Embed Size (px)
Citation preview
Vergleichende Untersuchungen zum Saponingehalt
von Asparagus officinalis
von Diplom-Lebensmitteltechnologin
Anita Schwarzbach
aus Berlin
von der Fakultät III-Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Ingenieurwissenschaften
- Dr. Ing. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. H. Kunzek
Berichter: Prof. Dr. D. Knorr
Berichter: Prof. Dr. L. Kroh
Berichter: Dr. M. Schreiner
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 28. Januar 2004
Berlin 2004
D 83
1
Inhaltsverzeichnis 1 Allgemeiner Teil ..............................................................................................6
1.1 Einleitung.................................................................................................6
1.2 Spargel ....................................................................................................9
1.3 Saponine ...............................................................................................11
1.3.1 Steroidsaponine..............................................................................13
1.3.2 Saponine im Spargel ......................................................................17
1.3.3 Nachweismethoden ........................................................................22
1.4 Aufgabenstellung ...................................................................................24
2 Material und Methoden .................................................................................26
2.1 Geräte....................................................................................................26
2.2 Probenmaterial ......................................................................................27
2.2.1 Versuch 1: Einfluss der Bodentemperatur ......................................27
2.2.2 Versuch 2: Einfluss der Sorte .........................................................29
2.2.3 Versuch 3: Verpackungsversuch ....................................................29
2.2.4 Versuch 4: Thermostabilität von Saponinen ...................................31
2.2.5 Sonstiges Probenmaterial...............................................................32
2.3 Methoden...............................................................................................33
2.3.1 Extraktion........................................................................................33
2.3.2 DC-Methode zur qualitativen Bestimmung .....................................34
2.3.3 DC-Methode zur quantitativen Bestimmung ...................................37
2.3.4 Säulenchromatographie..................................................................39
2.3.5 Massenspektrometrie .....................................................................40
3 Ergebnisse und Diskussion...........................................................................41
3.1 Präparation ............................................................................................41
3.2 Qualitative Arbeiten und Identifizierung der Saponine ...........................43
3.3 Validierung der DC-Methode zur Gehaltsbestimmung...........................50
3.4 Quantitative Auswertung der Versuche .................................................51
3.4.1 Versuch 1: Einfluss der Bodentemperatur ......................................54
3.4.2 Versuch 2: Einfluss der Sorte .........................................................57
3.4.3 Versuch 3: Verpackungsversuch ....................................................62
3.4.4 Versuch 4: Thermostabilität von Saponinen ...................................65
2
3.4.5 Sonstige Proben .............................................................................70
3.5 Diskussion und Ausblick ........................................................................72
3.5.1 Einfluss von Sorte und Bodentemperatur auf den Saponingehalt ..74
3.5.2 Thermostabilität von Spargelsaponinen .........................................76
3.5.3 Einfluss von Lagerung und Verpackung .........................................77
4 Zusammenfassung .......................................................................................83
5 Summary ......................................................................................................85
6 Literaturverzeichnis.......................................................................................87
7 Anhang .........................................................................................................94
3
Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen Abbildung 1: Saponine vom Furostanol- und Spirostanol-Typ am Beispiel von zwei
Spargelsaponinen...................................................................................................14 Abbildung 2: 25 S- und 25 R-Formen ausgewählter spirostanoler Aglycone...................16 Abbildung 3: Derivatisierung eines bandförmig aufgetragenen Spargelextraktes mit
unterschiedlichen Reagenzien ................................................................................44 Abbildung 4: übereinander gelegte Densitogramme von zwei Spargelextrakten auf zwei
verschiedenen DC-Platten ......................................................................................45 Abbildung 5: Zweidimensionale DC eines Spargelextraktes (Farben invertiert) ..............46 Abbildung 6: Fragmentierung des Saponinmoleküls mit m/z 1047,7 ...............................47 Abbildung 7: Fragmentierung des Saponinmoleküls mit m/z 1061,7 ...............................48 Abbildung 8: Saponingehalt von 15 einzelnen Stangen der Sorte 'Gijnlim' der kalten
Variante ..................................................................................................................52 Abbildung 9: Gehalt an Einzelsaponinen (AS 1-AS 6) und Gesamtsaponin (AS ges.) der
Sorten und Temperaturvarianten aus Versuch 1....................................................55 Abbildung 10: Densitogramme verschiedener Proben aus dem Versuch 1.....................56 Abbildung 11: Gehalt an Einzelsaponinen und Gesamtsaponin (AS ges.) der Sorten aus
Versuch 2 ...............................................................................................................58 Abbildung 12: Saponingehalte und Signifikanzen aller Sorten im Vergleich der beiden
Erntetermine ...........................................................................................................60 Abbildung 13: ausgewählte Densitogramme aus dem Sortenversuch.............................61 Abbildung 14: Saponingehalt und Signifikanzen (p<0,05) von gelagertem Spargel.........62 Abbildung 15: Gesamtsaponin nach verschiedenen thermischen Behandlungen ...........65 Abbildung 16: Verlauf des Saponinabbaus in Spargelextrakten nach thermischer
Behandlung im Trockenschrank..............................................................................68 Abbildung 17: Saponingehalt und Standardabweichung von gefriergelagerten
Spargelproben ........................................................................................................70
4
Tabelle 1: Veröffentlichungen zu Spargelsaponinen .......................................................18 Tabelle 2: Saponinausbeute nach der ersten Säulenchromatographie über Kieselgel 60
...............................................................................................................................41 Tabelle 3: Mögliche Zuordnung der untersuchten Spargelsaponine................................50 Tabelle 4: Saponingehalt von 15 Einzelstangen der Sorte 'Gijnlim'.................................53 Tabelle 5: Mittelwerte und Standardabweichungen der Saponingehalte aus den einzelnen
Varianten aus Versuch 1.........................................................................................55 Tabelle 6: Anteil der Einzelsaponine am Gesamtsaponingehalt (%) ...............................57 Tabelle 7: Saponingehalt, Gehalt und prozentualer Anteil der Einzelsaponine sowie
Signifikanzen (p<0,05) im Sortenvergleich ..............................................................59 Tabelle 8: Mittelwert des Gesamtsaponingehaltes und Standardabweichung aus den
Einzelwerten der Verpackungsvarianten aus Versuch 3..........................................63 Tabelle 9: Saponingehalt, Signifikanzen und Standardabweichung von Spargelextrakt
nach thermischer Behandlung.................................................................................66 Tabelle 10: Saponingehalt und –verlust in rohen und gekochten Spargelproben ............69
5
Abkürzungsverzeichnis
AS Asparagus-Saponin (Asparagoside)
BOPP Biaxial-orientiertes Polypropylen
CA Controlled atmosphere
DC
Da
Dünnschicht-Chromatographie
Dalton
FM Fließmittel
FM Frischmasse
Glu Glucose
HPLC High Performance Liquid Chromatography
HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography
IGZ Institut für Gemüse und Zierpflanzenbau
Großbeeren/Erfurt e.V.
MAP Modified Atmosphere Packaging
MS Massenspektrometrie
NMR Nuclear magnetic resonance
Rf-Wert Retentionsfaktor
Rha Rhamnose
RI Refraktionsindex
TM Trockenmasse
VK Varianzkoeffizient
6
1 Allgemeiner Teil
1.1 Einleitung
Zur Gattung Asparagus L. gehören verschiedene Arten, die sich zum Teil in ihrem
äußeren Erscheinungsbild erheblich unterscheiden. Gemeinsam ist diesen
Pflanzen aus der Familie der Liliaceae ein ausdauernder Wurzelstock, der aus
dicken, fleischigen Wurzeln besteht. Aus diesem wachsen normalerweise
einjährige Sprosse, die mehr oder weniger stark verholzen. Sie können aufrecht,
büschelig verzweigt oder dünn und rankend sein. Diese Wildformen findet man in
Europa, Afrika (insbesondere im Mittelmeerraum) und Asien (Göschke, 1874).
Die kultivierte Form des Spargels ist die Gattung Asparagus officinalis L., deren
Sprosse als wertvolles Gemüse verzehrt werden.
Viele der Wildformen sind durch ihre Verwendung in der Volksmedizin bekannt.
Bei der wissenschaftlichen Untersuchung der entsprechenden Wirkstoffe stießen
die Forscher immer wieder auf Saponine. In einem Review aus Indien werden u.a.
Anwendungen von Asparagus gonocladus und Asparagus filicinus bei
Verdauungsbeschwerden, Rheuma oder Gicht genannt (Khaliq-uz-Zaman et al.,
1998). Insgesamt wurden 73 verschiedene Steroidsaponine als Wirkstoffe in
sieben Asparagus-Arten aufgeführt.
In einer anderen Arbeit wurde über die Wirkung von fünf Saponinen aus
Asparagus africanus gegen Protozoen in Äthiopien berichtet (Debella et al.,
1999).
Saponine sind Glycoside, die aus einem Aglycon- oder Geninteil sowie aus einem
oder mehreren Zuckeranteilen bestehen. Die Einteilung erfolgt nach der
Konstitution des Aglycons in Triterpenoidsaponine, Steroidsaponine und
Steroidalkaloidsaponine. Innerhalb dieser Gruppen ist die Anzahl der
Zuckerketten für die weitere Einteilung ausschlaggebend. Monodesmosidisch
werden Saponine mit einer Zuckerkette, vorwiegend am C-3 Atom, genannt.
Bisdesmosidische Saponine besitzen zwei voneinander unabhängige
Zuckerketten, meist an C-3 und C-28 bzw. C-26. Selten wurden bisher
7
trisdesmosidische, also drei Zuckerketten enthaltende, Saponine gefunden. Die
Zuckerketten können linear oder verzweigt sein. Bisher wurden maximal 11
Zuckereinheiten nachgewiesen. Die meisten Saponine enthalten zwei bis fünf
Monosaccharide, häufig unverzweigt. Als Zuckereinheiten kommen vor:
D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Fructose, D-Galacturonsäure, D-
Glucuronsäure, L-Rhamnose, L-Arabinose, L-Fucose, L-Arabinose, und 6-
Desoxyglucose. In einigen marinen Organismen wurde auch D-Chinovose
gefunden. D-Zucker sind meist α-glycosidisch, die L-Zucker aber immer ß-
glycosidisch gebunden (Tschesche and Wulff, 1973).
Des weiteren kann eine Einteilung in neutrale, saure und basische Saponine
erfolgen, je nach Art der funktionellen Gruppen.
Bisher gibt es keine einheitliche Nomenklatur für diese Stoffgruppe. Jedoch wird
häufig an den Namen der Pflanze, aus der das Saponin zuerst isoliert wurde, die
Endung –in (z.B. Asparasaponin, Dioscin) angehängt, während
Furostanolsaponinen die Endung –osid (z.B. Asparagosid, Ginsenosid) angefügt
wird. Manche Autoren verwenden für die Furostanolform die Vorsilbe Proto- z.B.
Protodioscin, Protogracillin (Tschesche and Wulff, 1973). Zur Unterscheidung
ähnlicher Saponine aus einer Pflanze werden häufig Buchstaben und/oder Zahlen
an die Bezeichnung angehängt (z.B. Soyasaponin A1, Ginsenosid Rb1). Wie später
noch deutlich werden wird, erhalten auch Saponine mit identischer Struktur
herkunftsspezifische Namen, was die Übersichtlichkeit erschwert (z.B. ist
Protodioscin aus Dioscorea collettii identisch mit ACS 2 aus Asparagus
officinalis).
Saponine kommen in ca. 75% aller Pflanzenarten vor und gehören mit Gehalten
zwischen 0,1 bis 30% in der Trockenmasse wohl zu den am häufigsten
auftretenden sekundären Pflanzeninhaltsstoffen (Tschesche and Wulff, 1973).
Der Name Saponin leitet sich von dem lateinischen Wort sapo = Seife ab. Diese
Bezeichnung ist auf die oberflächenaktiven Eigenschaften der Saponine
zurückzuführen, die schon seit Hunderten von Jahren als natürlich vorkommende
8
Detergentien verwendet wurden. Sie findet sich auch in einigen Namen der dafür
genutzten Pflanzen, z. B. Echtes Seifenkraut (Saponaria officinalis), Seifenbaum
(Quillaja saponaria) oder Seifennuss (Sapindus mukurossi). Darüber hinaus
weckten Saponine wegen ihrer heilenden Wirkungen schon früh das Interesse der
Forscher. In einem 1927 erschienen Buch "Die Saponine" (Kofler, 1927) wurden
sehr detailliert die Eigenschaften und pharmazeutischen Wirkungen der Saponine
beschrieben, obwohl zu diesem Zeitpunkt noch keine einzige dieser Substanzen
vollständig charakterisiert war. 60 Jahre später war die Struktur von über 100
Saponinen aufgeklärt, heute dürften es ca. 1000 sein.
Die Aufklärung der Struktur der Saponine erfordert langwierige und aufwändige
Techniken zur Isolierung und Strukturanalytik. Die Isolierung aus Pflanzenmaterial
wird erschwert durch Wechselwirkungen mit anderen Substanzen und durch
mögliche Strukturveränderungen während des Extraktionsprozesses (Tschesche
and Wulff, 1973).
Im Allgemeinen werden Saponine zuerst durch alkoholisch-wässrige Extraktion
aus der Probe gewonnen. Anschließend werden über weitere physikalische oder
chemische Aufreinigungsschritte noch vorhandene nicht-saponinige Bestandteile
aus dem Extrakt entfernt.
Zur qualitativen und quantitativen Analytik eignen sich chromatographische
Methoden, die eine Auftrennung der einzelnen Saponine mit anschließender
Detektion ermöglichen. Dazu sind Vergleichssubstanzen in reiner Form
(Standards) erforderlich. Die früher verwendeten Messungen der Schaumbildung,
der Hämolyseaktivität oder der Fischtoxizität werden heute für quantitative
Aussagen nicht mehr genutzt, da diese Eigenschaften nicht bei allen Saponinen
gleich ausgeprägt sind (Hostettmann and Marston, 1995).
Auch in den als Gemüse verzehrten weißen Sprossen von Asparagus officinalis,
sind Saponine nachgewiesen worden. Nur eine Studie beschäftigte sich bisher mit
der Quantifizierung der Gesamtsaponine (Fenwick and Oakenfull, 1983). Weitere
Veröffentlichungen bezogen sich auf die Strukturaufklärung und die Untersuchung
bestimmter biologischer Eigenschaften von Spargelsaponinen (Shao et al., 1996),
9
(Shimoyamada et al., 1990; Shimoyamada et al., 1996), (Kawano et al., 1977).
Über die Anteile der einzelnen Saponine sowie den Einfluss verschiedener Vor-
und Nacherntebedingungen ist jedoch noch recht wenig bekannt.
In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden ob es sortenspezifische
Unterschiede im Saponingehalt gibt und wie sich unterschiedliche
Bodentemperaturen während der Ernteperiode sowie thermische Behandlung und
Lagerung nach der Ernte auf den Saponingehalt der Spargels auswirken.
1.2 Spargel
Die Erntezeit für Spargel in Mitteleuropa ist etwa von März bis Juni, wobei Importe
aus Nordafrika und Südamerika den Angebotszeitraum erheblich verlängern.
Der Pro-Kopf-Verbrauch an Spargel betrug in Deutschland im Jahre 2002 1,4 kg,
der Anteil einheimischer Produktion lag bei über 50 % (Behr, 2002). In
Deutschland stellt Spargel auch in wirtschaftlicher Hinsicht eine attraktive Kultur
dar. So war in den letzten Jahren im Gegensatz zu anderen europäischen
Ländern eine stetige Zunahme der Anbaufläche zu verzeichnen.
Ein wichtiges Entscheidungskriterium für den Spargelanbau ist die Sortenwahl.
Sie muss einerseits den Standortbedingungen entsprechen und soll andererseits
möglichst konstante Erträge über den gesamten Erntezeitraum sichern. Es steht
ein beachtliches Sortenspektrum zu Verfügung. Man unterscheidet
niederländische, französische und deutsche Sorten (Ziegler, 2002).
Bisher sind Ertragszahlen und äußere Eigenschaften entscheidende
Auswahlkriterien für den Anbau. Innere Qualitätsmerkmale, wie der Gehalt an
bestimmten Inhaltsstoffen, spielen noch keine wesentliche Rolle. Lediglich das
Auftreten bitterer Stangen wird diskutiert.
Bitterer Geschmack in Gemüse kann durch verschiedene Stoffe hervorgerufen
werden. Es kommen sowohl anorganische Salze als auch Pflanzenterpenoide
und –phenole sowie durch Mikroorganismen gebildete Stoffe in Betracht
10
(Herrmann, 1992). Aus den weißen Sprossen von Asparagus officinalis wurde ein
Saponin als bitter identifiziert, während das zweite isolierte Saponin als nicht bitter
charakterisiert wurde (Kawano et al., 1977). Da Saponine als Bitterstoffe gelten,
erscheint es wahrscheinlich, dass auch gelegentlich auftretende Bitterkeit auf
Saponine zurückzuführen ist. Allerdings lässt sich noch nicht sagen, wie viel
Bitterkeit zum typischen Spargelgeschmack gehört. Verschiedene Arbeiten dazu
laufen gegenwärtig.
Die Inhaltsstoffe des Spargels sind (je 100 g Frischmasse):
Wasser 93,6 g
Roheiweiß 1,9 g
Rohfett 0,14 g
Kohlenhydrate 2,04 g
Verfügbare org. Säuren 0,16 g
Ballaststoffe 1,47 g
Mineralien 0,62 g
Außerdem enthält er verschiedene essentielle und nicht essentielle Aminosäuren,
Vitamine, Aromastoffe, Carotinoide und Pflanzenphenole (Souci et al., 2001).
Die Frischhaltung von Spargel gewinnt beim Ernten, Vermarkten, Lagern und
Verarbeiten eine immer größere Bedeutung. Die Wahl optimaler
Lagerbedingungen sowohl bei der CA-Lagerung (controlled atmosphere storage)
als auch der MAP (modified atmosphere packaging) ist daher ein entscheidendes
Kriterium für die Qualitätserhaltung (Geruch, Geschmack, Farbe, Konsistenz und
mikrobiologische Unbedenklichkeit) von gelagertem Spargel.
In verarbeiteter Form steht Spargel als Sterilkonserve, Gefrierkonserve oder als
Zusatz zu Fertiggerichten zur Verfügung.
11
1.3 Saponine
Saponine sind im Pflanzenreich sehr verbreitet, sowohl in Wildpflanzen als auch
in Kulturpflanzen. Nachfolgend werden hauptsächlich Pflanzen genannt, die als
Nahrungsmittel oder Tierfutter verwendet werden.
Die meisten der heute bekannten Saponine basieren auf einem triterpenoiden
Aglycon. Man findet sie, um nur einige Vertreter zu nennen, in verschiedenen
Bohnenarten und anderen Leguminosen, Erdnüssen, Spinat, Zuckerrüben,
Sonnenblumen, Alliumarten, Tee, Quinoa, Süßholz, Rosskastanie und Ginseng.
Sehr gut erforscht sind insbesondere die Saponine aus Soja. Steroidsaponine
sind hauptsächlich aus den Familien der Agavaceae, Liliaceae und
Dioscoreaceae bekannt.
Ihr Vermögen, in wässrigen Lösungen stabile Schäume zu bilden, gab den
Saponinen ihren Namen. Dieser Effekt ist auf die Zusammensetzung aus dem
apolaren (hydrophoben) Aglycon und dem polaren (hydrophilen) Zuckerrest
zurück zu führen.
Eine weitere charakteristische Eigenschaft ist die hämolytische Wirksamkeit, d. h.
die Zerstörung der Membran der roten Blutkörperchen (Erythrozyten).
Eine dritte bedeutende Wirkung der Saponine besteht in der Verringerung des
Blutcholesterinspiegels durch Bildung schwer- bzw. unlöslicher Komplexe mit dem
Steroid und ist daher bei der Herstellung von funktionellen Lebensmitteln von
Interesse.
Darüber hinaus gelten sie als Bitterstoffe, aber auch süß-schmeckende Saponine
sind beschrieben worden (Kennelly et al., 1996).
Toxische Eigenschaften gegenüber Fischen und Schnecken sind ebenfalls schon
sehr lange bekannt. Jedoch wurde erst mit verbesserten Methoden zur
Strukturaufklärung und Reindarstellung der Saponine deutlich, dass diese
Wirkungen sehr stark von der Struktur des Aglycons, der Anzahl und Position der
Zucker sowie weiteren funktionellen Gruppen abhängen.
Zur Toxizität gegenüber Kiemenatmern und Schnecken gibt es zahlreiche
Veröffentlichungen, u.a.(Sati et al., 1984),(Ndamba et al., 1994).
12
Für die perorale Aufnahme durch Warmblüter werden Werte von unter 50 mg kg-1
als nicht toxisch angegeben. Eine parenterale Injektion ist jedoch, je nach
Saponin, problematisch (Tschesche and Wulff, 1973).
Die Frage, welche Bedeutung Saponine für die Pflanze haben, wird noch
diskutiert.
Während zahlreiche Veröffentlichungen die Identifikation der Saponine, ihre
vielfältigen Auswirkungen auf tierische Zellen, aber auch auf Pilze und Bakterien
beschreiben, gibt es nur wenige, die sich mit der Funktion in der Pflanze
beschäftigen. Bekannt sind antimikrobielle, fungizide und insektizide Wirkungen.
Saponine gehören mit anderen Substanzen zu einer großen Gruppe von
sekundären Pflanzeninhaltsstoffen, die unterteilt werden in:
-"Phytoanticipine": diese werden aktiviert durch Pflanzenenzyme nach
Gewebezerstörungen oder Angriffen von Pathogenen und
-"Phytoprotectoren": diese haben generell antimikrobielle oder insektizide Aktivität
(Morrissey and Osbourn, 1999).
Außerdem dienen sie möglicherweise der Pflanze als Reserve für
Monosaccharide, da durch pflanzeneigene Enzyme endständige Zucker
abgespalten werden können.
Auch in niederen aquatischen Lebewesen wie Seestern, Seewalze oder Seegurke
konnten Saponine nachgewiesen werden (Sandvoss et al., 2001).
Viele Eigenschaften der Saponine werden ihrer Wirkung auf die Zellmembran
zugeschrieben, die zum einen auf der Oberflächenaktivität beruhen, zum anderen
durch die Komplexbildung mit Membransterolen aber auch mit Mineralien und
Spurenelementen wie Zink, Eisen oder Kalzium (Milgate and Roberts, 1995)
erklärt werden.
Zahlreiche Arbeiten sind publiziert, in denen weitere Eigenschaften von
Saponinen z.B. auf die Gewichtszunahme von Masttieren (Cheeke, 1996) oder
den Cholesterinstatus (Newman et al., 1996), (Amarowicz et al., 1994) untersucht
worden sind.
13
In mehreren Reviews liegen Zusammenfassungen der vielfältigen
Forschungsergebnisse zu Saponinen in Lebensmitteln (Oakenfull, 1981), (Price et
al., 1987), (Lasztity et al., 1998), zu biologischen Wirkungen auf Tiere (Francis et
al., 2002) sowie zu allgemeinen Eigenschaften und Wirkungen von Saponinen
(Mahato et al., 1982), (Milgate and Roberts, 1995) vor.
Antimikrobielle, immunmodulierende, entzündungshemmende und
antikanzerogene Effekte sind ebenfalls Gegenstand der Saponinforschung (Watzl
and Leitzmann, 1999).
Standen über Jahrzehnte die Saponine aus Heilpflanzen im Mittelpunkt
wissenschaftlicher Untersuchungen, so beschäftigen sich zahlreiche Studien der
letzten Jahre verstärkt mit saponinhaltigen Nahrungs- oder Futterpflanzen.
Danach verursachen einige Saponine geschmackliche Beeinträchtigungen durch
ihre Bitterkeit z.B. in Sojaprodukten (Price and Fenwick, 1984) oder
technologische Probleme durch Schaumbildung z.B. in Zuckerraffinerien (Ridout
et al., 1994).
Saponinhaltige Kräuter und Pflanzen werden u.a. bei der Herstellung und
Verarbeitung von Speisen verwendet als (Price et al., 1987)
Gewürz - z.B. Salbei (Salvia officinalis L)
Farbstoff - z.B. Ringelblume (Calendula officinalis L)
Zusatz von Vitamin C - z.B. Hagebutte (Rosaceae-Arten)
Schaumbildner - z.B. Quillajarinde (Quillaja saponaria)
Süßungsmittel - z.B. Lakritze (Glycyrrhiza glaba)
1.3.1 Steroidsaponine
Steroidsaponine sind zwar nicht so weit verbreitet wie Triterpensaponine, jedoch
findet man sie in vielen Vertretern der Monocotyledoneae (Einkeimblättrige),
insbesondere in den Liliaceae, Dioscoreaceae und Agavaceae, die entweder als
Nahrungsmittel (z.B. Yamswurzel) oder als Rohstoffe von Bedeutung sind. So
wurde Diosgenin, das Aglycon zahlreicher Steroidsaponine, lange Zeit als
Ausgangsmaterial für die Steroidhormon-Produktion verwendet (Takeda, 1972).
14
Es kann aus Wurzeln mancher Dioscoreaceae mit einer Ausbeute von 7%
gewonnen werden.
Es gilt heute als gesichert, dass Cholesterol die Vorstufe für die Biosynthese der
Steroidsapogenine ist, wobei der Verlauf dieses Prozesses noch nicht vollständig
verstanden ist (Schmittmann, 1993). Die Steroidsaponine unterteilen sich in zwei
Gruppen – Spirostanole und Furostanole (s. Abb. 1).
Abbildung 1: Saponine vom Furostanol- und Spirostanol-Typ am Beispiel von zwei Spargelsaponinen
(Glu = Glucose; Rha = Rhamnose)
Rha1Rha1
2
3
1H
OGlu
22
O
OCH3
2
3
1H
O
22
O26
O-GluOH
Glu
Rha1Rha 1
2 4
2 4
Furostanol-Typ am Beispiel von ACS 2
Spirostanol-Typam Beispiel von AS 2-I
15
Als ACS 2 wurde das in Spargel nachgewiesene Protodioscin bezeichnet (Shao
et al., 1996) und AS 2-I stellt die 25 S-Form des ebenfalls aus Dioscorea-Arten
bekannten Dioscins dar (Shimoyamada et al., 1996)
Die Zuckerkette an der OH-Gruppe des C-3 Atoms besteht bei beiden Formen
meist aus mehreren verzweigten oder unverzweigten Zuckern. Bei den
Furostanolen ist der endständige Sauerstoffring geöffnet und die freie OH-Gruppe
an C-26 durch D-Glucose geschützt, so dass sie mindestens bisdesmosidisch
sind. Durch enzymatische Hydrolyse wird häufig schon während des
Extraktionsprozesses diese Glucose abgespalten, was unter Freisetzung von
Wasser zu einem Ringschluss am Sauerstoffatom an C-22 und somit zur Bildung
eines Spirostanols führt. Bei Untersuchungen an Saponinen aus Dioscorea
floribunda, die auch aus Spargel bekannt sind, wurde die Vermutung aufgestellt,
dass Furostanolsaponine die "Transport-Form" und Spirostanolsaponine die
"Depot-Form" in der Wurzel sein könnten (Hoyer et al., 1975).
In Extrakten mit niederen Alkoholen reagieren 22-Hydroxy-Furostanolglycoside (s.
Abbildung 1) leicht zu den entsprechenden 22-Alkoxy-Derivaten. Es kommt zu
einer Methylierung, die ihrerseits reversibel ist, so dass häufig beide
Saponinformen parallel nachgewiesen werden können. Diese Umwandlung soll
mittels zweidimensionaler DC gut nachweisbar sein (Tschesche et al., 1969;
Tschesche and Wulff, 1973).
Weitere Beispiele dafür, dass häufig gleichzeitig zwei verschiedene
Konfigurationen der Aglyca vorliegen können, sind Yamogenin und Diosgenin
sowie Sarsasapogenin und Smilagenin (s. Abb. 2)
16
Abbildung 2: 25 S- und 25 R-Formen ausgewählter spirostanoler Aglycone
nach (Hostettmann and Marston, 1995)
(Unterschiede in der Stellung der Methylgruppe an C 25 bzw. der Doppelbindung
an C 5)
Während die Spirostanolsaponine, die in der Regel monodesmosidisch vorliegen,
alle oben genannten typische Saponineigenschaften aufweisen, sind diese bei
den Furostanolsaponinen weniger oder gar nicht vorhanden. So sollen
Hämolyseaktivität, Fungizität und Komplexbildung mit Cholesterin nur bei
Spirostanolsaponinen auftreten (Tschesche and Wulff, 1973). Wie die Beispiele in
Abbildung 2 zeigen, ist es häufig erst nach vollständiger Strukturaufklärung
möglich, eindeutige Aussagen über das gefundene Saponin (bzw. Sapogenin) zu
machen.
Dies bedeutet auch, dass bei der Extraktion auf schonende Vorgehensweise zu
achten ist, um möglichst die genuinen Saponine zu erhalten (Hiller, 2002).
O
CH3
OH
O
H
25
3
22
O
CH3
OH
O
H
25
3
22
CH3
O
OH
O
25
3
22
CH3
O
OH
O
25
3
22
Sarsasapogenin(C-25(S),3-beta-OH) Smilagenin (C-25(R), 3-beta-OH)
Yamogenin (C-25(S), 3-beta-OH) Diosgenin (C-25(R), 3-beta-OH)
17
1.3.2 Saponine im Spargel
Auch in diesem Vertreter der Liliaceae konnten Steroidsaponine nachgewiesen
werden. Es gibt Untersuchungen zum Rhizom (Kawano et al., 1975), (Goryanu et
al., 1976a; Goryanu et al., 1976d; Goryanu et al., 1976c; Goryanu et al., 1976b;
Goryanu and Kintya, 1976; Goryanu and Kintya, 1977), zum Spross und auch zu
den Samen (Shao et al., 1997). Eine Zusammenfassung aller bisherigen
Veröffentlichungen zu Saponinen in weißen Spargelstangen gibt Tabelle 1.
Anschließend werden die einzelnen Veröffentlichungen hinsichtlich ihrer
Zielstellung und Vorgehensweise dargestellt.
Zusammenfassend kann aus der Literaturrecherche festgestellt werden, dass in
Spargelstangen sechs Saponine mit ihrer Struktur bekannt sind, wobei sich ACS
2 und ASP I nur in der Position der OH-Gruppe an C-25 unterscheiden. Ob sich
dieser Unterschied auf die Bitterkeit, die ja für ASP-I nachgewiesen ist, auswirkt,
ist nicht bekannt. Nach Hydrolyse ließen sich alle Saponine auf drei Aglyca
zurückführen (Sarsasapogenin, Yamogenin, Diosgenin). Einige der Substanzen
sind auch aus anderen Pflanzen bekannt. Es gibt Hinweise auf weitere
Spargelsaponine. Vergleichende Untersuchungen der biologischen Eigenschaften
stehen noch aus. Die hochgerechneten Mengenangaben für Gesamt- bzw.
Rohsaponin je 100 g Frischmasse schwanken zwischen 2 mg und 130 mg bei
unterschiedlichem Ausgangsmaterial und individuellen Reinigungsverfahren
(Reinheitsgrad).
Wie die Tabelle 1 zeigt, hatte sich bis zum Abschluss der Versuche und der
Auswertung der vorliegenden Arbeit nur eine Veröffentlichung mit der
Quantifizierung der Spargelsaponine beschäftigt.
18
Tabelle 1: Veröffentlichungen zu Spargelsaponinen
Quelle Name Molek. Gew.
Mengenangaben (mg in 100g FM)
Angaben zur Herkunft
Untersuchung / Eigenschaft
ASP-I a 1048 Strukturaufklärung, Bitterkeit ja
(Kawano et al., 1977)
ASP-II b 902
ASP-Mix 48 1
Endstücke Abfall
Strukturaufklärung, Bitterkeit nein
(Fenwick and Oakenfull, 1983) Gesamtsaponin
130 2 Einzelhandel Bestimmung Gesamtsaponingehalt
(Shimoyamada et al., 1990) AS-I c 872
Strukturaufklärung, fungizide Wirkung u.a.
gegen Candida Albicans und Trichophyton
(Shimoyamada et al., 1996) AS-2-I d 868
Rohsaponin 25 1
Endstücke Abfall
Asparagus officinalis L.
'Merry Washington
500 W'
Strukturaufklärung, fungizide Wirkung u.a.
gegen Candida Albicans und Trichophyton
ACS 1 e 1062 (Shao et al., 1996) ACS 2 f 1048
ACS 1 + ACS 2 2 3
Asparagus Sprossen
Strukturaufklärung, Anti-Tumor-Wirkung
(Wang et al., 2003) ACS 2 s.o. ACS 2
25 2 Asparagus Sprossen
Quantifizierung von Protodioscin
1 = berechnet aus Angaben des Autors 2 = Angaben des Autors 3 = Angaben in späterer Veröffentlichung (Chin et al., 2002)
a "25S-furost-5-ene-3ß,22,26-triol-3-O-(2,4-di-O-α-L-rhamnopyranosyl-ß-D-glucopyranoside) -26-O-ß-D-glucopyranoside"
b "25S-furost-5-ene-3ß,22,26-triol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1�4)-ß-D-glucopyranoside] -26-O-ß-D-glucopyranoside"
c "3-O-[{ß-D-glucopyranosyl(1�2)}{ß-D-xylopyranosyl (1�4)-ß-D-glucopyranosyl]-(25S), 5ß-spirostan-3-ß-ol"
d "3-O-[{α-L-rhamnopyranosyl(1�2)}{α-L-rhamnopyranosyl (1�4)-ß-D-glucopyranosyl]-(25S), 5ß-spirost-5-ene-3-ß-ol"
e "3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1�2)-{α-L-rhamnopyranosyl-(1�4)}-ß-D-glucopyranosyl]-26-O- [ß-D-glucopyranosyl]-(25-R)-22α-methoxyfurost-5-ene-3ß, 26-diol"
f "3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1�2)-{α-L-rhamnopyranosyl-(1�4)}-ß-D-glucopyranosyl]-26-O- [ß-D-glucopyranosyl]-(25-R)-22α-furost-5-ene-3ß, 26-diol"
Die mit Kleinbuchstaben gekennzeichneten Strukturformeln sind der Schreibweise
der Autoren entnommen
19
In der ersten Untersuchung zur Gehaltsbestimmung wurde der Gehalt an
Gesamtsaponinen in 26 frischen und verarbeiteten Gemüsearten (u.a.
Leguminosen, Spinat, Knoblauch) dünnschicht-chromatographisch bestimmt
(Fenwick and Oakenfull, 1983). Dazu wurden die Proben getrocknet, im Soxhlett-
Apparat 24 Stunden mit Aceton zur Entfernung von Lipiden und Pigmenten und
weitere 24 Stunden mit Methanol extrahiert. Die methanolischen Proben wurden
zur qualitativen DC auf Kieselgelplatten aufgetragen und mit einem Butanol-
Ethanol-Ammoniak-Gemisch entwickelt. Mit drei verschiedenen Derivatisierungs-
Reagenzien (Anisaldehyd-Schwefelsäurereagenz, Silbernitrat/Natronlauge und
Erythrozytensuspension) wurden die Saponine nachgewiesen. Zur quantitativen
Bestimmung wurde als Standard "weißes Saponin" von Ajax Chemicals Sidney
verwendet. Nach Derivatisierung mit Schwefelsäure in Methanol wurde
densitometrisch ausgewertet und der Saponingehalt ermittelt. Jedoch wurden
keine Informationen über Art und Anzahl der gefundenen Saponine gegeben.
Die Methode erscheint als gut geeignet für die Analyse hoher Probenzahlen. Sie
lässt jedoch einige Fragen bezüglich der praktischen Durchführung der DC offen.
Außerdem ist anzumerken, dass der untersuchte Spargel mit einem Gehalt an
Trockenmasse von 8,1% deutlich über den üblichen Werten von ca. 6 bis 7 % lag.
In den anderen Untersuchungen stand nicht die Gehaltsbestimmung im
Vordergrund. Der jeweiligen Zielstellung entsprechend wurden einzelne Saponine
isoliert, ihre Struktur aufgeklärt und die Isolate auf bestimmte Eigenschaften
getestet.
Nachdem aus dem Rhizom von Asparagus officinalis bittere Furostanolsaponine
isoliert wurden (Kawano et al., 1975), untersuchte die gleiche Arbeitsgruppe
Spargelendstücken, die als Abfall bei der Konservenherstellung anfallen, auf
bittere Substanzen (Kawano et al., 1977). Das Saponingemisch aus den
Abfallstücken wurde zuerst mit heißem Wasser extrahiert, gefolgt von einer
Behandlung mit einem Ionenaustauscher und anschließender Fällung in Ether.
Dieses Gemisch ergab in einem DC-Screening fünf Furostanolsaponine (positiv
mit Ehrlich-Reagenz), die Asparasaponin I bis V (ASP) genannt wurden. ASP I
und II wurden für die Strukturaufklärung verwendet. ASP-I wurde durch seine
20
Struktur als konfigurelles Isomer (S-Form) des bekannten 25R Proto-Dioscins
(s.u.) gefunden, während ASP-II sich durch das Fehlen einer Rhamnoseeinheit
von ASP I unterschied. Nach saurer bzw. enzymatischer Hydrolyse beider
Saponine wurden sowohl Yamogenin als auch Diosgenin als Aglyca gefunden. Da
nach Angaben der Autoren unter normalen Hydrolysebedingungen Yamogenin in
Diosgenin konvertiert werden kann, umgekehrt aber nicht, sollte Yamogenin
genuin vorhanden sein. ASP I wurde als stark bitter bezeichnet und ASP II als
nicht bitter. Der Einsatz von Naringinase als Mischung aus Naringinin-α-1,2-
Rhamnosidase und ß-Glucosidase wurde als geeignet angesehen, um
unerwünschten bitteren Geschmack bei der Verwendung der Spargelabfälle als
Lebensmittelzusatz zu beseitigen.
In der Publikation wird intensiv auf die Strukturaufklärung eingegangen und
erstmalig ein direkter Vergleich hinsichtlich der Bitterkeit zweier Spargelsaponine
durchgeführt. Jedoch gibt es keinen Hinweis darauf, warum die anderen
nachgewiesen Saponine nicht weiter untersucht wurden und mit welcher Methode
die Bitterkeit getestet wurde.
Bei dem 25R Proto-Dioscin handelt es sich um ein Saponin, das zuerst aus
Dioscorea-Arten isoliert wurde (Kiyosawa and Hutoh, 1968), (Hoyer et al., 1975)
und gemeinsam mit seinem 22-Methyl-Analogon auch in anderen Pflanzen
gefunden wurde, z.B. in Trigonella foenum-greacum. (Bogacheva et al., 1976).
Auch aus Spargel konnte die 25R-Form des Proto-Dioscins isoliert werden. ES
wurde sowohl in den Samen (Shao et al., 1997) als auch in den Sprossen
nachgewiesen (Shao et al., 1996). Dazu wurde getrocknetes Material sechs Tage
mit Methanol extrahiert, dann mit heißem Wasser, mit Ethylacetat und mit
Butanol. Anschließend wurde über einer Diaion HP-20 Säule und erneutes
Waschen das Rohsaponingemisch erhalten. Nach weiteren
Chromatographieschritten konnten die beiden Saponine gewonnen und ihre
Struktur über MS und NMR aufgeklärt werden. Als Aglyca nach Hydrolyse beider
wurde Diosgenin nachgewiesen. Das Molekül mit C22-OH wurde als ACS 1 (s.
Abbildung 1) bezeichnet und das mit der Methylgruppe an C22 als ACS 2.
21
Die Autoren erwähnten keine weiteren Saponine. Ziel der Studie war die
Untersuchung antikanzerogener Eigenschaften. Im Ergebnis konnte gezeigt
werden, dass beide Saponine in vitro das Wachstum verschiedener Tumorzellen
hemmten, wobei ACS 1 eine höhere Aktivität zeigte. Ausgehend davon, dass in
vitro Versuche noch nicht ausreichen, um eine Wirkung zu begründen, wurde auf
laufende Versuche an Mäusen, bei denen ein Tumor induziert wurde, verwiesen
(Chin et al., 2002).
Die gleiche Forschergruppe veröffentlichte im Oktober 2003, also nach den
Versuchen für die vorliegende Arbeit sowie deren Auswertung; die Quantifizierung
des bis dahin als ACS 2 bezeichneten Protodioscins in drei verschiedenen
Spargelsorten, die an der Rutgers Universität angebaut wurden und deren
Bezeichnung nicht mit den in Deutschland verwendeten Sorten vergleichbar ist.
(Wang et al., 2003). Dazu wurden je Sorte sechs Spargelstangen untersucht. Als
Referenzsubstanz wurde selbst aufgereinigtes Protodioscin aus Tribulus terrestris
verwendet und die Proben wurden mittels einer HPLC-MS Methode analysiert.
Erstmals verwendeten die Autoren Ethanol zur Extraktion, wodurch die
Entstehung von Methyl-Protodioscin (bis dahin als das potentere Saponin bei den
Versuchen an Tumorzellen bezeichnete ACS 1) vermieden werden sollte. Neben
Protodioscin wurde über zwei weitere Saponine berichtet, deren Gehalte jedoch
nicht bestimmt wurden.
Eine dritte Forschergruppe verwendete Endstücke (Abfall) von Spargel, die in
getrockneter Form 24 Stunden in Methanol (60%) extrahiert wurden. Danach
wurde der Extrakt abwechselnd in Butanol/Wasser und Benzen/Wasser
ausgeschüttelt und anschließend in Ether gefällt (Shimoyamada et al., 1990). Der
über Säulenchromatographie fraktionierte Rohsaponinextrakt wurde auf fungizide
Wirkungen an 27 Pilzen mit sehr unterschiedlichen Ergebnissen getestet.
Außerdem wurde die Struktur eines Spirostanolsaponins, das als AS-1 bezeichnet
wurde, aufgeklärt und die fungizide Aktivität dieser Reinsubstanz (insbesondere
gegen Candida albicans) im Vergleich mit der des Rohsaponingemisches als
geringer bewertet.
22
In Fortführung der Arbeiten wurde nach weiterer Fraktionierung die Struktur von
AS-2-I (s. Abbildung 1) aufgeklärt und eine wesentlich höhere Aktivität gegen
Candida albicans gemessen (Shimoyamada et al., 1996). Das Aglycon von AS-1
wurde nach der Abspaltung von zwei Molekülen Glucose und einem Molekül
Xylose als Sarsasapogenin identifiziert. Während nach Hydrolyse von AS-2-I
Yamogenin und ein Molekül Glucose sowie zwei Moleküle Rhamnose erhalten
wurden. Insgesamt gibt es Hinweise auf neun Saponinfraktionen.
Aus beiden Veröffentlichungen kann geschlussfolgert werden, dass nur die
Spirostanolsaponine fungizid gegen die untersuchten Pilze waren. Auf Anfrage
stellte Makoto Shimoyamada 2 bzw. 1 mg von AS-1 und AS-2-I für unsere
Arbeiten zur Verfügung ebenso kleine Mengen der "aktiven Fraktion" (Gemisch
aus Spirostanolsaponinen) und der "inaktiven Fraktion" (Gemisch aus
Furostanolsaponinen).
1.3.3 Nachweismethoden
Die klassischen Methoden der Saponinanalytik wurden bereits erwähnt. Heute
werden moderne Verfahren wie DC (Dünnschicht-Chromatographie) bzw. die
leistungsfähigere HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatographie) sowie
HPLC (High Performance Liquid Chromatographie) zur Saponinanalytik
verwendet. Für die Analytik der Sapogenine und der Zucker nach Hydrolyse hat
sich GC-MS (Kopplung der Gas-Chromatographie mit der Massenspektrometrie)
durchgesetzt. Auf letztere Methode soll nicht weiter eingegangen werden, da in
dieser Arbeit keine Strukturbestimmung der Sapogenine erfolgt.
Für den qualitativen Nachweis der Saponine ist die DC mit anschließender
(postchromatographischer) Farbreaktion durch Derivatisierung mit
dehydratisierenden Reagenzien weit verbreitet.
Diese Form der Chromatographie erfolgt auf Platten aus Glas, Aluminium oder
Kunststoff, die mit einem Sorbens beschichtet sind (stationäre Phase). Für
23
verschiedene Anwendungen steht heute eine Vielzahl von Sorbentien zur
Verfügung (Frey and Zieloff, 1992). Für das Auftragen der Probe etwa 5 bis 10
mm oberhalb des unteren Plattenrandes gibt es verschiedene Geräte. Je nach
gewünschter Präzision und Probenanzahl kann punkt- oder strichförmig, manuell
sowie mittels halb- und vollautomatischer Auftragegeräte gearbeitet werden. Die
Probe wird anschließend in einer Entwicklungskammer mit einem geeigneten
Fließmittel (mobile Phase) aufgetrennt. Das Prinzip der Trennung beruht darauf,
dass die mobile Phase durch Kapillarkräfte nach oben steigt und die Substanzen
unterschiedlich weit mit sich trägt. Dabei spielen sowohl Adsorptionsprozesse als
auch Verteilungsprozesse eine Rolle (Frey and Zieloff, 1992). Ist eine
ausreichende Trennung der Substanzen erreicht, wird der chromatographische
Prozess abgebrochen (unvollständige Chromatographie). Die charakteristische
Größe für eine Substanz bei konstanten Chromatographiebedingungen ist der Rf-
Wert. Er ist definiert als Quotient aus der Entfernung der Substanzzone und der
Fließmittelfront von der Startlinie.
Nach der Entwicklung können die Substanzen entweder unter UV-Licht gemessen
oder durch Derivatisierung sichtbar gemacht werden. Ein relativ einfacher
Nachweis von Saponinen gelingt bereits durch Besprühen der entwickelten Platte
mit Wasser. Saponinfreie Zonen werden dadurch transparent, während
saponinhaltige Zonen weiß bleiben (Plock, 2002). Da Saponine kaum UV-aktiv
sind (Hostettmann and Marston, 1995), empfiehlt sich die bereits erwähnte
postchromatographische Derivatisierung. Auch dafür steht eine Palette von
Reagenzien zur Verfügung (Jork et al., 1993). Anhand der typischen Farbreaktion
lassen sich dann die Saponine erkennen. Für quantitative Untersuchungen
werden die einzelnen Bahnen der Platte mittels eines Densitometers gescannt.
Die dazugehörige Software berechnet dann auf Grund der Intensität der Farbe die
Konzentration der Substanz. Dafür ist die Aufnahme einer Kalibrierkurve mit
Referenzsubstanzen für jede Platte erforderlich.
Sehr gute praktische Hinweise finden sich u.a. in einem Buch zur Durchführung
und Fehlervermeidung in der DC (Hahn-Deinstrop, 1997).
24
Die Methode der HPLC ist ebenfalls für die Saponinanalytik sehr gut geeignet. Im
Gegensatz zur DC handelt es sich dabei um eine vollständige Chromatographie,
bei der die Probe unter Druck durch eine mit Sorbens gefüllte Säule aufgetrennt
wird. Jedoch gibt es hier auch Einschränkungen bei der Detektion der
Substanzen. Wegen des Fehlens von UV-Chromophoren werden Messungen des
RI (Refraktionsindex), MS (Massenspektrometrie) oder pre- bzw.
postchromatographische Derivatisierung empfohlen (Hostettmann and Marston,
1995).
Mittels MS können Aussagen über das Molekulargewicht getroffen sowie die
Moleküle in charakteristische Fragmente (z.B. Zucker, Aglycon) aufgespalten
werden.
1.4 Aufgabenstellung
Die bisherigen Untersuchungen zu den Saponinen im Spargel haben gezeigt,
dass durchaus bemerkenswerte Gehalte von max. 130 mg in 100 g Frischmasse
(Fenwick and Oakenfull, 1983) zu finden sind.
Da die Saponinforschung insbesondere in den letzten Jahren
gesundheitsfördernde Eigenschaften dieser Stoffgruppe nachweisen konnte,
sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit ermittelt werden, welche Gehalte an
Saponinen in Deutschland angebauter Spargel aufweist. Dabei war zu prüfen, ob
über die Wahl der Spargelsorte und die Modifizierung der Bodentemperatur
während der Ernteperíode Einfluss auf diese Werte genommen werden kann.
Bei der Interpretation der Saponingehalte besteht möglicherweise ein Konflikt
zwischen ernährungsphysiologischer und sensorischer Bewertung.
Bitterer Geschmack stellt für Spargelbetriebe zunehmend ein Qualitätsproblem
dar. Bei den niederländischen Sorten 'Grolim' und 'Gijnlim' traten bittere Stangen
gelegentlich in Abhängigkeit vom Erntezeitraum und Anbaufaktoren (Witterung,
Bodenart und Temperatur) auf, wobei sich laut einer Studie aus der Erntesaison
2001 direkte Zusammenhänge nicht finden ließen. Danach hatte die Sorte 'Grolim'
25
einen unverkennbaren, spargeltypischen Geschmack mit einer stärkeren bitteren
Komponente im unteren Stängelteil (Ziegler et al., 2002). Weitere Sorten waren in
die Studie nicht einbezogen. Über ähnliche Ergebnisse wurde in einer anderen
Studie berichtet (Paschold and Schöpplein, 2002).
Weiterhin sollten Nacherntefaktoren wie Lagerung und Verpackung sowie
Wärmebehandlung und Gefrierlagerung bezüglich ihres Einflusses auf den Gehalt
an Saponinen betrachtet werden.
Aufgrund der unterschiedlichen biologischen Wirkungen verschiedener Saponine
sollte versucht werden, auch die Anteile der Einzelsaponine am Gesamtgehalt zu
ermitteln.
Da es bisher keine Standardmethode für die Analytik von Saponinen gab, wurde
für die vorliegende Arbeit eine Methode zur Extraktion und Analytik von
Saponinen aus Spargel entwickelt, bei der das Probenmaterial möglichst
schonend behandelt wird, um enzymatische oder andere Veränderungen
weitestgehend zu vermeiden. Diese Methode ermöglicht die Aufarbeitung hoher
Probenzahlen.
Die Ergebnisse der Arbeit dienen als Grundlage für weitere Untersuchungen
dazu, ob die Gewinnung von Saponinen aus Spargelabfällen möglich ist. Diese
Abfälle entstehen bei den Spargelerzeugern u.a. aus nicht verkaufsfähigen und
zerbrochenen Stangen sowie den Spargelabschnitten. Sie werden derzeit fast
ausschließlich kompostiert. Als Verwendungszweck für die so gewonnen
Saponine wäre der Zusatz zu funktionellen Lebensmitteln denkbar oder ein
Einsatz als Rohstoff für Nutraceuticals.
Aus den Ergebnissen der Arbeit können Empfehlungen für den Produktions- und
Verarbeitungsprozess abgeleitet werden, wie z. B. die Sortenwahl, die Einstellung
der Bodentemperatur oder die thermische Behandlung nach der Ernte sowie
Bedingungen für die Lagerung.
26
2 Material und Methoden
2.1 Geräte
Messung der Gasatmosphäre: CheckMate 9900, PBI Dansensor
Klimazelle: 14 m3, York International
Homogenisator: H 04, Bühler
Zentrifuge: Suprafuge 22, Heraeus sepatech
Autoklav: Dampfsterilisator Typ 500, Varioklav
Festphasenextraktion: spe-12-G-system, BAKER
Säulen RP-18 Lichrolut (40-63µm) Merck
Dünnschichtchromatographie: Linomat IV, CAMAG
AS 30 mit Autosampler, DESAGA
Densitometer CD 60, MS DOS Software 5.1,
DESAGA
Tauchkammer, BARON
Plattenheizer, DESAGA
Horizontalkammer (200x100), CAMAG
Dokumentation der DC-Platten: Kleinbildkamera mit Reprostativ
Flachbettscanner (Epson-Stylos)
Massenspektrometrie: MSD Trap 1100 Series, Agilent Technologies,
mit ESI-MS Ion Trap Bruker Daltronics,
Chemstation Software 4.0, mit Spritzenpumpe.
Einfache statistische Berechnungen und Graphiken wurden mit MS Excel 2000
vorgenommen. Die Signifikanztests wurden mit STATISTICA Version 6.0
durchgeführt (Fisher LSD-Test für Versuch 1, Tuckey-HSD-Test für Versuche 2
und 4 sowie HSD-Test für ungleichen Stichprobenumfang für Versuch 3).
Die Strukturformeln und Berechnungen der Molekulargewichte wurden mit ISIS
Draw 2.5 angefertigt.
27
2.2 Probenmaterial
Entsprechend der Aufgabenstellung wurde das Probenmaterial aus
verschiedenen Spargelanlagen bezogen bzw. speziellen Nacherntebehandlungen
unterzogen. Nachfolgend werden die gartenbaulichen oder technologischen
Versuche erläutert. Neben dem Material für die Saponinanalytik wurden von jeder
Spargelprobe 25-30 g für die Bestimmung der Trockenmasse durch Trocknung im
Trockenschrank über 24 Stunden bei 105°C benötigt.
2.2.1 Versuch 1: Einfluss der Bodentemperatur
Dazu wurde Probenmaterial aus einem Gewächshausversuch am Institut für
Gemüse- und Zierpflanzenbau Großbeeren/Erfurt e.V. (IGZ) verwendet. In dieser
Versuchsanlage konnten mittels Heiz- und Kühlregistern unterschiedliche
Bodentemperaturen eingestellt und durch Sensoren überwacht werden. Die
Pflanzung erfolgte im April 2001 mit den Sorten 'Grolim' und 'Gijnlim' auf einer
Fläche von 200 m2. Je Sorte wurden in neun Dämmen drei Wiederholungen
angelegt. Die Unterbodentemperatur wurde auf 18°C festgelegt und für die
Oberbodentemperatur folgende drei Abstufungen eingestellt:
kalt 10-15°C
mittel 18-22°C
warm 25-30°C.
Der Pflanzabstand betrug 30 cm bei 12 Pflanzen je Wiederholung und die
Pflanztiefe 22 cm. Die Bewässerung wurde per Tropfschlauch realisiert und alle
anderen pflanzenbaulichen Maßnahmen wie Düngung und Pflanzenschutz
erfolgten praxisüblich. Die Erntemenge für das Jahr 2003 wurde so festgelegt,
dass sie die für eine Anlage im zweiten Erntejahr übliche von ca. 75 dt ha-1 nicht
überschritt.
28
Der Erntezeitraum und die tatsächlichen Erntemengen waren:
warm 'Gijnlim' 13.2.-26.2.03 14,9 kg/ 12 Pflanzen
'Grolim' 13.2.-28.2.03 15,5 kg/ 12 Pflanzen
mittel 'Gijnlim' 16.2.-18.3.03 15,2 kg/ 12 Pflanzen
'Grolim' 18.2.-11.4.03 14,0 kg/ 12 Pflanzen
kalt 'Gijnlim' 23.2.-8.4.03 15,5 kg/ 12 Pflanzen
'Grolim' 2.3.-14.4.03 12,7 kg/ 12 Pflanzen
Die Spargelstangen für die Saponinanalytik wurden unmittelbar nach der Ernte
gewaschen und davon 150 g ungeschält für die sofortige Extraktion verwendet. Je
nach verfügbarer Stangenanzahl und –gewicht setzte sich die Mischprobe aus 4-5
Stangen zusammen. Da jedoch insbesondere die Sorte 'Grolim' zu geringerer
Stangenzahl, dafür aber zu dickeren Stangen neigt (Durchschnittsgewicht >80 g),
gingen gelegentlich nur 2-3 Stangen in die Mischprobe ein. Für die
Mittelwertberechnung standen unterschiedliche Probenzahlen zur Verfügung, weil
die Erntezeiträume und die täglichen Erntemengen für die Varianten verschieden
waren. Die Laborkapazität für die Extraktion lag bei maximal drei Proben in
Doppelbestimmung täglich.
Die unterschiedliche Probenzahl je Variante war im Ernteverlauf und der
Begrenzung der Aufarbeitungskapazität von maximal drei Proben in
Doppelbestimmung begründet. So waren bei beiden Sorten die Erntemengen der
warmen Variante schon nach ca. zwei Wochen erreicht, während die Ernte der
kalten Variante ca. sechs bis sieben Wochen dauerte.
Aus der gleichen Anlage wurden 15 Stangen der Sorte 'Gijnlim' der kalten
Variante für den direkten Vergleich einzelner Stangen bei ansonsten gleichen
Bedingungen entnommen.
29
2.2.2 Versuch 2: Einfluss der Sorte
In diesem Versuch sollte untersucht werden, ob es sortenabhängige Unterschiede
im Saponingehalt von Spargel unter gleichen Anbaubedingungen gibt und ob sich
Korrelationen zu einer sensorischen Bewertung herstellen lassen.
Das Probenmaterial stammte aus dem vierten Erntejahr einer Anlage in der
Anbauregion Beelitz. Die Anlage war im Jahr 1998 im Rahmen des
Brandenburger Sortenversuches unter Beteiligung der Landesanstalt für
Gartenbau auf einer Fläche der Firma Buschmann/Winkelmann in Schlunkendorf
angepflanzt worden. Der Anbau erfolgte je Sorte in drei Wiederholungen
(Parzellen) unter praxisüblichen Bedingungen und unter Verwendung von
Antitaufolie. Geerntet wurde einmal täglich (Hetz and Schulze, 2000).
Für den Versuch wurden die Sorten 'Grolim', 'Gijnlim', 'Backlim', 'Eposs', 'Andreas'
und 'Huchels Alpha' der Handelsklasse I (s. Anhang) ausgewählt.
An den Erntedaten 29.5.02 und 12.6.02 wurden die gewaschenen, auf Eis
gelagerten Spargelstangen von jeweils drei Parzellen nach dem Transport sofort
geschält und sowohl für die sensorische Bewertung als auch die Saponinanalytik
vorbereitet.
Die Proben zur Untersuchung des Saponingehaltes wurden längs halbiert und in
Portionen zu ca. 150 g einer Mischprobe aus 8-10 Stangen bis zur Analytik
eingefroren.
2.2.3 Versuch 3: Verpackungsversuch
Spargel ist ein empfindliches leicht verderbliches Produkt, bei dem schon nach
der Ernte eine Beschleunigung der Stoffwechselprozesse einsetzt. Ein sehr
schnelles Abkühlen auf Temperaturen unter 2°C und Aufbewahrung im Dunkeln
sind daher unerlässlich (Böttcher, 1996). Die hohe Atmungsaktivität des Spargels
kann außerdem durch die Luftzusammensetzung im Lagerraum und in der
Verpackung beeinflusst werden. Atmosphärische Gaswerte von 10-15% O2 und
ca. 10% CO2 bei Temperaturen unter 10°C sollten angestrebt werden (Schmidt,
2003).
30
Die Spargelstangen (Handelsklasse II) für die Saponinanalytik wurden im Juni
2003 von einem Anbaubetrieb aus der Region Beelitz bezogen, wobei die
Homogenität des Probenmaterials hinsichtlich der Sorten vom Betrieb nicht
gewährleistet werden konnte. Der Spargel wurde am Morgen vor der Einlagerung
gestochen, anschließend in Eiswasser gekühlt und am Nachmittag geschält. Der
Transport erfolgte in Containern mit Eis und die Lagerung bis zum nächsten Tag
in feuchten Tüchern bei 2°C. Eine Probe von 500 g wurde als Kontrolle für die
Bestimmung des Saponingehaltes des Ausgangsmaterials verwendet.
Für die Lagerung wurden Foodtainer (Polypropylen, 175x271x70 mm) mit 1.000 g
Spargeleinwaage befüllt und mit entsprechenden Siegelfolien verschweißt. Die
eingesetzten Folien waren in einem Vorversuch auf ihre Eignung getestet worden
(Schmidt, 2003).
Als Siegelfolien wurden verwendet:
Folie a: Antifog-beschichtetes Polypropylen, 35 µm
Folie b: Biaxial-orientiertes Polypropylen, 25 µm, Perforation 2x5 Löcher 4
µm
Der verpackte Spargel wurde in Anlehnung an die Bedingungen im Handel bzw.
beim Verbraucher über vier Tage in einer Kühlzelle bei 8°C und anschließend
weitere sieben Stunden bei 20°C gelagert. Proben wurden am dritten, und vierten
Lagertag sowie nach weiteren sieben Stunden entnommen. Während der
Lagerung wurden die O2- und CO2-Gehalte in den Verpackungen im Abstand von
24 Stunden gemessen.
Für die Saponinbestimmung wurde eine Mischprobe von 12-15 Stangen aus den
einzelnen Foodtainern gezogen, diese Stangen wurden längs halbiert und bis
zum nächsten Tag bei -30°C eingefroren und so für die Extraktion verwendet.
31
2.2.4 Versuch 4: Thermostabilität von Saponinen
Zum Verhalten von Saponinen bei thermischer Belastung gibt es unterschiedliche
Untersuchungsergebnisse (Önning and Asp, 1996) (Bobeyko and Kintia, 1996).
Danach soll die Thermostabilität der einzelnen Saponine individuell schwanken.
Das Versuchsdesign wurde so gewählt, dass es den beim Garen, Konservieren,
Trocknen oder Aufbereiten von Spargelextrakten in der Praxis entspricht.
Für die Testung der Hitzebeständigkeit wurden aufgereinigte Extrakte der Sorte
'Grolim' (kalte Variante) aus Versuch 1 vereinigt, die mit bekanntem
Saponingehalt in 100 ml Methanol zur Verfügung standen. Proben wurden in
Glasflaschen zu 1,5 ml abgefüllt und das Methanol bei 65°C im Trockenschrank
ausgetrieben.
Jeweils sechs Proben wurden folgender Thermobehandlung ausgesetzt:
Trockenschrank 100°C 15, 30, und 60 Minuten,
140°C 15, 30, und 60 Minuten,
Autoklav 121°C 15 Minuten, 1,4 bar
Die Proben für den Autoklaven wurden vorher in 1 ml destilliertem Wasser
rückverdünnt und nach der Behandlung wieder auf 1,5 ml mit Methanol aufgefüllt.
Eine Entfernung des Wassers hätte eine zusätzliche thermische Belastung
dargestellt. Die Proben aus dem Trockenschrank wurden mit 80%-igem Methanol
auf das Ursprungsvolumen rückverdünnt, weil sie in reinem Methanol auf Grund
starker Verkrustung nicht mehr vollständig lösbar waren.
Die Thermostabilität der Saponine in der Spargelmatrix wurde an drei Proben aus
dem Versuch 1 (mittlere Variante, 2x 'Gijnlim', 1x 'Grolim') getestet. Dazu wurden
je Probe die Stangen halbiert und die eine Hälfte sofort extrahiert während die
andere nach der Vorschrift für die Sensorik (Anhang) gekocht und anschließend
analysiert wurde.
Die Überprüfung des Saponingehaltes von Spargel, der bei –18°C gelagert
wurde, erfolgte an Probenmaterial aus dem Versuch 3. Dazu wurden Proben des
Ausgangsmaterials portioniert, bei –38°C eingefroren, bei –18°C gelagert und
nach acht und 12 Wochen analysiert.
32
2.2.5 Sonstiges Probenmaterial
Das Probenmaterial für die Vorversuche und die Erarbeitung der Methoden für die
Extraktion, die DC und die Präparation wurde aus eingefrorenen
Spargelendstücken eines Anbaubetriebes in Brandenburg gewonnen. Darüber
hinaus standen kleine Mengen eines als bitter aufgefallenen importierten Spargels
zur Verfügung, die für qualitative und semiquantitative Vergleiche eingesetzt
wurden.
Für eine erste Aussage darüber, ob in industriell verarbeitetem Spargel Saponine
nachweisbar sind, wurden im Einzelhandel drei Sterilkonserven gekauft, bei
denen der Inhalt bezüglich Größe und Aussehen der Stangen sowie des
Abtropfgewichtes und der Zutatenliste vergleichbar war. Probe A war mit
Herkunftsland China deklariert, während bei den Proben B und C keine Angaben
zur Herkunft vorhanden waren.
Nach dem Abtropfen der salzhaltigen und zitronensäurehaltigen Flüssigkeit wurde
der Spargel mit Wasser gespült und anschließend aus dem homogenisierten
Konserveninhalt eine Mischprobe von 150 g für die Extraktion gezogen.
33
2.3 Methoden
2.3.1 Extraktion
Die Vorversuche zur Gewinnung der Saponine aus der Spargelmatrix wurden in
Anlehnung an die in Tabelle 1 genannten Veröffentlichungen vorgenommen.
Jedoch wurde auf langes Arbeiten in wässrigen Lösungen verzichtet, um
enzymatische Veränderungen an den Saponinen auszuschließen. Ebenso
wurden keine Ionenaustauscher eingesetzt, weil dadurch Veränderungen im
Molekül vorkommen könnten (Tschesche and Wulff, 1973). Flüssig/flüssig-
Extraktion mit Butanol/Wasser und Toluol/Wasser brachte zwar für die
Gewinnung von Extrakten für die Vorversuche recht gute Aufreinigungen, war
aber für hohe Probenzahlen nicht geeignet. Einerseits entstand beim
Ausschütteln ein Zwei-Phasen-Gemisch, das sich nur langsam wieder trennte,
und andererseits hätte sowohl die Wasserfraktion mit den polareren Saponinen
als auch die Butanolfraktion mit den unpolareren weiter behandelt werden
müssen. Ebenso erwies sich die Fällung in Ether als ungeeignet, weil mit einem
Verhältnis von Probe zu Ether von 1:100 gearbeitet wurde (Beyer, 2002), was
eine erhebliche Arbeitsplatzbelastung in sich birgt. Außerdem zeigte sich auch
hier, dass nicht alle Saponine fällbar waren.
Als moderne Methode zur Reinigung von Pflanzenproben wird heute vielfach die
Festphasenextraktion (SPE) angewendet. Mit verschiedenen handelsüblichen
SPE-Säulen wurden Vorversuche durchgeführt, von denen sich in Anlehnung an
eine Applikation der Firma Merck für Alkaloide aus Kartoffelprodukten RP-18
Säulen als geeignet erwiesen (Anonymus, 2002).
Folgende Extraktionsmethode wurde erarbeitet:
Frische oder gefrorene Spargelstangen wurden zerkleinert (Küchenmaschine mit
Schneidwerkzeug oder manuell). Davon wurden 10 g in Homogenisatorbecher
eingewogen, mit 30 ml Methanol (p.A., Merck) 2 Minuten bei 10.000 U min-1
homogenisiert und anschließend 30 Minuten bei 12.000 U min-1 unter Kühlung
zentrifugiert. Nach dem Dekantieren wurden diese Schritte noch zwei weitere
34
Male wiederholt. Die Überstände wurden vereinigt, im Rotationsverdampfer
eingeengt und anschließend in destilliertem Wasser rückverdünnt (6 ml). RP-18
Säulen für die SPE (2.000 mg) wurden mit Methanol konditioniert, dann wurde die
Probe aufgegeben, mit Wasser gewaschen und anschließend wurden die
Saponine mit Methanol (HPLC-rein, Merck) eluiert.
Als interner Standard zur Ermittlung der Ausbeute wurde Ginsenosid Rg1 in
HPLC-reiner Form (Extrasynthese) verwendet. Dieses Saponin aus der
Ginsengwurzel zeigte bei der Derivatisierung mit Anisaldehyd-Schwefelsäure-
Reagenz eine rot-braune Farbe und war somit visuell von den grünen Zonen der
Spargelsaponine zu unterscheiden. Der externe Standard wurde dem
zerkleinerten Probenmaterial vor Beginn des ersten Extraktionsschrittes zugefügt.
Es konnte eine 100 %–ige Wiederfindung densitometrisch gemessen werden.
Somit kann die Extraktion nach der beschriebenen Methode als geeignet
betrachtet werden.
2.3.2 DC-Methode zur qualitativen Bestimmung
Zu Beginn der Arbeiten galt es durch Vorversuche sowohl ein geeignetes Sorbens
zu finden als auch die Parameter für die Dünnschichtchromatographie und ein
Derivatisierungsreagenz für die Saponine aus Spargel. In Anlehnung an vielfältige
Literaturangaben (Tschesche and Wulff, 1973), (Niesel, 1992), (Fenwick and
Oakenfull, 1983) wurden verschiedene Lösemittelgemische (Fließmittel) auf
verschiedenen Sorbentien getestet. Die beste Auftrennung wurde mit einem
Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser auf HPTLC-Kieselgel 60–Platten
erzielt. Am Beginn der Arbeiten wurde die Entwicklung in Normalkammern
(Vertikalkammern) ohne Kammersättigung durchgeführt. Für die fortführenden
Analysen stand eine H-Kammer (Horizontalkammer) zur Verfügung. Nachdem
durch Besprühen einer entwickelten Platte mit Wasser weiße Flecken auf
transparentem Untergrund mit hoher Wahrscheinlichkeit als Saponine identifiziert
wurden, erfolgte die Derivatisierung mit
35
a) Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz
b) Vanillin-Schwefelsäure-Reagenz
c) Ehrlich's Reagenz und
d) 10%-iger Schwefelsäure (methanolisch).
Dabei zeigte sich mit Vanillin-Schwefelsäure-Reagenz und Schwefelsäure keine
differenzierte Färbung, d.h. alle Flecken (nicht nur die als Saponine erkannten)
waren von fast einheitlicher braun-violetter Farbe. Mit Ehrlich's Reagenz
erschienen die meisten Saponinflecken in kräftiger Rotfärbung (Ehrlich-positiv),
während andere Flecken nicht sichtbar waren (Ehrlich-negativ). Die
Derivatisierung mit Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz ergab differenzierte
Farben – grün für alle Saponine, grau für polare Substanzen unterhalb der
Saponine und blau-violett für apolare Substanzen oberhalb der Saponine
(Abbildung 4).
Zusätzlich wurden in zwei Versuchen entwickelte Platten sowohl mit Anisaldehyd-
Schwefelsäurereagenz und Ehrlich's Reagenz derivatisiert als auch mit
Blutgelatine-Reagenz beschichtet. Letzteres diente zum Nachweis der
hämolytischen Aktivität, die nur bei Spirostanolsaponinen vorhanden sein soll. Es
zeigte sich, dass mit Anisaldehyd-Schwefelsäurereagenz alle Saponine detektiert
wurden, mit Ehrlich's Reagenz die polareren und mit Blutgelatine die unpolareren
Saponine. Daraus konnte in Anlehnung an die Literatur das Resümee gezogen
werden, dass Anisaldehyd-Schwefelsäurereagenz für die Derivatisierung sowohl
von Furostanol- als auch von Spirostanolsaponinen geeignet ist. Die
Derivatisierung kann durch Besprühen oder Tauchen erfolgen. Letzteres zeigte
ein homogeneres Ergebnis, so dass es bevorzugt eingesetzt wurde.
Das Auftragen der Proben erfolgte für einfache Screenings, wie beispielsweise
bei der Überwachung von Reinigungsschritten oder präparativen Arbeiten,
punktförmig mit Einmalkapillaren. Für exakte Tests wurde grundsätzlich
strichförmiges Auftragen mit halb- oder vollautomatischen Geräten angewandt.
36
Aus den Vorversuchen wurde folgende DC-Methode für den qualitativen
Nachweis von Saponinen erarbeitet, mit der sich Aussagen über die Anzahl sowie
auch eine grobe Einschätzung der Menge (semiquantitativ) vorhandener
Saponine treffen lassen:
Platten: DC- oder HPTLC Kieselgel 60 (Merck)
Probenauftragung: 10 mm vom unteren Plattenrand
Kammertyp: H-Kammer
Fließmittel: Chloroform:Methanol:Wasser (6:4:1)
Kammersättigung: 10 Minuten
Entwicklungszeit: 20 Minuten
Laufstrecke: ca. 70 mm
Derivatisierung: 2 Sekunden Tauchen in Anisaldehyd-
Schwefelsäurereagenz, Erhitzen 2 Minuten von 105 auf
120° C
Herstellung der Reagenzien
Anisaldehyd-Schwefelsäurereagenz: 85 ml Methanol wurden mit 10 ml Eisessig
und 5 ml konzentrierter Schwefelsäure versetzt (Stammlösung). Zu der
Stammlösung wurden 0,8 ml (für Tauchlösung) bzw. 1 ml (für Sprühlösung) 4-
Methylbenzaldehyd (Merck) gegeben
Vanillin-Schwefelsäurereagenz: Zu der Stammlösung (s.o.) wurden 500 mg
Vanillin unter Rühren hinzugegeben (Sprühreagenz).
Blutgelatine-Reagenz: 4 ml defibriniertes Rinderblut wurden mit gleichen Teilen
physiologischer Kochsalzlösung versetzt und fünf Minuten bei 2.000 U min-1
zentrifugiert. Der Überstand wurde abpipettiert, frische Kochsalzlösung
hinzugegeben, die Suspension gemischt und erneut zentrifugiert. Dieser
Waschvorgang wurde so lange wiederholt, bis der Überstand farblos blieb. Die
37
verbliebenen Erythrozyten wurden mit der gleichen Menge physiologischer
Kochsalzlösung versetzt. Diese Suspension wurde zu einer auf < 35°C
abgekühlten Gelatine-Lösung gegeben und vorsichtig auf eine vorbereitete,
entwickelte DC-Platte gegossen. Nach Aufbewahrung bei Raumtemperatur über
Nacht konnte das Ergebnis als entfärbte Zonen auf der roten Gelatineschicht
visuell ermittelt werden (Hahn-Deinstrop, 1997).
Adaptiertes Ehrlich's Reagenz (Sprühreagenz): 0,2 g 4-
Dimethylaminobenzaldehyd (Merck) wurden in einer Mischung aus 5 ml
Salzsäure und 15 ml Methanol gelöst (Pachaly, 1995).
2.3.3 DC-Methode zur quantitativen Bestimmung
Für die quantitative Bestimmung von Substanzen konnte prinzipiell nach der
gleichen Methode wie für qualitative Arbeiten verfahren werden, jedoch war eine
wesentlich höhere Präzision erforderlich. Diese konnte durch folgende zusätzliche
Maßnahmen sichergestellt werden:
�� Exakte Einhaltung der Konzentration der Probenlösungen
�� Genaue Probendosierung bei der Auftragung
�� Vorwaschen und Aktivieren der Platten zur Beseitigung etwaiger
Verunreinigungen
�� Präzise Einhaltung der Chromatographiebedingungen
Ein weiteres wichtiges Kriterium war die Wahl und Herstellung des
Referenzmaterials. Da kommerziell keines der bekannten Spargelsaponine
erhältlich war, und durch eigene präparative Arbeiten im Rahmen der zur
Verfügung stehenden Zeit keine befriedigende Reinheit der Substanzen erreicht
werden konnte, wurden verschiedene handelsübliche Standardsaponine auf ihre
Eignung getestet. Von diesen Substanzen erwies sich das Timosaponin A-3
(Wako Chemicals) als gut geeignet. Es handelt sich dabei um ein
Spirostanolsaponin aus Sarsasapogenin mit einer Zuckerkette aus Glucose und
38
Galactose am C-3 Atom (Molekulargewicht von 740,9 Da) in HPLC-reiner Form.
Dieses Saponin wird aus dem Rhizom von Annemarrhena asphodeloides isoliert.
Die derivatisierten Zonen hatten ihr Adsorptionsmaximum, wie auch die
Spargelsaponine, bei einer Wellenlänge von 440 nm. Für die Standardlösung
wurden 10,0 mg im 100,0 ml Messkolben in HPLC-reinem Methanol gelöst, immer
kühl und dunkel gelagert und nur Aliquote für die Analysen bei Raumtemperatur
aufbewahrt. Alle Messungen wurden mit diesem Ansatz durchgeführt.
Unter Beachtung der genannten Anforderungen für quantitative Analysen wurde
die oben dargestellte Methode um folgende Schritte ergänzt:
Platten: HPTLC Kieselgel 60 (200x100) vorgewaschen mit dem
Fließmittel und 30 Minuten bei 110°C im Trockenschrank
aktiviert
Probenauftragung: strichförmig 5 mm, Bahnabstand 3 mm,
Geschwindigkeit 7sec µl-1
AS 30 mit Autosampler DESAGA
Bahnbelegung: 9 Bahnen für Standards und 12 Bahnen für Proben
Auswertung: unmittelbar nach Abkühlung der Platte (max. 10 Minuten)
Remissionsmessung, 440 nm, Peakfläche
DC-Scanner CD 60, DESAGA
Mit dieser Methode ließen sich pro Platte 6 Proben in Doppelbestimmung
messen. Der Ausdruck für eine solche Methode ist im Anhang beigefügt. Der
Zeitaufwand pro Platte betrug etwa 2,5 Stunden. Dabei war es jedoch häufig
notwendig, zuerst eine semiquantitative Aussage zu treffen, um das
aufzutragende Probenvolumen zu ermitteln.
Da die Software des Densitometers so aufgebaut ist, dass jedem Probenpeak ein
Standardpeak zugeordnet ist, dies aber bei der Verwendung nur einer
Standardsubstanz nicht der Fall war, musste die Mengenberechnung anhand der
Peakflächen separat erfolgen.
39
Da die Peakflächen der Saponine AS 3 bis AS 5 bei sehr vielen Proben unterhalb
der Berechnungsgrenze lagen, wurden in diesen Fällen manuell Werte zwischen
0,5 und 0,05 mg in die Berechnung aufgenommen. Dadurch war es für die
statistische Auswertung möglich, die Bezeichnung "nicht bestimmbar" zu
ersetzten und somit die fälschliche Nullsetzung zu vermeiden.
2.3.4 Säulenchromatographie
Als Sorbentien für präparative Aufreinigung von Spargelsaponinen wurden
Kieselgel 60 (63-200 µm, Merck), LiChroprep RP 18 (40-63µm, Merck) und
Sephadex LH-20 (Pharmacia) verwendet.
Die Fließmittelsysteme (FM) für die Säulenchromatographie an Kieselgel waren:
FM1: Chloroform-Methanol-Wasser 6:4:1
FM2: Chloroform-Methanol Gradient von 13:7 bis 9:11
Für Sephadex LH-20 wurde HPLC-reines Methanol verwendet.
Für die erste säulenchromatographische Fraktionierung über Kieselgel wurde das
Sorbens (130 g) in FM1 suspendiert und in eine Säule (560 mm x 26 mm)
gegeben. Das Ausgangsmaterial waren 500 mg Rohsaponingemisch (incl. 15 mg
Timosaponin) aus gefriergetrockneten Eluaten der Vorversuche für die SPE. Das
getrocknete Rohsaponingemisch wurde im Mörser mit Kieselgel verrieben und auf
das in der Säule befindliche Sorbens aufgetragen. Danach wurde die
Säulenfüllung mit etwas Kieselgel beschichtet und die Chromatographie durch
vorsichtiges Zugeben kleiner Mengen von FM 1 gestartet. Nachdem ein
ausreichender Flüssigkeitspegel über dem Sorbens aufgebaut war, erfolgte die
weitere Zugabe des Fließmittels über ein Vorratsgefäß. Mit einem
Fraktionssammler wurden Fraktionen á 6 ml gesammelt.
Für die zweite säulenchromatographische Fraktionierung über Kieselgel wurde
nach dem gleichen Schema eine Säule (290 mm x 10 mm) mit dem in
Chloroform-Methanol (13:7) suspendierten Sorbens befüllt. Bei einem Fluss von
ca. 0,8 ml min-1 wurde mit FM2, durch manuelle Einstellung eines Gradienten aus
40
Chloroform und Methanol von 13:7 bis 9:11, chromatographiert. Fraktionen á 2,1
ml wurden gesammelt.
Für die Fraktionierung über Sephadex LH-20 wurde das Sorbens in Methanol zum
Quellen über Nacht stehen gelassen. Anschließend wurde eine Säule (290 mm x
10 mm) damit befüllt und die in wenig Methanol gelöste Probe vorsichtig
aufgetragen. Bei einem Fluss von ca. 0,5 ml min-1 wurden Fraktionen á 2,5 ml
gesammelt.
2.3.5 Massenspektrometrie
Massenspektrometrische Untersuchungen wurden an präparierten
Saponinfraktionen durchgeführt, um Aussagen über das Molekulargewicht der
Substanzen zu erhalten.
Dazu wurden die in Methanol (HPLC-rein) gelösten Proben mittels Spritzenpumpe
(500 µl) bei einem Fluss von 0,6 ml h-1 direkt in die Ionenfalle eingespritzt und die
Molpeaks im positiven bzw. negativen Modus erhalten. Als Trockengas wurde
hochreiner Stickstoff bei einem Fluss von 5 l min-1, einer Kapillar-Temperatur von
325 °C und eine Kapillar-Spannung von 4,5 kV verwendet. Mit Helium als
Nebulizer wurde bei einem Druck von 15 psi von m/z 400 bis 1400 gescannt. Für
die Standardsubstanz Timosaponin A-3 mit einem Molekulargewicht von 740,9 Da
wurden sowohl im positiven als auch im negativen Modus die entsprechenden
Molpeaks gefunden.
41
3 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Präparation
Ziel der präparativen Arbeiten war die Gewinnung von Saponinen zur
Identifizierung und die Verwendung als Referenzsubstanz für die quantitative DC.
Im ersten Schritt wurden 120 Fraktionen á 6 ml erhalten, die nach DC-Analyse zu
fünf Fraktionen mit folgenden Ausbeuten vereinigt wurden (Tabelle 2):
Tabelle 2: Saponinausbeute nach der ersten Säulenchromatographie über Kieselgel 60
Fraktion Glas Saponine Ausbeute (mg)
Fr. V 18-22 Timosaponin, AS 6, AS 5 20,0
Fr. IV 27-30 AS 6, AS 5 12,1
Fr. III 31-40 AS 4, AS 3, AS 2 118,6
Fr. II 41-55 AS 2, AS 1 79,9
Fr. I 58-96 AS 2, AS 1, unbek. 57,0
Eine schärfere Trennung der Einzelsaponine war nach diesem Schritt nicht
möglich.
Daher wurden 20 mg der Fraktion Fr. II zur weiteren Fraktionierung durch
Säulenchromatographie mit einem Stufengradienten des Lösemittelgemisches mit
einem Polaritätsindex von 5,17 bis 5,61 vorbereitet. Es wurden 80 Fraktionen á
2,1 ml erhalten. Nach DC-Analyse zeigte sich, dass die erwarteten Saponine AS 2
und AS 1 in den Fraktionen 24 bis 44 enthalten waren. Somit wurde deutlich, dass
auch unter den veränderten Chromatographiebedingungen keine Trennung dieser
beiden Saponine möglich war.
42
Aus diesem Grund wurde mit Sephadex LH 20 die Trennung der Fraktion Fr. II
getestet. Es wurden 80 Fraktionen á 2,5 ml erhalten. Die Detektion mittels DC
ergab ebenfalls keine Fraktionierung der beiden Saponine.
Aus diesen Ergebnissen kann zusammenfassend festgestellt werden, dass
Kieselgel 60 für eine erste Fraktionierung aufgereinigter Spargelsaponine
geeignet war. Weitere Auftrennungen der einzelnen Fraktionen sind jedoch nur
durch differenziertere Chromatographiebedingungen zu erreichen bzw. durch die
Kombination mit zusätzlichen chemischen oder physikalischen Techniken. Dazu
sollten in weiterführenden Arbeiten Möglichkeiten der präparativen HPLC, der
Flash-Chromatographie oder des Einsatzes beschichteter Membranen in
Ultrafiltrationsanlagen getestet werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit war
die vollständige Aufarbeitung von Reinsubstanzen aus zeitlichen und apparativen
Gründen nicht möglich. Eine im Mai diesen Jahres erschienene Veröffentlichung
zur erstmaligen Synthese des auch aus Spargel bekannten Methyl-Protodioscins
weckt die Hoffnung, dass dieses Saponin künftig in Reinstform kommerziell
erhältlich ist und somit die präparative Gewinnung des Standards nicht mehr
erforderlich sein könnte (Cheng et al., 2003).
Zur Identifizierung der in der qualitativen DC als Saponine nachgewiesenen
Zonen wurden Spargelextrakte strichförmig über die ganze Plattenbreite (180
mm) aufgetragen, entwickelt, jeweils 25 mm an den Plattenrändern abgeschnitten
und diese Randstreifen mit Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz und Ehrlich's
Reagenz derivatisiert.
Anschließend wurden die derivatisierten Plattenstücken wieder angelegt und die
einzelnen Saponinzonen von dem nicht derivatisierten Stück der DC-Platte
vorsichtig ausgekratzt. Nach Auswaschen der Saponine aus dem so gewonnenen
Material wurden diese für massenspektrometrische Untersuchungen gewonnen
(ca. 1-11 µg, berechnet aus aufgetragener Menge bei einer geschätzten
Ausbeute von 50 %).
43
3.2 Qualitative Arbeiten und Identifizierung der Saponine
Mit der Methode zur qualitativen DC ließ sich in allen Spargelproben aus den
Versuchen ein charakteristischer "Fingerprint" aus maximal sechs Saponinen
nachweisen (s. Abbildung 4). Dabei war in der Regel der Peak von AS 2 der
größte, gefolgt von AS 1 und AS 6. Da die Struktur der Saponine nicht bekannt
war, wurden sie aufsteigend in Chromatographierichtung als AS 1 bis AS 6
(Asparagus-Saponin) bezeichnet.
Die Rf-Werte lagen für:
AS 1 zwischen 0,305 und 0,320
AS 2 0,360 und 0,375
AS 3 0,400 und 0,418
AS 4 0,426 und 0,449
AS 5 0,464 und 0,480
AS 6 0,525 und 0,538.
Zur Identifizierung der Saponine wurde zuerst mit verschiedenen Reagenzien
derivatisiert. Abbildung 3 zeigt die unterschiedliche Färbung von strichförmig
aufgetragenem Spargelextrakt durch Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz,
Ehrlich's Reagenz, Vanillin-Schwefelsäure-Reagenz und methanolische
Schwefelsäure. Das Besprühen mit Wasser konnte nicht dokumentiert werden,
weil der Effekt der weißen Zonen weder fotografisch noch im Flachbettscanner
sichtbar war. AS 4 war in diesem Extrakt nicht nachweisbar. AS 6 ist auf Grund
der ungenügenden Auflösung der im Flachbettscanner dokumentierten DC-Platte
nur undeutlich zu erkennen. Während nur Furostanolsaponine mit Ehrlich's
Reagenz eine charakteristische Rotfärbung ergaben, wurden mit Anisaldehyd-
Schwefelsäure-Reagenz sowohl Furostanol- als auch Spirostanol-Saponine grün
dargestellt. Andere Substanzen wurden mit Ehrlich's Reagenz gar nicht
derivatisiert und mit Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz zeigten sie grau-
braune bzw. lila Zonen. Mit Schwefelsäure und Vanillin-Schwefelsäure-Reagenz
war keine selektive Auswahl der Saponinzonen möglich.
44
Abbildung 3: Derivatisierung eines bandförmig aufgetragenen Spargelextraktes mit unterschiedlichen Reagenzien
(die senkrechte Beschriftung kennzeichnet die Zonen der Saponine AS 1 bis 6)
Aus einem zusätzlichen Vergleich mit einer mit Blutgelatine beschichteten DC-
Platte (nicht dargestellt) konnte geschlussfolgert werden, dass AS 1 bis AS 5 sehr
wahrscheinlich Furostanolsaponine sind (nicht hämolytisch) und AS 6 vom
Spirostanoltyp ist. Allerdings zeigte diese Platte im Gegensatz zum Anisaldehyd-
Schwefelsäure-Reagenz im Bereich von AS 6 zwei hämolytische Zonen, so dass
es denkbar ist, dass sich hinter diesem Peak zwei Saponine verbergen.
In der Abbildung 4 wurden exemplarisch die Densitogramme von zwei
unterschiedlichen Spargelextrakten übereinander gelegt. Während der eine
Extrakt nur fünf Saponinpeaks zeigte, konnten bei dem anderen sechs
nachgewiesen werden. AS 1, AS 2 und AS 6 waren in der Regel eindeutig
zuordenbar. Die Abbildung zeigt auch, wie schwierig die Zuordnung der Saponine
45
AS 3, AS 4 und AS 5 war. Die DC war nach der beschriebenen Methode
durchgeführt worden.
Abbildung 4: übereinander gelegte Densitogramme von zwei Spargelextrakten auf zwei verschiedenen DC-Platten
Beide Extrakte zeigten den typischen "Fingerprint" im Hinblick auf das Verhältnis
der einzelnen Saponine zueinander
Zur Identifizierung der Spargelsaponine wurde Spargelextrakt auf DC-Platten
bandförmig über die gesamte Breite (180 mm) aufgetragen und nach der
Entwicklung und Auskratzen der einzelnen Saponinzonen eine
massenspektrometrische Untersuchung der so gewonnenen Saponine
vorgenommen. Für die Zonen der Saponine AS 1 und AS 2 wurden in mehreren
Messungen Molekulargewichte von 1048 Da und 1062 Da gefunden, wobei AS 1
eine höhere Intensität von 1048 Da und AS 2 von 1062 Da aufwies. Bei den
Molekulargewichten von 1071 Da und 1085 Da, die ebenfalls gefunden wurden,
dürfte es sich um den jeweiligen Molpeak + Natrium handeln. Warum jedoch die
in der DC gut getrennten Saponinzonen jeweils beide Massen enthielten, lässt
46
sich nicht eindeutig erklären. Eine zweidimensionale DC zeigte, dass die beiden
Saponine nicht stabil waren (Abbildung 5).
Abbildung 5: Zweidimensionale DC eines Spargelextraktes (Farben invertiert)
(links ist die eindimensionale Entwicklung als Vergleich zur der Diagonale aus der
zweidimensionalen dargestellt)
Dazu wurde auf eine DC-Platte ein Spargelextrakt links und rechts punktförmig
aufgetragen und zuerst in eine Richtung entwickelt. Danach wurde die Platte um
90° gedreht und die rechts aufgetragene Probe in die andere Richtung entwickelt.
Bei stabilen Substanz-Zonen entsteht eine Diagonale. Die Saponine AS 1 und AS
2 zeigen jedoch ein Viereck (weiß eingekreist), was bedeutet, dass bei der
zweiten Entwicklung beide Substanz-Zonen nicht ganz stabil waren. Da es sich
mit den gefundenen Molekulargewichten vermutlich um die bereits bekannten
Spargelsaponine Methyl-Protodioscin oder ACS 1 (m/z 1061,7) und Protodioscin
ACS 2 (m/z 1047,7) (Shao et al., 1996) bzw. ASP I (Kawano et al., 1977) handelt,
könnten die Beobachtungen sowohl in der DC als auch im Massenspektrometer
auf das rasche Übergehen beider Formen ineinander schließen lassen. Dies ist
konform zu den Erklärungen aus der Literatur bezüglich des Verhaltens in
alkoholischen Auszügen (Tschesche et al., 1969). Die Fragmentierung des
47
Moleküls mit der Masse m/z 1047,7 ergab m/z 901,7 (Abbildung 6 ). Dies würde
ASP II entsprechen. Bei der Fragmentierung des Moleküls mit dem
Molekulargewicht m/z 1061,7 wurde ein Fragment gemessen, das sich mit einem
Molekulargewicht von m/z 913,7 genau um das einer CH2-Gruppe entsprechende
höher ist als das Fragment von m/z 1047,7 (Abbildung 7). Die beiden Fragmente
würden daher auf die Abspaltung je einer Zuckereinheit aus dem
Ausgangsmolekül hinweisen und die Zuordnung der Spargelsaponine zu den
Molekulargewichten erhärten.
Eindeutige Aussagen dazu sind aber erst nach genauen Strukturuntersuchungen
möglich, die im Rahmen dieser Arbeit nicht erfolgen konnten.
Abbildung 6: Fragmentierung des Saponinmoleküls mit m/z 1047,7
Das Fragment mit m/z 901,4 zeigt die Abspaltung eines Rhamnosylrestes mit m/z
146,1 [M-18]+
48
Abbildung 7: Fragmentierung des Saponinmoleküls mit m/z 1061,7
Das Fragment mit m/z 915,7 zeigt die Abspaltung eines Rhamnosylrestes mit m/z
146,1 [M-18]+ und das Fragment mit m/z 769,6 eines weiteren Rhamnosylrestes
Für AS 4 wurde bei Untersuchungen, die im Jahre 2002 freundlicherweise im
Hans-Knöll-Institut in Jena durchgeführt wurden, ein Peak bei m/z 925,1 [M+Na]+
gefunden, was im positiven Modus also ASP II mit der Masse 902 Da
entsprechen könnte (Kawano et al., 1977). Bei eigenen Untersuchungen wurde
ein Peak bei m/z 914,7 (methylierte Form) für die Zone von AS 4 ermittelt. Bei den
Zonen der Saponine AS 5 und AS 6 wurden keine aus dem Untergrundrauschen
deutlich zu erkennenden Saponinpeaks gefunden werden. Dies lag an der zu
geringen Konzentration der gewonnen Substanzen.
Jedoch zeigten die massenspektrometrischen Untersuchungen der Fraktion V aus
der Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (s. Tabelle 2) einen deutlichen Peak
bei m/z 763 [M+Na]+ was Timosaponin mit einer Masse von 740 Da entsprechen
würde. Dass die Ausbeute von Timosaponin mit 20 mg (s. Tabelle 2) höher als die
zu Beginn der Extraktion zugegebene Menge von 15 mg war, könnte wie folgt
erklärt werden. Timosaponin besteht aus dem Aglycon Sarsasapogenin mit einem
Molekül Glucose und einem Molekül Galactose. Die beiden Zucker haben das
gleiche Molekulargewicht von 180 Da. AS 6 könnte daher ein Spargelsaponin aus
Sarsasapogenin mit zwei Glucoseeinheiten sein, welches sich bezüglich des
Molekulargewichts nicht von Timosaponin unterscheiden lässt.
49
Ein Vergleich der Rf-Werte von AS 6 mit dem des in geringen Mengen (1 mg) von
Makoto Shimoyamada aus Japan zur Verfügung gestellten Spargelsaponins AS
2-I zeigte eine annähernde Übereinstimmung. Ein entsprechendes
Molekulargewicht von 868 Da konnte jedoch nicht gemessen werden. Der Rf-Wert
des ebenfalls für Vergleiche verfügbaren (japanischen) AS 1 lag etwa im Bereich
des in dieser Arbeit als AS 5 benannten Spargelsaponins. Jedoch zeigte AS 5
eine positive Reaktion mit Ehrlich's Reagenz, während die Vergleichssubstanz
negativ reagierte, was für Spirostanolsaponine typisch ist.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass mit hoher Wahrscheinlichkeit
zwei bzw. drei der bereits aus Spargel bekannten Saponine (ACS 1, ACS 2 bzw.
ASP I) in den eigenen Proben nachgewiesen werden konnten. Neben den mittels
MS gefundenen Molekulargewichten basiert diese Annahme auch auf der
Tatsache, dass die drei Saponine vom Furostanoltyp sind und in den
Untersuchungen eine positive Reaktion mit Ehrlich's Reagenz ergaben.
Für die Übereinstimmung der Spargelsaponine AS 3, AS 4 und AS 5, die
ebenfalls mit dem Reagenz positiv reagierten (Rotfärbung) mit weiteren
bekannten Saponinen gibt es vage Hinweise.
AS 6 entsprach bezüglich der Reaktion mit Ehrlich's Reagenz (negativ), der
hämolytischen Wirkung und dem Rf-Wert den Eigenschaften von AS 1 aus Japan,
die massenspektrometrische Bestätigung einer Übereinstimmung steht jedoch
noch aus.
So ergibt sich aus den zusammengefassten Informationen zu den
Molekulargewichten bzw. Rf-Werten folgende mögliche Zuordnung der
Spargelsaponine (Tabelle 3).
50
Tabelle 3: Mögliche Zuordnung der untersuchten Spargelsaponine
In dieser Arbeit verwendete Bezeichnung
Molekulargewicht Typ Mögliche Übereinstimmung
AS 1 1048 Furostanol
ACS 2, ASP-I (Protodioscin) 25-S bzw. 25-R Form
AS 2 1061 Furostanol
ACS 1 22-Methyl-Protodioscin
AS 3 915 Furostanol 22-Methyl-Analogon von AS 4
AS 4 902 Furostanol ASP-II
AS 5 Furostanol ?
AS 6 Spirostanol AS 2-I oder
Sarsasapogenin +2 Glucose-Einheiten
3.3 Validierung der DC-Methode zur Gehaltsbestimmung
Eine Validierung der Methode, wie sie beispielsweise in der Pharmazie üblich ist
(Hahn-Deinstrop, 1997), konnte für die vorliegende Arbeit aus folgenden Gründen
nicht durchgeführt werden: Erstens gab es kein Probenmaterial mit bekannten
Saponingehalten und zweitens fehlten authentische Spargelsaponine, um deren
Wiederfindung zu ermitteln.
Subjektive Fehler durch individuelle Handhabung der einzelnen Arbeitsschritte
wurden dadurch weitestgehend verringert, dass alle Analysen von einer Person
durchgeführt wurden.
Die Beeinflussung des chromatographischen Ergebnisses durch Veränderung des
Fließmittels wurde dadurch ausgeschlossen, dass das Fließmittelgemisch für
jeden Analysentag frisch angesetzt wurde.
Die Stabilität des Analyten (d.h. der einzelnen Saponine) während der
Chromatographie wurde durch zweidimensionale DC ermittelt. Dabei zeigte sich,
dass es bei zwei Saponinen zu einer Veränderung kam, auf die im Kapitel zur
Identifizierung (3.2) eingegangen wurde.
51
Die Gerätepräzision für den AS 30 und das CD 60 wurde durch Auftragen eines
lipophilen Farbstoffgemisches (je 1 µl) auf 12 Bahnen und Entwicklung mit Toluol
überprüft. Dabei wurde für den Farbstoff Rot ein Varianzkoeffizient von 0,7 %
ermittelt.
Durch 12-maliges Messen einer Bahn mit dem Standard (0,75 µg µl-1) wurde für
die Messgenauigkeit ein Variationskoeffizient von 1,7 % dokumentiert (Anhang).
Für die Messung von drei Spargelproben auf je zwei Bahnen mit einer
Wiederholung auf drei Platten ergaben sich folgende Varianzkoeffizienten (n=6):
Probe A 8,0 %
Probe B 8,8 %
Probe C 12,2 %
Diese Fehlerangaben beinhalten die Fehler sowohl der Auftragung als auch der
Messgenauigkeit und ergeben somit für die DC-Methode einen Fehler von ca.
10%. In der Arbeit aus dem Jahr 1983, aus der die einzigen Angaben zum
Saponingehalt von Spargel stammen, wurde ein Fehler von 20% angegeben
(Fenwick and Oakenfull, 1983).
Mit diesen Auswertungen erwies sich die Methode als geeignet für vergleichende
Analysen.
3.4 Quantitative Auswertung der Versuche
Generell werden nachfolgend die Saponingehalte in mg bezogen auf 100 g
Frischmasse angegeben.
Von allen aufbereiteten Spargelproben, die auf eine handelsübliche Länge von 21
cm geschnitten worden waren, wurde die Trockenmasse bestimmt. Sie lag bei
ungeschälten Stangen im Mittel bei 6,58% und bei geschälten Stangen bei 6,16%.
Diese Werte entsprechen den in der Literatur angegebenen von 6 bis 7% (Souci
et al., 2001), (Herrmann, 1996). Die Trockenmassebestimmung diente der
Berechnung des Gesamtsaponingehaltes in % TM für Vergleiche mit
Literurangaben.
52
Die Analyse von fünfzehn Spargelstangen, die aus dem Versuch 1 entnommen
wurden, gibt einen Überblick über die Schwankungen im Saponingehalt einzelner
Stangen. Dazu wurde Probenmaterial der Sorte 'Gijnlim' der kalten Variante von
drei Erntetagen untersucht und die Ergebnisse in Abbildung 8 dargestellt. In
Tabelle 4 sind die Daten zusammengefasst.
Die Tabelle zeigt, dass die Gewichte der einzelnen Spargelstangen zwischen
27,89 g und 78,45 g lagen. Die Stangen waren nicht nach Handelsklassen
ausgewählt worden.
Mit Gehalten an Gesamtsaponinen von 127,7 bis 46 mg in 100 g Frischmasse
wiesen die einzelnen Stangen erhebliche Schwankungen auf, jedoch bestand
keine Korrelation zwischen Gewicht und Saponingehalt. Von den 15 hatten zwei
Stangen Gehalte über 100 mg berechnet auf 100 g FM. In nur einer dieser
Proben konnten alle sechs Saponine nachgewiesen werden.
Abbildung 8: Saponingehalt von 15 einzelnen Stangen der Sorte 'Gijnlim' der kalten Variante
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
22A
22B
22C
22D
22E
22F
30A
30B
30C
30D
30E
30F
33D
33E
33F
Probe
Sapo
ning
ehal
t (m
g in
100
g F
M)
AS 6
AS 5
AS 4
AS 3
AS 2
AS 1
53
Tabelle 4: Saponingehalt von 15 Einzelstangen der Sorte 'Gijnlim'
Saponingehalt (mg in 100 g FM) % in TMProb. Nr. Datum Ernte Gewicht
(g) AS 1 AS 2 AS 3 AS 4 AS 5 AS 6 AS
ges. AS ges.
22A 17.3.03 60,11 11,36 21,31 2,33 0,00 2,36 9,76 47,12 0,67
22B 17.3.03 43,86 12,74 26,35 2,53 0,00 2,53 2,53 46,68 0,67
22C 17.3.03 73,44 16,54 35,05 2,72 0,00 5,92 13,95 74,18 1,09
22D 17.3.03 78,45 31,02 57,39 8,85 0,00 9,53 20,86 127,65 1,74
22E 17.3.03 47,16 20,92 38,91 3,49 0,00 3,76 9,31 76,38 1,12
22F 17.3.03 62,81 13,93 21,94 2,78 0,00 4,57 12,44 55,66 0,79
30A 2.4.03 34,30 31,99 20,70 3,05 0,00 0,50 19,11 75,35 1,33
30B 2.4.03 41,40 26,70 16,46 6,78 0,00 0,50 32,83 83,26 1,32
30C 2.4.03 29,16 29,68 17,89 6,80 0,00 0,50 22,38 77,25 1,22
30D 2.4.03 26,99 17,40 4,19 3,12 0,00 0,50 20,78 45,99 0,73
30E 2.4.03 28,92 18,90 5,81 2,78 0,00 0,50 23,44 51,43 0,77
30F 2.4.03 27,89 37,01 14,82 7,24 0,00 0,50 26,05 85,62 1,29
33D 8.4.03 62,60 34,36 32,03 4,59 2,38 2,48 11,95 83,06 1,17
33E 8.4.03 40,00 39,43 49,13 0,50 0,00 0,50 17,98 106,53 1,81
33F 8.4.03 38,20 34,88 32,97 4,63 0,00 2,14 10,92 85,53 1,41
Mittelwert 46,35 25,12 26,33 4,15 0,16 2,45 16,95 74,78 1,142
Standardabweichung 16,51 9,27 14,34 2,22 0,59 2,52 7,53 22,33 0,35
VK (%) 35,6% 36,9% 54,5% 53,5% 374,2%102,7% 44,4% 29,9% 30,8%
Anteil an AS ges. (%) 33,6% 35,2% 5,5% 0,2% 3,3% 22,7% 100,0%
Zusammenfassend zeigten die Mittelwerte der Gehalte an den einzelnen
Saponinen, dass der Gesamtsaponingehalt zu ca. 90 % von den Saponinen AS 1,
AS 2 und AS 6 bestimmt wird. Die Saponine AS 3 bis AS 5 beeinflussten den
Gesamtgehalt also nur geringfügig.
54
3.4.1 Versuch 1: Einfluss der Bodentemperatur
Es wurden 34 Proben in Doppelbestimmung ausgewertet. Von den beiden Sorten
standen je Variante der Oberbodentemperatur
kalt 10-15°C
mittel 18-22°C
warm 25-30°C
verschiedene Stichprobenzahlen zur Verfügung. Dies resultierte aus der
unterschiedlichen Erntemenge bei den Temperaturvarianten, Überlappungen der
Erntetage und der Vorgabe, dass alle Proben unmittelbar nach der Ernte (ohne
Zwischenlagerung) aufgearbeitet werden sollten.
Der Saponingehalt von 'Grolim' in 100 g FM stieg von der warmen zur kalten
Variante von 54,0 über 57,0 auf 81,18 mg, der für 'Gijnlim' von 50,28 über 56,68
auf 60,74. Somit zeigten beide Sorten bei sinkender Oberbodentemperatur und
damit verlangsamtem Wachstum steigende Saponingehalte. Jedoch war dieser
Anstieg nur bei 'Grolim' der kalten Variante signifikant. In Abbildung 9 sind die
Mittelwerte der Gehalte an den einzelnen Saponinen sowie der
Gesamtsaponingehalt mit den Signifikanzen (p<0,05) graphisch dargestellt.
55
Abbildung 9: Gehalt an Einzelsaponinen (AS 1-AS 6) und Gesamtsaponin (AS ges.) der Sorten und Temperaturvarianten aus Versuch 1
Die Saponine AS 1, AS2 und AS 6 bestimmten, wie schon bei der Analyse der
Einzelstangen, zu über 90 % den Gesamtsaponingehalt.
Tabelle 5 enthält die zusammengefassten Daten dieses Versuchs.
Tabelle 5: Mittelwerte und Standardabweichungen der Saponingehalte aus den einzelnen Varianten aus Versuch 1
Saponingehalt (mg in 100 g FM) Sorte Temperatur n
AS 1 AS 2 AS 3 AS 4 AS 5 AS 6 AS ges. TM(g)% in TM
Mittelwert 3 11,66 21,23 1,07 1,27 0,50 15,27 54,00 6,46 0,79Grolim warm Standardabw. 2,52 5,38 0,98 1,11 0,00 4,92 13,49
Mittelwert 4 9,50 25,46 0,50 1,07 0,50 19,97 57,00 6,52 0,87Grolim mittel Standardabw. 4,05 6,98 0,98 1,11 0,00 1,39 11,89
Mittelwert 7 17,59 41,70 1,32 0,00 1,39 19,18 81,18 6,31 1,29Grolim kalt Standardabw. 2,97 4,33 0,00 2,15 0,00 13,41 14,87
Mittelwert 3 9,48 20,76 0,50 0,33 0,50 18,71 50,28 6,55 0,77Gijnlim warm Standardabw. 3,80 12,90 0,00 2,47 0,00 18,90 14,88
Mittelwert 7 8,71 21,39 1,46 1,19 1,53 22,54 56,68 6,86 0,83Gijnlim mittel Standardabw. 4,54 11,98 0,00 2,47 0,00 19,58 7,28
Mittelwert 10 11,52 29,76 1,00 0,33 2,25 15,88 60,74 6,69 0,91Gijnlim kalt Standardabw. 2,42 2,63 0,00 0,00 0,00 6,02 10,49
A AB
AA A
0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0
Sapo
ning
ehal
t (m
g in
100
gFM
)
Gro
lim w
arm
Gro
lim m
ittel
Gro
lim k
alt
Gijn
lim w
arm
Gijn
lim m
ittel
Gijn
lim k
alt
AS 1 AS 2 AS 3 AS 4 AS 5 AS 6 ASges.
56
Exemplarisch sind nachfolgend sechs Densitogramme eindimensional dargestellt
(Abbildung 9). Der charakteristische "Fingerprint" wird deutlich, jedoch fehlt bei
diesen Proben AS 5.
Abbildung 10: Densitogramme verschiedener Proben aus dem Versuch 1
(oberhalb der einzelnen Densitogramme ist die Bahnnummer auf der DC-Platte
angegeben)
in allen Proben entspricht Peak 5 dem AS 6, da in diesen Proben AS 4 nicht
nachweisbar war
Bei der Betrachtung der Anteile der einzelnen Saponine am Gesamtgehalt zeigte
sich eine relativ hohe Übereinstimmung zwischen den Varianten (Tabelle 6).
57
Tabelle 6: Anteil der Einzelsaponine am Gesamtsaponingehalt (%)
Anteil der Einzelsaponine an AS ges. (%) Sorte
Temperatur n AS 1 AS 2 AS 3 AS 4 AS 5 AS 6 AS ges.
Grolim warm 3 22,9 41,6 2,1 2,5 1,0 29,9 100,0
Grolim mittel 4 16,7 44,7 0,9 1,9 0,9 35,0 100,0
Grolim kalt 7 21,7 51,4 1,6 0,0 1,7 23,6 100,0
Gijnlim warm 3 18,9 41,3 1,0 0,7 1,0 37,2 100,0
Gijnlim mittel 7 15,4 37,7 2,6 2,1 2,7 39,8 100,0
Gijnlim kalt 10 19,0 49,0 1,7 0,5 3,7 26,1 100,0
Durchschnitt 19,2 44,9 1,6 1,2 1,9 31,3 100,0
3.4.2 Versuch 2: Einfluss der Sorte
Für diesen Versuch wurden 36 Proben in Doppelbestimmung ausgewertet. Für
die beiden Erntetermine waren folgende Klimaparameter erfasst worden:
29. Mai 10 Tage vorher: 43 mm Niederschlag bei 17 °C Lufttemperatur
5 Tage vorher: 12 mm Niederschlag bei 16 °C Lufttemperatur
12. Juni 10 Tage vorher: 19 mm Niederschlag bei 18 °C Lufttemperatur
5 Tage vorher: 7 mm Niederschlag bei 17 °C Lufttemperatur
(Brückner, 2002b)
Die gemittelten Werte für die Einzelsaponine und den Gesamtgehalt aus jeweils
sechs Wiederholungen sind in Abbildung 11 dargestellt.
In diesem Versuch zeigte die Sorte 'Grolim' (52,67 mg) im Vergleich zu 'Andreas'
(29,62 mg), 'Backlim' (25,97 mg) und 'Eposs' (26,13 mg) signifikant höhere
Gehalte. 'Gijnlim' lag mit 37,43 mg zwischen diesen drei Sorten und 'Grolim',
während für der Sorte 'Huchels Alpha' (14,27 mg) signifikant geringe Werte
ermittelt wurden.
58
Abbildung 11: Gehalt an Einzelsaponinen und Gesamtsaponin (AS ges.) der Sorten aus Versuch 2
Die zusammengefassten Mittelwerte der Sorten an beiden Ernteterminen, der
Anteil der Einzelsaponine am Gesamtsaponingehalt sowie die Signifikanzen der
Einzelsaponine im Sortenvergleich (p<0,05) sind in Tabelle 6 enthalten.
0
10
20
30
40
50
60
70
Sapo
ning
ehal
t mg
je 1
00 g
FM
Andr
eas
Back
lim
Epos
s
Gijn
lim
Gro
lim
Huc
hels
Alp
ha AS 1 AS 2 AS 3 AS 4 AS 5 AS 6 AS ges.
59
Tabelle 7: Saponingehalt, Gehalt und prozentualer Anteil der Einzelsaponine sowie Signifikanzen (p<0,05) im Sortenvergleich
Saponingehalt (mg in 100g FM) Sorte AS 1 AS 2 AS 3 AS 4 AS 5 AS 6 AS ges. TM (g) % in TM
MW 5,56 12,83 0,95 2,80 1,58 5,90 29,62 6,11 0,48 Anteil an AS ges. 18,8% 43,3% 3,2% 9,4% 5,3% 19,9% Andreas
Signifikanz* ab de g h j k AB MW 6,22 11,71 0,29 2,38 0,06 5,29 25,97 5,91 0,44
Anteil an AS ges. 23,9% 45,1% 1,1% 9,2% 0,2% 20,4% Backlim Signifikanz* ab de g h i k AB
MW 5,91 11,85 0,30 2,20 0,33 5,54 26,13 6,39 0,41 Anteil an AS ges. 22,6% 45,3% 1,1% 8,4% 1,3% 21,2% Eposs
Signifikanz* ab de g h i k AB MW 11,45 17,21 0,14 2,80 0,07 5,54 37,43 6,31 0,59
Anteil an AS ges. 30,6% 46,0% 0,4% 7,5% 0,2% 14,8% Gijnlim Signifikanz* bc e g h i k BC
MW 16,64 28,04 0,64 1,98 0,41 4,96 52,67 6,14 0,86 Anteil an AS ges. 31,6% 53,2% 1,2% 3,8% 0,8% 9,4% Grolim
Signifikanz* c f g h i k C MW 2,06 5,03 0,40 2,20 0,12 4,46 14,27 6,17 0,23
Anteil an AS ges. 14,5% 35,2% 2,8% 15,4% 0,8% 31,3% Huchels Alpha
Signifikanz* a d g h i k A * gleiche Buchstaben in der Spalte symbolisieren keine signifikanten Unterschiede
Im Vergleich der beiden Erntetermine wurde bei allen Sorten, mit Ausnahme von
'Eposs', tendenziell eine Erhöhung der Saponingehalte im Juni festgestellt. Die
Gehaltsveränderung betrug im Detail bei:
'Andreas' +22 %
'Backlim' +15 %
'Eposs' -13 %
'Gijnlim' +87 %
'Grolim' + 3 %
'H. Alpha' +61 %.
Die Abbildung 13 zeigt diese Veränderung. Über den Balken sind die
Signifikanzen für die Gesamtsaponine (p<0,05)aufgetragen.
60
Abbildung 12: Saponingehalte und Signifikanzen aller Sorten im Vergleich der beiden Erntetermine
(gleiche Buchstaben über den Balken symbolisieren keine signifikanten
Unterschiede der Gesamtsaponingehalte, p<0,05)
Die Darstellung (Abbildung 12) zeigt deutlich, dass der Anstieg des
Saponingehaltes bei der Sorte 'Gijnlim' am höchsten war. Dies korreliert mit den
Ergebnissen der Sensorik, nach denen die Komponente "bitter" bei dieser Sorte
am späteren Erntetermin verstärkt auftrat. Bei 'Grolim' war dieses
Geschmacksattribut bereits bei der Probe aus dem Mai relativ stark ausgeprägt
und erhöhte sich, wie auch der Saponingehalt, im Juni noch. 'Eposs' zeigte im
Juni eine Verringerung der bitteren Geschmackskomponente (Brückner, 2002b),
was ebenfalls mit der Verringerung des Saponingehaltes korreliert. (Die
graphische Darstellung der sensorischen Ergebnisse ist im Anhang beigefügt).
Bei den anderen Sorten ließen sich solche Korrelationen nicht ohne intensivere
Auswertungen finden. Anzumerken ist, dass die Sensorik durch ein geschultes
Panel erfolgte und nicht zur Testung der Verbraucherakzeptanz diente.
ab
a
cc
abcabc
abcabc
abc
abc
abc
bc
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
31.5. 13.6. 31.5. 13.6. 31.5. 13.6. 31.5. 13.6. 31.5. 13.6. 31.5. 13.6.
Andreas Backlim Eposs Gijnlim Grolim H. Aplha
Sapo
ning
ehal
t (m
g in
100
g F
M)
AS 6
AS 5
AS 4
AS 3
AS 2
AS 1
61
Die Korrelationen zwischen sensorischen Eigenschaften und Saponingehalt
sollten in einem weiteren Erntejahr genauer untersucht werden. Da bisher nur ein
Spargelsaponin als bitter beschrieben wurde (Kawano et al., 1977), sollte nach
Gewinnung ausreichender Mengen der einzelnen Saponine getestet werden,
welche dieser Substanzen auf die Sensorik Einfluss nehmen.
Exemplarisch sind nachfolgend sechs Densitogramme eindimensional dargestellt
(Abbildung 13). Jeweils der letzte Peak entspricht AS 6, da nach Peakzahl
nummeriert wird. Bei den dargestellten Proben für 'Huchels Alpha' und 'Andreas'
wird deutlich, dass die exakte Trennung und Zuordnung der Peaks für die
Saponine 3 bis 5 zum Teil sehr schwierig war und in diesen Fällen manuell
vorgenommen werden musste.
Abbildung 13: ausgewählte Densitogramme aus dem Sortenversuch
(von 'Grolim' und 'Huchels Alpha' ist jeweils nur eine Probe dargestellt)
Es wird deutlich, dass Anzahl und Fläche der einzelnen Peaks stark variieren.
AndreasGijnlim Grolim
H.Alpha
62
3.4.3 Versuch 3: Verpackungsversuch
Dieser Versuch sollte zeigen, ob sich eine Kurzzeitlagerung bei 8°C von
geschältem und verpacktem Spargel auf den Saponingehalt auswirkt. Dazu
wurden Proben der zwei verschiedenen Verpackungen (s. Kapitel 2.2.3) am
dritten und am vierten Lagertag entnommen. Ein Teil der Proben des vierten
Tages wurde noch 7 Stunden bei 20 °C gelagert und anschließend für die Analytik
aufbereitet (diese Proben sind mit "w" gekennzeichnet).
Die Ergebnisse der Saponinbestimmung sind in Abbildung 14 graphisch
dargestellt und die Werte in Tabelle in Tabelle 8 enthalten.
Das Ausgangsmaterial wurde am Einlagerungstag extrahiert und hatte einen
Saponingehalt von 22,5 mg in 100 g FM.
Abbildung 14: Saponingehalt und Signifikanzen (p<0,05) von gelagertem Spargel
w = Aufbewahrung 7 Stunden bei 20°C nach der Auslagerung am jeweiligen Tag
(gleiche Buchstaben über den Balken symbolisieren keine signifikanten
Unterschiede der Gesamtsaponingehalte)
abcbc
a
c
abc bc
ab
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
Ausg. Tag 3 Tag 4 Tag 4w
Tag 3 Tag 4 Tag 4w
Folie a Folie b
Sap
onin
geha
lt (m
g in
100
g F
M)
AS 6
AS 5
AS 4
AS 3
AS 2
AS 1
63
Während am dritten Lagertag bei Verpackung a ein nicht signifikanter
Saponinverlust von 15,4% und bei Verpackung b von 14,9 % gemessen wurde,
stieg der Wert bei Verpackung a am vierten Tag und bei Verpackung b am vierten
Tag warm erheblich an, jedoch ebenfalls nicht signifikant zum Ausgangsmaterial.
Da insbesondere eine Erhöhung der Saponingehalte schwer zu erklären ist,
wurde nach den Ursachen für die Ergebnisse gesucht. Es wurde festgestellt, dass
die Standardabweichungen zwischen den jeweils vier bis sechs Einzelwerten je
Variante relativ hoch waren (Tabelle 7).
Tabelle 8: Mittelwert des Gesamtsaponingehaltes und Standardabweichung aus den Einzelwerten der Verpackungsvarianten aus Versuch 3
(Folie a und b nach 3 Lagertagen bei 7°C, nach 4 Lagertagen bei 7 °C und nach
der Auslagerung am 4. Tag und Aufbewahrung bei 20°C über 8 Stunden)
Variante Gesamtsaponingehalt (mg in 100 g FM)
Standard-Abweichung
Folie a, 3 d 19,07 7,47 Folie b, 4 d 28,74 8,49
Folie a, 4 d warm 12,36 1,68 Folie b, 3 d 19,19 8,29 Folie a, 4 d 18,75 6,29
Folie b, 4 d warm 27,72 2,53
Als Ursachen für diese Schwankungsbreite kann inhomogenes Probenmaterial
zur Ernte in Betracht kommen. Durch den Anbaubetrieb konnte
Sortenhomogenität nicht bestätigt werden. Der Betrieb baut mehrere
Spargelsorten an, davon auch solche, die im Sortenversuch (Versuch 2) hohe
bzw. niedrige Saponingehalte aufwiesen. Wenn die 12-15 Stangen des
Probenmaterials aus unterschiedlichen Anteilen beispielsweise der Sorten
'Grolim' (52,67 mg in 100 g FM) und 'Huchels Alpha' (14,27 mg in 100 g FM) bei
der Entnahme der Stichproben am jeweiligen Auslagerungstag zusammengesetzt
waren, so könnte dies eine mögliche Erklärung für die große Streuung sein.
Eine andere Ursache für die unterschiedliche Saponindynamik in der Nachernte
könnte in der Verpackungsatmosphäre vermutet werden. Es wurde jedoch
64
dokumentiert, dass die Unterschiede in den O2/CO2-Gehalten zwischen den
beiden Verpackungen minimal waren. Bereits nach 24 Stunden nach Einlagerung
waren die angestrebten Gaswerte erreicht worden (10-15% O2 und ca. 10% CO2);
sie blieben bis zur Auslagerung am 4. Tag nahezu stabil. Die 7-stündige Lagerung
bei 20°C führte, wie zu erwarten war, zu einer aktivierten Atmung und damit zu
Veränderungen der Gaszusammensetzung (Schmidt, 2003). Daher konnte in
diesem Parameter ebenfalls keine Erklärung gefunden werden. Auch bei den
visuellen Bonituren und den sensorischen Bewertungen ergaben sich keine
Hinweise auf die ermittelten Veränderungen im Saponingehalt.
Interessant waren jedoch die mikrobiologischen Untersuchungen, die an
Probenmaterial, das ebenfalls aus den Foodtainern entnommen worden war,
durchgeführt wurden.
So zeigten diese Ergebnisse einen signifikanten Anstieg der Keimzahlen auf
Endo-Agar, jedoch nicht in ernährungsphysiologisch bedenklichen Bereichen, am
dritten Lagertag für die Folie b und am vierten Lagertag für die Folie a. Diese
Ergebnisse korrelieren zwar nicht direkt mit den Anstiegen der Saponingehalte in
den beiden Verpackungen, regen jedoch Überlegegungen zu einem etwaigen
Zusammenhang zwischen dem Wachstum bestimmter Mikroorganismen und dem
Saponingehalt an.
65
3.4.4 Versuch 4: Thermostabilität von Saponinen
Wärmebehandlung
Für diesen Versuch wurden 48 Proben aus dem selben methanolischen
Saponinextrakt analysiert. Sechs Proben wurden nicht thermisch behandelt. Ihr
Saponingehalt dient als Ausgangswert für die Ermittlung der
Gehaltsveränderungen in den behandelten Proben. Die anderen
Temperaturvarianten wurden so gewählt, dass sie den Temperaturen bei
technologischen Prozessen wie Kochen, Konservieren und Trocknen
entsprechen.
Abbildung 15 stellt die Saponingehalte der einzelnen Behandlungen graphisch
dar. Das Ausgangsmaterial hatte einen Gesamtsaponingehalt von 0,64 mg ml-1.
Abbildung 15: Gesamtsaponin nach verschiedenen thermischen Behandlungen
(gleiche Buchstaben über den Balken symbolisieren keine signifikanten
Unterschiede der Gesamtsaponingehalte, p<0,05)
DC
BBBBA
B
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Ausg
ang
100°
C-1
5min
100°
C-3
0min
100°
C-6
0min
140°
C-1
5min
140°
C-3
0min
140°
C-6
0min
Auto
klav
Sapo
ning
ehal
t (m
g in
100
g F
M)
AS6
AS5
AS4
AS3
AS2
AS1
66
Die Mittelwerte des Gesamtsaponingehaltes aus den einzelnen Behandlungen
zeigen einen signifikanten Verlust von ca. 10% nach allen drei Zeitstufen bei 100
°C (15, 30 und 60 Minuten) sowie auch nach 15 Minuten bei 140°C und 15
Minuten im Autoklaven. Nach 30 bzw. 60 Minuten bei 140 °C im Trockenschrank
war der Saponingehalt signifikant auf 77,8% bzw. 68,7% des Ausgangsmaterials
gesunken.
Alle Werte sowie die Standardabweichungen und die Ergebnisse des Signifikanz-
Tests (p<0,05) sind in der Tabelle 9 enthalten.
Tabelle 9: Saponingehalt, Signifikanzen und Standardabweichung von Spargelextrakt nach thermischer Behandlung
(gleiche Buchstaben in den Spalten symbolisieren keine signifikanten
Unterschiede der Gesamtsaponingehalte)
Saponingehalt (mg ml-1) Behandlung
(°C-Min.)
AS1 AS2 AS3 AS4 AS5 AS6 AS ges.
MW 0,138 0,327 0,008 0,000 0,007 0,163 0,643 Signifikanz d a d a a A Ausgang Std.abw. 0,010 0,023 0,001 0,000 0,001 0,013 0,039
MW 0,228 0,214 0,008 0,000 0,005 0,118 0,572 Signifikanz b d d cd b B 100-15 Std.abw. 0,011 0,011 0,001 0,000 0,001 0,008 0,028
MW 0,228 0,236 0,008 0,000 0,004 0,113 0,588 Signifikanz b dc c d b B 100-30 Std.abw. 0,008 0,013 0,001 0,000 0,001 0,005 0,024
MW 0,219 0,237 0,009 0,000 0,005 0,113 0,583 Signifikanz b dc cb cd b B 100-60 Std.abw. 0,011 0,011 0,001 0,000 0,001 0,007 0,024
MW 0,186 0,257 0,007 0,000 0,006 0,116 0,572 Signifikanz c c cb bc b B 140-15 Std.abw. 0,005 0,019 0,001 0,000 0,001 0,008 0,029
MW 0,073 0,319 0,005 0,000 0,007 0,097 0,500 Signifikanz e b cb ab c C 140-30 Std.abw. 0,006 0,016 0,000 0,000 0,001 0,008 0,026
MW 0,052 0,287 0,003 0,000 0,006 0,094 0,442 Signifikanz f a b abc c D 140-60 Std.abw. 0,006 0,016 0,000 0,000 0,001 0,008 0,026
MW 0,340 0,121 0,011 0,000 0,004 0,114 0,589 Signifikanz a e a d b B
121-15 (Autoklav)
Std.abw. 0,007 0,010 0,001 0,000 0,000 0,005 0,017
67
Ein Vergleich der Temperatursummen (°C*Minuten) erwies sich für die
Beschreibung der Abbauvorgänge als nicht geeignet. Bei den Proben 100-60 mit
6000 °C*Minuten war der Saponinabbau deutlich geringer als bei den Proben
140-30 mit 4200°C Minuten.
Auffällig war jedoch ein Anstieg der absoluten Werte von AS 1 bei gleichzeitiger
Verringerung von AS 2. Betrug der Anteil von AS 1 im Ausgangsmaterial 21,5%
und der von AS 2 50,9%, so zeigte sich bei den Proben 100-15, 100-30 und 100-
60 ein fast angeglichenes Verhältnis von ca. 38% - 40 % (annähernd gleiche
Peakflächen). Da die Anteile von AS 1 und AS 2 vermutlich lediglich den Grad der
Methylierung bzw. Demethylierung ausdrücken (s. Kapitel 3.2), wurde für die
Bewertung des Abbaus die Summe aus diesen beiden Substanzen gebildet.
Diese Summenkurve folgte der Abbaukurve der Gesamtsaponine (Abbildung 16).
Für AS 6, das vermutlich einzige Spirostanol, verringerte sich der absolute Wert
bereits nach 15 Minuten bei 100 °C um ca. 30 %. Dieser Verlust blieb annähernd
gleich bei den Stufen 100-30, 100-60, 140-15 und beim Autoklavieren. Bei 140-30
betrug er 40 % und bei 140-60 42 %.
Bei den Proben, die mehr als 15 Minuten auf 140°C erhitzt wurden, verringerten
sich der absolute Gehalt von AS 1 und AS 2, jedoch nahm der Anteil am
Gesamtsaponingehalt von AS 1 bei jeder Zeitstufe von 32,6% auf 11,7% ab und
der von AS 2 stieg von 45% auf 65%.
In Abbildung 16 sind relativ zum Ausgangsmaterial (100%) der
Gesamtsaponingehalt, die Saponine AS 1, AS 2, deren Summe sowie AS 6 bei
den einzelnen Behandlungen im Trockenschrank graphisch dargestellt. AS 3 und
AS 5 wurden wegen ihrer geringen Anteile aus Gründen der Übersichtlichkeit
nicht in die Darstellung aufgenommen.
68
Abbildung 16: Verlauf des Saponinabbaus in Spargelextrakten nach thermischer Behandlung im Trockenschrank
Bei den autoklavierten Proben war der Gehalt von AS 1 mit 57,7% deutlich höher
als der von AS 2 mit 20,5%. Die Proben zeigten also eine Abweichung vom
typischen "Fingerprint".
Gegarter Spargel
Für den Vergleich der Thermostabilität zwischen extrahierten Saponinen und
solchen, die sich noch in der Spargelmatrix befinden, wurden Spargelstangen
längs halbiert, die eine Hälfte roh extrahiert und die andere nach der Garvorschrift
für sensorische Tests zubereitet und anschließend extrahiert.
Unabhängig vom Ausgangswert wurde für alle drei Proben eine Verringerung des
Saponingehaltes auf 72,1 %, 71,9 % und 69,4 % in den gegarten Stangenteilen
und somit ein Verlust von ca. 30 % festgestellt.
Die Ergebnisse dieser Analyse von drei Spargelproben zeigt Tabelle 10.
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
160%
180%
Ausga
ng
Behandlung
Sapo
ning
ehal
t
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
AS1+AS2
AS6
AS 1
AS 2
AS ges.
69
Tabelle 10: Saponingehalt und –verlust in rohen und gekochten Spargelproben
Saponingehalt (mg in 100g FM) Sorte Temperatur S1 S2 S3 S4 S5 S6 ges. Verlust
roh 12,06 17,29 0,30 0,00 0,20 13,99 43,84 Gijnlim (mittel) gekocht 9,15 13,64 0,20 0,00 0,00 8,62 31,61
72,10%
roh 24,50 24,68 0,40 0,00 0,20 12,41 62,20 Gijnlim (mittel) gekocht 16,93 16,04 0,50 0,00 0,00 11,24 44,72
71,90%
roh 38,25 38,03 0,64 0,00 0,40 4,26 81,57 Grolim (mittel) gekocht 23,06 29,95 0,40 0,00 0,15 3,03 56,60
69,40%
Die Verluste von ca. 30% Gesamtsaponin sind deutlich höher als bei der
thermischen Behandlung der Saponinextrakte bei 100 °C (10%). Die
"Fingerprints" der gegarten Proben und somit die Anteile der Saponine AS 1, AS
2 und AS 6 entsprechen denen des rohen Spargels. Das bedeutet, dass ein
gleichmäßiger Verlust der Einzelsaponine gemessen werden konnte.
Die Ergebnisse sind wegen des geringen Stichprobenumfangs nicht statistisch
abgesichert. Jedoch scheint es denkbar, dass bei der Erhitzung innerhalb der
Spargelmatrix durch den Einfluss anderer Matrixbestandteile bzw. durch
Auswaschen größere Saponinverluste auftraten als bei matrixfreien Proben.
Gefrierlagerung
Als Kontrolle für die Überprüfung eventueller Veränderungen während einer
Gefrierlagerung diente das Ausgangsmaterial aus Versuch 3 (s. Kapitel 2.2.3).
Von dem portioniert eingefrorenen Probenmaterial wurden nach acht und 12
Wochen jeweils fünf Proben aufgetaut und extrahiert.
Im Ausgangsmaterial wurde ein Gesamtsaponingehalt von 22,54 mg 100 g-1
Frischmasse nachgewiesen. Nach acht Wochen waren es 22,40 mg und nach 12
Wochen 22,95 mg. Die geringfügigen Unterschiede zwischen den Werten
entsprechen dem Fehler der Methode, so dass davon ausgegangen werden kann,
dass durch die Gefrierlagerung bei –18°C innerhalb von drei Monaten keine
Veränderung im Saponingehalt erfolgt war. In Abbildung 18 sind die
Gesamtsaponingehalte und die Standardabweichungen für die Mittelwerte dieser
70
Proben dargestellt. Da Probenmaterial für sechs Monate eingelagert wurde, kann
die Untersuchung in monatlichen Abständen fortgesetzt werden.
Abbildung 17: Saponingehalt und Standardabweichung von gefriergelagerten Spargelproben
3.4.5 Sonstige Proben
Sterilkonserve
In den drei untersuchten Proben aus Sterilkonserven wurden Gehalte an
Gesamtsaponin von
Probe A 11,36 mg in 100 g
Probe B 7,98 mg in 100 g
Probe C 8,22 mg in 100 g ermittelt.
Die Proben zeigten einen ähnlichen "Fingerprint" wie er auch bei frischem Spargel
auftrat. Die Daten sind wegen des geringen Stichprobenumfangs nicht statistisch
gesichert und die Saponinmenge im Ausgangsmaterial war nicht bekannt. Sie
zeigen jedoch, dass auch in Spargel, der einen industriellen
Verarbeitungsprozess durchlaufen hat, noch ein ähnliches Saponinspektrum wie
22,13 22,40 22,95
0,000
5,000
10,000
15,000
20,000
25,000
30,000
Ausgang 8 Wochen 12 Wochen
Ges
amts
apon
in m
g in
100
g F
M
71
in frischen Material zu finden war. Die Gehalte liegen deutlich unter denen der
Sorte 'Huchels Alpha', die im Sortenvergleich die niedrigsten Werte aufwies
(14,27 mg in 100 g).
72
3.5 Diskussion und Ausblick
Die Aufgabenstellung für diese Arbeit bestand in der Ermittlung der
Gesamtsaponingehalte verschiedener in Deutschland angebauter Spargelproben
und des Einflusses ausgewählter Vor- und Nacherntefaktoren auf mögliche
Gehaltsveränderungen.
Ebenfalls sind auch Erkenntnisse über die Zahl und die Struktur der Saponine und
über damit verbundene biologische Eigenschaften für die Interpretation der
Ergebnisse von Bedeutung. Aus diesem Grund wurden erste
massenspektrometrische Untersuchungen zur Identifizierung der gefundenen
Saponine durchgeführt.
Wie der Vergleich von 15 einzelnen Stangen der Sorte Gijnlim zeigte, schwankten
die Saponingehalte im biologischen Material fast um den Faktor drei. Da die
Stangen bezüglich Sorte, Versuchsanlage, Temperatur und Stechzeitpunkt am
jeweiligen Erntedatum identisch waren, scheint es individuelle Faktoren zu geben,
die die Bildung von Saponinen beeinflussen. So ist beispielsweise denkbar, dass
der Gehalt der Sprossen durch spezielle Ursachen am jeweiligen Rhizom
bestimmt wird. Bei einer Wiederholung des Versuches im Folgejahr sollten daher
die Stangen einzelner Spargelpflanzen analysiert werden.
Mit der erarbeiteten DC-Methode wurden Gesamtsaponingehalte von ca. 10 mg
bis ca. 80 mg in 100 g Frischmasse, mit Einzelwerten über 100 mg, in
verschiedenen Spargelproben ermittelt. Wie die Tabelle 1 (s. Kapitel 1.3.3) zeigt,
wurden bisher in anderen Arbeiten Saponingehalte zwischen 130 mg und 2 mg in
100 g Frischmasse dokumentiert.
Insgesamt können also die mittleren Werte der im Rahmen dieser Arbeit
untersuchten frischen Spargelproben als vergleichbar mit denen der Literatur
angesehen werden.
Erstmals wurden in der vorliegenden Arbeit Vergleiche zwischen
unterschiedlichen Sorten aus gleichen Spargelanlagen vorgenommen sowie der
Einfluss verschiedener Vor- und Nacherntebehandlungen untersucht.
73
Nach Abschluss der experimentellen Arbeiten und Auswertung der Daten zu der
vorliegenden Arbeit erschien im Oktober 2003 eine Veröffentlichung der schon
aus anderen Veröffentlichungen bekannten Forschergruppe der Rutgers
University in New Jersey (Wang et al., 2003). Die Autoren beschrieben sehr
genau die erarbeitete Methode und wiesen darauf hin, dass die Verwendung von
Ethanol statt Methanol für die Extraktion der Saponine aus der Spargelmatrix
dazu führte, dass nur Protodioscin und nicht mehr die methylierte Form davon
nachgewiesen werden konnte. Als Standardsubstanz war aus Tribulus terrestris
isoliertes Protodioscin verwendet worden. In der HPLC wurden fünf Peaks
gefunden, von denen zwei den Flavonoiden zugeordnet wurden und die anderen
drei den Saponinen. Ein Peak entsprach mit m/z 1031,9 [M-18+1]+ dem
Protodioscin, für das auch eine Gehaltsbestimmung erfolgte. Die beiden anderen
Peaks mit m/z 925,8 [M+Na]+ und m/z 927,8 [M+Na]+ würden dem bekannten
ASP II (Kawano et al., 1975) entsprechen bzw. einem Saponin mit einem um 2
Protonen größeren Aglycon (fehlende Doppelbindung). Der Saponingehalt in den
drei verwendeten Spargelsorten (A34, IIIJ und IID) wurde aus jeweils sechs
Spargelstangen (24 cm), die in drei Segmente (top, middle, bottom) á 8 cm
unterteilt worden waren, ermittelt. In allen Sorten wurden 0,24 mg je 100 g FM im
oberen Abschnitt und 25 mg je 100 g FM im unteren Abschnitt nachgewiesen.
Nach der aufgeführten Grafik unterscheiden sich die unteren Abschnitte der
Sorten jedoch in Werten zwischen ca. 0,018 und ca. 0,028 % FM. Eine
statistische Auswertung der Varianzen zwischen den einzelnen Sorten ist nicht
dokumentiert. Die Trockenmasse des verwendeten Spargels wird mit 10 %
angegeben. Die relative Standardabweichung für die Quantifizierung lag unter
8%. Aussagen zur Bitterkeit des Saponins werden auch in dieser Veröffentlichung
nicht gemacht.
Die Arbeit bestätigt die eigenen Untersuchungen bezüglich des parallelen
Auftretens der methylierten und der demethylierten Form des Protodioscins, bzw.
unterstreicht die Vermutung, dass es sich bei dem Methyl-Protodioscin um ein
Artefakt der methanolischen Extraktion handelt. Vergleicht man die Summen von
AS 1und AS 2, dann entsprechen die Gehalte an Protodioscin von 0,24 bis 25 mg
in 100 g FM denen der in den eigenen Versuchen gefunden Werte, wobei in
74
unseren Arbeiten sortenspezifische Unterschiede deutlicher nachgewiesen
werden konnten, jedoch keine Segmentierung der Spargelstangen vorgenommen
wurde.
3.5.1 Einfluss von Sorte und Bodentemperatur auf den Saponingehalt
Sortenabhängige Unterschiede konnten für die untersuchten sechs Spargelsorten
von zwei Ernteterminen nachgewiesen werden.
Die höchsten Saponingehalte hatte die Sorte 'Grolim' mit 52,7 mg in 100 g FM.
Während die anderen vier Sorten im Bereich von 25 bis 37 mg lagen, unterschied
sich die Sorte 'Huchels Alpha' mit nur 14,3 mg signifikant.
Spargelsorten werden von den Anbauern so ausgewählt, dass sie möglichst
stabile Ernteerträge liefern, für die entsprechenden Anbauverfahren geeignet sind
und in zunehmenden Maße auch Resistenzen gegen Pilzerkrankungen (z. B.
Stemphylium, Puccinia, Fusarium und Botrytis) besitzen (Fischer-Klüver, 2003).
'Grolim' und 'Gijnlim' gehören zu Hybridsorten, die letztere Eigenschaften
besitzen. Vor dem Hintergrund, dass Saponine fungizid wirken, scheint ein
erhöhter Saponingehalt bei Sorten mit hoher Krankheitsresistenz erklärbar.
Im Vergleich der Saponingehalte zwischen den beiden Erntedaten fiel auf, dass
die größten Veränderungen die Sorte 'Gijnlim' zeigte . Mit Ausnahme der Sorte
'Eposs' war bei allen Sorten ein leichter Anstieg der Werte vom 31. Mai zum 13.
Juni zu beobachten. Lag 'Gijnlim' am früheren Erntetermin noch innerhalb der
Werte der mittleren Sorten (25 bis 30 mg), so erreichte er am zweiten Erntetermin
mit 48,8 mg fast das Niveau von 'Grolim'. Anders als im Gewächshausversuch
(Versuch 1), wo 'Grolim' offenbar auf niedrigere Oberbodentemperaturen mit
erhöhten Saponingehalten reagierte, lag eine der Ursachen für die stärkere
Veränderung bei 'Gijnlim' in diesem Sortenversuch eventuell in den
dokumentierten geringeren Niederschlagsmengen im Juni. Vermutlich hat nicht
ein einzelner Faktor (z.B. die Temperatur oder die Sorte) Einfluss auf den
Saponingehalt des Spargels sondern eine Kombination aus mehreren Faktoren.
75
Mit den Proben der Sorten 'Grolim' und 'Gijnlim' aus Versuch 1 aus einer
Versuchsanlage, bei der mit Hilfe von drei unterschiedlichen
Oberbodentemperaturenbereichen (10-15°C, 18-22°C und 25-30°C) praxisnahe
Anbaubedingungen bei wechselnder Wetterlage simuliert werden konnten, wurde
bei beiden Sorten tendenziell ein leichter Anstieg des Saponingehaltes bei
sinkenden Oberbodentemperaturen und damit verbundenem langsamerem
Wachstum festgestellt (im Bereich von 50 auf 60 mg in 100 g FM). Signifikant
erhöht war jedoch nur der Gehalt der Sorte 'Grolim' der kalten Variante mit 81,18
mg in 100 g FM.
Es konnten keine Literaturangaben gefunden werden, die ähnliche
Untersuchungen an saponinhaltigen Pflanzen dokumentieren, aber bezüglich
saisonaler, genotypischer oder umweltbedingter Schwankungen liegen einige
Studien vor. So wurde für in China im Verlauf der Monate Mai bis November
angebaute Astragalus-Arten dokumentiert, dass Astragaloside I-IV (Saponine)
von Mitte August bis Mitte September die höchsten Werte hatten (Ma et al.,
2002). Der Saponingehalt war also saisonabhängig.
Für Lupine wurden standort- und sortenabhängige Unterschiede in den
Saponingehalten nachgewiesen (Ruiz et al., 2001a; Ruiz et al., 2001b).
Standortabhängige Werte beinhalten klimatische und bodenabhängige Einflüsse.
Ähnliche Ergebnisse brachte eine Untersuchung über zwei Ernteperioden an 10
Neuzüchtungen von Trigonella foenum-graecum L., aus denen Sapogenine für
die Steroidproduktion nach Hydrolyse aus den Saponinen gewonnen wurden.
Nach einer multivariaten Analyse der Saponingehalte traten die höchsten
Signifikanzen bei einer Kombination aus Sorte und Jahr sowie Standort und Jahr
auf (Taylor et al., 2002). Dies belegt ebenfalls, dass die Saponinbildung nicht
allein durch die Sorte bestimmt wird, sondern auch durch klimatische Einflüsse
wie Temperatur und Niederschlag beeinflusst wird.
Die eigenen Beobachtungen an den Sorten 'Grolim' und 'Gijnlim' aus den
Versuchen 1 und 2 werden dadurch bestätigt. Offenbar ist 'Grolim' sensitiver
gegenüber niedrigeren Temperaturen und 'Gijnlim' gegenüber Trockenheit. Für
die wegen eines guten Ertrages, frühzeitigen Erntebeginns und hohem
76
Gesamteindruck weit verbreitete Sorte 'Gijnlim' wird von Praktikern die Beregnung
unbedingt empfohlen (Fischer-Klüver, 2003), allerdings bisher noch nicht unter
dem Gesichtspunkt unerwünschter Bitterkeit durch hohe Saponingehalte.
Anbaubetriebe, die Imageverluste durch gelegentlich bittere Stangen vermeiden
möchten, sollten die beiden Sorten nur anbauen, wenn Bewässerung und
Temperatur-Regulierung durch Folieneinsatz möglich sind.
3.5.2 Thermostabilität von Spargelsaponinen
Zunächst wurden Saponinextrakte unterschiedlichen Wärmebehandlungen
zwischen 100°C und 140°C ausgesetzt, Bereiche, in denen bei verschiedenen
Verarbeitungsverfahren (Kochen, Trocknen) gearbeitet wird.
Aus der Literatur war bekannt, dass die einzelnen Saponine unterschiedlich auf
Erhitzung reagieren. So erwiesen sich Saponine aus Hafer (Avenacoside A und
B) über drei Stunden bei 100°C als stabil. Eine Temperaturerhöhung auf 140°C
brachte eine pH-abhängige Verringerung des Saponingehaltes von 12% (pH 7)
bis 50% (pH 4) (Önning and Asp, 1996). In einer anderen Arbeit wurden
verschiedene Saponinpräparate im Bereich zwischen 20°C und 500°C erhitzt.
Dabei wurde im Temperaturintervall zwischen 70°C und 130°C ein Verlust von 2
bis 9 % als Entzug von Wasser aus dem Molekül ermittelt. Danach blieben die
Substanzen bis 170°C stabil, bei höheren Temperaturen wurde die Glucose an C-
26 abgespalten und ein Spirostanol gebildet und ab 270°C wurde das Saponin
zerstört (Bobeyko and Kintia, 1996).
In den eigenen Untersuchungen lag der pH-Wert der Extrakte im Bereich von 7.
Der ermittelte Saponinverlust von ca. 10% bei der Erhitzung auf bis zu 15 Minuten
bei 140°C ist daher vergleichbar mit den Ergebnissen dieser beiden Studien. Die
anschließende weitere Verringerung des Saponingehaltes folgte aber offenbar
nicht dem von Bobeyko und Kintia beschriebenen Schema. In diesem Falle hätten
bei Abspaltung von Zuckereinheiten die Peaks der Saponine AS 1 und AS 2
kleiner und die von AS 3 bis AS 6 größer werden müssen und somit eine
Verschiebung innerhalb des "Fingerprints" auftreten müssen. Dies war nicht der
Fall, sondern ab 30 Minuten bei 140°C verringerte sich der Gehalt aller Saponine.
77
Die Ursachen dafür sind mit der Methode der DC nicht feststellbar. Dazu sollte in
weiteren Untersuchungen mit HPLC-MS Techniken gearbeitet werden, bei denen
mögliche Strukturveränderungen an den Molekülen erfasst werden können.
Im Vergleich zu den matrixfreien Proben wurden drei Spargelproben sowohl im
rohen als auch im gegarten Zustand verglichen. Dabei zeigte sich ein
Saponinverlust von ca. 30% in den zubereiteten Proben. Auch wenn der
Stichprobenumfang gering war, lässt sich dieses Ergebnis so interpretieren, dass
durch Auswaschen oder Wechselwirkungen mit anderen Substanzen aus der
Spargelmatrix möglicherweise mehr Saponine zerstört werden als beim Erhitzen
der reinen Substanzen. Eine mögliche Ursache liegt in der Aktivität
pflanzeneigener Glycosylhydrolasen, über deren Hitzebeständigkeit keine
Informationen vorliegen. Bekannt ist lediglich, dass Enzyme mit ähnlicher
Wirksamkeit aus unterschiedlichem Ausgangsmaterial in ihrer Thermostabilität
variieren (Bhatia et al., 2002).
Durch die Analyse gefriergelagerter Spargelproben konnte nachgewiesen werden,
dass in den ersten drei Lagermonaten kein Abbau der Saponine erfolgte. Dieses
Ergebnis ist konform zu einer Untersuchung an Sojasaponin ßg, für das bei einer
Lagerung bei –20°C über 15 Tage ebenfalls kein signifikanter Saponinverlust
dokumentiert ist (Hu et al., 2002). Andere vergleichbare Untersuchungen konnten
in der Literaturrecherche nicht gefunden werden.
Damit kann es als gesichert angesehen werden, dass eine Gefrierlagerung von
Spargel über mehrere Wochen keinen Einfluss auf den Saponingehalt hat. Das
Ergebnis ist nicht nur für die Praxis der Lebensmittelverarbeiter interessant,
sondern erleichtert auch die Versuchsplanung für künftige Analysen, weil
Probenahme und Laborkapazitäten besser koordiniert werden können.
3.5.3 Einfluss von Lagerung und Verpackung
Geernteter Spargel wird in der Regel entweder frisch zubereitet oder industriell zu
Steril- oder Gefrierkonserven verarbeitet. Als Zusatz zu Fertiggerichten wird er in
getrockneter Form verwendet. Zunehmend wird geschälter und in
Folienverpackungen über kurze Zeit gelagerter Spargel als Convenience-Produkt
78
im Handel angeboten. Daher war die Frage zu beantworten, ob thermische
Behandlungen oder Folienverpackung Einfluss auf den Saponingehalt haben.
Das Verhalten der Spargelsaponine bei der Verpackung geschälter
Spargelstangen in Foodtainern mit zwei verschiedenen Folienverpackungen über
vier Tage bei 8°C und über weitere sieben Stunden bei 20°C sollte an solchem
Convenience-Spargel überprüft werden. Die Ergebnisse des Versuches lassen
jedoch keine Aussagen zur Saponindynamik zu, da an zwei
Auslagerungsterminen eine Erhöhung des Saponingehaltes im Vergleich zum
Ausgangsmaterial festgestellt wurde. Die Untersuchungen sollten in der nächsten
Ernteperiode unter mikrobiologischer Kontrolle wiederholt werden.
Bei parallel durchgeführten Bestimmungen der Keimzahl hatten sich signifikante
Erhöhungen auf Endo-Agar für einige Proben ergeben. Bisher ist nicht bekannt,
ob in geerntetem Pflanzenmaterial noch eine Saponin-Synthese erfolgt. Ebenso
fehlen Informationen darüber, ob mikrobielle Aktivitäten Einfluss auf Saponine
haben. Bekannt ist jedoch, dass einige Mikroorganismen zu Transformationen an
den Molekülen von Steroiden führen (Madyastha, 1996).
Ausblick Die durchgeführten Untersuchungen an verschiedenen Spargelproben sollten in
einer weiteren Erntesaison validiert werden. Aus den bei der Durchführung und
Auswertung der Versuche gesammelten Erfahrungen sollten folgende
Spezifikationen vorgenommen werden:
Für den Gewächshausversuch (Versuch 1) sollten je Temperaturvariante
mindestens sechs Spargelpflanzen ausgewählt werden, von denen jeweils die
Proben entnommen werden.
Der Sortenversuch (Versuch 2) sollte so angelegt werden, dass jeweils eine längs
halbierte Stange sensorisch mit den Saponingehalten verglichen werden kann.
Der Verpackungsversuch (Versuch 3) sollte mit definiertem, sortenreinem
Probenmaterial wiederholt werden. Dabei sollte, wiederum durch längs Halbieren
der Stangen, Probenmaterial sowohl für die Saponinanalytik als auch für die
Keimzahlbestimmung gewonnen werden.
79
Der Versuch zur Ermittlung der Thermostabilität (Versuch 4) sollte in der gleichen
Anordnung wiederholt werden. Dabei wäre eine begleitende Untersuchung mittels
HPLC-MS für die Beschreibung möglicher Strukturveränderungen in den
Saponinmolekülen sehr aussagefähig.
Präparative Arbeiten sollten unter Einbeziehung weiterer Techniken wie Einsatz
beschichteter Membranen oder Flash-Chromatographie fortgesetzt werden, um
die Saponine zu identifizieren und größere Mengen davon für die
Charakterisierung ihrer Eigenschaften zu verwenden. Eine dieser Eigenschaften
sollte die Bitterkeit sein, da bisher nur ein Spargelsaponin als bitter beschrieben
worden ist.
Aus ernährungsphysiologischer Sicht erscheinen saponinreiche Lebensmittel
vorteilhaft, weil insbesondere in den letzten Jahren zahlreiche
Forschungsarbeiten gesundheitsfördernde Eigenschaften für diese Stoffgruppe
belegen konnten. Zu diesen Eigenschaften gehören u.a. die Senkung des Blut-
Cholesterinspiegels (Harris et al., 1997), (Amarowicz et al., 1994), eine mögliche
Krebsprävention (Chin et al., 2002), (Rao and Sung, 1995) sowie eine antivirale
Aktivität gegen den Herpes-Erreger HSV-1 (Ikeda et al., 2000). Die angeführten
Studien deuten also auf sehr unterschiedliche Anwendungsgebiete
saponinhaltiger Pflanzenauszüge hin.
Einige Veröffentlichungen einer indonesischen Forschergruppe bezüglich einer
möglichen Beeinflussung sexueller Dysfunktionen u.a. (Adimeolja, 2000)
erscheinen auf Grund mangelnder Darstellung des Versuchsaufbaus und der
statistischen Auswertung der Ergebnisse als wissenschaftlich fragwürdig.
Jedoch gibt es, im Gegensatz zu pharmazeutischen Präparaten, im
Lebensmittelbereich einige Probleme, die auf die Bitterkeit vieler Saponine
zurückzuführen sind und somit zu sensorischen Einschränkungen beim Verzehr
dieser Lebensmittel oder Zubereitungen führen.
Eine der Arbeiten, bei der die Struktur zweier Spargelsaponine aufgeklärt wurde,
hatte zum Ziel, die bitteren Komponenten aus Spargelabfällen zu entfernen, um
diese als Zusatz zu Getränken verwenden zu können (Kawano et al., 1977). Auch
80
bei anderen Nahrungspflanzen (z.B. Soja, Lupine) bereitet der bittere Geschmack
Qualitätsprobleme (Price and Fenwick, 1984), (Ruiz et al., 1996).
Ebenso scheint sich diese Eigenschaft der Saponine in dem beschriebenen
Auftreten bitterer Spargelstangen und somit in negativen
Verbraucherbewertungen niederzuschlagen. In einer Studie, bei der die
Ausprägung dieser Geschmackskomponente bei den beiden Sorten zu
verschiedenen Erntedaten und von verschiedenen Standorten bewertet wurde,
zeigte 'Grolim' häufiger höhere Werte. Die Ursachen dafür konnten nicht eindeutig
einem Kriterium zugeordnet werden. Vielmehr war zu vermuten, dass eine
bestimmte Kombination von Standort, Sorte und Umweltbedingungen für diese
sensorische Komponente ausschlaggebend war (Ziegler et al., 2002). Auch in
anderen sensorischen Bewertungen wurden ähnliche Tendenzen festgestellt
(Brückner, 2002b), (Paschold and Schöpplein, 2002). Bei diesen sensorischen
Beurteilungen ging es jedoch nicht um die Ermittlung der Verbraucherakzeptanz
sondern lediglich um die Ausprägung der Geschmackskomponente "bitter". Wie
stark diese Komponente ausgeprägt sein sollte, um einen typischen
Spargelgeschmack zu erhalten, muss in einem direkt mit der Saponinanalytik
gekoppelten Verbrauchertest untersucht werden. Dabei sollte untersucht werden,
ob ein Schwellenwert im Saponingehalt ermittelt werden kann, ab dem der
Geschmack des Spargels negativ bewertet wird. Der Versuch sollte so angelegt
sein, dass jeweils eine längs halbierte Stange für die Sensorik und die andere
Hälfte für die Analytik verwendet wird.
Spargel, der auf Grund zu hoher Bitterkeit für den Handel nicht geeignet ist, stellt
eine gute Quelle für die Gewinnung von Saponinen als Rohstoff dar. Die
Ergebnisse dieser Arbeit dienen als Grundlage für die Entwicklung eines
Verfahrens zur Aufbereitung von Spargelabfällen. Von diesen Abfällen entstehen
nach einer Schätzung in Deutschland ca. 25.000 Tonnen aus Spargelabschnitten
und nicht verkaufsfähigem Spargel. Als Anwendungsgebiete für die aus Spargel
gewonnenen Saponine wäre ein Zusatz zu funktionellen Lebensmitteln, als
Nutraceuticals oder als Pflanzenschutzmittel denkbar.
81
Unter funktionellen Lebensmitteln können nach einer von der EU geförderten
Studie solche Lebensmittel verstanden werden, die über die Effekte einer
adäquaten Ernährung hinaus zur Verbesserung der Gesundheit und des
Wohlbefinden und/oder zu einer Verringerung eines Krankheitsrisikos beitragen.
Als Nutraceuticals (Nutrition=Ernährung, Pharmaceutical=Medikament) werden
Präparate bezeichnet, die als Tabletten, Kapseln, Pulver oder Ampullen isolierte,
teilweise chemisch reine Lebensmittelinhaltsstoffe in hochdosierter Form
enthalten (Rechkemmer, 2001).
Für diese Anwendungen wären insbesondere die Senkung des
Cholesterinspiegels und eine mögliche Krebsprävention interessant. Das
Interesse an dem auch im Spargel vorkommenden Methyl-Protodioscin (in dieser
Arbeit vermutlich AS 2) zeigt ein im Mai diesen Jahres erschienener Artikel über
die erstmalige Synthese dieses Saponins (Cheng et al., 2003) durch eine
Forschergruppe, die vorher bereits Untersuchungen mit diesem Saponin an Linien
von 60 Krebszellen vorgenommen hatte. Allerdings wird in einer anderen, kürzlich
erschienen Publikation dargestellt, dass das Methyl-Protodioscin lediglich ein
Nebenprodukt des Protodioscins ist, das beim Extrahieren mit Methanol entsteht
(Wang et al., 2003). Ob sich die komplizierte Synthese im Vergleich zur
Gewinnung der Substanz aus pflanzlichen Rohstoffen als ökonomisch und
qualitativ überlegen erweisen wird, werden erst weitere Forschungen belegen
können. Immerhin enthält eine Tonne Spargel ca. 300 bis 500 g Gesamtsaponin.
Es ist jedoch anzumerken, dass für alkoholische Auszüge, wie sie beispielsweise
in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden, für diese Ausbeute erhebliche
Mengen Alkohol eingesetzt werden müssten. Daher ist die Suche nach
geeigneten Verfahren in Kombination aus chemischen und physikalischen
Schritten, wie z. B. Umkehrosmose und modifizierte Membrantechniken der
Schwerpunkt für die Gewinnung der Saponine aus dem Pflanzenmaterial.
Ähnliche Anforderungen bestehen auch, wenn Spargelsaponine für
Pflanzenschutzmittel auf biologischer Basis gewonnen werden sollen. Wobei in
diesem Fall vermutlich ein geringerer Reinheitsgrad erforderlich wäre.
Die vielfach nachgewiesene fungizide Aktivität der Saponine, insbesondere der
Spirostanolformen, macht einen Einsatz gegen bestimmte Pilzerkrankungen an
82
Kulturpflanzen denkbar. Jedoch sollten dazu die Wechselwirkungen zwischen
dem Pathogen und dem jeweiligen Saponin untersucht werden. Für die Infektion
von Tomatenpflanzen wurde ein Mechanismus der "Entgiftung" des
Alkaloidsaponins α-Tomatin durch den Pilz Septoria lycopersici durch das Enzym
Tomatinase beschrieben, was als Resistenzbildung interpretiert wurde (Bouarab
et al., 2002).
In einer Versuchsreihe sollte getestet werden, ob die aufgereinigten
Saponinextrakte auf bekannte Pflanzenpathogene wie Fusarium und Rhizoctonia
wachstumshemmende Effekte haben.
Sollten sich solche Eigenschaften bestätigen, könnte mit einem geeigneten
Verfahren aus den in großen Mengen anfallenden Spargelabfällen ein
biologisches Pflanzenschutzmittel gewonnen werden.
83
4 Zusammenfassung
Spargel gehört in Deutschland nicht nur wegen seiner kulinarischen und
ökonomischen Bedeutung zu den wichtigsten Gemüsearten, sondern er tritt auch
zunehmend in das wissenschaftliche Interesse wegen seiner
gesundheitsfördernden Eigenschaften.
In der vorliegenden Arbeit sollte der Saponingehalt von in Deutschland
angebautem Spargel bestimmt werden. Dabei sollte auch betrachtet werden,
welche Faktoren vor und nach der Ernte Einfluss auf diese Gehalte haben.
Nach der Erarbeitung einer Methode für die Extraktion und Analytik konnten an
Probenmaterial aus definierten Anbaubedingungen Gesamtsaponingehalte
zwischen ca. 14 mg bis 80 mg in 100 g Frischmasse ermittelt werden.
Dabei zeigten sich eindeutig sortenabhängige Unterschiede. So hatte von sechs
untersuchten Sorten 'Grolim' die höchsten Gehalte während die Sorte 'Huchels
Alpha' die niedrigsten Werte aufwies. Die anderen vier Sorten unterschieden sich
nur unwesentlich voneinander.
Im Vergleich zu sensorischen Bewertungen konnten Parallelen zwischen dem
Saponingehalt und der Ausprägung der bitteren Komponente gefunden werden.
Innerhalb der Sorten zeigte sich aber auch eine unterschiedliche Reaktion auf
solche Faktoren wie Bodentemperatur sowie möglicherweise Bodenfeuchte und
pflanzenspezifische Aspekte, wie z.B. einem Befall mit Pathogenen.
Wie sich Nacherntebehandlungen wie Erhitzen oder Einfrieren auf die
Saponingehalte auswirken, wurde ebenfalls getestet. So zeigten Saponine aus
Spargelextrakten bei Erhitzung auf 100°C bis zu 60 Minuten und beim
Autoklavieren (121°C) über 15 Minuten Gehaltsabnahmen von 10% während eine
Erhitzung auf 140°C über 30 Minuten zu Verlusten bis zu 31,3% führten.
Spargelproben, die bei –38°C eingefroren und bei –18°C gelagert wurden, wiesen
nach acht und 12 Wochen Lagerung keine Saponinverluste auf.
Bezüglich der einzelnen Saponine konnte festgestellt werden, dass bis zu sechs
Saponine in den Proben nachgewiesen werden konnten, aber drei davon bis zu
90% des Saponingehaltes bestimmten. Die Identität dieser Saponine konnte nicht
gänzlich aufgeklärt werden, dazu sind weitere massenspektrometrische und
84
Methoden der NMR erforderlich. Mit großer Sicherheit entsprechen die
Spargelsaponine, die in dieser Arbeit als AS 1 und AS 2 bezeichnet wurden, dem
auch schon aus anderen Pflanzen bekannten Protodioscin und Methyl-
Protodioscin.
In Fortführung der Arbeiten sollten durch Präparation ausreichende Mengen der
Einzelsaponine gewonnen werden, um mit strukturaufklärenden Methoden die
Identität der Saponine zu bestimmen und vergleichende Beschreibungen der
Eigenschaften vorzunehmen.
Die Aufbereitung von Spargelabfällen zur Gewinnung von Reinsubstanzen
erscheint vor dem Hintergrund, dass in Deutschland pro Erntesaison ca. 25.000
Tonnen dieser Abfälle entstehen, als durchaus sinnvoll. Für den Einsatz solcher
aufgereinigten Saponine sind verschiedene Anwendungsgebiete denkbar. Dazu
gehören funktionelle Lebensmittel, Nutraceuticals und biologische
Pflanzenschutzmittel. Jedoch müssen für den Test der Eignung der Saponine für
solche Anwendungen mit geeigneten präparativen Verfahren ausreichende
Mengen dieser Substanzen gewonnen werden.
85
5 Summary
In Germany, White Asparagus (Asparagus officinalis) is a popular vegetable with
pleasant flavour and economic significance. In addition scientists pay more and
more attention to its health promoting properties.
One of the main topics of this work was to estimate the quantity of saponins in
asparagus shoots grown in Germany with respect to different cultivars as well as
pre and post harvest treatments.
A method was developed to prepare samples by Solid Phase Extraction (SPE)
and to analyse these extracts by High Performance Thin Layer Chromatography
(HPTLC). With this method contents of total saponins of approximately 14 mg to
80 mg per 100 g fresh weight were calculated. Significant differences depending
on cultivars and soil temperatures were found. Among six cultivars grown under
defined conditions 'Grolim' showed the highest levels of saponins whilst 'Huchels
Alpha' had the lowest contents. The other four cultivars showed intermediate
levels.
Low soil temperature, and consequently reduced growth rate, influenced the
Saponin content of 'Grolim' significantly. But other pre harvest conditions like low
soil moisture or infections of pathogens may also have effected the levels.
Saponins are considered as being bitter substances, though it is known that there
are differences in their perceived bitter intensity. With regard to sensory
evaluation, a positive correlation between higher saponin content and bitter taste
was found.
Asparagus shoots, frozen at –38°C and stored at –18°C, showed no loss of
saponins after eight and 12 weeks. Whereas heating at 100°C up to 60 minutes,
at 121°C for 15 minutes and 140°C for 15 minutes of extracted asparagus
saponins showed 10 % reduction. Heating at 140 °C for more than 30 minutes
reduced the saponins by 31,3%.
In extracted samples up to six saponins were found, but three of them were the
main components with approximately 90% of the total content.
86
Mass spectrometry characterized the two saponins (AS 1 and AS 2) being known
as Protodioscin and Methyl-Protodioscin which had been analysed in plants of
Dioscoreaceae species. Special techniques like NMR are required to identify
accurately all asparagus saponins.
Furthermore, the preparation of higher quantities of these compounds is
necessary to test the bitter taste and to estimate biological properties, such as
antifungal, cytotoxic and cholesterol lowering activities.
In Germany, every season about 25.000 t of broken asparagus sprouts, bottom
cuts and other unmarketable parts are disposed and mainly biologically
degradated.
But this waste product could be a rich source of saponins as additive to functional
food, nutraceuticals or natural pesticides.
87
6 Literaturverzeichnis
Adimeolja A (2000) Phytochemicals and the breakthrough of traditional herbs in the management
of sexualdysfunctions. Int J of andrology 23: 82-84.
Amarowicz R, Shimoyamada M and Okubo K (1994) Hypocholesterolemic effects of saponins.
Roczn Pzh 125-130.
Anonymus (1999) Verordnung zur Festsetzung der Vermarktungsnorm für Spargel. Amtsblatt der
Europäischen Gemeinschaften.
Anonymus (2002) SPE Application guide. Merck.
Behr H-C (2002) ZMP-Marktbilanz Gemüse 2002. Verlag ZMP Zentrale Markt- und
Preisberichtsstelle GmbH, Bonn.
Beyer G (2002) persönliche Mitteilung.
Bhatia Y, Mishra S and Bisaria VS (2002) Microbial beta-glucosidases: Cloning, properties and
application. Critical Reviews in Biotechnology 22: 375-407.
Bobeyko VA and Kintia PK (1996) Thermal Behavior of Steroidal Glycosides. In: Waller GR and
Yamasaki K (eds) Saponins used in Food and Agriculture, pp 271-280.
Bogacheva Ng, Kiselev VP and Kogan LM (1976) Isolation of 3,26-Bisglycoside of Yamogenin
from Trigonella Foenum-graecum. Khimiya Prirodnyk Soedinenii 2: 268-269.
Bouarab K, Melton R, Peart J, Baulcombe D and Osbourn A (2002) A saponin-detoxifying enzyme
mediates suppression of plant defences. Nature 418: 889-892.
Böttcher H (1996) Frischhaltung und Lagerung von Gemüse. Verlag Eugen Ulmer, Stuttgart.
Brückner B (2002a) unveröffentlicht.
Brückner B (2002b) Sortenversuch Spargel, sensorische Ergebnisse 2002. Brandenburgisches
Spargelseminar, Seddin.
88
Cheeke PR (1996) Biological Effects of Feed and Forage Saponins and Their Impacts on Animal
Production. In: Waller GR and Yamasaki K (eds) Saponins used in Food and Agriculture,
pp 377-386.
Cheng MS, Wang QL, Tian Q, Song HY, Liu YX, Li Q, Xu X, Miao HD, Yao XS and Yang Z (2003)
Total Synthesis of Methyl Protodioscin: A Potent Agent with Antitumor Activity. Journal of
Organic Chemistry 68: 3658-3662.
Chin C-K, Garrison StA, Shao Y, Wang M and Simon J (2002) Functional Elementss from
Asparagus for Humen Health. Proceedings of the 10th International Asparagus
Symposium, pp 233-236.
Debella A, Haslinger E, Kunert O, Michl G and Abebe D (1999) Steroidal saponins from
Asparagus africanus. Phytochemistry 51: 1069-1075.
Fenwick DE and Oakenfull D (1983) Saponin content of food plants and some prepared foods. J
Sci Food Agric 34: 196-191.
Fischer-Klüver G (2003) Straelener Spargeltag. Gemüse 6: 25-27.
Francis G, Kerem Z, Makkar HPS and Becker K (2002) The biological action of saponins in animal
systems: a rewiew. British Journal of Nutrition ��: 587-605.
Frey HP and Zieloff K (1992) Qualitative und quantitative Dünnschichtchromatographie. VCH
Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim - New York - Basel.
Goryanu GM and Kintya PK (1976) The Structure of Asparagosides D and G. Journal Khimiya
Prirodnykh Soedinenii XVII: 762-765.
Goryanu GM and Kintya PK (1977) Steroid Glycosides from Asparagus officinalis Asparagosides F
and H. Journal Khimiya Prirodnykh Soedinenii 6: 810-813.
Goryanu GM, Krokhmalyuk VV and Kintya P (1976a) Structure of the Glycosides of Asparagus
officinalis. Khimiya Prirodnyk Soedinenii 3: 400-401.
Goryanu GM, Krokhmalyuk VV and Kintya PK (1976b) The structure of Asparagosides A and B.
Khimiya Prirodnyk Soedinenii 3: 401-402.
89
Goryanu GM, Krokhmalyuk VV and Kintya PK (1976c) The structure of Asparagosides C and E.
Khimiya Prirodnyk Soedinenii 6: 743-744.
Goryanu GM, Krokhmalyuk VV and Kintya PK (1976d) The structure of Asparagosides C and E.
Khimiya Prirodnyk Soedinenii.
Göschke F (1874) Die rationelle Spargelzucht. Verlag von Schotte & Voigt, Berlin.
Hahn-Deinstrop E (1997) Dünnschicht-Chromatographie, Praktische Durchführung und
Fehlervermeidung. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim.
Harris WS, Dujovne CA, Windsor SL, Colle Gerrond LL, Newton FA and Gelfand RA (1997)
Inhibiting Cholesterol Absorption with CP-88,818 (b-Tigogenin Cellobiose; Tiqueside):
Studies in Normal and Hyperlipidemic Subjects. J of Cardiovascular Pharmacology 55-60.
Herrmann K (1992) Vorkommen, Gehalte und Bedeutung der Inhaltsstoffe des Obstes und
Gemüses, VII Bitterstoffe. Die industrielle Obst- und Gemüseverwertung 95: 170-175.
Herrmann K (1996) Inhaltsstoffe des Spargels. Die industrielle Obst- und Gemüseverwertung 8:
250-256.
Hetz E and Schulze J (2000) Spargel (Asparagus officinalis). Landesanstalt für Gartenbau.
Hiller K (2002) persönliche Mitteilung.
Hostettmann K and Marston A (1995) Saponins. Cambridge University Press, 544 pp.
Hoyer GA, Sucrow W and Winkler D (1975) Diosgenin Saponins from Dioscorea floribunda.
Phytochemistry 14: 539-542.
Hu J, Lee S-O, Hendrich S and Murphy PA (2002) Quantification of the Group B Soyasaponins by
High-performance Liquid Chromatography. J Agric Food Chem 50: 2587-2594.
Ikeda T, Ando J, Miyazono A, Zhu X-H, Tsumagari H, Nohara T, Yokomizo K and Uyeda M (2000)
Anti-herpes Virus Activity of Solanum Steroidal Glycosides. Biol Pharm Bull 23: 363-364.
Jork H, Funk W, Fischer W and Wimmer H (1993) Dünnschicht-Chromatographie, Reagenzien
und Nachweismethoden. VCH Verlagsgesellschaft Weinheim.
90
Kawano K, Sakai K, Sato A and Sakamura S (1975) A Bitter Principle of Asparagus: Isolation and
Structure of Furostanol Saponin in Asparagus Storage Root. Agric Biol Chem 39: 1999-
2002.
Kawano K, Sato H and Sakamura S (1977) Isolation and Structure of Furostanol Saponin in
Asparagus Edible Shoots. Agric Biol Chem 41: 1-8.
Kennelly EJ, Suttisri R and Kinghorn AD (1996) Novel Sweet-Tasting Saponins of the Cycloartane,
Oleanane, Secodammarane, and Steroidal Types. In: Waller GR and Yamasaki K (eds)
Saponins used in Food and Agriculture, pp 13-24.
Khaliq-uz-Zaman SM, Shameel S and Ahmad VU (1998) Saponins from the Genus Asparagus.
Jour Chem Soc Pak 20 (4): 299-306.
Kiyosawa S and Hutoh M (1968) Detection of Proto-type Compounds of Diosgenin- and Other
Spirostanol-Glycosides. Chem Pharm Bull 16: 1162-1164.
Kofler L (1927) Die Saponine. Verlag von Julius Springer Wien.
Lasztity R, Hidvegi M and Bata A (1998) Saponins in Food. Food Rev Int 14: 371-390.
Ma XQ, Shi Q, Duan JA, Dong TTX and Tsim KWK (2002) Chemical analysis of Radix Astragali
(Huangqi) in China: A comparison with its adulterants and seasonal variations. J Agric
Food Chem 50: 4861-4866.
Madyastha KM (1996) Novel Microbial Transformations of Steroids. In: Waller GR and Yamasaki K
(eds) Saponins used in Food and Agriculture, pp 259-270.
Mahato SB, Ganguly AN and Sahu NP (1982) Steriod saponins - a review. Phytochemistry 21:
959-978.
Milgate J and Roberts DCK (1995) The Nutritional and Biological Significance of Saponins.
Nutrition Researche 15: 1223-1249.
Morrissey JP and Osbourn AE (1999) Fungal Resistance to Plant Antibiotics as a Mechanism of
Pathogenesis. Microbiology and Molecular Biology Reviews 63: 708-724.
91
Ndamba J, Lemmich E and Molgaard P (1994) Release of Molluscidal Saponins from Phytolacca
dodecandara Aqueous Berry Extracts as Influenced by the Male Plant and Extraction
procedure. Biochemical Systematics an Ecology 22: 249-257.
Newman HAI, Kummerow FA and Scott HM (1996) Dietary Saponin, a Factor Which May Reduce
Liver and Serum Cholesterol Levels. Poultry Science 37: 42-46.
Niesel St (1992) Untersuchungen zum Freisetzungsverhalten und zur Stabilität ausgewählter
wertbestimmender Pflanzeninhaltsstoffe unter besonderer Berücksichtigung moderner
phytochemischeer Analysenverfahen. Dissertation 124-153.
Oakenfull D (1981) Saponins in food a review. Food Chemistry 6: 19-40.
Önning G and Asp N-G (1996) Analysis, Heat Stability and Physiological Effects of Saponins from
Oats. In: Waller GR and Yamasaki K (eds) Saponins used in Food and Agriculture, pp
365-376.
Pachaly. DC-Atlas. DC in der Apotheke[1-3]. 1995. Stuttgart, Wissenschaftliche
Verlagsgesellschaft mbH.: Catalog
Paschold P-J and Schöpplein E (2002) Spargelgeschmack der Sorten 'Grolim' und 'Gijnlim'.
Gemüse 3: 29-30.
Plock A (2002) Untersuchungen zur leishmaniziden Wirksamkeit von pflanzlichen Extrakten bzw.
Naturstoffen unter besonderer Berücksichtigung der Saponine aus Yucca filamentosa L.
Berlin Dissertation.
Price KR and Fenwick GR (1984) Soyasaponin I, a Compound Possessing Undesirable Taste
Characteristics Isolated from Dried Pea (Pisum sativum. L.). J Sci Food Agric 35: 887-892.
Price KR, Johnson IT and Fenwick GR (1987) The Chemistry and Biological Significance of
Saponins in Foods and Feeding stuffs. Food Sciences and Nutrition 26.
Rao AV and Sung M-K (1995) Saponins as Anticarcinogens. American Institute of Nutrition 717S-
724S.
Rechkemmer G (2001) Functional Food. Der Lebensmittelbrief 7: 180-182.
92
Ridout CL, Price KR, Parkin G, Dijoux MG and Lavaud C (1994) Saponins from Sugar Beet and
the Floc Problem. J Sci Food Agric 42: 279-282.
Ruiz RG, Price KR, Arthur AE, Petterson DS and Fenwick GR (2001a) Variation in the Saponin
Content of Different Varieties of Australian-grown Lupin. Agri-Food Quality 106-110.
Ruiz RG, Price KR, Rose ME, Rhodes M and Fenwick GR (1996) A Preliminary Study on the
Effect of Germination on Saponin Content and Composition of Lentils and Chickpeas. Z
Lebensm Unters Forsch 203: 366-369.
Ruiz RG, Rose ME, Price KR and Fenwick GR (2001b) Effect of Variety, Seed Character and
Agronomy on Saponin Content in Lupin and Lentil Seed. pp 386-390.
Sandvoss M, Weltring A, Preiss A, Levsen K and Wuensch G (2001) Combination of matrix solid-
phase dispersion extraction and direct on-line liquid chromatography-nuclear magnetic
resonance spectroscopy-tandem mass spectrometry as a new efficient approach for the
rapid screening of natural products: Application to the total asterosaponin fraction of the
starfish Asterias rubens. Journal of Chromatography A 917: 75-86.
Sati OP, Pant G and Hostettmann K (1984) Potent Molluscicides from Asparagus. Pharmazie 39:
581.
Scheer Ch (2002) Spargelqualität im Produktions- und Aufbereitungsprozess. Berlin Dissertation.
Schmidt St (2003) unveröffentlicht.
Schmittmann T (1993) Inhaltsstoffe von Vernonia amygdalina und Ilex brevicuspis - Aufklärung
durch NMR-Spektroskopie. Bonn Dissertation.
Shao Y, Chin C-K, Ho C-T, Ma W, Garrison StA and Huang M-T (1996) Anti-tumor activity of the
crude saponins obtained from asparagus. Cancer Letters 104: 31-36.
Shao Y, Poobrasert O, Kennelly EJ, Chin C-K, Ho C-T, Huang M-T and Garrison StA (1997)
Steroidal Saponins from Asparagus officinalis and Their Cytotoxic Activity. Planta medica
63: 258-262.
Shimoyamada M, Suzuki M, Maruyama M and Watanabe K (1996) An Antifungal Saponin from
White Asparagus (Asparagus officinalis L) Bottoms. J Sci Food Agric 72: 430-434.
93
Shimoyamada M, Suzuki M, Sonta H, Maruyama M and Okubo K (1990) Antifungal Activity of the
Saponin Fraction Obtained from Asparagus officinalis L. and Its Active Principle. Agric Biol
Chem 54: 2553-2557.
Souci SW, Fachmann W and Kraut H (2001) Die Zusammensetzung der Lebensmittel-
Nährwerttabellen. medpharm-Scientific Publishers Stuttgart, 703 pp.
Takeda K (1972) The Steroidal Sapogenins of the Dioscoreaceae. In: Reinhold L (ed) pp 287-333.
Verlag Wiley and Sons.
Taylor WG, Zulyniak HJ, Richards KW, Acharya SN, Bittman S and Elder JL (2002) Variation in
diosgenin levels among 10 accessions of fenugreek seeds produced in western Canada. J
Agric Food Chem 50: 5994-5997.
Tschesche R, Lüdke G and Wulff G (1969) Sarsaparillosid, ein bisdesmosidisches 22-Hydroxy-
furostanol-Saponin. Chem Ber 102: 1253-1269.
Tschesche R and Wulff G (1973) Biologie und Chemie der Saponine. In: Herz W, Grisebach H
and Kirby GW (eds) Fortschritte in der Chemie organischer Naturstoffe, pp 462-668.
Springer-Verlag.
Wang M, Tadmor Y, Wu Q-L, Chin C-K, Garrison StA and Simon JA (2003) Quantification of
Protodioscin and Rutin in Asparagus Shoots by LC/MS and HPLC Methods. J Agric Food
Chem 51: 6132-6136.
Watzl B and Leitzmann C (1999) Bioaktive Substanzen in Lebensmitteln. Hippokrates-Verlag.
Ziegler J (2002) Bleichspargelanbau. Neustadter Hefte 101: 20-21.
Ziegler J, Mulder JH and Lavrijsen P (2002) Einfluss von Anbaubedingungen und Sorte auf den
Spargelgeschmack. Gemüse 5: 41-43.
94
7 Anhang
Sortiernormen für weißen, langen Spargel
Gemäß der Verordnung Nr. 2377/1999 vom 9. November 1999 der Kommission
der Europäischen Gemeinschaften zur Festsetzung der Vermarktungsnorm für
Spargel wurden die einzelnen Spargelstangen entsprechend der Vorgaben für
weißen Spargel bonitiert (Anonymus, 1999). Folgende Mindesteigenschaften
mussten erfüllt sein:
-ganz,
-gesund; ausgeschlossen sind Erzeugnisse mit Fäulnisbefall oder anderen
Mängeln, die sie zum Verzehr ungeeignet machen,
-frei von Schäden, die durch unsachgemäßes Waschen hervorgerufen wurden
(die Spargelstangen dürfen gewaschen, aber nicht gewässert sein),
-sauber; praktisch frei von sichtbaren Fremdstoffen,
-von frischem Aussehen und Geruch,
-praktisch frei von Schädlingen,
-praktisch frei von Schäden durch Schädlinge,
-praktisch frei von Quetschungen und Druckstellen,
-frei von anomaler äußerer Feuchtigkeit, d.h. nach etwaigem Waschen bzw.
Kühlen mit kaltem Wasser wieder ausreichend getrocknet,
-frei von fremden Geruch und/oder Geschmack
Die Schnittflächen am unteren Ende mussten möglichst glatt sein und sich im
rechten Winkel zur Längsachse der Spargelstange befinden. Die Spargelstangen
durften nicht hohl, gespalten, abgeschält oder gebrochen sein. Kleine, nach dem
Stechen entstandene Risse waren jedoch zulässig, sofern die Gütetoleranzen und
Grenzwerte nicht überschritten wurden.
Seit 1997 wenden alle deutschen Erzeugerorganisationen schärfere
Sortierungsvorschriften an, als in der EU-Vermarktungsnorm festgelegt ist. Die
Einteilung von weißem, langen Spargel (über 17 cm Länge) in Klassen erfolgt
nach dem Durchmesser der Spargelstangen in der Stangenmitte entsprechend
95
der von der Bundesvereinigung der Erzeugerorganisationen Obst und Gemüse
verfassten Sortierungsvorschrift.
Für die Mindestdurchmesser von weißem, langem Spargel und die
Größensortierung gilt folgendes:
Klasse Mindestdurchmesser Größensortierung Extra 16 mm 16 – 26 mm,
16 mm und mehr mit einer Abweichung von höchstens 8 mm in einem Packstück/Bündel
I 14 mm 14 – 18 mm, 14 mm und mehr mit einer Abweichung von höchstens 10
mm in einem Packstück/Bündel II 14 mm 14 mm und mehr
Besondere Merkmale von weißem, langen Spargel
Aus:(Scheer, 2002)
Klasse Besondere Merkmale zulässig Extra Gerade, gesunde Stangen, Köpfe weiß
und geschlossen, nicht hohl, nicht holzig Nach dem Stechen eingetretener rötlicher
Anlauf der Stangen und leichter, durch Schälen entfernbarer Rost
I Gerade, gesunde Stangen, Köpfe weiß und geschlossen, nicht hohl, nicht holzig
Nach dem Stechen eingetretener rötlicher Anlauf der Stangen
II Stangen gut gewachsen, jedoch auch leicht gebogen, nicht hohl und nicht
gespalten
Stangen mit nicht so fest geschlossenen Köpfen, die eine Färbung haben, jedoch
nicht grün sein dürfen, leichter durch Schälen entfernbarer Rost, leicht holzig
96
Garvorschrift für weißen Spargel
Die geschälten Spargelstangen wurden in vier gleiche Abschnitte geteilt.
Zur Vorbereitung einer Serie wurde ein 5,0 l AMC-Topf mit Siebeinsatz mit 100 ml
Leistungswasser gefüllt und auf eine elektrische Kochplatte gestellt. Zunächst
wurde mit Stufe 0,5 (von 3) angewärmt. Anschließend wurde auf Stufe 3 erhitzt
bis der Zeiger des Deckels kurz vor dem roten Sektor war. Zur Konditionierung
wurde der Topf vom Herd genommen, das Wasser verworfen und die Platte
wieder auf 0,5 gestellt.
Für den eigentlichen Kochzyklus wurde der warme Topf wieder mit
Leitungswasser gefüllt und die Spargelabschnitte wurden gleichmäßig auf dem
Siebeinsatz verteilt. Mit geschlossenem Deckel und Heizstufe 3 wurde gewartet
bis die Deckelanzeige kurz vor dem roten Bereich war (leichtes Dampfen
sichtbar). Auf Stufe 0,5 wurde der Spargel exakt 10 Minuten gegart. Danach
wurde der Topf vom Herd genommen und fünf Minuten stehen gelassen. Das
Sieb mit dem Spargel wurde herausgenommen und drei Mal jeweils ca. eine
Sekunde in ein Becken mit kaltem Leitungswasser getaucht. Nach dem Abtropfen
wurde mit der Extraktion begonnen (Brückner, 2002a).
97
Abbildung A-1: Veränderung der Merkmalsausprägungen im Sortenversuch
zwischen den Erntedaten 31.5. und 13.6. (Brückner, 2002b)
98
Abbildung A-2: Ergebnisse und Densitogramme der Validierung des CD 60 durch
12-maliges Messen einer Bahn mit dem Standard 0,75 µg
99
Abbildung A-3: CD 60-Methode für gefriergelagerten Spargel
100
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dietrich Knorr für die Überlassung des
interessanten Themas und die Betreuung, Beratung und Unterstützung bei der
Anfertigung dieser Arbeit.
Frau Dr. Monika Schreiner danke ich sowohl für die fachliche und
organisatorische Unterstützung bei der Bearbeitung des Themas als auch für die
zahlreichen Anregungen, die zum Gelingen dieser Arbeit beitrugen.
Allen beteiligten Mitarbeitern des Instituts für Gemüse und Zierpflanzenbau
Großbeeren/Erfurt e. V., insbesondere Frau Andrea Maikath, danke ich für die
Unterstützung bei der Durchführung der praktischen Arbeiten. Bei Herrn Dr.
Bernhard Brückner und Frau Dr. Stefanie Schmidt bedanke ich mich für die
Unterstützung bei der Bereitstellung des Probenmaterials sowie bei Frau Dr.
Angelika Krumbein für die Möglichkeit zur Aufnahme von Massenspektren.
Des weiteren gilt mein Dank den beiden Buchautorinnen Frau Elke Hahn-
Deinstrop und Frau Dr. Angelika Koch für die vielen praktischen Hinweise zu allen
Fragen der Dünnschicht-Chromatographie sowie Herrn Dr. Ernst Roemer vom
Hans Knöll Institut Jena, der mir bei der Einarbeitung in die Analyseverfahren
behilflich war und in zahlreichen Diskussionen beratend zur Seite stand.
Die vorliegenden Untersuchungen wurden aus Mitteln des Instituts für Gemüse
und Zierpflanzenbau Großbeeren/Erfurt e. V. ermöglicht. Auch dafür möchte ich
mich bedanken.
