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Veränderbarkeit des Säugetiergenoms durch Crispr-Cas: Was wissen wir und was können wir erwarten Franz Hofmann, Pharmakologie, TU München Biologentag 2017 des VBIO-NRW: Genom-Editierung und Gentherapie Edierung

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Veränderbarkeit des Säugetiergenoms durch Crispr-Cas:

Was wissen wir und was können wir erwarten

Franz Hofmann, Pharmakologie, TU München

Biologentag 2017 des VBIO-NRW: Genom-Editierung und GentherapieEdierung

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Klassische Gen-Modifizierung mit dem Cre-lox-System

Embryonale Stammzellen

Identifizierung der Zelle, die das mutierte Gen enthält

Transfektion mit Cre und Entfernung der NeoTK Kassette

Identifizierung der Zelle, die das mutierte Gen enthält

Vermehrung dieser Zelle und Injektion der Zellen in Blastozyste

Selektion des Babies mit dem gewünschten GenotypBrandmayr et al J Biol Chem. 287(27): 22584 (2017)

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Die neuen programmierbaren Systeme

ZFN Zinkfinger-Nukleasen

TALEN Transcription activator-like effector nucleasen

CRISPR/Cas9-System clustered regularly interspacedshort palindrome repeats /CRISPR-associated endonuclease

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Jackson et al., Science 2017 356, eaal5056 7 April 2017

CRISPR-Cas adaptation and defense.

L = leader sequence

R = repeat squences

Color = spacer = foreign sequence

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Doudna & Charpentier SCIENCE 346: 1077 (2014)

Protospacer adjacent motif (PAM)

5'-NGG-3'

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Nukleasen mit verschiedenen PAM-

Spezifitäten

Type I = mehrere kleine Cas-Proteine

Cas 3 dsDNA

Type II = Cas 9 dsDNA

Type IIIA = Csm6 dsDNA

Type IIIB = Cmr4 RNA

Komor et al (2017) Cell 168: 20

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Komor et al (2017) Cell 168: 20

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Modified from SCIENCE 346: 1077 (2014)

Examples of cell types and organisms that have been engineered using CRISPR/Cas9

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Modifizierung Humaner Gene in vitroBlutzellen und Blutstammstellen

Transfektion der Zellen mit Crispr/Cas

Vermehrung der transfizierten Zellen

Reinfundierung der modifizierten Zellen

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Gene Editing of CCR5 in Autologous CD4 T Cells of Persons Infected with HIV

Pablo Tebas, M.D., David Stein, M.D., Winson W. Tang, M.D., Ian Frank, M.D., Shelley Q. Wang, M.D., Gary Lee, Ph.D., S. Kaye Spratt, Ph.D., Richard T. Surosky, Ph.D., Martin A. Giedlin, Ph.D., Geoff Nichol, M.D., Michael C. Holmes, Ph.D., Philip D. Gregory, Ph.D., Dale G. Ando, M.D., Michael Kalos, Ph.D., Ronald G. Collman, M.D., Gwendolyn Binder-Scholl, Ph.D., Gabriela Plesa, M.D., Ph.D., Wei-Ting Hwang, Ph.D., Bruce L. Levine, Ph.D., and Carl H. June, M.D

N Engl J Med 370:901-910, 2014

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N Engl J Med 2017;376:848-55.

Gene Therapy in a Patient with Sickle Cell Disease

Jean-Antoine Ribeil et al

Sickle cell disease results from a homozygous missense mutation in the β-globin

gene that causes polymerization of hemoglobin S. Gene therapy for patients with

this disorder is complicated by the complex cellular abnormalities and challenges

in achieving effective, persistent inhibition of polymerization of hemoglobin S. We

describe our first patient treated with lentiviral vector–mediated addition of an

antisickling β-globin gene into autologous hematopoietic stem cells. Adverse

events were consistent with busulfan conditioning. Fifteen months after treatment, the

level of therapeutic antisickling β-globin remained high (approximately 50% of

β-like–globin chains) without recurrence of sickle crises and with correction of the

biologic hallmarks of the disease.

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N Engl J Med 2017;376:848-55.

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Non-Clinical development of in vitro and in vivo gene editing

Target

CCR5; HIVHBB; β-ThalassemiaDMD; Duchenne muscular dystrophyG6Pase; Glycogen storage disease type IACFTR; Cystic fibrosisPD-1; Cancer; melanoma

Als Nuklease wird benutzt ZNF, Talen, Crispr-Cas9

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Strategies for In Vivo Delivery of

CRISPR-Based Genome-Editing Agents

Komor et al (2017) Cell 168: 20

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Immuntherapie von Krebs

Prinzip: CAR-T-Zellen = Chimeric Antigen Receptor T-Zellen for advanced Therapies

Erfolgreich bei einigen hämatologischen Tumoren

Problem: Umgehung des Immunsystems / des Körpereigenen Abwehrsystems

Probleme: ZytokinsturmB-Zell Runterregulierung / AntikörpermangelKosten 50 -70 000 € pro Patient

Antibody-modified T cells: CARs take the front seat for hematologic malignanciesMarcela V. Maus, Stephan A. Grupp, David L. Porter and Carl H. JuneBlood 2014 123:2625-2635;

Tisagenlecleucel-T (Novartis) Therapie von B-Zell-akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL)

Axicabtagene ciloleucel (Kite Pharma Inc.) Therapie von refractory diffuse large B cell lymphoma (DLBCL), transformed follicular lymphoma and primary mediastinal B cell lymphoma

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An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma

Patrick A. Ott…& Catherine J. Wu: Nature 547,217;2017

Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer

Ugur Sahin … & Özlem Türeci: Nature 547, 222;2017

Melief CJM Nature 547, 165; 2017

Programmed cell death protein 1, PD-1 and/or CD279

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CRISPR-Cas9 mediated efficient PD-1 disruption on human primary T cells

from cancer patientsShu Su et al Scientific Reports 6, Article number: 20070 (2016)

First trial of CRISPR in people Chinese team approved to test gene-edited cells in people with lung cancer.

Nature 4 7 6 | N AT U R E | VO L 5 3 5 | 2 8 J U LY 2 0 1 6

First CRISPR clinical trial gets green light from US panel

The technique's first test in people could begin as early as the end of the year.

Nature 2016

Programmed cell death protein 1, PD-1and/or CD279

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Clinical trials of gene editing

PDCD-1 , Gene for Programmedcell death protein 1, PD-1and/or CD279

SHIM et al APS (2017) 38: 738–753;

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Problems associated with Gene Therapy

Off-target genotoxicity

Immunogenicity of Nucleases and Vectors

Pharmacokinetics and biodistribution

Tumorgenicity

Safety of delivery system

Efficacy

Duration of gene editing

Animal models for efficacy tests

Purity and Sterility of gene-editing therapeutics

Manufactoring processes

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Sperm injection Cas9 mRNA/sgRNAs injection

Culture9 hr

Embryo transfer

Mutant founders Surrogate mother

Gestation5 months

http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.01.027Niu et al. (2014) “Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos”

CRISPR-Cas9 modifies your DNA

Niu et al. Cell 156, 836–843, 2014

Modify the Mammalian Genom

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The Belgian Blue has a natural mutation in the myostatin gene which codes for the protein, myostatin ("myo" meaning muscle and "statin" meaning stop). Myostatin is a protein that acts to inhibit muscle development.

A Belgian Blue Bull

Phenotype sharedby cattle known as Piedmontese

(https://en.wikipedia.org/wiki/Belgian_Blue#cite_note-Kambadur-4)

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Not yet 5, he can hold seven-pound weights with arms extended, something many adults cannot do.

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Myostatin-KO Pigs created in South Korea

„Super-muscly pigs created by small genetic tweak” NATURE 523, 13-14, 2015

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Ziel Gen-Defekte bei einem Menschen korrigieren!

In Deutschland verboten!

Geht nur bei einem Embryo im 1-Zellstadium (Zygote).

Im anglo-amerikanischen Forschungsbereich ist das Experimentieren an menschlichen Embryonen bis zum 14 Tag nach Fusion von Spermium und Oocyte (Zeugung) erlaubt.

Korrektur eines defekten Genes

PID erlaubt die Sortierung von 3 oder 5 Tage alten Embryonen nach ~200 spezifischen Gendefekten, wenn es von einer Ethikkommission genehmigt wird.

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CRISPR-Cpf1 correction of muscular dystrophy mutations in human cardiomyocytes and miceYu Zhang, Chengzu Long, Hui Li, John R. McAnally, Kedryn K. Baskin, John M. Shelton, Rhonda Bassel-Duby, Eric N. Olson

Sci. Adv. 2017;3: e1602814

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Repair of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD)

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McNally & Wyatt (2017) Circulation. 136:979-981

Eteplirsen (EXONDYS 51 ®)

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CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human zygotes using Cas9 protein

Tang, L., Zeng, Y., Du, H. et al. Mol Genet Genomics (2017). doi:10.1007/s00438-017-1299-z

Previous works using human tripronuclear zygotes suggested that the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9 system could be a tool in correcting disease-causing mutations. However, whether this system was applicable in normal human (dual pronuclear, 2PN) zygotes was unclear. Here we demonstrate that CRISPR/Cas9 is also effective as a gene-editing tool in human 2PN zygotes. By injection of Cas9 protein complexed with the appropriate sgRNAs and homology donors into one-cell human embryos, we demonstrated efficient homologous recombination-mediated correction of point mutations in HBB and G6PD. However, our results also reveal limitations of this correction procedure and highlight the need for further research.

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Human 3PN Embryos; nicht lebensfähig

Indel efficiency HDR efficiency NHEJ efficiencyRAG1 60% 60%NEK1 70% 69%G6PD 70% 5% 10-20% HBB 5% 10%

Human 2PN Embryos; Gesund normal

ß-Thalassemia; stop codon at the 59th codon of HBB

male sperm heterozygous for ß-thalassemia + normal human oocytes

4 embryos that are heterozygous

2 embryos with indels from them 1 embryo with correction of ß-thalassemia HHB gene.

G6PD Mutation G1376T correction apparently more efficient (100%)

Indel = Insertionen und Deletionen

Human β-globinGlucose-6-Phosphate-DehydrogenaseNIMA (never in mitosis gene a)-related kinase 1

Recombination activating gene 1

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WINBLAD N & LANNER F Nature 548; 398 (2017)

Correction of a pathogenic gene mutation in human embryos

Ma H, …….. & Mitalipov S Nature in press (2017) MYBPC3 gene: 42 of 58 embryos tested (72.4%) were corrected

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Assembly of embryonic and extraembryonic stem cells to mimic embryogenesis in vitro

Sarah Ellys Harrison, Berna Sozen, Neophytos Christodoulou, Christos Kyprianou, Magdalena Zernicka-Goetz

Science 14 Apr 2017: Vol. 356, Issue 6334, pp. 137-138

In vitro stem cell–embryos model mouse embryo development from implantation to gastrulation.

naturel

Embryonic stem cells +Extraembryonic trophoblast stem cells

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JOHN AACH, JEANTINE LUNSHOF, ESWAR IYER AND GEORGE M CHURCH

Addressing the ethical issues raised by synthetic human entities with embryo-like features

eLife 2017;6:e20674.

The "14-day rule" for embryo research stipulates that experiments with intact human

embryos must not allow them to develop beyond 14 days or the appearance of the primitive streak.

However, recent experiments showing that suitably cultured human pluripotent stem cells can selforganize

and recapitulate embryonic features have highlighted difficulties with the 14-day rule and

led to calls for its reassessment. Here we argue that these and related experiments raise more

foundational issues that cannot be fixed by adjusting the 14-day rule, because the framework

underlying the rule cannot adequately describe the ways by which synthetic human entities with

embryo-like features (SHEEFs) might develop morally concerning features through altered forms of

development. We propose that limits on research with SHEEFs be based as directly as possible on

the generation of such features, and recommend that the research and bioethics communities lead a

wide-ranging inquiry aimed at mapping out solutions to the ethical problems raised by them.

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Figure 1. Biological landscape of embryos and Synthetic human

entities with embryonic features (SHEEFs) in relation to moral

status. Embryos derived through sexual intercourse or assisted

insemination (Cantineau et al., 2013; Hurd et al., 1993) (left),

cultured embryos (center), and SHEEFs (right) start from types

of pluripotent cells (zygotes and hPSC; bottom) that have

different capacities for development: Embryos formed from

zygotes derived sexually can develop into fetuses in utero

(vertical arrows, left). Embryos can also be generated from

zygotes formed in vitro

Aach et al. eLife 2017;6:e20674.

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vector-borne diseases MosquitoesErkrankung

Malaria

Dengue

Zika

Unterbindung der Übertragung des Vektors z.B. Expression eines Gens, das den Vektor zerstört

Wildtyp Mosquito in einen Vektor-zerstörenden Mosquito umwandeln

Gene Drives

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Valentino M. Gantz and Ethan Bier. The mutagenic chain reaction: A method for converting heterozygous to

homozygous mutations. SCIENCE 348:442 – 444, 2015

Oye et al. Regulating gene drives. SCIENCE 345: 626 – 628, 2015

Gene Drive

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Prinzip eines Gene Drive Konstrukts

Champer et al NATURE REVIEWS | GENETICS 17:146-159; 2016 |

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A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria

mosquito vector Anopheles gambiaeHammond et al. NATURE BIOTECHNOLOGY 34: 78-83; 2016

Inactivation of 3 genes recessive female-sterility phenotype

US National Academies Hit the Brakes on Gene Drive–Modified Organisms 2016

Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector

mosquito Anopheles stephensiGantz et al. PNAS E6736–E6743;2015

Expression of two antibodies that target the human malaria parasite Plasmodium falciparum ookinete protein Chitinase

1 and the circumsporozoite protein (CSP). Prevention of sporocoites and, therefore, were incapable of transmitting

parasites

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Möglicher Gebrauch von Gene-Drives

Esvelt et al. eLife 2014;3:e03401.

Esvelt wird gefördert für Development of Gene-DrivesVon US Defense Advanced Research Projects Agency(DARPA)

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Novel CRISPR/Cas9 gene drive constructs revealinsights into mechanisms of resistance allele formation and drive efficiency in geneticallydiverse populations.Champer J, …….Messer PW.

Plos Genet.:2017 Jul 20;13(7):e1006796.

In a heterozygous female with genotype D/+, expression

of Cas9 in a germline cell can produce one of three outcomes: (i)

successful conversion of the wild type allele into a drive

allele by HDR, (ii) formation of a resistance allele when HDR is

incomplete or cleavage is repaired by NHEJ, or (iii)

continuing presence of the wild type allele if no cleavage occurred or

was perfectly repaired. For our nanos construct in

the w1118 line, we observed successful germline conversion in D/+

females at a rate of approximately 60%, leaving 80%

of gametes with gene drive alleles. Almost all remaining gametes

(20%) contained resistance alleles, with only less than

1% of gametes carrying a wild type allele.

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Question:

Who transfers the first gene-corrected human zygote to a pseudo-pregnant female?

Which country allows that?

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A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunityKimberley D. Seed, David W. Lazinski, Stephen B. Calderwood, and Andrew Camilli,*

Nature. 2013 February 28; 494(7438): 489–491.

Use natural or engineered bacteriophages that encode Crispr/Cas to destroy bacterial resistance genes for antibiotics

Problems: Phages are strain or even substrain specific Bacteria could evolve resistance to phages Engineered phages have not been tested in humans Phages may trigger immune response in humans Phages could transfer antibiotic-resistance genes to non-resistant bacteria

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Scheufele, DA et al. „U.S. attitudes on human genome editing.“ Science 357, 553 (2017)

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Danke fürs Zuhören