VPLIV BIOLOŠKEGA POSPEŠEVALCA RASTI RASTLIN NA MINERALNO …pefprints.pef.uni-lj.si/5913/1/Miha_Lampe_2019.pdf · Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta,

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

MIHA LAMPE

VPLIV BIOLOŠKEGA POSPEŠEVALCA RASTI

RASTLIN NA MINERALNO PREHRANO SONČNICE

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2019

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA DVOPREDMETNI UČITELJ BIOLOGIJA - KEMIJA

MIHA LAMPE

Mentor: PROF. DR. KATARINA VOGEL MIKUŠ

VPLIV BIOLOŠKEGA POSPEŠEVALCA RASTI

RASTLIN NA MINERALNO PREHRANO SONČNICE

DIPLOMSKO DELO

LJUBLJANA, 2019

Lampe M. Vpliv biološkega pospeševalca rasti rastlin na mineralno prehrano sončnice.

Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Kemija in biologija, 2019.

II

Diplomsko delo je zaključek Univerzitetnega študija kemije in biologije. Opravljeno je bilo

na Katedri za fiziologijo rastlin Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v

Ljubljani.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednica: izr. prof. dr. Mateja GERM

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Mentorica: prof. dr. Katarina VOGEL MIKUŠ


Član: doc. dr. Matevž LIKAR


Datum zagovora: ________________________________________________

Podpisani izjavljam, da je diplomska naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Izjavljam, da je elektronska verzija identična tiskani. Na Univerzo v Ljubljani prenašam

pravico objave svoje diplomske naloge v polnem tekstu na svetovnem spletu preko

Digitalne knjižnice Pedagoške fakultete.

Miha Lampe



III

POVZETEK

Sončnica spada med kmetijsko in gospodarsko zelo pomembne rastlinske vrste. Za rastline

je zadostna mineralna prehranjenost pogoj za uspešno rast in razvoj. Ker se z dodajanjem

gnojil lahko povečata tako uspešnost donosa kot tudi rast rastlin, je za kmetijstvo izbira

pravega gnojila vitalnega pomena. Ker navadna kemijska gnojila lahko škodujejo okolju,

se v zadnjem času velik poudarek daje predvsem naravnim gnojilom, ki imajo poleg

mineralne komponente gnojila prisotne tudi tako imenovane biološke pospeševalce, med

katerimi so najštevilčnejše mikorizne glive in PGPB (plant growth promoting bacteria),

torej bakterije, ki spodbujajo rast in razvoj rastlin. PGPB imajo več mehanizmov delovanja

na rastlino, med katerimi so: biološka fiksacija dušika, proizvodnja indolskih spojin,

proizvodnja sideroforov, aktivnost ACC deaminaze in raztapljanje fosfatov. Večina PGPB

se nahaja v rizosferi, tanki plasti zemlje, ki neposredno obdaja koreninski sistem rastlin. V

diplomskem delu smo preučevali vpliv bioloških pospeševalcev na rast in mineralno

prehranjenost sončnic (Helianthus annuus L.) s pomočjo zasnovanega eksperimenta.

Eksperiment smo zasnovali tako, da smo posadili sončnice s tremi različnimi

izpostavitvami. Prva serija je bila kontrola in ta skupina sončnic ni prejela gnojila. Drugi

seriji vzorcev smo dodali avtoklavirano organsko gnojilo, pri čemer smo z avtoklaviranjem

odstranili vse, kar je v gnojilu predstavljalo živo komponento. Tretja serija vzorcev je

dobila nespremenjeno organsko gnojilo. Po enem mesecu rasti smo vzorce stehtali in jih

analizirali z metodo rentgensko fluorescenčne spektrometrije. Poleg tega smo na poganjkih

določili tudi vsebnost fotosinteznih pigmentov kot merilo stresa. Hipotezo, da bodo

sončnice z dodanim gnojilom, ki ima biološke pospeševalce, bolj rasle in bodo imele

primernejšo vsebnost mineralnih snovi kot sončnice z dodanim gnojilom brez bioloških

pospeševalcev, smo po statistični obdelavi vzorcev ovrgli. Vzorci posameznih izpostavitev

so se med seboj razlikovali le po vsebnosti treh elementov. V poganjkih sta se razlikovali

koncentracija fosforja in kalija, v koreninah pa bakra. V eksperimentu nismo potrdili

pozitivnega vpliva biološkega pospeševalca, ki smo ga v eksperimentu uporabili.

KLJUČNE BESEDE:

biološki pospeševalci, sončnica, PGPB (bakterije, ki spodbujajo rast rastlin), biognojilo,

mineralna prehrana rastlin



IV

ABSTRACT

The sunflower is one of the most economically important plant species. Sufficient mineral

nutrition is a prerequisite for successful plant growth and development. Since the addition

of fertilizers can increase both yield performance and plant growth, choosing the right

fertilizer is vital for agriculture success. Since ordinary chemical fertilizers can be

damaging to the environment, a great deal of emphasis has recently been placed on natural

biofertilizers, which, in addition to the mineral component of the fertilizer, contain the so-

called biological promotors, the most numerous being mycorrhizal fungi and PGPB (Plant

growth promoting bacteria), which promote plant growth and development. PGPBs have

several mechanisms of interaction with the plant, including: biological nitrogen fixation,

production of indole compounds, and production of siderophores, ACC deaminase activity,

and phosphate dissolution. Most PGPB bacteria are found in the rhizosphere, this refers to

the thin layer of soil that directly surrounds the root system of the plants. In our thesis we

studied the influence of these biopromotors on the mineral nutrition of sunflowers

(Helianthus annuus L.) by means of a designed experiment. We designed the experiment

by planting sunflowers with three different treatments. The first batch was a control and no

biofertilizer was given to this group of sunflowers. An autoclaved biofertilizer was added

to the second batch of samples, and the organic component of the biofertilizer was

removed by autoclaving. The third batch of samples received unchanged biofertilizer.

After one month of growth, the samples were weighed and analysed by X-ray fluorescence

spectrometry. In addition, the content of photosynthetic pigments was determined on

shoots as an indicator of sunflower nutrition. The hypothesis that sunflowers with fertilizer

with biological accelerators will grow more and have a more optimal value of mineral

substances than sunflowers with fertilizer without biological accelerators has been rejected

after the statistical treatment of samples. The samples were statistically different in only

three items. Phosphorus and potassium concentrations differed in the shoots and copper in

the roots. The positive effect of biopromotors on the biofertilizer used in the experiment

has not been confirmed.

KEYWORDS:

biopromotors, sunflower, PGPB (plant growth promoting bacteria), biofertilizers, mineral

nutrition



V

KAZALO

POVZETEK .......................................................................................................................................... III

ABSTRACT .......................................................................................................................................... IV

KAZALO ............................................................................................................................................... V

KAZALO SLIK ...................................................................................................................................... VI

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI .................................................................................................................... VII

1 UVOD .............................................................................................................................................. 5

2 PREGLED OBJAV .............................................................................................................................. 7

2.1 SONČNICA (HELIANTHUS ANNUUS L.) ..................................................................................... 8

2.2 BIOLOŠKA GNOJILA .................................................................................................................. 9

2.3 MEHANIZMI DELOVANJA PGPB ............................................................................................. 12

2.4 BIOPOSPEŠEVALEC, UPORABLJEN V EKSPERIMENTU ............................................................ 18

3 MATERIALI IN METODE ................................................................................................................ 19

3.1 KEMIKALIJE ............................................................................................................................ 19

3.2 LABORATORIJSKA OPREMA ................................................................................................... 19

4 METODE DELA .............................................................................................................................. 20

4.1 PRIPRAVA POSKUSA .............................................................................................................. 20

4.2 ANALIZA Z METODO RENTGENTSKO FLUORESCENČNE SPEKTROMETRIJE ........................... 20

4.3 POSTOPEK ANALIZE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV ............................................................... 21

4.4 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV ........................................................................................ 22

5 REZULTATI .................................................................................................................................... 23

5.1 SVEŽA IN SUHA MASA POGANJKOV IN KORENIN .................................................................. 23

5.2 ANALIZA Z XRF – KONCENTRACIJE MINERALNIH ELEMENTOV ............................................. 24

5.3 ANALIZA FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV ................................................................................ 26

6 DISKUSIJA ...................................................................................................................................... 28

7 ZAKLJUČEK .................................................................................................................................... 29

VIRI ................................................................................................................................................... 30

ZAHVALA .......................................................................................................................................... 32



VI

KAZALO SLIK

Slika 1: Sončnica (Helianthus annuus L.)

