CHƯƠNG 1

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

CHƯƠNG 1

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

VI SINH VẬT

I. 1. HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

-Trong phân tích, kiểm nghiệm vi sinh vật, môi

trường cần cho việc tăng sinh, phân lập, phân

biệt, nhân giống, cấy chuyền, bảo quản, định

danh vi sinh vật…

- Môi trường cần chứa đầy đủ các thành phần về

nguồn carbon, đạm, khoáng và vi lượng … và có

các điều kiện lý hóa thích hợp

* Theo nguồn gốc

- Tự nhiên

- Tổng hợp

- Bán tổng hợp

* Theo trạng thái vật lý

- Lỏng (Brothe)

- Rắn

- Bán lỏng (bán rắn)

PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VSV

PHÂN LOẠI MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VSV

* Theo mục đích

- Môi trường tiền tăng sinh

- Môi trường tăng sinh

- Môi trường chọn lọc

- Môi trường phân biệt

- Môi trường thử nghiệm sinh hóa

PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

• Môi trường tự pha chế– Chẩn bị nguyên liệu: Cân, đong thành phần– Pha chế: Hòa tan, bổ sung agar (môi

trường rắn)– Lọc– Điều chỉnh pH– Phân phối vào dụng cụ– Hấp khử trùng (1210C/30p)

• Môi trường đông khô:

Được sử dụng phổ biến trong các phòng kiểm nghiệm vi sinh– Cân lượng môi trường– Bổ sung nước (theo tỷ lệ), hòa tan– Phân phối vào dụng cụ chứa– Hấp khử trùng (1210C/15’)

Note: Thông thường môi trường được pha chế có giá trị pH thích hợp, không cần phải hiệu chỉnh pH sau khi được pha chế .

Vi khuẩn gram dương trên môi trường chọn

lọc CAN (Colistan Nalidixic Acid Agar )

S. epidermidis và S. aureus trên môi trường chọn lọc –

phân biệt Mannitol Salt Agar (MSA)

Môi trường kiểm tra khả năng sinh Indol

Môi trường kiểm tra khả năng lên men Môi trường kiểm tra khả năng lên men Dextrose (Glucose) Dextrose (Glucose)

I.2. KỸ THUẬT LẤY MẪU, VẬN CHUYỂN MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU

THỰC PHẨM

Một kế hoạch lấy mẫu chi tiết cần có các yếu tố

sau: n, c, m, M

- n: số mẫu thử

- c: số mẫu được phép nằm trong khoảng lân cận

giới hạn (m c M)

- m: khoảng chấp nhận (mật độ vi sinh <m)

- M: khoảng không chấp nhận (mật độ vi sinh

>M; thông thường 10 x m M

KẾ HOẠCH LẤY MẪU THỰC

PHẨM

Ví dụ: Tiêu chuẩn về tổng số vsv trong sp trứng

được thanh trùng Pasteur: n=5, c=2, m= 5.104,

M= 106 CFU/25g

- Kế hoạch 2 thuộc tính

- Chỉ nêu ra m

- Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu

trong n mẫu thử >m: Chấp nhận lô hàng

- Nếu >c mẫu trong số n mẫu thử >m: từ

chối lô hàng

- Kế hoạch 3 thuộc tính- Đặt ra cả m và M

- Chỉ tiêu “m” thường phản ánh ngưỡng trên

của GMP- Chỉ tiêu “M” đánh dấu giới hạn trên (nguy

hiểm/không chấp nhận.- Nếu tất cả các mẫu m hoặc c mẫu trong

n mẫu thử nằm trong khoảng >m và M: Chấp nhận lô hàng

- Nếu >c mẫu trong n mẫu thử nằm trong khoảng >m và M Hoặc có một mẫu >M: Từ chối lô hàng

- Lựa chọn kế hoạch lấy mẫu

- Kế hoạch 2 thuộc tính: Đối tượng vsv quan

tâm không được phép có trong thực phẩm;

- Kế hoạch 3 thuộc tính: Nếu cho thực phẩm

một số lượng nhất định vsv trong một đơn vị thể

tích.

