Versuch 3: Enzymologie - uni-koeln.de · Enzymologie 3-1 2017 Zentrum Biochemie Versuch 3: Enzymologie Bitte einen eigenen Laptop für die Auswertung mitbringen, da im Computerraum

Enzymologie 3-1

2017 Zentrum Biochemie

Versuch 3: Enzymologie

Bitte einen eigenen Laptop für die Auswertung mitbringen, da im Computerraum nur eine begrenzte Anzahl an Computern vorhanden ist.

Versuche: 1. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase Aktivität

- Acetylcholinesterase-Bestimmung im Serum

- Hemmung des Enzyms mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)

- Reaktivierung mit Pyridin-2-Aldoxim-Methyljodid (PAM)

2. Enzymkinetik der Laktatdehydrogenase

- Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration

- Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substrat (Pyruvat-) Konzentration

- Zeichnen des Michaelis Menten Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung

- Ermittelung von KM und vmax, Vergleich der ermittelten Werte aus dem Michaelis-Menten-Plot

und der Lineweaver-Burk-Darstellung

Wissensgebiete

Einteilung der Enzyme in Enzymklassen

Aktivierungsenergie einer Reaktion

Einfluss von Katalysatoren auf die Aktivierungsenergie

Reaktionen 0. und 1. Ordnung

Reaktionsgeschwindigkeit

Enzymatische Reaktionen

Enzymsubstrat-Komplex

Substratspezifität

Substrat- und Enzymkonzentrations-Diagramme

Hemmsubstanzen, Mechanismus der Hemmung

Kompetitive und nicht kompetitive Hemmung, Beispiele

Quantitative Bestimmung der enzymatischen Aktivität

Einheit der Enzymaktivität: Katal (neu), Units (alt)

Lineweaver-Burk-Diagramme

Km-Bestimmung

Wechselzahl

pH- und Temperatur-Einfluss auf enzymatische Reaktionen

Isoenzyme

Multienzym-Komplexe und multifunktionelle Enzyme

Regulation der Enzymaktivität, Allosterie, negative Rückkopplung, Beispiele

Neurotransmitter, Beispiele

Acetylcholinesterase, Inhibitoren und Enthemmer

Optische Eigenschaften sowie Coenzymfunktionen von NAD+, NADP+ und FAD

Optischer Test

Kombinierter optischer Test (Kofaktor-gekoppelte Reaktion)

Enzymologie 3-2


Einführung

Bei reversiblen chemischen Reaktionen stellt sich ein Gleichgewicht ein. Im Gleichgewichtszustand ist

die Geschwindigkeit von Hin- und Rückreaktion gleich schnell. Katalysatoren erhöhen nur die Ge-

schwindigkeit der Reaktion und beschleunigen damit die Gleichgewichtseinstellung; sie beeinflussen

aber nicht die Lage des Gleichgewichts. Enzyme sind in der Regel Proteine, die als Katalysatoren

fungieren.

Die International Union of Biochemistry and Molecular Biology hat 1961 und 1964 Regeln für die

Nomenklatur der Enzyme aufgestellt. Die Enzyme werden in sechs Hauptklassen eingeteilt, die jeweils

gleiche chemische Reaktionstypen katalysieren.

1. Oxidoreduktasen

übertragen Wasserstoff zwischen zwei Reaktionspartnern. Zu ihnen gehören die Dehydro-

genasen, Hydroxylasen und Oxigenasen.

2. Transferasen

katalysieren die Übertragung von Atomgruppen oder ganzen Molekülen zwischen zwei

Reaktionspartnern. Untergruppen dieser Klasse sind die "Kinasen": Carboxyl-Transferasen,

Amino-Transferasen, Glycosyl-Transferasen und Acyl-Transferasen.

3. Hydrolasen

sind Ester-, Peptid- und Glycosylbindungen spaltenden Enzyme. Bekannte Enzyme wie Pep-

sin, Chymotrypsin, Trypsin, Renin und Papain gehören dazu.

4. Lyasen

katalysieren die nichthydrolytische Spaltung kovalenter Bindungen: Decarboxylasen, Aldola-

sen, Dehydratasen.

5. Isomerasen

epimerisieren ein optisch aktives C-Atom oder racemisieren optisch aktive Verbindungen.

6. Ligasen

führen zur Verknüpfung zweier Substratmoleküle unter gleichzeitiger Spaltung von ATP in

AMP und Pyrophosphat. Wichtige Vertreter dieser Gruppe sind die Synthetasen, z.B. Amino-

acyl-tRNS-Synthetasen, Acyl-CoA-Synthetasen oder auch die Carboxylasen.

Die in Braunschweig angesiedelte Enzymdatenbank Brenda ist das zur Zeit ausführlichste

Informationssystem für alle Aspekte der zur Zeit bekannten Enzyme.

Die Enzymaktivität bestimmt man, indem Enzym und Substrat bei bestimmter Temperatur,

bestimmtem pH-Wert, definierter Substrat- und Enzymkonzentration sowie in Gegenwart erforderlicher

Kofaktoren inkubiert und die Reaktion in Abhängigkeit von der Zeit verfolgt. Der Umsatz muss

photometrisch zu verfolgen sein.

Enzymologie 3-3


1) Reaktionen 1. Ordnung

Bei einer Reaktion 1. Ordnung hängt die Reaktionsgeschwindigkeit nur von der Konzentration des

Substrats ab. Das gängige Beispiel ist der radioaktive Zerfall. Welche Enzymreaktion ist eine Reaktion

erster Ordnung?

Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten k einer Reaktion 1. Ordnung

[1]

v = Reaktionsgeschwindigkeit k = Geschwindigkeitskonstante [S] = Substratkonzentration t = Zeit

[2]

Wenn x die Substratmenge ist, die in der Zeit t umgesetzt wurde, und a die Substrat-

Anfangskonzentration bei t = 0 ist, so gilt:

[3]

[4]

[5]

[6]

Bei der Halbwertszeit t½ ist x = a/2. Daraus ergibt sich:

[7]

2) Reaktionen 2. Ordnung

Die enzymatischen Reaktionen sind Reaktionen 2. Ordnung: Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von

Konzentrationen zweier Komponenten ab, der Substrat- und der Enzymkonszentration.

[8]

[E] = Enzymkonzentration (mg Protein)

[S] = Substratkonzentration (µMol/l)

Die Berechnung der Substratkonzentration in der Zeit t wird jedoch kompliziert.

Enzymologie 3-4


[9]

Man kann die Behandlung dieses Systems vereinfachen, indem man:

1. Substrat im Überschuss einsetzt oder

2. die Enzymkonzentration konstant hält.

1. Substratüberschuss: Die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional der Enzymkonzentration

[10]

[E] = Enzymkonz. (mg Protein) [S] = Substratkonz.n (µMol/l)

Die Geschwindigkeit bleibt konstant. Man nutzt dieses Experiment, um die Wechselzahl eines Enzyms

zu bestimmen. Bei einem Enzym mit nur einer Wirkgruppe entspricht die Wechselzahl der Anzahl

Substratmolekülen, die pro Molekül Enzym in einer Minute umgesetzt werden (z.B.: Fumarase 105,

Acetylcholinesterase 2 x 107 mol Substrat/mol Enzym x Min).

2. Enzymkonz. konstant: Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von der Substratkonz. ab

Hält man die Enzymkonzentration [E] konstant und steigert die Substratkonzentration [S], so erhält

man folgendes Bild:

Abbildung 3-1: Reaktionsgeschwindigkeit bei konstanter Enzym- und variabler Substratkonzentration.

Zu Beginn steigt die Geschwindigkeit linear mit steigender Substratskonzentration (I). Mit steigender

Substratkonzentration wird ein Plateau erreicht (II), d.h. das Enzym ist mit Substrat gesättigt. Die

maximale Reaktionsgeschwindigkeit ist erreicht, und eine weitere Zugabe von Substrat bei konstanter

Enzymkonzentration steigert die Umsatzgeschwindigkeit nicht mehr. Eine solche zweiphasige Kurve

kann man erklären, wenn man eine Komplexbildung zwischen Enzym und Substrat (Enzym-Substrat-

Komplex, ES) annimmt, bevor das Reaktionsprodukt gebildet wird. Die abnehmende Reaktionsge-

schwindigkeit (III) erklärt man durch Substrathemmung: Zu viele Substratmoleküle vermindern die

Effizienz der Enzym-Substrat-Wechselwirkung.

In der Praxis sind die genannten Extremfälle jedoch selten anzutreffen.

Die Nettogeschwindigkeit der Bildung von [ES] = die Nettogeschwindigkeit des Zerfalls von [ES], P ist

das Reaktionsprodukt:

Enzymologie 3-5


[11]

[12]

Die Einführung der Konstanten Km (der Michaelis-Konstanten), der maximalen Reaktionsgeschwindig-

keit vmax und die Umformulierung nach vo ergibt:

[13]

y = a.x + b

Abbildung 3-2: Der Lineweaver-Burk-Plot.

Trägt man 1/vo als Ordinate gegen 1/[S] als Abszisse auf, resultiert eine Gerade (Lineweaver-Burk-

Plot). Die Gerade schneidet die Ordinate bei 1/vmax, die Abszisse bei -1/km. Ihre Steigung ist km/vmax.

Die reziproken Anfangsgeschwindigkeiten werden gegen die reziproken Substratkonzentrationen

aufgetragen.

Eine andere Darstellungsart der Gleichung erhält man, wenn man beide Seiten der Gleichung mit [S]

multipliziert. Zeichnet man vo gegen [S] auf, so erhält man eine Hyperbel. Bei dieser Darstellungsart

wird die Bedeutung von Km deutlich, die bei der Ableitung der Gleichung eingeführt wurde.

Km ist demnach die Substratkonzentration, bei der vo = vmax / 2 ist.

Abbildung 3-3: Die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration.

Enzymologie 3-6


I. Acetylcholinesterase im Serum

Einführung:

Synapsen sind spezialisierte Kontaktstellen für eine Kommunikation zwischen Neuronen oder

zwischen Neuronen und z. B. einer Muskelzelle oder einer Drüsenzelle. Sie stellen auch die

Verbindungen zwischen einem Umweltreiz und der Wahrnehmung im Hirn. Sie ermöglichen das

Denken und die Kontrolle von Systemen des Körpers.

Abbildung 3-5: Schema einer Synapse [Quelle: Wikipedia, modifiziert]

Breitet sich die Erregung in Form eines Aktionspotenzials über ein Axon - kontinuierlich bei Myelin-

freien und saltatorisch über myelinisierte Neuriten - bis hin zu den terminalen Synapsen aus, so wird

dort eine chemische Transmitter-Substanz, z. B. Acetylcholin, aus synaptischen Vesikeln in den Sy-

napsenspalt freigesetzt.

Abbildung 3-6: Depolarisation der postsynaptischen Membran durch Acetylcholin

Einführung:

Der am längsten bekannte und am besten untersuchte Transmitter ist das Acetylcholin, andere sind

die -Aminobuttersäure und die Glutaminsäure. Der berühmte Versuch von Otto Loewi in 1921 bewies

am perfundierten Froschherzen, dass bei Vagusreizung Acetylcholin an den Endigungen post-

ganglionärer präsynaptischer Nervenfasern entsteht. Dale und Feldberg (1930) zeigten, dass Acetyl-

cholin an vielen Synapsen des peripheren Nervensystems der Säuger entsteht. Auch an den moto-

rischen Endplatten des Skelettmuskels wird Acetylcholin freigesetzt. Acetylcholin wird präsynaptisch in

cholinergen Neuronen durch Cholin-Acetat-Transferase nach folgender Gleichung synthetisiert:

CH3-CO~SCoA + HO-CH2-CH2-N+(CH3)3 CH3-COO-CH2-CH2-N+(CH3)3 + CoASH

Enzymologie 3-7


Das Acetylcholin wird dann in Vesikeln gespeichert und bei Depolarisation der präsynaptischen Mem-

bran in "Quanten" in den Synapsenspalt ausgeschüttet. Nach Bindung an den Acetylcholinrezeptor

der postsynaptischen Membran mit Öffnung der Natriumkanäle (Depolarisation) wird es durch die

Cholinesterase hydrolysiert. Das Ruhepotenzial wird wieder aufgebaut.

CH3-COO-CH2-CH2-N+(CH3)3 + H2O CH3-COOH + HO-CH2-CH2-N+(CH3)3

Das Enzym hat im aktiven Zentrum zwei charakteristische Wirkungszentren:

1. die anionische Bindungsstelle, an die der quaternäre Stickstoff des Cholins bindet,

2. die Esterase-Gruppe, die Elektronen auf den Acetatrest übertragen kann, wodurch ein

acetyliertes Enzym entsteht, das anschließend hydrolysiert wird.

Abbildung 3-7: Die enzymatische Spaltung von Acetylcholin zum Acetat und Cholin

Acetylcholinesterase gehört, wie die Phosphatasen, zur Klasse der Hydrolasen. Man unterscheidet

zwei Typen von Cholinesterasen. Wie aus der Tabelle hervorgeht, enthält vor allem Nervengewebe

einen hohen Gehalt an echter Acetylcholinesterase. Die Rolle der Pseudocholinesterase dürfte im

intermediären Stoffwechsel des Cholins und verwandter Verbindungen sowie in Entgiftungsvorgängen

(Procain-Esterase, Aspirin-Esterase) zu suchen sein.

Tabelle 3-4: Eigenschaften der Cholinesterase-Typen

Kriterium Acetylcholinesterase

(E C 3.1.1.7.) (E C 3.1.1.8)

Synonym

Vorkommen

pH-Optimum

Spezifität

echte Cholinesterase

Gehirn, Nerven, Erythrozyten, Schlangengifte

7,8

spaltet nur Ester der Essigsäure

Pseudo-Cholinesterase

Leber, Pankreas, Blutserum

8,5

weiter Spezifitätsbereich

Enzym + DFP gehemmtes Enzym

Enzymologie 3-8


Die Aktivität beider Cholinesterase-Typen kann durch spezifische Inhibitoren teilweise oder völlig ge-

hemmt werden. Das Enzym mit Aktivitäten um 2000 U/l im Serum wird in der Leber synthetisiert. Da-

her sind bei schweren Lebererkrankungen die Werte im Serum erniedrigt. Pharmakologische und

physiologische Studien haben zur Entwicklung vieler Enzym-Inhibitoren geführt, von denen einige

sehr toxisch sind. Cholinesterasen werden von zahlreichen Insektiziden (z.B. E 605, p-Nitrophenyl-di-

ethylester der Thiophosphorsäure) und von Physostigmin stark gehemmt. Praktische Bedeutung

haben vor allem folgende Gruppen von Cholinesterase-Hemmern:

a. Medikamente, die auf Grund einer gewissen Strukturanalogie die Acetylcholinspaltung kompe-

titiv hemmen. Dazu gehören die als Parasympathikomimetika verwendeten Pharmaka wie

Prostigmin, Biotin, Eserin.

b. Organische Phosphorsäure- oder Thiophosphorsäure-Ester, welche als Insektizide in der

Landwirtschaft verbreitet Anwendung finden, z. B. Parathion. Ähnlich in Bau und Wirkung sind

die in der experimentellen Forschung verwendeten Cholinesterase-Blocker DFP oder DIFP (=

Diisopropylfluorophosphat). Es handelt sich dabei um äußerst gefährliche Nervengifte.

c. Nervengifte vom Typ der Trilone, deren Verwendung als chemische Kampfstoffe (Sarin, So-

man, Tabun) nach der Genfer-Konvention verboten sind.

Enzym-DFP-Komplex + PAM Reaktivierung des Enzyms

Während die Wirkung von Stoffen der Gruppe a) auf einer reversiblen Veränderung beruht, kommt es

bei denen der Gruppe b) zu einer festen Bindung des Blockers an das Serin des Enzymproteins. Die

völlige Hemmung der Acetylcholinesterase im zentralen und peripheren Nervensystem durch solche

"Blocker" führt zu einem stetigen Ansteigen der Acetylcholinkonzentration im Bereich der cholin-

ergischen Synapsen und Nervenendigungen. Die Folge ist eine starke Parasympathikusreizung und

eine Störung der neuromuskulären Reizübertragung. Der Tod infolge Atemlähmung kann innerhalb

einer Stunde eintreten.

Da Vergiftungsfälle durch Inhibitoren relativ häufig sind (Verwechslungen, Unachtsamkeit, Suizid-

versuche), sei kurz auf den biochemischen Aspekt von Diagnose und Therapie dieser Vergiftung

eingegangen. Die Formel einiger Cholinesterase-Substrate und Inhibitoren sowie des Deblockers

PAM werden hier aufgeführt.

Enzymologie 3-9


Die Diagnose hat in erster Linie auf Grund des allgemeinen klinischen Bildes und des Augenbefundes

(kleine, stecknadelkopfgroße, reaktionslose Pupillen!) zu erfolgen. Als Ergänzung vermag auch die

Bestimmung der Cholinesterase-Aktivität des Serums im Schnelltest (Testpapierstreifen) wertvolle

Hinweise zu geben. Bei der Behandlung derartiger Vergiftungsfälle sollen neben Atropin (in hoher

Dosierung!) spezifisch auf den Cholinesterase-Inhibitor-Komplex einwirkende Substanzen wie Picolin-

hydroxansäure oder PAM (Pyridin-2-Aldoxim-Methojodid) verwendet werden. Der therapeutische Ef-

fekt von PAM beruht auf einer Befreiung des Enzyms vom anhaftenden Inhibitor.

Auch zur Erkennung der nicht allzu seltenen Fälle von Dyscholinesterasämie leistet die Bestimmung

der Cholinesterase-Aktivität im Serum wertvolle Dienste. Bei dieser genetisch determinierten Anomalie

wird eine atypische Variante von Cholinesterase mit einem unterschiedlichen Spezifitätsbereich syn-

PAM DFP

Physostigmin-Eserin

Enzymologie 3-10


thetisiert. Die strukturanaloge Verbindung Succinyldicholin wird beispielsweise infolge einer etwa 100-

fach geringeren Affinität von dem atypischen Enzym kaum umgesetzt. Die Träger dieser Anomalie

sind nicht in der Lage, Succinyldicholin zu spalten bzw. zu inaktivieren. Wird diese Substanz als Mus-

kelrelaxans bei der Operationsvorbereitung injiziert, kommt es zu einem lebensbedrohenden Zustand

(Apnoe). Die Untersuchung der Serum-Cholinesterase auf atypisches Verhalten gehört daher zu einer

gewissenhaften Operationsvorbereitung, sofern die Verabreichung von Succinyldicholin beabsichtigt

ist.

Prinzip:

Als Substrat dient Acetylthiocholinjodid und als Indikator für freigesetztes Thiocholin wird 5,5'-Dithio-

bis-2-nitrobenzoesäure verwendet, die zur gelb gefärbten 5-Mercapto-2-nitrobenzoesäure reduziert

wird. Zur Bestimmung der Pseudocholinesteraseaktivität wird der Thiocholinester der Buttersäure

verwendet.

In alkalischem Medium vertieft sich die gelbe Farbe des 5-Mercapto-2-nitro-benzoesäure unter

Bildung der chinoiden Verbindung:

Abbildung 3-8:

Bestimmung der Acetylcholinesterase-

Aktivität

1) Zeit-Umsatzkurve der Serum-

Cholinesterase

2) Hemmung mit DIFP

3) Reaktivierung mit PAM

Enzymologie 3-11


II. Laktatdehydrogenase

Einführung:

Die Laktatdehydrogenase (LDH) gehört zur Enzymklasse der Oxidoreduktasen und kommt praktisch

in allen Geweben vor. Hohe Aktivitäten lassen sich im Herzmuskel, in der Leber, im Skelettmuskel, in

Erythrozyten und Thrombozyten nachweisen.

Für LDH sind fünf Isoenzyme bekannt. Isoenzyme unterscheiden sich in ihren physikalischen

Eigenschaften (Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt, Denaturierungstemperatur) wie auch in ihren

katalytischen Eigenschaften (KM, pH-Optimum, Wechselzahl). Das LDH-Holoenzym ist aus vier

Untereinheiten aufgebaut, die entweder dem Typ M (Muskeltyp) oder dem Typ H (Herztyp)

entsprechen. Diese Untereinheiten werden durch nicht-kovalente Bindungen zusammengehalten. Die

Kombination dieser beiden Untereinheiten zu einem Tetramer in unterschiedlicher Relation ergibt die

fünf Isoenzyme: H4, H3M, H2M2, HM3 und M4, die auch als LDH 1, 2, 3, 4 und 5 bezeichnet werden.

Die Anteile der fünf LDH-Isoenzyme im Cytosol sind von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich,

innerhalb eines Organs jedoch relativ konstant.

LDH 1 und 2: Herzmuskel, rote Blutkörperchen

LDH3: Lunge, Milz, Lymphknoten, Thrombozyten, Schilddrüse, Nebennierenrinde

LDH 4 und 5: Leber und Skelettmuskulatur

Die Verteilung der LDH-Isoenzyme in den verschiedenen Organen weist eine Korrelation zu deren O2-

Versorgung auf. Das H4-Isoenzyme arbeitet relativ langsam und wird durch einen Überschuss an

Pyruvat gehemmt. Das M4-Enzym hat dagegen eine wesentlich höhere Wechselzahl und wird kaum

durch Pyruvat gehemmt.

Abbildung 3-8: Die metabolische Funktion der LDH.

Die Zelle gewinnt viel mehr ATP durch die Verstoffwechselung des Pyruvats im Citronensäurezyklus

als durch die Umsetzung zu Laktat. Dazu ist allerdings Sauerstoff nötig, um das produzierte NADH

reoxidieren zu können und damit in der Atmungskettenphosphorylierung ATP zu synthetisieren. In

einem aeroben Gewebe, wie im Herzen, steht Sauerstoff immer in genügenden Mengen zur

Verfügung, so dass jede Umwandlung von Pyruvat zu Laktat, das heißt Abzug dieses Metaboliten vom

PDH

10

10

Enzymologie 3-12


Citronensäurezyklus, einen Energieverlust darstellen würde. Deshalb dominieren in diesem Gewebe

die Isoenzyme H4 und H3M, deren Aktivität unter physiologischen Bedingungen durch Pyruvat

gehemmt wird. Als Konsequenz wird Pyruvat nicht zu Laktat umgesetzt, sondern im

Citronensäurezyklus verstoffwechselt.

In anaeroben Geweben mit limitiertem Sauerstoffangebot, wie z.B. in kontrahierenden Skelettmuskeln,

wird ATP unabhängig von der Verfügbarkeit von Sauerstoff während der Umwandlung von Glucose in

Pyruvat produziert. Wenn die ATP-Konzentration sinkt, steigt der Fluss der Glykolyse um ein

vielfaches an, um die notwendige Menge ATP zu synthetisieren. Unter diesen Bedingungen muss

NADH schnell in NAD+ überführt werden, weil es sonst zum Stopp der Glykolyse kommen würde.

NAD+ kann aber durch die LDH-Reaktion schnell regeneriert werden. Deshalb herrscht in solchen

anaeroben Geweben das Isoenzym M4 mit hoher Wechselzahl vor, dessen Aktivität Pyruvat nicht

hemmt. Als Produkt der Reaktion akkumuliert Laktat, was schließlich im Cori-Zyklus der

Gluconeogenese benutzt werden kann.

Klinische Anwendung:

Die im Serum messbare LDH-Aktivität stellt eine Summe der aus verschiedenen Organen

stammenden Isoenzyme dar. Deswegen kann aus einer einfachen Aktivitätsmessung nicht unbedingt

auf die Organherkunft des Enyzms geschlossen werden. Da aber im Falle der LDH das Verhältnis der

einzelnen Isoenzyme von Organ zu Organ unterschiedlich ist, spiegelt sich die Schädigung eines

bestimmten Gewebes auch als typisches Isoenzymmuster im Serum wider. Eine solche

Differenzierung der LDH-Isoenzyme nach Organen ist mit Elektrophorese möglich. Auf diese Weise

lässt sich z.B. unterscheiden, ob eine Erhöhung der LDH-Aktivität im Serum auf eine Schädigung des

Herzmuskels oder der Leberzelle zurückzuführen ist.

Abbildung 3-9: Eiweiß-Elektrophorese der

LDH-Isoenzyme aus menschlichen Seren

Enzymologie 3-13


Die LDH-Aktivität im Blut wird aus verschiedenen Gründen bestimmt:

Als Teil einer Routinelaboruntersuchung

Bei Gelbsucht (Ikterus)

Bei Lebererkrankungen

Verdacht auf Infektiöse Mononukleose (Pfeiffersches Drüsenfieber)

Verdacht auf Hämolyse (Zerfall von Erythrozyten)

Verdacht auf Blutarmut

Verlaufsbeurteilung maligner Erkrankungen (Krebs, Lymphdrüsen, Leukämien)

(Referenzbereiche: Männer: 135-225 U/l Frauen: 135-215 U/l)

Die Bestimmung der LDH zur Erkennung und Beobachtung von Herzerkrankungen und

Muskelerkrankungen ist durch den Ersatz besserer Marker (z.B. Troponin, CK-MB) abgelöst worden.

Stark erhöhte Werte der LDH-Aktivität finden sich bei Hämolyse, Vitamin B12/Folsäuremangel,

Herzinfarkt, Lebererkrankungen und malignen Erkrankungen. Ebenso können körperliche Arbeit und

Leistungssport zur Erhöhung führen.

Prinzip:

Die Pyridinnukleotide NAD+ und NADP+ können reversibel Wasserstoff aufnehmen. Ihre Funktion als

Coenzym vieler Dehydrogenasen (Oxidoreduktasen) beruht auf dieser Fähigkeit. Bei der Hydrierung

wird der aromatische Charakter des Nikotinsäureamid-Ringsystems aufgehoben. Das entstandene Di-

hydropyridin-Ringsystem besitzt eine spezifische Lichtabsorption mit einem Maximum von 340 nm, die

bei NAD+ fehlt. Man kann daher die Umwandlung von NAD+ in NADH und umgekehrt mit dem

Photometer messen.

NAD+ NADH

Enzymologie 3-14


Abbildung 3-10: Absorptionsspektren von NADH und NAD+. Die Konzentration des gebildeten bzw. verbrauchten NADH oder die Konzentration der entsprechenden Reaktionspartner der Enzyme werden mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes berechnet.

Pyruvat wird von Laktatdehydrogenase (LDH) in Gegenwart von NADH nach folgender Gleichung zu

L+-Laktat reduziert.

CH3-CO-COO- + NADH + H+ CH3-CH(OH)-COO- + NAD+

Die Gleichgewichtskonstante dieser Reaktion ist bei 25 °C:

K = [Laktat]/[Pyr] = 3,6 . 1011 l/mol

Pyruvat wird daher praktisch vollständig zu Laktat reduziert.

Abbildung 3-11: NADH Verbrauch als indirekter Nachweis der Pyruvat-Umsetzung nach Zugabe der

LDH

Enzymologie 3-15


Durchführung der Versuche

I. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase-Aktivität

1. Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität

2. Hemmung der Acetylcholinesterase mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)

3. Reaktivierung mit Pyridin-2-aldoximmethyljodid (PAM)

II. Enzymkinetik der Lactatdehydrogenase

1. Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration

2. Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substrat (Pyruvat-) Konzentration

3. Zeichnen des Michaelis-Menten-Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung

4. Ermittelung von KM und vmax, Vergleich der beiden Werte aus dem Michaelis-Menten-Plot und

der Lineweaver-Burk-Darstellung

Enzymologie 3-16


I. Bestimmung der Serum-Acetylcholinesterase-Aktivität

1. Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität

2. Hemmung der Acetylcholinesterase mit Diisopropylfluorophosphat (DIFP)

3. Reaktivierung mit Pyridin-2-aldoximmethyljodid (PAM)

die Acetylcholinesterase katalysiert die Umsetzung von Acetylthiocholinjodid zu Thiocholin

indirekter kolorimetrischer Nachweis von Thiocholin mit 5,5‘-Dithio-bis-(2-nitro-benzoesäure)

als Indikator, welches zur gelb gefärbten 5-Mercapto-2-nitrobenzoesäure reduziert wird

Photometer auf λ= 405 nm einstellen

in vier beschriftete Küvetten werden folgende Lösungen pipettiert:

Photometer vor jeder Zeitmessreihe mit Küvette 1 (Leerwert) nullen!

nach 1, 3, 5, 10, 15, 20 min Extinktionen der Küvetten 2-4 im Photometer messen, indem die

Küvette ins Photometer gestellt und der Wert abgelesen wird

Werte in die Tabelle 1.1 eintragen

Achtung: DIFP ist hoch toxisch!!!!

Küvetten-Nr. 1

Leerwert

2

Aktivität

3

Hemmung

4

Reaktivierung

5,5‘-Dithio-bis-(2-nitro-

benzoesäure) 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

Serum (enthält

Acetylcholinesterase) 20 l 20 l 20 l 20 l

DIFP (Hemmstoff) 50 l - 50 l 50 l

Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen und 5 min warten, dann PAM in die

angegebenen Küvetten geben !!

PAM (Enthemmer) 50 l - - 50 l

Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen und 10 min warten, dann Substrat in

die angegebenen Küvetten geben!!

Acetylthiocholinjodid (Substrat) - 100 l 100 l 100 l

Jede Lösung mit dem Plastikspatel gut mischen!

Achtung Reaktion startet jetzt, da Substratzugabe!!!! Zeit nehmen!!

Enzymologie 3-17


Tabelle: 1.1

Zeit nach

Substratzugabe

Werte für

Aktivität

Werte für

Hemmung

Werte für

Reaktivierung

1 min

3 min

5 min

10 min

15 min

20 min

a) Stellen Sie die Ergebnisse graphisch mit Excel dar (X,Y-Diagramm). (Extinktion gegen Zeit)

b) Berechnen Sie die Acetylcholinesterase-Aktivität in der Einheit U/l im normalen,

gehemmten und reaktivierten Zustand.

c) Diskutieren Sie die Graphen für Aktivität, Hemmung und Reaktivierung. Was sind die

Unterschiede? Welche Aussage kann man anhand der Ergebnisse machen ?

Die Aktivität wird mit Hilfe von Steigungsdreiecken aus dem linearen Bereich der Kurven bestimmt, die

Extinktionsveränderung der Kurve pro Minute (E/t) angegeben und mit Hilfe des Lambert-

Beerschen Gesetz berechnet. Wichtig: Wählen Sie für alle drei Fälle (Normalzustand, gehemmter

und reaktivierter Zustand) den gleichen Zeitraum (z.B. immer zwischen der 1. und 3. Minute, oder

zwischen der 1. und 5. Minute).

E=*c*d

E : aus Werten errechnen [z.B. E(405nm)5 min - E(405nm)1min] t : aus Werten errechnen [z.B. 5 min - 1min] d : 1 cm : 13,3 * 103 [l/(mol * cm)] c/min : umgesetztes Substrat/min [mol/(l * min)] VF : Verdünnungsfaktor (Enzym) für jede Küvette unterschiedlich daher einzeln

berechnen, z.B Plastikküvette I (3120 l : 20 l = 156) (Gesamtvolumen:Volumen Serum)

Unit : 1 mol Substratumsatzerhöhung / min [Vorsicht: mol in mol umrechnen (x 106)]

ΔE c/min [U/l] = x VF

d * * t

Enzymologie 3-18


II. Enzymkinetik der Lactatdehydrogenase

1. Abhängigkeit der NADH-Umsetzung von der Pyruvatkonzentration

die Laktatdehydrogenase katalysiert die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat mit Hilfe von

NADH, das dabei zu NAD+ oxidiert wird

NADH besitzt im Gegensatz zu NAD+ ein zusätzliches Extinktions-Maximum bei λ= 340nm;

dadurch kann der Verbrauch von NADH photometrisch bestimmt werden

Photometer auf =340nm einstellen

Photometer mit H2O nullen

Lösungen in die bereitgestellten Küvetten pipettieren und mit einem Plastikspatel gut mischen!

(Spatel zwischendurch abwischen), eine Küvette zurückhalten für H2O um das Photometer zu

nullen!

Pipettierschema:

REAKTION STARTET JETZT! DIREKT ZEIT MESSEN!

alle 15 sec in einem Zeitraum von 2 min die Extinktion ablesen und in Tabelle 2.1

eintragen (Die Küvette bleibt die ganze Zeit im Photometer stehen!)

mit den Lösungen 2-5 gleichermaßen verfahren

Reagenzglas-Nr. 1 2 3 4 5

Citrat-Puffer pH 6,0 [ml] 1,65 1,6 1,5 1,3 1,1

0,5mM Natrium-Pyruvat-Lösung [ml] 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6

1mM NADH [ml] 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Anfangsextinktionen (E0) der einzelnen Lösungen messen, nach 30

Sekunden erneut den Wert ablesen (wenn konstant, dann LDH

dazugeben)

Laktatdehydrogenase (LDH) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Enzymologie 3-19


Tabelle 2.1

E(340nm) Lösung

Zeit [s] 1 2 3 4 5

15

30

45

60

75

90

105

120

2. Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration

a) Für jede Pyruvatkonzentration (Lösungen 1-5) einen Graphen zeichnen. (Extinktion gegen

Zeit) (alle Graphen in einem Diagramm) (Tabelle 2.1 in Excel darstellen)

b) Die Anfangsgeschwindigkeit (v0) mit Hilfe des Lambert-Beerschen-Gesetz für jeden

Graphen ermitteln. Eine Beispielrechnung pro Substratkonzentration ist für das Protokoll

ausreichend. Bitte machen Sie kenntlich, welche Extinktionswerte Sie für die Berechnung

benutzt haben. Wichtig: verwenden Sie immer den gleichen Zeitraum.

ΔE=*c*d

E = Extinktionsabnahme = molarer Extinktionskoeffizient von NADH bei 340nm=6,2*103 l/(mol*cm)

d = Schichtdicke, 1cm c = Änderung der NADH-Konzentration

Linearen Anfangsbereich der einzelnen Graphen ermitteln und die Extinktionsabnahme (E) pro Zeit

(t), die in diesem Bereich liegt, berechnen. Daraus ergibt sich dann folgende

Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion, v0,:

c E E [mol] E * 0,16 [µmol] v0= = = = t *d*t ( 6,2*103*t) [min* l ] t [min * ml]

Enzymologie 3-20


Tabelle 2.2

Lösung

Substratkonz. [S]

(in der Lösung) Anfangsgeschw. v0 1/[S] 1/v0

Nr. mmol/l mol/(ml*min) l/mmol (ml*min)/mol

1

2

3

4

5

Berechnung der Pyruvatkonzentration:

Pyruvatvolumen [ml] Verdünnungsfaktor [1-5] = Gesamtvolumen [ml]

Pyruvatkonzentration (1-5) [mmol/l] = Ausgangskonzentration [0,5mmol/l] * Verdünnungsfaktor [1-5]

3. Zeichnen des Michaelis-Menten-Plot und der Lineweaver-Burk-Darstellung

a) Für den Michaelis-Menten-Plot werden die Anfangsgeschwindigkeiten (v0) gegen die

Pyruvatkonzentrationen [S] in Excel aufgetragen (X,Y-Diagramm). Die Michaelis-Menten

Konstante (KM), sowie die Maximalgeschwindigkeit der Reaktion, die bei Substratsättigung

erreicht wird (vmax), wird optisch ermittelt.

b) Der Lineweaver-Burk Plot ist eine doppel-reziproke Darstellung von v0 und [S], also in Form von

1/vo und 1/[S]. 1/v0 und 1/[S] als Tabelle in Excel darstellen (X,Y-Diagramm) und einen Graph

zeichnen lassen. Durch rechtsklicken Trendlinie auswählen. Diese linear einzeichnen lassen und

sich auch die Gleichung anzeigen lassen. KM wird als x-Achsen Schnittpunkt (y=0) im negativen

Bereich (-1/KM ) und vmax als y-Achsen Schnittpunkt (x=0) (1/ vmax) mit der Gleichung der Trenlinie

errechnet.

4. Ermittelung von KM und vmax

Vergleichen Sie die ermittelten Werte KM und vmax zwischen Michaelis Menten Plot und

Lineweaver-Burk-Darstellung. Rechnen Sie gegebenenfalls die Werte in die erforderlichen

Einheiten um und tragen Sie diese in die Tabelle 2.3 ein. Wenn sich KM und vmax voneinander

unterscheiden, welchen Grund könnte das haben? Führen Sie hierfür die Vor-und Nachteile des

jeweiligen Darstellungsverfahrens (Michaelis-Menten-Plot bzw. Lineweaver-Burk-Darstellung) an.

Tabelle 2.3 KM [mol/l]

Vmax [mmol / l * min ]

Michaelis-Menten-Plot

Lineweaver-Burk-Darstellung

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Versuch 3: Enzymologie - uni-koeln.de · Enzymologie 3-1 2017 Zentrum Biochemie Versuch 3: Enzymologie Bitte einen eigenen Laptop für die Auswertung mitbringen, da im Computerraum