VITAMINIVitamini su neophodno potrebni za normalan razvoj svakog ivog organizma. To su biokatalizatori koje ivotinjski organizam prima hranom, jer ih sam nije u stanju sintetisati.

ODREIVANJE VITAMINA CVitamin C spada u grupu vitamina rastvornih u vodi. On je vaan faktor ishrane i njegovo pomanjkanje u hrani uzrokuje skorbut, bolest poznatu od davnina. Ona je najee vladala meu mornarima koji na dugim putovanjima nisu imali sveu hranu. Znak bolesti je sklonost krvarenju, nenormalne promene na hrskavici, kostima i zubima. Izvori askorbinske kiseline su voe i povre, a u namirnicama ivotinjskog porekla ima ga samo u malim koliinama. U veim koliinama se nalazi u paprici, sveem spanau, sveem i kiselom kupusu, paradajzu, ipurku,bananama, limunu, naranama i jabukama. Tablica 1. Askorbinska kiselina u hrani < 10 mg/100g 10 - 25 mg/100g 25-100 mg/100g 100-350 mg/100g repa, argarepa, jaja, mleko krastavci, ananas, salata limun, paradajz, spana suena paprika, slatka paprika, bela repa

U sveem biljnom materijalu preovladava L-askorbinska kiselina. Nosilac vitaminske aktivnosti u prirodnom materijalu je sastav:

L-askorbinska kiselina se zbog odgovarajuih fiziolokih i fiziko-hemijskih osobina iroko primenjuje u prehrambenoj industriji, te je mnogi proizvodi sadre i kao dodatak. Dodaje se ili u cilju poveanja sadraja vitamina C ili u cilju odrivosti boje, arome i opte stabilnosti prehrambenih proizvoda. Ravnotena reakcija za oksidaciju askorbinske kiseline je: C6H8O6(aq) + H2O C6H8O7(aq) + 2H+ + 2eMetode odreivanja vitamina C U literaturi su opisane razliite metode za odreivanje pojedinanih sadraja Laskorbinske kiseline, dehidroaskorbinske kiseline i njihovog ukupnog sadraja (vitamina C).

1

Metode odreivanja L-askorbinske kiseline, odnosno dehidroaskorbinske kiseline temelje se na njihovim fiziko-hemijskim i fiziolokim osobinama (bioloke metode), a sve metode odreivanja ukupnog vitamina C na reverzibilnosti sistema. Metode odreivanja L-askorbinske kiseline i dehidroaskorbinske kiseline, mogu se podeliti u dve osnovne grupe: oksidoredukcione titracije i kolorimetrijski postupci. Kolorimetrijski postupci Postoji itav niz reagensa koji daju obojene komplekse sa askorbinskom kiselinom, a na osnovu intenziteta nastalog obojenja odreuje se sadraj askorbinske kiseline. Najkarakteristinija kolorimetrijska metoda odreivanja askorbinske kiseline je metoda u kojoj se askorbinska kiselina oksiduje u dehidroaskorbinsku kiselinu i kao takva odreuje sa 2,4-dinitrofenilhidrazinom: dehidroaskorbinska kiselina, kao karbonilno jedinjenje daje se ovim reagensom crveno obojeni proizvod. Reakciju ometaju eeri i druga karbonilna jedinjenja. Osim navedenih metoda, za odreivanje L-askorbinske kiseline predloene su i metode koje se temelje na njenom karakteristinom UV-apsorpcionom spektru pri odgovarajuoj vrednosti pH-rastvora. Ove metode, meutim, nisu strogo specifine (mnogi faktori utiu na apsorpciju), te se retko koriste (kod istih preparata). Pri odreivanju sadraja vitamina C, primenom bilo koje metode moraju se preduzeti sve mere predostronosti kako, tokom pripremanja uzorka za analizu, tako i pri ekstrakciji, kao i pri izvoenju postupka odreivanja, ne bi dolo do razgradnje vitamina C. U prirodnom materijalu se, uz vitamin C, nalaze i mnoga jedinjenja koja reaguju na slian nain kao askorbinska ili dehidroaskorbinska kiselina. Da bi se uklonio uticaj supstanci koje ometaju odreivanje, primjenjuju se razni postupci preiavanja ekstrakta vitamina C. Metode odreivanja dehidroaskorbinska kiseline temelje se na redukciji dehidroaskorbinske kiseline u askorbinsku kiselinu i odreivanje kao takve. Iz ove grupe najpoznatija metoda, koja se danas najee upotrebljava, je metoda po Emmerie i V.Eckelen-u, po kojoj se dehidroaskorbinska kiselina redukuje u askorbinsku kiselinu pomou vodonik-sulfida, a nakon uklanjanja H2S s ugljen-dioksidom, odreuje se askorbinska kiselina. Dehidroaskorbinska kiselina moe se redukovati i pomou nascentnog vodonika, natrijum sulfida, tioacetamida, itd.

