VSEBNOST, LOKALIZACIJA IN VEZAVNE OBLIKE5. 3 MIKRO-RENTGENSKA ABSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA ..... 58 6 SKLEPI ..... 61 Hosta N. Vsebnost, vezavne oblike in lokalizacija železa v zrnih

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ STRUKTURNE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE

Natalija HOSTA

VSEBNOST, LOKALIZACIJA IN VEZAVNE OBLIKE

ŽELEZA V ZRNIH RAZLIČNIH SORT PŠENICE

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij – 2. stopnja

Ljubljana, 2017

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ŠTUDIJ STRUKTURNE IN FUNKCIONALNE BIOLOGIJE

Natalija HOSTA

VSEBNOST, LOKALIZACIJA IN VEZAVNE OBLIKE ŽELEZA V

ZRNIH RAZLIČNIH SORT PŠENICE

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij – 2. stopnja

CONTENT, LOCALIZATION AND BINDING FORMS OF IRON IN

GRAINS OF DIFFERENT WHEAT CULTIVARS

M. Sc. THESIS

Master Study Programmes

Ljubljana, 2017

Hosta N. Vsebnost, vezavne oblike in lokalizacija železa v zrnih različnih sort pšenice

Mag. delo. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij strukturne in funkcionalne biologije, 2017

II

Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. bolonjske stopnje

Strukturne in funkcionalne biologije. Opravljeno je bilo na Katedri za fiziologijo rastlin

Oddelka za biologijo Biotehniške fakultete Univerza v Ljubljani, inštitutu Jožef Stefan, v

Ljubljani in laboratoriju European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) v Grenoblu,

Francija.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje oziroma senat oddelka je dne 19. 6. 2014 odobril naslov

magistrske naloge. Za mentorico dela je bila imenovana doc. dr. Katarina Vogel Mikuš, za

somentorja prof. dr. Iztok Arčon, za recenzentko pa prof. dr. Marjana Regvar.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednica: izr. prof. dr. Mateja GERM

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Mentorica: izr. prof. dr. Katarina VOGEL MIKUŠ


Somentor: prof. dr. IZTOK ARČON

Univerza v Novi Gorici, Laboratorij za kvantno optiko

Recenzentka: prof. dr. MARJANA REGVAR


Datum zagovora: 15. 9. 2017

Podpisana izjavljam, da je naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela. Izjavljam, da je

elektronski izvod identičen tiskanemu. Na univerzo neodplačno, neizključno, prostorsko in

časovno neomejeno prenašam pravici shranitve avtorskega dela v elektronski obliki in

reproduciranja ter pravico omogočanja javnega dostopa do avtorskega dela na svetovnem

spletu preko Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete.

Natalija Hosta



III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

DN Du2

DK UDK 581.5:582.546.11(043.2)

KG železo/pšenica/vsebnost/lokalizacija/vezavne oblike/fortifikacija/rentgenske

analitske metode

AV HOSTA, Natalija, diplomirana biologinja (UN)

SA VOGEL MIKUŠ, Katarina (mentorica)/ARČON Iztok (somentor), REGVAR,

Marjana (recenzentka)

KZ SI – 1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Študij strukturne in funkcionalne

biologije

LI 2017

IN VSEBNOST, LOKALIZACIJA IN VEZAVNE OBLIKE ŽELEZA V ZRNIH

RAZLIČNIH SORT PŠENICE

TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja)

OP XI, 70 str., 27 sl., 2 pregl., 1 pril., 62 vir.

IJ SI

JI sl/en

AI V magistrskem delu smo določali koncentracije Fe v zrnju različnih sort pšenice,

določili njegova mesta akumulacije ter vezavne oblike. Koncentracije Fe smo

določali s standardno rentgensko fluorescenčno spektrometrijo, z mikro-rentgensko

fluorescenčno spektrometrijo smo lokalizirali Fe na tkivnem nivoju v zrnu, z mikro-

rentgensko absorpcijsko spektrometrijo pa smo določili vezavne oblike Fe v

celotnem zrnu in v posameznih tkivih zrna. Pričakovano so se sorte razlikovale po

vsebnosti Fe. Največ ga je vsebovala sorta Super žitarka. Fe spojine, ki so ustrezale

izmerjenim spektrom naših vzorcev, so bile pri vseh sortah enake: Fe2+ fitat, Fe3+

fitat in Fe3+ citrat. Tudi njihovi deleži, so bili pri vseh sortah primerljivi, z izjemo

sorte Katarina, ki je vsebovala več Fe2+ fitata in manj Fe3+ citrata od ostalih sort,

kar kaže na slabšo biodostopnost Fe pri omenjeni sorti. S Fe so najbolj bogata tkiva

zrna: perikarp, nucleus in alevron. Perikarp ne vsebuje Fe3+ fitata, kar vpliva na

večjo biorazpoložljivost Fe za rastline. Izstopa tudi embrio, kjer je bila povečana

vsebnost Fe3+ citrata glede na Fe3+ fitat v primerjavi z ostalimi tkivi. Otrobi so

pomemben vir Fe, vendar se v predelavi za prehrambene namene izgubijo. Njihova

uporaba bi pomenila pomemben korak v smeri biofortifikacije živil.



IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

DN Du2

DC UDC 581.5:582.546.11(043.2)

CX iron/wheat/content/localization/binding form/fortification/X-Ray analitical tools

AU HOSTA, Natalija

AA VOGEL MIKUŠ, Katarina (supervisor)/ARČON Iztok (co-advisor), REGVAR,

Marjana (reviewer)

PP SI – 1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical faculty, Master Study Programmes in

Structural and functional biology

PY 2017

TI CONTENT, LOCALIZATION AND BINDING FORMS OF IRON IN GRAINS

OF DIFFERENT WHEAT CULTIVARS

DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes)

NO XI, 70 p., 27 fig., 2 tab., 1 ann., 62 ref.

LA SI

AL sl/en

AB In the dissertation, we have been determining Fe concentration in grain of various

sorts of wheat, its places of accumulation, and its binding forms. We have been

determining the Fe concentrations with Standard Energy-Dispersive X-ray

Fluorescence Spectrometry, the localization of Fe on tissue level of grain with

Micro X-ray Absorption Spectroscopy and Fe binding forms in the whole grain and

in separate tissues with Micro- X-ray Fluorescence Spectroscopy. As expected,

various sorts differed in Fe content, with the sort »Super žitarka« containing the

most Fe. Fe compounds that have corresponded to our measured spectres have been

the same in all sorts: Fe2+ phytate, Fe3+ phytate and Fe3+ citrate. Their shares have

also been comparable in all sorts, with the exception of the sort »Katrina« that

contained more Fe2+ phytate and less Fe3+ citrate than other sorts, which shows

inferior bioaccessibility of Fe in the said sort. The tissues most rich in Fe are the

pericarp, nucleus and alveron. The pericarp does not contain Fe3+ phytate, which

effects the greater bioaccessibility of Fe. The embryo also stands out with the

increased content of Fe3+ citrate according to the Fe3+ phytate in comparison with

the other tissues. For biofortification, it would be particularly necessary to use

wheat bran that are rich in Fe and are lost in the processing.



V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ................................................ III

KEY WORDS DOCUMENTATION .............................................................................. IV

KAZALO VSEBINE .......................................................................................................... V

KAZALA PREGLEDNIC ............................................................................................. VIII

KAZALA SLIK ................................................................................................................. IX

KAZALO PRILOG ............................................................................................................ X

SLOVAR OKRAJŠAV IN SIMBOLOV ......................................................................... XI

1 UVOD ................................................................................................................................ 1

1.1 OPREDELITEV PROBLEMA .................................................................................... 1

1.2 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE ............................................................... 1

2 PREGLED OBJAV .......................................................................................................... 2

2. 1 UVOD ......................................................................................................................... 2

2. 2 ANEMIJA ................................................................................................................... 4

2. 3 VLOGA IN POJAVNE OBLIKE ŽELEZA ................................................................ 5

2. 4 BIODOSTOPNOST IN RASTLINSKE STRATEGIJE ZA PRIVZEM ŽELEZA ..... 6

2. 5 TRANSPORT ŽELEZA PO RASTLINI ..................................................................... 8

2. 6 LOKALIZACIJA ŽELEZA V RAZLIČNIH RASTLINSKIH TKIVIH ................... 10

2. 7 BIODOSTOPNOST IN VEZAVNE OBLIKE ŽELEZA PRI ČLOVEKU ............... 11

2. 8 FORTIFIKACIJA IN BIOFOTRIFIKACIJA ............................................................ 13

2. 9. RENTGENSKE ANALITSKE METODE ............................................................... 16

2. 9. 1 Teoretične osnove rentgenskih analitskih metod ......................................... 16

2. 9. 1. 1 Rentgenska fluorescenčna spektrometrija ................................................. 18

2. 9. 1. 2 Mikro-rentgenska fluorescenčna spektrometrija ....................................... 19

2. 9. 1. 3 Rentgenska absorpcijska spektrometrija ................................................... 19

2. 9. 1. 5 Spektri železa in železovih spojin ............................................................. 21

3 MATERIAL IN METODE ............................................................................................ 22

3.1 RASTLINSKI MATERIAL ....................................................................................... 22

3. 1. 1 Podatki o sortah ............................................................................................... 22

3. 1. 1. 1 Sorta ........................................................................................................... 23

3. 1. 1. 2 Tip klasa ................................................................................................... 24

3. 1. 1. 3 Dolžina rastne dobe in klasitev .................................................................. 24

3. 1. 1. 4 Višina rastline ............................................................................................ 24

3. 1. 1. 5 Poleganje ................................................................................................... 24



VI

3. 1. 1. 6 Absolutna masa ......................................................................................... 25

3. 1. 1. 7 Surove beljakovine .................................................................................... 25

3. 1. 1. 8 Sedimentacijska vrednost .......................................................................... 26

3. 1. 1. 9 Število padanja .......................................................................................... 26

3. 1. 1. 10 Kakovostni razred ................................................................................... 26

3. 1. 1. 11 Oznaka ''n'' ............................................................................................... 27

3. 1. 1. 12 Pridelek .................................................................................................... 27

3. 2 PRIPRAVA MATERIALA IN EDXRF ANALIZE ................................................. 28

3. 2. 1 Priprava materiala .......................................................................................... 28

3. 2. 2 Analiza EDXRF ............................................................................................... 30

3. 2. 3 Statistika .......................................................................................................... 30

3. 3. PRIPRAVA MATERIALA IN MIKRO-XRF ANALIZE ....................................... 31


3. 3. 2 Mirko-XRF analize ......................................................................................... 31

3. 4 PRIPRAVA MATERIALA IN MIKRO-XAS ANALIZE ........................................ 32


3. 4. 2 Mikro-XAS analize ......................................................................................... 32

4 REZULTATI .................................................................................................................. 33

4. 1 STANDARDNA RENTGENSKO FLUORESCENČNA SPEKTROMETRIJA

(EDXRF) ......................................................................................................................... 33

4. 1. 1 Koncentracija železa ....................................................................................... 33

4. 1. 2 Koncentracija drugih merjenih elementov ................................................... 35

4. 1. 2. 1 Fosfor ........................................................................................................ 35

4. 1. 2. 2 Žveplo ........................................................................................................ 36

4. 1. 2. 3 Kalij ........................................................................................................... 36

4. 1. 2. 4 Kalcij ......................................................................................................... 37

4. 1. 2. 5 Mangan ...................................................................................................... 39

4. 1. 2. 6 Cink ........................................................................................................... 40

4. 1. 3 Metoda glavnih komponent ali Principal Component Analysis (PCA) ..... 42

4. 2 MIKRO-RENTGENSKO FLUORESCENČNO SPEKTROMETRIJO ................... 43

4. 3 MIKRO-RENTGENSKA ABSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA ........................ 52

5 RAZPRAVA ................................................................................................................... 56

5. 1 STANDARDNA RENTGENSKA FLUORESCENČNA SPEKTROSKOPIJA

(EDXRF) ......................................................................................................................... 56

5. 2 MIKRO-RENTGENSKA FLUORESCENČNA SPEKTROMETRIJA ................... 57

5. 3 MIKRO-RENTGENSKA ABSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA ........................ 58

6 SKLEPI ........................................................................................................................... 61

7 POVZETEK .................................................................................................................... 62



VII

8 VIRI ................................................................................................................................. 64

ZAHVALA

PRILOGE



VIII

KAZALA PREGLEDNIC

PREGLEDNICA 1: Znani podatki o preučevanih pšeničnih sortah ................................... 22

PREGLEDNICA 2: Masa posameznega pšeničnega zrna različnih sort ............................ 28



IX

KAZALA SLIK

Slika 1: Fotoefekt in augerjev efekt ..................................................................................... 17

Slika 2: Spekter XRF ........................................................................................................... 18

Slika 3: Spektri XANES železovih referenčnih spojin ........................................................ 20

Slika 4: Grafični prikaz koncentracij železa v zrnih pšenice ............................................... 33

Slika 5: Primerjava povprečnih koncentracij vsebnosti železa pri golicah in resnicah ....... 34

Slika 6: Grafični prikaz koncentracij fosforja v zrnih pšenice ............................................ 35

Slika 7: Grafični prikaz koncentracij žvepla v zrnih pšenice .............................................. 36

Slika 8: Grafični prikaz koncentracij kalija v zrnih pšenice ................................................ 37

Slika 9: Grafični prikaz koncentracij kalcija v zrnih pšenice .............................................. 38

Slika 10: Primerjava povprečnih koncentracij vsebnosti kalcija pri golicah in resnicah .... 38

Slika 11: Grafični prikaz koncentracij mangana v zrnih pšenice ........................................ 39

Slika 12: Primerjava povprečnih koncentracij vsebnosti mangana pri golicah in resnicah 40

Slika 13: Grafični prikaz koncentracij mangana v zrnih pšenice ........................................ 41

Slika 14: Grafični prikaz metode glavnih komponent ......................................................... 42

Slika 15: Prečni prerez semena z oznakami ........................................................................ 43

Slika 16: Mape porazdelitve sorte Vulkan .......................................................................... 44

Slika 17: Mape porazdelitve sorte Vulkan .......................................................................... 45

Slika 18: Mape porazdelitve sorte Super žitarka ................................................................. 46

Slika 19: Mape porazdelitve sorte Super žitarka ................................................................. 47

Slika 20: Mape porazdelitve sorte Soissons ........................................................................ 48

Slika 21: Mape porazdelitve sorte Soissons ........................................................................ 49

Slika 22: Mape porazdelitve sorte Katarina ........................................................................ 50

Slika 23: Mape porazdelitve sorte Katarina ........................................................................ 51

Slika 24: Spektri XANES na železovem K robu ................................................................. 52

Slika 25: Radarski diagram vsebnosti železa po tkivih ....................................................... 54

Slika 26: Graf PCA analize preferenc vezavnih oblik železa po tkivih .............................. 54

Slika 27: Radarski diagram vsebnosti železa po sortah ....................................................... 55



X

KAZALO PRILOG

PRILOGA A: Preglednica rezultatov ujemanja z linearno kombinacijo spektrov

referenčnih spojin vseh merjenih Fe-XANES spektrov.



XI

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

Ca kalcij

EDXRF standardna rentgenska fluorescenčna spektrometrija

EXAFS angl. Extended X-ray Absorption Fine Structure

Fe železo

Fe2+ dvovalentno železo

Fe3+ trivalentno železo

IDA anemija, ki jo povzroči pomanjkanje železa

K kalij

LCF metoda najboljšega ujemanja z linearno kombinacijo spektrov referenčnih

spojin, angl. Linear Combination Fitting

Mikro-XAS mikro-rentgenska absorpcijska spektrometrija

Mikro- XRF mikro-rentgenska fluorescenčna spektrometrija

Mn mangan

NA nikotinamin

OSL Opisna sortna lista za pšenico 2013 Republike Slovenije

P fosfor

S žveplo

VPU preizkušanje vrednosti sorte za pridelavo in uporabo

XANES angl. X-ray absorption near-edge structure

XAS rentgenska absorpcijska spektrometrija, angl. X-ray Absorption

Spectroscopy

XRF rentgenska fluorescenčna spektrometrija, angl. X-ray Fluorescence

Spectrometry

YS1 rastlisnski membranski prenašalni prosteini Yellow Stripe 1

Zn cink



1

1 UVOD

1.1 OPREDELITEV PROBLEMA

Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije več kot 30 odstotkov ljudi na svetu trpi

zaradi pomanjkanja železa (Fe). Posebej so izpostavljene populacije z enolično prehrano,

ki temelji na žitih. Pšenica (Triticum aestivum L.) je globalno pomembna žitna poljščina, ki

predstavlja 20 odstotkov celotne svetovne dnevne oskrbe s hrano. Na splošno žitna zrna

vsebujejo nizke koncentracije Fe, poleg tega se velik del Fe izgubi med obdelavo zrnja; pri

mletju in luščenju, kjer se izločijo s Fe bogati deli zrnja. Dodatna težava, ki se ob tem

pojavlja, je, da je Fe vezano v oblike, ki rastlinam niso dostopne za absorpcijo. Za

izboljšanje mineralne sestave zrnja bi bilo najbolj učinkovito in cenovno ugodno, da bi

uspeli povečati koncentracije biodostopno vezanih elementov v zrnih še pred žetvijo. To bi

lahko dosegli z različnimi agronomskimi praksami ali z genetskim inženiringom. Gnojenje

z železovimi pripravki se pri biofortifikaciji doslej ni izkazalo za zelo učinkovito, saj je Fe

v tleh le slabo topno in tako rastoči rastlini slabo biodostopno. Dodatna možnost je

selekcija kultivarjev, ki učinkovito privzemajo in prenašajo Fe v zrnje, kjer ga shranjujejo

v biodostopni obliki.

1.2 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE

Cilj magistrskega dela je določiti vsebnost Fe in ostalih mineralnih hranil, kot so: fosfor

(P), žveplo (S), kalij (K), kalcij (Ca), mangan (Mn) in cink (Zn) v zrnju različnih pšenic, ki

jih gojijo v Sloveniji in na območju nekdanje Jugoslavije. Cilj je bil tudi določiti

učinkovitost teh sort za kopičenje železa v biodostopni obliki in izmed vseh sort izbrati

tiste z največjo vsebnostjo Fe. Poleg tega bomo določili mesta akumulacije Fe in vezavne

oblike na tkivnem nivoju. Pričakujemo, da se bodo vsebnosti in vezavne oblike Fe v zrnju

različnih sort pšenice razlikovale. Pri različnih sortah pričakujemo razlike v deležu Fe, ki

je vezano na fitat. Prav tako pričakujemo razlike v porazdelitvi in vezavnih oblikah Fe na

tkivnem nivoju.



2

2 PREGLED OBJAV

2. 1 UVOD

Človek potrebuje raznoliko in uravnoteženo prehrano, ki vsebuje kompleksno mešanico

makro- in mikroelementov, da lahko ohranja primerno zdravstveno stanje. Makrohranila

(ogljikovi hidrati, maščobe in beljakovine) tvorijo večinski del prehrane, ki jo telo

uporablja kot vir energije. Mikrohranila pa so organske ali neorganske snovi, ki se sicer

pojavljajo v majhnih količinah ali samo v sledeh in ne služijo kot vir energije, vendar so

kljub temu nujno potrebne za zdravje. Veliko ljudi v razvijajočih se državah živi od

preproste hrane, sestavljene iz nekaj osnovnih živil, katerim primanjkuje nekaterih

makrohranil in številnih esencialnih mikrohranil (DellaPenna, 1999). Mikrohranila igrajo

osrednjo vlogo v metabolizmu in pri vzdrževanju funkcionalnosti tkiv, njihov vnos v

zadostni meri je tako nujen. Vendar je tudi presežek vnosa mikrohranil, za tiste ljudi, ki

dodatka ne potrebujejo, lahko škodljiv (Shenkin, 2006). Živila na rastlinski osnovi lahko

zagotovijo ustrezno prehrano ljudi, vendar se vsebnosti mikrohranil v rastlinah razlikujejo,

njihov prehranski vnos pa je odvisen od prevladujočega rastlinskega živila (Della Penna,

1999). Eden od temeljnih razlogov za mineralno podhranjenost v svetu je obsežna uporaba

žit kot osnovnega živila, zlasti v državah v razvoju. Žitna zrna so temeljno živilo v

prehrani modernega človeka. Pšenica, koruza in riž predstavljajo 75 % skupnega dnevnega

vnosa kalorij na svetu. Preko 50 % vseh beljakovin, ki jih človek vnese v svoje telo, ima

nizko prehransko vrednost (Sands in sod., 2009). V zadnjih petdesetih letih je bil glavni

cilj modernega kmetijstva in gojitvenih programov iskanje rešitve za zagotovitev

potrebnega kaloričnega vnosa za rastočo svetovno populacijo (DellaPenna, 1999). Zelena

revolucija je bila zelo uspešna pri zvišanju skupnega donosa živil, posebno žit. Povečan

pridelek je narodom na robu lakote pomagal pri prehodu v obdobje relativne varnosti glede

preskrbe s hrano (Sands in sod., 2009). Ravno tako pomembna, vendar v glavnem

spregledana, sta tudi mikrohranilana gostota in sestava pridelka (DellaPenna, 1999).

Gojenje žit z velikimi donosi je privedlo do tega, da so se pridelovalci raje odločali za vrste

z večjim pridelkom kot prehransko kvaliteto, kar je vodilo v nepričakovano mineralno

pomanjkanje (Zhao in sod., 2008). Pomanjkanja mikrohranil lahko nadzorujemo s

prehranskimi dopolnili in z izboljšanjem prehrane. Vendar so potrebni novi pristopi, zlasti

taki, ki bodo lahko dosegli tudi revnejše države in ljudi. Biofortifikacija je ena izmed



3

možnosti. Glavni izziv pri biofortifikaciji kot rešitvi je prepričati proizvajalce in porabnike,

da bodo sprejeli taka žita in povečali vnos tarčnih hranil (Nestel in sod., 2006).

Najbolj pogosta oblika mikrohranilnega pomanjkanja je pomanjkanje Fe. Zajema več kot

1,6 milijarde ljudi po celem svetu, predvsem so ogrožene ženske v rodni dobi (posebej

nosečnice) in majhni otroci (Grimm in sod., 2012).

Pšenica (Triticum aestivum L.) je globalno pomembna žitna poljščina, ki predstavlja 20 %

celotne svetovne dnevne oskrbe s hrano (Braun in sod., 2010; cit. po Reynolds in sod.,

2012). V žitih, kot je na primer pšenica, so otrobi pomemben vir Fe. Kljub temu je

prehranska dostopnost Fe v pšenični moki omejena, saj pride do izgube s Fe bogatih

otrobov med mletjem in obdelavo ter zaradi prisotnosti anti-nutrientov (npr. fitinska

kislina, ki veže Fe v zrnu v netopne komplekse). Poznavanje absorpcije, transporta in

porazdelitve Fe v rastlini in njenih sprejemnih organih, njihovega spreminjanja med rastjo

in razvojem rastline ter poznavanje prehranske biorazpoložljivosti je pomembno zato, da bi

lahko izboljšali raven Fe v zrnju in viodostopnst Fe v prehrani (Singh in sod., 2013).



4

2. 2 ANEMIJA

Anemija je zdravstveni problem svetovnih razsežnosti, ki prizadene populacije tako revnih

kot bogatih dežel. Leta 2012 je bila IDA (od pomanjkanja Fe odvisna anemija) ocenjena

kot eden izmed najpomembnejših faktorjev, ki prispevajo k svetovnemu zdravstvenemu

bremenu. Vzroki za anemijo so številni, vendar je globalno najpomembnejši vzrok, ki

prispeva predvsem k začetku anemije, pomanjkanje Fe. Zato sta IDA ter anemija pogosto

uporabljena kot sinonima, pojavnost anemije pa je pogosto prikazana kot pojavnost IDA.

Splošno domnevanje je, da je v 50 % primerov vzrok anemije pomanjkanje Fe, vendar se

delež razlikuje med populacijskimi skupinami in med različnimi območji. Med

najpomembnejše faktorje tveganja za IDA sodijo nizek vnos Fe, slaba absorpcija Fe iz živil

z visokimi vsebnostmi fitata ali fenolov in obdobja življenja, ko so potrebe po Fe višje od

običajnih (t. j. rast in nosečnost). Anemija nastopa v vseh življenjskih obdobjih, pogostejša

je pri nosečnicah in majhnih otrocih. Kljub temu, da je pomanjkanje Fe predstavljeno kot

prvotni razlog za povzročanje anemije, je o tem zbranih malo podatkov. Ovrednotenje Fe

je zahtevno, ker razpoložljivi indikatorji stanja Fe sami ne zagotavljajo dovolj informacij

in jih je potrebno uporabiti v kombinaciji, če želimo pridobiti relevantne informacije o

pomanjkanja železa. Zaradi svoje več-vzročne narave zdravljenje anemije navadno zahteva

integriran pristop. V primerih, kjer je pomanjkanje Fe vzrok anemije, je dodaten vnos

železa navadno zagotovljen s prehranskimi dopolnil za ranljive skupine. Prehranski

pristopi, ki temeljijo na povečanju vnosa preko biofortifikacije in prehranske raznolikosti,

so zelo pomembne in tehtne strategije za preprečevanje IDA v splošnih populacijah

(McLean in sod., 2008).



5

2. 3 VLOGA IN POJAVNE OBLIKE ŽELEZA

V tradicionalni klasifikaciji makrohranil (N, S, P, Ca, K, Mg), mikrohranil (Fe, Mn, B, Cl,

Zn, Cu, Mo) in koristnih elementov (Na, Si, Se, F, Co) Fe dosega zgornjo mejo

mikrohranilne kategorije; s približno 2 µmol/g v rastlinski suhi masi (Marschner, 1995, cit.

po Hell in Stephan, 2003). Fe je esencialni element v rastlinah in je nujno potrebno za

celične procese, kot sta celično dihanje in fotosinteza. Potrebno je tako pri sintezi barvila

hem kot tudi pri sintezi klorofila. Majhna prisotnost klorofila (kloroza) v mladih listih je

tudi najbolj očitno viden znak pomanjkanja Fe (Bashir in sod., 2007). Mikrohranila niso

pomembna izključno za rast in razvoj rastlin, bistvena so tudi za človekovo zdravje in za

zdravje živali (Bashir in sod., 2013). Fe se pojavlja v dveh valenčnih oblikah: »ferrous«

(Fe2+) in »ferric« (Fe3+). Sposobnost Fe, da obstaja v teh dveh valenčnih stanjih, je

osrednjega pomena za njegove funkcije v telesu: kot nosilec kisika iz pljuč do tkiv, kot

prenašalni medij elektronov znotraj celic in kot povezovalni člen številnih encimskih

reakcij. Večinski del funkcionalnega Fe v telesu je v obliki hemoglobina (Hb), ostanek se

pojavlja kot mioglobin, hemsko in nehemski encimi ter »transferin-bound Fe«. Večina

shranjenega Fe se nahaja v jetrih, vranici in kostnem mozgu. Fe je shranjeno v obliki

feritina, sferičnega proteina z atomi Fe znotraj njega. Prehransko Fe obstaja v dveh

različicah; hemsko Fe, ki se nahaja v hrani živalskega izvora, kot Hb in mioglobin; ter

nehemsko železo, ki ga najdemo v žitih, stročnicah, zelenjavi in tudi mesu. Drugi viri

nehemskega železa v prehrani pa izvirajo iz fortificirane hrane, kot so kosmiči in moka, ali

v obliki Fe prehranskih dopolnil ali zaradi kontaminacije s Fe med kuhanjem iz npr.

litoželeznih posod, ki jih uporabljamo (Singh, 2006).



6

2. 4 BIODOSTOPNOST IN RASTLINSKE STRATEGIJE ZA PRIVZEM ŽELEZA

Vsa živa bitja potrebujejo Fe za opravljanje številnih ključnih presnovnih poti (Bocchini in

sod., 2015). Rastline imajo dve težavi v povezavi s prostimi Fe ioni: prvo težavo

predstavlja njihova netopnost, drugo strupenost. Za zagotovitev privzema Fe iz prsti in v

izogib njegovim presežkom v celicah sta privzem in homeostaza močno regulirana (Hell in

Stephan, 2003). Kljub temu, da je v prsti Fe v obilici, je večinoma prisotno v oksidirani

Fe3+ obliki, ki je slabo topna v nevtralnih do alkalnih tleh (Chen in Barak, 1982, cit. po

Bashir, 2007). Bazična tla so potencialni krivec pomanjkanja Fe v rastlinah. Kljub

prisotnosti visokih koncentracij Fe v tleh, je njegova razpoložljivost v tleh bistveno

zmanjšana, ko pH tal presega 6,5. Apnenčasta tla, ki imajo visok pH, pa zmanjšajo

afiniteto rastlin za Fe in s tem ovirajo mehanizme za privzemanje Fe (Sah in Singh, 2015).

Apnenčasta tla obsegajo 30 % svetovne obdelovane zemlje (Chen in Barak, 1982, cit. po

Bashir, 2007). Tako je pomanjkanje železa težava svetovnih razsežnosti in je vzrok za

resnejše zmanjšanje pridelka (Bashir, 2007). Kljub temu, da je koncentracija Fe v geosferi

visoka, je bio-razpoložljivost Fe rastlinskim koreninam lahko zelo skromna (Bocchini in

sod., 2015). Rizosfera je definirana kot del prsti, na katerega vplivajo rastlinske korenine s

svojo aktivnostjo (Hinsinger, 1998, cit. po Mimmo, 2014). Za ta majhen in določen del

prsti je značilna vsebnost organskih in anorganskih snovi, ki jih izločijo rastline ali t. i.

rastlinski eksudati, in so temeljne za procese v rizosferi. Te snovi vplivajo na pretok hranil

iz prsti v rastlino. Zaradi tega predstavljajo ozko grlo pri mobilizaciji hranil v prsti in

posledično rastlinskega privzema hranil, ki se odraža v pridelku. Procesi v rizosferi in

vpliv rizosfere na rastlino določajo koreninski eksudati, ki jih sestavlja mešanica visoko

molekularnih in nizko molekularnih snovi. Ti so sposobni sprožiti bistvene spremembe v

kemičnih, fizikalnih ali bioloških značilnostih v delu prsti, ki tesno obdaja korenine.

Fizikalni, kemijski in biološki procesi v prsti so v veliki meri povezani s Fe in njegovo

dostopnostjo za mikroorganizme in rastline v prsti. Kljub navadno veliki količini Fe v

geosferi, ocenjeni na 20–40 g/kg, ima slabo topnost v prsti, kar omejuje njegovo

dostopnost (Mimmo, 2014).

Evkariontski organizmi so razvili različne mehanizme za privzem Fe, ki je nujno potrebno

za njihovo preživetje (Nozoye in sod., 2011). Da bi rešile težavo pomanjkanja Fe, lahko



7

rastline razvijejo dve različni strategiji za privzemanje Fe skozi korenine v različnih prsteh.

Strategijo I uporabljajo višje rastline, z izjemo trav, ki uporabljajo strategijo II. Strategija II

kaže na številne ekološke prednosti v primerjavi s strategijo I, kot sta topnost zmerno

topnih anorganskih Fe3+ spojin v rizosferi in manjša inhibicija privzema pri visokem pH

(Bocchini in sod., 2015; Römheld in Marschner, 1986). Modelni organizmi za preučevanje

Strategije I vključujejo Arabidopsis thaliana (navadni repnjakovec), Lycopersicon

esculentum (paradižnik) in Pisum sativum (grah). Te rastline izboljšajo privzemanje železa

s pomočjo dveh reakcij. Prvič z izločanjem protonov preko plazmaleme s P-tip ATP-

azami, da zakisajo rizosfero, kar poveča topnost Fe3+. Drugič z redukcijo Fe3+ v Fe2+ s kelat

reduktazo in transportom Fe2+ preko plazmaleme s pomočjo prenašalcev. Obe obliki

strategije I sta poudarjeni v obdobju pomanjkanja železa. Dodatna stopnja prilagajanja

vključuje spremembe v morfologiji korenin, koreninskih laskov in razvoju celic za

transport ter povečane koncentracije citrata v floemu (Schmidt, 1999, cit. po Hell in

Stephan, 2002). Rastline, ki se poslužujejo strategije II, so trave in med njimi pomembne

prehranske rastline, kot so pšenica (Triticum aestivum), ječmen (Hordeum vulgare), riž

(Oryza sativa) in koruza (Zea mays) (Hell in Stephan, 2002). Žita so razvila posebne

mehanizme za privzem mikronutrientov iz prsti ter njihov transport iz korenin do

poganjkov in semen. Žita uporabljajo strategijo privzema mineralov s kelacijo (Nozoye in

sod., 2011). Njihove korenine izločajo majhne molekule, imenovane siderofori iz družine

mugineične kisline (MAs). MAs imajo sposobnost, da raztapljajo Fe, cink (Zn), baker (Cu)

in mangan (Mn) (Treeby in sod., 1989). Pojem siderofori izhaja iz grških besed sidero, ki

pomeni Fe in phore, kar pomeni prenašalec. To so nizkomolekularne (<10kDa) snovi s

sposobnostjo vezave železa. Tvorijo jih bakterije v rizosferi in številne rastlinske korenine

ter tako olajšajo privzemanje Fe kompleksa v obdobjih, ko je Fe v pomanjkanju (Sah in

Singh, 2015). Izločanje »Mugenic acid« (MA) se odvija periodično v določenih jutranjih

urah in se poveča med stresom zaradi pomanjkanja Fe. Zadnje nakazuje na to, da je

izločanje nadzorovano in odvisno od znotrajcelične vsebnosti Fe. MA izboljšajo

raztapljanje Fe3+ v razponu pH med 4 in 9 (Takagi in sod., 1984). Fitosideroforne

komponente torej raztapljajo železo v prsti in rastline nato privzemajo nastali železo-

fitosideroforni kompleks. Prav tako za pridobivanje železa siderofore uporabljajo bakterije

in sesalci (Nozoye in sod., 2011).



8

2. 5 TRANSPORT ŽELEZA PO RASTLINI

Koreninske celice izločajo siderofore, da bi s kelacijo močno vezale Fe in privzele Fe3+

fitosideroforni kompleks preko prenašalcev, imenovanih Yellow Stripe1 (YS1). To so

membranski proteini, ki omogočajo privzem Fe. Ko pride do pomanjkanja železa, se nivo

YS1 informacijske RNK poveča, tako v koreninah kot v poganjkih (Curie in sod. 2001).

Privzem Fe in drugih mikrohranil v rastlinah se začne v apoplastu koreninskih

epidermalnih celic (Sattelmacher, 2001). Fe nato potuje preko prostega apoplastnega

prostora do membrane, vendar, ko je enkrat reducirano ali de-helirano, se najbrž ne bo

popolnoma privzelo. Zato se pri dovajanju kisika del železa oksidira in se obori v hidroksid

ali fosfatno sol, ki tvori apoplastni železov bazen (Bienfait in sod., 1985). Ta bazen

predstavlja do 95 % celotne vsebnosti železa, ki se lahko porablja v obdobjih, ko nastopi

pomanjkanje železa (Becker in sod., 1995). Ko enkrat železo vstopi v koreninski simplast

preko opisanega membranskega transportnega sistema, se mora ponovno zaščititi pred

kisikom, da ne pride do obarjanja in tvorbe prostih radikalov. Fe se transportira preko

celične membrane s pomočjo strategije I ali strategije II. Znotraj celice se samodejno veže

z nikotinaminom (NA), da se izogne obarjanju in katalizi kisikovih radikalov. NA je

prisoten v ksilemu in floemu in NA-Fe kompleksi predstavljajo transportno obliko Fe tako

pri strategiji I kot strategiji II in uporabljajo YS transporterje (Hell in Stephan, 2003).

Čeprav obstaja več celičnih organskih kislin in aminokislin, ki so primerne za kelacijo Fe,

je NA primernejši zaradi številnih vzrokov. NA tvori stabilne komplekse z obema

oksidacijskima stanjema Fe pri nevtralnih in bazičnih vrednostih pH (Stephan in sod 1996,

cit. po Hell in Stephan, 2002). Navzoč je v vseh višjih rastlinah in se pojavlja v vseh

rastlinskih tkivih (Scholz in sod. 1992, cit. po Hell in Stephan, 2002). NA-Fe kompleks so

relativno slabi Fentonovi reagenti (von Wiren in sod 1999, cit. po Hell in Stephan, 2002).

Paradižnik z okvarjenimi NA je imel povišano aktivnost antioksidativnih encimov (Herbik

in sod., 1996, cit. po Hell in Stephan, 2002). Obarjanje Fe v vakuolah in mitohondrijih (Liu

in sod. 1998, cit. po Hell in sod., 2002) in koncentracije NA v sočnici in ječmenu so

porasle v koreninskih vršičkih, kjer je bilo več privzema Fe in radialnega transporta

(Stephan in Scholz 1990, cit. po Hell in Stephan, 2002) ter koncentracije NA so soodvisne

z lokalizacijo in nivoji vsebnosti železa v grahu in paradižniku (Pich in sod., 2001, cit. po

Hell in Stephan, 2002). Zato igra NA pomembno vlogo kot glavni kelator prostega železa v



9

celicah, kjer Fe ni vezano na tarčne strukture – kot je barvilo hem, ali skladiščeno kot

fitoferitin (Hell in Stephan, 2002). Radialni transport Fe iz korenin do ksilema domnevno

poteka kot Fe2+-NA kompleks po simplastni poti (Stephan in sod. 1996, cit. po Hell in

Stephan, 2002). Ker imajo kortikalne celice, na primer pri ječmenu, okoli 20.000

plazmodezem na celico, NA-Fe kompleks z lahkoto potuje v smeri difuzijskega gradienta,

od mesta aktivnega privzema na zunanji površini korenin in nato po obsežnem ksilemskem

transportnem sistemu. Porazdelitev Fe iz celic, ki so poleg žil listne lamine, je najverjetneje

ponovno posredovana z NA-Fe kompleksi (Hell in Stephan, 2002). Po dolgem transportu

preko vaskularnega sistema se Fe odloži v sprejemnih rastlinskih tkivih, kot so popki,

poganjki in semena (Singh in sod., 2013).



10

2. 6 LOKALIZACIJA ŽELEZA V RAZLIČNIH RASTLINSKIH TKIVIH

Med razvojem semena se Fe ioni preko floemskih tkiv remobilizirajo iz listov v razvijajoča

se zrna, do pretrganja ksilema in do tega, ko v semenih ne poteka več transpiracija (Singh

in sod., 2013). Znanje o transportu Fe v semena je bistvenega pomena pri načrtovanju

biofortifikacijskih strategij. Nedavne raziskave kažejo, da je Fe skladiščeno znotraj embria

(Conte in Walker, 2011). V žitnih zrnih je večina Fe vezana s fitinsko kislino v alevronski

plasti (Regvar in sod., 2011). V žitih, kot je na primer pšenica, so otrobi pomemben vir Fe

(Singh in sod., 2013).



11

2. 7 BIODOSTOPNOST IN VEZAVNE OBLIKE ŽELEZA PRI ČLOVEKU

Biodostopnost nekega hranila lahko definiramo kot delež zaužitega hranila, ki je

absorbiran v gastrointestinalnem traktu in se uporabi za presnovne vloge ali skladišči v

določenih predelih (Dwyer in sod., 2014). Pri človeku naj bi optimalna prehrana vsebovala

od 13–18 mg Fe na dan, od katerega je dejansko absorbiran samo 1 mg Fe. Tudi pri obliki

anemije, ki jo povzroča pomanjkanje Fe, je absorpcija le 2–4 mg in pri presežku vsebnosti

Fe v telesu se absorpcija zmanjša za 0.5 mg. V človekovi prehrani je vnos železa sestavljen

iz dveh komponent: hemsko železo (npr. je prisotno v rdečem mesu) in nehemsko ali

neorgansko železo (npr. prisotno v zelenjavi, žitih itn.) (Miret in sod., 2003). Absorpcija Fe

iz prehrane se spreminja glede na potrebe po Fe. Več Fe se iz hrane absorbira v stanju, ko

je Fe v pomanjkanju in manj, ko je Fe dovolj (Singh in sod., 2006). Vključevanje Fe v

eritrocite predstavlja neposredno merilo za biodostopnost Fe (Fairweather-Tait, 2001, cit.

po Singh in sod., 2006). Hemsko Fe je učinkoviteje absorbirano iz prehrane (20–30 %), kot

ne-hemsko Fe (5–15 %). Hemsko Fe je visoko biodostopno, ker je absorbirano

nedotaknjeno, za razliko od ne-hemskega Fe, na katerega vplivajo številne snovi, ki so

prisotne v obroku. Te snovi vplivajo na topnost, oksidativno stanje in na količino prostega

Fe ter spreminjajo Fe, ki je dosegljivo za privzem preko specifičnih prenašalcev na površju

enterocitov v zgornjem črevesu.

Kalcij (Ca) zavira absorpcijo tako hemskega kot nehemskega Fe. Druge snovi v prehrani

pa na absorpcijo hemskega Fe nimajo vpliva. Absorpcija ne-hemskega Fe se poveča ob

prisotnosti askorbinske kisline iz sadja in zelenjave. Največji inhibitorji pri absorpciji ne-

hemskega Fe so fitinska kislina v žitih in stročnicah ter fenolne sestavine iz napitkov, kot

so čaj, kava, kakav, rdeče vino in zeliščni čaji (Singh in sod., 2006).

Fitinska kislina močno veže Fe v gastrointestinalnem traktu in tako zmanjša absorpcijo še

tako biodostopnih železovih snovi (Hurrell in sod., 2002). V svoji raziskavi je Richard

Hurrel predstavil rezultate, s katerimi je dokazal, da degradacija fitata v žitih izboljša

absorpcijo Fe (Hurrell in sod., 2002). Različne raziskave so pokazale, da ima nivo fitata

večji vpliv na biodostopnost železa kot skupna vsebnost Fe. Fitinska kislina je močan

inhibitor absorpcije Fe, tudi, ko se ta pojavlja v zelo nizkih koncentracijah. Vsebnost



12

fitinske kisline je bilo potrebno zmanjšati za 95 % in s tem doseči njeno vsebnost v obroku

nižjo od 10 mg, da se je opazovana absorpcija železa pomenljivo zvišala (Hurrell in sod.,

1992, cit po Hurrell, 2002). Podobno, ko je bila prosta fitinska kislina dodana kruhu, se že

vrednosti nižje od 7 mg reducirale absorpcijo Fe za približno 20 % in pri vrednosti 35 mg

so reducirale absorpcijo Fe za 60 % (Hallberg in sod., 1989, cit. po Hurrell, 2002).



13

2. 8 FORTIFIKACIJA IN BIOFOTRIFIKACIJA

Leta 1987 je komisija organizacije Codex Alimentarius povzela splošne principe za

dodajanje mineralnih hranil hrani (Codex Alimentarius Commission, cit. po Dwyer, 2014).

Izmenično so uporabljali izraza »fortifikacija« ali »obogatitev« s sledečo definicijo:

»Fortifikacija ali obogatitev pomeni dodajanje enega ali več esencialnih hranil hrani, ki jih

slednja navadno vsebuje ali ne, z namenom, da bi preprečili ali izboljšali pomanjkanja

enega ali več hranil v populaciji ali specifičnih populacijskih skupinah, ki trpijo za

pomanjkanjem tega ali teh hranil« (Dwyer in sod., 2014). V razvitih državah so splošno

razširjene strategije za izboljševanje pomanjkanja Fe v prehrani, ki obsegajo javna

izobraževanja za izboljšanje prehrane, prehranska dopolnila v obliki Fe tablet, kapsul ali

napitkov ter preskrba s Fe obogatene hrane. Vendar imajo vsi ti pristopi omejitve, ki

vplivajo na njihovo učinkovitost ali dolgoročno obstojnost, sploh v državah v razvoju

(World Healt Organization, 2001, cit. po Hass in sod., 2005). Biofortifikacija je razvoj z

mikrohranili bogatih osnovnih živil preko uporabe tradicionalnih gojitvenih praks in

moderne biotehnologije (Nestel, 2006). Je učinkovita in cenovno ugodna zamenjava za

tradicionalne poti boja proti pomanjkanju mikrohranil v obliki posebne prehrane (ta je

navadno draga), prehranskih dodatkov ali hrane obogatene z esencialnimi hranili. Teh

konvencionalnih metod si velik delež svetovne populacije ne more privoščiti, predvsem

tisti, ki so omejeni s sredstvi in imajo nizke dohodke (Hass in sod., 2005). Povečevanje

vsebnosti mikrohranil v zrnju preko biofortifikacije ponuja velik potencial za boj proti

pomanjkanju mikro hranil in ima dramatičen učinek na zdravje človeka (DellaPenna,

1999). Hass in sodelavci so načrtovali raziskavo, kjer so preverjali biološke učinke

uživanja z železom biofotificiranega riža. Preizkus učinkovanja je bil izveden na dveh

filipinskih sestrah, katerih prehrana je tipična za okolje, kjer živita. Slednja vsebuje velike

količine riža, ki predstavlja kar 50 % dnevnega vnosa energijske hrane in tudi nizko

vsebnost železa – zaradi uživanja pretežno rastlinske hrane in omejene količine mesa v

prehrani. Sestri sta bili izbrani zato, ker predstavljata skupino prebivalstva – ženske v

reproduktivni fazi, ki je ogrožena zaradi pomanjkanje železa in bi se posledično

najverjetneje odzvali na povečan vnos železa v prehrani. Vsebnost železa v

biofortificiranem rižu je bila za 2,80 mg/kg večja od vsebnosti komercialno dostopnega

riža. Kljub temu, da je bil dnevni vnos Fe v primerjavi s prejšnjim le malo povečan, se je



14

vsebnost železa v telesu povečala. Zato je za vsakega posameznika, ki trpi za

pomanjkanjem železa, dodatna vsebnost železa, čeprav zelo majhna, v biofortificiranem

rižu koristna (Hass in sod., 2005). Biofortifikacija ima številne prednosti, saj izkorišča

običajen dnevni vnos hrane iz stalne in široke palete živil cele družine. Ker so uporabljena

osnovna živila, ki temeljijo na žitih in prevladujejo v prehrani revnih, ta strategija doseže

tudi gospodinjstva z nizkimi dohodki. Poleg tega po enkratni investiciji v razvoj semen, so

ponavljajoči stroški nizki in semena se lahko izmenjujejo internacionalno. Ko je

biofortificiran pridelek pridobljen, je obstojen. Hranilno izboljšane sorte lahko gojimo in

shranjujemo leto za letom. Predvsem pa biofortifikacija zagotavlja izvedljiv način za

doseganje podhranjenih populacij z dostavljanjem naravno obogatene hrane ljudem z

omenjenim dostopom do komercialno prodajanih obogatenih produktov, ki so bolj

dostopni v urbanih naseljih. In nazadnje, gojenje za višjo vsebnost mineralov, ki jih

najdemo v sledeh, v zrnih ne bo imelo posledic pri donosnosti pridelka (Nestel, 2006).

Izziv je pridobiti zaupanje ljudi v biofortificirane poljščine in s tem povečati vnos tarčnih

hranil (Nestel, 2006). Da bi bila biofortifikacija uspešna, je potrebno izpolniti tri jasne

pogoje. Prvič: gojenje mora biti uspešno – visoka hranilna gostota mora biti kombinirana z

visokimi pridelki in visoko dobičkonosnostjo. Drugič: dokazana mora biti učinkovitost –

dokazano mora biti izboljšano mikronutrientno stanje pri človeku, ki uživa biofortificirane

produkte. Zato se mora obdržati zadostna količina hranil tudi v postopku predelave in

priprave hrane – kuhanja in ta hranila morajo biti biodostopna v zadostni količini. Tretjič:

biofortificirano poljščino morajo v zadostnem številu sprejeti kmetje in uživati ljudje, ki

trpijo zaradi pomanjkanja mikrohranil (Bouis in sod., 2011). Z začetkom dobrega sistema

produkcije semen, razvoja trga in produktov ter ustvarjanja povpraševanja je

biofortifikacija mogoča (Nestel, 2006). Med komercialnimi kultivarji pšenice je široka

naravna raznolikost z ocenjenimi vrednostmi železa od 19 do 58 mg/kg, kar nakazuje na to,

da bi bilo mogoče selekcionirati z železom bogate genotipe in jih uporabiti v gojenju za

biofortifikacijo. Zadnji podatki kažejo, da se vrednosti železa celotnega zrna odražajo v

beli frakciji moke, ki se uporablja za veliko živilskih proizvodov, vključno z belim

kruhom. To je pomembna ugotovitev, če sta vsebnost in biodostopnost železa v hrani

odvisni od uporabljenega načina predelave. Med mletjem pšenice so zunanje plasti zrna in

embrio odstranjeni, da se otrobi ločijo od škrobnatega endosperma, ki je glavna sestavina



15

bele moke. Ker otrobi vsebujejo višjo koncentracijo železa, je pomembna tudi kontrola

akumulacije železa v zrnu na tkivnem nivoju (Eagling in sod. 2014).



16

2. 9. RENTGENSKE ANALITSKE METODE

Določanje koncentracije kovin v rastlinskih organih in razumevaje njihovega privzemanja,

transporta in lokalizacije v rastlinah je predpogoj za razumevanje metabolnih poti kovin v

rastlini (Vogel-Mikuš, 2012). Zaradi povečane potrebe po zaščiti okolja je pomembno, da

so analitski procesi za določanje koncentracij številnih elementov v prsti, vodi in bioloških

materialih natančni, zanesljivi in ponovljivi. Poleg tega morajo biti analitične tehnike

cenovno dostopne in z enostavno pripravo vzorcev (Nečemer in sod., 2008, 2011). Metode,

ki uporabljajo rentgensko svetlobo ali t. i. rentgenske analitske metode s hitrim razvojem

detektorskih sistemov in sistemov za obdelavo signalov, nudijo cenovno ugodne, hitre,

občutljive in natančne analize elementne sestave (Nečemer in sod., 2008, 2011). Poleg tega

rentgenska fluorescenca predstavlja temelj za analize, ki omogočajo vizualizacijo

prostorske lokalizacije in porazdelitve določenih elementov v bioloških vzorcih (Kaulich in

sod., 2009).

2. 9. 1 Teoretične osnove rentgenskih analitskih metod

Elektrone lahko spravimo iz kovine, če jo osvetlimo (Strnad, 1982). Pri sipanju fotona na

vezanem elektronu, ko sprejme gibalno količino atom kot celota, lahko elektron prejme od

fotona vso njegovo energijo. Nekaj jo porabi za premagovanje vezavne energije,

preostanek pa elektron odnese kot kinetično energijo (Cvelbar, 2003). Pojav, ko svetloba

izbije elektrone iz kovine, imenujemo fotoefekt ali fotoelektrični pojav (Strnad, 1982).

Rentgenska svetloba je elektromagnetno valovanje, katerega spekter se razprostira od

valovne dolžine okoli 1 nm do približno 1 pm, kar ustreza energijam od približno 1000 eV

do 1000 keV, če govorimo o energijah fotonov (Strnad 1992). Ko tak žarek usmerimo v

snov, fotoni trčijo ob atome in pri tem lahko spravijo elektrone iz osnovnega v vzbujeno

vezano (višje energijsko) stanje – na višjo lupino. To pomeni, da foton preda svojo

energijo elektronu, ta pa zasede energijsko višje stanje. Na ta način prihaja do

fotoabsorpcije rentgenske svetlobe (Strnad, 1992). Vezavna energija je najmanjša energija,

ki jo moramo dovesti, da odtrgamo elektron iz kristala (Strnad 1992). Največji presek za

fotoefekt je na elektronih v lupini K. Seveda mora imeti foton višjo energijo kot je vezavna

energija elektrona v izbrani lupini (Cvelbar, 2003). Pri tem se del energije fotona (kolikor



17

znaša vezavna energije elektrona) porabi za izbitje, del pa se pretvori v kinetično energijo

foto-elektrona. Izbiti elektron zleti iz atoma (Strnad, 1992). Po izsevanju fotoelektrona

ostane v elektronskem oblaku praznina, atom pa je vzbujen za vrednost vezalne energije

izbitega elektrona. Ko v vrzel preskoči elektron iz lupine L oziroma M, izseva

karakteristični foton. Pri srednje težkih in težkih jedrih je ta energija v rentgenskem

območju (Cvelbar, 2003). V procesu fotoefekta, ko zaradi eksitacije tesno vezanih atomov

na K in L lupini z energijami, ki morajo preseči vezavno energijo le-teh za K in L lupine,

pride do rentgenske fluorescence. Vzbujeni lahki atom pa pogosto ne izseva

karakterističnega fotona, ampak to energijo absorbira manj vezan elektron na eni izmed

zunanjih lupin. Ta elektron je potem izsevan iz atoma kot Augerjev elektron. Za lahke

elemente (Z<20) med sprostitvijo iz lupine K prevladuje nastanek Augerjevih elektronov,

pri srednje težkih in težkih elementih pa se elektroni izsevajo v radioatkivnem načinu

(Cvelbar, 2003; Vogel Mikuš in sod., 2012).

Slika 1: Fotoefekt in Augerjev efekt. (a) Fotoefekt na notranji lupini K atoma in zapolnitev vrzeli z

elektronom iz lupine L v procesu fluorescence; (b) Augerjev efekt (Vogel Mikuš in sod., 2013).

Presek za fotoefekt v atomu v odvisnosti od energije vpadnih fotonov se skokovito poveča,

ko energija fotona doseže vezavno energijo elektrona. V primeru ionizacije lupine K v

atomu govorimo o absorpcijskem robu K. Ionizacijska energija lupine K je odvisna od

vrstnega števila atomov absorberja. Presek za fotoefekt zelo narašča z vrstnim številom

atoma. Izrazito povečana absorpcija rentgenskih fotonov v atomih z visokim vrstnim

številom prispeva k dobri ločljivosti diagnostičnih rentgenskih posnetkov (Cvelbar, 2003).

Za preučevanje z rentgensko absorpcijsko spektrometrijo so primerne lupine K elementov

z vrstnim številom večjim od 14 in lupine L elementov z vrstnim številom večjim od 39, ki



18

imajo vezavne energije večje od 2000 eV (Šuc, 2016; cit po Thompson s sod., 2009). V

primeru železa smo izkoristili lupino K z ionizacijsko energijo 7112 eV.

2. 9. 1. 1 Rentgenska fluorescenčna spektrometrija

Rentgenska fluorescenčna spektrometrija (angl. X-ray fluorescence spectrometry (XRF))

je hitra metoda za analizo elementov v različnih vrstah vzorcev pri zelo nizkih

koncentracijah, ki vzorca ne uničijo (Vogel – Mikuš in sod., 2010; 2012). Je ena izmed

najenostavnejših in ekonomičnih metod za določanje kemijske sestave različnih vrst

materiala. Uporablja se za širok izbor elementov, od natrija do urana, in zagotavlja

natančne meritve do nekaj 10 ppm (Clapera, 2006). Spektrometer za standardno XRF

(EDXRF) običajno sestavljata dve osnovni enoti – ekscitacijski vir in spektrofotometični

detektorski sistem (Vogel-Mikuš in sod., 2012). Atome v vzorcu vzbudimo z rentgenskimi

žarki, izsevanimi iz rentgenske cevi ali z radioizotopi. Vsak prenos elektrona oddaja

značilno fluorescenčno sevanje, ki ga meri polprevodniški detektor (Clapera, 2006). Z

analogno digitalnim pretvornikom in analizatorjem višine signala iz detektorja (PHA –

pulse height analyser) izmerimo spekter fluorescenčne rentgenske svetlobe, ki jo odda

vzorec. Energijska ločljivost polprevodniškega detektorja (npr. SDD detektor), ki je

običajno v območju od 150 eV do 200 eV, omogoča ločevanje posameznih karakterističnih

črt, ki jih izsevajo različni elementi v vzorcu. V spektru PHA vsak vrh predstavlja svetlobo

s točno določeno energijo fotonov, ki ustreza točno določenemu prehodu med dvema

orbitalama pri določenem elementu. Število izsevanih fluorescenčnih fotonov je med

drugim sorazmerno številu izbrane vrste atomov v vzorcu, ki to svetlobo oddajo (Cvelbar,

2003).

Slika 2: Spekter XRF, merjen na suhih listih hiperakumulativnega modrikastega mošnjaka Thlaspi

caerulescenc, posnet po vzbuditvi z radioizotopom Cd – 109 (Vogel Mikuš, 2012).



19

2. 9. 1. 2 Mikro-rentgenska fluorescenčna spektrometrija

Mikro-rentgenska fluorescenčna spektrometrija (mikro-XRF) je posebna oblika rentgenske

fluorescenčne spektrometrije, pri kateri lahko s posebno optiko za fokusiranje

rentgenskega žarka dosežemo, da žarek omejimo na premer velikosti manj kot 1 µm. Tak

mikro-žarek lahko zelo natančno usmerimo na določeno mesto vzorca in z njim potujemo

po vzorcu ter v vsaki točki naredimo analizo elementne sestave za elemente, ki nas

zanimajo. Na ta način izdelamo dvodimenzionalno sliko porazdelitve izbranih elementov v

vzorcu (Kanngiesser in Haschke, 2006). Fotografijo nato ustrezno opremimo z oznakami,

ki prikazujejo pomembne podrobnosti. Lep primer take fotografije je porazdelitvena mapa

video lokalizacije mezofilnega tkiva v zrelih listih ranega mošnjaka Noccaea (Thlaspi)

praecox (Koren in sod., 2013).

2. 9. 1. 3 Rentgenska absorpcijska spektrometrija

Rentgenska absorpcijska spektrometrija (angl.: X-ray absorption spectroscopy (XAS)) je

analitična metoda, pri kateri merimo, kako se spreminja absorpcija rentgenske svetlobe v

odvisnosti od energije fotonov. Uporablja se za analize atomskih in molekularnih struktur

v snoveh, ki omogočajo identifikacijo lokalnih struktur v vzorcu okoli atomov

selekcioniranega tipa. Osnovni mehanizem XAS metode je zelo enostaven: skozi

homogeni vzorec z optimalno absorcpcijsko debelino (µd = 2) svetimo z monokromatskim

rentgenskim žarkom. Kot izvor svetlobe uporabimo sinhrotron, ki je najsvetlejši vir

rentgenske svetlobe, in lahko dosežemo monokromatsko svetlobo z energijsko resolucijo

reda 10-4 in intenzitete monokromatskega žarka reda velikosti 109 fotonov na sekundo ali

več (Vogel-Mikuš in sod., 2012). Podrobna okolica robu in rentgenski absorpcijski spekter

vsebuje uporabne informacije o strukturi. Energijsko območje nad absorpcijskim robom

med 50 eV in 1000 eV vsebuje podaljšano drobno strukturo absorpcijskega roba EXAFS

(extended X-ray absorption fine structure), iz katere lahko določimo število in vrsto

sosednjih atomov, njihovo oddaljenost od absorbirajočega atoma in termični in statični

nered njihovih pozicij. Spekter absorpcijskega roba, ki se razteza do 50 eV nad

absorpcijskim robom XANES (X-ray absorption near-edge structure) pa vsebuje

informacije o alenci in simetriji absorbirajočega atoma (Vogel-Mikuš in sod., 2012).



20

Če je v vzorcu, na katerem smo izmerili absorpcijski koeficient v okolici roba K železa,

prisotnih več železovih spojin, potem je normiran spekter XANES linearna kombinacija

spektrov XANES posameznih spojin. Prispevke posameznih spojin v vzorcu lahko

izluščimo iz celotnega spektra XANES mešanice s pomočjo primerjave s spektri XANES,

izmerjenimi na čistih referenčnih spojinah (Vogel Mikuš in sod., 2012 in Ravel in

Nevwille, 2005). Na vzorcu izmerjene XANES spektre primerjamo s spektri, izmerjenimi

na referenčnih snoveh z znano valenco in vezavno obliko merjenega elementa (Vogel-

Mikuš in sod., 2012). To opravimo po metodi najboljšega ujemanja. Z linearno

kombinacijo spektrov referenčnih spojin (linear combination fitting oz. LCF), lahko

določimo spojine elementa, ki se nahajajo v vzorcu. S pomočjo programa za analizo

Athena (Ravel in Nevwille, 2005) skušamo najti kombinacijo spektrov XANES

referenčnih spojin, ki se čim bolj prilegajo izmerjenemu spektru.

Slika 3: Spektri XANES železovih referenčnih spojin za analizo železovih spojin v koreninah riža z

modeliranjem z linearno kombinacijo. Spektri so po ordinatni osi zamaknjeni zaradi preglednosti (Šuc,

2016).



21

2. 9. 1. 5 Spektri železa in železovih spojin

Prostorsko porazdelitev kovin v rastlinskih tkivih lahko preučujemo z mikro-analitičnimi

tehnikami, ki temeljijo na sevanju rentgenskih žarkov. Mikro-XRF omogoča mapiranje

elementne porazdelitve na nivoju tkiva, celice in nivoji, ki so manjši od celice. In situ pa

lahko raziskujmo kemijsko okolico z metodo mikro-XANES (Singh, 2013). Mikro-

rentgenska absorpcijska spektrometrija je oblika rentgenske absorpcijske spektrometrije,

pri kateri lahko mikro žarek natančno usmerimo na določeno mesto vzorca in pomerimo

absorpcijski spekter ter iz njega ugotovimo, v kakšni obliki je vezan določen element na

nivoju tkiva in celo v različnih delih znotraj posamezne celice (Vogel Mikuš in sod.,

2012). Natančna lega absorpcijskega roba pri kovinskem železu je določena s točko prvega

prevoja v absorpcijskem spektru. Absorpcijski rob se pojavi pri energiji 7112 eV (Arčon in

sod., 2012; 2015). Struktura XANES v spektrih trdne snovi je odvisna predvsem od

elektronske strukture zunanjih atomskih in molekularnih orbital: simetrije okolice atoma,

efektivnega naboja vzbujenega atoma, dolžine vezi in elektronegativnosti ligandov

(Mullner, 2005). Različna kemijska okolica atoma v trdni snovi povzroči spremembo

vezavnih energijskih stanj v atomu in posledično premik roba ki ga imenujemo tudi

kemijski premik. Ta premik robalahko uporabimo za posredno določanje efektivnega

naboja oz. valence atoma v spojini. Metoda določanja efektivnega naboja s pomočjo

premikov absorpcijskega roba se precej uporablja pri raziskovanju neznanih spojin (Vogel

Mikuš in sod., 2012). Znano je namreč empirično večkrat dokazano dejstvo, da energija

absorpcijskega roba narašča z valenco (Wong in sod., 1984). V primeru železovih atomov,

ki so vezani na kisikove ligande, to pomeni približno 4 eV razlike med lego absorpcijskega

roba dvo- in trivalentnih železovih kationov (Arčon in sod., 2007; Arčon, 2008). Nekatere

železove spojine imajo absorpcijski rob med absorpcijskimi robovi čistih dvo- in

trivalentnih spojin. Tak primer predstavlja Fe3O4 z mešano valenco železa. Fe3O4 (v

naravi se pojavlja kot mineral magnetit) je posebna oblika železovega oksida, ki vsebuje

tretjino dvovalentnih ionov in dve tretjini trivalentnih železovih ionov. Povprečna valenca

železa v Fe3O4 je torej 2,67+. Temu ustrezno se nahaja tudi absorpcijski rob te spojine

med dvo- in trivalentnimi spojinami (Arčon in sod., 2012; 2015).



22

3 MATERIAL IN METODE

3.1 RASTLINSKI MATERIAL

Različne sorte pšenice, ki smo jih preučevali, so izbrane iz Opisne sortne liste za pšenico

2013 (OSL) Republike Slovenije, ki jo je izdalo Ministrstvo za okolje Republike Slovenije.

Namen OSL je bilo zbrati in strokovno ovrednotiti rezultate, ki so bili pridobljeni s

preizkušanjem vrednosti sorte za pridelavo in uporabo (VPU) v postopku vpisa v

slovensko sortno listo in s posebnim preizkušanjem sort v nevtralnih ter po enotni metodi

izvedenih sortnih poskusih na različnih lokacijah, pri različnih načinih pridelovanja in za

različne namene uporabe sort (Opisna Sortna Lista 2013, 2013).

3. 1. 1 Podatki o sortah

Vse sorte so bile vzgojene na poskusnem polju, da bi zmanjšali vplive okolja na privzem in

razporejanje železa v tkivih. Preučevali smo 23 sort.

Preglednica 1: Znani podatki o preučevanih pšeničnih sortah. Oznaka * - izven kakovostnih razredov, oznaka

X - ni podatka.

Sorta

Tip

kla

sa

Kla

site

v ±

dn

i

Viš

ina r

ast

lin

e (r

el.)

Pole

gan

je (

oce

na 1

-9)

Ab

solu

tna m

asa

(g)

Su

rove

bel

jak

ovin

e (%

)

Sed

imen

taci

jsk

a

vre

dn

ost

(m

l)

Šte

vil

o p

ad

an

ja (

s)

Kak

ovost

ni

razr

ed

(A, B

1,

B2)

n

Pri

del

ek (

rel.

)

ANĐELKA G x 100 1 39 13,0 41 329 x x x

BASTIDE G 0,9 87 2 41 12,0 37 257 B2 29 100

BC NINA G -1,6 98 3 46 11,7 41 209 B2 17 104

BC RENATA G 2,6 111 2 38 13,1 49 267 B1 12 99

BC ZDENKA G 3,2 90 1 34 14,4 57 376 A 13 75

BOLOGNA R -2,1 92 2 35 14,2 66 340 A 9 94

se nadaljuje



23

Nadaljevanje preglednice 1: Znani podatki o preučevanih pšeničnih sortah. Oznaka * - izven kakovostnih

razredov, oznaka X - ni podatka.

Sorta

Tip

kla

sa

Kla

site

v ±

dn

i

Viš

ina r

ast

lin

e (r

el.)

Pole

gan

je (

oce

na 1

-9)

Ab

solu

tna m

asa

(g)

Su

rove

bel

jak

ovin

e (%

)

Sed

imen

taci

jsk

a

vre

dn

ost

(m

l)

Šte

vil

o p

ad

an

ja (

s)

Kak

ovost

ni

razr

ed

(A, B

1, B

2)

n

Pri

del

ek (

rel.

)

CCB

INGENIO

R -3,1 94 2 54 13,5 57 233 B2 12 108

ELEMENT R x x x x x x x B1/A x x

EUCLIDE R 1,3 98 1 46 11,9 43 323 B2 3 108

FELIX G -6,5 84 2 41 14,4 61 372 A 12 90

GARCIA G -0,4 90 2 42 11,9 29 303 * 12 103

ISENGRAIN R 0,3 96 2 41 11,9 39 303 B2 39 101

KATARINA G x 96 2 37 12,9 45 283 B2 x x

LUKULLUS R 5 93 2 41 13,2 42 325 B1 x 99

RENAN R 3,3 101 2 49 12,9 47 336 B1 39 108

RENATA G x 93 2 40 14,2 52 370 x x x

ROSARIO G 7,0 83 2 41 11,5 38 313 * 24 101

SOISSONS R -1,1 95 2 39 12,5 41 355 B2 39 103

SUPER

ŽITARKA

G -1,1 91 2 44 13,6 42 305 B1 29 86

VULKAN R -5,8 105 2 38 14,0 50 258 B1 12 107

3. 1. 1. 1 Sorta

V zbirni tabeli so uporabljena odobrena imena sort, pod katerimi so sorte vodene v Sortni

listi Republike Slovenije ali v skupnem Katalogu sort poljščin Evropske Unije (Opisna

Sortna Lista 2013, 2013).



24

3. 1. 1. 2 Tip klasa

Sorte delimo tudi glede na prisotnost res, in sicer v dve skupini: na tiste, ki imajo klas brez

res ali t. i. golice (te so v tabeli označene s črko G), ter tiste, ki imajo klas z resami ali t. i.

resnice (te so v tabeli označene s črko R) (Opisna Sortna Lista 2013, 2013).

3. 1. 1. 3 Dolžina rastne dobe in klasitev

Pri izboru sort je zelo pomembno merilo dolžina rastne dobe. Za lažja tla so namreč bolj

primerne sorte s krajšo rastno dobo, saj morajo dozoreti pred nastopom sušnega obdobja.

Medtem ko so sorte z daljšo rastno dobo primerne za tla, ki imajo dobro sposobnost

zadrževanja vode, kot tudi za ombočja, kjer je več padavin čez celo rastno dobo. Dolžina

rastne dobe posameznih sort, ki se trenutno pridelujejo v Sloveniji, znaša od dva do tri

tedne.

O klasitvi govorimo, ko se na 75 odstotkih vseh rastlin pojavi klas. V tabeli smo jo

prikazali kot število dni glede na povprečni datum klasenja sorte Žitakra (Opisna Sortna

Lista 2013, 2013).

3. 1. 1. 4 Višina rastline

Pri izbiri sort je višina rastline pomembna za pridelovalce, ki potrebujejo slamo za nastilj.

Slednji bodo izbrali sorte z daljšo slamo. Te sorte imajo prednost tudi zato, ker

pomanjkanje svetlobe zatre plevel v posevku. Višina je pomembna tudi pri dejavniku

odpornosti na poleganje, kjer so praviloma boljša izbira sorte s krajšo slamo. Povprečna

višina rastlin se izmeri od tal do vrha klasa, pri čemer se izračuna povprečje vrednosti,

izmerjenih na različnih lokacijah. V tabeli so zapisane povprečne višine rastlin do vrha

klasa, izražene so v odstotkih v primerjavi s povprečno višino sorte Žitarka (Opisna Sortna

Lista 2013, 2013).

3. 1. 1. 5 Poleganje

Poleganje posevkov ne vpliva samo na zmanjšanje pridelka, pospešuje tudi razvoj bolezni

in je velika ovira pri spravilu. Največja težava pri poleganju se dogaja v obdobju klasenja,



25

cvetenja in dozorevanja. Navadno je posledica pregoste setve, prekomernega gnojenja z

dušikom, neurij in toče, dolgotrajnega deževja, glivičnih in drugih bolezni. Poleganje se

vizualno oceni in izračuna povprečje teh vrednosti za posamezno lokacijo preizkušanja.

Poleganje se ocenjuje po kriterijih: 1 – ni poleganja, 3 – vse bili nagnjene za 30° ali močno

poleganje na eni četrtini parcele, 5 – vse bili nagnjene za 45° ali močno poleganje na eni

polovici parcele, 7 – vse bili nagnjene za 60° ali močno poleganje na treh četrtinah parcele,

9 – popolnoma poleglo. V tabeli je poleganje izraženo z oceno iz zgoraj navedenih

kriterijev (Opisna Sortna Lista 2013, 2013).

3. 1. 1. 6 Absolutna masa

Absolutna masa, ki je prikazana v tabeli, je masa 1000 zrn, izražena v gramih (g) (Opisna


3. 1. 1. 7 Surove beljakovine

Beljakovine so visoko molekularne spojine, sestavljene iz aminokislin. V pšeničnem zrnju

so najpomembnejše beljakovine albumini, globulini, glutenini in gliadini. Albumini in

globulini (9 do 15 % v zrnju, pretežno v kalčku in alevronu) imajo večjo biološko vrednost

kot ostale beljakovine v zrnju, ki pa se jih s klasičnim mletjem odstrani med otrobe. S

stališča kakovosti moke so najvažnejši glutenini in gliadini (večinoma v endospermu), ki

so v vodi netopni. Količina beljakovin je spremenljiva lastnost, ki se giblje med 8 in 17 %.

Odvisna je od različnih dejavnikov, kot so: genetske lastnosti sorte, klimatski in talni

dejavniki, agrotehnični ukrepi ter drugi zunanji in notranji dejavniki. Najbolj intenzivno

nalaganje beljakovin se odvija v začetku voščene zrelosti, medtem ko proti koncu voščene

zrelosti prevladuje nalaganje škroba. Zato v primeru nastopa sušnega obdobja ali

vročinskega vala in posledično prisilnega dozorevanja zrnje vsebuje več beljakovin.

Klimatski dejavniki so zato pomemben dejavnik, ki vpliva na vsebnost beljakovin v zrnju.

Največji vpliv na povečanje vsebnosti beljakovin pa ima dognojevanje tik pred začetkom

klasenja ali takoj po njem. Lastnost se določa po metodi iz standarda ISO 1871:2011. V

tabeli je izražena vrednost beljakovin v odstotkih (Opisna Sortna Lista 2013, 2013).



26

3. 1. 1. 8 Sedimentacijska vrednost

Z beljakovinami povezana je sedimentacijska vrednost, preko katere se določa kakovost

beljakovin. Za razliko od vsebnosti beljakovin je bolj odvisna od genetskih lastnosti. Če

ima neka sorta genetski potencial za sintetiziranje kakovostnih beljakovin, se skladno z

intenzivnim gnojenjem z dušikom povečujeta tako vsebnost beljakovin kot sedimentacijska

vrednost. Lastnost se določa po metodi iz standarda SIST ISO 5529:2010. Sedimentacijska

vrednost je vrednost za določanje kakovosti beljakovin in je izražena v mililitrih (ml)

(Opisna Sortna Lista 2013, 2013).

3. 1. 1. 9 Število padanja

Kakovost škroba se ugotavlja z metodo določanja števila padanja. Zanima nas aktivnost

amilolitičnih encimov, predvsem α in β amilaz, ki spreminjajo škrob v sladkorje in

dekstrine. Določena količina teh encimov oziroma sladkorjev je v moki zaželena za

nemoten razvoj kvasovk. Metoda temelji na merjenju časa v sekundah, ki ga porabi

posebno mešalo, da preide skozi suspenzijo moke in vode, segrete na 100 oC. Če se škrob

ne razgradi, se na višji temperaturi spremeni v klej, s čimer se poveča viskoznost

suspenzije in zato začne mešalo počasneje potovati skozi suspenzijo. Če se škrob razgradi,

lahko mešalo hitro potuje skoznjo. Poleg sorte na število padanja močno vplivajo

vremenske razmere v času dozorevanja, poleganje in gnojenje z dušikom. Optimalna

vrednost padnega števila pri pšenici je 250 sekund, pri čemer moramo upoštevati napako

metode: +/– 20 s. Pšenica, ki ima padno število pod 180 s, ni primerna za samostojno peko,

temveč ji je potrebno primešati moko z višjim padnim številom. Testo iz take moke je

lepljivo in vlažno, se slabo prepeče, sredica kruha je gnetljiva, skorja je temno rjava in

odstopi. Lastnost se določa po metodi iz standarda SIST ISO 3093:2010. V tabeli je

izražena vrednost za določanje aktivnosti amilolitičnih encimov v sekundah (s) (Opisna


3. 1. 1. 10 Kakovostni razred

Zaradi velike porabe pšenice v prehrani ljudi, se zahteva pšenico z dobro tehnološko

kakovostjo. Slednja je v zelo veliki meri genetsko pogojena lastnost in jo določajo številni



27

parametri. Pri nas preverjamo samo nekatere parametre določanja kakovosti, saj je

preverjanje zahtevno in drago. Preverja se vsebnost beljakovin, sedimentacijska vrednost,

število padanja ter absolutna in hektolitrska masa. S pomočjo teh podatkov lahko pšenico

razvrstimo v kakovostne razrede. V tabeli je uporabljena razvrstitev sort v kakovostne

razrede A, B1 in B2, glede na vrednost parametrov za ocenjevanje tehnološke kakovosti

zrnja. Sorte z oznako * so sorte izven kakovostnega razreda, ker imajo vsaj pri enem od

parametrov vrednost manjšo od minimalne vrednosti za kakovostni razred B2 (Opisna


3. 1. 1. 11 Oznaka ''n''

Predstavlja število podatkov, uporabljenih pri izračunu za določanje lastnosti pridelka zrnja

(Opisna Sortna Lista 2013, 2013).

3. 1. 1. 12 Pridelek

Višina pridelka je genetsko pogojena lastnost, ki pri najnovejših sortah dosega 10 t/ha in

več. Velik vpliv imajo pr tem: tip tal, količina in razporeditev padavin ter agrotehnični

ukrepi. Sorte z daljšo rastno dobo naj bi bile bolj rodne in naj bi imele slabšo kakovost

zrnja. V tabeli je zapisan relativni povprečni pridelek zrnja (izražen v odstotkih) v

primerjavi s povprečnim pridelkom standardnih sort (Opisna Sortna Lista 2013, 2013).



28

3. 2 PRIPRAVA MATERIALA IN EDXRF ANALIZE

3. 2. 1 Priprava materiala

Za obdelavo rezultatov analiz je bilo potrebno pridobiti maso posameznega zrna. Znanje o

premikanju Fe v semena je bistvenega pomena pri načrtovanju biofortifikacijskih strategij.

Nedavne raziskave kažejo, da je Fe skladiščeno znotraj embria (Conte in Walker, 2011). V

žitnih zrnih je večina Fe vezana s fitinsko kislino v alevronski plasti (Regvar in sod.,

2011). V žitih, kot je na primer pšenica, so otrobi pomemben vir železa (Singh in sod.,

2013). Zato je pomembno poznati maso zrna, saj je ta povezana z njegovo velikostjo in

posledično z razmerjem tkiv, ki ga tvorijo. Določanje mase posameznega zrna je potekalo

v treh ponovitvah. V vsaki smo prešteli 100 zrn, jih stehtali ter nato maso delili s 100, da

smo dobili maso enega zrna. Iz rezultatov vseh treh ponovitev za eno sorto smo izračunali

povprečje in pridobili maso enega zrna (preglednica 2).

Preglednica 2: Masa posameznega pšeničnega zrna različnih sort.

Sorta pšenice Masa enega (1) zrna [g]

ANĐELKA 0,0417

BASTIDE 0,0479

BC NINA 0,0465

BC RENATA 0,044

BC ZDENKA 0,0374

BOLOGNA 0,0352

CCB - INGENIO 0,0541

ELEMENT 0,0447

EUCLIDE 0,0474

FELIX 0,0435

GARCIA 0,0492

ISENGRAIN 0,0422

KATARINA 0,0422

LUKULLUS 0,0484

RENAN 0,0515

se nadaljuje



29

Nadaljevanje preglednice 2: Masa posameznega pšeničnega zrna različnih sort.

Sorta pšenice Masa enega (1) zrna [g]

RENATA 0,0461

ROSARIO 0,0485

SOISSONS 0,0416

SUPER ŽITARKA 0,0476

VULKAN 0,0385

V mlinčku za mletje smo zmleli posamezen vzorec zrnja. Po vsakem mletju smo mlinček

očistili z etanolom in acetonom, da ne bi prišlo do kontaminacije vzorca. Od zmletega

vzorca smo najprej vrnili v epruveto, v kateri smo hranili zrnje, približno 10–12 g vzorca

polnozrnate moke (PM). Pred vsakim naslednjim mletjem smo očistili mlinček. Odstranili

vse nože v mlinčku, jih očistili z acetonom in alkoholom, očistil notranjost mlinčka z

acetonom in alkoholom ter ponovno namestili nože. Vedno smo očistili tudi žličko za

rokovaje z vzorcem ter ključ za namestitev nožev v mlinček. Iz vzorca PM smo izdelali 3

serije tablet za vsak sorto pšenice. Te smo izdelali s pomočjo hidravlične stiskalnice. Pred

izdelavo tablet iz vzorca druge sorte pšenice smo bate in valj očistili z etanolom in

acetonom, da smo se izognili kontaminaciji vzorca. Vsako izdelano tableto smo stehtali.



30

3. 2. 2 Analiza EDXRF

Koncentracije Fe, P, S, K, Ca, Mn in Zn v tabletah iz zmletih zrn so bile določene z XRF

spektrometrijo. Kot vir vzbujanja atomov v vzorcu so bili uporabljeni izotopi Am (25 mCi)

in 55Fe (25 mCi) (Isotope Products Laboratories, Valencia, ZDA). Oddano fluorescenčno

sevanje je zbiral prenosni ED – XRF spektrometer Peduzo z Rh anodo (Inštitut Jožef

Stefan (IJS)). Energijska resolucija spektrometra je bila 35 keV.

3. 2. 3 Statistika

Statistične analize za mineralne koncentracije smo opravili s programom Statistica Statsoft,

version 7,0. Primerjave med rezultati smo izvedli z uporabo Duncanovega testa p ≤ 0,05.



31

3. 3. PRIPRAVA MATERIALA IN MIKRO-XRF ANALIZE


Za mikro-XRF analizo smo zrela in suha zrna s pomočjo nerjavečega jeklenega skalpela

prečno prerezali v 2 mm tanke rezine. Te smo nato posamično namestili na poliamidni film

za mikro-XRF analize (Singh in sod., 2013).

3. 3. 2 Mirko-XRF analize

Mapiranje elementne porazdelitve v zrnih različnih sort pšenice je bilo izvedeno z uporabo

rentgenskega mikroskopa na žarkovni liniji ID21 v sinhrotronskem laboratoriju European

Synchrotron Radiation Facility (ESRF) v Grenoblu, Francija (Koren in sod., 2013).

Rentgenska absorpcija vzorcev je bila izmerjena v fluorescenčnem načinu na žarkovni

liniji ID21 sinhrotrona ESRF v Grenoblu (Salomé idr., 2013). Rentgenski žarek je bil

monokromatiziran z dvokristalnim silicijevim monokromatorjem (Si 111) z energijsko

resolucijo 0,8 eV pri 7 keV ter Kirkpatric Baez zrcalom za mikrofokusiranje. Jakost toka v

gorišču je znašala 1010 fotonov na sekundo, globina gorišča pa je bila 100 mikronov. Za

vzbujanje železovih atomov nad robom K smo uporabili monokromatski žarek z energijo

fotonov 7300 eV. Za merjenje vstopnega svetlobnega toka so uporabili ionizacijsko celico,

za transmisijo fotodiodo in za fluorescenco SDD detektor (Koren in sod., 2013; Šuc,

2016).



32

3. 4 PRIPRAVA MATERIALA IN MIKRO-XAS ANALIZE


Pri mikro-XAS analizah smo uporabili nepoškodovana zrna in jih na aluminijaste nosilce

pritrdili z uporabo lepilnega traku (Singh in sod., 2013).

3. 4. 2 Mikro-XAS analize

Spektri referenčnih železovih spojin Fe2+ fitat, Fe3+ citrat in Fe3+ fitat so bili izmerjeni v

transmisiji pri sobni temperaturi na žarkovni liniji BM23 v sinhrotronskem laboratoriju

ESRF v Grenoblu, Francija. Žarkovna linijaje bila opremljena s silicijevim

monokromatorjem z dvojnim kristalom 111, katerega energijska resolucija v območju

železovega roba K znaša 1 eV. Višje harmonske frekvence žarka smo odstranili z zrcalom,

ki je bilo prevlečeno z rodijem (Rh). Jakost svetlobnega toka so merili s tremi

ionizacijskimi celicami. Prva je bila napolnjena z dušikom s tlakom 830 mbar, druga in

tretja pa z argonom s tlakom 135 mbar in 550 mbar. V vsako celico smo dodali še helij do

skupnega tlaka 2 barov (Šuc, 2016). Analizo spektrov XANES smo opravili z IFEFFIT

programom Athena (Ravel in Newville, 2005). Na pšeničnih zrnih smo na K železovem

absorpcijskem robu izmerili spektre XANES. Slednje smo primerjali s spektri standardnih

železovih spojin in organskih kompleksov s pomočjo metode najboljšega ujemanja z

linearno kombinacijo referenčnih spektrov. Na ta način smo lahko prepoznali glavne

vezavne oblike železa v različnih tkivih pšeničnega zrna. Za vse spektre smo izbrali

interval primerjave od –20 eV do 50 eV, glede na absorpcijski rob (Singh in sod. 2013).



33

4 REZULTATI

4. 1 STANDARDNA RENTGENSKO FLUORESCENČNA SPEKTROMETRIJA

(EDXRF)

S standardno rentgensko fluorescenčno spektrometrijo smo poleg koncentracij železa

določili še koncentracije drugih elementov, in sicer fosforja, žvepla, kalija, kalcija,

mangana in cinka.

4. 1. 1 Koncentracija železa

Rezultati meritev so pokazali, da se glede koncentracije železa sorte ločijo v tri skupine,

kar je dobro razvidno iz slike 04. V prvi skupini so sorte z majhno koncentracijo železa, od

77,9 mg do 83,4 mg (Euclide, Lukullus, Renan in Vulkan), v drugi skupini so sorte s

srednjo koncentracijo železa, od 86,7 mg do 91,2 mg (BC Nina, Soissons, Isengrain, BC

Renata, Rosario, Felix, Bologna in Renata), v tretji skupini pa tiste sorte, pri katerih je

koncentracija železa (v primerjavi z ostalimi) velika, t. j. od 93,3 mg do 101,3 mg (CCB –

Ingenio, BC Zdenka, Katarina, Anđelka, Element, Garcia, Bastide in Super žitarka).

Slika 4: Grafični prikaz koncentracij železa (mg/kg) v zrnih pšenice .Različne črke nad vrednostmi pomenijo

statistično značilne razlike v koncentraciji Fe med posameznimi sortami (n = 10, Duncanov test p < 0,05).



34

Skupina sort, ki vsebujejo statistično značilno več železa od ostalih preučevanih sort,

vključuje osem različnih sort. Od tega je kar šest sort golic. Tudi izračun povprečne

vsebnosti železa med golicami in resnicami kaže na večjo vsebnost železa pri golicah

(Slika 5).

Slika 5: Primerjava povprečnih koncentracij vsebnosti železa pri golicah in resnicah .Različne črke nad

vrednostmi pomenijo statistično značilne razlike v koncentraciji Fe med posameznimi sortami n = 10,

Duncanov test p < 0,05).



35

4. 1. 2 Koncentracija drugih merjenih elementov

Rezultati koncentracij drugih merjenih elementov niso pokazali bistvenih razlike v

vsebnosti le-teh v različnih sortah. Statistično značilne razlike se pojavijo pri vsebnosti

kalija in cinka. Izmed vseh sort je s preučevanimi elementi najbolj bogata sorta Element, ki

se pri merjenju vseh elementov pojavlja v skupini sort z visoko vsebnostjo merjenega

elementa. Sorta Vulkan je v nas zbudila zanimanje, ker je odporna na sušo. Izkazalo se je,

da vsebuje veliko mangana in kalcija v primerjavi z ostalimi sortami.

4. 1. 2. 1 Fosfor

Rezultati meritev koncentracije fosforja v zrnih (Slika 6) so pokazali, da se sorte ne

razlikujejo bistveno glede na vsebnost fosforja. Izstopata le sorti Katarina in Garcia s

koncentracijami od 2495,1 mg do 2615 mg. Koncentracija ostalih pa se giblje od 1161,1

mg do 2419 mg. Statistično značilnih razlik v koncentraciji fosforja med golicami in

resnicami ni.

Slika 6: Grafični prikaz koncentracij fosforja (mg/kg) v zrnih pšenice .Različne črke nad vrednostmi

pomenijo statistično značilne razlike v koncentraciji P med posameznimi sortami (n = 10, Duncanov test p <

0,05).



36

4. 1. 2. 2 Žveplo

Glede na vsebnost žvepla se statistično razlikujeta le sorta Super Žitarka in Euclide (Slika

7) s koncentracijami od 903,5 mg do 924,2 mg. Pri ostalih sortah se koncentracije gibljejo

od 648 mg do 899,1 mg. Statistično značilnih razlik v koncentracijah žvepla med golicami

in resnicami ni.

Slika 7: Grafični prikaz koncentracij žvepla (mg/kg) v zrnih pšenice .Različne črke nad vrednostmi pomenijo

statistično značilne razlike v koncentraciji S med posameznimi sortami (n = 10, Duncanov test p < 0,05).

4. 1. 2. 3 Kalij

Statistično značilne razlike se pojavijo pri vsebnosti kalija, kjer se, kot pri železu, sorte

razslojijo v več skupin (Slika 8). Velika večina, t. j. enajst sort (BC Zdenka, Soissons,

Rosario, Vulkan, Felix, Super žitarka, Isengrain, Renan, Anđelka, Lukullus in Euclide)

spada v prvo skupino, v tisto z majhno koncentracijo kalija (od 2804,3 mg do 4016,7 mg),

šest sort (BC Nina, BC Renata CCB-Ingenio, Katarina, Renata in Garcia) spada v skupino

s srednjo koncentracijo (od 4149,2 mg do 4799 mg), tri pa v skupino sort z veliko

koncentracijo kalija. Sorte z največjo vsebnostjo kalija so: Element, Bastide in Bologna in

vsebujejo od 4870,8 mg do 4976,7 mg kalija. Vendar pa pri kaliju lahko prihaja do



37

odstopanj zaradi nehomogenosti v vsebnosti K v tleh, na kateri so bile sorte gojene.

Statistično značilnih razlik v koncentracijah kalija med golicami in resnicami ni.

Slika 8: Grafični prikaz koncentracij kalija (mg/kg) v zrnih pšenice .Različne črke nad vrednostmi pomenijo

statistično značilne razlike v koncentraciji K med posameznimi sortami (n = 10, Duncanov test p < 0,05).

4. 1. 2. 4 Kalcij

Pri vsebnosti kalcija se preučevane sorte ne razlikujejo bistveno (Slika 9). Kar 16 sort,

katerih koncentracije se gibljejo od 218,8 mg do 302,9 mg, ne kaže razlik glede

koncentracije kalcija. Med ostalimi štirimi (Element, Isengrain, Bologna in Vulkan), kjer je

koncentracija kalcija različna, pa največ kalcija (od 306,4 mg do 384,3 mg) vsebujeta sorti

Bologna in Vulkan. Izračun povprečne vsebnosti posameznih elementov pri golicah in pri

resnicah je pokazal na statistično značilne razlike v koncentracijah kalcija. Resnice v

povprečju vsebujejo več kalcija (Slika 10).



38

Slika 9: Grafični prikaz koncentracij kalcija (mg/kg) v zrnih pšenice . Različne črke nad vrednostmi

pomenijo statistično značilne razlike v koncentraciji Ca med posameznimi sortami (n = 10, Duncanov test p

< 0,05).

Slika 10: Primerjava povprečnih koncentracij vsebnosti kalcija pri golicah in resnicah . Različne črke nad

vrednostmi pomenijo statistično značilne razlike v koncentraciji Ca med posameznimi sortami (n = 10,




39

4. 1. 2. 5 Mangan

Podobno kot pri kalciju tudi pri merjenju vsebnosti mangana rezultati kažejo na

neraznolikost (Slika 11). Pri šestnajst sortah, kjer se koncentracije gibljejo od 67,8 mg do

80,2 mg, ni bistvenih razlik v koncentraciji mangana. Med ostalimi štirimi sortami

(Bologna, Super žitarka, Element in Vulkan) sorti Element in Vulkan s koncentracijami

93,9 mg in 95,1 mg vsebujeta največ mangana in se zaradi tega razlikujeta od ostalih sort.

Podobno kot pri kalciju so se pri izračunu povprečne vsebnosti mangana pokazale

statistično značilne razlike med golicami in resnicami. Resnice v povprečju vsebujejo več

mangana (Slika 12).

Slika 11: Grafični prikaz koncentracij mangana (mg/kg) v zrnih pšenice . Različne črke nad vrednostmi

pomenijo statistično značilne razlike v koncentraciji Mn med posameznimi sortami (n = 10, Duncanov test p

< 0,05).



40

Slika 12: Primerjava povprečnih koncentracij vsebnosti mangana pri golicah in resnicah . Različne črke nad

vrednostmi pomenijo statistično značilne razlike v koncentraciji Mn med posameznimi sortami (n = 10,


4. 1. 2. 6 Cink

Statistično značilne razlike se pojavijo pri merjenju vsebnosti cinka (Slika 13). Kot pri

železu in kaliju se pojavijo tri skupine. Prvo skupino sestavlja devet sort (Rosario,

Anđelka, Isengrain, Euclide, Garcia, CBB-Ingenio, BC Nina, BC Renata in Vulkan), ki v

primerjavi z ostalimi vsebujejo najmanj cinka, in sicer od 35,4 mg do 41,9 mg. V naslednji

skupini je šest sort (Katarina, Bologna, Soissons, Lukullus, BC Zdenka in Bastide) s

srednjo koncentracijo, t. j. od 42,1 mg do 44,4 mg. V zadnji skupini pa so sorte z največjo

vsebnostjo cinka, teh je pet (Renan, Felix, Renata, Super žitarka in Element), te imajo

koncentracijo od 44,7 mg do 50,1 mg. Statistično značilnih razlik v vsebnosti cinka med

golicami in resnicami ni.



41

Slika 13: Grafični prikaz koncentracij mangana (mg/kg) v zrnih pšenice . Različne črke nad vrednostmi

pomenijo statistično značilne razlike v koncentraciji Fe med posameznimi sortami (n = 10, Duncanov test p <

0,05).



42

4. 1. 3 Metoda glavnih komponent ali Principal Component Analysis (PCA)

S pomočjo metode glavnih komponent (PCA), ki prikazuje korelacijo med posameznimi

spremenljivkami – v našem primeru koncentracijo merjenih elementov v različnih sortah –

lahko razberemo zgoraj opisane rezultate (Slika 14). Sorte so umeščene v koordinatni

sistem glede na elementno sestavo v njihovem zrnju. Na desni strani koordinatega sistema

so sorte, ki so bogate z elementi. Najdemo že naštete sorte, ki spadajo v skupino sort z več

železa v primerjavi z ostalimi (Bastide, Katarina, Garcia, Super žitarka, Element, CCB-

Ingenio), medtem ko sta sorti BC Zdenka in Anđelka, ki sicer tudi spadata v to skupino,

umeščeni v levo polovico koordinatnega sistema, ker sta z ostalimi elementi revni. Na

desni strani koordinatnega sistema se nahajata tudi sorti Bologna in Vulkan, ki smo ju

posebej omenjali zaradi velike koncentracije kalcija in mangana. Sorta Element se uvršča

najbolj stran od ostalih sort, saj je, kot že omenjeno, glede merjenih elementov najbolj

bogata sorta.

Slika 14: Grafični prikaz metode glavnih komponent ali Principal Component Analysis (PCA).



43

4. 2 MIKRO-RENTGENSKO FLUORESCENČNO SPEKTROMETRIJO

Za meritve z mikro-rentgensko fluorescenčno spektrometrijo smo izbrali in uporabili zrna

štirih sort iz celotnega prvotnega nabora analiziranega z EDXRF. To so sorte Vulkan,

Soissons, Katarina in Super žitarka. Sorte smo izbrali glede na gradient koncentracije

železa – od tistih z manj Fe (Soissons) do tistih z več Fe (Super žitarka). Mape

porazdelitve smo opravili za Fe, P in S. Žarek smo usmerili na dve različni področji zrna,

področje B in področje C, ki sta označeni na sliki 015.

Slika 15: Prečni prerez semena z oznakami . Rdeče obarvani kvadrati (z označbami B in C) označujejo

mesta, na katerih so bile ustvarjene mape porazdelitve. Z rumenimi velikimi tiskanimi črkami so označena

tkiva: aleuron (A), embrijo (E), endosperm (EN), nucleus (N) in perikarp (PER).

Na slikah od 16 do 23 so predstavljene dvodimenzionalne porazdelitve koncentracij Fe. S

črko ''P'' so označene posamezne točke, na katerih so bili pomerjeni spektri mikro-XAS na

železovem robu K.



44

Na slikah 16 in 17 so porazdelitvene mape sorte Vulkan.

Na sliki 16 so porazdelitvene mape za vse tri merjene elemente (Fe, S in P) na področju C

(Slika 15) oziroma iz področja brazde semena. Železo se večinoma kopiči na območju

nucelusa in alevrona. Porazdelitvena mapa S nakazuje kopičenje v endospermu, P pa se

kopiči v alevronu.

Slika 16: Mape porazdelitve sorte Vulkan prikazujejo lokalizacijo Fe (zgoraj), P (levo spodaj) in S (desno

spodaj) v prečnih prerezih zrn pšenice. Barvne lestvice določajo koncentracije merjenih elementov v µg.

Območje P1 – P3 so oznake točk, kjer so bile opravljene meritve Fe-K XANES spektrov. Meritve v točkah

so bile izvedene s fokusiranim žarkom..

X P1 X P2

X P3

X P4



45

Na sliki 17 so porazdelitvene mape za Fe, S in P, merjene v območju B (Slika 15), oziroma

na področju skuteluma semena. Železo se zgoščeno nahaja v alevronu in skutelumu.

Žveplo se koncentrira v endospermu, P pa je nakopičen v alevronu in skutelumu.

Slika 17: Mape porazdelitve sorte Vulkan prikazujejo lokalizacijo Fe (zgoraj), P (levo spodaj) in S (desno


Območje P1–P3 so oznake točk, kjer so bile opravljene meritve Fe-K XANES spektrov. Meritve v točkah so

bile izvedene s fokusiranim žarkom.



46

Na slikah 18 in 19 so porazdelitvene mape sorte Super Žitarka.

Območje C (Slika 15) je predstavljeno na sliki 18, na kateri lahko vidimo, da se železo

kopiči v alevronu in skutelumu, kjer se koncentracije gibljejo 150–200 mg/kg Nekaj rdečih

točk je za P v področju endosperma in za S v področju okolice brazde, ki je tudi tkivo

endosperma.

Slika 18: Mape porazdelitve sorte Super Žitarka prikazujejo lokalizacijo Fe (zgoraj), P (na sredini) in S

(desno spodaj) v prečnih prerezih zrn pšenice. Barvne lestvice določajo koncentracije merjenih elementov v

µg. Območje P1–P3 so oznake točk, kjer so bile opravljene meritve Fe-K XANES spektrov. Meritve v točkah

so bile izvedene s fokusiranim žarkom.

X P1

X P2

X P3



47

Na sliki 19 je porazdelitvena mapa področja B (Slika 15). Tukaj je Fe koncentrirano le v

skutelumu, S in P sta enakomerno koncentrirana po celoti površini merjenega mesta

Slika 19: Mape porazdelitve sorte Super Žitarka prikazujejo lokalizacijo Fe (zgoraj), P (levo spodaj) in S

(desno spodaj) v prečnih prerezih zrn pšenice. Barvne lestvice določajo koncentracije merjenih elementov v

µg. Območje P1 in P2 sta oznaki točk, kjer so bile opravljene meritve Fe-K XANES spektrov. Meritve v

točkah so bile izvedene s fokusiranim žarkom.

X P1

X P2

X P3



48

Na slikah 20 in 21 so porazdelitvene mape sorte Soissons.

Območje C (Slika 15) je predstavljeno na sliki 20. Koncentracija Fe je nizka, koncentracija

S je enakomerno porazdeljena, koncentracija P pa je locirana na alevron. V točki P4 je

označeno mesto, kjer je bilo merjeno Fe na preikarpu. Vidimo lahko rdečo obarvanje, kar

nakazuje na visoko koncentracijo.

Slika 20: Mape porazdelitve sorte Soissons prikazujejo lokalizacijo Fe (zgoraj), P (levo spodaj) in S (desno


Območje P1 in P2 sta oznaki točk, kjer so bile opravljene meritve XANES spektrov na absorpcijskem robu K

železa. Meritve v točkah so bile izvedene s fokusiranim žarkom.

X P1

X P2

X P3

X P4



49

Območje B (Slika 15) je predstavljeno na sliki 21. Koncentraciji S in P sta enakomerno

porazdeljeni, S je več od P. Fe je koncentrirano v točki P1.

Slika 21: Mape porazdelitve sorte Soissons prikazujejo lokalizacijo Fe (zgoraj), P (levo spodaj) in S (desno






50

Na slikah 22 in 23 so porazdelitvene mape sorte Katarina.

Porazdelitvene mape za vse tri merjene elemente (Fe, S in P) kažejo, da se na področju C

(Slika 15) Fe nahaja v nucleu, alevronu in endospermu, S na brazdi sorte Katarina nakazuje

na večjo in enakomerno vsebnost v predelu endosperma, kar prikazuje tudi slika 22 iz

področja B (Slika 15). P dosega večje koncentracije v predelu alevrona, tako v območju C

kot v območju B (Slika 15).

Slika 22: Mape porazdelitve sorte Katarina prikazujejo lokalizacijo Fe (zgoraj), P (levo spodaj) in S (desno


Območje P1–P3 so oznake točk, kjer so bile opravljene meritve XANES spektrov na absorpcijskem robu K




51

Slika 23: Mape porazdelitve sorte Katarina prikazujejo lokalizacijo Fe (zgoraj), P (levo spodaj) in S (desno






52

4. 3 MIKRO-RENTGENSKA ABSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA

Analize z mikro-XANES smo razdelili v dva sklopa. V prvem smo merili vezavne oblike

Fe v posameznih tkivih, v drugem pa smo analizirali vezavne oblike Fe v celotnem zrnu

posameznih izbranih sort. Rezultati modeliranja štirih reprezentativnih XANES spektrov

na absorpcijskem robu K železa, posnetih v različnih tkivih pšeničnega zrna z linearno

kombinacijo treh izbranih referenčnih spektrov, so prikazani na sliki 024.

(a)

(b)

(c)

(č)

Slika 24: Spektri XANES na železovem robu K vzorcev (a) skutelum pšenične sorte Vulkan, (b) nucelus

pšenične sorte Soissons, (c) alevrona pšenične sorte Super žitarka in (č) nucelus pšenične sorte Katarina.

Merjeni spektri (črna črta) opisan z LCF treh spektrov (vijolična črta), po enega iz treh različnih skupin

referenčnih spektrov: Fe3+ fitat (modra črta), Fe3+ citrat (temno modra črta) in Fe2+ fitat (rdeča črta).

Izrisani so tudi deleži referenčnih spektrov ter razlika med meritvijo.



53

Z metodo najboljšega ujemanja z linearno kombinacijo spektrov referenčnih spojin smo

določili deleže Fe spojin, ki so prisotni v vzorcu. V vseh vzorcih (Vulkan, Soissons,

Katarina in Super Žitarka) so bile prisotne enake tri spojine in sicer Fe2+ fitat, Fe3+ fitat in

Fe3+ citrat. Rezultati linearne kombinacije fitov vseh pomerjenih spektrov XANES

železovega roba K so prikazani v prilogi A. Spektri Fe so bili pomerjeni na različnih tkivih

zgoraj omenjenih sort. In sicer na skutelumu pšenične sorte Vulkan, nucelusu pšenične

sorte Soissons, alevronu pšenične sorte Super žitarka in nucelusu pšenične sorte Katarina.

Rezultati kažejo na tkivno specifičnost vezavnih oblik Fe. Tako najdemo v skutelumu in

alevronu velik delež Fe3+ fitata, v nucelusu pa Fe2+ fitata. Da bi ovrednotili razlike v Fe

vezavnih oblikah v pšeničnem zrnu na tkivnem nivoju smo izračunali povprečne deleže

Fe2+ in Fe3+ fitata ter Fe3+ citrata vseh sort in jih prikazali z radarskim diagramom (Slika

25), naredili pa smo tudi analizo glavnih komponent. Tkiva, ki so najbolj bogata s Fe, so:

perikarp (0,17 mg /g), nucleus (0,16 mg/g) in alevron (0,16 mg/g). V alevronu in

skutelumu je vsebnost Fe2+ fitata, Fe3+ fitata, in Fe3+ citrata enakomerna. V nucleu

prevladuje Fe2+ fitat s kar 53 %, na račun katerega je manj Fe3+ fitata, vsebnost Fe3+ citrata

pa je primerljiva z vsebnostjo le-tega v ostalih tkivih. Vsebnost Fe3+ fitata je manjša tudi v

embriu, kjer pa je povečana vsebnost Fe3+ citrata. Meritev na perikarpu je pokazala, da v

slednjem nad obema fitatoma prevladuje Fe3+ citrat s kar 56 %. Tudi analiza glavnih

komponent (Slika 26) prikazuje, da so vezavne oblike Fe podobne v alevronu in

skutelumu, kjer prevladuje Fe3+ fitat, v nucelusu prevladuje Fe2+ fitat, v perikarpu pa

nefitatni Fe ligandi. Na sliki 027 pa lahko vidimo prikaz razdelitve vezavnih oblik Fe v

celotnem zrnu izbranih sort pšenice. Deleži Fe2+ fitata, Fe3+ fitata in Fe3+ citrata so pri

sortah Super žitarka, Soissons in Vulkan enakomerno vsebovani, sorta Katarina pa izstopa

po povišanem deležu Fe2+ fitata (43 %) in na ta račun zmanjšanem deležu Fe3+ citrata (27

%).



54

Slika 25: Radarski diagram vsebnosti vsega Fe (modro) in posameznih vezavnih oblik Fe: Fe2+ fitat (rdeča

črta), Fe3+ fitat (zeleno) in Fe3+ citrat (vijolično), v različnih tkivih. NP – nukleus, A – alevron, SC –

skutelum, E – embrio, PER – perikarp. Desno ob diagramu je pripadajoča tabela vrednosti.

Slika 26: Graf PCA analize preferenc vezavnih oblik Fe po tkivih .

NP

ASC

EPER

Fe.conc

Fe_II_fitat

Fe_III_fitat

Fe_III_citrat

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

F2 (

33

.93

%)

F1 (41.17 %)

Biplot (axes F1 and F2: 75.10 %)



55

Slika 27: Radarski diagram vsebnosti posameznih vezavnih oblik Fe: Fe2+ fitat (modro), Fe3+ fitat (rdeče)

in Fe3+ citrat (zeleno), v štirih izbranih sortah pšenice: Vulkan, Soissons, Super žitarka in Katarina. Desno

ob diagramu je pripadajoča tabela vrednosti.



56

5 RAZPRAVA

Cilj magistrskega dela je bil določiti vsebnost Fe in ostalih mineralnih hranil (P, S, Cl, K,

Ca, Mn, Zn) v zrnju različnih avtohtonih sort pšenice ter izmed vseh sort izbrati tiste, ki

imajo največjo vsebnost Fe. Cilj je bil tudi določiti mesta akumulacije Fe in vezavne oblike

na tkivnem nivoju.

5. 1 STANDARDNA RENTGENSKA FLUORESCENČNA SPEKTROSKOPIJA

(EDXRF)

Merjenje koncentracij železa in ostalih elementov s standardno rentgensko fluorescenčno

spektroskopijo (EDXRF) je razslojilo sorte pšenic na več skupin, glede na vsebnost

posameznega merjenega elementa. Rezultati meritev so pokazali, da se, glede na

koncentracije železa, sorte ločijo v tri skupine: skupina z majhno koncentracijo, skupina s

srednjo koncentracijo in skupina sort, pri katerih je koncentracija v primerjavi z ostalimi

sortami velika. Na podlagi obstoječih raziskav smo to raznolikost tudi pričakovali. Tudi

dve komercialni pšenični sorti: Rialto in Riband akumulirata različno količino železa v

zrnju (Eagling in sod., 2014). V omenjeni raziskavi se je koncentracija Fe v zrnih gibala

med 6,7 mg/kg in 46,7 mg kg-1. Prav tako se je v raziskavi Singh in sodobnikov

koncentracija razlikovala pri primerjavi pšeničnega kultivarja Triticum aestivum Cv.

WL711 in prvotne nekultivirane sorte Triticum aestivum L. IITR26, kjer je divja sorta

Triticum aestivum L. IITR26 vsebovala več železa (38 mg kg-1) (Singh in sod., 2014). Prav

tako se je koncentracija Fe v zrnih pšenice pri Zhao in sodobnikih (2008) gibala v razponu

med 28,9 mg/kg in 50,8 mg kg-1. Pri naših meritvah se je koncentracija Fe gibala med 77,6

mg/kg in 101,3 mg kg-1, kar je skoraj dvakratna koncentracija Fe v primerjavi z najvišjo

koncentracijo Fe v zgoraj omenjenih raziskavah.

Poleg razlike v vsebnosti železa je pri kultivirani sorti Triticum aestivum Cv. WL711 in

nekultivirani sorti Triticum aestivum L. IITR26 celotni spekter mineralne vsebnosti kazal v

prid divji sorti Triticum aestivum L. IITR26 (Singh in sod., 2014). Koncentracije mineralov

se razlikujejo v različnih vzorcih pšeničnih zrn, kar so dokazali tudi Zhao in sodobniki

(2008). Koncentracije Fe, Zn in Se se občutno razlikujejo v 150. vrstah pšenice za



57

pridobivanje moke ter 25. vrstah drugih pšenic, ki so bile različnega izvora in različnih

rastnih pogojev. Izmerjena raven Fe v omenjeni raziskavi je bila podobna rezultatom iz

drugih sorodnih raziskav, koncentracija Zn pa je bila v zrnih na splošno nižja od

pričakovanj. Razliki domnevno botruje visok pH prsti, v katerih je bila pšenica gojena, ta

naj bi zmanjšal dostopnost Zn za rastline (Zhao in sod., 2008). Rezultati naših meritev so

pokazali, da je bila koncentracija v primerjavi z zgoraj navedeno raziskavo relativno

visoka. Izmerjeni maksimum pri Zhao in sodobnikih (t. j. 34,5 mg kg-1) predstavlja

minimalno vrednost pri merjenju Zn v našem vzorcu nabora pšenic, ta ustreza 35,4 mg kg1.

Zanimiva je tudi primerjava vsebnosti Fe v zrnih drugih kultivarjev, kot so na primer

ječmen, riž in ajda. Vsa tri žita v zrnih vsebujejo manj železa, kot smo ga izmerili v zrnih

dvajsetih sort pšenice. Pri ječmenu se koncentracija Fe v zrnju giblje med 40–80 mg kg-1,

koncentracija Zn pa med 20–40 mg/kg (Persson in sod., 2009). Koncentracija Fe v zrnih

ajde znaša 78,2 mg/kg (Pongrac in sod., 2016). Povprečna in mediana koncentracija Fe v

vzorcih zrn rjavega riža pa je 32,0 in 22,1 mg kg-1, v vzorcih zrn belega riža pa 7,9 in 7,2

mg/kg (Joy in sod. 2016), v primerjavi s koncentracijo Fe pri pšenici, ki smo jo izmerili v

naši raziskavi, je to zelo nizka koncentracija. Vendar pa je omenjeni rezultat smiselen, saj

je preučevanemu rižu odstranjena testa.

5. 2 MIKRO-RENTGENSKA FLUORESCENČNA SPEKTROMETRIJA

Pri analizah mikro-XRF smo skenirali del brazde in del med skutelumom, embrijem in

endospermom. Brazda zrna predstavlja tkivo, ki nastane z zlitjem dveh materinskih tkiv;

funikula in kalaze. V pšeničnih zrnih se hranila nalagajo iz vaskularnega dela, ki obdaja

brazdo (Perason in sod., 1995). Med razvojem zrna se kovinski ioni remobilizirajo iz listov

in poteka kopičenje hranil iz materinske rastline v endosperm zrna preko materinskih tkiv

v brazdi (Hell in Stephan, 2003; Stomph in sod., 2011). Večina Fe je bila lokalizirana v

alevronski plasti in v kalčku pšeničnega zrna, oba se izgubita pri mletju, saj je frakcija

moke, v kateri se nahajata, odstranjena (Conte in Walker, 2011; Regvar in sod., 2011;

Singh in sod., 2013).



58

Pri vseh štirih sortah pšenic v naši raziskavi je primerjava obarvanja z barvno lestvico, ki

določa koncentracije merjenih elementov, pokazala, da je alevronska plast najbolj bogata z

merjenimi elementi; Fe, P in S. V endospermu pa se le-teh akumulira bistveno manj.

Porazdelitvena mapa z železom najbolj bogate sorte, sorte Super žitarka, prikazuje najvišjo

vsebnost Fe. XRF analiza je pokazala očitno razliko v vzorcu porazdelitve Fe v pšeničnih

zrnih. Podobne rezultate kažejo tudi druge raziskave (Singh in sod., 2013).

5. 3 MIKRO-RENTGENSKA ABSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA

O deležu Fe kemijskih oblik Fe2+ in Fe3+ v pšeničnih zrnih je malo znanega (Ortega in

sod., 2012). V pšeničnih zrnih naj bi bila večina Fe vezana v komplekse s fitinsko kislino,

ki veže tako Fe2+ kot Fe3+ (Bretti in sod., 2012; Regvar in sod., 2011, Singh in sod. 2013).

Analize XANES z uporabo LCF analize veljajo za zanesljivo tehniko določanja

oksidacijskega stanja in molekularne geometrije elementov v bioloških vzorcih in situ, ki

ne potrebujejo posebne priprave vzorca in z njo povezanih morebitnih kemijskih

sprememb v vzorcu. Ker Fe spojine proizvajajo različne profile na robu K železa nam LCF

pomaga identificirati ne samo deleže Fe2+ in Fe3+, temveč tudi elemente (ligande) v okolici

Fe (Arčon in sod. 2007; Ortega in sod., 2012).

Iz spektrov XANES na železovem K robu lahko zaradi energijskega premika in

absorpcijskega roba sklepamo na relativno frakcijo valenčnega stanja kovine (Singh in

sod., 2013). Normalizirani Fe spektri XANES so bili pridobljeni na vzorcih

nepoškodovanih zrn in z določitvijo referenčnih spojin z valenco Fe2+ in Fe+. Z linearno

kombinacijo spektrov referenčnih spojin smo dobili ujemanje Fe spojin in njihove relativne

vrednosti. Spojine, ki so ustrezale spektru vseh štirih vzorcev, so: Fe2+ fitat, Fe3+ fitat in

Fe3+ citrat. Pri merjenju XANES spektrov na Fe robu K na A. kotschyi acc. 3790, T.

aestivum WH291 in T. aestivum WL711 je bilo najboljše ujemanje doseženo s kombinacijo

Fe2+ fitat, Fe3+ fitat in Fe3+ sulfat, pri T. aestivum L. ILTR26 pa s kombinacijo Fe2+ fitat

Fe3+ fitat (Singh in sod., 2013).

Spektri Fe so bili merjeni na različnih tkivih zgoraj omenjenih sort. Rezultati se razlikujejo

glede na tkiva, kjer so bili Fe spektri merjeni. V skutelumu sorte Vulkan so razmerja Fe



59

spojin 20 % Fe2+ fitata, 41 % Fe3+ fitata in 39 % Fe3+ citrata. V nucleusu sorte Soissons je

razmerje Fe spojin 37 % Fe2+ fitata, 20 % Fe3+ fitata in 43 % Fe3+ citrata. V alevronu sorte

Super žitarka je razmerje Fe spojin 28 %, Fe2+ fitata, 46 % Fe3+ fitata in 26 % Fe3+ citrata.

V nucleu sorte Katarina pa je razmerje Fe spojin 62 % Fe2+ fitata, 8 % Fe3+ fitata in 30 %

Fe3+ citrata. Tako razliko v razmerjih treh spojin med posameznimi sortami pripisujemo

prav dejstvu, da so bila merjena različna tkiva.

Pri preučevanju vsebnosti Fe v različnih tkivih zrna so rezultati pokazali, da so s Fe najbolj

bogati perikarp, nucelus in alevron. Vendar pa je ta meritev pokazala na različnost v

vsebnosti, saj je razkrila odsotnost Fe3+ fitata v tem delu zrna. To vpliva na večjo

biorazpoložljivost Fe v semenski ovojnici, ki v prehrani predstavlja otrobe. Slednji so

lahko bogat vir Fe. Ugotovili smo že, da je prehranska dostopnost Fe v pšenični moki

omejena, saj pride do izgube s Fe bogatih otrobov med mletjem in obdelavo ter zaradi

prisotnosti anti-nutrientov, kot je fitinska kislina, ki veže Fe v zrnu v netopne komplekse

(Singh in sod. 2013).

V nucelusu je bilo od celotne koncentracije Fe kar 53 % Fe2+ fitata, v vseh ostalih tkivih pa

se je količina le-tega gibala okoli 34 %. V alevronu in skutelumu so si bile koncentracije

vseh treh spojin najbolj enakomerne (30–36 %). V nucelusu je zaradi velike vsebnosti Fe2+

fitata bila zmanjšana vsebnost Fe3+ fitata, vsebnost Fe3+ citrata pa je bila primerljiva z

vsebnostjo Fe3+ citrata v ostalih tkivih. Z razliko v deležih Fe spojin je izstopal še embrio,

kjer je bila povečana vsebnost Fe3+ citrata na 45 %, vsebnost Fe2+ fitata je bila primerljiva

z vsebnostjo le-tega v ostalih tkivih, zmanjšana pa je bila vsebnost Fe3+ fitata na 21 %. Pri

A. kotschyi acc. 3790, T. aestivum L. ILTR26, T aestivum Cv. WH291 in T. aestivum Cv.

WL711 je najvišje deleže dosegal Fe3+ fitat (49 %–85 %), Fe2+ fitat pa najmanjše (14 %–

24 %) (Singh in sod., 2013).

Pri preučevanju vsebnosti Fe v štirih izbranih sortah so že rezultati EDXRF pokazali, da je

s Fe najbolj bogata sorta Super Žitarka. Sorte bi za nadaljnje preučevanje vsebnosti Fe

lahko gojili na drugi poskusni njivi, različni od njive, na kateri so bile gojene sorte, iz

katerih smo pridobili zrnje. Sestava tal namreč določa vsebnost posameznih elementov,

vpliva tudi na privzem le-teh (Bashir, 2007; Sah in Singh, 2015).



60

Deleži Fe2+ fitata, Fe3+ fitata, in Fe3+ citrata so pri sortah Super žitarka, Soissons in

Vulkan enakomerno vsebovani, sorta Katarina pa izstopa po povišanem deležu Fe2+ fitata

(43 %) in na ta račun zmanjšanem deležu Fe3+ citrata (27 %).

Fitat ima sposobnost, da tvori močno vezane topne in delno topne komplekse z različnimi

proteini, ogljikovimi hidrati, drugimi organskimi ligandi ter številnimi kovinami in

kovinskimi kationi, s čimer vpliva na njihovo biodostopnost in aktivnost. Dobro znano je,

da je Fe – zaradi helacije s fitatom – organizmom težko dostopno za absorpcijo (Bretti,

2012). Pri biofortificiranem rižu, kjer so dodajali citronsko kislino in trinatrijev citrat, je

bila absorpcija Fe bistveno višja (Hackl, 2016). Glede na te podatke lahko sklepamo, da so

oblike Fe spojin, kjer je Fe vezano na fitat, slabše biodotsopne od tistih, pri katerih Fe tvori

komplekse s citratom. Zato bistvene razlike v biodostopnosti Fe v preučevanih sortah ni.

Pri primerjavi tkiv z razliko v deležih Fe spojin izstopata perikarp in embrio, kjer je bila

vsebnost Fe3+ citrata 45 %. V ostalih tkivih se je delež citrata gibal med 30 % in 33 %.



61

6 SKLEPI

Preučevane sorte pšenice so vsebovale različne koncentracije Fe. Izmed vseh preučevanih

sort smo selekcionirali osem sort (CCB-Ingenio, BC Zdenka, Katarina, Anđelka, Element,

Garcia, Bastide in Super žitarka), ki vsebujejo statistično značilno več Fe.

Da bi zagotovili verodostojnejše rezultate merjenja koncentracije Fe, bi bilo dobro zrnje

pred mletjem oprati.

Alevronske plasti so s Fe, P in S bogat del zrna. V endospermu pa se le-teh elementov

akumulira bistveno manj. Z železom so najbolj bogati perikarp, nucelus in alevron.

Železove spojine, ki so ustrezale spektru vzorcev sort Vulkan, Soissons, Super žitarka in

Katarina, so: Fe2+ fitat, Fe3+ fitat in Fe3+ citrat.

Deleži Fe2+ fitata, Fe3+ fitata in Fe3+ citrata so pri sortah Super žitarka, Soissons in Vulkan

enakomerno vsebovani, sorta Katarina pa izstopa po povišanem deležu Fe2+ fitata in na ta

račun zmanjšanem deležu Fe3+ citrata.

Bistvene razlike v biodostopnosti Fe v preučevanih sortah ni.

Pri primerjavi tkiv z razliko v deležih Fe spojin izstopa embrio, kjer je bila povečana

vsebnost Fe3+ citrata.

V perkikarpu je odsoten Fe3+ fitat, kar vpliva na večjo biorazpoložljivost Fe.

Pšeničnih sorte, ki vsebujejo večje koncentracije Fe, bi lahko uporabljali kot živilo za

biofortifikacijo. Predvsem pa bi bilo nujno uporabiti s Fe bogate otrobe, ki se sicer v

predelavi izgubijo.



62

7 POVZETEK

V magistrskem delu smo določali vsebnost Fe in ostalih mineralnih hranil (P, S, Cl, K, Ca,

Mn, Zn) v zrnju različnih avtohtonih sort pšenice. Izmed vseh sort smo izbrali tiste z

največjo vsebnostjo Fe. Za nadaljnje analize smo glede na gradient vsebnosti Fe izbrali

štiri sorte in določili mesta akumulacije Fe v zrnu ter vezavne oblike Fe v posameznem

tkivu zrna.

Različna žitna zrna na splošno niso bogata z minerali. Trenutno uporabljeni postopki

(luščenje, mletje, sejanje) za predelavo zrnja za prehranske namene povzročijo izgubo

delov zrnja, ki so bogati s Fe. Dodatna težava, ki se še pojavlja, pa je prisotnost anti-

nutrientov, kot je fitinska kislina, ki veže Fe v zrnu v netopne komplekse. Za izboljšanje

mineralne sestave zrnja bi bilo najbolj učinkovito in cenovno ugodno, da bi uspeli povečati

koncentracije biodostopno vezanih elementov v zrnih še pred žetvijo. To bi lahko dosegli s

selekcijo kultivarjev, ki učinkovito privzemajo in transportirajo Fe v zrnje, kjer ga

shranjujejo v biodostopni obliki.

Preučevali smo 23 sort izbranih iz Opisne sortne liste za pšenico 2013 (OSL) Republike

Slovenije, ki jo je izdalo Ministrstvo za okolje Republike Slovenije. Analize so temeljile na

uporabi rentgenskih analitskih metod; z EDXRF smo merili koncentracije Fe in nekaterih

ostalih elementov v zrnih vseh preučevanih pšeničnih sort, z mikro-XRF smo lokalizirali

Fe, P in S na tkivnem nivoju v zrnu, z mikro-XAS pa smo določali Fe spojine oz. vezavne

oblike Fe v celotnem zrnu in v posameznih tkivih zrna.

Pričakovano so se sorte razlikovale po vsebnosti Fe. Glede na koncentracije Fe so se

oblikovale tri skupine: skupina z majhno, skupina s srednjo in skupina z veliko

koncentracijo. V skupini z veliko koncentracijo, t. j. od 93,3 mg do 101,3 mg, so sorte

CCB-Ingenio, BC Zdenka, Katarina, Anđelka, Element, Garcia, Bastide in Super žitarka.

Iz slednje skupine smo za nadaljnje raziskave uporabili sorti Super žitarka in Katarina. Iz

skupine z majhno koncentracijo smo uporabili sorto Vulkan, iz skupine s srednjo

koncentracijo pa sorto Soissons.



63

Pri vseh teh štirih izbranih sortah, je analiza mikro-XRF pokazala, da so alevronske plasti

najbolj bogate z merjenimi elementi. V endospermu pa se le-teh akumulira bistveno manj.

Pri preučevanju vsebnosti Fe v različnih tkivih zrna so rezultati pokazali, da so s Fe najbolj

bogati perikarp, nucelus in alevron. Porazdelitvena mapa z železom najbolj bogate sorte,

sorte Super žitarka, pričakovano glede na rezultate EDXRF, prikazuje največje vrednosti

Fe v posameznih tkivih.

Normalizirane Fe spektre mikro-XANES smo pridobili z meritvami na vzorcih in

referenčnih spojinah z valenco Fe2+ in Fe3+ in z linearno kombinacijo spektrov referenčnih

spojin določili ujemajoče Fe spojine v vzorcih. Te so bile pri vseh štirih sortah enake: Fe2+

fitat, Fe3+ fitat in Fe3+ citrat.

Deleži Fe2+ fitata, Fe3+ fitata in Fe3+ citrata so pri sortah Super žitarka, Soissons in Vulkan

enakomerno vsebovani, sorta Katarina pa izstopa po povišanem deležu Fe2+ fitata in na ta

račun zmanjšanem deležu Fe3+ citrata. Oblike Fe spojin, kjer je Fe vezano na fitat, so

slabše biodotsopne od tistih, pri katerih Fe tvori komplekse s citratom. Zato bistvene

razlike v biodostopnosti Fe v preučevanih sortah ni.

Pri primerjavi tkiv z razliko v deležih Fe spojin izstopa embrio, kjer je bila povečana

vsebnost Fe3+ citrata. Meritev na perikarpu pa je pokazala, da slednji ne vsebuje Fe3+ fitata,

kar vpliva na večjo biorazpoložljivost Fe, saj je fitinska kislina anti-nutrien, ki veže Fe v

netopne komplekse.



64

8 VIRI

Arčon I. 2008. Introduction to XANES and EXAFS analysis. Nova Gorica, University of

Nova Gorica: str. 9–11, 13–17

Arčon I., Kolar J., Kodre A., Hanžel D., Strlič M. 2007. XANES analysis of Fe valence in

iron gall inks. X-Ray Spectrometry, 36, 3: 199–205

Arčon I., Paganelli S., Piccolo O., Gallo M., Vogel-Mikuš K., Baldi F. 2015. XAS analysis

of iron and palladium bonded to a polysaccharide produced anaerobically by a strain of

Klebsiella oxytoca. Journal of Synchrotron Radiation, 22: 1215–1226

Arčon I., Piccolo O., Paganelli S., Baldi F. 2012. XAS analysis of a nanostructured iron

polysaccharide produced anaerobically by a strain of Klebsiella oxytoca. Biometals, 25,

5: 875–881

Bashir K., Nagasaka S., Itai Nakanishi R., Kobayashi T., Takahashi M., Nakanishi H.,

Mori S., Nishizawa N. K. 2007. Expression and enzyme activity of glutathione

reductase in upregulated by Fe-deficiency in graminaceous plants. Plant Molecular

Biology, 65: 277–284

Bashir K., Takahashi R., Nakanishi H. 2013. The road to micronutrient biofortification of

rice: progress and prospects. Frontiers in Plant Science, 4: 15

Becker R., Fritz E., Manteuffel R. 1995. Subcellular localization and characterization of

excessive iron in the nicotianamine-less tomato mutant chloronerva. Plant Physiology,

108, 1: 269–275

Bienfait H.F., Van den Briel W., Mesland-Mul N.T. 1985. Free space iron pools in roots.

Generation and mobilization. Plant Physiology, 78, 3: 596–600



65

Bocchini M., Bartucca M. L., Ciancaleoni S., Mimmo T., Cesco S., Pii Y., Albertini E.,

Del Buono D. 2015. Iron deficiency in barley plants: phytosiderophore release, iron

translocation, and DNA methylation. Frontiers in Plant Science, 6: 514

Bouis H. E., Hotz C., McClafferty B., Meenakshi J. V., Pfeiffer W. H. 2011.

Biofortification: A new tool to reduce micronutrient malnutrition. Food and Nutrition

Bulletin, 32, 1: 31–40

Bretti C., Cigala R. M., Lando G., Milea D., Sammartano S. 2012. Sequestering ability of

phytate toward biologically and environmentally relevant trivalent metal cations.

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60, 33: 8075–8082

Clapera R. S. 2006. Energy Dispersive X-ray Fluorescence: Measuring Elements in Solid

and Liquid Matrices. Antwerpen, Karel de Grote-Hogeschool, Industriële

Wetenschappen en Technologie: 69 str.

http://dugi-doc.udg.edu/bitstream/handle/10256/7563/1EDXRF-project.pdf?sequence=1

(23. avg. 2017)

Conte S. S., Walker E. L. 2011. Transporters contributing to iron trafficking in plants.

Molecular Plant, 4, 3: 464–476

Curie C., Panaviene Z., Loulergue C., Dellaporta S. L., Briat J. F., Walker E. L. 2001.

Maize yellow stripe1 encodes a membrane protein directly involved in Fe(III) uptake.

Nature, 409, 6818: 346–349

Cvelbar F. 2003. Merjenje ionizirajočega sevanja. Ljubljana, Društvo matematikov, fizikov

in astronomov Slovenije: 176 str.

DellaPenna D. 1999. Nutritional genomics: manipulating plant micronutrients to improve

human health. Science, 285: 375–379



66

Dwyer J. T., Woteki C., Bailey R., Britten P., Carriquiry A., Gaine P. C., Miller D.,

Moshfegh A., Murphy M. M., Smith Edge M. 2014. Fortification: new findings and

implications. Nutrition reviews, 72, 2: 127–141

Eagling T., Wawer A. A., Shewry P., Zhao F. J., Fairweather-Tait S. J. 2014. Iron

Bioavailability in Two Commercial Cultivars of Wheat: Comparison between

Wholegrain and White Flour and the Effects of Nicotianamine and 2′-Deoxymugineic

Acid on Iron Uptake into Caco‑2 Cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 62:

10320–10325

Grimm K. A., Sullivan K. M., Alasfoor D., Parvanta I., Suleiman A. J. M., Kaur M., Al-

Hatmi F. O., Ruth L. J. 2012. Iron-fortified wheat flour and iron deficiency among

women. Food and Nutrition Bulletin, 33, 3: 180–185

Hass J. D., Beard J., Murray-Kolb L. E., Del Mundo A. M., Felix A., Gregorio G. B. 2005.

Iron-biofotrified rice improves the iron stores of nonanemic flilpino women. The

Journal of Nutrition, 135, 12: 2823–2830

Hell R., Stephan U. W. 2003. Iron uptake, trafficking and homeostasis in plants. Planta,

216: 541–551

Hurrell R. F. 2002. Fortification: overcoming technical and practical Barriers. The journal

of Nutrition, 132: 806–812

Hurrell R. F., Reddy M. B., Burri J., Cook J. D. 2002. Phytate degradation determines the

effect of industrial processing and home cooking in iron absorption from cereal-based

foods. British Journal of nutrition, 88: 117–123

Joy E. J. M., Ander E. L., Broadley M. R., Young S. D., Chilimba A. D. C., Hamilton E.

M., Watts M. J. 2016. Elemental composition of Malawian rice. Environmental

Geochemistry and Health, 39, 4: 835–845



67

Kanngiesser B., Haschke M. 2006. Micro X-Ray Fluorescence Spectroscopy. V:

Handbook of Practical X-Ray Fluorescence Analysis. Beckhoff B., Kanngiesser B.,

Langhoff N., Wedell R., Wolff H. (ur.). Berlin, Springer-Verlag: 433–473

Kaulich, B., Gianoncelli, Beran A., Eichert D., Kreft I., Pongrac P., Regvar M., Vogel

Mikuš K., Kiskinova M. 2009. Low-energy X-ray fluorescence microscopy opening

new opportunities for bio-related research. Journal of the Royal Society Interface, 6, 5:

641–647

Koren Š., Arčon I., Kump P., Nečemer M., Vogel Mikuš K. 2013. Influence of CdCl2 and

CdSO4 supplementation on Cd distribution and ligand environment in leaves of the Cd

hyperaccumulator Noccaea (Thlaspi) praecox. Plant and Soil, 370, 1–2: 125–148

McLean E., Cogswell M., Egli. I., Wojdyla D., Benoist B. 2008. Worldwide prevalence of

anaemia, WHO Vitamin and Mineral Nutrition Information System, 1993–2005. Public

Health Nutrition, 12, 4: 444–454

Miret S., Simpson R. J., McKie A. T. 2003. Physiology and molecular biology of dietary

iron absorption. Annual Review of Nutrition, 23: 283–301

Müllner A. 2005. X-ray Absorption Near Edge Structure. Ljubljana, Univerza v Ljubljani,

Fakulteta za matematiko in fiziko: 17 str.

http://mafija.fmf.uni-lj.si/seminar/files/2004_2005/Monochromators.pdf (23. avg. 2017)

Nečemer M., Kump P., Ščančar J., Jaćimović R., Simčič J., Pelicon P., Budnar M., Jeran

Z., Pongrac P., Regvar M., Vogel-Mikuš K. 2008. Application of X-ray fluorescence

analytical techniques in phytoremediation and plant biology studies. Spectrochimica

Acta Part B: Atomic Spectroscopy, 63, 11: 1240–1247

Nečemer M., Kump P., Vogel-Mikuš K. 2011. Use X-ray fluorescence-based analytical

techniques in phytoremediation. V: Handbook of phytoremediation (Environmental



68

science, engineering and technology). Golubev I. A. (ur.). New York, Nova Science

Publishers: 331–358

Nestel P., Bouis H. E., Meenakshi J. V., Pfeiffer W. 2006. Biofortification of staple food

crops. The Journal of Nutrition, 136, 4: 1064–1067

Nozoye T., Nagasaka S., Takahashi M., Sato Y., Sato Y., Nobuyuki U., Nakanishi H.,

Nishizawa N. K. 2011. Phytosiderophore efflux transporters are crucial for iron

acquistion in graminaceous plants. The Journal of Biological Chemistry, 286, 7: 5446–

5454

Opisna sortna lista za pšenico 2013. 2013. Letnik 7, številka 2. Ljubljana, Ministrstvo za

kmetijstvo in okolje: 28 str.

http://www.uvhvvr.gov.si/fileadmin/uvhvvr.gov.si/pageuploads/OBJAVE_ZA_JAVNO

ST/Objave_SEME/Sortna_lista/OSL_Psenica_2013.pdf (23. avg. 2017)

Ortega R., Carmona A., Llorens I., Solari P. L. 2012. X-ray absorption spectroscopy of

biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 27, 12:

2054–2065

Pearson J. N. , Rengel Z., Jenner C. F., Graham R. D. 1995. Transport of zinc and

manganese to developing wheat grains. Physiologia Plantarum, 95, 3: 449–455

Persson D. P., Hansen T. H., Laursen K. H., Schjoerring J. K., Husted S. 2009.

Simultaneous iron, zinc, sulfur and phosphorus speciation analysis of barley grain

tissues using SEC-ICP-MS and IP-ICP-MS. Metallomics, 1: 418–426

Pongrac P., Scheers N., Sandberg A. S., Potisek A., Arčon I., Kreft I., Kupm P., Vogel

Mikuš K. 2016. The effects of hydrothermal processing and germination on Fe

speciation and Fe bioaccessibility to human intestinal Caco-2 cells in Tartary

buckwheat. Food Chemistry, 199: 782–790



69

Ravel, B., Newville M. 2005. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-

ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation 12: 537–

541

Regvar M., Eichert D., Kaulich B., Gianoncelli A., Pongrac P., Vogel Mikuš K., Kreft I.

2011. New insights into globoids of protein storage vacuoles in wheat aleurone using

synchrotron soft X-ray microscopy. Journal of Experimental Botany, 62, 11: 3929–3939

Reynolds M., Foulkes J., Furbank R., Griffiths S., King J., Murchie E., Parry M., Slafer G.

2012. Achieving yield gains in wheat. Plant, Cell and Environment, 35: 1799–1823

Römheld V., Marschner H. 1986. Evidence for a specific uptake system for iron

phytosiderophores in roots of grasses. Plant Physiology, 80: 175–180

Sah S., Singh R. 2015. Siderophore: structural and functional characterisation – a

comprehensive review. Agriculture, 61, 3: 97–114

Sands D. C., Morris C. E., Dratz E. A., Pilgeram A. 2009. Elevating optimal human

nutrition to a central goal of plant breeding and production of plant-based foods. Plant

Science, 177, 5: 377–389

Sattelmacher B. 2001. The apoplast and its significance for plant mineral nutrition. New

Phytologist 149, 2: 167–192

Shenkin A. 2006. Micronutrients in health and disease. Postgraduate Medical Journal, 82:

559–567

Singh M., Sanderson P., Hurrell R. F., Fairweather-Tait S. J., Geissler C., Prentice A.,

Beard J. L. 2006. Iron bioavailability: UK food standards agency workshop report.

British Journal of Nutrition, 96: 985–990



70

Singh S. P., Vogel-Mikuš K., Arčon I., Vavpetič P., Jeromel L., Pelicon P., Kumar J., Tuli

R. 2013. Patern of iron distibution in maternal and filial tissues in wheat garins with

contrasting levels of iron. Journal of Experimental Botany, 64, 11: 3249–3260

Singh S. P., Jeet R., Kumar J., Shukla V., Srivastava R., Mantri S. S., Tuli R. 2014.

Comparative transcriptional profiling of two wheat genotypes, with contrasting levels of

minerals in grains, shows expression differences during grain filling. Plos One, 9, 11: 1–

16

Stomph T. J., Choi E. Y., Stangoulis J. C. R. 2011. Temporal dynamics in wheat grain zinc

distribution: is sink limitation the key?. Annals of Botany, 107, 6: 927–937

Strnad J. 1982. Fizika 3. del: Posebna teorija relativnosti, Kvantna fizika, Atomi.

Ljubljana, Državna založba Slovenije: 320 str.

Strnad J. 1992. Mala kvantna fizika. 2 natis. Ljubljana, Društvo matematikov, fizikov in

astronomov Slovenije: 140 str.

Šuc B. 2016. Identifikacija porazdelitev in vezavne oblike železa v rižu (Orzya sativa L.) z

rentgensko absorpcijsko in emisijsko mikro-spektroskopijo. Diplomsko delo. Nova

Gorica, Univerza v Novi Gorici, Fakulteta za znanosti o okolju: 46 str.

Takagi S., Nomoto K., Takemoto T. 1984. Physiological aspect of mugenic acid, a possible

phitosiderophore of graminaceous plants. Journal of plant nutrition, 7: 469–477

Treeby M., Marschner H., Römheld V. 1989. Mobilization of iron and other micronutrient

cations from calcareous soil by plant-borne, microbal, and synthetic metal chelators.

Plant and Soil, 114: 217–226

Vogel-Mikuš K., Kump P., Nečemer M., Pelicon P., Arčon I., Pongrac P., Povh B.,

Regvar M. 2010. Quantitative analyses of trace elements in environmental samples:



71

options and(im)possibilities. V: Soil heavy metals (Soil biology). Sherameti I., Varma

A. (ur.). Berlin, Springer: 113–138

Vogel-Mikuš, K., Arčon, I., Kump, P., Pelicon, P., Nečemer, M., Vavpetič, P., Koren, Š.,

Regvar, M. 2012. Analytical Tools for Exploring Metal Accumulation and Tolerance in

Plants. V: Phytotechnologies: remediation of Environmental Contaminants. Anjum N.

A., Pereira M. E., Ahmad I., Duarte A. C., Umar,S., Khan N. A (ur). Združeno

kraljestvo, Taylor in Francis: 443–495

Wong J., Lytle F. W., Messmer R. P., Maylotte D. H. 1984. K-edge spectra of selected

vanadium compounds. Physical Review B, 30: 5596–5610

Zhao F. J., Su Y. H., Dunham S. J., Rakszegi M., Bedo Z. McGrath S. P., Shewry P. R.

2008. Variation in mineral micronutrient concentrations in grain of wheat lines of

diverse orihin. Jurnal of Cereal Science, 49: 290–295



ZAHVALA

Najprej bi se rada zahvalila mentorici, izr. prof. dr. Katarini Vogel Mikuš, ki me je

spremljala v dolgem procesu nastanka tega magistrskega dela. Hvala za vse predano

znanje, vse nasvete in spodbude. Hvala, ker ste si kljub obilici drugih obveznosti vzeli čas

zame.

Hvala tudi somentorju, prof. dr. Iztoku Arčonu, za odgovore na moja številna vprašanja in

izr. prof.dr. Mateji Germ ter prof. dr. Marjani Regvar za natančen pregled magistrskega

dela in kakovostne predloge in popravke.

Hvala celotnemu kadru na katedri za fiziologijo rastlin Biotehniške fakultete Univerze v

Ljubljani, za vsakršno pomoč in prijazno besedo, ki sem je bila deležna v času priprave

materiala in analiz. Hvala tudi vsem tistim, ki ste me spremljali med delom na Inštitutu

Jožef Štefan.

Hvala sinhrotronskemu laboratoriju European Synchrotron Radiation Facility v Grenoblu v

Franciji, za omogočeno uporabo rentgenskega mikroskopa na žarkovni liniji ID21 in hvala

vsem, ki ste sodelovali pri mapiranju vzorcev za to magistrsko delo.

Hvala Megi, za lektoriranje in natančen celostni pregled magistrskega dela, za vse nasvete,

komentarje, predvsem pa čas, ki si ga je za to vzela.

Med zahvalami, ki sledijo, so naštete moje najdražje osebe, ki me spremljajo v vseh

vidikih mojega življenja. Najbolj zaslužena za to, da sem dosegla vse, kar sem, sta moja

starša. Hvala, ker sta mi omogočila šolanje in sta mi vedno stala ob strani ter verjela, da

zmorem.

Hvala možu Mateju, ki me spremlja na moji poti. Z mano premaguje ovire in se veseli

vsake, še tako majhne, zmage.

Hvala sestrama, Kristini in Veroniki, ter bratu Sebastjanu, ki so vedno prisluhnili mojim

študentskim težavam, mi bili v oporo, spodbudo in pomoč. Hvala za vse čudovite trenutke,

ki smo jih preživeli skupaj.



Hvala Maji in Tadeji, ki sta mi bili in sta mi še vedno veliko več kot le študijski sošolki.

Hvala Tini za uspešen, predvsem pa nepozaben, študijski vikend.

Hvala sosedi in prijateljici Alini. Za vse spodbude in za posvečene trenutke.

Hvala mami in tatu, Kristini in Janu, Veroniki in Marku, Anji, Meti in Klemnu ter še

marsikomu, ki je poskrbel za Angelikino varstvo v obdobju intenzivnega pisanja

magistrskega dela.

Nazadnje hvala moji mali Angeliki, ki mi je s svojo potrpežljivostjo in nezahtevnostjo

omogočila, da sem študij zaključila.



.PRILOGE

Priloga A

Preglednica z rezultati ujemanja z linearno kombinacijo spektrov referenčnih spojin vseh

merjenih Fe-Xanes. Tkiva: aleuron (A), embrio (E), endosperm (EN), nucelus (NP) in

perikarp (PER).

Sorta Tkivo Fe2+ fitat Fe3+ fitat 𝐅𝐞𝟑+ citrat Konc. Fe

vulkan NP 0.74 0.00 0.26 330

vulkan A 0.22 0.43 0.35 318

vulkan SC 0.34 0.37 0.29 171

vulkan SC 0.34 0.36 0.30 157

vulkan SC 0.20 0.41 0.39 157

vulkan A 0.34 0.34 0.32 113

vulkan E 0.38 0.30 0.32 70.9

s. zit. NP 0.39 0.28 0.33 58

s. zit. A 0.38 0.25 0.37 120

s. zit. SC 0.34 0.45 0.21 73

s. zit. SC 0.34 0.21 0.45 83

s. zit. A 0.28 0.46 0.26 135

s. zit. E 0.31 0.09 0.60 7

soissons NP 0.37 0.20 0.43 89

soissons PER 0.21 0.16 0.63 167

soissons PER 0.19 0.32 0.49 166

soissons A 0.40 0.49 0.11 124

soissons SC 0.39 0.45 0.16 41

soissons SC 0.36 0.29 0.35 79

soissons E 0.47 0.11 0.42 10

katarina NP 0.62 0.08 0.30 172

katarina A 0.39 0.33 0.28 190

katarina SC 0.38 0.33 0.29 114

katarina SC 0.36 0.40 0.24 125

katarina A 0.38 0.39 0.23 131

Documents

VSEBNOST, LOKALIZACIJA IN VEZAVNE OBLIKE5. 3 MIKRO-RENTGENSKA ABSORPCIJSKA SPEKTROMETRIJA ..... 58 6 SKLEPI ..... 61 Hosta N. Vsebnost, vezavne oblike in lokalizacija železa v zrnih