新規保存したい場合・メニューバー＞[Analyses]＞[Translation]＞[Into New Protein] を選択して下さい。・ファイル名などを入力するメッセージ（右図）が表示されますので、適当な名前をつけて保存してください。

※ コドンフレームが分からない時は 6 Frame Translation をご利用下さい。 7) データ/グラフィックのコピー (Camera) Cameraツールを用いてグラフィックやテキストをコピーする事ができます。・目的のペインを選択後、ツールバーの Camera アイコン（）をクリックして下さい。右の画面が表示されますので、"All", "Clipboard" を選択して、[Copy] ボタンをクリックし、他のアプリケーションで貼り付けして下さい。・選択した部分のみをコピーしたい場合は、右図が表示された際に"Selection" を選択して下さい。 8) グラフィックの編集 (Edit Picture) ・グラフィックペインの画像を編集する際は、ツールバーの Edit Picture アイコン( )をクリックして下さい。 Edit Picture モードになります。グラフィックの各パーツをクリックすると、画像として編集できる状態となっています。目的のパーツをマウスを用いて移動させたり、パーツをダブルクリックすると表示される画面にて色などを変更したりできます。変更後は、Edit

Pictureモードを OFF にして下さい。 ※ 編集した画像は保存できません。データを保存して開きなおすと、元の状態に戻っています。


8

9) Feature情報の付加 (Add Feature) ・ Featureを付加したい配列を選択し、ツールバーから Add Feature （）アイコンをクリックしてください。・入力/編集画面が表示されます。左側より、Featureのタイプを選択し、右上に名前を入力し、[OK]をクリックして下さい。・既存の Feature情報を編集する場合は、そのFeatureをダブルクリックして、右図の編集画面が表示させてください。

- - - - - - - - - - - - 制限酵素の追加登録方法 - - - - - - - - - - - - - - - 制限酵素を追加登録するには、REBASEから最新のデータを取り込む方法が最も一般的です。 1. REBASE < http://rebase.neb.com > を開いてください。 2. [REBASE Files] というアイコンをクリックしてください。 3. 様々なソフトウェアに対応したリストが表示されます。リストの No.19 をクリックしてください。 4. GET FIle: bairoch.### を右クリックして、ハードディスクに保存してください。 5. VectorNTI Explorer を起動し、上記でダウンロードしたファイルをドラッグ＆ドロップしてください。 6. 保存場所の確認画面などが表示されますので、そのままデフォルトで進めてください。(もちろん変更いただいて結構です） 7. どの制限酵素を登録するかの確認画面が表示されますので、制限酵素を選択して保存してください。 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


9

10) PCRプライマーの設計 (Primer Design) i) 主に以下の２つのモードがあります。目的の配列を選択した状態で、いずれかを選択して下さい。・選択範囲の内側に Primerを設計する場合：メニューバー＞[Primer Design]＞[Find PCR Primers] ・選択範囲を残すように Primerを設計する場合：メニューバー＞[Primer Design]＞[Amplify Selection]

ii) 条件設定画面（右図→）が表示されます。条件を設定し [OK]をクリックして下さい。

iii) 設計されたプライマーはテキストペインに表示されます（右図→）。 ※ TaOpt はアニーリング温度です。

iv) 各プライマーの特性を解析する場合、設計されたプライマー配列を選択し、右クリック＞[Add to Oligo List] を選択して下さい（下図-左）。ツールバーから Open Oligo List ( ) をクリックし、Oligo Listを表示してください（下図-中央）。プライマーを選択し、Analyze や Duplex をクリックすると特性を解析できます。

v) プライマー設計結果を保存する場合、テキストペインから "PCR Analysis" を選択し、右クリック＞[Save As

Analysis Result] を選択してください。名前を付けて保存してください。結果は、データベースエクスプローラで、左上のプルダウンメニューより [Analysis Results] を選択すると表示されます。


10

11) BLAST検索 (BLAST Search) ・検索を行いたい配列を開けた状態で、[メニュバー]＞[Tools]＞[BLAST Search] を選択して下さい。・配列全体か現在選択されている部分だけかの選択画面（右図→）が表示されます。確認後、[OK]をクリックして下さい。・検索先の確認画面が表示されます。 "NCBI BLAST Server" にチェックをつけて [OK] ボタンをクリックして下さい。・ BLAST検索画面が表示されます（右図→）。各種パラメータを設定して [Submit] をクリックして下さい。・検索画面の下部に検索状況が表示されます。 Statusの欄が

"Finished" になったらダブルクリックして開いて下さい。・テキストペイン（左部）にヒットした遺伝子がリストアップされます。ある遺伝子をリストから選択すると、その遺伝子に対するアラインメント情報が各ペインに表示されます。・不要な遺伝子については、そのデータ上で右クリック＞

[Delete] を行うことでリストから削除することができます。


11

12) 制限酵素を用いたクローニング (Molecular Construction) 制限酵素を用いたクローニングでは、各制限酵素フラグメントを一旦 Goal list という一時保管場所に登録します。その後、登録された各フラグメントをつなぎ合わせます。 Gatewayクローニングについては、第8章をご覧ください。 i) PCRと制限酵素を用いたクローニングについて説明します。途中までは、前述の「PCRプライマーの設計」で記述した手順を行います。 ii) 目的の配列部分を選択した状態で、メニューバー＞[Primer Design]＞[Amplify Selection] を選択してください。 iii) 条件設定画面が表示されます。一番下の入力ボックス (Attach to 5'

terminus) に、プライマーの末端に付加したい配列を入力できます。プラスミド挿入時に利用する制限酵素サイト配列を入力してください。ここでは Hind III と EcoR I を使用しています。 iv) その他の条件を確認後、[OK] をクリックしてください。

v) テキストペイン(左上のペイン)に、PCRの候補が表示されます。 "#1: Product of Length ..... " を右クリックし、[Save as Molecule in Database] を選択してください。

vi) PCR産物の名前を確認する画面が表示されるので、名前をつけて [OK] をクリックしてください。

vii) 上記で保存したPCR産物を開いてください。 viii) [メニューバー]＞[Cloning]＞[Using Construct/Design

Procedure] を選択してください。 ix) [メニューバー]＞[List]＞[Add Fragment to Goal List] を選択してください。

x) "Construction fragment" を選択し、[次へ＞] をクリックしてください。


12

xi) "Set to a restriction site" を選択後、グラフィック上の制限酵素サイトをクリックしてください。そうするとメッセージ画面上に制限酵素サイトが表示されます。その後、[次へ＞] をクリックしてください。右図は Hind III を使用した場合の例です。

xii) 3'-末端側の位置の確認画面が表示されます。 "Set to a restriction site" を選択後、[Shift]キーを押しながらグラフィック上の制限酵素サイトをクリックしてください。そうするとメッセージ画面上に制限酵素サイトが表示されます。

画面上でクローニングしたい部位が含まれているかどうかを確認後、[完了] をクリックしてください。

xiii) 確認画面が表示されますので、確認後、[Add to list] をクリックしてください。 -- 以上で、PCR産物が Goal list に登録されました。

xiv) クローニングに用いるベクターを開いてください。 xv) 上述のステップ (x)～(xiv) を行い、ベクターのフラグメントを Goal

list に登録してください。 xvi) [メニューバー]＞[List]＞[Molecule Goal List]を選択してください。

xvii) リスト上部のアイコンから [Run]をクリックしてください。

xviii) この新しいベクターの名前を"Name" のところに書き込み、[Construct] をクリックしてください。

xix) 保存場所を指定し、保存してください。 xx) List画面を閉じてください。 xxi) 以上で、目的のベクターの完成です。


13

13) 制限酵素切断フラグメント (Restriction Fragments) ・ [メニューバー]＞[Analyses]＞[Restriction Analyses] ＞[Restriction Fragments] を選択して下さい。・制限酵素選択画面（右図）が表示されますので、目的の制限酵素のみを選択した状態とし、[OK] をクリックして下さい。 ※ 制限酵素自体を追加したい場合は、一旦ステップ(1)で Restriction Map のオプションを変更して下さい。・テキストペインの "Restriction Fragments" という項目に、切断結果が表示されます（右図）。例 856: xxxxx : AvaI(323) - AvaI(1179) と表示された場合フラグメント長: 856 323塩基目のAva I切断サイト～1179塩基目のAva I切断サイト

14) 制限酵素切断リストの作成 (Restriction Map) ※ 画面に表示される制限酵素を変更したい場合は、ステップ(1)の Restriction

Map のオプションを変更して下さい。 a) 画面に表示されている制限酵素のみを対象とする場合・ [メニュバー]＞[File]＞[Molecule Operation Report]＞[Complehensive Report] を選択して下さい。・右図の画面が表示されますので、[Finish] を選択して下さい。・レポートが表示されます。 Restriction/Methylation Map の部分を選択し、[Camera] ボタンをクリックして下さい。・ Cameraのオプション画面が表示されますので、"Selection", "Clipboard" を選択し、[Copy] をクリックして下さい。 Excel や Word にペーストできます。

b) 全ての制限酵素を対象とする場合・ [メニュバー]＞[Analyses]＞[Restriction Analyses] ＞[Restriction Report] を選択して下さい。・レポートが表示されます。 [Camera] ボタンををクリックして下さい。・ Cameraのオプション画面が表示されますので、"All", "Clipboard" を選択し、[Copy] をクリックして下さい。 Excel や Word にペーストできます。


14

5555 VectorVectorVectorVector NTI NTI NTI NTI 基本画面基本画面基本画面基本画面 (Protein) (Protein) (Protein) (Protein) タンパク質のデータも、DNAと同じように行ってください。 DNAと異なる部分は下記の部分です。 1) 生化学的な解析 (Standard Analysis) アミノ酸配列に基づく生化学的な解析結果がテキストペインのAnalysisのところに表示されます（右図→）。

2) 逆翻訳 - 1 (Back Translation) i) メニューバー＞[Analyses]＞[Back Translation] を選択して下さい。 ii) データ全体か選択した部分のみかの選択画面が表示されますので、どちらかを選んで [OK] をクリックしてください。 iii) 逆翻訳の画面が表示されます（右図→）。・上段に表示の [Change] をクリックして、生物種を選択できます。・縮重度（degeneracy）も同様に変更できます。 iv) 逆翻訳された配列は、下段の [Copy selection] または [Copy all] をクリックして、他のアプリケーションへ配列をコピーしてください。 3) 逆翻訳 - 2 (ReGENerator) 目的のDNA配列を人工合成によってクローニングする場合に有効なツールです。 i) メニューバー＞[Cloning]＞[ReGENerator] を選択して下さい。 ii) データ全体か選択した部分のみかの選択画面が表示されますので、どちらかを選んで [OK] をクリックしてください。 iii) 逆翻訳の画面が表示されます（右図→）。・上段に表示の [Change] をクリックして、生物種を選択できます。・アミノ酸配列を変更して変異（mutation）を加えたり、5’末端や3’末端に制限酵素サイト、Gateway組み換えサイトを加えたりできます。 iv) 逆翻訳された配列は、下段の [View In Silico DNA] をクリックすると、VectorNTI Molecule Viewerで表示されます。


15

4) 疎水性等のグラフ表示 (BioAnnotator) i) メニューバー＞[Analyses]＞[BioAnnotator]＞[Analyze

Selected Molecule] を選択して下さい。 ii) Hydrophobicity のグラフが表示されます（右図→）。

iii) メニューバー＞[Analyses]＞[Analyses Setup] を選択すると、画面設定が表示されます。

iｖ) [Analyses list] を選択すると、グラフの選択画面が表示されます。目的のものをダブルクリックして下段に表示させ、[OK] をクリックすると、そのグラフが表示されます。

5) モチーフ検索 (Run Analysis Monitor) PFAM, PROSITE のモチーフ検索を行うことができます。 i) 目的のタンパク質を開いておき、メニューバー＞[Analyses]＞[Run Analysis Monitor] を選択して下さい。 ii) 解析に使える機能が表示されます（右図）。ここでは PFAMを選び、[Apply] をクリックして下さい。

iii) 解析画面が表示されます。条件を確認後、[Submit]をクリックして下さい。


16

iv) 解析完了後にそのデータを開くと、ヒットした配列が元のデータと一緒に表示されます。薄茶色で表示されている部分がヒットしたモチーフです。

※ PROSITEはライセンスの都合上、初期インストールには含まれておりません。下記のサイトでライセンスをご確認の上、ダウンロードしてご利用ください。併せて、PFAMのアップデート方法もご覧ください。 # PROSITE # 1. http://www.expasy.org/prosite/ にアクセスして下さい。 2. ウェブ画面から Download by FTP をクリックして下さい。 3. releaseディレクトリより prosite.dat をダウンロードして下さい。 4. ダウンロードした prosite.dat をファイル名を変えずに、そのまま C:\VNTI Database\AM に保存して下さい。 # PFAM # 1. http://pfam.wustl.edu/ にアクセスして下さい。 2. PFAM_ls または PFAM_fs をダウンロードして下さい。（PFAM_ls が一般的です） 3. ダウンロードしたファイルを解凍し、ファイル名を PFAM に変更して下さい。 4. C:\VNTI Database\AM にある PFAM ファイルを上書き保存して下さい。


17

6666 Align X Align X Align X Align X （（（（マルチプルアラインメントマルチプルアラインメントマルチプルアラインメントマルチプルアラインメント））））・ Vector NTI データベースエクスプローラにて、アラインメントを行いたいデータを選択後、[メニューバー]＞[Align]＞[Align X- Align Selected Molecule] を選んで下さい。・直接立ち上げたい時は、Windowsスタートメニュー＞[すべてのプログラム]＞[Invitrogen]＞[Vector NTI Advance 11]＞[Align X] を選択、起動して下さい。

1) Align X の画面が立ち上がります。もし対象データを追加する場合は、[メニューバー]＞[Project]＞[Add Files] を選択して、アラインメントを行いたいデータをインポートします。（Drag&Dropでもインポートできます）

2) 左上のデータペインからデータを選択し、ツールバーの Align アイコンをクリックして下さい。


18

3) 結果が表示されます。左中段のガイドツリーはアミノ酸配列で 4つ以上のデータを使用したときのみ表示されます。

4) 下段のアラインメントペインの配色を変更することができます。ツールバーのAlignment Display Setup アイコンをクリックするか、アラインメント上で右クリック＞[Display Setup] を選択すると設定画面が表示されます。

5) アラインメント後に手作業でアラインメント結果を編集することができます（ギャップ周辺のみ）。下段のアラインメントペイン上で右クリック＞[Edit Alignment] を選択して下さい。下図が表示されます。移動したい配列を選択後、左下にあるアイコンを用いて左右に移動させてください。

6) 保存について。アラインメント結果はプロジェクトファイルとして保存します。 Save Project アイコンをクリックするか、メインメニュー＞[Project]＞[Save As]を選んで保存して下さい。

7) Microsoft Wordへのコピーについて。アラインメントペイン(下段）がアクティブになっている状態で、Cameraアイコンをクリックして下さい。右図が表示されます。 Format: Text、Wrap Sequencesにチェックをつけ、[OK]をクリックして下さい。その後、Word にて貼付けを行うことによりコピーできます。フォントをMSゴシックなどの等幅フォントにすると見やすいです。文字の背景色は、Word の "蛍光ペン" 機能が利用されています。他のソフトでは背景色は反映されません。


19

8) アラインメントペイン(下段)に Feature情報を表示。使用した配列に Featureが登録されている場合は、アラインメントペインにその情報を表示することができます。テキストペイン(左上段）で、表示したい配列を右クリックし、[Show all Features for XXX]を選択してください。

9) グラフの追加について。グラフペイン(右上段）がアクティブになっている状態で、List of Analysis ( ) アイコンをクリックして下さい。または、メニューバーより [View]＞[List of Analysis] を選択してください。右図が表示されます。上段より画面に表示させたい関数をダブルクリックして下段に移してください。下段のリストにて "Consensus"と記載のものはコンセンサス配列をグラフ表示します。 "Consensus" と記載部分をクリックすると各配列ごとのグラフを表示できる "Alignment" に切り替わります。 [OK]をクリックすると、右図のように追加のグラフが表示されます。


20

7777 Contig Express Contig Express Contig Express Contig Express （（（（フラグメントフラグメントフラグメントフラグメントののののアッセンブルアッセンブルアッセンブルアッセンブル））））・ Vector NTI データベースエクスプローラにて、メニューバー＞[Assemble]＞[ContigExpress- Open New

Assembly Project] を選んで下さい。・直接立ち上げたい時は、Windowsスタートメニュー＞[すべてのプログラム]＞[Invitrogen]＞[Vector NTI Advance 11]＞[ContigExpress] を選択、起動して下さい。

1) Align X の画面が立ち上がったら、メニューバー＞[Project]＞[Add Fragments]＞[From XXX ｆile] を選択して、アッセンブルを行いたいフラグメントデータをインポートしてください。 ※ 利用できるデータは abi, alf, esd, scf, Phred (.seq), Phrap ACE (.ace) など。 ※ Drag&Dropでもインポートできます。 ※ インポート時に、下図のような、ファイルの中に記載のシークエンス名をそのまま使うかどうかの確認画面が出ることがあります。 [はい] をクリックして下さい。

2) フラグメントの確認。各フラグメントはダブルクリックにより開くことができます。波形を見ながらデータをチェックして下さい。この画面で配列を修正する事ができます。画面下部のタブをクリックすることで、情報、シークエンス、波形ペインの表示を変更することができます。

※ もし旧バージョンの表示レイアウトに変更する場合は、メニューバー＞[View]＞[Edit Pane Layout] にて Standard を選択し、[OK] をクリックしてください。


21

3) トリミング - フラグメントの両末端をトリミング：トリミングしたいフラグメントを選択後、メニューバー＞[Edit]＞[Trim Selected Fragment Ends...] を選んでください。左下図が表示されますので、[Settings] ボタンをクリックして下さい。トリミング設定画面（右下図）にて条件を設定し、[OK] ボタンをクリックして下さい。その後、[Calculate] ボタンをクリックして計算後、[OK] をクリックして下さい。

4) トリミング - ベクター由来データのトリミング：やや複雑ですので、初めてContigExpressをご利用の際は、このステップはパスしてください。 i) 利用するベクターを登録します。ベクターデータを Molecular

Viewer で開き、マルチクローニングサイトを選択してください。 ii) その状態で、メニューバー＞[Tools]＞[Send to]＞[Polylinker to

Contig Express] を選択してください。（右図） iii) 確認画面が表示されますので、[Selection Only] と [Direct] にチェックがついていることを確認し、[OK] をクリックして下さい。 iv) ファイル名を指定する画面が表示されます。適当な名前をつけて、[保存] をクリックして下さい。 v) ContigExpressにて、トリミングしたいフラグメントを選択後、メニューバー＞[Edit]＞[Trim Selected

Fragment For Vector Contamination] を選んで下さい。次画面で [Setting] をクリックして下さい。 vi) 左のボックス表示されているベクターリストから、目的のものをクリックしてください。 vii) [Add REN Sites] をクリックし、Enzlist25.dat ファイルを開いてください。 viii) 制限酵素サイトが表示されるので、遺伝子を挿入されている制限酵素をクリックして下さい。または、挿入部位にカーソルを合わせ、 [Add

Insertion Point] をクリックすることで直接指定できます。 ix) 前画面に戻ります。 [Calculate] をクリックしてトリミング部分を計算させ、[OK] をクリックして下さい。


22

5) オートクリッピング- フラグメントの両末端をトリミング： VectorNTI Ver.10以降で追加された機能です。前述のトリミングがアッセンブル前に行うのに対し、このオートクリッピングはアッセンブルの実行を行った時に、各配列の類似性やQV値を元に各フラグメントの両末端をトリミングする機能です。デフォルトでONになっています。オートクリッピング機能をONにしていると、一旦アッセンブルしたデータを、他の配列データを加えて再アッセンブルする場合、最初のアッセンブル結果は消去されます。 OFFにする場合は、 1) メニューバー＞[Assemble]＞[Assembly Setup] を選択後、

[Clipping] タブを開いてください。 2) Use Automatic Clipping のチェックボックスからチェックをはずし、[OK] をクリックしてください。

6) アッセンブルの実行。アッセンブルを行うフラグメントを選択後、ツールバーのAssembleのアイコンをクリックして下さい。

アッセンブルの結果が表示されます。データペインから "Contig 1" をダブルクリックして下さい。

7) コンティグデータの表示・編集。


23

1) 波形を表示させるには、ツールバーの [Show/hide Chromatgrams] アイコンをクリックして下さい。全てのフラグメントを表示させるときは、アライメントペイン上で右クリック＞[Show All Chromatgrams] を選択して下さい。 2) フラグメント間で一致しなかった塩基は、コンティグ配列（アラインメントペインの最下部）では N と表示されます。ツールバーの [Find Next Ambiguous] アイコンをクリックすると、N と表示されている部分に移動できます。 3) フラグメント間で一致していない部分は、グラフィックペインの最下部に緑色の線で表示されます。この緑線の幅が広いほどミスマッチが発生しています。 4) ｒead-only モードとなっています。編集時には、メニューバー左端の Edit mode 切替ボタン（）をクリックし、Editモードにしてください。 5) 各フラグメントの配列、あるいは最下段に表示される

Contig配列を編集してください。 6) 編集終了後、画面を閉じる時に変更を適用するかどうか（Apply change to…?）の画面が表示されます。適用するときは [はい] を選択してください。 ※ ペインレイアウトを変更する場合は、メニューバー＞[View]＞

[Edit Pane Layout] で変更してください。 ※ コンティグ全体の方向を入れ替える場合は、グラフィックペインにて、メニューバー＞[View]＞[Reverse Complement

Contig] を選んでください。

8) コンティグデータのエクスポート。以下の２つの方法があります。・ "Contig 1" を Drag&Dropで、VectorNTI データベースエクスプローラへ直接エクスポートできます。データ名を入力するメッセージが表示されますので適当な名前をつけて保存してください。・ "Contig 1" を選択した状態で、メニューバー＞[Project]＞

[Export item]＞[To GenBank file] を選択してください。 GenBankファイルとして保存する事が出来ます。

9) アッセンブル結果の保存。アッセンブルの結果はプロジェクトとしてファイルに保存できます。コンティグの表示画面(ステップ5の画面）を閉じ、プロジェクトの画面に戻って下さい。 [Save Project] アイコンをクリックし、保存してください。ステップ5で作成したコンティグ配列を配列データとして利用する場合は、"Contig 1" を VectorNTI データベースエクスプローラーに Drag&Drop して下さい。波形情報は削除され、配列情報として登録されます。


24

8888 Entrez Entrez Entrez Entrez 検索検索検索検索（（（（GenBank GenBank GenBank GenBank やややや PubMed PubMed PubMed PubMed のののの検索検索検索検索））））・ Vector NTI データベースエクスプローラにて、 [メニューバー]＞[Tools]＞[Open]＞[Retrieve from NCBI Entrez Server] を選んで下さい。

1) 画面左上のプルダウンメニューにて、Pubmed, Nucleotide, Protein などから、検索したいものを選んで下さい。

2) Terms の欄に、検索キーワードを入力してください。 3) [Search] をクリックして下さい。

4) 検索結果がリストアップされます。リストの左端のアイコンまたは id 番号をダブルクリックすると、内容が表示されます。

5) 検索対象がNucleotideやProteinの場合、VectorNTIで表示されます。


25

6) Pubmed の場合、Citation Viewer （左下図）で表示されます。 PubMed と類似の表示となります。

参考文献は、VectorNTI データベースエクスプローラに保存しておく事ができます（右上図）。エクスプローラ左上のプルダウンメニューより Citation を選ぶと内容が表示されます。エクスプローラより文献を選択し、右クリック＞[Copy Bibliography] を選択すると、各論文雑誌に沿ったフォーマットでデータをコピー＆ペーストする事が出来ます。（右図）

7) Structure の場合、3D Viewer (下図）で表示されます。


26

9999 Gateway Gateway Gateway Gateway クローニングクローニングクローニングクローニングエントリークローンの作成 1) ベクターに挿入したい領域を選択して下さい。

2) メニューバー＞[Cloning]＞[Gateway Cloning]＞[Create an Entry Clone]＞[Amplify selection to use in BP reaction] を選んで下さい。

3) プライマー設計画面（右図→）が表示されます。プライマーの条件、5' 末端/3' 末端の付加配列を設定し、[OK] をクリックして下さい。 ※対象となる配列を変更したい場合は、C:¥Program Files¥Invitrogen¥Vector NTI Advance 11¥ に保存されている gwcloning.xml をメモ帳などで開き、編集・保存してください。

4) プライマーが設計され、テキストペイン(左上のペイン）に表示されます。と同時に、Gatewayクローニングをこのまま続けるかどうかのメッセージ（右図→）が表示されます。選択ボックスの両方にチェックをつけて、[OK] をクリックして下さい。

5) ステップ(4)で設計したプライマーを用いたPCR産物と、Gateway BP反応に用いるドナーベクターを選択する画面が表示されます。 1. 上段右側にある [Add] をクリックすると、ドナーベクター選択画面が表示されます。目的のドナーベクターを選択し、[OK] をクリックしてください。 2. 選択したドナーベクターがリストアップされます。 3. ドナーベクターを確認後、[次へ] をクリックしてください。

4. 確認画面が表示されます。 [完了] をクリックしてください。


27

6) 目的の遺伝子とドナーベクターを用いて設計されたエントリークローンが表示されます。発現クローンの作成ステップへ進む場合は、一旦データを保存してください。

発現クローンの作成 7) エントリークローンが開いている状態で、メニューバー＞[Cloning]＞[Gateway Cloning]＞[Create an

Expession Clone by LR] を選んでください。

8) 発現ベクターの選択画面が表示されます。ステップ(5)と同様にして発現ベクターを選択し、 [次へ]をクリックしてください。その後、確認画面が表示されますので、[完了] をクリックして下さい。

9) 発現クローンが表示されます。


28

10101010 TOPOTOPOTOPOTOPO クローニングクローニングクローニングクローニング PCRPCRPCRPCRプライマプライマプライマプライマーーーー設計設計設計設計をををを行行行行うううう場合場合場合場合 1) ベクターに挿入したい領域を選択して下さい。

2) メニューバー＞[Cloning]＞[TOPO Cloning]＞[Amplify selection to use in TOPO reaction] を選んで下さい。

3) プライマー設計画面（右図→）が表示されます。プライマーの条件、TOPOクローニングのタイプを設定し、[OK] をクリックして下さい。 ※右図の赤く囲ったところが、TOPOクローニングのタイプです。 Zero-Blunt: 両末端が平滑末端DNAのクローニング用。 T-A: 3' -A 突出末端を持つDNAのクローニング用。 Directional: センス鎖の5'末端に CACC 配列をもち、もう一端が平滑末端となっているDNA用

4) プライマーが設計され、テキストペイン(左上のペイン）に表示されます。と同時に、クローニングウィザードをこのまま続けるかどうかのメッセージ（右図→）が表示されます。選択ボックスの両方にチェックをつけて、[OK] をクリックして下さい。


29

5) ステップ(4)で設計したプライマーを用いたPCR産物と、TOPOクローニング反応に用いるベクターを選択する画面が表示されます。 1. 下段右側にある [Add] をクリックすると、ベクター選択画面が表示されます。目的のベクターを選択し、

[OK] をクリックしてください。 2. 選択したベクターがリストアップされます。 3. ベクターを確認後、[次へ] をクリックしてください。

6) 確認画面が表示されます。 [完了] をクリックしてください。

7) 目的のインサートが入った TOPOクローンの完成です。 ※ Blunt, TAの場合、インサートが正逆両方向のクローンが考えられるため、２つのファイルが生じます。


30

遺伝子遺伝子遺伝子遺伝子データデータデータデータからからからから直接行直接行直接行直接行うううう場合場合場合場合 1) ベクターに挿入したい領域を選択して下さい。

2) メニューバー＞[Cloning]＞[TOPO Cloning]＞[Launch Wizard] を選んで下さい。 3) ベクターに挿入したい領域 (Inserts) と、TOPOクローニング反応に用いるベクターを選択する画面が表示されます。

1. 下段右側にある [Add] をクリックすると、ベクター選択画面が表示されます。目的のベクターを選択し、[OK] をクリックしてください。（Bluntタイプのみ利用可能です。） 2. 選択したベクターがリストアップされます。 3. ベクターを確認後、[次へ] をクリックしてください。

4) 確認画面が表示されます。 [完了] をクリックしてください。

5) 目的のインサートが入った TOPOクローンの完成です。


31

11111111 GENEARTGENEARTGENEARTGENEART クローニングクローニングクローニングクローニングはじめに VectorNTI Advance 11.5..1 に含まれるGENEARTは、日本語Windowsでは文字化けの都合により、そのままでは機能いたしません。お手数ですが、下記の作業により、文字化けの解消をお願いいたします。

1) VectorNTI を起動してください。 2) メニューバー＞[Tools]＞[Tools Manager]を選んで下さい。

3) Tools Manager の画面が表示されます。 1. 画面左側より、[Assemble]＞[GENEARTR Assemble.tq] を選択してください。 2. 画面右側より、[Rename] をクリックしてください。 3. [GENEARTR Assemble.tq] を [GENEART Assemble.tq] に変更してください。 4. 画面右側より、[OK] をクリックしてください。 5. 画面右側より、[Rename] をクリックしてください。

4) VectorNTI を一旦終了し、立ち上げ直してください。

5) 以上で、GENEART機能が使用できるようになりました。メニューバー＞[Assemble]＞[GENEART Assembly] が表示されるようになります。


32

SeamleSeamleSeamleSeamless Cloningss Cloningss Cloningss Cloningについてについてについてについて GENEARTには簡単に遺伝子配列をつなぎ合わせるための Seamless Cloning と、複数本のフラグメントを効率的につなぎ合わせるための High Order Assembly の2種類があります。ここでは Seamless Cloningについて説明いたします。 High Order Assembly についても同様の方法でご利用ください。

1) GENEARTでアッセンブルするためのフラグメントを準備してください。 ※ GENEART Assembly Tool内では、配列の一部分だけを読み込むことができません。お手数ですが、あらかじめ必要な部分を一つのフラグメント配列としてご用意をお願いします。 ※ 下記 (2) で操作する1本だけは、選択した部分だけを利用できます。

2) GENEARTでアッセンブルする配列の一つを選択し、メニューバーの [Assemble]＞[GENEART Assembly] を選択して下さい。

3) 対象部分を選択し、[OK] をクリックして下さい。

4) GENEART Assembly Tool が立ち上がります。クローニングに用いるベクターやアッセンブルするフラグメントを追加して下さい。 ※ 利用するDNAの末端 (平滑、3'-突出、5'-突出）にご注意ください。このGENEART Assembly Toolでは、現在のところ 5'-突出末端には対応しておりません。

5) 最初に登録した配列が Vector の扱いとなっております。ベクターにチェックを入れてください。


33

6) PCRにて増幅してつなぐ場合、Amplify の欄にチェックをつけ、内容を確認後、[Assemble] をクリックして下さい。

7) 保存先の Subset、配列名を入力し、[OK] をクリックして下さい。

8) 設計されるプライマーの名前を入力し、[OK] をクリックして下さい。

9) 元の配列に含まれていた Feature情報を利用するかどうかの確認画面が表示されます。 [Yes] または [No] をクリックして下さい。 ※ GENEART Assemblyを行った際に Feature情報の位置がずれてしまうことがあります。 Assembly終了後、Feature情報がずれていないかご確認ください。

10) GENEART Seamless Cloning によって得られるクローンが設計できました。

11) メニューバーの [list]＞[Oligo List] を選択すると、GENEARTクローニング用に設計されたプライマーが表示されます。 ※ Oligo List は一時的な保存スペースです。 1本ずつ配列を選択し、[Save]をクリックしてデータベースに保存して下さい。データベースに保存したオリゴあるいは不要なオリゴは [Remove] により削除して下さい。

Documents

Vector NTI AdvanceVector NTI Advance · Vector NTI AdvanceVector NTI Advance クイックスタートガイドクイックスタートガイド ... `abckl opn,01