Mẫu:

- Phải mang tính đại diện (nhiều thời điểm,

vi trí)

- Đ/v mẫu tp đã biết: sử dụng que bông vô

trùng quét 1 diện tích bề mặt nhất định or cắt

lát 2-3mm)

- Tránh sự tạp nhiễm vi sinh vật ngoại lai

(chứa mẫu trong các bình bằng nhựa có nắp

vô trùng)

- Ghi chú mẫu: thời gian, nhiệt độ, nơi lấy

mẫu, phương tiện vận chuyển, …

KẾ HOẠCH THU MẪU THỰC PHẨM

Nơi lấy mẫu

Thời điểm lấy mẫu

Số lượng mẫu cần lấy1

Chỉ tiêu VSVkiểm tra

Qui mô

nhỏ

Qui mô vừa

Qui mô lớn

CSGMtrâu bò

Sau khi khám thịt, trước khi đưa thân thịt đi tiêu thụ/sơ chế hoặc trước khi làm lạnh, mẫu được thu thập trong vòng 30 phút.

1 - 3

4 - 6

7 - 12

- VKHK TS- Enterobacteriaceae- Salmonella

CSGM lợn

Sau khi khám thịt, trước khi đưa thân thịt đi tiêu thụ/sơ chế hoặc trước khi làm lạnh, mẫu được thu thập trong vòng 30 phút.

1 - 3

4 - 6

7 - 12

- VKHK TS- Enterobacteriaceae- Salmonella

CSGM cừu, dê, chó, ngựa

Sau khi khám thịt, trước khi đưa thân thịt đi tiêu thụ/sơ chế hoặc trước khi làm lạnh, mẫu được thu thập trong vòng 30 phút.

1- 34 - 6

7 - 12

- VKHK TS- Enterobacteriaceae- Salmonella

Phương pháp lấy mẫu thịt

Nơi lấy mẫu

Thời điểm lấy mẫu

Số lượng mẫu cần lấy1

Chỉ tiêu VSVkiểm tra

Qui mô

nhỏ

Qui mô vừa

Qui mô lớn

CSGM gia cầm2

Sau khi đưa thân thịt đi làm lạnh ít nhất 1,5 giờ (cả trong kho làm lạnh chúng hoặc sau khi treo thân thịt lại trên dây) hoặc trước khi đưa đi tiêu thụ/sơ chế.

1 - 3

4 - 6

7 - 12

- VKHK TS- Enterobacteriaceae- Salmonella- Campylobacter

Cơ sở pha lọc/sơ chế

Sau khi lọc xương, bắt đầu làm lạnh hoặc đông lạnh tiếp theo, thu thập mẫu là các miếng thịt pha lọc, thịt sơ chế hoặc thịt xay trước khi bao gói chân không hoặc bao gói kín.

1 - 3

4 - 6

7 - 12

- VKHK TS- E.coli- Salmonella- VSV khác khi yêu cầu

Cơ sở bảo quản (Kho lạnh)

Trong kho lạnh, tại thời điểm bảo quản mẫu. Mẫu lấy là thịt lạnh hoặc lạnh đông tại 5 điểm: 4 góc và 1 giữa. Gộp lại là 1 mẫu.

Cho 1 kho lạnh lấy 5 đơn vị mẫu

tại 5 vị trí.

- VKHK ưa lạnh- Enterobacteriaceae- Salmonella

Các sản phẩm lạnh đông:

- Lau cồn phía ngoài PE

- Đặt vào khay tráng men đã vô trùng

- Đưa vào buồng vô trùng để rã đông tự nhiên (T0 phòng); 2-50C (18h); 450C (15 phút)

Mẫu đồ hộp:

- Kiểm tra hộp có bị phồng, biến dạng, hở …

- Lau chùi bằng cồn bên ngoài

- Đưa vào phòng vô trùng để kiểm

Các sp bao bì, nylon, thủy tinh …

- Kiểm tra độ kín của bao bì

- Lau cồn phía ngoài

- Đưa vào phòng vô trùng để kiểm

Trong quá trình vận chuyển:

- Mẫu phải được bảo quản ở -200C cho đến khi

phân tích (0-40C)

- Mẫu phải xét nghiệm trong vòng 36h (6h)

- Vi sinh vật có thể bị tổn thương nên trong

nhiều trường hợp cần giai đoạn tăng sinh.

VẬN CHUYỂN VÀ BẢO QUẢN MẨU THỰC PHẨM

- Giải đông mẫu trước khi phân tích

. Đk vô trùng (2-50C trong 18h, 450C

trong 15 phút kết hợp lắc bình chứa mẫu để tăng

tốc độ giải đông và đồng nhất nhiệt độ trong

mẫu)

- Đồng nhất mẫu

. Đk vô trùng, mẫu lỏng (lắc kỹ), mẫu

rắn (stomacher)

- Cân mẫu

. Đk vô trùng, sai số cho phép ± 0,1g

. Định tính: 10g; định lượng: 25g

CHUẨN BỊ MẪU THỰC PHẨM

Stomacher

SP đặc hoàn toàn:

10g(25g) mẫu → nghiền nát trong cối sứ vô trùng → Erlen có chứa sẵn bi thủy tinh và 90ml (225ml) nước cất vô trùng hoặc nước muối sinh lý → lắc đều, lắng cặn → hút phần dịch để cấy mẫu, độ pha loãng 10-1 (10-2)

Các sp vừa đặc vừa lỏng:

Cân 100g mẫu (cả cái lẫn nước) → cối nhỏ vô trùng, nghiền → cân 10g (dịch nghiền) → Erlen (90ml NMSL + bi thủy tinh) → lắc đều, để lắng cặn → hút phần dịch để cấy mẫu.

Sp lỏng hoàn toàn:

- Sử dụng trực tiếp mẫu hoặc pha loãng tùy theo mức độ nhiễm bẩn.

- Lắc kỹ bình chứa mẫu, hút 10ml mẫu cho vào Erlen có sẵn 90ml nước cất hay nước muối sinh lý tiệt trùng (độ pha loãng 10-1)

- Dung dịch pha loãng: Tốt hơn nên dùng nước pepton 0,1%; nước muối sinh lý (0,85%), trong buffer nếu cần.

I. 3. THỬ NGHIỆM SINH HÓA

Trong kỹ thuật phân tích vi sinh vật

- Định danh vi sinh vật: dựa vào

- Các đặc điểm về kiểu hình

- Các p/ư sinh hóa được thực hiện bởi các chủng vi sinh vật

- Các p/ư sinh hóa có thể thực hiện theo 3 cách:

- Truyền thống

- Bộ KIT

- Thiết bị tự động

TRUYỀN THỐNG

•Xác định khả năng sử dụng một nguồn carbon nhất định bởi vsv để tăng trưởng theo con đường lên men

•Sp (rượu, acid hữu cơ, CO2) tạo thành làm giảm pH môi trường → thay đổi màu môi trường

• CO2 tạo ra được bẩy bằng ống durham làm nổi ống.

Thử nghiệm khả năng lên men

Thử nghiệm khả năng lên men

+ + --

• Môi trường sử dụng: Phenol Red broth base: đỏ (pH 7,4) → vàng (pH 6,8)

• Dùng để định danh các vsv thuộc họ Enterobacteriacea (vk đường ruột): E.coli, Klebsiella, Staphylococcus (+); Corynebacterium (-)

Thử nghiệm khả năng oxy hóa – lên men

(TN Hugh –Leifson)

•Xác định vi sinh vật dị dưỡng cần cung cấp nguồn carbon dưới dạng chất hữu cơ, thường là carbonhydrate. Vsv sử dụng CBH này làm nguồn năng lượng theo con đường lên men hay hô hấp

• Quá trình lên men thường tạo môi trường có tính acid cao hơn quá trình hô hấp.

• Môi trường Hugh- Leifson có chỉ thị pH là bromothymol blue (pH = 6.0: vàng; pH= 7,6: xanh dương)

•Thử nghiệm Hugh – Leifson

- 2 ống nghiệm chứa mt hugh-Leifson; 1 ống được phủ paraffin lỏng vô trùng trên bề mặt môi trường.

- Cấy đâm sâu vsv, ủ 24-48h trong cùng đk

•Sau p/ư:

- Lên men: cả 2 ống bị oxh đều từ trên bề mặt và phần sâu của mt

- Hô hấp: ống kị khí bị oxh đều từ trên bề mặt xuống phần sâu của mt; ống hiếu khí chỉ bị acid hóa ở phần đáy

Thử nghiệm Hugh-

Leifson

• Phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong esculin thành esculentin và glucose

• Esculentin p/ư với muối sắt tạo phức hợp màu nâu hay đen

• MT: Aesculin Medium hay Edwards

• Sau p/ứ: hóa nâu hay đen (+); ko đổi màu (-)

Thử nghiệm Bile Esculin

Thử nghiệm Bile Escusin

+

-

Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate

• Citrate được sử dụng làm nguồn carbon duy nhất của vsv.

• Sp biến dưỡng citrate thay đổi tuỳ vào pH môi trường

pH kiềm: acetate và formate

pH trung tính: acetate và CO2

pH acid: acetoin và lactate

•Mt Simmons citrate chứa chất chỉ thị màu Bromothymol blue ở pH trung tính có màu xanh lục, pH kiềm có màu xanh dương (pH>7,6).

• Sau p/ư: mt có màu xanh lục (-); xanh dương (+)

+ -

Môi trường Simmons citrate agar có chất chỉ thị màu bromothymol blue.

Sau phản ứng: Xanh lục (-); xanh dương (+)

+ -

- Môi trường manolate broth có chứa bromothymol bue

Sau p/ư: Xanh lục (-); xanh dương (+)

Thử nghiệm khả năng biến dưỡng malonate

Thử nghiệm catalase

• Phân biệt vi sinh vật hiếu khí và vi sinh vật kị khí

• VSV hiếu khí có enzyme catalase có khả năng phân giải H2O2 → H2O và O2

• Thí nghiệm:

H2O2 30% (giữ lạnh)→ nhỏ 1 giọt sinh khối vsv lên 1 giọt H2O2

Sủi bọt (+): Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus

Không xuất hiện bọt khí (-): Clostridium, Streptococcus

Thử nghiệm catalase

-

++ -

Thử nghiệm decarboxylase

• Phân loại và định danh các loại vi khuẩn đường ruột dựa trên loại enzyme decarboxylase xúc tác phản ứng phân giải 1 a.a đặc trưng → CO2 → tăng pH môi trường

• Có 3 loại enzyme: ODC, LDC và ADC (ADH)

• Môi trường Decarboxylase basal medium chứa chỉ thị bromocrezol purple và 1 loại a.a (ornithin, lysin, arginin)

• Sau p/ư: Vàng (-), tím (+)

Thử nghiệm decarboxylase

-+

Thử nghiệm coagulase

•Định danh Staphylococcus, loài này có khả năng tiết enzyme coagulase làm kết tụ các thành phần huyết tương tạo khối đông huyết tương

•Thử nghiệm được thực hiện với huyết tương thỏ hay người dạng đông khô

• Tiến hành trên phiến kính/ống nghiệm

•Sau p/ư (khoảng 4 phút)

Xuất hiện đám ngưng kết: +

Ko có p/ư ngưng kết: -

Thử nghiệm Coagulase

+ -

Thử nghiệm urease

•Xác định khả năng tạo enzyme urease của 1 số Xác định khả năng tạo enzyme urease của 1 số vsv, đặc biệt là nhóm vsv, đặc biệt là nhóm ProteusProteus

