LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

INDRĖ ŠVEIKAUSKAITĖ

ŠVINO IR NIKELIO JONŲ ĮTAKA BENDRŲ BALTYMŲ IR

METALOTIONEINŲ SINTEZEI LABORATORINIŲ PELIŲ

KEPENYSE: CINKO JONŲ APSAUGOS POVEIKIO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

dr. Ilona Sadauskienė

KAUNAS

2014

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS

MOLEKULINĖS NEUROBIOLOGIJOS LABORATORIJA

TVIRTINU

Farmacijos fakulteto dekanas prof. Vitalis Briedis

ŠVINO IR NIKELIO JONŲ ĮTAKA BENDRŲ BALTYMŲ IR METALOTIONEINŲ SINTEZEI

LABORATORINIŲ PELIŲ KEPENYSE: CINKO JONŲ APSAUGOS POVEIKIO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

dr. Ilona Sadauskienė

2014 05 22

Darbo recenzentas

Darbą atliko

Magistrantė Indrė Šveikauskaitė

2014 05 22

KAUNAS

2014

3

TURINYS

SANTRAUKA .......................................................................................................................................... 4

SUMMARY .............................................................................................................................................. 5

SANTRUMPOS ........................................................................................................................................ 7

ĮVADAS .................................................................................................................................................... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI .................................................................................................... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ....................................................................................................... 11

1.1 Švino biologinis vaidmuo ......................................................................................................... 11

1.1.1. Švino savybės ir vaidmuo ligų patogenezėje .................................................................... 11

1.1.2 Švinas ir oksidacinis stresas .............................................................................................. 12

1.2 Nikelio poveikis organizmui .................................................................................................... 14

1.2.1 Nikelio savybės ir vaidmuo ligų patogenezėje .................................................................. 14

1.2.2 Nikelis ir oksidacinis stresas ............................................................................................. 15

1.3 Cinko vaidmuo organizme ........................................................................................................ 16

1.3.1 Cinko reikšmė organizmui ................................................................................................ 16

1.3.2 Cinko antioksidacinės savybės .......................................................................................... 17

1.4 Sunkiųjų metalų įtaka baltymų sintezei .................................................................................... 19

1.4.1 Metalotioneinų reikšmė metalų detoksikavime ................................................................. 19

1.4.2 Toksiškų metalų įtaka genų raiškai ................................................................................... 21

2. MEDŽIAGOS IR METODAI ......................................................................................................... 23

2.1 Tyrimo objektas ir reagentai ......................................................................................................... 23

2.2 Sunkiųjų metalų poveikio laboratorinėms pelėms tyrimo modelis ............................................... 24

2.3 Baltymų sintezės greičio nustatymas ............................................................................................ 27

2.4 Metalotioneinų koncentracijos nustatymas ................................................................................... 27

2.5 Duomenų patikimumo vertinimas ................................................................................................. 28

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ............................................................................................. 28

3.1 Metalų įtaka baltymų sintezei ....................................................................................................... 28

3.2 Metalų poveikis metalotioneinų sintezei pelių kepenyse .............................................................. 31

3.2.1 Kompleksinis švino ir cinko poveikis metalotioneinų sintezei .............................................. 31

3.2.2 Kompleksinis nikelio ir cinko poveikis MT sintezei ............................................................. 33

IŠVADOS ................................................................................................................................................ 36

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS .............................................................................................................. 37

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ................. 44

PRIEDAI ................................................................................................................................................. 45

4

SANTRAUKA

Indrės Šveikauskaitės magistro baigiamasis darbas. Švino ir nikelio jonų įtaka bendrų baltymų ir

metalotioneinų sintezei laboratorinių pelių kepenyse: cinko jonų apsaugos poveikio įvertinimas. Mokslinis

vadovas dr. Ilona Sadauskienė. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija,

Neuromokslų institutas, Molekulinės neurobiologijos laboratorija, Kaunas, 2014.

Pagrindinis tyrimo tikslas – įvertinti švino ir nikelio jonų įtaką baltymų ir metalotioneinų sintezei

laboratorinių pelių kepenyse bei cinko apsauginį poveikį, veikiant švinui ir nikeliui.

Tyrimams naudotos 4-6 savaičių nelinijinės baltosios laboratorinės pelės, sveriančios nuo 20 iki 25

gramų. Pelių laikymo sąlygos atitiko reikalavimus.

Eksperimentams pelės buvo suskirstytos į 6 grupes: I – kontrolinė, II – gaunančios Pb(CH3COO)2

(dozė 10 mg Pb/kg), III – gaunančios ZnSO4 (1,56 mg Zn/kg), IV – ZnSO4 ir po 20 minučių Pb(CH3COO)2

(anksčiau nurodytos dozės), V – NiCl2 (1,12 mg Ni/kg) , VI – ZnSO4 ir po 20 minučių NiCl2 (anksčiau

nurodytos dozės). Druskų tirpalai į pilvo ertmę švirkšti 14 dienų. Praėjus 14 dienų, pelės buvo

anestezuotos, joms atlikta cervikalinė dislokacija. Tyrimams naudotos pelių kepenys.

Baltymų koncentracijai nustatyti naudojome Beer/Lambert metodą, spektrofotometriškai

matavome sugertį ties 260 ir 280 nm banga. Metalotioneinų koncentraciją nustatėme pagal Peixoto

metodiką, spektrofotometriškai sugertį matavome ties 412 nm banga.

Nustatėme, jog metalai skirtingai veikia bendrų baltymų ir metalotioneinų sintezę. Švinas neturėjo

statistiškai reikšmingo poveikio bendrų baltymų sintezei, o nikelis skatino bendrą baltymų sintezę. Nikelis

metalotioneinų sintezę taip pat aktyvino labiau nei švinas. Padidėjus metalotioneinų koncentracijai bei

suaktyvėjus bendrų baltymų sintezei, užfiksuotas cinko jonų apsauginis poveikis.

5

SUMMARY

Master thesis of Indre Sveikauskaite. The effects of lead and nickel ions on total proteins and

metallothioneins synthesis in mice liver: protective effects of zinc ions evaluation. Scientific supervisor

dr. Ilona Sadauskiene. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Neuroscience

Institute, Laboratory of Molecular Neurobiology, Kaunas 2014.

The present study was conducted to investigate the effects of lead and nickel ions on total proteins

and metallothioneins synthesis in mice liver and evaluate protective effects of zinc ions.

Experiments were done on 4-6 weeks old white laboratory outbreed mice weighing 20-25 g. All

experiments performed according to the Republic of Lithuania Law on the Care, Keeping and Use of

animals (License of State Veterinary Service for working with laboratory animals No 0221).

For experiment mice were sorted out into 6 groups: I group – control; II group – Pb(CH3COO)2 (10

mg Pb per kg of body mass), III group – ZnSO4 (1,56 mg Zn per kg of body mass), IV – ZnSO4 and after

20 minutes Pb(CH3COO)2 (the same doses), V – NiCl2 (1,12 mg Ni per kg of body mass) , VI – ZnSO4 and

after 20 minutes NiCl2 (the same doses).

Concentration of protein was determined by Lowry method. MTs were assayed in mice liver

according to the method of Peixoto N. C.

There is no statistically significant effect of lead on protein synthesis in mice liver. ZnSO4, injected

20 minutes before Pb(CH3COO)2, increased protein synthesis. After injection of NiCl2 solution, marked

amino acid actuation to new synthesized protein has increased, but ZnSO4, injected 20 minutes before

NiCl2, decreased protein synthesis. Obtained data showed, that in mice liver treated with NiCl2 and

Pb(CH3COO)2 solutions, MTs content was increased. According to the data, ZnSO4 injected 20 minutes

before NiCl2 or Pb(CH3COO)2, decreased MTs content.

6

PADĖKA

Norėčiau padėkoti visiems padėjusiems rengiant magistro baigiamąjį darbą. Dėkoju savo

mokslinei vadovei dr. Ilonai Sadauskienei už pagalbą, motyvaciją ir patarimus. Dėkoju dr. Jurgitai

Šulinskienei už nuolatines konsultacijas bei bendradarbiavimą. Ačiū Neuromokslų instituto Molekulinės

neurobiologijos laboratorijos vedėjui habil. dr. Leonidui Ivanovui už suteiktą galimybę mokslinius

tyrimus atlikti šiame universiteto padalinyje.

7

SANTRUMPOS

8-OH-dG – 8-hidroksi-2-deoksiguanozinas

ADF – aktyviosios deguonies formos

ALA – alaninas

ALAD – δ-aminolevulino rūgšties dehidratazė

APE1 – apirimidininė endonukleazė

ATP – adenozino 5'-trifosfatas

DNR – deoksiribonukleorūgštis

FMSF – proteazių slopiklis

G-6-PDH – gliukozės 6- fosfatdehidrogenazė

GPx – gliutationo peroksidazė

GSH – redukuotas glutationas

LD50 – vidutinė mirtinoji dozė; dozė, nuo kurios žūva pusė (50 proc.) tiriamų gyvūnų

LPO – lipidų peroksidinė oksidacija

MT – metalotioneinai

MTF – metalų indukuojamas transkripcijos veiksnys

RNR – ribonukleorūgštis

SH – sulfhidrilinės grupės

SM – sunkieji metalai

SOD – superoksido dismutazė

TchA – trichloracto rūgštis

TRIS – tris (hidroksimetil) aminometanas

8

ĮVADAS

Oksidacinis stresas – aktyviųjų deguonies formų (ADF) sukelto biomolekulių pažeidimo

rezultatas. Itin stiprus oksidacinis stresas sukelia ląstelių žūtį (Barja et al., 2002). Normaliomis sąlygomis

ADF kiekiai yra reguliuojami ir kompensuojami jas naikinančių reakcijų. Nedideli ADF kiekiai valdo tam

tikrus fiziologinius procesus ląstelėje: yra tarpiniai reakcijų produktai, svarbūs reguliuojant ląstelės

dauginimąsi bei signalo perdavimo keliams, NO˚ veikia kraujagyslių tonusą. Sutrikus pusiausvyrai tarp

ADF susidarymo ir pašalinimo, pradeda vystytis oksidacinis stresas. Jeigu oksidacinis stresas nestiprus,

ląstelė sugeba apsisaugoti greitindama antioksidacinės sistemos fermentų sintezę. Dažniausiai ląstelė

aktyvina katalazės ir glutationo reduktazės genų raišką. Oksidacinį stresą gali sukelti radiacija, ultragarsas,

sunkieji metalai (Barja et al., 2002; Valko et al., 2004). Toksiški ir kancerogeniški metalai sąveikaudami

su branduolio baltymais sukelia oksidacinį stresą ir DNR pažaidas (Valko et al., 2005). Vieni tokių metalų

– švinas ir nikelis.

Švinas – sunkusis metalas, sukeliantis neurologines, virškinamojo trakto, reprodukcinės sistemos,

imunologines patologijas (Patrick et al., 2006). Švinu galima apsinuodyti pro kvėpavimo ir virškinimo

sistemas (Mudipalli et al., 2007). Nustatyta, jog kepenys – viena didžiausių švino talpyklų organizme,

švinas kepenis pasiekia per žarnyno ir vartų venas (Ptašekas et al., 2002). Sunkusis metalas suriša

baltymų, turinčių sulfidrilines grupes, molekules, skatina laisvųjų radikalų sintezę bei mažina

antioksidantų aktyvumą bei sukelia oksidacinį stresą (Patrick et al., 2006; Sanders et al., 2009).

Oksidacinis stresas – pirmasis apsinuodijimo švinu požymis, ADF randama plaučiuose, endoteliniame

audinyje, kepenyse ir smegenyse (Hsu et al., 2002).

Nikelis į organizmą gali patekti per plaučius, odą ir virškinamąjį traktą. [Valko et al., 2005]

Pagrindiniais nikelio organai taikiniai – inkstai ir kepenys, tačiau sunkusis metalas negrįžtamai gali

pažeisti plaučius, širdį bei lytinius organus (Keyuna et al., 2011). Išaiškinta, jog pagrindinis nikelio

toksiškumo mechanizmas – glutationo išeikvojimas ir baltymų sulfidrilinių grupių surišimas (Valko et al.,

2005). Mažindamas ATP‘azės aktyvumą, nikelis gali iššaukti neurologinius sutrikimus, konvulsijas bei

komą (Keyuna et al., 2011). Lyginant su kitais sunkiaisiais metalais, nikelis sukelia silpną ADF indukciją,

tačiau Ni gali indukuoti DNR grandinių trūkius bei chromosomų aberacijas (Dally et al., 1997) Nikelio

kancerogeniškumą lemia susiformavusios replikacijos klaidos, genomo nestabilumas bei atsiradusi

transkripcijos bei signalo perdavimo indukcija (Keyuna et al., 2011).

9

Cinkas – žmogui būtinas mikroelementas, esantis visuose organuose, audiniuose ir skysčiuose

(Benters et al., 1997). Didžioji cinko dalis surišta su baltymais ar amino rūgštimis: GSH, cisteinu,

histidinu (Oteiza et al., 2012). Cinkas laikomas netiesioginiu antioksidantu – nesuriša laisvųjų radikalų,

tačiau palaiko antioksidacinę sistemą (Valko et al., 2005). Cinko trūkumas siejamas su audinių oksidacine

pažaida, trūkstant cinko organizmas tampa jautresnis oksidaciniam stresui (Valko et al., 2005).

Organizmui kovojant su sunkiaisiais metalais, itin svarbūs apsauginiai baltymai – metalotioneinai

(MT). MT – viduląsteliniai, mažos molekulinės masės, sunkiuosius metalus surišantys baltymai. Šią jų

savybę sąlygoja molekulėje esančios cisteino liekanos (Coyle et al., 2002). MT būtini detoksikuojant

organizmą (Curtis et al., 1999). Didžiausias metalotioneinų kiekis inkstuose, žarnyne, kasoje ir kepenyse

(Coyle et al, 2002). Metalotioneinai – didžiausia cinko talpykla organizme. Oksidacinio streso metu

sudėtinės metalotioneinų cisteino liekanos oksiduojamos, o cinko atpalaidavimas reikšmingas apsaugant

ląstelę nuo oksidacinės pažaidos (Maret et al., 1995).

Įvairių studijų metu išsiaiškinta, jog sunkieji metalai sukelia oksidacinį stresą bei DNR pažaidas,

tačiau vis dar nėra bendros išvados, koks mechanizmas tai lemia, remiantis tyrimų duomenimis – jų

keletas. Šiame darbe vertinama cinko jonų geba apsaugoti kepenų baltymų sintezės sistemą nuo dviejų

sunkiųjų metalų – švino ir nikelio – poveikio.

Darbo naujumas. Šiame darbe pateikti tyrimai ir analizė leidžia detaliau suprasti cinko apsauginį

poveikį, veikiant nikeliui ir švinui. Nustatėme, jog cinkas gali apsaugoti ląstelę sunkiųjų metalų poveikio,

tačiau poveikis priklauso nuo intoksikavimo laiko. Cinkas gali apsaugoti ląstelę ankstyvoje švino

intoksikavimo stadijoje, tačiau vėlyvoje nikelio intoksikavimo stadijoje.

Tyrimų rezultatus pristačiau tarptautinėse konferencijose Lietuvoje ir užsienyje, parengiau

straipsnį žurnalui „Biologija“.

10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: įvertinti švino ir nikelio jonų įtaką baltymų ir metalotioneinų sintezei laboratorinių

pelių kepenyse bei cinko apsauginį poveikį, veikiant šiems metalams.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti baltymų sintezės greitį pelių kepenyse po švino ir nikelio druskų poveikio.

2. Nustatyti metalotioneinų koncentraciją pelių kepenyse po švino ir nikelio druskų poveikio.

3. Įvertinti cinko įtaką baltymų ir metalotioneinų sintezei, veikiant švinui ir nikeliui.

11

1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1 Švino biologinis vaidmuo

1.1.1. Švino savybės ir vaidmuo ligų patogenezėje

Švinas egzistuoja trijose formose: metalinis švinas, neorganinis švinas ir jo junginiai (švino

druskos) bei organinis švinas (sudėtyje yra anglies) (Sanders et al, 2009).

Švinas sukelia neurologines, hematologines, reprodukcines bei imunologines patologijas (Patrick

et al., 2006). Apsinuodijimas švinu galimas per kvėpavimo ir virškinimo sistemas. Maždaug 30-40 proc.

įkvėpto švino patenka į kraujotaką. Absorbuotas švinas 30-35 dienas lieka kraujyje ir per tą laiką kaupiasi

kituose audiniuose – kepenyse, aortoje, smegenyse, plaučiuose, kauluose ir dantyse (Patrick et al., 2006).

Švino pusperiodis smegenyse – maždaug dveji metai, kauluose švinas gali išlikti apie 20-30 metų

(Verstraeten et al., 2008). Tyrimų metu nustatyta, jog kepenų audinys didžiausia švino talpykla (iki 33

proc.) iš visų minkštųjų audinių (Mudipalli, 2007).

Švinas pasiekia kepenis per žarnyno ir vartų venas. Dalis švino pasišalina per kepenis kartu su

tulžimi, likusioji – kaupiasi hepatocituose (Ptašekas et al., 2002). Švinui inhibuojant ALA dehidratazę,

sutrikdoma hemo sintezė, pradeda vystytis toksinė anemija. Švinas turi itin daug įtakos energijos

metabolizmo silpnėjimui (Rosenthal et al., 2009). Kaip ir kiti sunkieji metalai, švinas skatina laisvųjų

radikalų sintezę bei silpnina antioksidantų veikimą. Sunkusis metalas taip pat suriša baltymų, turinčių

sulfhidrilines grupes, molekules. Baltymai tampa neaktyvūs bei sutrikdomas oksidacinis balansas (Patrick

et al., 2006).

Apsinuodijimo švinu mechanizmas kompleksinis: oksidacinis stresas, membranų biofizikiniai

pokyčiai, ląstelės signalų išreguliavimas bei neurotransmisijos pablogėjimas, iššaukiantis švino jonų

neurotoksiškumą. Švino toksiškumas pasireiškia dviem keliais: oksidacinio streso – aktyviųjų deguonies

formų generacija ir tiesioginiu antioksidantų atsargų išeikvojimu (Patrick et al., 2006; Sanders et al, 2009).

Sunkusis metalas inhibuoja ALAD, todėl padidėja ADF produkciją stimuliuojančios ALA. Švinas taip pat

gali stimuliuoti membranos lipidų peroksidaciją, surišdamas fosfatidilcholiną bei pakeisdamas membranos

biofizikines savybes (Gillis et al., 2012).

Švinas geba pakeisti kalcio jonus, todėl nesunkiai pereina kraujo – smegenų barjerą. Pažeidžiamas

hipokampas, smegenėlės, didžioji smegenų žievė. Dėl tokio poveikio pradeda vystytis įvairūs

neurologiniai sutrikimai: smegenų pažeidimai, protinis atsilikimas, elgesio sutrikimai, nervų pažeidimai,

atsiranda rizika Alzheimerio, Parkinsono ligų bei šizofrenijos vystymuisi (Sanders et al, 2009).

12

Švino buvimas organizme pastebimas tiriant glutationo metabolizmą. Glutationas – stipriausias

organizmo antioksidantas, kurį sudaro cisteino, glicino ir glutamo rūgštys. Slopindamas laisvuosius

radikalus, glutationas atsakingas už specifinių vaistų ir toksinų metabolizmą kepenyse. Švinas paveikia

glutationo molekulę ir ši tampa neaktyvi (Gillis et al., 2012).

Nustatyta, kad nedidelės švino koncentracijos stimuliuoja ląstelių augimą. Galimas šio reiškinio

mechanizmas grindžiamas švino gebėjimu surišti laisvą viduląstelinį kalcį bei aktyvuoti baltymo kinazę C

(PKC). Švinas sukelia signalo perdavimo kaskadą, kuri pradeda stimuliuoti DNR sintezę (Rosenthal et al.,

2009)

1.1.2 Švinas ir oksidacinis stresas

Nustatyta, jog švino sukeltas oksidacinis stresas – pirmasis apsinuodijimo šiuo sunkiuoju metalu

požymis ligos patogenezėje. Oksidacinio streso požymių rasta įvairiuose organuose, ADF aptikta

plaučiuose, endoteliniame audinyje, smegenyse bei kepenyse (Hsu et al., 2002). 1 pav. pateikiami švino

sukelto oksidacinio streso požymiai.

1 pav. Švino sukelto oksidacinio streso požymiai (pagal A. Mudipalli)

Švino oksidacinis stresas susijęs su ADF generavimo ir šalinimo disbalansu audiniuose ir ląstelės

komponentuose: membranose, DNR, baltymuose. Membranų rūgštyse esantys dvigubi ryšiai silpnina C-H

ryšį anglies atome ir H gali būti pašalinamas daug lengviau. Taip pat rūgštys, turinčios ne daugiau dviejų

dvigubųjų rūgščių yra atsparesnės oksidaciniams stresui. Esminis švino sukelto oksidacinio streso

mechanizmas siejamas su rūgščių struktūros pakeitimu. Membranos jautrumas peroksidacijai sąlygoja

• Modifikuojami membranos baltymai;

• Pakeičiamas signalas;

• Riebiųjų rūgščių grandinės ilginimas.

Ląstelės membrana

• Akumuliuojantis ALA sąveikauja su alkilinančiu agentu ir suformuoja DNR aduktus;

• Sąveika su cinką rišančiais baltymais transkripcijos

komplekse.

Genomas

• Baltymų funkcinių grupių inhibavimas SOD, GSH peroksidazė, GSH reduktazė;

• GSH išeikvojimas.

Antioksidantų sistema

13

rūgščių ilgį, o švino sukeltas arachidono rūgšties pailgėjimas gali sukelti padidėjusią lipidų peroksidaciją

membranoje. Taip pat švinas veikia kitus ląstelėje vykstančius procesus: endocitozę ir egzocitozę, signalo

perdavimą, membranos fermentų aktyvumo pokyčius (Patra et al., 2011). 2 pav. pateiktas galimas švino

sukelto oksidacinio streso mechanizmas ir taikiniai.

Manoma, kad glutationo bei antioksidacinio baltymo aktyvumo pokyčiai susiję būtent su švino

sukeltu oksidaciniu stresu. Keleto studijų metu įrodyta, jog tai lemia aktyviųjų deguonies formų

susidarymą, kuris sąlygoja biomolekulių: baltymų, lipidų ir DNR pažaidą (Stohs et al., 1995).

Nustatyta, jog ilgiau trunkantis švino poveikis sąlygoja OH+, H2O2, O2 ir LPO (lipidų

peroksidazės) gamybą in vivo. Ilgalaikis švino poveikis gali nulemti ląstelių vidinių antioksidacinių

gynybinių savybių išeikvojimą ir sisteminę mobilizaciją (Flora et al., 2008).

2 pav. Švino sukelto oksidacinio streso galimas mechanizmas ir taikiniai (Pagal Gagan Flora)

Keleto studijų metu įrodyta, kad švinas keičia antioksidacinių baltymų: superoksido dismutazės

(SOD), katalazės, glutationo peroksidazės (GPx) ir gliukozės 6-fosfato dehidrogenazės (GGPD) aktyvumą

(Chiba et al., 1996). Pagrindiniai potencialūs švino taikiniai – fermentai: SOD, katalazė ir GPx.

Selenas būtinas GPx aktyvumui, tačiau švinas jungiasi su selenu ir silpnina pastarojo aktyvumą.

Katalazė – hemą sudarantis baltymas, todėl prisijungus švinui, jos aktyvumas mažėja (Flora et al., 2008).

SOD aktyvumui būtinas cinkas ir varis. Vario jonai dalyvauja oksidacijoje, o cinkas stabilizuoja baltymo

molekulę. Abu metalai pakeičiami švinu, kuris sumažina SOD aktyvumą (Halliwell et al., 1989).

ADF gamyba

O2; H2O2;OH+

Oksidacinis stresas

Pb

Baltymai

Lipidai

DNR

Baltymų oksidacija,

paveikianti jų funkciją

Lipidų peroksidacija,

suardanti membraną

Nukleininės rūgšties

oksidacija, iššaukianti

mutacijas

Ląstelės žūtis

14

1.2 Nikelio poveikis organizmui

1.2.1 Nikelio savybės ir vaidmuo ligų patogenezėje

Nikelis – daugelyje junginių randamas elementas. Maždaug 150 000 tonų nikelio į aplinką pateko

su vulkaninėmis dulkėmis ir akmenų erozijos metu, apie 180 000 tonų nikelio nuteka iš antropogeninių

šaltinių – fosilijų oksidavimosi metu bei iš industrinių atliekų (Kasprzak et al., 2003). Maždaug 5 proc.

viso nikelio sunaudojama liejyklose bei gaminant spausdintuvų kasetes (Keyuna et al., 2011).

Priklausomai nuo formos, nikelis į organizmą gali patekti per odą, plaučius ir virškinamąjį traktą

(Hoffmal et al., 2007). Nikeliui jautriems žmonėms pasitaiko alerginė odos reakcija. Dažniausiai

kontaktinį dermatitą sukelia nikelio turintys papuošalai bei aksesuarai (Keyuna et al., 2011). Nikelis ir jo

druskos priskiriami pirmai kancerogenų grupei, sukelia nosiaryklės bei kvėpavimo sistemos vėžį

(Murawska et al., 2012). Pagrindinės kancerogeniškos medžiagos, patenkančios nikelio įkvėpimo metu –

mažai tirpios vandenyje: kristalinio nikelio sulfidas, kristalinio nikelio subsulfidas ir įvairūs nikelio

oksidai (Sunderman et al., 1968). Fagocitavusios, netirpių medžiagų dalelės su nikelio jonais sudaro

viduląstelines vakuoles, kurios išsidėsto ląstelės centre aplink branduolį. Vakuolių rūgštinis pH 4,5

pagreitina nikelio jonų išsiskyrimą iš fagocitavusių dalelių ir taip ląstelės viduje sukuriama itin didelė

sunkiojo metalo koncentracija (Chervona et al., 2012). Nustatyta, jog žmogus vienu metu gali įkvėpti iki

30 μm nikelio. Dalelės, mažesnės nei 10 μm nusėda, gilesniuose plaučių audiniuose (Keyuna et al., 2011).

Svarbu paminėti, jog nikelis lengvai pereina placentą, gali patekti į motinos pieną (Dart et al.,

2000). Tikslus nikelio genotoksiškumo mechanizmas nėra išaiškintas, tačiau laisvųjų radikalų susidarymas

gali būti įvardijamas kaip viena pagrindinių grandžių (Murawska et al., 2012). Laisvieji radikalai susidaro

Fentono reakcijos metu, kuriai būtini H2O2 ir Fe(II) ar Cu(II) jonai. Reakcijos produktas – reaktyvus

hidroksilo radikalas OH•-, kuris reaguoja su kitomis molekulėmis. Taip sukeliama nukleobazių, ribozės ir

deoksiribozės, oksidacija. Tai buvo patvirtinta sukūrus eksperimentinį modelį, kurio metu padidėjo 8-

hidroksi-2`-deoksiguanozino (8-OH-dG) koncentracija. Šis produktas gali būti promutagenu, sukeliančiu

kancerogeniškus pokyčius vaisiaus organizme (Valko et al., 2005; Murawska et al., 2012).

Ištirta, jog nikelio toksiškumas organizme pasireiškia glutationo atsargų išeikvojimu bei baltymų

sulfidrilinių grupių surišimu (Valko et al., 2005). Nikelis linkęs kauptis plaučiuose: tik apie 20-35 proc.

plaučiuose nusėdusio nikelio yra absorbuojama (Hoffmal et al., 2007). Klinikinis nikelio poveikis

pasireiškia kvėpavimo sistemos sutrikimais, kurie gali komplikuotis į astmą, plaučių fibrozę bei plaučių

edemą (Dart et al., 2000). Pagrindiniai nikelio organai taikiniai – inkstai ir kepenys (Keyuna et al., 2011).

15

Tiriant žmones, ilgą laiką dirbusius su nikeliu, nustatyta, jog nikelis sukelia negrįžtamą plaučių

pažaidą, anomalias plaučių funkcijas, inkstų vamzdelių nekrozę, anemiją bei nosies pertvaros opas. Taip

pat ištirta, jog nikelis skatina kalcio ir cinko jonų ekskreciją su šlapimu. Nikelis, inhibuodamas ATP‘azę,

gali sukelti neurologinius sutrikimus, konvulsijas ir komą (Keyuna et al., 2011).

1.2.2 Nikelis ir oksidacinis stresas

Dvivalentis nikelis sukelia oksidacinį stresą. Tiesa, lyginant su kitais sunkaisiais metalais, nikelio

poveikis ADF indukcijai nestiprus (toksiškumas didėjimo tvarka: Ni (II)<Cr (VI)<Cd (II)) (Schmid et al.,

2007). Nikelis dažniausiai nemutageniškas bakterinėse sistemose, jo mutageniškumas žinduolių sistemose

nedidelis, tačiau jis geba indukuoti DNR grandinių trūkius bei chromosomų aberacijas

heterochromatiniuose regionuose (Dally et al., 1997).

Pats nikelis nesukelia laisvųjų radikalų susidarymo iš deguonies, vandenilio peroksido ar lipidų

hidroperoksidazių; nepaisant to, dvivalenčio nikelio reaktyvumas deguonies dariniams gali būti

moduliuojamas chelatinimo reakcijų metu su histidino ar cisteino ligandais. Laisvieji radikalai, susidarę

dvivalenčio nikelio – tiolo komplekso reakcijos metu su molekuliniu deguonimi ir/ar lipidų

hidroperoksize, gali būti itin svarbūs dvivalenčio nikelio toksiškumo mechanizmui (Das et al., 2007).

ADF susiformavimas gali būti aiškinamas įvairiais būdais. Hidroksilo radikalai reaguoja su visais

ląstelės DNR komponentais. Oksidacinė pažaida pasireiškia dėl laikinų genetinės informacijos

modifikacijų. Dėl DNR pažaidos, formuojasi replikacijos klaidos, atsiranda transkripcijos bei signalo

perdavimo indukcija ir genomo nestabilumas. Tuo pasireiškia nikelio kancerogeniškumas (Keyuna et al.,

2011).

Norint išsiaiškinti nikelio gebėjimą sukelti oksidacinę DNR pažaidą, HeLa ląstelės buvo

inkubuotos su NiCl2 18h. DNR grandinių trūkiai buvo sukelti esant 250 μM ir didesnei koncentracijai (3

pav.) (Dally et al., 1997). Kito eksperimento metu, ištyrus žmogaus limfocitus paaiškėjo, jog oksidaciniai

DNR pokyčiai susiję su redukuoto GSH sumažėjimu. Būtent GSH dalyvauja laisvųjų radikalų

detoksikavimo reakcijose (Murawska et al., 2012).

16

Nikelio sukelta oksidacinė DNR pažaida taip

pat pastebėta eksperimentų su gyvūnais metu.

Aukštesnis 8-hidroksiguanino lygis žiurkės inkstuose

sumažėjo po vienkartinės nikelio acetato injekcijos

(Kasprzak et al., 1992). Nikelis gali inaktyvuoti

fermentus tiesiogiai, pavyzdžiui reakcijų su histidinu

ar cisteinu metu bei pakeisti metalų jonus metalo

fermentų struktūroje (Dally et al., 1997).

3 pav. Ni sukelta oksidacinė pažaida (Pagal H. Dally, 1998)

1.3 Cinko vaidmuo organizme

1.3.1 Cinko reikšmė organizmui

Periodinėje elementų lentelėje cinkas randamas II b grupėje, kartu su toksiškais metalais – kadmiu

ir gyvsidabriu. Tačiau cinkas nėra toksiškas žmogui. Eksperimentų su pelėmis metu nustatyta, kad cinko

LD50 – 3g/kg kūno svorio, o tai 10 kartų daugiau nei kadmio bei 50 kartų daugiau nei gyvsidabrio LD50

(Plum et al., 2010).

Cinkas būtinas elementas kiekvienam gyvam organizmui. Jis aktyvina daugiau nei 300 fermentų,

svarbus DNR replikacijoje, transkripcijoje bei baltymų sintezėje. Jungdamasis su daugeliu fermentų,

cinkas gali aktyvinti ląstelių antioksidacinę sistemą ir apsaugoti organizmą nuo oksidacinio streso

poveikio (Patra et al., 2011). Suaugusio žmogaus organizme yra maždaug 1,5-2,5 gramai cinko, kuris

randamas visuose organuose, audiniuose, skysčiuose (Benters et al., 1997). Maždaug 90 proc. viso cinko

randama skeleto raumenyse ir kauluose. Mažesni cinko kiekiai yra virškinamajame trakte, odoje,

kepenyse, inkstuose, smegenyse, plaučiuose, prostatoje bei kituose organuose (Frederickson et al., 2001).

Eukariotų ląstelėse yra dideli cinko kiekiai (maždaug 100 μM). Viduląstelinio cinko telkiniai

skirstomi į: (1) prie makromolekulių tvirtai prisijungęs cinkas; (2) dideli cinko kiekiai pūslelėse (pvz.

sinapsinės pūslelės neuronų terminaluose); (3) laisvo cinko telkinys; (4) cinkas susijungęs su

metalotioneinais. Visi telkiniai priklausomi nuo specifinio transportinio baltymo, cinką reguliuojančio

17

transkripcijos faktoriaus, metalotioneinų bei kitų cinkui jautrių baltymų, kurie gali surišti arba atlaisvinti

cinko molekules (Fukada et al., 2011). Ląstelėje 30-40 proc. cinko lokalizuota branduolyje, 50 proc.

citozolyje, o likusi dalis yra membranose (Vallee et al., 1993).

Didžioji dalis ląstelinio cinko surišta su baltymais ar kitais ląstelės komponentais: GSH, cisteinu,

histidinu ar difosfato molekulėmis. Laisvo cinko dalis ląstelėje palyginti maža (Oteiza et al., 2012).

Baltymuose cinkas gali būti struktūrinis elementas arba gali lokalizuotis atrankaus fermento

katalizės vietoje. Cinkas yra baltymo dalyje, reguliuojančioje baltymo-baltymo sąveiką, sąveikas tarp

baltymo ir kitų makromolekulių – pvz. DNR ar RNR (Andreini et al., 2006).

Cinkas itin svarbus ląstelės membranos vientisumui: kontroliuoja insulino veikimą ir gliukozės

koncentraciją kraujyje bei yra būtinas imuninės sistemos vystumuisi ir palaikymui. Cinkas reikalingas

kaulų ir dantų mineralizacijai, žaizdų gijimui, taip pat yra 70 skirtingų baltymų komponentas,

dalyvaujantis lipidų, angliavandenių ir baltymų metabolizme (Hotz et al., 2003).

Cinko trūkumas organizme siejamas su netinkama mityba, chroniškomis ligomis ar per dideliu

geležies ar vario vartojimu (Hotz et al., 2003). Cinko trūkumas pasireiškia prastu augimu ir vystymusi,

apetito stoka, dermatitu, alopecija, prastu žaizdų gijimu bei imuninės sistemos susilpnėjimu. (Bray et al.,

1990). Cinko trūkumas yra itin retas ir jį dažniausiai sukelia genetiniai sutrikimai (Roth et al., 1994).

Cinkas į žmogaus organizmą gali patekti trimis būdais: įkvepiant, per odą arba per virškinimo

traktą. Nuo to priklauso, kokia cinko dalis pateks į organizmą (Plum et al., 2010). Apsinuodijimai cinku

reti, dažniausiai jie susiję su netinkama mityba bei gėrimais, kurie buvo laikomi galvanizuotose talpyklėse

(Duncan et al., 1992).

1.3.2 Cinko antioksidacinės savybės

Chroniškas organizmo atsakas į ilgalaikį cinko poveikį pasireiškia padidėjusia metalotioneinų

sinteze, chroniškas cinko trūkumas pasireiškia padidėjusiu jautrumu oksidaciniam stresui (Valko et al.,

2005).

Cinkas yra inertiškas metalas, nedalyvaujantis oksidacijos – redukcijos reakcijose. Stiprūs cinko

antioksidaciniai efektai pirmą kartą pastebėti 80-ųjų pabaigoje ir buvo išaiškinti du pagrindiniai šio efekto

mechanizmai:

1. Baltymų sulfhidrilinių grupių apsauga prieš laisvuosius radikalus – šių grupių apsauga nuo

oksidacijos. Geriausiai ištirtas baltymas – δ-aminolevulinato dehidratazė, kuri katalizuoja pirolo

18

porfobilinogeno formavimąsi (Gibbs et al., 1985). Gibbs et al. pasiūlė tris modelius, kurie paaiškintų

stabilizavimo mechanizmą: pirmasis modelis vaizduoja tiesioginį cinko prisijungimą prie sulfhidrilinių

grupių. Antrasis – cinko prijungimą netoli sulfhidrilinių grupių. Trečiasis – cinko prijungimą prie kitos

baltymo pusės, taip garantuojant baltymo konformacinius pokyčius.

2. OH radikalų iš vandenilio peroksido susidarymo silpninimas, taip išvengiant ADF formavimosi.

Yra du galimi mechanizmai, apsaugantys nuo OH radikalų formavimosi. Pirmasis – metalo pašalinimas iš

rišančios vietos, naudojant didelio giminingumo ligandus. Antrasis – pašalinant redokso metalą iš

sujungimo vietos, pakeičiant jį panašiu redokso neaktyviu metalu, pavyzdžiui, varis keičiamas cinku

(Bray et al., 1990).

Ilgalaikio cinko vartojimo pavyzdys – metalotioneinų indukcija (Valko et al., 2005). Paskutinėmis

studijomis įrodyta, jog metalotioneinai rodo ryšį tarp vidinio ląstelės cinko ir ląstelės redokso būsenos.

Esant itin stipriam oksidaciniam stresui, keičiasi ląstelės redokso būsena ir iš metalotioneinų

atpalaiduojamas cinkas, kaip sulfidų ir disulfidų pasikeitimo rezultatas (Jiang et al., 1998).

Cinko trūkumas siejamas su didesne nei įprasta audinių oksidacine pažaida, įskaitant padidėjusią

lipidų, baltymų ir DNR oksidaciją (Valko et al., 2005).

Kai kurių eksperimentų su gyvūnais metu įrodyta, jog chroniškas arba ilgalaikis cinko netekimas

padaro organizmą jautresnį oksidacinio streso sukeltoms pažaidoms. Cinko trūkumas, susijęs su ADF

formavimusi, kliniškai aprašytas kaip plaučių pažaida, laisvųjų radikalų gamyba plaučių mikrosomose ir

mitochondrijose (Burke et al., 1985; Valko et al., 2005).

Vieno eksperimento metu buvo tiriami cinko trūkumo efektai žiurkių sėklidžių baltymams,

lipidams ir DNR po oksidacinės pažaidos (Oteiza et al., 1995). Buvo nustatytas mažesnis glutamino

sintetazės aktyvumas, didesnės baltymo koncentracijos ir mažesnis 8-OH-dG lygis. Oksidacinė pažaida

buvo aiškinama kaip padidėjusi ADF generecija ir/ar cinko valdomų antioksidantinių procesų

susilpnėjimas.

Yra žinoma, kad cinkas kovoja su švino jonais virškinamajame trakte, juos surišdamas

metalotioneinų transportiniais baltymais (Ryan-Harsham et al., 2005). Todėl galima daryti prielaidą, jog

cinkas pasižymi švino toksiškumą mažinančiomis savybėmis. Kai švinu pažeistoms žiurkėms buvo

suleista cinko, prieš tai buvęs kritinis SOD rodmuo tapo normalus, o ALAD inhibavimas buvo sustabdytas

(Batra et al., 1998).

Kito eksperimento metu švinu paveiktoms žiurkėms buvo duodama cinko su metioninu ir tiaminu.

Švino toksiškumo rodikliai tik dar labiau padidėjo (Flora et al., 1989; Flora et al., 1991). Tačiau nėra jokio

aiškaus įrodymo, kad cinkas gali veikti dvejopai – kaip antioksidantas ir kaip chelatinis junginys.

19

Cinkas taip pat veikia kaip antioksidantas smegenyse. Lyginant su kitais audiniais, smegenyse yra

sąlyginai daug cinko (Valko et al., 2005).

1.4 Sunkiųjų metalų įtaka baltymų sintezei

1.4.1 Metalotioneinų reikšmė metalų detoksikavime

Metalotioneinai (MT) – viduląsteliniai, mažos molekulinės masės, cisteinu praturtinti baltymai,

priklausantys metalus rišančių baltymų superšeimai (Coyle et al., 2002). MT aptinkami gyvūnų

organizmuose, aukštesniuose augaluose, eukariotiniuose mikroorganizmuose bei daugelyje prokariotų

(Kägi et al., 1979; Kojima et al., 1991). Šios unikalios biomolekulės patraukė biologų ir chemikų dėmesį

dėl savo nepaprastos cheminės struktūros – metalotioneinai sudaryti iš 61 amino rūgšties (nė vienos

aromatinės), iš kurių 20 – cisteino liekanos. Cisteino liekanos sąlygoja MT savybę prijungti sunkiųjų

metalų jonus (Curtis et al., 1999). Metalotioneinai suriša metaboliniams procesams trikdančius

sunkiuosius metalus ir juos atskiria. Švinas ir nikelis sukelia apsauginių baltymų sintezę (Jeremy et al.,

2007). Šie baltymai dalyvauja viso organizmo metalų metabolizme (David et al., 2009).

Kol kas nėra išaiškintas tikslus MT sintezės mechanizmas, tačiau bendru sutarimu manoma, jog

metalų indukuojamas transkripcijos veiksnys (MTF-1) svarbiausias MT transkripcijoje. MTF-1 šešių

cinko „pirštų“ DNR rišantis domenas funkcionuoja kaip cinką fiksuojantis domenas ir visi šeši skirtingi

„pirštai“ gali aktyviai dalyvauti moduliuojant MTF-1 perkėlimą į baltymą bei surišant MT-1 geno

aktyvatorius (Li et al., 2006).

Šiuo metu metalotioneinai skirstomi į 15 skirtingų šeimų (Binz et al., 1999). Žinduolių

metalotioneinai – vienos grandinės polipeptidai. Aminorūgščių liekanos išsidėsto keliais galimais

variantais: cys-x-cys; cys-x-y-cys; cys-cys, kai x ir y – nėra cisteino amino rūgštis (Coyle et al., 2002).

Metalotioneinai sudaryti iš dviejų subvienetų: α-domeno, kuris gali prijungti keturis dvivalenčio metalo

atomus ir mažiau stabilaus β-domeno, kuris gali prijungti vos tris (Kägi et al., 1979). 4 pav. vaizduojama,

kaip MT prisijungia metalų jonus (Curtis et al., 1999).

Nors MT atrasti daugiau nei prieš 50 metų, pagrindinės jų funkcijos ir paskirtis vis dar

nagrinėjami. Norint išsiaiškinti pagrindines MT fiziologines funkcijas, buvo naudojamos keturios

skirtingos sistemos: (1) gyvūnai, kuriems buvo švirkščiami chemikalai, mažinantys MT kiekį; (2) ląstelės,

galinčios augti ir prisitaikyti esant dideliam toksinų kiekiui; (3) ląstelės su MT genu ir (4) MT

20

transgeniniai gyvūnai. Paskutinių dviejų sistemų panaudojimu įrodyta, jog MT būtini surišant sunkiųjų

metalų jonus ir detoksikuojant organizmą (Curtis et al., 1999). Naudojant žuvų (Cyprinus carpio) epitelio

ląsteles buvo nustatytas apsauginis MT poveikis, kai ląstelės buvo paveiktos kadmiu, o vėliau gydomos

menadionu (Wright et al., 2000). Drosophila melanogaster turi keturis MT genus, kurie skatinami to

paties MTF-1 faktoriaus. Tikslingo mutageninio poveikio metu pastebėta, kad visi keturi genai dalyvauja

sunkiųjų metalų homeostazėje ir detoksikavime (Egli et al., 2006). MT ir kadmio koncentracijų ryšys

inkstuose buvo nustatytas laukinių gyvūnų – slankų ir laukinių pelių – organizmuose (Alhama et al.,

2006).

MT – gausiausia cinko saugykla. MT dažniausiai suriša cinko jonus, tačiau gali surišti ir Cu1+/2+

;

Cd2+

; Hg2+

; Pb2+

; Fe2+

; Co2+

). MT sudaryti iš cinko telkinių sričių, kurios pasižymi kintamu rišamuoju

efektu, todėl MT yra pagrindiniai laisvo ląstelinio cinko reguliuotojai. Cisteino tiolatai metalotioneinuose

suriša cinką tetraedrine struktūra, susidaro Zn3S9 bei Zn4S11 sritys (Curtis et al., 1999). Cinkas

natūraliomis sąlygomis pirmiausia surišamas β-domene, todėl tiksliai galima nustatyti atpalaiduojamo

cinko kiekį (Palumaa et al., 2005).

Didelis metalotioneinų cisteino liekanų skaičius reikšmingas oksidacinio streso metu. MT veikia

kaip viduląstelinė nukleofilinė „talpykla“, kuri „sugauna“ elektrofilus, alkilinančius reagentus bei

laisvuosius radikalus (Lazo et al., 1995). Oksidacinio streso metu sudėtinės MT cisteino liekanų dalelės

gali būti oksiduojamos, o cinko jonų atpalaidavimas reikšmingas apsaugant nuo oksidacinės pažaidos

(Maret et al., 1998).

4 pav. Metalotioneinų struktūra (pagal Curtis D. Klassen)

21

Aptiktos kelios metalotioneinų izoformos: žinduolių MT-1 ir MT-2 randama visuose organuose,

MT-3 tik smegenyse, o MT-4 gausu audiniuose. MT-1 ir MT-2 izoformos sužadinamos daugelios streso

faktorių bei gliukokortikoidų, citokinų, reaktyvių deguonies formų ir metalų jonų. MT-3 ir MT-4 į šiuos

veiksnius nereaguoja. Daugėja įrodymų, kad žinduolių MT-1 ir MT-2 izoformos susijusios su cinko

homeostaze bei apsauginiu poveikiu prieš sunkiuosius metalus (Rigby et al., 2006). Tyrimų metu

nustatyta, kad MT-3 izoforma cinko ir kadmio jonus suriša silpniau nei MT-2, tačiau MT-3 pasižymi

didesniu metalų surišimo našumu bei plastiškumu. Mažesnė metalų surišimo trauka gali būti susijusi su

heksapeptido bei rūgštiniais intarpais (Palumaa et al., 2005).

Didžiausias metalotioneinų kiekis organizme – inkstuose, kepenyse, žarnyne ir kasoje (Coyle et

al., 2002). Kepenų MT kiekiai skirtinguose organizmuose skiriasi: žmonių, šunų, kačių, kiaulių MT lygis

400-700 μg/g kepenų; beždžionių, karvių ir avių apie 200 μg/g kepenų, o triušių ir graužikų vos 2-10 μg/g

kepenų (Henry et al., 1994).

MT taip pat gali būti naudojami kaip biologiniai žymenys nustatant sunkiųjų metalų buvimą

aplinkoje. Ankstyva MT indukcija žymėtais metalais reikalinga norint aptikti aplinkai toksiškus metalus

(Cd, Hg, Cu) (Dabrio et al., 2002). Atrinkti sunkieji metalai, pvz. Cd, Cu ar Hg – itin geri MT biosintezės

induktoriai, dėl to MT dažnai pasirenkami kaip biologiniai žymenys vandens ekosistemoje (Alhama et al.,

2006).

1.4.2 Toksiškų metalų įtaka genų raiškai

Švinui ir nikeliui galima pritaikyti tris pagrindinius, kancerogeniškumą aiškinančius,

mechanizmus: oksidacinis stresas, DNR pokyčius bei signalo perdavimo blokavimas (Beyersmann et al.,

2008). Kancerogeniški metalai (pavyzdžiui, nikelis, vanadis, chromas) gali paskatinti redokso reakcijas

biologinėse sistemose. Tyrimų in vivo ir in vitro metu nustatyta, kad jie skatina reaktyvių deguonies ir

azoto formų susidarymą žinduolių ląstelėse.

5 pav. schemoje galima matyti, kad oksidacinio streso metu susidarę hidroksilo radikalai sukelia

oksidacinę lipidų, baltymų ir DNR pažaidą (Patra et al., 2011).

Nustatyta, kad Pb(NO3)2 sukelia DNR pažaidą, nepriklausančią nuo švino dozės, o PbCl2

sukeliamos mutacijos – tiesiogiai proporcingos šio sunkiojo metalo dozei (Danadevi et al., 2003).

Valverde (Valverde et al. 2001) iškelta hipotezė, kad švinas jungiasi prie baltymų, kurie sąveikauja su

22

DNR, buvo greitai paneigta mokslininko Ciesiolka (Ciesiolka et al., 1992), įrodžiusio, kad švinas,

prisijungęs prie RNR, sukelia molekulės trūkius.

5 pav. Hidroksilo radikalų poveikis ląstelei (Pagal R.C. Patra)

Švino genotoksiškumą sąlygoja du mechanizmai – pro-oksidacinio/anti-oksidacinio balanso

ardymas bei sąveikavimas su DNR reparacijos sistemomis (McNeill et al., 2007). Švinas giminingas

cinkui, todėl sugeba išstumti cinko molekules iš jų prisijungimo vietų baltymuose (Huang et al., 2004).

Eksperimentų metu gyvūnams į papilvę švirkščiant nikelio druskų tirpalus, pastebėta chromosomų

pasikeitimų. Žinduolių ląstelėse minimolinės dvivalenčio nikelio jonų koncentracijos sukėlė DNR

pažaidą, chromosomų bei seserinių chromatidžių pasikeitimus. Taip pat nikelis inhibuoja DNR reparaciją

ir stiprina įvairių mutagenų poveikį (Beyersmann et al., 2008).

Esant net mažai mikromolinei koncentracijai, švinas sugeba inhibuoti apirimidininę endonukleazę

(APE1) izoliuotame baltymo testo modelyje bei kultūrinėse AA8 ląstelėse. Tai sąlygoja pirimidino

kaupimąsi DNR bei MMS indukuotą mutageniškumą (McNeill et al., 2007).

Naudojant ląstelių sistemas pastebėta, kad švinas sugeba sumažinti transkripcijos faktorių TFIIIA

ir Sp1 DNR surišimą (Huang et al., 2004). Tačiau toks poveikis nepastebėtas tiriant cinko turinčius Fpg ir

XPA baltymais (Asmuss et al., 1997).

Oksidacinis

fosforilinimas Aplinkos

faktoriai 0O2

1-

Superoksidazės

dismutazė

H2O2

Katalazė

Peroksidazė

H2O+O2

H2O Fe (II); Ni (II)

*OH

Lipidų

peroksidacija Baltymų

pažaida

DNR

pažaida

Aktyvūs

fagocitai

23

Protaminai (baziniai baltymai su DNR) gali moduliuoti DNR pažaidą. Sunkieji metalai, ypač

Ni(II), linkę prisijungti prie protamino 2. Šio peptido N-gale egzistuoja Arg-Thr-His aminorūgščių seka.

Būtent ši seka dažnai gali tapti „spąstais“ sunkiesiems metalams. Ni (II) prie protamino 2 prisijungia itin

stipriai ir specifiškai. Norėdami išnagrinėti šį ryšį, Bal et al (Bal et al., 1997) sintezavo baltymą, sudarytą

iš 15 aminorūgščių (HP1-15), kuris N-gale turėjo identišką žmogaus protamino-2 aminorūgščių seką. Buvo

pastebėta, jog peptidas Ni(II) prisijungė itin stipriai, o sukurtas HP1-15-Ni (II) kompleksas gebėjo aktyvuoti

deguonį bei H2O2. Sukurtas kompleksas aktyviau nei vienas sintetintas peptidas jungėsi prie DNR. Po

komplekso susidarymo nikelis tapo aktyvus ir galėjo ardyti DNR grandinę. Taip pat naujo komplekso

poveikis galėjo paskatinti laisvųjų radikalų susidarymą.

Nikelis stimuliuodamas signalinius kelius, aktyvina profibrotinius bei hipoksinio atsako baltymus:

interleukinus (IL)-8, IL-6; ciklooksigenazę – 2. Šių genų indukcija gali sąlygoti patologinius nikelio

efektus bei vėžį (Ding et al., 2009). Nikelis, esant geležies jonams, geba paveikti rekombinantinių baltymų

JHDM2A ir ABH3 aktyvumą (Chervona et al., 2012).

2. MEDŽIAGOS IR METODAI

2.1 Tyrimo objektas ir reagentai

Mokslinius tyrimus atlikti, laikantis Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo

įstatymo 14 straipsnio [Žin., 1997, Nr. 108-2728], Valstybinės veterinarijos tarnybos 2008 m. gruodžio 18

d. įsakymo Nr. B1-639 „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo

veterinarinių reikalavimų” [Žin., 2009, Nr. 8-2870] bei 1999 sausio 18 d. įsakymo Nr. 4-16 „Dėl

laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams” [Žin., 1999, Nr. 49-1591], Lietuvos

Respublikos Sveikatos apsaugos ministro 1999 m. Balandžio 12 d. Įsakymo Nr. 155 „Dėl geros

laboratorinės praktikos taisyklių neklinikinių (eksperimentinių) laboratorijų tyrimams” [Žin. 1999, Nr. 35-

1053] bei Europos etikos komiteto nustatytų reikalavimų darbui su laboratoriniais gyvūnais. Lietuvos

laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos 2012 02

09 posėdžio protokolo Nr. 1 išvada gautas leidimas darbui su laboratoriniais gyvūnais (leidimo Nr. 0221)

(žr. Priedas Nr. 1).

Eksperimentams naudotos iš LSMU Veterinarijos akademijos vivariumo atsivežtos 4-6 savaičių

nelinijinės baltosios laboratorinės pelės, kurių svoris buvo 20-25 gramai. Laboratorijoje pelės buvo

laikomos karantino sąlygomis vieną savaitę. Patelės ir patinai laikyti atskirai, skirtinguose narvuose.

24

Pelėms buvo sudarytos optimalios sąlygos: patalpų temperatūra ~20˚C, santykinė oro drėgmė 55±10 proc.,

natūralus šviesos režimas. Pelės buvo šeriamos pilnaverčiu maistu, girdomos vandentiekio vandeniu.

Šieno ir medienos drožlių pakratai buvo kasdien keičiami.

Eksperimentams naudoti šie reagentai: Tris, tiobarbituro rūgštis (TBR), ditiotreitolis (DTT), L-

aminorūgščių mišinys – firmos „Sigma“ (JAV); etilendiamintetraacetatas (EDTA), N-2-

hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfo rūgštis (HEPES), sacharozė, fenilmetilsulfonilfluoridas (PMSF), 5,5-

ditiobisnitrobenzoinė rūgštis (DTNB) – firmos „Serva“ (Vokietija); adenozino 5'-trifosfatas (ATP),

guanozino 5'-trifosfatas (GTP), 2-merkaptoetanolis, kalio chloridas (KCl), magnio chloridas (MgCl2),

magnio acetatas (Mg(CH3COO)2), druskos rūgštis (HCl), fosforo rūgštis (H3PO4), natrio fosfatas – firmos

„Merck“ (Vokietija); fosfokreatinkinazė, fosfokreatinas – firmos „Reanal“ (Vengrija); toluenas, natrio

selenitas (Na2SeO3), natrio chloridas (NaCl), kadmio chloridas (CdCl2), cinko sulfatas (ZnSO4) – firmos

„Lachema“ (Čekija); trichloracto rūgštis (TChA), natrio acetatas (CH3COONa), n-butanolis, fenolis,

izopropanolis, chloroformas – Rusija. [14

C]-leucinas (specifinis radioaktyvumas – 8880 MBq/mmol),

chlorelos [14

C]-baltymų hidrolizatas (specifinis radioaktyvumas – 1,48 GBq/mg C atomo) – (Čekija).

Tirpalams gaminti naudojotas dejonizuotas vanduo bei fiziologinis tirpalas.

2.2 Sunkiųjų metalų poveikio laboratorinėms pelėms tyrimo modelis

Vertinant sunkiųjų metalų poveikį, naudota LD50 – vidutinė mirtina dozė. LD50 – mažiausia

medžiagos koncentracija, kuria paveikus žūva pusė (50 proc.) bandomųjų gyvūnų. Žinant vidutines

mirtinas dozes, galima korektiškai planuoti tyrimus, išvengiant sunkiųjų metalų perdozavimo. Taip pat

žinant šią reikšmę, galima palyginti skirtingų medžiagų toksiškumą. Norint nustatyti naudojamų medžiagų

vidutines mirtinas dozes, į tris skirtingus narvelius patalpinta po 4 peles. Kiekvienai jų į pilvo ertmę

sušvirkščiama atitinkamos metalo druskos tirpalo. ZnSO4 ir NiCl2 druskos tirpinamos fiziologiniame

tirpale, o Pb(CH3COO)2 – bidistiliuotame vandenyje.

Po 24 valandų vertinamas išgyvenusių ir kritusių pelių santykis. Remiantis mokslinėje literatūroje

aprašytomis nustatytomis švino LD50 reikšmėmis žiurkėms, tyrimas pradėtas nuo 50 mg švino

koncentracijos. Suleidus šią dozę, visos pelės liko gyvos, todėl koncentraciją padidinta iki 100 mg. Šioje

grupėje išgyveno pusė pelių (1 lentelė). Norint nustatyti, kokia koncentracija sukelia visų pelių žūtį, dozę

padidinta iki 200 mg. Šioje eksperimentinėje grupėje visos pelės neišgyveno.

25

1 lentelė. Pelių išgyvenamumo priklausomybė nuo Pb, Ni ir Zn dozės

Švinas Nikelis Cinkas

Dozė

(mg/kg)

Mirtingumas

Dozė

(mg/kg)

Mirtingumas

Dozė

(mg/kg)

Mirtingumas

50 mg

100 mg

200 mg

0/4

2/4

4/4

10 mg

11 mg

12 mg

1/4

0/4

4/4

5,15 mg

10,3 mg

20,6 mg

0/4

2/4

4/4

Nustatant nikelio LD50, eksperimentas pradėtas nuo 11 mg koncentracijos remiantis literatūros

duomenimis. Šioje eksperimentinėje grupėje visos pelės liko gyvos. 12 mg nikelio koncentracija buvo

didžiausia ir lėmė visų pelių žūtį. Dozę sumažinus iki 10,5 mg, neišgyveno 1 pelė (1 lentelė)

Vertinant cinko LD50, tyrimas pradėtas nuo 5,15 mg dozės. Šioje grupėje visos pelės liko gyvos.

20,6 mg koncentracija sukėlė visų pelių žūtį, o dozę sumažinus iki 10,3 mg eksperimentinėje grupėje

išgyveno 2 pelės.

Švino ir cinko grupėje kritusių ir išgyvenusių pelių santykis buvo 50 proc., todėl tirpale ištirpusio

metalo kiekis (100 mg) laikytas vidutine mirtina doze. Kadangi nikelio grupėje kritusių ir išgyvenusių

pelių santykis nebuvo vienodas (50 proc.), LD50 buvo apskaičiuojama pagal formulę (Jing-Hui, Marsh,

1988):

lgLD50=lg DN – δ(Ʃ Li-0,5)

DN – eksperimente naudota maksimali metalo druskos dozė;

δ – panaudotų dozių santykio logaritmas;

Li – kritusių ir visų pelių santykis;

Ʃ Li skirtingų Li reikšmių suma.

Nustatytos tokios vidutinės mirtinos dozės:

• Pb(CH3COO)2 – 100 mg švino vienam kilogramui kūno masės;

• NiCl2 – 11,25 mg nikelio vienam kilogramui kūno masės;

• ZnSO4 – 10,3 mg cinko vienam kilogramui kūno masės.

26

Tyrimo metu nustatytos vidutinės mirtinosios dozės leido planuoti, kokias sunkiųjų metalų dozės

bus naudojamos kituose eksperimentuose. 2 lentelėje pateiktos visos darbe naudotos sunkiųjų metalų

tirpalų dozės.

Švino, nikelio ir cinko jonų poveikiui įvertinti naudotas ūmaus 14 dienų intoksikavimo modelis. 14

dienų iš eilės pelėms į pilvo ertmę buvo švirkščiami vienodi tūriai sunkiųjų metalų druskų tirpalų.

Tiriamosios pelės buvo suskirstytos į šešias grupes (2 lentelė).

2 lentelė. Eksperimentinės pelių grupės

1 gr. Pb(CH3COO)2 0,1 LD50 10 mg Pb/ kg

2 gr. ZnSO4 0,15 LD50 1,56 mg Zn/ kg

3 gr. ZnSO4 ir po 20 minučių Pb(CH3COO)2 Anksčiau nurodytos dozės

4 gr. NiCl2 0,1 LD50 1,12 mg Ni/ kg

5 gr. ZnSO4 ir po 20 minučių NiCl2 Anksčiau nurodytos dozės

6 gr. Fiziologinis tirpalas

Po 14 dienų periodo pelės buvo anestezuotos, joms atlikta cervikalinė dislokacija. Tyrimams

naudotos pelių kepenis.

Nustatant sunkiųjų metalų poveikį metalotioneinų sintezei taip pat pasirinktas vienkartinio

intoksikavimo modelis ir pelėms į pilvo ertmę po vieną kartą švirkšti anksčiau minėti tirpalai.

Pb(CH3COO)2 pelės buvo veikiamos 8 valandas, NiCl2 – 24 h. Praėjus šiam laikui pelės anestezuotos ir

dislokuotos. Tiriamosios pelės buvo suskirstytos į 6 grupes (3 lentelė).

3 lentelė. Vienkartinio intoksikavimo pelių grupės

1 gr. Pb(CH3COO)2 0,5 LD50 50 mg Pb/ kg

2 gr. ZnSO4 0,15 LD50 1,56 mg Zn/ kg

3 gr. ZnSO4 ir po 20 minučių Pb(CH3COO)2 Anksčiau nurodytos dozės

4 gr. NiCl2 0,5 LD50 5,62 mg Ni/ kg

5 gr. ZnSO4 ir po 20 minučių NiCl2 Anksčiau nurodytos dozės

6 gr. Fiziologinis tirpalas

27

2.3 Baltymų sintezės greičio nustatymas

Tiriant baltymų sintezės greitį pelėms į pilvą švirkšta [14

C] arginino (7,4 MBq)/1 kilogramui kūno

masės). Išankstinių eksperimentų metu buvo nustatyta, kad aminorūgštys 2 valandas tolygiai įjungiamos į

naujai sintetinamus peptidus, todėl baltymų sintezės greičio matavimuose aminorūgšties įjungimo trukme

pasirinktas 1 valandos laikotarpis.

Kai po radioaktyvios aminorūgšties sušvirkštimo praėjo valanda, peles užmigdytos anestetiku

narkotanu ir dislokuotos. Eksplantuotos pelių kepenys tiksliai pasvertos, atšaldytos ant ledo ir audinys

susmulkintas smulkintuve, pridėjus 3 tūrius (lyginant su kepenų mase) buferinio tirpalo (50 nM Tris-HCl

(pH 7,6), 5 mM MgCl2, 60 mM KCl, 10 mM β-merkaptoetanolis, 250 mM sacharozė). Gautas kepenų

ekstraktas 15 minučių centrifuguotas 15000xg K-24 centrifūgoje, nufiltruotas per keturgubą sterilios marlės

sluoksnį ir gauta pomitochondrinio supernatanto frakcija.

Norint suardyti aminoacil-tRNR, 0,1 ml supernatanto sumaišyta su 0,5 ml 10 proc. TchA tirpalo ir

gautas mišinys 10 minučių inkubuotas 90˚C temperatūroje. Paruoštas mėginys 20 minučių šaldytas ledo

vonioje, susiformavus nuosėdoms, jos surinktos ant nitroceliuliozės filtrų „Synpor Nr. 3“, praplautos 5

proc. TchA tirpalu. Baltymų sintezės greičiui apibūdinti, skysčio scintiliaciniu skaitikliu „Delta 300“

matuotas TchA netirpių nuosėdų radioaktyvumas.

Baltymų koncentracijai nustatyti naudotas Beer/ Lambert metodas, spektrofotometriškai matuojant

sugertį ties 260 ir 280 nm banga. Baltymų sintezės greitis apskaičiuotas: imp [14

C]-arginino/min/mg

baltymo.

2.4 Metalotioneinų koncentracijos nustatymas

Metalotioneinų koncentraciją nustatyta pagal Peixoto metodiką. Pasvertos kepenys susmulkintos

smulkintuvu, pridėjus keturis tūrius buferinio tirpalo (sudaryto iš 20 mM Tris – HCl (pH 8,6), 0,5 M

PMSF (proteazių slopiklis), 0,01 proc. β-merkaptoetanolio (merkapto grupių reduktorius). Gautas

ekstraktas 30 minučių centrifuguotas Beckman J2-21 centrifuga 17 000 x g. Gautas supernatantas buvo

naudojamas metalotioneinų koncentracijai nustatyti.

1 ml supernatanto sumaišyta su 1,05 ml šalto absoliutaus etanolio ir 80 μl chloroformo. Gautas

mišinys 10 minučių centrifuguotas K-24 centrifuga 6000 x g. Po centrifugavimo nusiurbta supernantanto

28

frakciją, į kurią pridėtas trigubas tūris šalto (-20 ˚C) etanolio, 1 valandą laikyta -20 ˚C temperatūroje. Po to

10 minučių centrifuguota K-24 centrifuga ir surinktos nuosėdos praplautos etanolio ir 1 proc. chloroformo

mišiniu. Gautas tirpalas 10 minučių centrifuguotas 6000 x g.

Gautos nuosėdos ištirpintos 0,15 ml 0,25 M NaCl ir 0,15 ml 1N HCl tirpale, nuosėdoms ištirpus,

įpilta 4,2 ml kambario temperatūros 2 M NaCl (pH 8,0) ir centrifuguota 5 minutes. Vėl nusiurbta

supernatanto frakciją ir spektrofotometriškai nustatyta metalotioneinų koncentraciją, matuojant sugertį ties

412 nm banga. Metalotioneinų koncentracija išreikšta μg vienam gramui kepenų.

2.5 Duomenų patikimumo vertinimas

Eksperimentų metu gauti duomenys analizuoti naudojant SPSS 20 (SPSS Inc., Čikaga, JAV)

statistinį paketą. Tyrimų rezultatai pateikti kaip vidurkiai (M) ± pasikliautinieji intervalai (PI 0,95). Norint

įsitikinti, kad vidurkių lygybės hipotezė teisinga, taikytas Stjudento t testas. Skirtumai traktuoti kaip

statistiškai reikšmingi, jeigu reikšmingumo lygmuo p<0,05.

Grafiniam gautų rezultatų išreiškimui naudota MS Excel (Microsoft, JAV) programa.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Metalų įtaka baltymų sintezei

Nagrinėtoje literatūroje teigiama, jog vienas pagrindinių švino bei nikelio jonų taikinių – baltymai.

Švinas ir kiti sunkieji metalai linkę jungtis prie sulfhidrilinių grupių (SH). Švinas su cisteino SH grupėmis

formuoja nestabilius kompleksus, inhibuoja funkcines SH grupes kai kuriuose fermentuose: ALAD,

superoksido dismutazėje (SOD), katalazėje (CAT), gliutationo peroksidazėje (GPx), gliukozės 6-

fosfatdehidrogenazėje (G-6PDH) (Patra et al. 2011). Pb pakeičia membranos baltymus, suformuoja DNR

aduktus, įrodyta, jog gali pakeisti antioksidacinių baltymų aktyvumą (Mudipalli et al., 2007; Flora et al.,

2008). Nikelis pažeidžia branduolio baltymus, slopina fermentus, sukelia DNR grandinės trūkius (Coyle et

al., 2002). Nikelis ir švinas suardo antioksidantų balansą ląstelėje, sukelia baltymų, DNR, lipidų pažaidas,

geba pakeisti cinko jonus ląstelėje (Mudipalli et al., 2007).

29

Eksperimentų metu stengtasi išsiaiškinti, ar švino bei nikelio sukeltas oksidacinis stresas turi įtakos

baltymų sintezės (transliacijos) sistemoje. Vertinti du aspektai: švino ir nikelio jonų poveikis transliacijai

bei cinko jonų gebėjimas apsaugoti baltymus nuo sunkiųjų metalų poveikio.

6 pav. Baltymų sintezės greitis pelių kepenyse po 14 dienų Pb(CH3COO)2 , ZnSO4 ir/arba NiCl2 tirpalų

švirkštimo. Baltymų sintezė kontrolinių pelių kepenyse po 14 d. (335 imp.[

14C]-arginino/min./mg baltymo) prilyginta 100 proc. n=6-8; * –

statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant su kontrolinių pelių grupe.

6 pav. pateiktuose rezultatuose matyti, jog po 14 dienų Pb(CH3COO)2 tirpalo švirkštimo kasdien

baltymų sintezė nepakito – liko kontrolės dydžio. Tokie pat rezultatai gauti atliekant tyrimą su cinku –

cinko jonai įtakos baltymų sintezei neturėjo. Tačiau ZnSO4, suleistas 20 minučių prieš Pb(CH3COO)2

tirpalą, statistiškai nepatikimai padidino baltymų sintezę.

Po 14 dienų NiCl2 švirkštimo baltymų sintezės greitis padidėjo 57 proc. (p<0,05), lyginant su

kontroline grupe. ZnSO4 tirpalas, sušvirkštas 20 minučių prieš NiCl2, sumažino nikelio poveikį

transliacijai 33 proc.

Daugelyje literatūros šaltinių nurodoma, jog švinas gali aktyvinti arba slopinti baltymų sintezę,

priklausomai nuo dozės bei efekto laiko. Švino aktyvumas taip pat priklauso nuo G6PD aktyvumo bei

oksidacinio streso ląstelėje. Amerikiečių mokslininkai 15 savaičių triušių patinams kartą per savaitę

švirkštę švino acetato tirpalą pastebėjo, jog baltymų sintezė inkstuose bei kepenyse reikšmingai padidėjo

(Kanitz et al., 1999). Kepenyse suaktyvėjusi baltymų sintezė siejama su metalotioneinų – apsauginių

baltymų – sintezės aktyvumu (Bouta et al., 1996). Nustatyta, jog švinas aktyvina mažos molekulinės

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Pb Ni Zn Zn+Pb Zn+Ni

Bal

tym

ų s

inte

zės

gre

itis

(p

roc.

)

30

masės jį jungiančius baltymus (analogiškus į metalotioneinus) tam tikrose vietose – eritrocituose,

plaučiuose, inkstuose, kepenyse, žarnyne (Gillis et al., 2012).

Kepenyse švinas randamas branduolyje, dauguma švino prisijungia prie branduolio membranos

baltymų, viduląstelinis švinas siejamas su histono frakcijomis, o šviną rišančių baltymų nebuvo rasta

kepenų ląstelių citoplazmoje (Gillis et al., 2012). Vienas pagrindinių ląstelės apsauginių mechanizmų,

patekus sunkiajam metalui – specifinių Hsp genų sintezė. Sintezė suaktyvėja, kai ląstelėje susidaro

oksidacinis stresas ar patenka sunkiųjų metalų jonų (Geraci et al., 2004).

Mūsų tyrimo metu gautą rezultatą, jog švinas neturėjo reikšmingos įtakos baltymų sintezei, galima

sieti su ląstelių antioksidacinės apsaugos sistemos adaptacija prieš toksinį švino poveikį. Esant

kompleksiniam švino ir cinko poveikiui, pastebėtas transliacijos suaktyvėjimas gali būti aiškinamas kaip

cinko jonų gebėjimas aktyvinti metalotioneinų – apsauginių baltymų – sintezę. Pagal R.C. Patra et al.

cinko ir švino konkurencija dėl vietos aktyviajame centre sąlygoja sumažėjusią švino absorbciją bei

sunkiojo metalo toksiškumą, cinkas mažina švino koncentraciją kraujyje, kepenyse ir inkstuose. Švino

poveikio metu sulėtėjusi baltymų sintezė gali būti siejama su sumažėjusiu DNR kiekiu bei aminorūgščių

panaudojimu (Moussa et al., 2008).

Literatūroje nagrinėjamas nikelio jonų poveikis baltymų sintezei prieštaringas. Vienos studijos

metu žiurkėms girdant vandeninį nikelio tirpalą pastebėtas reikšmingas bendrų baltymų koncentracijos

sumažėjimas (Sidhu et al., 2005). Kaip ir kiti sunkieji metalai, nikelis patekęs į organizmą skatina

apsauginių baltymų sintezę. Nikelis sutrikdo normalią baltymų funkciją, sukeldamas transkripcijos

faktoriaus HIF-1α aktyvinimą bei vienintelis iš sunkiųjų metalų sugeba paveikti chromatino struktūrinius

baltymus. Aktyvintas HIF-1α skatina visus transkripcijos etapus, dėl to paveikus nikeliu, gali aktyvėti

baltymų sintezė. Tyrimo metu gautas rezultatas, jog nikelis reikšmingai padidino baltymų sintezę, gali būti

siejamas su metalotioneinų sintezės aktyvinimu.

Esant kompleksiniam cinko ir nikelio poveikiui, baltymų sintezė padidėjo ne taip žymiai. Galima

daryti prielaidą, jog esant cinko ir nikelio konkurencijai, cinkas užėmė daugiau vietos aktyviajame centre,

todėl buvo iššaukta ne tokia intensyvi MTs sintezė.

Nikelis aktyvuoja C-Myc transkripcijos faktorių – baltymą, kuris kontroliuoja 15 proc. žmogaus

genų raiškos. Ištyrus žmogaus bronchų epitelio ląsteles buvo pastebėta, jog suaktyvėjo C-Myc mRNR

sintezė, tačiau nikelis nepadidino baltymo stabilumo (Keyuna at al., 2011). Studijų metu įrodyta, jog

nikelis ląstelėje sukelia baltymų denatūraciją, DNR grandinių trūkius ir pažaidas, chromosomų aberacijas.

Vienas pagrindinių ląstelės apsauginių mechanizmų prieš nikelio kancerogeniškumą ir sukeltą oksidacinį

stresą – suaktyvėjusi apsauginių baltymų raiška (Coyle et al., 2002).

31

Apibendrinant mūsų tyrimo metu gautus rezultatus galima daryti išvadą, jog nikelis po 14 poveikio

dienų skatino baltymų sintezę, švinas statistiškai reiškmingo pokyčio baltymų sintezei neturėjo, o cinkas

konkuravo su abiem sunkiaisiais metalais ir lėmė aktyvinamą apsauginių baltymų sintezę.

3.2 Metalų poveikis metalotioneinų sintezei pelių kepenyse

Tyrimo metu išsiaiškinta, jog sunkieji metalai skirtingai veikia baltymų sintezę: nikelis skatina,

švinas – neturi poveikio. Tolesnių eksperimentų metu bandyta išsiaiškinti švino, nikelio ir cinko įtaką

specifinių apsauginių baltymų – metalotioneinų sintezei. Tirtas švino ir nikelio poveikis bei kompleksinis

cinko ir vieno iš metalų poveikis.

Metalotioneinai – mažos molekulinės masės, daug cisteino turintys apsauginiai baltymai, gebantys

surišti sunkiųjų metalų jonus (Zou et al., 2009). Švinas prie MT jungiasi ex vivo sąlygomis (Zou et al.,

2009; Wallkes et al., 2004) ir MT kiekis gali padidėti prisijungus sunkiajam metalui (Ikebuchi et al.,

1986). Šis teiginys patvirtintas studijų metu – pelėms sušvirkštus švino tirpalo ir po 24h išmatavus MT

sintezę jų inkstuose, pastebėta, jog sintezė žaibiškai padidėjo kelis kartus (Zou et al., 2009). MT taip pat

sugeba surišti laisvuosius radikalus. Metalotioneinai laikomi didžiausia cinko jonų saugykla organizme,

atpalaiduodami cinko jonus, MT sugeba stabilizuoti ląstelės membraną (Nemec et al., 2009).

3.2.1 Kompleksinis švino ir cinko poveikis metalotioneinų sintezei

7 pav. pateiktuose rezultatuose matyti, jog po vienkartinės Pb(CH3COO)2 injekcijos,

metalotioneinų sintezė suaktyvėjo 16 proc. (p<0,05). Po 14 dienų švino poveikio, MT sintezė suaktyvėjo

42 proc. (p<0,05). Po vienkartinės ZnSO4 injekcijos, MT koncentracija pelių kepenyse padidėjo 42 proc.

(p<0,05), lyginant su kontroline grupe, tačiau po 14 dienų to paties tirpalo poveikio, MT sintezė padidėjo

vos 15 proc. (p<0,05).

32

7 pav. MT koncentracija po Pb(CH3COO)2 ir/arba ZnSO4 tirpalų sušvirkštimo Metalotioneino koncentracija kontrolinių pelių kepenyse 8 val. (28 μg/g) ir po 14 d. (33 μg/g) prilyginta 100 proc. n=6-8;

* – statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant su kontroline grupe; # – statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant su Pb paveiktų

pelių grupe

Švirkščiant vienkartinę cinko tirpalo dozę 20 minučių prieš švino tirpalo sušvirkštimą, pastebėta

dar aktyvesnė MT sintezė – 29 proc. (p<0,05). Po 14 dienų kompleksinio metalų poveikio, MT sintezė

sumažėjo, apsauginių baltymų sintezė buvo 29 proc. (p<0,05) mažesnė nei švino grupėje.

Mūsų tyrimų metu nustatytą metalotioneinų sintezės padidėjimą galima traktuoti kaip organizmo

apsauginę reakciją, siekiant sušvelninti sunkiųjų metalų poveikį, sustabdyti jų patekimą į ląsteles bei

skatinti SM pasišalinimą iš ląstelių (Park et al., 2001). Literatūroje švinas įvardijamas kaip netiesioginis

MT induktorius, kadangi gali aktyvuoti metalotioneinus tik in vivo. Kituose šaltiniuose nurodomas, jog

švinas neaktyvuoja MT sintezės, o tik prisijungia prie apsauginių baltymų (Park et al., 2001; Choudhury et

al., 2008). Tačiau po 2 savaičių Pb(CH3COO)2 poveikio, metalotioneinų sintezė padidėjo iki 142 proc.,

toks efektas gali būti siejamas su dideliu susikaupusio švino kiekiu.

Pastebėta suaktyvėjusi metalotioneinų sintezė abiem atvejais: po vienkartinės ZnSO4 injekcijos bei

po 2 savaičių poveikio. Literatūros šaltiniuose cinkas aprašomas kaip metalotioneinus aktyvinantis

elementas (Park et al., 2001). Esant kompleksiniam abiejų metalų poveikiui, MT sintezė suaktyvėjo po

vienkartinės dozės. Tai gali būti susiję su Pb bei Zn aktyvinta metalotioneinų sinteze. Tačiau po dviejų

savaičių kompleksinio metalų poveikio pastebėtas metalotioneinų sintezės sumažėjimas, kuris gali būti

siejamas su abiejų metalų konkurencija dėl prisijungimo vietos metalotioneinuose (Coyle et al., 2002).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Pb Zn Pb+Zn

Met

alo

tio

nei

nų

ko

nce

ntr

acija

(p

roc.

)

Vienkartinė injekcija

14 injekcijų

33

3.2.2 Kompleksinis nikelio ir cinko poveikis MT sintezei

Tęsiant tyrimus, nustatytas nikelio ir/arba cinko poveikis metalotioneinų sintezei. Iš 8 pav. pateiktų

rezultatų galima matyti, jog vienkartinė NiCl2 injekcija metalotioneinų sintezę padidino 35 proc. (p<0,05),

o po dviejų savaičių NiCl2 poveikio, MT sintezė buvo padidėjusi 57 proc. (p<0,05), lyginant su kontroline

pelių grupe.

8 pav. MT koncentracija pelių kepenyse po NiCl2 ir/arba ZnSO4, tirpalų sušvirkštimo Metalotioneino koncentracija kontrolinių pelių kepenyse 24 val. (29 μg/g) ir po 14 d. (28 μg/g) prilyginta 100 proc. n=6-8; * –

statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant su kontrolinių pelių grupe; # – statistiškai reikšmingi skirtumai, lyginant su Ni

paveiktų pelių grupe

Esant kompleksiniam metalų poveikiui, kai ZnSO4 tirpalas buvo sušvirkštas 20 minučių prieš

NiCl2, gauti skirtingi rezultatai. Po vienkartinės metalų injekcijos, MT sintezė padidėjo 41 proc., o po 14

dienų poveikio cinkas sugebėjo inaktyvuoti nikelį ir MT sintezė buvo beveik lygi kontrolinei grupei.

Įvairių studijų metu išsiaiškinta, jog laisvo cinko kiekis ląstelėje didėja dėl nikelio poveikio. Esant

tokiam efektui, ląstelėje susidaro vientisa grandinė: cinkas aktyvina MTF-1, pastarasis skatina mt2a geno

raišką, dėl to pradeda aktyvėti MT sintezė (Nemec et al., 2009).

Apibendrinant mūsų tyrimų rezultatus, galima teigti, jog nikelis metalotioneinų sintezę aktyvino

labiau nei švinas. Tai pastebėta tiek po paros, tiek po 14 dienų. Atliekant dviejų savaičių kompleksinio

metalų poveikio tyrimus paaiškėjo, jog cinkas, sušvirkštas 20 minučių prieš nikelio tirpalą, metalotioneinų

sintezę grąžino beveik iki kontrolės dydžio.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

Ni Zn Ni+Zn

Met

alo

tio

nei

nų

ko

nce

ntr

acija

(p

roc.

)

Vienkartinė injekcija

14 injekcijų

34

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Tyrimo metu sukurtas sunkiųjų metalų sukelto oksidacinio streso modelis, kurį galima pritaikyti

tiriant galimus gydymo ir profilaktikos metodus. Tolimesnius tyrimus būtų galima tęsti su

farmakognozijos specialistais: yra nemažai augalų, kurie pasižymi antioksidaciniu poveikiu, tačiau vis dar

nėra rastas tinkamiausias metodas geresniam bioprieinamumui; žinomos aktyviosios medžiagos, tačiau vis

dar ieškomas augalas, kuris tinkamiausias šių veikliųjų medžiagų išskyrimui.

Natūralūs antioksidantai skirstomi į fermentinius ir nefermentinius. Fermentiniai antioksidantai

gaminami ląstelėje, o nefermentinius – karotinoidus, flavonoidus, vitaminus ir mineralus galime išskirti iš

daugelio vaisių, daržovių, riešutų, kruopų (Flora et al., 2009).

Vieni daugiausiai tyrinėjamų natūralių antioksidantų – flavonoidai. Oksidacinį stresą gali mažinti

nutraukdami ADF reakcijas (Terao, 2009). Jų aktyvumas priklauso nuo struktūros – metalų surišimo

savybes lemia funkcinė hidroksilo grupė B žiede ir 5-hidroksi grupė A žiede, taip pat svarbios 2 ir 3

padėtyse C žiede esančios dvigubos jungtys su 4-okso grupe (Dugas et al., 2000). Geriausiai ištirtas

flavonoidias – kvercetinas, galintis sudaryti chelatinį junginį su švinu per orto-fenolines grupes kvercetino

B žiede (Bravo at el., 2001). Liu et al. (2010) įrodė kvercetino naudą bei apsauginį poveikį pelių inkstams

po ilgalaikio švino švirkštimo. Kvercetinas sumažino ADF kiekį bei normalizavo GSH lygį inkstuose. Hu

et al. (2008) atliktame tyrime kvercetinas taip pat pagerino pelių sveikatos būklę po ilgalaikio švino

vartojimo. Tokie teigiami rezultatai leidžia tikėtis, jog kvercetinas taps puikiu vaistu kovojant su SM

toksiškumu, tačiau norint tai įrodyti, reikia daugiau ir įvairesnių tyrimų.

Sunku atrasti tinkamus augalinius antioksidantus. Dėl nedidelės kainos ir nestiprių šalutinių efektų,

augalai galėtų būti puikūs antioksidantai, tačiau tik dalinis jų bioprieinamumas organizme, ilgesnio

gydymo trukmės bei didesnės dozės sukelia daugiau problemų. Kol kas plačiau aprašyti tik keli augalai,

veiksmingi esant SM sukeltam oksidaciniam stresui. Vienas tokių – česnakas, kurio pagrindinė veiklioji

medžiaga – alicinas. Česnakas pasižymi gebėjimu mažinti oksidacinį stresą, kadangi suriša SM jonus bei

laisvuosius radikalus. Pourjafal et al. (2007) tyrimų metu įrodė, jog česnakas slopina oksidacinį stresą

žiurkių inkstuose, kepenyse, kraujyje. Taip pat SM sukeltą oksidacinį stresą gali mažinti kurkuma. Shukla

et al. (2003) įrodė kurkumo apsauginį poveikį prieš švino sukeltą oksidacinį stresą žiurkių organizme.

Daniel et al. (2009) šį rezultatą patvirtino tirdami žiurkių smegenis. Tačiau vis dar išlieka problema, kaip

kurkumą tinkamai pritaikyti, kadangi šio augalo bioprieinamumas itin mažas. Tai susiję su prasta jo

absorbcija žarnyne bei itin greitu metabolizmu kepenyse ir pašalinimu (Maiti et al., 2007).

35

Kinijoje ir Indonezijoje auginama ir Lietuvoje kol kas mažai žinoma azijinė centelė (Centella

asiatica) šiuo metu vis plačiau tyrinėjamas augalas. Tyrimų metu įrodyta, jog augalas geba sumažinti

chelatinių grupių skaičių ir oksidacinį stresą (Saxena et al., 2006). Šiuo metu netgi iškelta hipetezė, jog C.

asiatica galėtų atkurti prooksidantų/antioksidantų balansą po SM veikimo, tačiau tam vis dar trūksta

tyrimų.

Pasinaudojant sukurtu oksidacinio streso modeliu, galima plačiau tyrinėti retesnius augalus,

bandyti atrasti tinkamiausią formą, kuri padidintų jau ištirtų augalų (pvz. kurkumos) bioprieinamumą.

36

IŠVADOS

1. Nustatyta, jog nikelio jonai aktyvino bendrą baltymų sintezę, o švino jonai sintezės procesui

įtakos neturėjo.

2. Nepriklausomai nuo poveikio trukmės (sunkiesiems metalams veikiant 8 val., 24 val., ir 14

dienų), švino ir nikelio jonai skatino metalotioneinų sintezę pelių kepenyse.

3. Cinko jonai mažino nikelio jonų indukuotą bendro baltymo ir metalotioneinų sintezę pelių

kepenyse.

37

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS

1. Alhama J, Romero-Ruiz A, Lopez-Barea J. Metallothionein quantification in clams by reversed-

phase high-perfomance liquid chromatography coupled to fluorescence detection after

monobromobimane derivatization. J. Chromatogr A 2006;1107:52-8

2. Binz P.-A. and Kägi J.H.R. Metallothionein: molecular evolution and classification. In:

Metallothionein IV 1999, pp. 7-14, Klaassen C.D. (ed.), Birkhäauser, Basel

3. Chervona Y, Arita A, Costa M. Carcinogenic Metals and the Epigenome: Understanding the effect

of Nickel, Arsenic, and Chromium. Metallomics. 2012 July; 4(7):619-627.

4. Duncan M.W., Marini A.M., Watters R.; Kopin I.K.; Markey S.P.J. Neuroscience 1992, 12, 1523-

1537

5. Flora SJ, Kumar D, Das Gupta S. Interaction of zinc, methionine or thei combination with lead at

gastrointestinal or post-absorptive level in rats. Pharmacol Toxicol 1991; 68:3-7

6. Flora SJ, Singh S, Tandon SK. Thiamine and zinc in prevention or therapy of lead intoxication. J.

Int Med Res 1989; 17:68-75

7. Hsu PC, Guo YL. Antioxidant nutrients and lead toxicity. Toxicology 2002; 180; 33-44

8. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer. Biochemistry 2007, P. 155 / W.H. Freeman

and Company, New York

9. Andreini C, Banci L, Bertini I, Rosato A. Zinc through the three domains of life. J Proteome Res.

2006; 5:3173-3178

10. Bal W, Lukszo J, Kasprzak K S. Mediation of oxidative DNA damage by nickel (II) and copper

(II) complexes with the N-terminal sequence of human protamine HP2. Chemical Research in

Toxicology 1997, vol. 10, no.8, pp. 915-921

11. Barja G. Endogenous oxidative stress: relationship to aging, longevity and caloric restriction.

Aging Res Rev 2002;1:97-411.

12. Batra N. Nehru B, Bansal MP. The effect of zinc supplementation on the effects of lead in the rat

testis. Reprod Toxicol 1998; 12:535-540.

13. Benters J.; Flogel U.; Schafer T., Leibfritz D.; Hechtenberg S., Beyersmann D. Biochem. J. 1997,

322, 793-799

14. BeyersmannD, Hartwig A. Carcinogenic metal compounds: recent insight into molecular and

cellular mechanisms. Arch Toxicol. 2008; 82: 493-512

15. Bouta BD, Struzynska L, Rafatowska U. Effect of acute and chronic lead exposure on the level of

sulfhydryl groups in rat brain. Acta Neurobiol Exp. 1996;56:233–236

38

16. Bravo A, Anacona JR. Metal complexes of the fl avonoid quercetin: antibacterial properties. Trans

Met Chem 2001, 26: 20–23

17. Bray T M, Ray T MT, Bettger W J. Free Rad. Biol. Med. 1990, 8, 281-291

18. Burke J P , Fenton M R. proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1985, 179, 187-191

19. Chervona Y., Arita A., Costa M. Carcinogenic Metals and the Epigenome: understanding the

effect of Nickel, Arsenic, and Chromium. Metallomics. 2012 July, 4(7): 619-627.

20. Chiba M, Shinohara A, Matsushita K, Watanabe H, Inaba Y. Indices of lead exposure in blood and

urine of lead exposed workers and concentration of major and trae element and activities of SOD,

GSH-Px and catalase in their blood. Tohoku J Exp Med 1996; 178: 49-62.

21. Choudhury H, Mudipalli A. Potential considerations & concerns in the risk characterization for the

interaction profiles of metals. Indian J Med Res. 2008;10:1–33.

22. Ciesiolka J, Lorenz S, Erdmann VA. Different conformational forms of Escherichia coli and rat

liver 5S rRNA revealed by Pb(II) – induced hydrolysis. Eur J. Biochem, 1992;204:583-9

23. Coyle P., Philcox J.C., Carey L.C., Rofe A.M. Metallothionein: the multipurpose protein. CMLS,

Cell. Mol. Life Sci. 59. 2002; 627-647

24. Curtis D, Jie L, Supratim Ch, Metallothionein: an intracellular protein to protect against cadmium

toxicity; Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1999. 39:267-94

25. Dabrio M, Rodriguez AR, Bordin G, Bebianno MJ, De Ley M, Sestakova I, et al. Recent

developments in quantification methods for metallothionein. J Inorg Biochem 2002;88(2):123-34

26. Dally H, Hartwig A, Induction and reapair inhibition of oxidative DNA damage by nickel (II) and

cadmium (II) in mammalian cells. Carcinogenesis vol. 18 No. 5 p.p. 1021-1026, 1997

27. Danadevi K, Rozati R, Banu BS, Rao PH, Grover P. DNA damage in workers exposed to lead

using comet assay. Toxicology. 2003; 187: 183-93

28. Daniel S, Limson JL, Dairam A, Watkins GM, Daya S. Through metal binding, curcumin protects

against lead- and cadmium-induced lipid peroxidation in rat brain homogenates and against lead-

induced tissue damage in rat brain. J Inorg Biochem 2004, 98: 266–275

29. Das KK, Buchner V. Effect of nickel exposure on peripheral tissues: role of oxidative stress in

toxicity and possible protection by ascorbic acid. Rev Environ Health. 2007; 22(2): 157-173

30. David A. Bender, Kathleen M. Botham, Peter J. Kennelly, Victor W. Rodwell, P. Anthony Weil

(2009) Harper’s illustrated biochemistry. The McGraw – Hill Companies

39

31. Ding J, He G, Gong W, Wen W, Sun W, Ning B, Huang S, Wu K, Huang C, Wu M, Xie W, Wang H.

Effects of Nickel on Cyclin Expression, Cell Cycle Progression and Cell Proliferation in Human

Pulmonary Cells. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2009 June; 18(6).

32. Dugas AJ, Castaneda-Acosta J, Bonin GC, Price KL, Fischer NH, Winston GW. Evaluation of the

total peroxyl radical-scavenging capacity of fl avonoids: structure-activity relationships. J Nat Prod

2000, 63: 327–331

33. Egli D, Domenech J, Selvaraj A, Balamurugan K, Hua H, Capdevila M, et al. The four members if

the Drosophila metallothionein family exhibit distinct yet overlapping roles in heavy metals

homeostasis and detoxification. Genes Cell 2006;11:647-58

34. Flora G, Gupta D, Tiwari A. Toxicity of lead: a review with recent updates. Interdiscip Toxicol

2012, Vol. 5(2): 47-58

35. Flora SJS. Structural, chemical and biological aspects of antioxidants for strategies against metal

and metalloid exposure. Oxid Med Cell Longev 2009, 2: 191–206

36. Flora SJS, Mittal M, Mehta A. Heavy metal induced oxidative strees and it‘s possible reversal by

chelation therapy. Indian J Med Res 128, 2008, pp 501-523

37. Flora SJS., Pande M., Kannan G.M., Mehta A. Lead induced oxidative stress and its recovery

following co-administration of melatonin or N-acetylcysteine during chelation with succimer in

male rats. Cellular and Molecular Biology 50, 2004 Cell. Mol. Biol.

38. Frederickson C.J.; Bush A.I.; Biometals 2001, 14, 353-366

39. Fukada T, Yamasaki S, Nishida K, Murakami M, Hirano T. Zinc homestasis and signaling in

health and diseases: Zinc signaling. J Biol Inorg Chem. 2011; 16:1123-1134

40. Geraci F, Pinsino A, Turturici G, Savona R, Giudice G, Sconzo G. Nickel, lead and cadmium

induce differential cellular responses in sea urchin embryos by activating the synthesis of different

HSP70s. Biochem Biophys Res Commun. 2004;322:873–7.

41. Gillis B. S, Arbieva Z., Gavim I. M. Analysis of lead toxicity in human cells. BMC Genomics

2012, 13:334

42. Halliwell B, Gutteridge JMC, editors. Free radicals in biology and medicine. Oxford: Clarendon

Press; 1989

43. Henry R.B., Liu J., Choudri S. and Klaassen C.D. (1994) Species variation in hepatic

metallothionein. Toxicol Lett, 74: 23-33.

44. Hoffmal Nelson, Howland Lewin, Flomenbaum Goldfrank (2007) Manual of toxicologic

emergencies. The McGraw – Hill Companies

45. Hotz C.; Lowe N.M.; Araya M.; Brown K.H.; J. Nutr. 2003, 133, 1563S-1568S

40

46. Hu P, Wang M, Chen WH, Liu J, Chen L, Yin ST, Yong W, Chen JT, Wang HL, Ruan DY.

Quercetin relieves chronic lead exposure-induced impairment of synaptic plasticity in rat dentate

gyrus in vivo. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2008, 378: 43–51

47. Huang M, Krepkiy D, Hu W, Petering DH. Zn-, Cd-, and PB transcription factor IIIA: properties,

DNA binding, and comparison with TFIIIA-Wnger 3 metal complexes. J Inorg Biochem.

2004:98:775-85

48. Ikebuchi, H., Teshima, R., Suzuki, K., Terao, T., and Yamane, Y. (1986). Stimultaneous induction

of Pb-metallothionein-like protein and Zn-thionein in the liver of rats given lead acetate. Biochem.

J. 233, 541–546.

49. Jiang L J, maret W, Vallee B L. Proc Natl Acad Sci. USA 1998, 95, 9146-9149

50. Jing-Hui L, Marsh RE. LD50 determination of zinc phosphide toxicity for house mice and albino

laboratory mice. Proceedings of the thirteenth vertebrate pest conference 1988; 91-94

51. Kägi J.H.R, Evolution, structure and chemical activity of class I metallothioneins: An overview. In

Metallothionein III: Biological Roles and Medical Implications, ed. KT Suzuki, N Imura, M

Kimura. 29-56, Berlin: Birkhauser 1993

52. Kägi J.H.R. and Nordberg M. (1979) Metallothionein. Proceedings of the First International

Meeting on „Metallothionein and Other Low Molecular Weight Metal Binding Proteins“,

Birkhäuser, Basel

53. Kanitz MH, Witzman FA, Zhu H, Fultz CD, Skaggs S, Moorman WJ, Savage RE. Alterations in

rabbit kidney protein expression following lead exposure as analyzed by two-dimensional gel

electrophoresis. Electrophoresis. 1999;20:2977–85.

54. Kasprzak K S, Diwan B A, Konishi N, Misra M and Rice J M (1990) Initiation by nickel acetate

and promotion by sodium barbital of renal cortical epithelial tumors in male F344 rats.

Carcinogenesis, 11, 647-652

55. Kasprzak K S, Drwan B A, Rice J M , Misra M, Riggs C W, Olinski R, Dizdaroglu M (1992)

Nickel (II)-mediated oxidative DNA base damage in renal and hepatic chromatin of pregnant rats

and their fetuses. Possible relevance to carcinogenesis. Chem. Res. Toxicol, 5, 809-815

56. Kasprzak KS, Sunderman FW, Salnikow K. Mutat Res. 2003; 533:67-97

57. Keyuna S. Cameron, Buchner V., Tchounwou Paul B. Exploring the Molecular Mechanisms of

Nickel-Induced Genotoxicity and Carcinogenicity: A Literature Review. Rev Environ Health

2011; 26(2): 81-92

58. Kojima Y, Hunziker PE. 1991. Amino acid analysis of metallothionein. Methods Enzymol.

205:419-21

59. Lazo JS, Pitt BR. 1995 Metallothioneins and cell death by anticancer drugs. Annu. Rev.

Pharmacol. Toxicol. 35: 635-53

41

60. Li Y, Kimura T, Laity JH, Andrews GK. The zinc-sensing mechanism of mouse MTF-1 involves

linker peptides between the zinc fingers. Mol Cell Biol 2006;26:5580-7

61. Liu CM, Ma JQ, Sun YZ. Quercetin protects the rat kidney against oxidative stress-mediated DNA

damage and apoptosis induced by lead. Environ Toxicol Pharmacol 2010, 30: 264–271

62. Maiti K, Mukherjee K, Gantait A, Saha BP, Mukherjee PK. Curcumin phospholipid complex:

Preparation, therapeutic evaluation and pharmacokinetic study in rats. Int J Pharm 2007, 330: 155–

163

63. Maret W, Vallee BL, 1998 Thiolate ligands in metallothionein confer redox activity on zinc

clusters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3478-82

64. McNeill DR, Wong HK, Narayana A, Wilson DM 3rd. Lead promotes abasic site accumulation

and co-mutagenesis in mammalian cells by inhiting the major abasic endonuclease Apel. Mol

Carcinog. 2007; 46:91-9

65. Miriam D.Rosenthal, Robert H. Glew (2009) Medical biochemistry. Human metabolism in health

and disease. Wiley

66. Moussa SA, Bashandy SA. Biophysical and biochemical changes in the blood of rats exposed to

lead toxicity. Romanian J. Biophys. 2008;18:123–33.

67. Mudipalli A: Lead hepatotoxicity and potential health effects. Indiam J Med Res 2007,

126(6):518-527

68. Murawska-Cialowicz E, Bal W, Januszewska L, Zawadzki M, Rychel J, Zuwala-Jagiello J.

Oxidative Stress Level in the Testes of Mice and Rats during Nickel Intoxication. The Scientific

World Journal. Volume 2012

69. Nemec AA, Leikauf GD, Pitt BR, Wasserloos KJ, Barchowsky A. Nickel mobilizes intracellular

zinc to induce metallothionein in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol.

2009;41:69–75.

70. Oteiza P I Zinc and the modulation of redox homeostasis. Free Radic Biol Med 2012 November 1;

53(9): 1748-1759

71. Oteiza P I, Olin K L, Fraga C G, Keen C L. J.Nutr. 1995, 125, 823-829

72. Palumaa P, Tammiste I, Kruusel K, Kangur L Jornvall H, Sillard R. Metal binding of

metallothionein – 2: lower affinity and higher plasticity. Biochim Biophys Acta 2005; 1747:205-

11

73. Park JD, Liu Y, Klaassen CD. Protective effect of metallothionein against the toxicity of cadmium

and other metals. Toxicology. 2001;163:93–100.

42

74. Patrick L: Lead toxicity, a review of the literature. Part 1: exposure, evaluation, and treatment.

Altern Med Rev 2006, 11(1):2-22

75. Plum L M, Rink L, Haase H. The Essential Toxin: impact of zinc on human health. Int. J. Environ.

Res. Public Health 2010, 7, 1342-1365

76. Pourjafar M, Aghbolaghi PA, Shakhse-Niaie M. Eff ect of garlic along with lead acetate

administration on lead burden of some tissues in mice. Pak J Biol Sci 2007, 10: 2772–2774

77. Richard C. Dart, M.D., PH.D. (2000) The 5 minute Toxicology consult. A Wolters Kluwer

Company.

78. Rigby Ducan K E, Stillman MJ. Metal – dependant protein folding:metallation of metallothionein.

J Inorg Biochem 2006;100:2101-7

79. Roth T.M. Kirchgessner M., Trace Elem. Electr 1994, 1, 46-50

80. Ryan-Harsham M, Aldoori W. The relevance of selenium to immunity, cancer, and infections/

inflammatory diseases. Can J Diet Pract Res 2005; 66:98-102

81. Sanders T., Liu Y., [...] and Tchounwou Paul B. Neurotoxic effects and biomarkers of lead

exposure: a review. Rev Environ Health, 2009 Jan-Mar; 24(1) 15-45

82. Saxena G, Flora SJ. Changes in brain biogenic amines and haem biosynthesis and their response to

combined administration of succimers and Centella asiatica in lead poisoned rats. J Pharm

Pharmacol 2006, 58: 547–559

83. Schmid M, Zimmermann S, Krug HF, Sures B. Influence of platinum, palladium, and rhodium as

compared with cadmium, nickel and chromium on cell viability and oxidative stress in human

bronchial epithelial ceel. Environ Int. 2007; 33(3): 385-90

84. Sidhu P, Garg ML, Morgenstern P, Vogt J, Butz T, Dhawan DK. Ineffectiveness of nickel in

augmenting the hepatotoxicity in protein deficient rats. Nutr Hosp. 2005;6:378–85

85. Shukla PK, Khanna VK, Khan MY, Srimal RC. Protective eff ect of curcumin against lead

neurotoxicity in rat. Hum Exp Toxicol 2003, 22: 653–658

86. Stohs, S.T. and Bagchi, D., Oxidative mechanism in the toxicity of metal ions. Free Rad. Biol.

Med. 1995, 18: 321-336

87. Sturzenbaum S.R., Winters C., Galay M., Morgan A.J. and Kille P. Metal trafficking in

earthworms – identification of a cadmium specific metallothionein. 2001 J. Biol. Chem. 275:

34013-34018

88. Sunderman F W, Selin C E (1968) The metabolism of nickel-63 carbonyl. Toxicol, APPL.

Pharmacol, 12, 207-218

43

89. Sunderman FW, Hopfer SM, Plowman MC, Knight JA. Res Commun Chem Pathol Pharmacol.

1990; 70:103-113

90. Valko M, Izakowic M, Mazur M, et al. Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer

incidence. Mol Cell Biochem 2004;266:37-56

91. Valko M, Morriss H, Cronin MT. Metals, toxicity, and oxidative stress. Curr Med Chem. 2005;

12(10):1161-1208

92. Vallee B L, Falchuk K H. The biochemical basis of zinc physiology. Physiol. Rev. 1993, 73, 79-

118

93. Valverde M, Trejo C, Rojas E. Is the capacity of lead acetate and cadmium chloride to induce

genotoxic damage due to direct DNA-meta; interaction. Mutagenesis. 2001; 16:265-70

94. Verstraeten SV, Aimo L, Oteiza Pl: Aliuminium and lead: molecular mechanisms of brain toxicity.

Arch Toxicol 2008, 82(11): 789-802

95. Waalkes, M. P., Liu, J., Goyer, R. A., and Diwan, B. A. (2004). Metallothionein-I/II double

knockout mice are hypersensitive to leadinduced kidney carcinogenesis: Role of inclusion body

formation. Cancer Res. 64, 7766–7772

96. Wright J, George S, Martinez-Lara E, Carpene E, Kindt M. Levels of cellular glutathione and

metallothionein affect the toxicity of oxidative stressors in an established carp cell line. Mar

Environ Res 2000;50:503-8

97. Zuo P, Qu W, Cooper R, Goyer R, Diwan B, Waalkes M. Potential Role of α-Synuclein and

Metallothionein in Lead-Induced Inclusion Body Formation. Toxicological Sciences 2009. 111(1),

100-108.

44

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO TEMA PASKELBTŲ

PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS

Straipsniai mokslo leidiniuose

1. Šveikauskaitė I, Šulinskienė J, Sadauskienė I, Ivanov L. The effects of lead and nickel ions on total

proteins and metallothioneins synthesis in mice liver. Biologija. 2014:60(1):17–21.

Pranešimų tezės

1. Šveikauskaitė I, Šulinskienė J, Sadauskienė I, Ivanov L. The protective effects of zinc ions on total

proteins and metallothioneins synthesis in mice liver. The Vital Nature Sign. 8th

International

Scientific Conference: Abstract book. Kaunas: Vytautas Magnus University. 2014, p. 62, no. P-30.

2. Šveikauskaitė I, Šulinskienė J, Sadauskienė I, Ivanov L. Total protein and metallothioneins

synthesis in mice liver under exposure of lead and nickel ions for two weeks. The 4th

International

Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practice: Abstract book. Kaunas:

Lithuanian University of Health Sciences. 2013, p. 52-53, no. P-12.

3. Šveikauskaitė I, Šulinskienė J, Sadauskienė I, Ivanov L. The effects of lead and nickel ions on total

proteins and metallothioneins synthesis in mice liver. The Vital Nature Sign: 7th International

Scientific Conference: Abstract book. Kaunas: Vytautas Magnus University. 2013, 1 skelb, p. 46,

no. P-21.

Kiti pristatymai

1. Šveikauskaitė I, Differences of lead and nickel ions effects on total protein and metallothioneins

synthesis in mice liver. 26th Annual Euromeeting Vienna 2014. 25-27 March 2014, ACV, Vienna,

Austria. Student posters, no. P-13.

45

PRIEDAI