Oksidimetrijske titracije Oksidimetrijske titracije askorbinske kiseline se zasnivaju na jakim redukcionim osobinama endiolne grupe, odnosno na redukciji primenjenog reagensa i oksidaciji askorbinske kiseline u dehidroaskorbinsku kiselinu. Kao oksidaciona sredstva se koriste: 2,6-dihlorfenolindofenol, hloramin, metilensko plavo i dr. Oksidometrijske titracije su brze i jednostavne, ali nisu strogo specifine, jer sa navedenim reagensima reaguju, pored askorbinske kiseline, i mnoga druga prirodna jedinjenja koja poseduju redukcione osobine (cistein, glutation, glukoreduktion, gvoe (II), kalaj(II) i bakar(I), sulfiti, sulfidi, tanini i sl.). Zbog toga se ove metode praktino koriste za odreivanje askorbinske kiseline u istim rastvorima npr. pri analizi farmaceutskih proizvoda. U analitici prehrambenih proizvoda se od oksidimetrijskih titracija koriste jedino titracija sa 2,6-dihlorfenol-indofenolom (najstarija metoda odreivanja vitamina C, koju je

2

prvi uveo J. Tillmans, 1927. g.), prvenstveno za odreivanje vitamina C u vou, povru i njihovim proizvodima. Odreivanje askorbinske kiseline u tabletama vitamina C sa kalijum bromatom Princip Uzorak koji sadri askorbinsku kiselinu se rastvori u vodi i tretira kiselim rastvorom jodida,I -; i tano izmerenom koliinom rastvora jodata, IO3-, (jodid treba da bude u viku); nastaje crveno-smei trijodid, I3-, (blai oksidujui agens u odnosu na jodat, IO3-): IO3 - + 8I- + 6H+ 3I3 - + 3H2O (faza 1) Kod analize, askorbinska kiselina iz uzorka redukuje deo od poznate koliine I3- nastale u rastvoru u fazi 1. C6H8O6 + I3- + H2O C6H8O7 + 3I- + 2H+ (faza 2.) viak I3 , - oznaen kao I3 "v") moe se titriovati standardnim rastvorom tiosulfata, S2O3 2-, pri emu nastaje I- i S4O6 2-: S2O3 2- + I3-"v" 3I- + S4O6 2(faza 3) Razlika izmeu I3 - nastalog iz IO3 - (faza1) i onog koji je odreen kao viak (faza 3.) odgovara sadraju askorbinske kiseline u uzorku. Zavrna taka titracije odreuje se dodatkom skroba kao indikatora. Priprema materijala za analizu Svee voe: filtrira se 125-130 mL svee iscenenog soka kroz nekoliko slojeva gaze, pa se u u suv izmeren Elermayer doda 100 mL filtriranog soka i ponovno odredi masa, doda 40 mL 0,5 M H2SO4 i 0,5 g NaHCO3. Svee povre: izmeri se 100 g (0,01 g) sveeg povra. Uzorak se prenese u avan i usitni. Doda se 5 mL 0,5 M H2SO4 i nastavi usitnjavanje uzorka. Zatim se doda novih 15 mL 0,5 M H2SO4, izmea i filtrira kroz nekoliko slojeva gaze. Zatim se doda 20 mL 0,5 M H 2SO4 u avan, dobro promea i prelije kroz isti filter. Pranje avna se ponovi s 20 mL dejonizirane vode. Kompletan rastvor od ispiranja sakupi se u Elermayer od 250 mL u koju se doda 0,5 g NaHCO3

Odpipetira se 25 mL standardnog rastvora KIO3 u pripremljen rastvor uzorka, doda 1 g KI a zatim 5 mL 0,5 M rastvora H2SO4 i 0,1 g NaHCO3. Viak I3 - u uzorku se titruje standardnim rastvorom Na2S2O3. Analizu ponoviti (najmanje tri puta); sadraj askorbinske kiseline treba biti u granicama 1%.

Odreivanje askorbinske kiseline sa 2,6 dihlor-fenol-indofenolomPrincip i primena Metoda se zasniva na sposobnosti 2,6-dihlor-fenol-indofenola (DCP) da oksiduje askorbinsku kiselinu i da pri tom prelazi u bezbojnu leuko-bazu.Metoda se primenjuje pri odreivanju askorbinske kiseline u bombonama.

3

Ovakav postupk odreivanja askorbinske kiseline ometa prisustvo proteina koje treba ukloniti. Stoga se pre titracije DCP-om uzorak zakiseli metafosfornom kiselinom (HPO3)n ili siretnom kiselinom. Osim to slui za taloenje proteina dodatkom kiseline utie se i na stabilizaciju molekula askorbinske kiseline. Standradni rastvor2,6-dihlor-fenol-indofenola (DCP) je tamno plave boje, pri niim pH vrednostima (kisela sredina) plava boja prelazi u crvenu, dok je redukovani oblik DCP-a bezbojan. Postupak Standardizacija rastvora Pre upotrebe se rastvor 2,6-dihlor-fenol-indofenola standardizuje askorbinskom kiselinom. U erlenmajer zapremine 100 ml otpipetira se 10 ml standardnog rastvora i titruje rastvorom 2,6-dihlor-fenol-indofenolom do ruiaste boje, koja mora biti postojana 15 s. Titar rastvora 2,6-dihlor-fenol-indofenola izraunava se prema formuli: . E = A/Z . gde je: E titar 2,6-dihlor-fenol-indofenola, u mg/ml; A masa askorbinske kiseline u 10 ml standardnog rastvora, u mg; Z zapremina 2,6-dihlor-fenol-indofenola utroena za titraciju 10 ml standardnog rastvora askorbinske kiseline, u ml. Postupak U odmernu tikvicu zapremine 100 ml odmeri se, s tanou od 0,1 mg, koliina usitnjenih bombona koja sadri 5 do 10 mg askorbinske kiseline, rastvori se i do oznake dopuni 2%-nom siretnom ili oksalnom kiselinom. U erlenmajer zapremine 100 ml otpipetira se 10 ml tog rastvora i titrira rastvorom 2,6-dihlorfenol-indofenola do pojave ruiaste boje, koja mora biti postojana 15 s. Pri pripremanju uzorka mora se paziti da uzorak ne doe u dodir s metalom da askorbinska kiselina ne bi oksidovala. Izraunavanje Koliina askorbinske kiseline izraunava se po formuli: askorbinska kiselina (mg/100 g) = V * E * 10/c * 100 gde je: V 2,6-dihlor-fenol-indofenol utroena za titraciju 10 ml probnog rastvora, u ml; E titar 2,6-dihlor-fenol-indofenola, u mg/ml;

4

c masa uzorka, u g.

Preciznost metode Razlika izmeu rezultata dva uporedna odreivanja, ne sme biti vea od 5% od utvrene srednje vrednosti (relativna disperzija). Ako je razlika vea od 5%, postupak se mora ponoviti.

5