(Vir:https://www.ekodezela.si/vsebina/vrtnarstvo/soncnice-za-sreco-za-cebele/ 2019) ...... 8

Slika 2: Interakcije rizosfere in PGPB (Souza s sod., 2015) ............................................... 12

Slika 3: Sveža masa poganjkov in korenin sončnic pri različnih pogojih (povprečje ±

standardna napaka) n(poganjkov) = 10, n(korenin)= 3. Različne črke nad stolpci označujejo

statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05). ................................................ 23

Slika 4: Suha masa poganjkov in korenin sončnic pri različnih pogojih (povprečje ±

standardna napaka) n(poganjkov) = 10, n(korenin)= 3. Različne črke nad stolpci označujejo


Slika 5: Vsebnost kalija v poganjkih sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna

napaka) n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko

med izpostavitvami (p < 0,05). ............................................................................................ 25

Slika 6: Vsebnost fosforja v poganjkih sončnic pri različnih pogojih (povprečje ±

standardna napaka) n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično

značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05). ................................................................. 25

Slika 7: Vsebnost bakra v koreninah sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna

napaka), n(korenin) = 3. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med

izpostavitvami (p < 0,05). .................................................................................................... 26

Slika 8: Koncentracija klorofila b in klorofila a+b v mg na g vzorca pri različnih pogojih

(povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo


Slika 9: Koncentracija karotenoidov v mg na g vzorca pri različnih pogojih (povprečje ±

standardna napaka), n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično

značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05). ................................................................. 27



VII

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

XRF Rentgenska fluorescenca

PGPB Plant Growth Promoting Bacteria – bakterije, ki spodbujajo rast rastlin

BNF Biological Nitrogen Fixation – biološka fiksacija dušika

EDXRF Energy Dispersive X-ray Fluorescence – energijsko disperzivna rentgenska

fluorescenca

FS Fotosintezni



5

1 UVOD

Poljedelstvo se je pojavilo pred približno 10.000 leti in je pomenilo velik korak v

človekovem razvoju. Odkritje je omogočilo, da se je človek za stalno naselil na določenem

območju. Osvajal je vedno nove površine, na katerih je gojil svoje rastline. S

poljedelstvom se je zmanjšala človekova odvisnost od narave. Človek je začel naravo

spreminjati po svojih željah in potrebah [1]. Ker ima poljedelstvo za celotno človeštvo zelo

velik pomen, so se načini obdelovanja zemlje in poljščin skozi čas spreminjali. S časom so

se v poljedelstvu pojavila gnojila. S pomočjo gnojil so lahko kmetje povečali svoj pridelek,

imeli bolj uspešne rastline in boljšo obdelovalno zemljo. Znanost agronomije je

odgovarjala na vprašanja, katera gnojila so najoptimalnejša in zagotavljajo najboljše

razmere za rast in produktivnost rastlin. Torej, gnojila so naravna ali umetna snov, ki

vsebuje kemične elemente, ki izboljšujejo rast in produktivnost rastlin. Gnojila povečujejo

naravno plodnost zemlje ali nadomeščajo kemične elemente, ki so jih prejšnji posevki

odvzeli iz tal. Uporaba gnoja in kompostov za gnojilo je verjetno stara skoraj toliko kot

poljedelstvo samo. Sodobna kemična gnojila vključujejo enega ali več od treh elementov,

ki so najpomembnejši v prehrani rastlin: dušik, fosfor in kalij. Drugotnega pomena so

elementi žveplo, magnezij in kalcij. Večina dušikovih gnojil se pridobiva iz sintetičnega

amonijaka; ta kemična spojina (NH3) se uporablja bodisi kot plin ali v vodni raztopini,

lahko pa se jo pretvori v soli, kot so amonijev sulfat, amonijev nitrat in amonijev fosfat.

Pogosti viri so tudi običajni odpadki iz pakiranja, obdelani odpadki, odpadne vode in

hlevski gnoj. Fosforna gnojila vključujejo kalcijev fosfat, pridobljen iz fosfatnih kamnin.

Bolj topni superfosfatni in trojni superfosfatni pripravki so pridobljeni z obdelavo

kalcijevega fosfata z žveplovo oziroma fosforno kislino. Kalijeva gnojila, in sicer kalijev

klorid in kalijev sulfat, se pridobivajo z rudarjenjem pepelike (kalijev karbonat). Mešana

gnojila lahko vsebujejo več kot eno od treh glavnih hranilnih snovi: dušik, fosfor in kalij

[2].

Rastlinska hranila delimo na: primarna hranila ali makrohranila: dušik (N), fosfor (P) in

kalij (K); sekundarna hranila ali druga hranila, med katere sodijo: kalcij (Ca), magnezij

(Mg), natrij (Na) in žveplo (S); ter mikrohranila: bor (B), kobalt (Co), baker (Cu), železo

(Fe), mangan (Mn), molibden (Mo) in cink (Zn), pomembna za rast rastlin v količinah, ki



6

so majhne v primerjavi s količinami primarnih in sekundarnih hranil. Nadalje se gnojila

ločijo na: mineralna gnojila, ki vsebujejo izključno mineralne komponente in so

pridobljena v industrijskem postopku, ter organsko-mineralna gnojila, ki poleg mineralnih

komponent vsebujejo tudi organske snovi živalskega ali rastlinskega izvora in so

pridobljena z ekstrakcijo ali s fizikalnimi oz. kemijskimi industrijskimi postopki. Analize

gnojil izvajamo z namenom ugotavljati skladnost vsebnosti primarnih in sekundarnih

hranil ter mikrohranil z deklariranimi vsebnostmi. Določamo tudi nekatere fizikalne

lastnosti gnojil in vsebnost neželenih snovi, kot so težke kovine [3].

Zaradi negativnih vplivov mineralnih gnojil v okolju (izpiranje v podtalnico,

onesnaževanje in evtrofikacija vodotokov itd.) je vedno večji poudarek na uporabi

bioloških gnojil (tudi biognojila), ki vsebujejo žive mikroorganizme. S tem, ko ga dodamo

na semena, rastlinske dele ali zemljo, mikroorganizmi kolonizirajo rizosfero ali notranjost

rastline in spodbujajo rast s povečanjem razpoložljivosti in zaloge primarnih hranil za

rastlino, ki jim je izpostavljena. Biološka gnojila bi lahko pomembno vplivala na

zmanjševanje uporabe umetnih gnojil in pesticidov [4].

Cilji:

• Ugotoviti, ali in v kolikšni meri izbrano biognojilo vpliva na rast in prevzem za

rastlino potrebnih mineralnih snovi.

• S pomočjo eksperimenta ugotoviti, ali biognojilo vpliva na rast rastlin tudi, ko ga

avtoklaviramo in gnojilo ne vsebuje bioloških pospeševalcev.

• S pomočjo analize fotosinteznih pigmentov ugotoviti, ali biognojilo izboljša

fiziološko stanje rastline.

Hipoteze:

1. Rastline z dodanim gnojilom, ki vsebuje biološke pospeševalce, bodo bolje rasle in

bodo imele primernejšo vsebnost mineralnih snovi kot sončnice z dodanim

gnojilom brez bioloških pospeševalcev.

2. Rastline z dodanim gnojilom z biološkim pospeševalcem bodo imele višjo vsebnost

klorofilov in karotenoidov kot tiste brez bioloških pospeševalcev.

3. Ker dodano gnojilo vsebuje fosfat, kalcijev oksid in železo, bomo pri analizi z XRF

opazili povišane vrednosti elementov P, Ca in Fe pri rastlinah z dodanim gnojilom.



7

2 PREGLED OBJAV

Rastline za rast potrebujejo največ ogljika (C), kisika (O) in vodika (H). Iz teh elementov

je sestavljenih od 90 do 99 % rastlinskega telesa, preostali del rastline pa sestavlja

mineralna komponenta. Minerale (hranila) rastlina pridobi iz tal. Rastline potrebujejo

razmeroma veliko dušika (N), fosforja (P), kalija (K), kalcija (Ca), magnezija (Mg) in

žvepla (S), pravimo jim tudi makrohranila. Ker jih navadno v tleh ni dovolj, zanje običajno

poskrbimo z gnojenjem preko tal. N, P in K so glavna rastlinska hranila v ožjem smislu oz.

t. i. primarna hranila, Ca, Mg in S pa so sekundarna hranila. Mikrohranila (mikroelementi)

so tista rastlinska hranila, ki jih rastline potrebujejo le v sledovih, torej v manjših količinah

(bor, mangan, baker, cink, molibden, železo). Rastlinam jih največkrat dodamo preko

listov v obliki listnih gnojil (t. i. foliarno gnojenje). Ne glede na to, ali rastline navedena

hranila potrebujejo v velikih ali majhnih količinah, so vsa nujno potrebna za rast in razvoj

rastline, drugega z drugim pa ne moremo nadomestiti. Tudi če je le enega hranila premalo,

rastlina ne more uspevati, tako kot poškodovan sod ne more zadržati vode (Liebigov zakon

minimuma) (Polanec, 2014).

Hranila so snovi, s katerimi se rastline hranijo, gnojila pa so snovi, katerih glavni namen je

zagotavljanje hranil za rastline. Posamezna gnojila vsebujejo več ali manj hranil.

Najpomembnejše rastlinsko hranilo je dušik, ker je nepogrešljiv v obdobju intenzivne rasti

– pospešuje rast zelenih delov rastlin (tvorba beljakovin). Rastlina ga iz tal dobiva v obliki

nitratov, porabi pa lahko tudi dušik v amonijevi obliki. V prehrani rastlin z dušikom so

pomembne nitrifikacijske bakterije. Te oksidirajo amonijevo obliko dušika (NH4) v nitritno

(NO2), to pa v nitratno (NO3), ki je rastlinam dostopna. V kmetijstvu so pomembne še

denitrifikacijske bakterije. Te v nasprotju z nitrifikacijskimi bakterijami razkrajajo nitrite

in nitrate v prosti dušik, ki se sprošča v zrak (Polanec, 2014).

Mikoriza je vzajemna simbiontska zveza, ki temelji na dvosmernem prenosu hranil med

glivami v tleh in koreninami vaskularnih rastlin. Rastlina oskrbuje glivo s sladkorji, ki jih

proizvaja v procesu fotosinteze, medtem ko mreža hif izboljša sposobnost rastline za

absorbiranje vode in hranil, predvsem prevzem fosforja, bakra in cinka. Arbuskularne

mikorize (AM), imenovane tudi endomikorize, so najbolj starodavne, pogoste in razširjene

vrste mikoriz (Roy-Bolduc in Hijri, 2010).



8

Razpoložljivost mineralnih hranil je odvisna od kemičnih dejavnikov, kot so skupna

količina, kemijska oblika elementa in vezava mineralnega hranila na druge ione ali na tla,

kot tudi fizikalnih dejavnikov, predvsem razporeditve v tleh in mobilnosti. Med dobro

mobilne elemente štejemo dušik, fosfor, kalij, magnezij in klor; njihovo pomanjkanje se

najprej opazi na starejših listih. Med srednje mobilne elemente štejemo bor, železo, cink,

baker in molibden, med slabo mobilne pa kalcij in mangan. Simptomi pomanjkanja se

najprej pojavijo na mlajših delih rastlin (Polanec, 2014).

2.1 SONČNICA (HELIANTHUS ANNUUS L.)

Slika 1: Sončnica (Helianthus annuus L.) (Vir:https://www.ekodezela.si/vsebina/vrtnarstvo/soncnice-za-sreco-za-

cebele/ 2019)

Sončnico (Helianthus annuus L.) uvrščamo v družino košaric (Asteraceae, sin.

Compositae). Sončnica izvira iz južnega dela Severne Amerike, v Evropi so jo najprej

uporabljali kot okrasno rastlino. Sončnica ima namreč veliko sort, večina je okrasnih. V

rodu Helianthus je veliko vrst, najpomembnejši poleg sončnic je topinambur (Helianthus

tuberosus L.). V sredini 19. stoletja so iz sončnice v Rusiji začeli iztiskati olje in tako je

sončnica postala tudi gospodarsko pomembna. Seme sončnice vsebuje od 25 do 53 %

kakovostnega olja. Pri nas se je v manjšem obsegu začela sejati konec 19. stoletja,

predvsem so jih sejali na robovih njiv za okras. Največ površin pod sončnicami je bilo po

https://www.ekodezela.si/vsebina/vrtnarstvo/soncnice-za-sreco-za-cebele/https://www.ekodezela.si/vsebina/vrtnarstvo/soncnice-za-sreco-za-cebele/



9

drugi svetovni vojni (okrog 1000 ha). V zadnjih letih se površine pod sončnicami gibljejo

med 200 in 300 ha. V letu 2015 je bilo v Sloveniji s sončnicami posejanih 230 ha njiv [4].

Poleg uporabe v živilsko predelovalni industriji za prehrano ljudi (olje, margarina,

majoneza, celo zrnje) sončnice lahko uporabljamo tudi kot krmno poljščino. Rastline

siliramo v času cvetenja, lahko pa siliramo samo zrna v pozni mlečni zrelosti. Za krmo jo

sejemo tudi v mešanih posevkih (npr. s krmnim grahom, bobom ali grašico). Kot

beljakovinska krma so pomembne sončnične tropine, ki ostanejo po stiskanju zrnja za olje.

Zrnje sončnic je uporabno še kot hrana za ptice. Sončnice lahko uporabljamo tudi kot

kurivo (stebla in koški sončnic), so pa tudi zelo priljubljene okrasne rastline. Sončnica je

medovita rastlina. Njeni veliki zlato do rdečerumeni cvetovi so izredno privlačni za čebele

in predstavljajo pomemben vir čebelje paše. Sončnični med zdravi in preprečuje bolezni

dihal, vnetje želodčne in črevesne sluznice, srčne in ledvične bolezni ter uravnava krvni

tlak. Cenjen je tudi v kozmetiki. Čebele, čmrlji in ose so glavni opraševalci sončnice [5].

2.2 BIOLOŠKA GNOJILA

Biološko gnojilo (tudi biognojilo) je gnojilo, ki poleg mineralnih hranil vsebuje tudi žive

mikroorganizme. S tem, ko ga dodamo na semena, rastlinske dele ali zemljo,

mikroorganizmi kolonizirajo rizosfero ali notranjost rastline in spodbujajo rast s

povečanjem razpoložljivosti in zalogo primarnih hranil za rastlino, ki jim je izpostavljena.

Mikroorganizmi v bioloških gnojilih obnavljajo naravni ciklus hranil v tleh in ustvarjajo

organske snovi. Z uporabo bioloških gnojil se obenem povečata obstojnost in zdravje tal.

Ker igrajo več vlog, je najprimernejši znanstveni izraz za take koristne mikroorganizme oz.

bakterije »plant growth promoting bacteria« (PGPB). Ti spodbujajo rast in razvoj rastlin s

sintezo snovi, potrebnih za rastline, zato so izjemno koristni pri bogatenju in izboljšanju

rodovitnosti tal, kakor tudi pri doprinosu rastlini potrebnih hranil. Biognojila zagotavljajo

ekološko prijazen agrarni poseg [4].

Povpraševanje po kemičnih gnojilih v kmetijstvu je zgodovinsko vplivalo na več med

seboj povezanih dejavnikov, kot so rast prebivalstva po vsem svetu, gospodarska rast,



10

agrarna produkcija, … (Morel s sod., 2012 v Souza s sod., 2015). Zanimanje za uporabo

inokulantov, ki vsebujejo PGPB (Plant growth promoting bacteria), ki spodbujajo rast in

pridelek rastlin, se je povečalo zaradi dušikovih gnojil, ki postajajo draga in lahko resno

škodujejo okolju z onesnaženjem vode z nitrati in tudi pripomorejo k emisijam

toplogrednih plinov (Adesemoye s sod. 2009; Hungria s sod., 2013 v Souza s sod., 2015).

Povezave med rastlinami in mikroorganizmi so že dolgo raziskane, vendar je njihovo

izkoriščanje v kmetijstvu za delno nadomestitev ali nadomestitev dušikovih gnojil v celoti

še vedno nizko (Hungria s sod., 2013 v Souza s sod., 2015). Če so bakterijski inokulanti

učinkoviti, lahko prispevajo k povečanju agronomske učinkovitosti z zmanjšanjem

proizvodnih stroškov in onesnaževanja okolja, kadar se uporaba kemičnih gnojil enkrat

zmanjša ali odstrani (Souza s sod., 2015).

Rizosfera se nanaša na tanko plast zemlje, ki neposredno obdaja koreninski sistem

(Zeppenfeld s sod. 2017 v Priyank s sod., 2019). Rizosferna regija je pomembna za

heterogene, raznolike in aktivno presnavljajoče organizme v tleh, kot so bakterije, ki živijo

v rizosferi, glive, foliarne in rastlinojede žuželke in gliste. Na splošno si biodiverziteta in

biološke dejavnosti rizosferskih organizmov v rizosferskem okolju niso med seboj

podobne. Kompleksnejše biološke aktivnosti se naravno odvijajo približno 2 mm od

površine korenin in se bistveno razlikujejo kot tiste v prsti, v populacijah, vrstah in

funkcijah organizmov, zato je znano, da je rizosfera »hot spot« bioloških dejavnosti

(Mendes s sod. 2013 v Priyank Hanuman s sod., 2019). Korenine rastlin imajo ključno

vlogo v raznolikosti rizosfer in njihovih bioloških aktivnostih z zagotavljanjem mehanske

podpore ter lajšanjem prevzema vode in hranil. Poleg tega korenine rastlin sproščajo široko

paleto spojin, kot so aminokisline, organske kisline, oligosaharidi, sladkorji, vitamini,

nukleotidi, flavonoidi, encimi, hormoni, hlapne spojine, fenoli, sluzi, ogljikovi hidrati in

različni sekundarni metaboliti, ki povečujejo biološke aktivnosti v rizosferni regiji

(Rohrbacher in St-Arnaud, 2016 v Priyank s sod., 2019). Ta mikroflora je pomemben vir

hrane za rastlinojede živali, kot so gliste, skakači in pršice, ki postanejo žrtev drugih malih

živali, kot so pajki in stonoge. Saprofiti, ki se nahajajo v rizosferni regiji, razkrajajo odmrle

snovi in razgrajujejo kompleksne molekule v preproste. V procesu razgradnje se sproščajo



11

hranilne snovi in odpadki, ki jih neposredno uporabljajo gostiteljske rastline (Priyank s

sod., 2019).

Učinkovitost kolonizacije korenin s PGPB je tesno povezana z mikrobno kompeticijo in

preživetjem v tleh, pa tudi z modulacijo izražanja več genov in medcelično komunikacijo-

via quorum sensing (Souza s sod., 2015). Korenine rastlin se odzivajo na različne okoljske

razmere z izločanjem spojin širokega nabora, te spojine vplivajo na interakcijo med

rastlino in bakterijo, kar kaže na učinkovitost inokulantov (Souzas sod., 2015). Tudi

zdravje tal je pomemben dejavnik, ki vpliva na učinkovitost inokulacije. Značilnosti, kot so

vrsta tal, nabor hranil in koncentracije strupenih kovin, vlažnost tal, mikrobna raznolikost

in motnje tal, ki jih povzroča upravljanje s tlemi, so vsi dejavniki, ki vplivajo na

učinkovitost inokulacije (Souza s sod., 2015).

Mehanizmi, s katerimi stimulira PGPB rast rastlin in dovaja razpoložljivost hranil, izvirajo

iz genetskih procesov, kot so biološka fiksacija dušika, raztapljanje fosfatov, lajšanje stresa

s pomočjo modulacije ekspresije ACC deaminaze, produkcijo fitohormonov in sideroforov

kot tudi še nekatere druge. Interakcije med rastlinami in bakterijami se pojavijo s

simbiotičnimi, endofitičnimi ali asociativnimi procesi z različnimi stopnjami oddaljenosti

od korenin in okoliške prsti. Endofitične PGPB so dobre kandidatke za inokulacijo, ker

kolonizirajo korenine in ustvarjajo ugodno okolje za razvoj in delovanje. Nesimbiotski

endofitični odnosi se pojavljajo znotraj medceličnih prostorov rastlinskih tkiv, kjer tkiva

vsebujejo veliko ogljikovih hidratov, aminokislin in anorganskih hranil (Bacon in Hinton,

2006 v Souza s sod., 2015).



12

Slika 2: Interakcije rizosfere in PGPB (Souza s sod., 2015)

Interakcije rizosfere in PGPB (Souza s sod., 2015)

a) Različne vrste povezav med koreninami rastlin in koristnimi bakterijami v tleh.

b) Po kolonizaciji ali povezanosti s koreninami in/ali rizosfero lahko bakterije koristijo

rastlinam s/z:

• toleranco proti abiotskemu stresu z delovanjem ACC deaminaze;

• obrambo proti patogenom zaradi prisotnosti kompetitivnih lastnosti, kot je

proizvodnja sideroforov;

• povečanjem rodnosti in rasti rastlin s pomočjo biološke fiksacije dušika (BNF),

proizvodnjo IAA (indol-3-ocetne kisline) in raztapljanja fosfatov okoli korenin.

2.3 MEHANIZMI DELOVANJA PGPB

Biološka fiksacija dušika

Vsi organizmi potrebujejo dušik (N) za sintezo biomolekul, kot so proteini in nukleinske

kisline. Vendar pa glavni vir N v naravi, atmosferski dušik (N2), ni dostopen večini živih

organizmov, tudi evkariontom. Biološko fiksiranje dušika (BNF) je proces, pri katerem se

N2 reducira v amonijak (NH3) (Souza s sod., 2015). Proces se odvija predvsem v

diazotrofnih mikroorganizmih, zlasti bakterijah in Arhejah (Dixon in Kahn, 2004 v Souza s

sod., 2015). Diazotrofni mikroorganizmi izvajajo BNF skozi nitrogenaze, visoko

konzerviran encim, ki obsega dva metaloproteina, in sicer FeMo-protein in Fe-protein



13

(Dixon in Kahn, 2004 v Souza s sod., 2015). Družina Fabaceae ima prisotne talne bakterije

iz družine Rhizobiaceae (rhizobia), ki so omejene na korenske nodule (Willems, 2007 v

Souza s sod., 2015). Znotraj teh nodulov rizobia učinkovito izvajajo BNF skozi ustrezni

nadzor prisotnosti kisika, ki je inhibitor aktivnosti nitrogenaz. (Dixon in Kahn, 2004;

Shridhar, 2012 v Souza s sod., 2015).

Več vrst mikroorganizmov se uporablja v gojenju rastlin gospodarskih interesov. Na

primer za proizvodnjo soje (Glycine max L.) (Souza s sod., 2015) in sladkornega trsa

(Saccharum officinarum L.) (Thaweenut s sod., 2011 v Souza s sod., 2015) se uporablja

več različnih sevov bakterije Bradyrhizobium sp., kot sta B. japonicum in B. elkanii.

Herbaspirillum sp. je gram-negativna bakterija, povezana s pomembnimi kmetijskimi

pridelki, kot so riž (Oryza sativa L.) (Pedrosa s sod., 2011 v Souza s sod., 2015), sirek

(Sorghum bicolor L.) (James s sod., 1997 v Souza s sod., 2015), koruza (Zea mays L.)

(Monteiro s sod., 2008 v Souza s sod., 2015) in sladkorni trs (Pedrosa s sod., 2011 v Souza

s sod., 2015).

Proizvodnja indolskih spojin

Vpliv bakterij v rizosferi rastlin je v veliki meri posledica proizvodnje avksinov (Spaepen s

sod., 2007 v Souza s sod., 2015). Več vrst bakterij lahko proizvede indolske spojine (IC),

kot je avksinski fitohormon indol-3-ocetna kislina (IAA), ki predstavlja veliko fiziološko

pomembnost za interakcije med rastlinami in bakterijami od patogeneze do fitostimulacije

(Spaepen s sod., 2007 v Souza s sod., 2015). Sposobnost proizvodnje IC je pogosta pri

bakterijah, ki so z rastlinami povezane. Souza s sod. (2013) so pokazali, da približno 80 %

bakterij, izoliranih iz rizosfere, za pridelavo riža lahko izloča IC. Druge študije so

pokazale, da rizosferne bakterije proizvajajo več IC kot bakterije, ki se nahajajo v prsti

poleg rastline (Khalid s sod., 2004 v Souza s sod., 2015). V nedavni študiji Costa s sod.

(2014) so pokazali, da je bil učinek visoke proizvodnje IC opazen tudi v endofitnih

bakterijah, posebno v družini Enterobacteriaceae (Enterobacter, Escherichia, Grimontella,

Klebsiella, Pantoea in Rahnella). Na primer: fižol (Phaseolus vulgaris L.; kultivar

DOR364), cepljenje z A. brasilense Sp245 in Rhizobium etli CNPAF512 je pokazalo, da je

pri rastlini zrastlo večje število nodulov. Azospirillum sp., ki producira IAA, prav tako



14

spodbuja spremembe v rasti in razvoju pšenice (Triticum aestivum L.) (Souza s sod.,

2015). Prav tako lahko mikroorganizmi, ki katabolizirajo IAA, pozitivno vplivajo tudi na

rast rastlin in preprečujejo napade patogenov (Leveau in Lindow, 2005 v Souza s sod.,

2015).