•Enzyme này xúc tác p/ư phân giải ure thành NH3 và CO2 → tăng pH môi trường

•Môi trường lỏng Rustigian Stuart’s Urea broth hay mt đặc Christensen Urea chứa chỉ thị đỏ phenol

• Sau p/ư: không đổi màu (màu vàng cam): -; đỏ tím:+

Thử nghiệm urease

- ++++++

Thử nghiệm genlatinase

• Đánh giá khả năng tiết enzyme genlatinase phân giải genlatine thành polypeptide và a.a

• Môi trường nuôi cấy vsv được bổ sung gelnatine hoặc nuôi cấy vsv trên mt gelatine có bổ sung 5-10ml trichloacetic acid TCA là kết tủa gelatine.

• Sau p/ứ:

Ống nghiệm thạch nghiêng bị tan chảy: +

Không thay đổi trạng thái: -

* Chủng vsv: Aeromonas hydrophyla (+); E.coli (-)

Thử nghiệm gelatinase

+ -

Thử nghiệm khả năng sinh H2S

•Xác định khả năng phân giải các a.a chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) → H2S nhờ enzyme desulfuahydrase

• H2S tạo kết tủa màu đen với chỉ thị sulfide (Fe II, Fe III, amonium sulfate sắt …) chứa trong môi trườn.

• Môi trường thử nghiệm: KIA, TSI, SIM, PIA, BSA

• Sau nuôi cấy: Xuất hiện màu đen (+), ko xuất hiện màu (-)

• VSV: E.coli (+), Klebsiella (-), Proteus mirabilis (-)

Thöû nghieäm khaû naêng sinh H2S

Thử nghiệm khả năng sinh indol

•Xác định khả năng chuyển hóa các sp trung gian của quá trình oxy hóa thành indol.

• Indol được xác định nhờ p/ứ với thuốc p- dimethylaminobanzaldehide tạo phức quinon co màu đỏ

• MT thử nghiệm: nước trypton, MIU, SIM; thuốc thử là Kovacs và Erlich

• Sau p/ư: xuất hiện lớp màu đỏ trên bề mặt mt (+), màu vàng (-)

• VSV: E.coli (+), Klebsiella (-), Serratia marcescen (-), Proteus rettgeri (+)

Thử nghiệm khả năng sinh idol

- +

Thử nghiệm khả năng sinh idol

Thử nghiệm KIA, TSI

•Môi trường KIA, TSI sử dụng đồng thời để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau (glucose và lactose) và khả năng sinh H2S.

•KIA chứa 1%lactose, 0,1% glucose, chất chỉ thị Phenol red; TSI có thêm 1% succrose

•Trên mt KIA:

- glucose (+): Bề mặt có màu đỏ, phần sâu màu vàng

- glucose, lactose: cả bề mặt và phần sâu đều có màu vàng

- H2S: có màu đen trong thạch và có vết nứt

- Thử nghiệm HsS nhờ Na2SO3 trong tp môi trường và nhận biết H2S nhờ Amonium citrat sắt.

Thử nghiệm KIA, TSI

Thử nghiệm nitrase (khử nitrate)

• Đánh giá khả năng sử dụng enzyme nitratase để khử nitrate thành nitrite và các sp khác

• Nitrit tạo thành sẽ được nhận biết nhờ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylenediamide hydrochloride ở pH acid cho phức chất màu hồng

• Mt nitrate broth, sodium nitrate

• Sau p/ư: khi thêm thuốc thử vào và acid hóa môi trường

Màu hồng: +

Không xuất hiện màu hồng: -

Thử nghiệm nitratase

Thử nghiệm oxidase

•Nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vsv

• Hoạt tính oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, nếu có sự hiện diện của enzyme, thuốc thử bị oxy hóa → indolphenol có màu xanh dương

• Môi trường thử nghiệm: nutrient aga; lấy 1 ít sinh khối đặt trên 1 tấm giấy lọc có tẩm thuốc thử p-phenylenediamin

• Sau thử nghiệm: Xanh dương (+); không đổi màu (-)

Thử nghiệm oxidase

Thử nghiệm ONPG

•Xác định hoạt tính enzyme β-galactosidase tham gia vào quá trình lên men lactose ở vsv.

• Môi trường thử nghiệm: ONPG broth chứa o-nitrophenyl – D – galactopyranoside, sp tạo thành o- nitrophenol có màu vàng

• VSV: Serratia marcescens (+), Proteus rettgeri (-)

• Sau p/ư: màu vàng (+); ko đổi màu (-)

Thử nghiệm ONPG

+ -

Thử nghiệm MR (Methyl Red)

• Phân biệt vsv dựa vào sự khác biệt trong quá trình tạo và duy trì các sp có tính acid từ sự lên men glucose. VSV lên men glucose tạo và duy trì các sp có tính acid làm đổi màu thuốc thử. Nếu sp acid tiếp tục → các sp trung tính: không đổi màu thuốc thử

• Chất chỉ thị màu pH mt là methyl red

• Sau thử nghiệm: mt chuyển màu đỏ (+), mt không đổi màu (-)

• VSV: Proteus rettgeri (+), Serratia marcescens (-)

Thử nghiệm MR (Methyl Red)

_ + + +

Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)

Thử nghiệm VP (Vosges- Proskauer)

• Phân biệt các loài vk trong họ đường ruột Enterobacteriaceae, dựa vào sự oxh acetoin được tạo ra từ 2,3 butadiol thành diacetyl.

• Diacetyl được xác định dựa vào p/ư kết hợp với guanidine của pepton tạo phức màu đỏ

• MTTN: MR-VP

•Thuốc thử: Barritt, Koblentz chứa α-naphton và KOH

• Sau p/ư: màu đỏ (+), ko thay đổi màu (-)

• VSV: E. coli (-), Enterobacter cloacea (+)

-

- Phân biệt các nhóm Streptococcus.

- P/ư CAMP thực hiện giữa nhân tố CAMP của Streptococcus nhóm B tiết ra và β-hemolysin do Staphylococcus aureus làm tăng hoạt tính của β-hemolysin gây phá vỡ hồng cầu (tan huyết)

• Thử nghiệm đồng thời chủng staphylococcus aureus và chủng thử nghiệm, 2 đường cấy vuông góc cách nhau 2mm

Cyclic adenosine monophosphate

(cAMP, cyclic AMP or 3'-5'-cyclic adenosine monophosphate)

Thử nghiệm cAMP

Thử nghiệm CAMP

+-- Mttn: Tryptose Blood Agar Base

• Sau p/ư: có vùng tan huyết (+), không có vùng tan huyết (-)

• VSV: Strep. agalactiar (-), Strep nhóm B (+)

Thử nghiệm tính di động

KHÔNG TRUYỀN THỐNG

1.Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh

2. Phương pháp Elisa (Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay)

3. Phương pháp lai phân tử (Hybridization)

4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

5. Một số phương pháp thử nhanh khác

- Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ

- Kỹ thuật màng petri (petrifilm)

- Kỹ thuật Redigel

- Kỹ thuật độ dẫn điện, trở kháng (conductance/impedance)

- KT đo vi lượng calorie (microcalorimetry)

- KT đo mức phóng xạ

1.Phương pháp phát quang sinh học ATP trong giám sát vệ sinh

- Phân tử ATP có mặt trong tất cả các tế bào sống, sự phát hiện ATP → nhận biết các chất sống tồn tại.

- ATP được phát hiện nhờ lượng ánh sáng phát ra thông qua sự kết hợp với 1 enzyme luciferase nhờ một máy đo ánh sáng

- Ưu điểm: nhạy (1pg ATP = 10-12g), nhanh (vài phút)

- Nhược điểm: đắt tiền, hóa chất ổn định sự phát sáng, cồng kềnh (đã có sự cải tiến để mang đi được)

Cơ chế phản ứng

Luciferase + Luciferin + ATP Luciferase-Luciferin AMP + PPi

Luciferase-Luciferin AMP + O2 Oxyluciferin + AMP + CO2 + hv (phát quang)

Dụng cụ quẹt bề mặt

Máy đo sáng

Dụng cụ quẹt bề mặt Clean - Trace

2. Phương pháp Elisa (Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay)

PP elisa

- Nguyên tắc: Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ lên ngoài những đĩa giếng. Nếu có kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng. Nếu bổ sung kháng thể thứ cấp có gắn enzyme như horseradish peroxidase….

3. Lai phân tử (Hybridization)

Nguyên tắc: dựa vào sự biến tính tách mạch của phân tử DNA tại nhiệt độ nóng chảy Tm thành 2 mạch đơn (pp đo độ đục)-Nếu giảm nhiệt độ đột ngột: không có sự tái bắt cặp trở lại- Nếu ta giảm nhiệt độ từ từ thì có sự tái bắt cặp của các mạch đơn DNA: các phân tử lai

- Đặc điểm của lai phân tử

Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung

Các trình tự bổ sung có thể là DNA, RNA dẫn đến hình thành các phân tử lai DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA

Ứng dụng lai phân tử để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm?

- Định lượng vi sinh vật và độc tố- Sử dụng mẫu dò (probes), trên thị trường đã có các bộ kit (clostridium botulinum – Gene-trak; Escherichia coli – Gene-trak; staphylococcus aureus – AccuProbe; …)

Southern blot

method

Southern blot

method

Dot & slot bot

method

Dot & slot bot

method

4. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase chain reaction)

- Phương pháp PCR dùng để tổng hợp DNA dựa trên khuôn DNA ban đầu, khuyếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ enzyme polymerase và một cặp mồi (prime) đặc hiệu cho đoạn DNA này (Karl Mullis và cộng sự, 1985)

- Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt. Ðây là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen của một đối tượng vi sinh vật với độ chính xác cao.

- Hiện nay pp PCR được sử dụng để phát hiện, tạo đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát hiện mầm bệnh có trong thực phẩm …

- Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:• Biến tính: Mạch DNA tách thành mạch đơn (94-950C, 30s)• Lai: Các mồi bắt cặp với mạch khuôn (40-700C, 30-60s)• Kéo dài: Enzyme polymerase hoạt động, tổng hợp DNA (720C, 30s – vài phút)- Chu kỳ 3 bước lặp lại nhiều lần, sau 30-40 chu kỳ sẽ tạo ra 106 bản sao

Sau phản ứng PCR, DNA được nhuộm bởi ethidium bromide, quan sát qua điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sat dưới tia UV

Bản điện di

Máy điện di đứng

Máy điện di ngang

Máy luân nhiệt (Máy PCR realtime)

- DNA polymerase: cần thiết để tổng hợp DNA

- DNA mạch khuộn: trình tự DNA mục tiêu đặc trưng cho vi sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố của vi sinh vật này

- Mồi: là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn

- Các loại nucleotid A, T, X, G; nước, dung dịch đệm, ion Mg2+

Các thành phần của phản ứng PCR

Quy trình thực hiện:

- Tăng sinh: vi sinh vật được nuôi cấy tăng

sinh trong môi trường chọn lọc (TSB) 10-

20 giờ

- Thu dịch nuôi cấy, tách chiết DNA vi sinh

vật

- Thực hiện phản ứng PCR

- Điện di trên gel agarose 1,5%, Đọc kết

quả trên đèn UV

LOCAD-PTS reader [left] and swabbing unit [right]

ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)

ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)

Điện di đứng

Điện di ngang

ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)

ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)

ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS)