VIRUSOLOĢIJA (VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)

VIRUSOLOĢIJA(VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)

Vīrusu ģenētika

Vīrusu ģenētika.

Mutāciju tipi:bioķīmiskais raksturojums;fenotipiskā izpausme

Vīrusu mutāciju biežums

Mijiedarbības starp vīrusiem un starp vīrusu un šūnu

fenotipiskā sajaukšanāsreasortimentspalīgvīrusi interference restrikcija - modifikācija

Lītiskais un lizogēnais attīstības cikls, imunitāte

Transdukcija

Mutāciju tipi:

viena nukleotīda nomaiņa:tranzīcija vai transversija;misssense, nonsense vai

klusējošās;

nukleotīdu insercijas vai delēcijas;

rekombinācija;

genoma mutācijas:translokācijas;inversijas;delēcijas;duplikācijas.

Vīrusu ģenētika

Nulles mutācijas:

gēna inaktivēšana (nonsense, missense)

nonsense supresija

E.coli sup D, E, F, P tRNS

amber UAG ser, glu, tyr, leuochre UAA (UCG) (CAA) (UAU) (UUG)opal UGA

Temperatūras jutības (ts) mutācijas: nosacīti letālas (missense)

Saimnieku loka mutācijas

Plaka lielums, rezistence, enzīmu mutācijas. “karstie” mutanti, attenuētie (novājinātie mutanti)

J.W. Drake, B. Charlesworth, D. Charlesworth, J. F. CrowRates of Spontaneous MutationGenetics, Vol. 148, 1667-1686, 1998

G –genoma lielums (b.p.); Ge – kodējošā genoma lielums;b – mutāciju biežums uz vienu b.p. replikācijas ciklā;g – mutāciju biežums uz vienu genomu replikācijas ciklā;eg – mutāciju biežums uz vienu kodējošā genoma ekvivalentu replikācijas ciklā;

Mutāciju biežums

Mutāciju biežums

Mutāciju biežums

Mutāciju rezultāts

R.Sanjua, et al. (2004)The distribution of fitness effects caused by single-nucleotide substitutions in an RNA virus (VSV) PNAS, 101, 8396–8401

HOMOLOGĀ REKOMBINĀCIJA

Kopijas izvēle (copy choice) mehānisms vīrusu replikācijā

Pavedienu apmaiņas (strand exchange) mehānisms eikariotu šūnu replikācijāMutāciju kartēšana, atlase pēc pazīmes atjaunošanas

(marker rescue) īpašībām, saimniekšūnas genomu fragmentu iekļaušana vīrusā

REASORTIMENTSfragmentētu genomu saturošiem vīrusiem

Iespējas vakcīnas izstrādei, izmantojot gripas vīrusa genoma reasortimentu

Fenotipiskā sajaukšanās

Vīrusu ģenētika


Vīrusu ģenētika


Vīrusu ģenētika


Vīrusu ģenētika

Palīgvīrusi

Vīrusu ģenētika

HIMĒRĀS VĪRUSVEIDĪGĀS DAĻIŅAS

Interference

Defektīvās daļiņas konkurē par apvalka proteīniem kavē replikāciju

Vīrusu ģenētika

DNS / DNS hibridizācija (Southern blotting)

No inficētām šūnām attīrīta DNSViriona DNS

DNS zonde K DNS zonde S

Membrānas apstrāde – hibridizācija ar zondi K

Ad12 5’-gala KpnI fragments, 589 b.p.

Viriona DNS No inficētām šūnām attīrīta DNS

DNS zonde K DNS zonde S

Membrānas apstrāde – hibridizācija ar zondi S

+ 273 b.p. no Ad12 33845 - 34118

2x (+ 273 b.p. no Ad12 33845 – 34118)

3x (+ 273 b.p. no Ad12 33845 – 34118)

Ad12 3’-gala SacI fragments, 615 b.p.

Kā veidojas Ad 12 genoma 3’-gala “liekā” sekvence ?

Restrikcija - modifikācija

Vīrusu ģenētika

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)

Cas (CRISPR-associated) genes, CRISPR-based adaptive immune systems Terns and Terns, 2011

Baktēriju aizsardziba pret vīrusu infekcijām

CRISP-Cas

Mali P. et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science, V339, p. 824, 2013

Jaunās pieejas genoma modifikācijai

CRISP-Cas

Transfekcija

Proteīna neaizsargāta vīrusa ģenētiskā materiāla nogādāšana šūnā (elektrošoks, liposomas, hidroksilapatīts)

Transdukcija

Gēna pārnese ar vīrusa palīdzību

Specifiskā ( fāgs, gal, bio operoni)

Nespecifiskā (P2 fāgs, 40-50 kbp. genoma fragmenti)

Vīrusu ģenētika

Virulence / LizogēnijaVīrusu ģenētika

– fāga replikācijas stratēģiju izvēle

Virulence / Lizogēnija

Vīrusu ģenētika

Lambda () fāga ģenētiskā karteVīrusu ģenētika

http://biology.bard.edu/ferguson/course/bio404/Lecture_08.pdf


DNS bibliotēku veidošana fāgu vektoros

http://kkk.gobot.com/genomiclibrary.gif


infekcijas agrīnie posmi :

1. adsorbcija pie šūnas receptora (maltozes transporta proteīns);

2. DNS injekcija, cos secību - lipīgo galu savienošanās un ligēšana;

3. transkripcija – nekavējoši agrīnie, novēloti agrīnie, vēlīnie gēni;

4. replikācija – vispirms , pēc tam ripojošā gredzena mehānisms, specifiska šķelšana cos sekvencēs, lipīgo galu atdalīšanās, fāga savākšanās ;

5. baktērijas šūnas lizēšana.

fāga cos saita nukleotīdu secība

DNS replikācijas teta () mehanisms

Lambda () fāga replikācija

1. Vāja transkripcija no PL un PR. Veidojas antiterminācijas proteīns N, kas mijiedarbojas ar RNA polimerāzi un sekmē transkripciju abos virzienos. Veidojas regulācijas proteīns Cro, kas sekmē ranskripciju no PR

2. N sekmē CIII (CII stabilizētājs) {PL}; kā arī CII, (CI stimulators) O, P,(DNA sintēze, mehanisms) Q gēnu transkripciju {PR}

Agrīnā infekcijas stadija - izšķiršanās

Vīrusu ģenētika

Agrīnā infekcijas stadija - izšķiršanāsVīrusu ģenētika

Vīrusu ģenētika

Agrīnā infekcijas stadija - izšķiršanās

Izvēle - integrācijaVīrusu ģenētika

LIZOGĒNIJA. CII aktivē PRE (CI sintēzes

sākums) un PI (integrāze). Veidojas CI,

kas izspiež Cro no PL un PR, aktivē PRM

Int sekmē attP un attB mijiedarbību un fāga DNS saplūšanu ar baktērijas DNS.

Vīrusu ģenētika

Izvēle - integrācija

Izvēle - integrācijaVīrusu ģenētika

fāga att saita nukleotīdu secība

Izvēle - integrācija

Vīrusu ģenētika

Vīrusu ģenētika Izvēle - integrācija


Gēnu ekspresija profāgā

Vīrusu ģenētika

Lizogēnas šūnas:

• Satur fāga genomu integrētu hromosomā, neaktīvā stāvoklī.

• Ir imūnas pret infekcijām ar radniecīgiem fāgiem.

• Profāgu iespējams aktivēt ar dažādu faktoru (UV, mutagēni, nelabvēlīgi vides apstākļi).

PROFĀGS


Indukcija

Vīrusu ģenētika

Izvēle – litiskais ciklsVīrusu ģenētika

LIZE. Ja Cro ir pietiekami daudz, tiek bloķēta CI sintēze (vispirms), bet vēlāk

arī PL un PR kopumā. Izšķirošs kļūst

transkripts no PR’ sadarbībā ar Q

antitermināciju, kas palaiž fāga apvalku un lizes proteīnu sintēzi. DNS sintēze pāriet no uz ripojošā gredzena mehanismu.

Izvēle – litiskais cikls

Vīrusu ģenētika

DNS replikācijas ripojošā gredzena mehanisms

Lambda () fāga replikācija

ĢENĒTISKAIS SLĒDZIS

O1, 2, 3 sekvences ir līdzīgas, bet nav identiskas; CI saistība ir vislabākā ar O1, visvājākā – ar O3. Cro – vislabākā ar O3.

Kopumā CI saistas ar operatora saitiem apm. 5 reizes efektīvāk nekā Cro



Citi E. coli lizogēnie fāgi• fāgam līdzīgie – fāgi 21 f80, 82, 424, 434, krustimunitāte;

• P1, lielākais lizogēnais fāgs, 97 kbp. DNS, reti integrējas – vairāk sastopams plazmīdas veidā, Cre proteīns un rekombinācija loxP saitā, 40% DNS piepildījums nepieciešams agregācijai, nespecifiskā transdukcija;

• Mu, 42 kbp. DNS, fāga genoma galos – baktērijas skvences, efektīvs transpozons, mutāciju inducēšana;

• P2, 33,2 kbp. DNS, apm. 10 integrācijas vietas baktērijas genomā, lizē reti. P2 kodētos kapsīda proteīnus var izmantot P4 (11 kpb. DNS), kas šūnās bez P2 ir daudzkopiju plazmīdas formā.

TransdukcijaGēna pārnese ar LIZOGĒNA vīrusa palīdzību

Specifiskā ( fāgs, gal, bio operoni)

Nespecifiskā (P1, P22 fāgi, 40-50 kbp. genoma fragmenti)

Vīrusu ģenētika

SPECIFISKĀ TRANSDUKCIJA

SPECIFISKĀ TRANSDUKCIJA

NESPECIFISKĀ TRANSDUKCIJA




http://bio.classes.ucsc.edu/bio105l/EXERCISES/P1/masters.pdf

Documents

VIRUSOLOĢIJA (VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)