Proizvodnja sideroforov

Železo (Fe) je nujno potrebno mikrohranilo za rastline in mikroorganizme, saj sodeluje pri

različnih pomembnih bioloških procesih, kot so fotosinteza, dihanje, biosinteza klorofila

(Kobayashi in Nishizawa, 2012 v Souza s sod., 2015) in BNF (Dixon in Kahn, 2004 v

Souza s sod., 2015). Rastline v glavnem pridobivajo Fe iz rizosfere. Čeprav je Fe ena

najpogostejših kovin v zemeljski skorji, je njegova razpoložljivost za korenine rastlin zelo

majhna. Razpoložljivost Fe narekujeta obnovitveni potencial tal in pH. V tleh, ki so

aerobna ali z višjim pH, Fe hitro oksidira in je večinoma v obliki netopnih železovih

oksidov. Z nižjim pH se iz železovega oksida sprosti oksid, in s tem postane bolj na voljo

za vnos preko korenin. Odzivi na pomanjkanje Fe vključujejo spremembe koreninske

morfologije in up-reguliranje genov, vključenih v vnos Fe (Morrissey in Guerinot 2009).

Mehanizem vnosa železa, ki ga povzroči stres ob pomanjkanju le-tega, vključuje

sproščanje vodikovih ionov in reducentov iz korenin. Znižani pH in prisotnost reducenta v

koreninski coni skupaj z reduciranjem Fe3+ v Fe2+ na površini korenin omogočajo, da se

Fe2+ prevzame predvsem skozi mlade lateralne korenine. Koreninsko absorbiran Fe2+ se

oksidira do Fe3+ na stičišču protoksilema in metaksilema, kelira se s citratom, nato pa se po

metaksilemu prenese v rastlinski vrh (Brown 1978).

V anaerobnih in kislih tleh, kot so poplavljena tla, nastanejo visoke koncentracije

železovega (Fe2+) iona, ki nastane z redukcijo iz železovega (Fe3+) iona, to lahko povzroči

strupenost zaradi prekomernega privzema železa (Stein s sod., 2009 v Souza s sod., 2015).

V aerobnih pogojih je topnost železa nizka, kar odraža prevlada Fe3+ ionov, ki so običajno

vezani kot oksidihidroksidni polimeri, s čimer se omeji vnos železa za različne oblike

življenja. To je zlasti značilno za apnenčasta tla (Andrews s sod., 2003; Lemanceau s sod.,

2009 v Souza s sod., 2015). Mikroorganizmi so razvili aktivne strategije za absorpcijo Fe.

Bakterije lahko premagajo omejitve okolja pri vnosu Fe z uporabo kelatorjev, ki se

imenujejo siderofori. Siderofori so opredeljeni kot molekule z nizko molekulsko maso (<



15

1000 Da) z visoko specifičnostjo in afiniteto za keliranje ali vezavo Fe3+, ki mu sledita

transport in odlaganje Fe v bakterijske celice (Neilands, 1995; Krewulak in Vogel, 2008 v

Souza s sod., 2015). Izločanje sideroforov spodbudi rast rastlin, s čimer se izboljša

prehranjenost (neposredni učinek) ali zaviranje fitopatogenov (posredni učinek) z vplivom

na Fe iz okolja. Za razliko od mikrobnih patogenov na rastline ne vpliva bakterijsko

izčrpavanje železovih ionov, pri nekaterih rastline celo ujamejo in uporabijo bakterijski

Fe3+ – sideroforne komplekse (Dimkpa s sod., 2009 v Souza s sod., 2015).

Aktivnost ACC deaminaze

Etilen je endogeno proizveden plinski fitohormon, ki sodeluje v nizkih koncentracijah pri

regulaciji vseh procesov rasti, razvoja in staranja (Shaharoona s sod., 2006; Saleem s sod.,

2007 v Souza s sod., 2015). Etilen je bil prav tako opredeljen kot fitohormon stresa. Pod

abiotičnimi in biotičnimi stresi (poškodbe patogenov, poplave, suše, soli, organska in

anorganska onesnaževala) se proizvodnja endogenega etilena bistveno pospeši, kar

negativno vpliva na rast korenin in posledično rastline kot celote.

Preučenih je bilo več mehanizmov zmanjšanja ravni etilena v rastlinah. Eden od

mehanizmov vključuje aktivnost bakterijskega encima 1-aminociklopropan-1-karboksilat

(ACC) deaminazo (Souza s sod., 2015). ACC deaminaza ureja produkcijo etilena z

metaboliziranjem ACC (neposredni prekurzor biosinteze etilena v višjih rastlinah) v 2-

oksibutanojsko kislino ('Ketobutyric acid)'' in amonijak (Souza s sod., 2015). Znatna

količina rastlinskega ACC se lahko izloči iz korenin rastlin, količino, ki jo lahko pozneje

prevzamejo mikroorganizmi v tleh, pa hidrolizira encim ACC deaminaza, kar posledično

zmanjšuje količino ACC v okolju. Skupnosti mikroorganizmov v tleh s prisotno

aktivnostjo ACC deaminaze imajo lahko boljšo rast kot drugi prosti mikroorganizmi, saj ti

organizmi uporabljajo ACC kot vir dušika (Glick, 2005). Onofre-Lemus s sod. (2009) (v

Souza s sod., 2015) so opazili, da je aktivnost ACC deaminaze razširjena značilnost vrst

rodu Burkholderia. Ti avtorji so identificirali 18 vrst tega roda, ki kažejo dejavnost; med

temi bakterijami B. unamae lahko endofitično naseli paradižnik (Solanum lycopersicum

L.). Poleg tega so rastline paradižnika, ki so jih inokulirali z B. unamae sevom divjega tipa,

imele boljšo rast kot tiste, ki so jih inokulirali z mutiranim sevom brez aktivnosti ACC

deaminaze (Onofre-Lemus s sod., 2009). Alcaligenes sp., Bacillus sp. in Ochrobactrum sp.



16

vplivajo na toleranco soli in posledično izboljšujejo rast riža v slanih pogojih. Arshad s

sod. (2008) so pokazali podobne rezultate, da sev Pseudomonas spp. z aktivnostjo ACC

deaminaze delno odpravi učinek stresa zaradi suše na rast graha (Pisum sativum L.) (Souza

s sod., 2015).

Raztapljanje fosfatov

Fosfor (P) je bistveno hranilo za rastline, saj kot strukturna komponenta sodeluje pri

nukleinskih kislinah, fosfolipidih in adenozin trifosfatu (ATP) kot ključni element

metabolnih in biokemičnih poti, pomemben zlasti za BNF in fotosintezo (Khan s sod.,

2009; Richardson in Simpson, 2011 v Souza s sod., 2015). Rastline absorbirajo fosfor v

dveh topnih oblikah: H2PO4- in HPO4

2-(Glass, 1989 v Souza s sod., 2015). Vendar pa je

velik delež P v netopnih oblikah in zato ni na voljo za prehrano rastlin. Nizke vrednosti P

odražajo visoko reaktivnost fosforja z drugimi topnimi komponentami (Khan s sod., 2009

v Souza s sod., 2015), kot sta aluminij v kislih tleh (pH < 5) in kalcij v bazičnih tleh (pH >

7) (Holford, 1997; McLaughlin s sod., 2011 v Souza s sod., 2015). Organske (vključene v

biomaso ali organske snovi v tleh) in anorganske spojine, predvsem v obliki netopnih

mineralnih kompleksov, so največje zaloge razpoložljivega P v tleh (Rodríguez s sod.,

2006; Richardson in Simpson, 2011 v Souza s sod., 2015). Zato je razpoložljivost P

odvisna od topnosti tega elementa, na katerega bi lahko vplivali z delovanjem rastlinskih

korenin in mikroorganizmov v tleh. Bakterije in glive, ki raztapljajo fosfate, tvorijo

približno, v tem vrstnem redu, 1–50 % oz. 0,1–0,5 % celotne populacije mikroorganizmov

v tleh, ki jih lahko gojimo (Chabot s sod., 1993; Khan s sod., 2009 v Souza s sod., 2015).

Bakterije, ki raztapljajo fosfate, raztopijo anorganske zemeljske fosfate, kot so Ca3(PO4)2,

FePO4 in AlPO4, skozi produkcijo organskih kislin, sideroforov in hidroksilnih ionov

(Souza s sod., 2015). Nekatere bakterije raztapljajo samo kalcijev fosfat, medtem ko so

drugi mikroorganizmi sposobni raztapljanja tudi drugih oblik anorganskih fosfatov z

različno intenziteto. Predvsem proizvodnja organskih kislin glukonskih in karboksilnih je

eden od dobro preučenih mehanizmov, ki ga mikroorganizmi uporabijo za raztapljanje

anorganskih fosfatov (Rodriguez in Fraga, 1999). Ambrosini s sod. (2012) (v Souza s sod.,

2015) so dokazali, da so sevi Burkholderia, povezani z raztapljanjem Ca3(PO4)2,



17

prevladovali pri sončnicah. Chen s sod. (2006) so že prej poročali o več sevih bakterij, ki

topijo fosfate in spadajo v rodove Bacillus, Rhodococcus, Arthrobacter, Serratia,

Chryseobacterium, Gordonia, Phyllobacterium in Delftia (Souza s sod., 2015).

Qin s sod. (2011) so predlagali, da je sposobnost rizobija za raztapljanje anorganskega

fosfata povezana z zakisanjem rizosfere. Še več, inokulacija z rizobijem izboljša

pridobivanje P pri soji, zlasti, kjer je bil Ca3(PO4)2 primarni vir fosforja (Souza s sod.,

2015).

Poleg bakterij simbiotske glive prav tako pomembno vplivajo na rast in razvoj rastlin.

Glive pospešujejo razkroj organskih spojin v prsti v spojine, sprejemljive za višje rastline.

Glive rastlinam dovajajo fosfor in dušik ter nekatere vitamine, v sušnem obdobju pa tudi

vodo. Iz rastlin glive črpajo organske spojine, predvsem sladkorje, ki jih potrebujejo za

svoj razvoj. Mikoriza je nujna za pravilen razvoj številnih vrst rastlin. V naravi je mikoriza

zelo razširjena, saj ima mikorizno simbiozo kar 83 % dvokaličnic, 79 % enokaličnic in vse

golosemenke [7].

Mikorizna simbioza pomembno prispeva k prehrani rastlin, zlasti pri prevzemu fosforja.

Prvič zaradi svoje zelo velike površine hife gliv zelo učinkovito prevzemajo hranila. Glive

tvorijo izven koreninski micelij, ki je v tleh zelo obsežen in poveča območje absorpcije

korenin. Drugič, fosfor je zelo nepremičen element, ker ga delci zemlje zlahka absorbirajo,

okoli rastlinskih korenin pa hitro nastane območje brez fosfatov. Zelo obsežne hife segajo

preko tega izčrpanega območja in absorbirajo biološko razpoložljiv fosfat, ki sicer ne bi bil

dostopen rastlini. Tudi fosfatni ioni v tleh se hitro vežejo s kationi in tvorijo netopne

komplekse, ki niso na voljo rastlinam. Znano je, da prisotnost mikoriznih gliv v tleh

izboljša topnost fosfatov. Ali glive same sproščajo encime, ki razbijajo netopne fosfatne

komplekse, se še vedno razpravlja. Kljub temu je zagotovo to, da glive medsebojno

vzajemno delujejo z mikroorganizmi rizosfere in izboljšujejo vzpostavitev bakterij, od

katerih mnoge izločajo encime, ki topijo fosfate. Te interakcije imajo pozitivne sinergijske

učinke, ki se pokažejo kot povečana prehranjenost, rast in preživetje rastlin. Zgoraj opisani

procesi mobilizacije hranil so še posebej pomembni pri prehrani rastlin in razlagajo, zakaj

ne mikorizne rastline potrebujejo višjo raven rodovitnosti tal za vzdrževanje svojega

zdravja. Za obvladovanje gliv AM (Arbuskularna mikoriza) pri posevkih sta dva glavna



18

pristopa: nanos inokuluma izbranih sevov AM gliv ali upoštevanje prakse za povečanje

širjenja in kolonizacije avtohtonih gliv (Roy-Bolduc in Hijri, 2010).

2.4 BIOPOSPEŠEVALEC, UPORABLJEN V EKSPERIMENTU

Za namen eksperimenta smo uporabili biognojilo oz. biopospeševalec (proizvajalec želi

ostati anonimen).

Biognojilo vsebuje:

• organski dušik (N) 3 %

• skupno fosfatnega pentaoksida (P2O5) 9 %

• kalcijev oksid (CaO) skupno 8 %

• magnezijev oksid (MgO) skupno 2 %

• železo (Fe) 2 %

• organski ogljik (C) biološkega porekla 16 %

Dovoljeno v biološkem kmetovanju:

• Mineralno gnojilo: naraven razrahljan fosfat z vsebnostjo kadmija manj

ali enako 90 mg/kg P2O5, naravni dolomit, železova sol (sulfat).

• Organska komponenta gnojila: posušen gnoj in posušeni iztrebki

perutnine iz industrijskih farm, surov rastlinski material.



19

3 MATERIALI IN METODE

3.1 KEMIKALIJE

• biopospeševalec

• semena sončnic

• prst (Cvetal: univerzalni substrat)

• 80 % aceton (CH3(CO)CH3)

• tekoči dušik (N2) (za liofilizacijo)

• destilirana voda

3.2 LABORATORIJSKA OPREMA

Drobni inventar

• mikrocentrifugirke (1,5 mL in 2 mL iz polipropilena), Ratiolab GMBH, Nemčija

• laboratorijska steklovina

Aparature

• EDXRF PDZ-02T (last Inštituta Jožefa Štefana)

• sterilizator lab. 446 PR

• Shimadzu UV spectrophotometer: UV 1800



20

4 METODE DELA

4.1 PRIPRAVA POSKUSA

V deset lončkov smo posadili po 3–5 semen sončnice. V prvo serijo vzorcev, ki smo jih

poimenovali A, smo posadili 3–5 semen sončnice, vendar gnojila v to serijo nismo dodali

(kontrola). V serijo, ki smo jo poimenovali B, smo prav tako dodali v deset lončkov po 3–5

semen, ki smo jim dodali avtoklavirano gnojilo. Gnojilo v seriji B smo avtoklavirali zato,

da smo se znebili kakršnekoli biološke aktivnosti, ki bi vplivala na rast sončnic, saj smo z

eksperimentom poskušali ugotoviti le faktor, ki ga imajo na rast sončnic dodani biološki

pospeševalci. Torej, v tretjo serijo C smo dodali normalno neavtoklavirano gnojilo iz

embalaže. Vsi vzorci (B in C) so dobili po 1 gram gnojila/lonček v luknjo, narejeno s

prstom, v katero smo potem dodali semena. Pomembno je, da je imelo gnojilo stik z

semeni, saj so tako lahko mikroorganizmi v gnojilu lažje razvili povezavo z razvijajočimi

se kalicami. Vsi vzorci so tudi prejeli enako prst.

Lončke smo položili v pladnje, pladnje pa smo odnesli v rastne komore, kjer smo rastline

gojili pod enakimi pogoji; 16/8 urni dan/noč, 23C, 80 % relativna zračna vlaga. Rast

vzorcev je trajala od 2. 11. do 21. 12. 2019, torej vsega skupaj 49 dni. V tretjem tednu (21

dan) smo število rastlin omejili na dve na lonček.

Po koncu rasti sončnic smo rastline ločili od prsti in razdelili vzorce na poganjke (P) in

korenine (K), ki smo jih dodatno oprali. Vzorce smo sveže stehtali (sveža masa vzorcev),

zavili v alufolijo in zamrznili v tekočem dušiku ter shranili v zamrzovalniku do nadaljnjih

analiz.

Vzorce smo nato liofilizirali, določili suho maso in uprašili v terilnici.

4.2 ANALIZA Z METODO RENTGENTSKO FLUORESCENČNE

SPEKTROMETRIJE

XRF (rentgenska fluorescenca) je nedestruktivna analitska tehnika, ki se uporablja za

določanje elementne sestave materialov. XRF analizatorji določajo kemijo vzorca z

merjenjem fluorescenčnega (ali sekundarnega) rentgenskega spektra, ki ga vzorec oddaja,

ko ga vzbudi primarni vir rentgenskih žarkov. Vsak od elementov v vzorcu proizvaja niz

značilnih fluorescentnih rentgenskih žarkov (»prstni odtis«), ki je edinstven za ta specifični



21

element, zato je XRF spektroskopija odlična tehnika za kvalitativno in kvantitativno

analizo sestave materiala [6].

Pri naši analizi vzorcev z EDXRF smo analizirali elemente: fosfor (P), žveplo (S), kalij

(K), kalcij (Ca), mangan (Mn), železo (Fe), nikelj (Ni), baker (Cu), cink (Zn).

Postopek priprave tabletk in meritve XRF

Uprašene korenine in poganjke smo shranili v epice ter jih označili. Analizo mineralov v

vzorcih se je merilo s pomočjo prenosnega rentgenskega fluorescenčnega spektrometra v

laboratoriju za Rentgensko fluorescenčno spektrometrijo na Katedri za botaniko in

fiziologijo rastlin Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Iz posušenih in zmletih

vzorcev smo s pomočjo hidravlične stiskalnice stisnili tabletke tako, da so imele približno

enako maso. Tabletke smo stehtali in določili površinsko gostoto. Podatke smo uporabili

pri nadaljnjih izračunih koncentracij elementov v vzorcu s programsko opremo QAES

(Nečemer s sod., 2008).

4.3 POSTOPEK ANALIZE FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV

Metoda analize FS je rahlo spremenjena, vendar v celoti temelji na metodi avtorice Monni

(2001).

30 mg uprašenih vzorcev poganjkov smo natehtali v čiste centrifugirke. V centrifugirke

smo nalili 5 ml 80 % acetona, označili vzorce s flomastrom, pokrili z gumijastimi

pokrovčki in jih dobro zvorteksirali ter označili višino acetona. Centrifugirke smo čez noč

pustili v hladilniku, nato pa smo vanje dolil 80 % aceton do oznake, torej, kar ga je

izhlapelo. Vzorce smo še enkrat zvorteksirali in docentrifugirali 2 minuti na 2500 obratov

/min. Spektrofotometer smo umerili z 80 % acetonom in pomerili absorpcijo vzorcev pri

valovnih dolžinah 647 nm, 664 nm in 470 nm. Za izračun koncentracije pigmentov v

vzorcih smo uporabili izračun, povzet po Lichtenthaler in Buschmann (2001) (Kržič M.

2015).

Enačbe:

Klorofil a (Chla) (µmol/l) = 12,25 × A664 – 2,79 × A647

Klorofil b (Chlb) (µmol/l) = 21,50 × A647 – 5,10 × A664



22

Klorofil a+b (µmol/l) = 7,15 × A664 + 18,71 × A647

Ʃ karotenoidov = (1000 × A470 – 1,82 × Chla – 85,02 Chlb) ÷ 198

X (mg/g) = (konc. Chl(mg/l) × Vekstrakta (l)) ÷ mvzorca (g)

A664 = absorpcija ekstrakta pri valovni dolžini 664 nm

A647 = absorpcija ekstrakta pri valovni dolžini 647 nm

A470 = absorpcija ekstrakta pri valovni dolžini 470 nm.

4.4 STATISTIČNA ANALIZA PODATKOV

Podatke smo analizirali s standardnimi statističnimi metodami. Pri analizi smo si pomagali

z MS Excel 2013 in programskim kompletom Statistica (Statsoft 7.0.61.0 EN). Statistično

značilne razlike smo izračunali s pomočjo programa enosmerna ANOVA, Duncanov test

(p < 0,05).



23

5 REZULTATI

5.1 SVEŽA IN SUHA MASA POGANJKOV IN KORENIN

Vpliv biološkega pospeševalca na sončnico smo preverili tudi z določanjem sveže in suhe

mase korenin in poganjkov. V splošnem je bila sveža masa korenin manjša od sveže mase

poganjkov (Slika 3).

Sveže mase poganjkov in korenin med seboj niso statistično značilno različne (Slika 3) .

Slika 3: Sveža masa poganjkov in korenin sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka)

n(poganjkov) = 10, n(korenin)= 3. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p

< 0,05).



24

Slika 4: Suha masa poganjkov in korenin sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov)

= 10, n(korenin)= 3. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05).

Suha masa poganjkov je bila večja od suhe mase korenin. Suhe mase poganjkov in korenin

med seboj niso statistično značilno različne (Slika 4) .

5.2 ANALIZA Z XRF – KONCENTRACIJE MINERALNIH ELEMENTOV

Po analizi z XRF in statistični obdelavi podatkov smo ugotovili, da se med posameznimi

obravnavami statistično značilno razlikujejo le koncentracije fosforja (P) in kalija (K) v

poganjkih (Slika 5 in 6) in bakra v koreninah (Slika 7).



25

Slika 5: Vsebnost kalija v poganjkih sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) =

10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05).

Slika 6: Vsebnost fosforja v poganjkih sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka) n(poganjkov) =

10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05).



26

Slika 7: Vsebnost bakra v koreninah sončnic pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka), n(korenin) = 3.

Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05).

5.3 ANALIZA FOTOSINTEZNIH PIGMENTOV

Po statistični analizi vsebnosti fotosinteznih pigmentov vzorcev poganjkov smo ugotovili,

da se serije med seboj statistično razlikujejo v vsebnosti klorofila b (Slika 8) in vsebnosti

karotenoidov (Slika 9). Prav tako se serije med seboj statistično razlikujejo, vendar ne v

toliki meri, v vsebnosti klorofila a+b (Slika 8).



27

Slika 8: Koncentracija klorofila b in klorofila a+b v mg na g vzorca pri različnih pogojih (povprečje ± standardna

napaka) n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p <

0,05).

Slika 9: Koncentracija karotenoidov v mg na g vzorca pri različnih pogojih (povprečje ± standardna napaka),

n(poganjkov) = 10. Različne črke nad stolpci označujejo statistično značilno razliko med izpostavitvami (p < 0,05).



28

6 DISKUSIJA

Med različnimi avtorji obstaja različno mnenje o vplivu biognojil na rast in uspešnost

rastlin, ki so jih avtorji preučevali. »Uporaba biognojila, ki vsebuje koristne mikrobe, je

pokazala spodbuden učinek na rast koruze (Z. mays) in izboljšanje lastnosti tal s 87-dnevno

toplogredno študijo.« »Cepljenje z rizobakterijami lahko znatno poveča mikorizno

kolonizacijo korenin. Prisotnost mikoriznih gliv je imela vpliv na populacijo rizobakterij in

G. intraradices je spodbudila rast vnesenih koristnih bakterij v tleh rizosfere (Wu s sod.,

2005). Iz teh pridobljenih mnenj in rezultatov lahko sklepamo, da smo v našem

eksperimentu uporabili biognojilo, ki ni vsebovalo specifičnih vrst rizobakteriji, saj bi se

vpliv mikoriznih gliv na rastlino pokazal v večji meri, če bi jih gnojilo vsebovalo.

Rast riža (Oryza sativa L.) je bila boljša na hlevskem gnoju kot v serijah NPK gnojil in

zelenega gnoja, tem primeru zeleni gnoj pomeni zmlete odpadle veje in listje rastlin.

Očitno je sočasna inokulacija z dvema biognojiloma (''Biopower'' in ''EM'') izboljšala rast

korenin in poganjkov na tleh, pognojenih z gnojem. Ta študija zaključuje, da sta dve

gnojili očitno povečali biomaso poganjkov in donos zrnja na tleh, pognojenih z zelenim

gnojem (Javaid, 2011). Za izboljšanje naših rezultatov eksperimenta bi lahko preučevali

tudi vpliv našega biopromotorja v različnih vrstah substrata, torej, kako na razvoj PGPB

vpliva prst, v kateri se rastlina nahaja.

Ko smo SS (sewage sludges) uporabili neposredno na tleh, analizirana koncentracija

makro- in mikronutrientov tako v tleh kot v listih ni pokazala bistvenih razlik med rastnimi

dobami. Pomembni učinki so bili opaženi, ko je bil SS uporabljen kot foliarno gnojilo

(Tejada s sod., 2016). Iz tega lahko sklepamo, da bi v našem eksperimentu dobili drugačne

rezultate, če bi v eksperimentu uporabili gnojilo v foliarni obliki.

Uporaba rizobakterijskih inokulantov kot biognojil in biokontrolerjev je sestavni del prakse

trajnostnega kmetijstva (Babalola, 2010 v Aloo s sod., 2018) in je bila predmet preiskav že

dolgo (Stamenković s sod., 2018 v Aloo s sod., 2018). Z naraščajočim poudarkom na

trajnostnem kmetijstvu, varstvu okolja in zanesljivi preskrbi s hrano, je izkoriščanje

koristne mikrobiote tal neizogibno (Ilangumaranand Smith, 2017 v Aloo s sod., 2018).

Rizobakterije Bacilli ne predstavljajo le okolju prijazne, temveč tudi učinkovito

tehnologijo (Shafi s sod., 2017 v Aloo s sod., 2018), PGPB vplivajo prek različnih

mehanizmov, vključno z biološko zaščito rastlin, proizvodnjo hormonov in solubilizacijo



29

hranil. Sestava, komercializacija in uporaba rizobakterij v kmetijstvu v resnici ne odraža

obsega raziskav, ki so bila storjena z njimi in njihovimi različnimi sposobnostmi in

edinstvenimi lastnosti. Potrebnih je več preiskav v zvezi z njihovimi načini delovanja,

praktičnimi formulacijami, uporabo, prav tako je treba preveriti stabilnost pogojev na polju

in preverjanje učinkovitosti sevov (Aloo s sod., 2018). V našem eksperimentu bi morali

zagotovo določiti seve kultur prisotnih mikroorganizmov v biognojilu, in na podlagi

izsledkov inokulacije z temi sevi pridobiti realno sliko vplivov specifičnih sevov na rast

sončnice. Prav tako je treba omeniti, da bi lahko pri eksperimentu dobili drugačne

rezultate, če bi rast vzorcev trajala dalj časa. Na rezultate korenin je vplivalo tudi dejstvo,

da je bilo število vzorcev korenin v vsaki seriji le tri.

7 ZAKLJUČEK

• Našo prvo hipotezo lahko po analizi rezultatov z XRF ovržemo. Prav tako bi se bolj

uspešna rast lahko pokazala pri sami teži vzorcev oz. razliki med suho in svežo

maso vzorcev, vendar se serije vzorcev med seboj statistično ne razlikujejo.

• Drugo hipoteza smo ovrgli. Biognojilo je negativno delovalo na vsebnost klorofila

b, a+b in karotenoidov.

• Tretja hipoteza je prav tako ovržena.

• Uporabljen biološki pospeševalec rasti ni pomembno vplival na mineralno

prehranjenost sončnic.

• Biološka komponenta gnojila, ki smo jo preučevali s tem eksperimentom, se ni

pokazala, to lahko sklepamo iz rezultatov vzorcev med avtoklaviranim gnojilom

(B) in neavtoklaviranim gnojilom (C).

• Točno podani sevi v gnojilu niso napisani, kar pomeni, da je gnojilo lahko

vsebovalo vrste bakterij, ki škodujejo sončnicam.

• Sklepamo lahko, da je v primeru sončnic biognojilo premalo specifično za našo

vrsto rastline (sončnico). Gnojilo bi lahko izboljšali z inokulacijo vrste rastline s

točno določenim in specifičnim sevom, ki dokazano izboljša rast in razvoj vrste,

kar bi zagotovo prineslo boljše rezultate.



30

VIRI

[1] Kmetijstvo (2019). Pridobljeno s: https://sl.wikipedia.org/wiki/Kmetijstvo [Datum

dostopa: 10. 5. 2019]

[2] Fertilizer (2019). Pridobljeno s: https://www.britannica.com/topic/fertilizer [Datum

dostopa: 23. 5. 2019]

[3] Gnojila (2019). Pridobljeno s: https://www.kis.si/Gnojila/ [Datum dostopa: 10. 5.

2019]

[4] Biofertilizer (2019). Pridobljeno s: https://en.wikipedia.org/wiki/Biofertilizer

[Datum dostopa: 10. 5. 2019]

[5] Sončnica (2017). Pridobljeno s:

https://lj.kgzs.si/Portals/1/2017%20%20novice/TN%20soncnica%2010%2004%2017.p

df [Datum dostopa: 10. 5. 2019]

[6] X-ray-diffraction (2019). Pridobljeno s: https://www.bruker.com/products/x-ray-

diffraction-and-elemental-analysis/x-ray-fluorescence/what-is-xrf.html [Datum

dostopa: 12. 5. 2019]

[7] Mikoriza (2019). Pridobljeno s: https://sl.wikipedia.org/wiki/Mikoriza

Alooa B.N., Makumbab B.A., Mbega E.R. (2018): The potential of Bacilli

rhizobacteria for sustainable crop production and environmental sustainability.

Microbiological Research, 219 26–39. Arusha, Eldoret.

Azizi M., Mahmoudabadi E., (2013): Effect of Biological Plant Growth Promoters on

Yield and Yield Components of Sesame, Agriculture Science Developments, 84–86.

Brown J. C. (1978): Mechanism of iron uptake by plants. Plant, Cell &

Environment, Volume 1, Pridobljeno s: https://doi.org/10.1111/j.1365-

3040.1978.tb02037.x

Javaid A. (2011): Effects of biofertilizers combined with different soil amendments on

potted rice plants. Chilean journal of agricultural research 71(1):157–163.

Likar M., (2012): Navodila za laboratorijske vaje pri predmetih fiziologija rastlin in

fitofiziologija. Biotehniška fakulteta.

Lichenthaler H.K., Buschmann C., (2001): Extraction of photosynthetic tissues:

chlorophylls and carotenoids. Current protocols in food analytical chemistry. John

Wiley, New York.



31

Morrissey, J., Guerinot M. L. (2009). Iron uptake and transport in plants: the good, the

bad, and the ionome. Chemical reviews, 109(10), 4553–4567. doi:10.1021/cr900112r

Nečemer M., Kump P., Ščančar J., Jaćimović R., Simčič J., Pelicon P., … Vogel-

Mikuš K., (2008): Application of X-ray fluorescence analytical techniques in

phytoremediation and plant biology studies. Spectrochim. Acta Part B At. Spectrosc.

63, 1240–1247. https://doi.org/10.1016/j.sab.2008.07.006.

Priyank H. M., Karthik C., Kadirvelu K., Divya K.L., … Shanmuganathan R. (2019):

Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR): A potential alternative tool for

nematodes bio-control. Sciencedirect, Volume 17, strani 119–128. Pridobljeno s strani:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1878818118306546#!

Polanec A. R., Košuta M., Jug T. (2014): Osnove prehrane rastlin in gnojenja. KGZS

– Kmetijsko gozdarski zavod Nova Gorica. Nova Gorica.

Roy-Bolduc A., Hijri M. (2010): The Use of Mycorrhizae to Enhance Phosphorus

Uptake: A Way Out The Phosphorus Crisis. Journal of Biofertilizers & Biopesticides,

Montreal. doi: 10.4172/2155-6202.1000104

Rouessac F., Rouessac A., (2000): Chemical Analysis - Modern Instrumental Methods,

Wiley, Chichester.

Souza R., Ambrosini A., Passaglia L. M. P., (2015): Plant growth-promoting bacteria

as inoculants in agricultural soils, Genetics and Molecular Biology, 401–419.

Tejadaa M, Rodríguez-Morgado B., Gómez I., Franco-Andreua L., Benítezc C.,

Parrado J. (2016): Use of biofertilizers obtained from sewage sludges on maize yield.

European Journal of Agronomy 78 (2016) 13–19. Sevilla.

Whiteside M. D., Werner G.D.A., Caldas V. E. A., Shimizu T. S., West S. A., Kiers E.

T., (2019): Mycorrhizal Fungi Respond to Resource Inequalityby Moving Phosphorus

from Rich to Poor Patchesacross Networks. Current biology 29, strani 2043–2050.

Pridobljeno s strani: https://doi.org/10.1016/j.cub.2019.04.061

Wu, S. C., Cao, Z. H., Li, Z. G., Cheung, K. C., Wong, M. H. (2005): Effects of

biofertilizer containing N-fixer, P and K solubilizers and AM fungi on maize growth: a

greenhouse trial. Geoderma, 125(1–2), 155–166. doi:10.1016/j.geoderma.2004.07.003

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1878818118306546https://doi.org/10.1016/j.cub.2019.04.061



32

ZAHVALA

Zahvaljujem se moji mentorici prof. dr. Katarini Vogel Mikuš za mentorstvo, dostopnost,

vodenje in prijaznost.

Za pomoč pri delu se zahvaljujem zaposlenim v laboratoriju, še posebno Mileni Kubelj.

Zahvaljujem se tudi svoji družini in sestri, saj so me na poti študija spodbujali in mi

pomagali. Hvala tudi Ajdi, Anželjcu in Davidu za neomajno podporo.

Documents

VPLIV BIOLOŠKEGA POSPEŠEVALCA RASTI RASTLIN NA MINERALNO …pefprints.pef.uni-lj.si/5913/1/Miha_Lampe_2019.pdf · Diplomsko delo. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta,