LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

Mindaugas Kirjanovas

Vitamino E preparatų analizė efektyviosios skysčių

chromatografijos metodu

Magistro darbas

Darbo vadovas:

prof. dr. L. Ivanauskas

KAUNAS, 2014

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

Data:

Vitamino E preparatų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos būdu

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Liudas Ivanauskas

Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantas

Mindaugas Kirjanovas

Data Data

KAUNAS, 2014

3

TURINYS

SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5

SUMMARY ............................................................................................................................................. 6

1. ĮVADAS ............................................................................................................................................... 7

2. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI .................................................................................. 8

3. LITERATŪROS APŽVALGA ............................................................................................................ 9

3.1. Vitaminas E. Cheminė struktūra ir fizikinės savybės. .................................................................. 9

3.2. Vitamino E absorbcija žarnyne ................................................................................................... 10

3.3. Vitamino E metabolizmas ........................................................................................................... 11

3.4. Antioksidacinis poveikis ............................................................................................................. 13

3.4.1. Laisvųjų radikalų neutalizacija. Neutralizacijos mechanizmas ............................................ 13

3.4.2. Antioksidacinis poveikis in vivo. Kai kurių ligų gydymas bei profilaktika vitaminu E ...... 14

3.5. Vitamino E trūkumas .................................................................................................................. 16

3.6. Rekomenduojamos vitamino E paros normos ............................................................................. 17

3.7. Pagrindiniai Vitamino E šaltiniai ................................................................................................ 17

3.8. Vitamino E preparatai, jų sudėtis ................................................................................................ 18

3.8.1. Receptiniai vaistai ................................................................................................................ 18

3.8.3. Kai kurie kompleksiniai preparatai ir maisto papildai, į kurių sudėtį įeina vitaminas E ..... 19

3.8.4. Preparatų sudėties apibendrinimas ....................................................................................... 21

3.9. Vitamino E preparatų analizė ...................................................................................................... 22

3.9.1. Tokoferolio acetato kiekybinio nustatytmo efektyviosios skysčių chromatografijos sistema

pavyzdžiai ....................................................................................................................................... 22

4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA ............................................................................................ 25

4.1. Tyrimo objektas ........................................................................................................................... 25

4.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ....................................................................... 25

5. REZULTATAI ................................................................................................................................... 27

5.1. Metodo validacija ........................................................................................................................ 27

5.1.1. Metodikos specifiškumas ..................................................................................................... 27

4

5.1.2. Tiesiškumas .......................................................................................................................... 29

5.1.3 Glaudumas ............................................................................................................................. 30

5.1.4. Tikslumas ............................................................................................................................. 31

5.2. Tokoferolio acetato preparatų analizės rezultatai ........................................................................ 32

6. REZULTATŲ APTARIMAS ............................................................................................................ 40

7. IŠVADOS ........................................................................................................................................... 42

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS .............................................................................................................. 43

5

SANTRAUKA

M. Kirjanovo magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. Dr. L. Ivanauskas; Lietuvos

sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. –

Kaunas

Nuolatos plečiantis maisto papildų rinkai ir augant naujai sukuriamų papildų kiekiui

būtina sukurti greitas, tikslias ir efektyvias papildų analizės metodikas, norint užtikrinti į rinką

tiekiamų farmacinių prepartų kokybę. Vitamino E nustatymui efektyviosios skysčių chromatografijos

būdu yra sukurta nemažai įvairių metodikų, tačiau svarbu žinoti, kuri metodika yra efektyviausia

būtent vitamino E preparatams.

Tyrimo tikslas - atlikti kokybinį ir kiekybinį tokoferolio acetato nustatymą pritaikant

efektyviosios skysčių chromatografijos metodą bei surasti efektyviausią tokoferolio acetato

ekstrakcijos metodiką vaistinių preparatų analizei.

Tyrimo uždaviniai - surinkti ir apibendrinti informaciją apie vitaminą E, jo poveikį

organizmui, maisto papildus su tokoferolio acetatu bei jų analizę; optimizuoti metodiką tokoferolio

acetato preparatų analizei efektyviosios skysčių chromatografijos būdu ir ją validuoti; atlikti

tokoferolio acetato preparatų (maisto papildo ir vaistinio preparato) paruošimą analizei įvairiomis

ekstrakcijos metodikomis; išanalizuoti gautus duomenis ir padaryti išvadas apie efektyviausias

ekstrakcijos metodikas bandinių paruošimui bei skirtumus tarp vaistinio preparato ir maisto papildo

analizės.

Metodas – tyrimas atliktas chromatografine sistema su fotodiodų matricos detektoriumi.

Mobilioji fazė – metanolis:distiliuotas vanduo (95:5), tekėjimo greitis – 1.2 ml/min, bandinio tūris – 10

µl, trukmė – 14 min, bangos ilgis – 282 nm. Išbandytos preparatų ekstrakcijos metodikos – tirpinimas

etanolyje, tirpinimas etanolyje ir ekstrakcija heksanu, muilinimo reakcija ir muilinimo reakcija

pridėjus antioksidanto (askobro rūgšties).

Tyrimo rezultatai – geriausias duomenų atkūrimas gautas ištirpinus preparatus etanolyje

(1,151 mg/ml tokoferolio acetato tirpalui ir 0.992 mg/ml kapsulėms) bei vykdant ekstrakciją heksanu

(atitinkamai 1.193 mg/ml ir 0.787 mg/ml).

Išvados – tinkamiausia metodika aliejinio tokoferolio acetato tirpalo paruošimui -

ekstrakcija heksanu, o kapsulėms – tirpinimas etanolyje kaitinant tirpalą, kad geriau suirtų apvalkalas.

Muilinimo reakcijos preparatams nerekomenduojamos. Vaistinis preparatas yra dozuotas tiksliau nei

maisto papildas.

6

SUMMARY

The food supplements market is constantly growing and new products are entering it

everyday. In order to assure the quality of these pharmaceuticals it is important to develop methods of

analysis which are fast, precise and effective. There are many methods created for the analysis of

vitamin E using high-performance liquid chromatography so it is important to know which of them are

the most effective for vitamin E food supplements.

The aim – to perform a qualitative and a quantitive assey of tochopherol acetate using

high performance liquid chromatography and to find the most effective method of extracting

tocopherol acetate from food suplements.

The tasks – to collect and to summarize the data on vitamin E, its effects on human body,

on the supplements containing tocopherol acetate and their analysis; to develop a high-performance

liquid chromatography method of analysis suitable for the pharmaceuticals containing tocopherol

acetate ant to validate it; to perform a tocopherol acetate (a food supplement and a drug) samples

preparation using different techniques chosen; to analyze the data collected and to make conclusions

about the most effective way of preparing samples for the analysis and about the differences between a

drug and a food supplement analysis.

The method – the study was conducted by high-performance liquid chromatography

using a photodiode matrix detector. Mobile phase – methanol:purified water (95:5), flow-rate – 1.2

ml/min, injection volume – 10 µl, detection was performed at 282 nm and each run lasted 14 min.

Sample preparation – dissolving in ethanol, dissolving in ethanol and extracting in hexane,

saponification and saponification adding antioxidants (ascorbic acid) – were tested.

The findings – the best results were reached by dissolving the pharmaceuticals in ethanol

(1,151 mg/ml for the tocopherol acetate solution and 0.992 mg/ml for the capsules) and by performing

an extraction in hexane (1,193 mg/ml and 0.787 mg/ml respectively).

The conclusions – the best method for preparing samples of a tocopherol acetate solution

is its extraction in hexane and for the capsules it’s heating them up in ethanol to remove their coating.

A drug is dosed more precisely than a food supplement.

7

1. ĮVADAS

Vitaminai – tai būtini ir nepakeičiami junginiai, padedantys pagerti žmonių sveikatą ir

gyvenimo kokybę. Maisto papildai, į kurių sudėtį įeina įvairūs vitaminai, tai viena didžiausių ir

plačiausiai vartojamų farmacinių produktų kategorijų. Kochanskienės ir kt (2010) atliktoje Lietuvos

vaistinių klientų apklausoje paaiškėjo, jog 100 procentų respondentų per pastaruosius metus vartojo

maisto papildus. Dažniausiai buvo vartoti multivitaminų preparatai, tačiau monovitaminų preaparatai

vartojami irgi dažnai. Vitamino E preparatus per paskutinius metus vartojo daugiau nei 20 %

respondentų [2]. Kadangi tai tikrai svarbi ir labai dažnai vartojama produktų grupė, būtina sukurti

patikimas papildų analizės metodikas, kurios leistų greitai, efektyviai ir nebrangiai užtikrinti

gaminamų papildų kokybę.

Farmakopėjoje aprašyta tokoferolio acetato analizė naudojant dujų chromatografiją,

tačiau efektyviosios skysčių chromatografijos metodas yra labiau paplitęs ir prieinamesnis, todėl

svarbu sukurti ir validuoti tokoferolio acetato analizės metodą, kas užtikrintų paprastesnę tokoferolio

acetato papildų kontrolę.

Riebaluose tirpių vitaminų preparatuose vitaminai visada būna ištirpinti nedideliame

kiekyje aliejaus. Tai kelia papildomų sunkumų analizuojant preparatus, nes aliejinio tirpalo negalima

tiesiogiai injekuoti į chromatografijos sistemą. Mokslinėje literatūroje siūloma nemažai skirtingų

metodų riebaluose tirpių vitaminų bandiniams ekstrahuoti. Visi jie turi savų teigiamų ir neigiamų

savybių, todėl svarbu žinoti, koks paruošimo būdas geriausiai tinka tiriamajai medžiagai, šiuo aveju

tokoferolio acetato papildams.

Darbo tikslas

Tyrimo tikslas - atlikti kokybinį ir kiekybinį tokoferolio acetato nustatymą pritaikant efektyviosios

skysčių chromatografijos metodą bei surasti efektyviausią tokoferolio acetato ekstrakcijos metodiką

vaistinių preparatų analizei.

8

2. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI

Darbo tikslas

Tyrimo tikslas - atlikti kokybinį ir kiekybinį tokoferolio acetato nustatymą pritaikant efektyviosios

skysčių chromatografijos metodą bei surasti efektyviausią tokoferolio acetato ekstrakcijos metodiką

vaistinių preparatų analizei.

Darbo uždaviniai

1. Susisteminti mokslinę literatūrą, susijusią su vitaminu E, jo poveikiu organizmui,

tokoferolio acetato vaistiniais preparatais bei jų analize.

2. Optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, ją validuoti ir

pritaikyti tokoferolio acetato preparatų analizei.

3. Atlikti tokoferolio acetato preparatų (maisto papildo ir vaistinio preparato) ekstrakciją

įvairiais literatūroje aprašytais metodais.

4. Apibendrinti gautus rezultatus bei pateikti išvadas apie atliktą tyrimą.

9

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Vitaminas E. Cheminė struktūra ir fizikinės savybės.

Vitaminas E buvo atrastas 1922 metais mokslininkų Evans ir Bishop, kurie ištyrė jog jis

yra būtinas apsaugoti nėščias žiurkes nuo vaisiaus resorbcijos. (Evans, Bishop, 1922; cit iš Traber,

2007) [63]. Vitamino E poveikiu pasižymi aštuoni struktūra labai panašūs tokoferoliai ir

tokotrienoliai, kurie visi yra kilę iš 6- chromanolio. Tokoferoliai ir tokokotrienoliai žymimi

graikiškomis raidėmis α-, β-,γ-, δ-. Jie vienas nuo kito skiriasi metilo grupių skaičiumi ir išdėstymu

benzolo žiede.[1].

1 pav. Vitamino E poveikiu pasižymintys tokoferoliai ir tokotrienoliai (Brigelius-Flohé ir kt. [10]).

In vivo, biologinis šių junginių vitamininis E aktyvmas skiriasi. Tam įtakos turi: 1 -

metilo grupių buvimas arba nebuvimas žiedo 5, 6 ar 8 padėtyse, 2 - anglies atomų skaičius šalutinėje

grandinėje, 3 - 2, 4’ ir 8’ anglies atomų stereospecifiškumas, 4 – šaulutinės grandinės šakotumas, 5 –

chromanolio žiedas lyginant su furanolio žiedu, 6 – šalutinės grandinės prisijungimo prie žiedo vieta

[17].

10

Stipriausiu vitamininiu E aktyvumu pasižymi alfa-tokoferolis. Tai chiralinė molekulė,

turinti aštuonis stereoizomerus. Gamtoje randamas RRR-alfa-tokoferolis (chiraliniai anglies atomai yra

R-konformacijoje, 2‘ , 4‘ ir 8‘ pozicijose [9], o sintetiškai gaminamas all-rac-alfa-tokoferolis (arba dl-

alfa-tokoferolis), visų aštuonių stereoizomerų mišinys [33]. Vitamino E papilduose dažnai vartojami ir

tokoferolių acetatų ar sukcinatų esteriai, norint prailginti tokoferolių stabilumą ir preparatų galiojimo

laiką. Visi šie junginiai (alfa-tokoferolis, jo acetato ar sukcinato esteris) organizme absorbuojami

panašiai [14]. Visi stereoizomerai turi vienodas antioksidantines, bet skirtingas biologines savybes. [9]

Tokoferoliai yra bespalviai aliejai, gerai tirpstantys riebaluose ir riebalų tirpikliuose,

atsparūs temperatūros poveikiui, tačiau greitai suyra, veikiami ultravioletinės spinduoliuotės [1].

3.2. Vitamino E absorbcija žarnyne

Visų riebaluose tirpių vitaminų absorbcija yra susijusi su riebalų absorbcija žarnyne.

Riebalai yra būtini vitamino E absorbavimu. Jeans ir kt (2004) įrodė, jog vitamino E preparatus

vartojant su riebalų turinčiu maistu, vitamino E koncentracija kraujyje būna žymiai didesnė [31].

Be riebalų, riebaluose tirpių vitaminų absorbcijai būtinos tulžies rūgštys ir kasos

fermentai. Jų svarbą įrodo vitamino E trūkumas, kuris pasireiškia pacientams, sergantiems cistine

fibroze arba cholestatine kepenų liga [42]. Su maistu gauti riebaluose tirpūs vitaminai ištirpsta

suvartotuose riebaluose. Tulžies pagalba riebalai yra emulguojami iki micelių. Labai susmulkintos

micelės įsiurbiamos. Specifiniai mechanizmai kaip micelėse ištirpęs vitaminas E įsiurbiamas į žarnų

enterocitus nėra iki galo ištirti [61]. Atliktas tyrimas in vivo ir in vitro parodė, jog baltymas Niemann-

Pick C1-like 1 (NPC1L1), būtinas cholesterolio absorbcijai, gali transportuoti alfa-tokoferolį [47]. Taip

pat tiriamas ir Scavenger receptoriaus B klasės I tipo (SR-BI) poveikis vitamino E pernešimui per

enterocitą. Studija parodė, jog žarnyne išskiriami SR-BI kiekiai bent dalinai įtakoja vitamino E pernašą

[54].

Enterocito įsiurbtas vitaminas E pakuojamas į chilomikronus ir taip patenka į limfos

cirkuliaciją bei yra išnešiojamas po periferinius audinius.

Skirtingai nei kiti riebaluose tirpūs vitaminai, turintys specifinius transporto baltymus

plazmoje, vitaminas E transportuojamas nespecifiškai, visais plazmos lipoproteinais. Chilomikrono

likučiui, turinčiam vitamino E, pasiekus kepenis, atrenkama tik vienintelė vitamino E forma, alfa-

tokoferolis. Alfa-tokoferolio iš visų vitamino E aktyvumą turinčių junginių atrinkimas kepenyse

vykdomas dar iki galo nežinomu procesu, kuriam būtinas kepenų alfa-tokoferolio transporto baltymas

11

[42]. Tai buvo įrodyta tyrimu su pelėmis, šertomis maistu tik su gama tokoferoliu 550, tai pat gama

tokoferoliu 60 ir pėdsakais alfa tokoferolio, taip pat kontroline dieta su mažu kiekiu tokoferolių.

Rezultatai parodė, jog nepaisant didelių gama tokoferolių kiekių maiste, kepenys į plazmą sekretavo

panašų kiekį alfa ir gama tokoferolių [62]. Jei nebūtų alfa-tokoferolio transporto baltymo, plazmoje

būtų buvę žymiai daugiau gama-tokoferolio. Taip pat teigiama, jog alfa tokoferolio transporto baltymo

ekspresiją sukelia oksidacinis organizmo stresas bei hipoksija [66]. Kadangi pagrindinis alfa-

tokofoerolio poveikis – antioksidacinis, tai laisvųjų radikalų, susidarančių organzime hipoksijos ar

oksidacinio streso metu, koncetracijos padidėjimas turėtų aktyvinti alfa tokoferolio transporto baltymo

veiklą ir didinti alfa tokoferolio koncentraciją plazmoje. Alfa-tokoferolis yra kepenų sekretuojamas į

plazmą kartu su labai-mažo-tankio-lipoproteinais (LMTL) [9]. LMTL yra katalizuojamas lipoproteazės

lipazės, suformuojant mažo tankio lipoproteinus (MTL), kurie yra pagrindiniai vitamino E nešėjai į

periferinius audinius. Hidrolizės būdu MTL gali būti perkeliami į DTL ir į audinius [42].

3.3. Vitamino E metabolizmas

Mechanizmai, kuriais reguliuojama tokoferolių koncentracija periferiniuose audiniuose,

dar nėra iki galo išaiškinti, tačiau iš kelių atliktų tyrimų galima daryti išvadą, jog tokoferolių

koncentracija yra reguliuojama. Pirmiausia, dideli pavartoto alfa-tokoferolio kiekiai tik truputį

padidina jo koncentraciją plazmoje. Antra, tokoferolio kiekiai audiniuose ir kraujo plazmoje

neatsipindi suvartoto tokoferolio kiekio [58].

Tokoferolis turi du metabolinius kelius. Vienas veda į šalutinės grandinės degradaciją

prieš tai suskaldžius chromano žiedą o kitas- šalutinės grandinės degradacija išlaikant chromano žiedą

[36].

Žmogaus citochromas P450 4F2 (CYP4F2) katalizuoja pradinę omega-hidroksilacinę

reakciją iš tokoferolių ir tokotrienolių į karboksichromanolus ir yra vienintelis fermentas, galintis

metabolizuoti vitaminą E. Tokoferoliai ir tokotrienoliai yra metabolizuojami iki vandenyje tirpių

metabolitų kai jų šalutinė grandinė sutrumpinama iki 3‘ anglies atomo. Pirmiausia vyksta galutinio

šalutinės grandinės metilo atomo omega-hidroksilacija, katalizuojama CYP4F2 fermento, kuris veikia

kaip tokoferol-omega-hidroksilazė. Šio proceso greičiui įtakos turi metilo grupių išsidėliojimas

chromanono žiede, ypač 5 padėtyje. Ten esanti metilo grupė pagreitina metabolizmą. Taip pat svarbus

sočiųjų jungčių skaičius šalutinėje grandinėje. Tokotrienoliai, turintys nesočiųjų jungčių,

metobolizuojami lėčiau nei tokoferoliai. Vėliau seka susidariusio 3‘ karboksichromanolio beta-

12

oksidacija. Karboksichromanolai vėliau palaipsniui yra sujungiami su gliukouronatu ir palaipsniui

išskiriami į šlapimą [58].

Pagrindinė vitamino E metabolizmo vieta yra kepenų ląstelės ir tai yra patvirtinta

daugybe tyrimų, atliktų su kepenų hepG2 ląstelėmis, tačiau nauji duomenys rodo, kad vitaminą

metabolizuoti gali ir plaučių epitelio ląstelės [30].

13

3.4. Antioksidacinis poveikis

3.4.1. Laisvųjų radikalų neutalizacija. Neutralizacijos mechanizmas

Vitaminas E yra radikalus neautralizuojantis antioksidantas, kuris apsaugo membranas ir

plazmos lipoproteinus nuo laisvųjų radikalų. Iš visų vitamino E formų, geriausiu antioksidaciniu

poveikiu in vitro pasižymi alfa tokoferolis, nepriklausomai nuo tirpiklio, kuriame vykdoma reakcija

[64]. Kai susiformuoja peroksilo radikalai (ROO•), jie 1000 kartų greičiau reaguoja su vitaminu E (vit.

E-OH) nei su nesočiosiomis riebiosiomis rūgštimis (RH) [9]. Taip vitaminas E apsaugo membranas ir

plazmos lipoproteinus.

Esant vitaminui E peroksilo radikalai reaguoja taip:

ROO• + Vit.E-OH → ROOH + Vit. E-O•

Vitamino E neesant, reakcija vykta taip:

ROO• + RH → ROOH + R•

R• + O2 → ROO• [9]

Vitamino E radikalų neutralizavimo greitis yra lygus greičio konstantos kE (ji priklauso

nuo radikalų tipo ir reakcijos aplinkos sąlygų), vitamino E koncentracijos ir radikalų koncentracijos

sandaugai :

Radikalų neautralizavimo greitis = kE[Vit.E][radikalo]

Radikalų neautralizavimo greitį lemia tirpiklio, kuriame vyksta reakcija, prigimtis. Pavydžiui, jeigu

susiformuoja vandenilinės jungtys tarp vitamino e ir tirpiklio, tokio kaip etanolis, reakcija lėtės. Taip

pat vitamino E reaktyvumas mažėja membranose, lipoproteinuose ir micelėse, turbūt dėl pasunkinto

molekulių judėjimo juose.

Susidaręs vitamino E radikalas vit. E-O• gali reaguoti su kitu radikalu susidarant stabiliems

produktams, gali reaguoti su lipidais arba su redukuojančiomis medžiagomis, tokiomis kaip askorbatai.

Šiuo būdu regeneruojamas vitamino E kiekis [49]. Svarbiausia yra vitamino E reakcija su vitaminu C.

Vyksta reakcija:

Vit. E-O• + AH → Vit. E- OH + A•

14

Ši reakcija vadinama “Vitamino E perdirbimu”. Jos metu vitamin E antioksidacinį veikimą atstato kiti

antikosidantai [9]. Tiesa, vitaminas E yra riebaluose tirpus, o vitaminas C – vandenyje, todėl nėra

aišku, ar šis mechanizmas tikrai veikia ir in vivo. Atliktos studijos nevienareikšmiškos. R. Bruno ir kt.

(2006) atliktame tyrime nustatyta, jog rūkančių asmenų alfa ir gama tokoferolių kiekis kraujyje

sumažėja, tačiau jį pavyksta atsatyti vitamino C papildais [12]. Taip pat buvo tirtas UV sipndulių

poveikis alfa tokoferoliui odoje. Nustatyta, jog alfa tokoferolis, absorbavęs UV spindulius, skyla į

laisvuosius radikalus bei tai, jog askobro rūgštis padeda atsistatyti vitamino C koncentracijai [34]. Šis

„Vitamino E perdirbimas“ svarbus apsaugant mažo tankio lipoproteinus, kuriais dažniausiai ir

transportuojamas vitaminas E. VE Kagan ir kt. (1992) atliktame tyrime nustatyta, jog mažo tankio

lipoproteinuose askorbatai gali „perdirbti“ vitamino E laisvuosius radikalus į vitaminą E [35].

Vitaminas E, esantis eritrocitų membranose ir kuris saugo jas nuo oksidacinio streso, saugomas jo

laisvuosius radikalus verčiant į vitaminą E dviem būdais – fermentiniu NADH – citochromo B5 keliu

arba nefermentiniu askorbatų arba dihidrolipoidinės rūgšties keliu [16]. Kita vertus, GW Burton ir kt.

(1990) atliktame tyrime su jūros kiaulytėmis nepastebėta tokoferolių koncetracijų skirtumų kraujyje ir

audiniuose tarp jūrų kiaulyčių grupių, šertų vienodu kiekiu tokoferolio ir skirtingų kiekių vitamino C

dieta. Daroma išvada, jog vitamino E ir vitamino C sąveika svarbi tik in vitro [13].

3.4.2. Antioksidacinis poveikis in vivo. Kai kurių ligų gydymas bei profilaktika

vitaminu E

Vitaminas E in vivo apsaugo ląstelių membranas ir plazmos lipoproteidus. Tai gali

užkirsti kelią kai kurioms ligoms atsirasti. Yra nustatytas ryšys tarp padidėjusios ląstelinių oksidantų

koncentracijos ir pagausėjusios ląstelių mutacijos, sukeliančios vėžį, taip pat radikalų sukeltas

pažeidimas ląstelių membranose sukelia lipidų peroksidaciją, kuri sąlygoja laisvųjų radikalų,

žalojančių ląsteles, atsiradimą [38].

Taigi, vitamino E vartojimas galėtų padėti vežio profilaktikai ir gydymui. Atlikti tyrimai

nevienareikšmiški. A Barve ir kt. (2009) atliktas tyrimas parodė, jog gama ir alfa-tokoferoliais

praturtinta dieta sumažino prostatos karcinogenezę pelėse [7] tačiau ME Wright ir kt. (2007) atliktas

tyrimas parodė, jog vitamino E papildai neapsaugo nuo prostatos vėžio, tačiau sumažina kliniškai

reikšmingos ligos pasireiškimą [70]. Tiriant rūkančių asmenų riziką susirgti plaučių vežiu ir vitamino

E įtaką plaučių vėžio atsiradimui, gauti duomenis ir patvirtina [69] ir paneigia [4] vitamino E

antivėžinį poveikį. Didelės vitamino E, ypač vartojant su vitaminu C ir betakarotenu, dozės mažina

15

gaubtinės žarnos vėžio riziką [8]. E Riboli ir R Kaaks atlikta didelės apimties studija EPIC (European

Prospective Investigation into Cancer and Nutrition) atlikta tiriant krūties vėžio rizikos sumažėjimą dėl

vartojamų vitamino D, E ir C, nerado reikšmingo vitamino E antivėžinio poveikio, tačiau pastebėtas

nedidelis antivėžinis poveikis postmenopauzinėje moterų grupėje [55].

Manoma, jog antioksidantai, tokie kaip vitaminas E, mažindami oksidacinį stresą, užkerta

kelią širdies ir kraujagyslių ligoms, taip pat mažina cholesterolio kiekį kraujyje ir mažina riziką

aterosklerozei. Su triušiais atliktas tyrimas parodė, jog hipercholesterolemijos širdžiai sukeliamas

oksidacinis stresas yra sumažinamas vitamino E pagalba [51]. Su žiurkėmis atliktas tyrimas parodė,

jog vitaminas E apsaugo aortą nuo pažeidimų ir trombų esant padidėjusiam cholesterolio kiekiui

kraujyje [37]. Tačiau pacientams, sergantiems širdies ir kraujagyslių ligomis, antioksidantų poveikis,

gerinantis ligos eigą, nenustatytas. Y Ye ir kt. (2013) atliktoje didelės apimties meta-analizėje, kurioje

buvo apžvelgtos 293 studijos ir tirti 188209 pacientai, buvo nustatyta, jog antioksidantai (vitaminas E,

betakarotinas ir vitaminas C) neturi jokios įtakos širdies ir kraujagyslių ligų, tokių kaip miokardo

infarktas ar insultas, atsiradimui [29]. Dar daugiau, ER Miller 3rd ir kt. (2005) atlikta meta-analizė net

teigia, jog didelės suvartoto vitamino E dozės (daugiau nei 400 UI per dieną) didina ligonių

mirtingumą [45]. Tačiau yra ir prieštaringų nuomonių. Yakoot M (2012) savo publikacijoje teigia, jog

taikant vitaminą E pacientams, būtina atsižvelgti ne tik į meta-analizes, kurios analizuoja populiacijas,

bet ir į individualius pacientus, jų vartojamus vaistus ir galimą antioksidantų naudą [28].

Didelį oksidacinį stresą patiria pacientai, sergantys cukriniu diabetu. Tai lemia plazmoje

padidėjęs gliukozės kiekis. Tai sukelia plazmos ir ląstelių glikozilinimą, kuris labiausiai pakenkia

kraujagyslių endoteliui. Dėl to diabetu sergantys pacientai patiria daugiau širdies ir kraujagyslių ilgų

komplikacijų nei juo nesergantys [24]. Tai, jog sergant diabetu padidėja organizmo oksidacinis stresas,

yra įrodyta diabetikams sumažėjusia antioksidantų koncentracija kraujyje [26]. Yra užtektinai

mokslinių įrodymų, jog būtų galima teigti, kad vitaminas E sumažina diabeto sukeliamų komplikacijų

riziką. Jain AB ir kt. (2012) atliktoje studijoje nustatyta, jog I ir II tipo diabetu sergantiems pacientams,

vartojusiems insuliną (I tipo diabetas) arba hipoglikeminius vaistus (II tipo diabetas) ir vitamino E

papildus, reikšmingai sumažėjo gliukozės, cholesterolio kiekis kraujyje ir diastolinis kraujo spaudimas,

pasireiškė mažiau širdies ir kraujagyslių ligų bei retinopatijos, lyginant su pacientais, vartojusiais tik

insuliną (I tipo diabetas) arba tik hipoglikeminius (II tipo diabetas) vaistus [32]. Kita studija įrodo, jog

vartojant hipoglikeminius vaistus kartu su vitaminu E labiau sumažinamas oksidacinis stresas ir

kraujagyslių pažaida nei vartojant vien tik hipoglikeminius vaistus [57].

Manoma, jog oksidacinis stresas yra labai svarbus tokių neurodegeneracinių ligų kaip

Azheimerio, Parkinsono liga, išsėtinė sklerozė ar senatvinė demensija patogenezei. Arikangolu ir kt.

(2013) atliktame tyrime buvo tiriami Alzheimerio liga sergančiųjų ir nesergančiųjų kraujo oksidantų ir

16

antioksidantų lygiai. Buvo nustatyta, jog Alzheimerio liga sergančiųjų antioksidantų lygis kraujyje

buvo statistiškai reikšmingai žemesnis nei nesergančiųjų, o oksidantų – aukštesnis [6]. Taigi, tokie

antioksidantai kaip vitaminas E turėtų sumažinti riziką susirgti Alzheimerio liga, tačiau atlikti tyrimai

ir meta-analizės nevienareikšmės. Li ir kt. (2012) atlikta meta-analizė rodo, jog antioksidantai, ypač

vitaminas E, gali sumažinti riziką susirgti Alzheimerio liga [41]. Tačiau A. Isaac ir kt. (2008) atlikta

meta-analizė parodė, jog nėra jokio ryšio tarp vitamino E papildų vartojimo ir Alzheimerio ligos

prevencijos [43]. Tokius prieštaringus duomenis interpretuodami OB Usoro ir SA Mousa (2010) teigia,

jog galbūt neigiamiems gydymo rezultatams įtakos turi tai, jog buvo pacientams buvo skirti vitamino E

preparatai, kuriuose yra alfa-tokoferolis. Jis teigia, jog Alzheimerio ligos prevencijai veiksimingiau

naudoti visų tokoferolių ir tokotrienolių mišinį [67].

A. Hadžović-Džuvo ir kt. (2011) savo darbe įrodė jog pacientų, sergančių išsėtine

skleroze, antioksidantų kiekiai kraujyje irgi būna sumažėję, lyginant su ja nesergančiais. Tai rodo, jog

oksidacinis stresas yra svarbus išsėtinės sklerozės patogenezėje ir kad antioksidantai yra svarbūs šios

ligos terapijoje. [25] Vitamino E poveikiui išsėtinės sklerozės atsiradimui ištirti atlikta meta-analizė

rodo, jog kuo ilgiau buvo vartojami vitamino E papildai, tuo mažesnė buvo sklerozės pasireiškimo

rizika [68] Parkinsono liga sergantiems asmenims taip pat nustatytas antioksidantų kiekio kraujyje

sumažėjimas, o oksidantų – padidėjimas [15]. Gydymui antioksidantais įvertinti atliktos meta-analizės

rodo, jog vitaminas E gali turėti neuroprotekcinį efektą ir sumažinti Parkinsono ligos riziką. M.

Etminam ir kt. (2005) atlikta meta-analizė rado ryšį tarp vitamino E, bet ne vitamino C ar A, ir

sumažėjusios rizikos sirgti Parkinsono liga [19]. Šį poveikį įrodo ir Y. Myake ir kt. (2011) atlikta

studija, rodantį ryšį tarp didesnio vitamino E ir betakaroteno suvartojimo ir mažesnės rizikos sirgti

Parkinsono liga [44].

Apibendrinus gautus duomenis galima daryti išvadą, jog vitamino E efektyvumas širdies

ir kraujagyslių bei vėžinių susirgimų gydymui ir profilaktikai yra abejotinas, tačiau diabeto bei

neurodegeneracinių ligų gydyme ir ypač profilaktikoje jis yra ganėtinai naudingas.

3.5. Vitamino E trūkumas

Riebaluose tirpiųjų vitaminų trūkumas yra ganėtinai retas, nes jie kaupiasi organzimo

riebaluose. Žmonėms jų trūkumas dažniausiai pasireiškia esant genetiniams alfa tokoferolio transporto

baltymo ar lipoproteinų sintezės sutrikimams, taip pat esant įvairiems malabsorbcijos sindromams [9].

Kadangi vitaminas E yra svarbus nervų sistemos antioksidantas, jo trūkumas lemia įvairias

17

neurologines disfunkcijas [65]. Su žiurkėmis atliktas tyrimas parodė, jog vitamino E trūkumas lemia

didesnį jų nervingumą [50]. Vitamino E trūkumas pažeidžia ir kitas sritis – rageną [39], mažina kaulų

masę [21]. Nėštumo metu, trūkstant vitamino E, gali sutrikti vaisiaus centrinės nervų sistemos

vystymasis [46], gali atsirasti hemolizinė mažakraujystė, ypač neišnešiotiems kūdikiams [18].

3.6. Rekomenduojamos vitamino E paros normos

Amerikos maisto ir mitybos tarnyba įvertino rekomenduojamas suvartoti alfa tokoferolio

paros normas, atsižvelgdama į dirbtinai žmonėms sukeltą vitamino E trūkumą ir ryšį tarp vandenilio

peroksido sukeltos eritrocitų lizės ir alfa-tokoferolio koncentracijos plazmoje. Rekomenduojama paros

dozė vyrams ir moterims yra 15 mg alfa-tokoferolio [48].

Tyrimas, atliktas su deuteriu pažymėtu alfa-tokoferoliu impregnuotais obuoliais

patvirtino, jog esant vidutinei 33% alfa-tokoferolio absorbcijai, reikia apie 15 mg alfa-tokoferolio

kasdien, norit pakeisti negrįžtamus jo nuostolius [11].

3.7. Pagrindiniai Vitamino E šaltiniai

Gausiausiu Vitamino E kiekiu pasižymi įvairios sėklos ir aliejai, grūdiniai produktai, taip

pat lapinės daržovės. Jungtinių Amerikos Valstijų žemės ūkio departamento duomenimis, gausiausi

vitaminu E produktai yra įvairių javų dribsniai ( nuo 45 iki net 230 mg/100 gramų produkto), taip pat

aliejai ( kviečių gemalų – 149.4 mg/100 ml, lazdyno riešutų – 47.20 mg/100 ml, saulėgrąžų sėklų –

41.08 mg/100 ml), sėklos ir riešutai (saulėgrąžos – 36.33 mg/100 g, migdolai – 25.97 mg/100 g).

Dideliu vitamino E kiekiu taip pat pasižymi margarinai, įvairūs prieskoniai, užkandžiai su riešutais [5].

Kasdieninėje dietoje didžiausi vitamino E kiekiai gaunami būtent iš aliejų ir sėklių bei vaisių. Garcia-

Closas ir kt. (2004) atliko tyrimą, siekdama išsiaiškinti, kokie pagrindiniai vitamino E šaltiniai ispanų

dietoje. Nustatyta, kad daugiausiai vitamino E gaunama iš augalinių aliejų (26 % iš saulėgrąžų aliejaus

ir 14% iš alyvuogių aliėjaus), daugiau nei 25 procentai – iš vaisių (obuolių ir kriaušių) bei daržovių

(pomidorų ir salotų). Kiti riebalų šaltiniai, tokie kaip margarinas, majonezas ar sviestas suteikė mažiau

nei 5% viso suvartoto vitamino E [22].

18

3.8. Vitamino E preparatai, jų sudėtis

Buvo apžvelgti įvairūs Lietuvos rinkoje esantys vitamino E preparatai arba kompleksiniai

preparatai, į kurių sudėtį įeina vitaminas E. Įvertinta preparatuose naudota vitamino E forma, kitos

sudedamosios medžiagos, naudotos pagalbinės medžiagos, vitamino E kiekis. Informacija apie

preparatų sudėtį imta iš www.vaistai.lt

3.8.1. Receptiniai vaistai

Lietuvos rinkoje yra šie tokoferolio acetato preparatai, parduodami tik su receptu:

Vitaminas E Medana geriamieji lašai, tirpalas 300mg/ml, 10ml – gamina įmonė „Medana Pharma“.

Sudėtis: alfa-tokoferolio acetatas (300 mg/ ml tirpalo), žemės riešutų aliejus.

Vitaminum E HASCO-LEK 100mg kapsulės N30 – gamina "Przedsiebiorstwo Produkcji

Farmaceutycznej HASCO-LEK". Sudėtis: visų racematų alfa-tokoferolio acetatas (100 mg /

kapsulėje), žemės riešutų aliejus. Kapsulės korpuse: želatina, glicerolis, kochinelo raudonasis.

Vitaminum A+E HASCO - LEK 30000TV/70mg kapsulės N30 - gamina "Przedsiebiorstwo Produkcji

Farmaceutycznej HASCO-LEK". Sudėtis: retinolio palmitatas (30000 TV / kapsulėje), visų racematų

alfa- tokoferolio acetatas (70 mg / kapsulėje), žemės riešutų aliejus. Kapsulės korpusas – želatina,

glicerolis.

3.8.2. Nereceptiniai preparatai ir maisto papildai

Vitaminas E 90mg kapsulės N20 – gamina „Mialteks“. Sudėtis: alfa-tokoferilacetatas (90 mg /

kapsulėje), augalinis aliejus, maistinė želatina, drėgmę išlaikanti medžiaga glicerolis.

Vitaminas E Dr.Smiths 200mg kapsulės N10x10 – gamina „Cipla Ltd“. Sudėtis: alfa-tokoferolio

acetatas (200 mg / kapsulėje), žemės riešutų aliejus.

19

Vitaminas E Dr.Smiths 400mg kapsulės N10x10 – gamina „Cipla Ltd“. Sudėtis: alfa-tokoferolio

acetatas (400 mg / kapsulėje), žemės riešutų aliejus.

Vitamin E 400 I.U. Highway N30 – gamina „Contract Pharmacal Corporation“. Sudėtis: DL – alfa

tokoferilacetatas 400 mg), želatina, sojų aliejus, drėgmę išlaikanti medžiaga – glicerolis.

Vita ES 200mg kapsulės N30 – gamina “Vitabalans oy”. Sudėtis – d-alfa-tokoferolis (200 mg /

kapsulėje).

3.8.3. Kai kurie kompleksiniai preparatai ir maisto papildai, į kurių sudėtį įeina

vitaminas E

Vitaminas A+E GSK 2500TV/50mg kapsulės N30 – gamina „GlaxoSmithKline Pharmaceuticals“.

Sudėtis: retinolio acetatas (2500 TV / kapsulėje), visų racematų alfa-tokoferolio acetatas (50 mg /

kapsulėje), oktilo galatas, žemės riešutų aliejus. Kapsulės korpusas – želatina, glicerolis, išgrynintas

vanduo.

Highway Vitamin A+E kapsulės N30 – gamina „Contract Pharmacal Corporation“. Sudėtis: retinilo

acetatas (825 mkg / kapsulėje), DL – alfa-tokoferilacetatas (75 mg / kapsulėje), lipnumą

reguliuojančios medžiagos: dikalcio fosfatas, silicio dioksidas; stearino rūgštis; magnio stearatas;

stabilizatorius: skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė; kapsulę sudaranti medžiaga: želatina.

Selezin ACE tabletės N30 – gamina „Walmark“. Sudėtis: laktozė, lipnumą reguliuojančios medžiagos:

mikrokristalinė celiuliozė, magnio stearatas, talkas,silicio dioksidas; cinko gliukonatas, L-askorbo

rūgštis, selenu papildytos mielės, D-alfa-tokoferilacetatas (15 mg / tabletėje), stabilizatoriai:

hidroksipropilmetilceliuliozė, hidroksipropilceliuliozė; piridoksino hidrochloridas, retinilo acetatas,

dažiklis titano dioksidas, medvilnės sėklų aliejus.

CRAZYVIT šnypščiančiosios čiulpiamosios tabletės N60 – gamina „Nycomed“. Sudėtis: Kalcio

karbonatas, rūgštingumą reguliuojanti medžiaga citrinų rūgštis, natrio vandenilio karbonatas, askorbo

rūgštis, emulsiklis riebalų rūgščių magnio druskos, nikotinamidas, dl-α-tokoferolio acetatas (10 mg /

tabletėje), kvapiosios medžiagos, saldikliai: sorbitolis, aspartamas, acesulfamas K; kalcio D-

pantotenatas, riboflavinas, tiamino mononitratas, retinolio palmitatas, piridoksino vandenilio chloridas,

folio rūgštis, biotinas, cholekalciferolis, ciankobalaminas.

20

Eunova Direkt 1.5g granulės N20 – gamina „Hemofarm“. Sudėtis: Kalcio karbonatas, sorbitolis,

rūgštingumą reguliuojanti medžiaga natrio citratas, magnio oksidas, L-askorbo rūgštis, užpildai:

manitolis, magnio citratas, natrio askorbatas, citrinų rūgštis, kvapiosios medžiagos, BHA , BHT ir

askorbilpalmitatas , želatina, gumiarabikas, antioksidantas liuteinas, kukurūzų krakmolas,

maltodekstrinas, riebiųjų rūgščių vidutinės grandinės trigliceridai, mono- ir digliceridai, modifikuotas

krakmolas, natrio selenatas, nikotinamidas, palmių aliejus, acesulfamas K ir aspartamas, magnio

stearatas) ir silicio dioksidas, natrio karboksimetilceliuliozė, retinilo palmitatas, tiamino mononitratas,

natrio riboflavin-5-fosfatas, piridoksino hidrochloridas, cianokobalaminas, cholekalciferolis, D-alfa-

tokoferilo rūgšties sukcinatas (12 mg / granulėje), fitomenadionas, D-biotinas, kalcio D-pantotenatas,

pteroilmonoglutamo rūgštis, cinko citratas.

Jamieson Vita Vim kramtomosios tabletės N60 – gamintojas „Jamieson laboratories“. Sudėtis:

Gliukozė, ortofosforo rūgšties kalcio druskos, lipnumą reguliuojanti medžiaga mikrokristalinė

celiuliozė, saldiklis manitolis, rūgštingumą reguliuojanti medžiaga citrinų rūgštis, L-askorbo rūgštis,

debetinė kvapioji medžiaga (maltodekstrinas, modifikuotas maistinis krakmolas, bevandeniai pieno

riebalai, iš dalies hidrintas sojų aliejus), magnio oksidas, augalinė stearino rūgštis, nikotinamidas,

augalinis magnio stearatas, braškių kvapioji medžiaga, vaivorų kvapioji medžiaga, lipnumą

reguliuojanti medžiaga silicio dioksidas, D-alfa-tokoferilacetatas (16,8 mg / tabletėje), aviečių kvapioji

medžiaga, geležies fumaratas, kalcio d- pantotenatas, dažiklis karminas, riboflavinas, piridoksino

hidrochloridas, sacharozė, tiamino mononitratas, vario citratas, beta-karotenas, retinilo acetatas,

liuteinas (iš didžiojo serenčio (Tagetes erecta) žiedų), pteroilmonoglutamo rūgštis, kalio jodidas, D-

biotinas, cianokobalaminas, cholekalciferolis.

NUTRISAVE Multivitaminai tabletės N60 – gamintojas „Principle Healthcare International“. Sudėtis:

kalcio karbonatas, lipnumą reguliuojanti medžiaga mikrokristalinė celiuliozė, askorbo rūgštis,

nikotinamidas, lipnumą reguliuojanti medžiaga silicio dioksidas, DL-alfa-tokoferilacetatas, kalcio D-

pantotenatas, maltodekstrinas, emulsiklis hidroksipropilmetilceliuliozė, emulsiklis akacijų sakai,

lipnumą reguliuojanti medžiaga magnio stearatas, cukrozė, kukurūzų krakmolas, piridoksino

hidrochloridas, dažiklis titano dioksidas, tiamino hidrochloridas, retinilo acetatas, riboflavinas,

hidroksipropilceliuliozė, DL-alfa-tokoferolis (10 mg / tabletėje), vidurinės grandies trigliceridai,

lipnumą reguliuojančios medžiagos trikalcio fosfatas ir dikalcio fosfatas, propileno glikolis, folio

rūgštis, cholekalciferolis, ciankobalaminas.

21

3.8.4. Preparatų sudėties apibendrinimas

Iš pasirinktų preparatų, didžiojoje daugumoje yra sintetinio alfa-tokoferolio, kuris, kaip

jau minėta, yra visų aštuonių stereoizomerų mišinys. Preparatų sudėtyje jis įvardinamas skirtingai – d-

alfa-tokoferolis (pavyzdžiui Selezin ACE), dl-alfa-tokoferolis (Vita ES 200mg), visų racematų alfa-

tokoferolis (Vitaminum E HASCO-LEK). Iš 15 apžvelgtų preparatų, 11 buvo naudotas šis sintetinis

alfa-tokoferolis, o keturiuose (Vitaminas E Medana geriamieji lašai, Vitaminas E 90mg, Vitaminas E

Dr.Smiths 200mg, Vitaminas E Dr.Smiths 400mg) – natūralus alfa-tokoferolis. Tik dviejuose

preparatuose (Vita ES 200mg, NUTRISAVAVE) naudojama neesterifikuota alfa-tokoferolio forma.

12 preparatų alfa-tokoferolis vartojamas acetato esterio pavidalu, viename (Eunova Direkt) – sukcinato

esterio. Alfa-tokoferolio esterių naudojimas farmacijos produktams prailgina produktų galiojimo laiką,

o, kaip jau minėta, šio vitamino absorbcijai neturi jokios įtakos tad tai nėra neigiamas dalykas.

Preparatai, į kurių sudėtį įeina tik alfa-tokoferolis arba alfa-tokoferolis kartu su riebaluose tirpiais

vitaminais, pateikiami kapsulių ar lašų forma, o vitaminai ištirpinti aliejuje. Dažniausiai naudojamas

žemės riešutų aliejus, viename preparate (Vitaminas E 90mg) nurodytas tiesiog augalinis aliejus ir

nepatikslinta jo rūšis, dar viename preparate (Vitamin E 400 I.U.) vartojamas sojų aliejus. Duomenų,

jog būtent žemės riešutų aliejus yra geriausias šiai vaistų formai ruošti nepavyko rasti. Preparatuose

vartojami įvairūs alfa-tokoferolio kiekiai. Tuose preparatuose, kuriuose yra vien tik alfa-tokoferolis

arba jis kartu su riebaluose tirpiais vitaminais, alfa-tokoferolio dozės labai didelės, iki 400 mg vienoje

kapsulėje. Šie preparatai skirti vartoti esant vitamino E avitaminozei, tad šios dozės yra racionalios.

Multivitaminų preparatuose dozės skiriasi nuo 10 mg iki 16,8 mg, tad varijuoja nedaug nuo vidutinės

alfa-tokoferolio paros dozės – 15 mg.

22

3.9. Vitamino E preparatų analizė

Nors farmakopėjoje aprašytas kiekybinis tokoferolio aceatato nustatymo metodas yra

dujų chromatografija [20], jis jau yra kiek pasenęs ir praktikoje dažniausiai naudojamas efektyviosios

skysčių chromatografijos metodas, kuris yra greitesnis ir efektyvesnis

Bandinių paruošimui egzistuoja daugybė įvairių metodikų. Metodikos parinkimas

paprastai priklauso nuo bandinių kilmės, priemaišių kiekio ir tipo ir panašių salygų.

Anot Ruperez ir kt. „Išskyrus vitamino E analizę aliejuose, kurie gali būti tiesiogiai

injekuoti į efektyviosios skysčių chromatografijos sistemą po ištirpinimo, vitaminas E turi būti

ekstrahuotas iš bandinio matricos ir kai kuriais atvejais koncetruojamas“ [65]. Bandinys turi būti

paveikiamas organiniu tirpikliu, norint suardyti struktūras, kurios gali būti susijungusios su su

tokoferolio acetatu (lipoproteinais, riebalų lašeliais). Beveik visada naudojamas etanolis, tačiau kartais

naudojamas ir metanolis [56]. Tokoferolio acetato ekstrakcijai iš matricos naudojami įvairūs tirpikliai-

heksanas, heksano – benzeno mišinys, heksano – etilo acetato mišinys, chloroformas, chloroformo –

acetono mišinys ir kiti. Dažniausiai naudojamas heksanas, tačiau Qian ir kt. (1998) įrodė, kad kai

kuriais atvejais heksanas nėra efektyviausias ir labiau tinka acetono-chloroformo mišinys [52].

Naudojant heksaną kaip ekstrahentą, ir bandinį analizuotant atvirkštinės fazės chromatografijos būdu,

būtina tirpiklį pakeisti kitu, poliškesniu. Tai atliekama išgarinant heksaną skysto azoto srove ir

išekstrahuotą tokoferolio acetato likutį ištirpinant poliniame tirpiklyje [56]. Kai kuriais atvejais

atliekamos saponifikacijos reakcijos, kuomet ištirpintas bandinys ištirpintas organiniame tirpiklyje,

kaitinamas su šarmu. Tokiu atveju nesaponifikuoti komponentai, tokie kaip vitaminas E, pereina į

organinio tirpiklio fazę, o riebiosios rūgštys, glicerolis ir kitos medžiagos, galinčios trukdyti analizei

lieka šarmo fazėje [52]. Temeratūriniai ir cheminiai veiksniai gali suardyti dalį tokoferolio acetato.

Sukeliamą ardantį cheminį ir temperatūrinį bandoma sumažinti į tirpalą pridėjus antioksidantų –

butilohidroksitolueno, pirogalolio ar askobro rūgšties [56].

3.9.1. Tokoferolio acetato kiekybinio nustatytmo efektyviosios skysčių

chromatografijos metodu pavyzdžiai

SK Jensen ir C Lauridsen (2007) aprašytas metodas, kuriuo galima nustatyti kiekybinę ir kokybinę

tokoferolio sudėtį naudojant normalios fazės aukšto slėgio skysčių chromatografiją (ASSC) bei vėliau

23

sekančio alfa tokoferolio stereoizomerų metilo esterių pavidalu atskyrimo naudojant chiralinę ASCC

[33].

Proceso eiga:

Homogenizuoti tiriamąjį pavyzdį šaltame etanolyje

↓

Muilinimo reakcija su KOH esant 80º C

↓

Ekstraktas su heptanu, 10 ml

↓ ↓

100µL tirpalo ištirti bendram Likę 9,9 ml išgarinami naudojant N2

tokoferolio kiekiui naudojant ASCC ↓

alfa-tokoferolių metilo esterių gavimas

↓

Chiralinė ASCC alfa-tokoferolių metilo esteriams

Naudojant šį metodą, alfa tokoferolio stereoizomerai yra atskiriami penkiais pikais. Pirmasis pikas

susideda iš keturių 2S izomerų (SSS-, SSR-,SRR-, SRS-), antrasis RSS-, trečiasis RRS -, ketvirtasis

RRR-, o penktasis iš RSR-alfa tokoferolio.

2 pav. ASSC chromatograma, kurioje vaizduojami alfa tokoferolio metilo esterių išsiskyrimo pikai.

Jensen ir kt. [33]

24

H. Iwase (2002) publikacijoje buvo įvertintas vitamino E ir betakaroteno kiekis

emulsifikuotuose maisto papilduose, po kietosios fazės ekstrahavimo [27].

Standartinio vitamino E paruošimas: 125 mg buvo iš anksto ištirpinti etanolyje 50 ml

matavimo kolboje. 5 ml pradinio tirpalo vėl buvo praskiesti etanolio iki 50 ml matavimo kolboje. 500

µl šio tirpalo buvo vėl praskiesta kolboje iki 50 ml etanolio. 100 µl šio tirpalo buvo praskiesta iki 10

ml etanoliu. Gauta galutinė koncetracija 2,5 µl / 100 ml.

Tiriamojo pavyzdžio paruošimas: 100 ml matavimo kolboje maisto papildas (10 g) buvo

ištirpintas 5% vandeniniame natrio sulfato tirpale, kuriame buvo 1 mM etilendiaminetetraacetinės

tūgšites dinatrio dihidrato (EDTA). 1 ml šio tirpalo buvo supilti į naudotą Bond Elut C18 kasetę, kuri

prieš tai buvo praplauta distiliuotu vandeniu ir etanolio tirpalu.

Eluentu buvo vartotas etanolis, jo buvo sušviršksta po 2 ml, sušvirkštus standartinius

tirpalus. Naudotas fluorescencinis detektorius. Kolona 15 cm ilgio ir 0,46 cm skersmens, mobilioji

fazė – etanolis ir metanolis (50:50), tekėjimo greitis – 0,6 ml/min, 40ºC.

3 pav. Vitamino E chromatograma, tirta emulsikuotame maisto papilde. Iwase [27]

25

4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA

4.1. Tyrimo objektas

Vaistinio preparato analizei buvo naudotas vitaminas E Medana, geriamieji lašai,

300mg/ml, 10ml – gamintojas „Medana Pharma“ (Lenkija). Maisto papildo analizė atlikta su papildu

„Vitaminas E – Mik“, 30 mg/kapsulėje, gamintojas UAB „Minskinterkaps“ (Baltarusija).

4.2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika

Naudotas etalonas

Eksperimentams naudotas standartizuotas α-tokoferolio acetatas (50.8 % acetato), kurį

suteikė UAB „Aconitum“ (Lietuva).

Įranga

Eksperimentas buvo atliktas chromatografinė sistema „Waters Alliance 269“5 su

fotodiodų matricos detektoriumi. Kolonėlė - ACE C18, 250 mm ilgio, 4,6 mm vidinio skersmens, 5μm

porų dydžio.

Reagentai

Vartoti reagentai – heksanas, NaOH, metanolis, askobro rūgštis („Sigma – Aldrich“,

Vokietija), 96 % etanolis („Stumbras“, Lietuva). Dejonizuotas vanduo buvo paruoštas išgryninto

vandens paruošimo sistema „Millipore“.

Chromatografavimo sąlygos

Buvo išbandytos kelios mobiliosios fazės ir nustatyta, jog efektyviausiai tokoferolio

acetatas iš kolonėlės išplaunamas naudojant metanolio:distiliuoto vandens mišinį santykiu 95:5.

Lanina ir kt. (2007) patvirtino, jog metanolinė fazė yra efektyvesnė prieš kitą dažniausiai naudojamą

fazę- acetonitrilinę. [41] Mobiliosios fazės tekėjimo greitis buvo 1.2 ml/min, bandinio injekuojamas

tūris – 10 µl. Tyrimo trukmė – 14 minučių. Tokoferolio acetato aptikimui buvo naudojama 282 nm

banga. Sistemoje buvo palaikoma 25º temperatūra.

Duomenų rinkimui ir analizei buvo naudojama Empower Chromatography Data Software

(Waters Corporation, Milford, JAV) programinė įranga.

26

Etaloninio tirpalo paruošimas

Etaloninis tirpalas buvo ruošiamas iš standartizuoto α-tokoferolio acetato miltelių.

Pasvertas tikslus kiekis, 111.00 mg tokoferolio acetato, jis subertas į 25 ml matavimo kolbą ir

ištirpintas apytiksliai 15 ml metanolio. Šis tirpalas buvo 15 minučių įdėtas į ultragarso vonelę kol

tokoferolio acetatas visiškai ištirpo ir tada praskiestas metanoliu iki 25 mililitrų. Gautas tirpalas buvo

nufiltruotas per 0,45 µm membraninį filtrą.

Kadangi milteliuose buvo 50.8% α-tokoferolio acetato, paruošta etaloninio tirpalo koncentracija yra:

111.00 mg x 0.508 / 25 ml = 2.255 mg/ml

27

5. REZULTATAI

5.1. Metodo validacija

Validacija atlikta pagal šiuos parametrus:

Specifiškumą

Tiesiškumą

Tikslumą

Glaudumą

Metodo validacija atlikta remiantis Tarptautinės konferencijos techninių reikalavimų, dėl žmonėms

skirtų vaistinių preparatų registravimo, suderinamumo klausimais parengtomis gairėmis [60].

5.1.1. Metodikos specifiškumas

Šis parametras parodo, jog metodika galima vienareikšmiškai įrodyti analitės buvimą.

Parametrui įvertinti lyginamos tiriamųjų mėginių ir etalonų chromatogramos, įvertinami spektrai ir

sulaikymo laikai.

Etaloninio tirpalo chromatograma:

Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)

Tokoferolio acetato etalonas 10.350 2604709 2.255

4 pav. Etaloninio tokoferolio acetato tirpalo chromatograma

28

1 lentelė. Tokoferolio acetato sulaikymo trukmė preparatų mėginiuose

Bandinio paruošimo būdas Sulaikymo trukmė, min

Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje 10.538

Kapsulių tirpinimas etanolyje 10.437

Kapsulių tirpinimas etanolyje jas kaitinant 10.455

Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje ir tirpalo ekstrakcija

heksanu 10.392

Kapsulių tirpinimas etanolyje ir tirpalo ekstrakcija heksanu 10.430

Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją 10.384

Kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją 10.263

Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją

pridėjus askobro rūgšties 10.260

Kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją pridėjus

askobro rūgšties 10.246

Vidurkis 10.378

Lygiant etalono ir tiriamųjų preparatų sulaikymo trukmės (atitinkamai 10.321 ir 10.378

minučių) matyti, jog jie sutampa.

Taip pat buvo palyginti etalono ir tiriamosios medžiagos spektrai:

5 pav. Etaloninio tokoferolio acetato UV šviesos absorbcijos spektras

29

6 pav. Tokoferolio acetato kapsulių UV šviesos absorbcijos spektras

Abu tokoferolio acetato tirpalai turi UV šviesos absorbcijos maksimumą prie 282.3 nm

bangos ilgio.

Remiantis tuo, jog sutampa lygintos etalono ir tiriamojo preparato sulaikymo trukmės ir

UV absorbcijos spektrai, galima teigti, jog specifiškumo kriterijus yra tenkinamas.

5.1.2. Tiesiškumas

Tiesiškumas buvo įvertintas analizuojant alfa tokoferolio skirtingų koncentracijų

standartus. Koncentracijos buvo nuo 1.69 mg/ml iki 0.02 mg/ml. Gauta tiesinė priklausomybė su

koreliacijos koeficientu r = 0,999929

2 lentelė. Analičių kalibracinės kreivės charakteristikos

Analitės

pavadinimas

Sulaikymo laikas

(min)

Koreliacijos

koeficientas

Kalibracinės

kreivės lygtis

Tiesiškumo ribos

(mg/ml)

Tokoferolio

acetatas 10.378 0.999929

Y = 7,90e+005

X + 7,38e+003 0,021 – 1,69

30

7 pav. Alfa tokoferolio kalibracinis grafikas

Gautas kalibracinės kreivės koeficientas yra > 0.99, tad tiesiškumo kriterijus yra

tenkinamas.

5.1.3. Glaudumas

Glaudumas nustatomas eilę kartų analizuojant tą patį mėginį. Glaudumas yra įvertinamas

nustatant santykinį standartinį nuokrypį (SSN%), kuris yra apskaičiuojamas atsižvelgiant į smailių

sulaikymo laikų, smailių plotų vidurkius bei standartinį nuokrypį. SSN neturėtų viršyti 5 procentų.

Glaudumą galima įvertinti trimis lygiais - pakartojamumu (tas pats mėginys leidžiamas keletą kartų

per trumpą laiko tarpą), tarpiniu preciziškumu (vertinamas atlikus eksperimentus per kelias dienas,

dalyvaujant skirtingiems mokslininkams) bei atkuriamumu (vertinamas rezultatų tikslumas tarp

skirtingų laboratorijų). Šiame darbe pasirinkta patikrinti pakartojamumą.

Atliktos 5 etaloninio tirpalo injekcijos:

31

8 pav. Penkis kartus pakartota tokoferolio acetato etalono chromatograma

Apskaičiuotas santykinis standartinis nuokrypis yra 0.64 %. Tai yra mažiau nei 5% tad

glaudumo kriterijus yra tenkinamas.

5.1.4. Tikslumas

Tikslumas išreiškia nustatytų rezultatų glaudumą jų tikrąjai vertei. Farmacinių preparatų

analizei tikslumas gali būti įvertintas patvirtinus metodikos specifiškumą, tiesiškumą ir glaudumą. Šie

parametrai šioje metodikoje jau įteisinti, tad papildomai nustatinėti tikslumą nereikia.

32

5.2. Tokoferolio acetato preparatų analizės rezultatai

Kadangi darbe siekiama įvertinti įvairių vitamino E bandinių ekstrahavimo metodikų

įtaką analizės tikslumui, buvo apžvelgta mokslinė literatūra šia tema ir pasirinkti keli bandinių

paruošimo būdai, kurie buvo taikomi ir maisto papildui – kapsulėms, ir vaistiniam preparatui – tirpalui.

Taip bus galima palyginti ne tik skirtingų metodikų įtaką analizės efektyvumui, tačiau ir skirtumus tarp

bandinio paruošimo iš kapsulių ir iš tirpalo bei skirtumus tarp vitamino E koncentracijos tikslumo

maisto papilde ir vaiste. Visų paruoštų tirpalų koncentracija buvo 1.2 mg/ml.

Buvo paruošti ir chromatografu analizuoti tokie tirpalai:

1. Tirpinimas etanolyje

a. Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje.

Pipete pamatuojamas 0.1 ml aliejinio tirpalo, kuris perkeliamas į 25 ml

tūrio kolbą ir ištirpinamas nedideliame kiekyje 96 % etanolio. Pipetė praplaunama

etanoliu, kadangi aliejinis tirpalas yra klampesnis ir gali būti likęs prie pipetės vidinių

sienelių. Tirpalas šildomas vandens vonelėje, maišomas, vėliau veikiamas ultragarsu 15

minučių. Atvėsinama iki kambario temperatūros, praskiedžiama etanoliu iki 25 mililitrų

ribos.

Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)

Tokoferolio acetato

tirpalas etanolyje 10.538 1475469 1.151

9 pav. Tokoferolio acetato aliejinio tirpalo, ištirpinto etanolyje, chromatograma

33

b. Kapsulių tirpinimas etanolyje.

1 kapsulė įdedama į cheminę stiklinę ir užpilama nedideliu kiekiu 96 %

etanolio. Kapsulė praduriama ir stengiamasi iš jos išleisti visą viduje esantį aliejinį

tirpalą. Toliau tirpalas šildomas vandens vonelėje, veikiamas ultragarsu 15 minučių,

atvėsinamas iki kambario temperatūros, perkeliamas į 25 mililtrų matavimo kolbą ir

praskiedžiamas etanoliu iki žymos.

Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)

Kapsulių tirpalas etanolyje 10.437 1042217 0.813

10 pav. Tokoferolio acetato kapsulių, ištirpintų etanolyje, chromatograma

2. Kapsulių tirpinimas etanolyje jas kaitinant.

Kadangi kapsules gaubia apvalkalas, norėta patikrinti hipotezę, jog veikiant karščiu

apvalkalas suirs ir bus lengviau suardyti kapsulę ir išleisti viduje esantį tirpalą nei vien tik

mechaniškai veikiant kapsulę. Viena kapsulė įdedama į cheminę stiklinę ir užpilama nedideliu

kiekiu 96% etanolio. Stiklinė kaitinama vandens vonelėje kol kapsulės apvalkalas suyra.

Etanolio tirpalas nupilamas, likusios apvalkalo dalys praplaunamos etanoliu kad būtų surinti

visi vitamino E aliejinio tirpalo likučiai. Gautas etanolinis tirpalas pašildomas ir veikiamas

ultragarsu kad gerai ištirptų. Tirpalas perkeliamas į 25 ml matavimo kolbą ir praskiedžiamas

etanoliu iki žymos.

34

Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)

Kapsulių tirpalas etanolyje

kaitinant 10.455 1271626 0.992

11 pav. Tokoferolio acetato kapsulių, ištirpintų etanolyje kaitinant, chromatograma

3. Ekstrakcija heksanu

a. Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje ir ekstrakcija heksanu

0,1 ml aliejinio vitamino E tirpalo atmatuojama pipete ir perkeliama į

cheminę stiklinę. Užpilama maždaug du mililitrai 96 % etanolio, aliejinis tirpalas

ištirpinamas etanolyje šildant. Į tirpalą įpilama apie du militrus heksano ir vykdoma

vitamino E ekstrakcija iš etanolinės fazės į heksano. Ekstrakcijai pagreitinti naudojamas

vortex aparatas, mėginys juo plakamas apie minutę. Baigus plakimą į tirpalą įpilamas

apie mililitras 1M NaOH tirpalo siekiant pagerinti fazių atsikyrimą. Tirpalas paliekamas

nusistovėti kol fazės visiškai atsiskiria. Heksano fazė kruopščiai nusiurbiama pipete ir

perkeliama į mėgintuvėlį. Kadangi heksano tirpalų negalima tirti efektyviosios skysčių

chromatografijos apartu, nes tiriamas tirpalas turi būti kuo panašesis į naudojamą

judriąją fazę, heksanas išgarinamas azoto dujomis ir vitamino E likutis ištiripinamas

mažame kiekyje 96% etanolio, perkeliamas į 25 ml matavimo kolbą ir praskiedžiamas

iki 25 ml žymos etanoliu.

35

Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)

Tirpalo ekstrakcija heksanu 10.392 1529782 1.193

12 pav. Tokoferolio acetato aliejinio tirpalo etanolyje, ekstrahuoto heksanu, chromatograma

b. Kapsulių tirpinimas etanolyje ir ekstrakcija heksanu

1 kapsulė įdedama į cheminę stiklinę, užpilama nedideliu kiekiu etanolio, praduriama ir

mechaniškai išspaudžiamas visas joje esantis aliejinis tirpalas. Etanolinis tirpalas

nupilamas į mėgintuvėlį, užpilamas antra tiek heksano, o toliau bandinio paruošimas

vykdomas kaip ir tirpalo ekstrakcijos su heksanu.

Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)

Kapsulių ekstrakcija heksanu 10.430 1007955 0.786

13 pav. Tokoferolio acetato kapsulių tirpalo etanolyje, ekstrahuoto heksanu, chromatograma

36

4. Bandinio paruošimas vykdant muilinimo reakciją

Tiriant riebaluose tirpių vitaminų kiekį įvairiose medžiagose efektyviosios skysčių

chromatografijos būdu, saponifikacija vykdoma norint visiškai pašalinti visas pašalines

medžiagas, riebalus, galinčius trukdyti tiksliai nustatyti vitaminų kiekį. Saponifikacija dažniau

taikoma tiriant pašarus [54] ar maisto produktus [3],

nes grynus aliejinius tirpalus galima

tiesiogiai tirpinti organiniuose tirpikliuose ir injekuoti į chormatografą. Visgi norima patikrinti

hipotezę, jog aliejuje ištirpintą tokoferolio acetatą sunkiau ekstrahuoti heksanu, todėl atlikus

muilinimo reakciją, kurios metu, reaguojant natrio šarmui su trigliceridais, pastarieji būtų

visiškai pašalinti ir iš tokio tirpalo, tokoferolio acetatas būtų ekstrahuojamas žymiai lengviau ir

tiksliau.

a. Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją

0,1 ml aliejinio vitamino E tirpalo ištirpinama 2 ml 96% etanolio. Į tirpalą

pridedama apie 2 ml 1M NaOH tirpalo (perteklius, kad reakcija pilnai įvyktų). Tirpalas

perkeliamas į saponifikacijai skirtą indelį užtvirtinamu dangteliu. Saponifikacija

vykdoma 60 laipsnių vandens vonelėje 10 minučių. Tirpalas atvėsinamas iki kambario

tenperatūros ir sumaišomas su 4 ml heksano. Dėl likutinio NaOH fazės gerai atsiskiria

todėl papildomai jo pilti nereikia. Tirpalas maišomas vortex aparatu 30 sekundžių.

Kruopščiai nusiurbiamas viršutinis heksano sluoksnis ir jis perkeliamas į kitą

mėgintuvėlį. Heksanas išgarinamas skystu azotu, o likęs tokoferolio acetato tirpalas

ištirpinamas mažame kiekyje etanolio, vėliau perkeliamas į 25 ml matavimo kolbą ir

praskiedžiamas iki žymės.

Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)

Tirpalo ekstrakcija muilinant 10.384 416100 0.325

14 pav. Tokoferolio acetato tirpalo paruošimas vykdant muilinimo reakciją

37

b. Kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją

1 kapsulė įdedama į cheminę stiklinę, užpilama apie 2 ml etanolio, kapsulė

praduriama ir kapsulės turinys mechaniškai išspaudžiamas į etanolį. Į tirpalą įpilama

2 ml 1M NaOH tirpalo ir jis toliau ruošiamas kaip ir aliejinis tirpalas.

Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)

Kapsulių paruošimas

muilinant 10.263 967329 0.755

15 pav. Tokoferolio acetato kapsulių paruošimas vykdant muilinimo reakciją

5. Bandinio paruošimas vykdant muilinimo reakciją ir pridėjus askobro rūgšties

Vykdant muilinimo reakciją tokoferolio acetatas veikiamas įvairiais cheminiais regentais

– alkoholiu, heksanu, azotu, natrio šarmu, taip pat veikiamas karščiu, maišomas vortex

prietaisu. Tai gali suardyti dalį tokoferolio acetato molekulių ir iškreipti analizės rezultatus.

Todėl kai kurie autoriai (3), atlikdami saponifikacijos reakcijas, prideda antioksidantų. Iškelta

hipotezė, jog pridėjus antioksidacinį poveikį turinčių medžiagų, tokoferolio acetato molekulės

bus geriau apsaugotos nuo cheminio ir fizikinio ardančio poveikio ir bus gauti tikslesni analizės

rezultatai. Kaip antioksidantas pasirinkta askobro rūgštis.

Tiek tirpalas tiek kapsulės paruošiamos taip pat kaip ir aprašyta muilinimo metode, tačiau

į tirpalą prieš įpilant natrio šarmo dar įberiama 30 mg askobro rūgšties miltelių ir gerai

išmaišoma.

38

Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)

Tirpalo ekstrakcija muilinant

pridėjus askobro rūgšties. 10.260 349782 0.273

16 pav. Tokoferolio acetato tirpalo paruošimas muilinant ir pridėjus askobro rūgšties

Piko pavadinimas Sulaikymo laikas (min) Plotas Koncentracija (mg/ml)

Kapsulių ekstrakcija muilinant

pridėjus askobro rūgšties 10.246 556431 0.434

17 pav. Tokoferolio acetato kapsulių paruošimas muilinant ir pridėjus askobro rūgšties

Įvairiais būdais paruoštus mėginius išanalizavus efektyvios skysčių chromatografijos

būdu, buvo apskaičiuota faktinė tokoferolio acetato koncentracija kiekviename mėginyje. Skaičiavimai

atlikti remiantis kalibraciniu grafiku (5 pav.). Geriausi gauti rezultatai paryškinti.

39

3 lentelė. Įvairių tokoferolio acetato prepratų bandinių chromatogramoje gautų

smailių plotas ir apskaičiuota koncentracija

Bandinio paruošimo būdas Smailės plotas

chromatogramoje

Medžiagos

koncentracija

(mg/ml)

Nustatyta

koncentracija lyginant

su teoriškai

apskaičiuota

koncentracija (%)

1.a. Aliejinio tirpalo tirpinimas etanolyje 1475469 1.151 95.52

1.b. Kapsulių tirpinimas etanolyje 1042217 0.813 67.75

2. Kapsulių tirpinimas etanolyje jas

kaitinant 1271626 0.992 82.67

3.a. Aliejinio tirpalo tirpinimas

etanolyje ir tirpalo ekstrakcija heksanu 1529782 1.193 99.42

3.b. Kapsulių tirpinimas etanolyje ir

tirpalo ekstrakcija heksanu 1007955 0.786 65.5

4.a. Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant

muilinimo reakciją 416100 0.325 27.08

4.b. Kapsulių paruošimas vykdant

muilinimo reakciją 967329 0.755 62.92

4.a. Aliejinio tirpalo paruošimas vykdant

muilinimo reakciją pridėjus askobro

rūgšties

349782 0.273 22.75

4.b. Kapsulių paruošimas vykdant

muilinimo reakciją pridėjus askobro

rūgšties

556431 0.434 36.17

40

6. REZULTATŲ APTARIMAS

Visose tiriamųjų mėginių chromatogramose tokoferolio acetato smailė atsiskiria apie 10

minutę. Tačiau vykdant muilinimo reakcijas gaunamos chromatogramos, pavyzdžiui 14 ar 15 pav., turi

žymiai daugiau pašalinių smailių, kartais net didesnių už tokoferolio acetato smailę (16 pav.), nei

chromatogramos, gautos iš mėginių, paruoštų neatliekant muilinimo reakcijos, pavyzdžiui 9 ar 10 pav.

Visi tirti mėginiai buvo gaminti vienodos koncentracijos (1.2 mg/ml), pagal gamintojo

nurodytas preparatų koncentracijas, tačiau chromatografu nustatytos koncetracijos skiriasi nuo 0,273

mg/ ml (16 pav.) iki 1.193 mg/ml (12 pav.). Šius koncentracijų skirtumus nulėmė skirtingi

ekstrakcijos metodų efektyvumai.

Atliekant eksperimentus nustatyta, jog efektyviausias metodas tirti aliejinį tirpalą yra jo

ištirpinimas etanolyje ir gauto tirpalo ekstrakcija heksanu (12 pav.). Taip paruoštame mėginyje

nustatytas didžiausias tokoferolio acetato kiekis, 1,193 mg/ml ir tai sudaro 99.42 % teoriškai

apskaičiuotos koncentracijos. Jis yra truputį efektyvesnis nei preparato tirpinimas etanolyje be

ekstrakcijos heksanu, nes be ekstrakcijos heksanu gauta koncentracija yra 3.9 % mažesnė nei vykdant

ekstrakciją. Efektyviausias metodas kapsulėms tirti – jų ištirpinimas etanolyje kaitinant tirpalą, kad

geriau suirtų kapsulės apvalkalas (11 pav.). Taip gauta koncentracija – 0.992 mg/ml ir tai sudaro 82.67

% teoriškai apskaičiuotos koncentracijos. Efektyviausias metodas aliejinio tirpalo analizei –

ekstrakcija heksanu – kapsulėms mažiau tinkamas, juo gauta koncentracija buvo 0.786 mg/ml, t.y.

0.206 mg/ml mažesnė nei kapsules kaitinant etanolyje.

Gimano ir kt. (2000) teigia, jog analizuojant aliejinius tokoferolio acetate tirpalus

geriausia juos tiesiog ištirpinti organiniame tirpiklyje be ekstrakcijos. Aliejuose esančios priemaiškos

nekliudo tokoferolio analizei, be to, neatliekant papildomų procedūrų sutrumpinama analizės trukmė

[23]. Tačiau šiame darbe aprašytas eksperimentas įrodo, kad atlikti ekstrakciją heksanu yra verta, nes

gaunami tikslesni duomenys.

Prastesni rezultatai gauti vykdant muilinimo reakciją, o patys prasčiausi – muilinant ir

pridėjus askobro rūgšties. Akivaizdu, jog poveikis karščiu ir stipriomis cheminėmis medžiagomis

(šarmu) muilinant suardo dalį tokoferolio acetato. Tačiau iškelta hipotezė, jog askobro rūgštis, kaip

stiprus antioksidantas, apsaugos tokoferolio acetatą, neapsiteisino, netgi priešingai, gauti dar prastesni

rezultatai nei muilinant be askobro rūgšties (gautos koncentracijos yra 0.325 mg/ml muilinant be

askobro rūgšties ir 0.273 mg/ml muilinant su askobro rūgštimi tokoferolio acetato tirpalui ir 0.755

mg/ml muilinant be askobro rūgšties ir 0.434 mg/ml muilinant su askobro rūgštimi tokoferolio acetato

41

kapsulėms). Vykdant muilinimo reakciją su askobro rūgštimi, tirpale atsirado nuosėdų, tirpalas

nusidažė švelniai oranžine spalva, todėl galima spėti, jog dėl askobro rūgšties priedo mėgintuvėlyje

įvyko cheminės reakcijos, suardžiusios dar didesnį kiekį tokoferolio acetato. Muilinimo reakcijos

analizuojant tokoferolio acetato preparatus nėra rekomenduotinos, nes užtrunka ilgai, reikalauja

daugiau įrenginių ir regentų, o gautas rezultatas būna prastesnis. Tačiau Albala - Hurtado ir kt. (1997

m.) pasiūlyta metodika tokoferolio acetatui nustatyti vykdant saponifikaciją ir pridėjus askobro

rūgšties, buvo sėkmingai pritaikyta analizei [3]. Joje saponifikacija buvo atlikta kambario

temepratūroje visą naktį, tuo tarpu šiame tyrime saponifikacija atlikta trumpą laiką aukštoje

temperatūroje, kas galbūt turėjo įtakos prastiems rezultatams. Būtų galima atlikti tolesnius tyrimus dėl

askobro rūgšties naudojimo tokoferolio acetatui apsaugoti, keičiant reakcijos sąlygas ar naudojant kitus

tirpiklius, kad neįvyktų jokios cheminės reakcijos.

Lyginant vaistinio preparato ir maisto papildo dozavimo tikslumą nustatyta, jog tiksliau

dozuotas yra vaistinis preparatas. Sudarytas grafikas (18 pav.) rodo skirtumus tarp nustatytų vaisto ir

maisto papildo koncentracijų naudojant tuos pačius ekstrakcijos būdus (ekstrakcijos būdai vykdant

muilinimo reakcijas neįtraukti nes jais nustatyti rezultatai ganėtinai prasti). Nors abu preparatai buvo

pagaminti vienodos 1.2 mg/ml koncentracijos pagal gamintojo nurodytas preparatų koncentracijas,

vaistinio preparato – tirpalo – koncentracija ir gauta panaši į teoriškai apskaičiuotą, tuo tarpu maisto

papilde nustatytas tokoferolio acetato trūkumas. Nors iš visų registruotų vitamino E preparatų

dauguma yra maisto papildai, akivaizdu, jog remiantis gautomis išvadomis, maisto papildai yra

dozuojami ne taip tiksliai kaip vaistiniai preparatai ir yra tikslinga vartoti vaistinius vitaminų

preparatus norit pasiekti geriausio terapinio efekto.

18 pav. Nustatytos tokoferolio acetato vaistinio preparato ir maisto papildo koncentracijos

Tirpinimasetanolyje

Tirpinimasetanolyjekaitinant

Ekstrakcijaheksanu

Tirpalas (vaistinis preparatas) 1.151 1.193

Kapsulės (maisto papildas) 0.813 0.992 0.786

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

Ko

nce

ntr

acija

, mg/

ml

Išekstrahuoti preparatų kiekiai

42

7. IŠVADOS

1. Apžvelgus mokslinę literatūrą,buvo aprašyta vitamino E struktūra, metabolizmas

organizme ir jo poveikis, apžvelgti ir apibendrinti Lietuvoje registruoti vitamino E

prepratai, taip pat farmakopėjiniai ir nefarmakopėjiniai jų analizės būdai.

2. Paruošta ir validuota metodika, tinkama vitamino E preparatų analizei efektyviosios

skysčių chromatografijos metodu.

3. Nustatyta, jog efektyviausias būdas aliejinių tirpalų bandinių ekstrakcijai – etanolinio

tirpalo ekstrakcija heksanu, o kapsulėms – jų kaitinimas etanolyje.

4. Muilinimo reakcijos su ar be askobro rūgšties priedo nėra tinkamos tokoferolio acetato

preparatų analzei. Vaistinis preparatas yra dozuotas tiksliau nei maisto papildas.

43

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Ivanovienė L, Praškevičius A. Stasiūnienė N, redaktoriai. Biochemija, antras leidimas. Kaunas:

Vitae Litera, 2006. p. 173-75

2. Kochanskienė, Ieva, et al. "Suaugusių žmonių maisto papildų vartojimo ypatybės." Lietuvos

bendrosios praktikos gydytojas 7-8 (2010).

3. Albala´-Hurtado, S., Novella-Rodri´ guez, S., Veciana-Nogue´ s, M. T., & Mariné-Font, A.

(1997). Determination of vitamins A and E in infant milk formulae by high-performance liquid

chromatography. Journal of Chromatography A, 778(1-2), 243-246.

4. Albanes, Demetrius, et al. "α-Tocopherol and β-carotene supplements and lung cancer

incidence in the Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Prevention Study: effects of base-

line characteristics and study compliance." Journal of the National Cancer Institute 88.21

(1996): 1560-1570.

5. Amerikos žemės ūkip departamento maisto produktų duomenų bazė. Žiūrėta 2014-04-29

Prieiga internetu : http://ndb.nal.usda.gov/ndb/nutrients/

6. Arikanoglu, Adalet, et al. "Relationship of cognitive performance with prolidase and oxidative

stress in Alzheimer disease." Neurological Sciences (2013): 1-5.

7. Barve A, Khor TO, Nair S and al. Gamma-tocopherol-enriched mixed tocopherol diet inhibits

prostate carcinogenesis in TRAMP mice. 2009 April.

8. Bostick, Roberd M., et al. "Reduced risk of colon cancer with high intake of vitamin E: the

Iowa Women's Health Study." Cancer research 53.18 (1993): 4230-4237.

9. Bowman B, Russell R, redaktoriai. Present knowledge in nutrition, devintas leidimas, I dalis.

Washington DC:International life sciences institute, 2006. p. 211 – 218

10. Brigelius-Flohe, Regina, and Maret G. Traber. "Vitamin E: function and metabolism." The

FASEB Journal 13.10 (1999): 1145-1155.

11. Bruno SR, Leonard SW, Park S et al. Human vitamin E requirements assessed with the use of

apples fortified with deuterium-labeled α-tocopheryl acetate. Iš American Society for Clinical

Nutrition, 2006 February.

12. Bruno, Richard S., et al. "Faster plasma vitamin E disappearance in smokers is normalized by

vitamin C supplementation." Free radical biology & medicine40.4 (2006): 689.

13. Burton GW, Wronska U, Stone L, et al. Biokinetics of dietary RRR-alpha-tocopherol in the

male guinea pig at three dietary levels of vitamin C and two levels of vitamin E. Evidence that

vitamin C does not "spare" vitamin E in vivo. 1990 April.

44

14. Cheeseman KH, Holley AE, Kelly FJ, Wasil M, Hughes L, Burton G. Biokinetics in humans of

RRR-alpha-tocopherol: the free phenol, acetate ester, and succinate ester forms of vitamin E.

1995 November (online). Žiūrėta 2013-03-20. Prieiga per internetą

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

15. Chen, Chiung-Mei, et al. "Increased oxidative damage in peripheral blood correlates with

severity of Parkinson's disease." Neurobiology of disease 33.3 (2009): 429-435.

16. Constantinescu, Anastasia, Derick Han, and Lester Packer. "Vitamin E recycling in human

erythrocyte membranes." Journal of Biological Chemistry268.15 (1993): 10906-10913.

17. Diplock, Anthony T., et al. "Relationship of Tocopherol Structure to Biological Activity,

Tissue Uptake, and Prostaglandin Biosynthesisa." Annals of the New York Academy of

Sciences 570.1 (1989): 72-84.

18. Dommergues, J. P., and B. Bader-Meunier. "Nutritional anemia in children." La Revue du

praticien 39.24 (1989): 2117.

19. Etminan, Mahyar, Sudeep S. Gill, and Ali Samii. "Intake of vitamin E, vitamin C, and

carotenoids and the risk of Parkinson's disease: a meta-analysis." The Lancet Neurology 4.6

(2005): 362-365.

20. European Pharmacopoeia, 7th edition, volume 2. Strasbourg: Council of Europe;2011. p. 3104-

3110.

21. Fujita, Koji, et al. "Vitamin E decreases bone mass by stimulating osteoclast fusion." Nature

medicine 18.4 (2012): 589-594.

22. García-Closas, Reina, et al. "Dietary sources of vitamin C, vitamin E and specific carotenoids

in Spain." British Journal of Nutrition 91.06 (2004): 1005-1011.

23. Gimeno, E., et al. "Rapid determination of vitamin E in vegetable oils by reversed-phase high-

performance liquid chromatography." Journal of Chromatography A 881.1 (2000): 251-254.

24. Goldenstein, Hagit, et al. "Patient selection and vitamin E treatment in diabetes

mellitus." Expert Review of Cardiovascular Therapy 11.3 (2013): 319-326.

25. Hadžović-Džuvo, Almira, et al. "Serum total antioxidant capacity in patients with multiple

sclerosis." Bosn J Basic Med Sci 11.1 (2011): 33-6.

26. Illison, Vanessa K., et al. "The relationship between plasma alpha-tocopherol concentration and

vitamin E intake in patients with type 2 diabetes mellitus."International journal for vitamin and

nutrition research. Internationale Zeitschrift fur Vitamin-und Ernahrungsforschung. Journal

international de vitaminologie et de nutrition 81.1 (2011): 12.

27. Iwase, Hiroshi. "Simultaneous sample preparation for high-performance liquid

chromatographic determination of Vitamin A and β-carotene in emulsified nutritional

supplements after solid-phase extraction." Analytica Chimica Acta463.1 (2002): 21-29.

45

28. Yakoot, Mostafa. "Vitamin E and Omega-3: What to believe: Observational studies or

randomized controlled trials?." Heart Views: The Official Journal of the Gulf Heart

Association 13.2 (2012): 66.

29. Ye, Yizhou, Jing Li, and Zhongxiang Yuan. "Effect of Antioxidant Vitamin Supplementation

on Cardiovascular Outcomes: A Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials." PloS

one 8.2 (2013).

30. You, Cha-Sook, et al. "Long-chain carboxychromanols are the major metabolites of

tocopherols and tocotrienols in A549 lung epithelial cells but not HepG2 cells." The Journal of

nutrition 135.2 (2005): 227-232.

31. Yvonne M. Jeanes, Wendy L. Hall, Susan Ellard, Elizabeth Lee and John K. Lodge (2004). The

absorption of vitamin E is influenced by the amount of fat in a meal and the food matrix.

British Journal of Nutrition, , pp 575-579.

32. Jain AB, and Jain VA. "Vitamin E, Its Beneficial Role in Diabetes Mellitus (DM) and Its

Complications." Journal of clinical and diagnostic research: JCDR 6.10 (2012): 1624.

33. Jensen, Søren Krogh, and Charlotte Lauridsen. "Alpha-tocopherol stereoisomers." Vitamins

and hormones 76 (2007): 281.

34. Kagan, Valerian E., et al. Recycling of vitamin E in human low density lipoproteins. 1992

March.

35. Kagan, Valerian, et al. "Ultraviolet light-induced generation of vitamin E radicals and their

recycling. A possible photosensitizing effect of vitamin E in skin." Free Radical Research 16.1

(1992): 51-64.

36. Kaneko, Kazuyo, et al. "Studies of the metabolism of α-tocopherol stereoisomers in rats using

[5-methyl-14C] SRR-and RRR-α-tocopherol."Journal of Lipid Research 41.3 (2000): 357-367.

37. Kirac, Deniz, Yesim Negis, and Nesrin Kartal Ozer. "Vitamin E attenuates homocysteine and

cholesterol induced damage in rat aorta." Cardiovascular Pathology (2013).

38. Klaunig, James E., and Lisa M. Kamendulis. "The role of oxidative stress in

carcinogenesis." Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44 (2004): 239-267.

39. Ko, Mei-Lan, et al. "Dietary deficiency of vitamin E aggravates retinal ganglion cell death in

experimental glaucoma of rats." Current eye research 35.9 (2010): 842-849.

40. Lanina, Svetlana A., et al. "Comparison of reversed-phase liquid chromatography–mass

spectrometry with electrospray and atmospheric pressure chemical ionization for analysis of

dietary tocopherols." Journal of chromatography A 1157.1 (2007): 159-170.

41. Li, Feng-Jiao, Liang Shen, and Hong-Fang Ji. "Dietary Intakes of Vitamin E, Vitamin C, and β-

Carotene and Risk of Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis."Journal of Alzheimer's

Disease 31.2 (2012): 253-258.

46

42. LODGE, JOHN K., et al. "Physiological factors influencing vitamin E biokinetics." Annals of

the New York Academy of Sciences 1031.1 (2004): 60-73.

43. MG Isaac, R. Quinn, and N. Tabet. "Vitamin E for Alzheimer's disease and mild cognitive

impairment." Cochrane Database Syst Rev 3 (2008).

44. Miyake, Y., et al. "Dietary intake of antioxidant vitamins and risk of Parkinson’s disease: a

case–control study in Japan." European Journal of Neurology 18.1 (2011): 106-113.

45. Miller, Edgar R., et al. "Meta-analysis: high-dosage vitamin E supplementation may increase

all-cause mortality." Annals of internal medicine 142.1 (2005): 37-46.

46. Miller, Galen W., et al. "The α-Tocopherol Transfer Protein Is Essential for Vertebrate

Embryogenesis." PloS one 7.10 (2012): e47402.

47. Narushima, Kazuya, et al. "Niemann-Pick C1-like 1 mediates α-tocopherol

transport." Molecular pharmacology 74.1 (2008): 42-49.

48. National Research Council. Dietary Reference Intakes for Vitamin C, Vitamin E, Selenium,

and Carotenoids . [Žiūrėta 2013-05-27] Washington, DC: The National Academies Press, 2000.

Prieiga internetu http://www.nap.edu

49. Niki E. Role of vitamin E as a lipid-soluble peroxyl radical scavenger: in vitro and in vivo

evidence. Free Radical Biology and Medicine. April 2013. Žiūrėta 2013-04-10. Prieiga per

internetą http://www.sciencedirect.com/

50. Okura, Yuki, et al. "Dietary vitamin E deficiency increases anxiety‐related behavior in rats

under stress of social isolation." Biofactors 35.3 (2009): 273-278.

51. Prasad, Kailash, et al. "Vitamin E slows the progression of hypercholesterolemia-induced

oxidative stress in heart, liver and kidney."Molecular and cellular biochemistry 368.1-2

(2012): 181-187.

52. Qian, H., and M. Sheng. "Simultaneous determination of fat-soluble vitamins A, D and E and

pro-vitamin D< sub> 2</sub> in animal feeds by one-step extraction and high-performance

liquid chromatography analysis." Journal of Chromatography A 825.2 (1998): 127-133.

53. Rachieru, D., Duca, R., & Olteanu, M. (2009). Validation of a method to determine vitamin E

(alpha tocopherol) from feed ingredients by HPLC using reversed phase

chromatography. Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicinǎ Veterinarǎ la lucrări ştiinţifice.

Ser Zootehnie, 52, 543-547.

54. Reboul, Emmanuelle, et al. "Scavenger receptor class B type I (SR-BI) is involved in vitamin E

transport across the enterocyte." Journal of Biological Chemistry 281.8 (2006): 4739-4745.

55. Riboli, Elio, and Rudolf Kaaks. "The EPIC Project: rationale and study design. European

Prospective Investigation into Cancer and Nutrition." International Journal of

Epidemiology 26.suppl 1 (1997): S6.

47

56. Ruperez, F. J., et al. "Chromatographic analysis of α-tocopherol and related compounds in

various matrices." Journal of chromatography A 935.1 (2001): 45-69.

57. Shinde, Sarita N., Vithal N. Dhadke, and Adinath N. Suryakar. "Evaluation of oxidative stress

in type 2 diabetes mellitus and follow-up along with vitamin E supplementation." Indian

Journal of Clinical Biochemistry 26.1 (2011): 74-77.

58. Sontag, Timothy J., and Robert S. Parker. "Cytochrome P450 ω-Hydroxylase Pathway of

Tocopherol Catabolism NOVEL MECHANISM OF REGULATION OF VITAMIN E

STATUS." Journal of Biological Chemistry 277.28 (2002): 25290-25296.

59. Sontag, Timothy J., and Robert S. Parker. "Influence of major structural features of tocopherols

and tocotrienols on their ω-oxidation by tocopherol-ω-hydroxylase." Journal of lipid

research 48.5 (2007): 1090-1098.

60. The international conference on harmonisation of technical requirements for registration for

pharmaceuticals for human use. Validation of analytical procedures: text and methodology Q2

(R1). 1996. Prieiga per internetą:

http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step

4/Q2_R1__Guideline.pdf

61. Traber M. Mechanisms for the prevention of vitamin E excess. The Journal of Lipid Research.

Kovas, 2013.

62. Traber MG, Siddens LK, Leonard SW ir kt. Alpha-tocopherol modulates Cyp3a expression,

increases gamma-CEHC production, and limits tissue gamma-tocopherol accumulation in mice

fed high gamma-tocopherol diets. 2005 March. Žiūrėta 2013-03-22. Prieiga per internetą

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

63. Traber, Maret G. "Vitamin E regulatory mechanisms." Annu. Rev. Nutr. 27 (2007): 347-362.

Žiūrėta 2013-03-20.

64. Traber, Maret G., and Jeffrey Atkinson. "Vitamin E, antioxidant and nothing more." Free

Radical Biology and Medicine 43.1 (2007): 4-15.

65. Ueda, Naohisa, et al. "Correlation between neurological dysfunction with vitamin E deficiency

and gastrectomy." Journal of the neurological sciences 287.1 (2009): 216-220.

66. Ulatowski L, Dreussi C, Noy N, ir kt. Expression of the α-tocopherol transfer protein gene is

regulated by oxidative stress and common single-nucleotide polymorphisms. 2012, October.

Žiūrėta 2013-03-22. Prieiga per internetą http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

67. Usoro, Owoedimo B., and Shaker A. Mousa. "Vitamin E forms in Alzheimer's disease: A

review of controversial and clinical experiences." Critical reviews in food science and

nutrition 50.5 (2010): 414-419.

48

68. Wang, Hao, et al. "Vitamin E intake and risk of amyotrophic lateral sclerosis: a pooled analysis

of data from 5 prospective cohort studies." American journal of epidemiology 173.6 (2011):

595-602.

69. Woodson, Karen, et al. "Serum α-tocopherol and subsequent risk of lung cancer among male

smokers." Journal of the National Cancer Institute 91.20 (1999): 1738-1743.

70. Wright, Margaret E., et al. "Supplemental and dietary vitamin E intakes and risk of prostate

cancer in a large prospective study." Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention 16.6

(2007): 1128-1135.