Vybrané metody ACh

Vybrané metody Vybrané metody AChACh

KAPALINOVÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIECHROMATOGRAFIE

Kapalinová Kapalinová chromatografie (LC)chromatografie (LC) Nejdéle známá chromatografická Nejdéle známá chromatografická

metoda (Cvět). Téměř 80% metoda (Cvět). Téměř 80% známých látek lze analyzovat známých látek lze analyzovat pomocí LC (iontové, polární i pomocí LC (iontové, polární i nepolární, mol.hm. 5-10nepolární, mol.hm. 5-1066)) Papírová chromatografie (PC)Papírová chromatografie (PC) je je

starší technika a byla postupně starší technika a byla postupně nahrazena nahrazena tenkovrstevnou tenkovrstevnou chromatografií (TLC).chromatografií (TLC).

Pro obě techniky je stacionární fáze Pro obě techniky je stacionární fáze umístěna v ploše. V případě PC je umístěna v ploše. V případě PC je tvořena speciálním papírem, u TLC tvořena speciálním papírem, u TLC tenkou vrstvou fáze na desce (sklo, tenkou vrstvou fáze na desce (sklo, hliníková či plastová folie)hliníková či plastová folie)

PC a TLC – stacionární fázePC a TLC – stacionární fáze V PC je stacionární fází voda V PC je stacionární fází voda

sorbovaná na papířesorbovaná na papíře V TLC stejné materiály jako v kolonové V TLC stejné materiály jako v kolonové

chromatografiichromatografii Pro lipofilní – adsorbenty oxid hlinitý Pro lipofilní – adsorbenty oxid hlinitý

(alumina), silikagel, polyamid, (alumina), silikagel, polyamid, acetylovaná celulózaacetylovaná celulóza

Pro hydrofilní – celulóza, měniče iontů, Pro hydrofilní – celulóza, měniče iontů, křemelina, polyamidy a chemicky vázané křemelina, polyamidy a chemicky vázané fázefáze

Desky pro TLC lze připravit v Desky pro TLC lze připravit v laboratoři, přednost se dává komerčně laboratoři, přednost se dává komerčně připraveným deskám pro klasickou připraveným deskám pro klasickou TLC, HPTLC či preparativní TLCTLC, HPTLC či preparativní TLC

PC a TLC – stacionární fázePC a TLC – stacionární fáze Vrstva fáze (0,1 -0,5 mm pro analytické a Vrstva fáze (0,1 -0,5 mm pro analytické a

0,5 -2,0 pro preparativní účely)je 0,5 -2,0 pro preparativní účely)je nanesena na skleněné, hliníkové nebo nanesena na skleněné, hliníkové nebo plastové desce. plastové desce. Přilnavost k desce se zvyšuje přídavkem pojiva Přilnavost k desce se zvyšuje přídavkem pojiva

0,1-10% (sádra, škrob, polyakrylová kyselina a 0,1-10% (sádra, škrob, polyakrylová kyselina a její soli)její soli)

Pro snadnější vizualizaci skvrn se často Pro snadnější vizualizaci skvrn se často přidává fluorescenční indikátor např. přidává fluorescenční indikátor např. aktivovaný křemičitan hořečnatý o stejném aktivovaný křemičitan hořečnatý o stejném zrnění (analyt zháší fluorescenci)zrnění (analyt zháší fluorescenci)

Někdy stacionární fázi na desce předchází Někdy stacionární fázi na desce předchází tzv. koncentrační zóna (2-3cm) tvořená tzv. koncentrační zóna (2-3cm) tvořená inertním sorbenteminertním sorbentem

Pro HPTLC se používají menší sférické Pro HPTLC se používají menší sférické částice (2-10částice (2-10μμm)s jednotnou velikostí m)s jednotnou velikostí nebo monolitické ultratenké vrstvy – nebo monolitické ultratenké vrstvy – vysoká účinnost, délku lze zkrátit na vysoká účinnost, délku lze zkrátit na několik cm, vyšší citlivost (pg)několik cm, vyšší citlivost (pg)

PC – mobilní fázePC – mobilní fáze

Jako mobilní fáze v PC se používají směsi Jako mobilní fáze v PC se používají směsi rozpouštědel v závislosti na struktuře rozpouštědel v závislosti na struktuře analytu.analytu. Pro polární látky se často používají směsi Pro polární látky se často používají směsi

butanol-kyselina octová (hydroxid amonný)-vodabutanol-kyselina octová (hydroxid amonný)-voda Pro středně polární butylacetát, Pro středně polární butylacetát,

diisopropylether, chloroform s malým diisopropylether, chloroform s malým přídavkem polárních rozpouštědel a vodypřídavkem polárních rozpouštědel a vody

Pro zcela nepolární látky papír impregnovaný Pro zcela nepolární látky papír impregnovaný parafinovým olejem a vodné roztoky alkoholů parafinovým olejem a vodné roztoky alkoholů nasycené stacionární fází jako mobilní fáze (RP-nasycené stacionární fází jako mobilní fáze (RP-PC).PC).

TLC – mobilní fázeTLC – mobilní fáze

O volbě mobilní fáze v TLC O volbě mobilní fáze v TLC rozhoduje použitá stacionární fázerozhoduje použitá stacionární fáze Pro dělení na adsorpčním principu a Pro dělení na adsorpčním principu a

chemicky vázaných fázích se volí chemicky vázaných fázích se volí rozpouštědla podle eluční schopnosti – rozpouštědla podle eluční schopnosti – eluotropní řadyeluotropní řady (n-pentan ,……., voda) (n-pentan ,……., voda)

Pro měniče iontů elektrolytyPro měniče iontů elektrolyty Pro gely voda nebo organická Pro gely voda nebo organická

rozpouštědlarozpouštědla

PC a TLC - vyvíjeníPC a TLC - vyvíjení Vzorek se nanese ve formě malých Vzorek se nanese ve formě malých

skvrn na skvrn na start start pomocí mikropipetky, pomocí mikropipetky, mikrostříkačky a nechá se mikrostříkačky a nechá se odpařit odpařit rozpouštědlorozpouštědlo

Uspořádání Uspořádání vzestupné, sestupnévzestupné, sestupné (PC), (PC), kruhovékruhové v komoře nasycené parami v komoře nasycené parami rozpouštědel – rozpouštědlo vzlíná rozpouštědel – rozpouštědlo vzlíná kapilárními silami. V HPTCL deska v kapilárními silami. V HPTCL deska v hermetické „komoře“ s kontrolovaným hermetické „komoře“ s kontrolovaným přetlakempřetlakem

VyvíjeníVyvíjení jednoduchéjednoduché (v jedné soustavě) (v jedné soustavě) vícenásobnévícenásobné – aplikují se různé mobilní – aplikují se různé mobilní

fáze, na čele nové mobilní fáze dojde k fáze, na čele nové mobilní fáze dojde k zakoncentrovánízakoncentrování

dvojrozměrnédvojrozměrné – skvrna se vyvine v jednom – skvrna se vyvine v jednom směru, deska se vysuší a otočí o 90° a vyvíjí směru, deska se vysuší a otočí o 90° a vyvíjí se v jiné soustavěse v jiné soustavě

PC a TLC – vyhodnocování PC a TLC – vyhodnocování kvalitykvality

Pokud nejsou dělené látky Pokud nejsou dělené látky barevné, je nutno skvrny barevné, je nutno skvrny vizualizovat.vizualizovat. Postřik činidlem, nebo namočení do Postřik činidlem, nebo namočení do

roztoku který poskytuje barevnou roztoku který poskytuje barevnou reakci (nespecifická – páry jódu, konc. reakci (nespecifická – páry jódu, konc. kyselina sírová, acidobazické kyselina sírová, acidobazické indikátory pro kyseliny a zásady, indikátory pro kyseliny a zásady, specifická pro funkční skupiny)specifická pro funkční skupiny)

Pozorování v UV záření – fluorescence Pozorování v UV záření – fluorescence či její zhášení na deskách s či její zhášení na deskách s indikátorem (254 nebo 366nm)indikátorem (254 nebo 366nm)

Základní veličina, která Základní veličina, která charakterizuje polohu charakterizuje polohu separovaných zón je separovaných zón je retardační retardační faktor Rfaktor RF F definovaný jako poměr definovaný jako poměr vzdáleností, které urazil analyt dvzdáleností, které urazil analyt di i a čelo mobilní fáze da čelo mobilní fáze dmm

RRFF = = ddii/d/dmm= u= uii/u/umm = 1/(1+k) = 1/(1+k)u – příslušné rychlosti, k- retenční u – příslušné rychlosti, k- retenční faktorfaktor

PC a TLC – vyhodnocování PC a TLC – vyhodnocování kvalitykvality

Hodnota RHodnota RFF se pohybuje od 0 (látka nemigruje) do se pohybuje od 0 (látka nemigruje) do 1 (látka není zadržována a migruje s čelem 1 (látka není zadržována a migruje s čelem rozpouštědla)rozpouštědla)

Hodnoty RHodnoty RFF jsou špatně reprodukovatelné jsou špatně reprodukovatelné Stacionární, mobilní fáze a páry nejsou v rovnovázeStacionární, mobilní fáze a páry nejsou v rovnováze Kapilární síly záleží na průměru kanálků – průtok není Kapilární síly záleží na průměru kanálků – průtok není

konstantníkonstantní

Látky se v PC a TLC vyhodnocují na základě RLátky se v PC a TLC vyhodnocují na základě RFF hodnot a jejich shodě se standardyhodnot a jejich shodě se standardy

Využívají se také hodnoty RVyužívají se také hodnoty RMM definované definované

RRMM = log = log[[(1/R(1/RFF)-1)-1 ] ]= log k= log k

hodnoty Rhodnoty RMM souvisejí se strukturou, v souvisejí se strukturou, v homologických řadách závisí lineárně na počtu homologických řadách závisí lineárně na počtu strukturních jednotekstrukturních jednotek

Pro kruhové vyvíjení platí RPro kruhové vyvíjení platí RF,lineární F,lineární =R=R22F,kruhovýF,kruhový..

PC a TLC – vyhodnocování PC a TLC – vyhodnocování kvantitykvantity Metody příméMetody přímé

Měření plochy skvrny – Měření plochy skvrny – logaritmus plochy je úměrný logaritmus plochy je úměrný koncentracikoncentraci

Radiochemické metody – Radiochemické metody – radioaktivně značené látkyradioaktivně značené látky

Denzitometrie – nejběžnější a Denzitometrie – nejběžnější a nejpřesnější – skenovací nejpřesnější – skenovací fotodenzitometry převádějí fotodenzitometry převádějí intenzitu skvrn na intenzitu skvrn na chromatogram s píky, jejichž chromatogram s píky, jejichž plocha je úměrná množství plocha je úměrná množství analytuanalytu

Nepřímá metoda – skvrna se Nepřímá metoda – skvrna se vystřihne či vyškrábe a vystřihne či vyškrábe a extrahuje a stanoví se extrahuje a stanoví se koncentrace koncentrace

Kolonová LCKolonová LC V klasickém provedení v kolonách 500 x V klasickém provedení v kolonách 500 x

10mm, částice 0,05-1,0 mm + hydrostatický 10mm, částice 0,05-1,0 mm + hydrostatický tlak – málo účinné, dlouhá doba analýzy tlak – málo účinné, dlouhá doba analýzy (hodiny) – dodnes pro preparativní a (hodiny) – dodnes pro preparativní a jednoduchá děleníjednoduchá dělení

HPLC se vyvinula z GC na počátku 70. let. HPLC se vyvinula z GC na počátku 70. let. Vysoké účinnosti se dosahujeVysoké účinnosti se dosahuje

Použitím malých částic (2-7Použitím malých částic (2-7μμm) pravidelného m) pravidelného tvaru a jednotné velikostitvaru a jednotné velikosti

Průtok mobilní fáze musí být zajištěn vysokým Průtok mobilní fáze musí být zajištěn vysokým tlakem (jednotky – desítky MPa)tlakem (jednotky – desítky MPa)

Lze zpracovávat malá množství (Lze zpracovávat malá množství (μμl)l) Potřeba citlivých detektorůPotřeba citlivých detektorů

náročná instrumentacenáročná instrumentace

Srovnání GC x HPLCSrovnání GC x HPLC

RozdílyRozdíly Podstatně menší částice (dPodstatně menší částice (dpp) – ) –

GC 0,1-0,3 mm x HPLC 0,01 – GC 0,1-0,3 mm x HPLC 0,01 – 0,003 mm0,003 mm

Podstatně vyšší viskozita a Podstatně vyšší viskozita a hustota mobilní fáze (Dhustota mobilní fáze (Dmm))

Aby bylo možno srovnávat Aby bylo možno srovnávat zavedeny redukované zavedeny redukované veličinyveličiny

mp

p

Ddu

dHh

/.

/

Kolony HPLCKolony HPLC Tradiční analytické náplňové kolony Tradiční analytické náplňové kolony

délka 5-25 cm, délka 5-25 cm, vnitřní průměr několik mm,vnitřní průměr několik mm, průtok mobilní fáze cca 1ml/minprůtok mobilní fáze cca 1ml/min objem vzorku 1-20 objem vzorku 1-20 μμll částice náplně 5-10 částice náplně 5-10 μμm, kulovitého tvarum, kulovitého tvaru

Během používání při vysokých tlacích se Během používání při vysokých tlacích se náplň sesedánáplň sesedá

Mikronáplňové Mikronáplňové vnitřní průměr 1 mm a menšívnitřní průměr 1 mm a menší částice 2-3 částice 2-3 μμm m Objem vzorku cca 1 Objem vzorku cca 1 μμll průtok mobilní fáze desítky průtok mobilní fáze desítky μμl/minl/min

Lze ještě používat běžnou instrumentaciLze ještě používat běžnou instrumentaci

Kolony HPLCKolony HPLC Kapilární náplňovéKapilární náplňové

Vnitřní průměr 0,15 – 0,5 Vnitřní průměr 0,15 – 0,5 mmmm

Částice 2 Částice 2 μμm a menším a menší Průtok mobilní fáze 1-15 Průtok mobilní fáze 1-15

μμl/minl/min KapilárníKapilární

Vnitřní průměr 10 Vnitřní průměr 10 μμm m Průtok mobilní fáze cca 1 Průtok mobilní fáze cca 1

ml/minml/min

Vyžadují speciální Vyžadují speciální instrumentaci (čerpadla, nl-instrumentaci (čerpadla, nl-dávkovače, detektory)dávkovače, detektory)

Čipová instrumentace Čipová instrumentace (celý kapalinový (celý kapalinový chromatograf na čipu) – chromatograf na čipu) – není dosud komerčně není dosud komerčně dostupnádostupná

Monolitické kolonyMonolitické kolony Kompaktnější náplň než klasické náplňové Kompaktnější náplň než klasické náplňové

kolonykolony Kolona je vyplněna polymerem organického Kolona je vyplněna polymerem organického

či anorganického původu o definované či anorganického původu o definované pórovitosti, který se vytvoří přímo v koloně pórovitosti, který se vytvoří přímo v koloně vhodnou polymerační reakcí v roztokuvhodnou polymerační reakcí v roztoku

Monolitické kolony na bázi silikagelu mají Monolitické kolony na bázi silikagelu mají vysokou pórovitost, která dovoluje vysoké vysokou pórovitost, která dovoluje vysoké průtoky a velký povrch pro interakce s průtoky a velký povrch pro interakce s analytyanalyty

Monolitické kolony mají větší životnost, Monolitické kolony mají větší životnost, velkou mechanickou stabilitu, jsou odolnější velkou mechanickou stabilitu, jsou odolnější ke změnám pH a vykazují vysoké účinnosti ke změnám pH a vykazují vysoké účinnosti při velkých průtocích mobilní fázepři velkých průtocích mobilní fáze

Separační principy v LCSeparační principy v LC Adsorpční chromatografie s Adsorpční chromatografie s

polárními sorbenty a polárními sorbenty a nepolárními mobilními nepolárními mobilními fázemi je historicky fázemi je historicky nejstarší – systém s nejstarší – systém s normálními fázeminormálními fázemi Analyt soutěží o aktivní místa Analyt soutěží o aktivní místa

na povrchu adsorbentu s na povrchu adsorbentu s mobilní fázímobilní fází

Fyzikální adsorpce je Fyzikální adsorpce je charakterizována slabšími charakterizována slabšími interakčními silamiinterakčními silami

Chemisorpce je nežádoucíChemisorpce je nežádoucí Silněji se sorbují polární látkySilněji se sorbují polární látky Sorpce je podporována Sorpce je podporována

nepolární mobilní fázínepolární mobilní fází

LSCLSC Při velkém zředění solutu lze adsorpční děj Při velkém zředění solutu lze adsorpční děj

popsat lineární izotermou danou Henryho popsat lineární izotermou danou Henryho zákonem, při vyšších koncentracích zákonem, při vyšších koncentracích (preparativní HPLC) sorpčními izotemami(preparativní HPLC) sorpčními izotemami Silikagel-polární sorbent (silanolové skupiny –Silikagel-polární sorbent (silanolové skupiny –

SiOH) , siloxanové (Si-O-Si) jsou nežádoucí. SiOH) , siloxanové (Si-O-Si) jsou nežádoucí. Stabilní při pH 2-8Stabilní při pH 2-8

Alumina – stabilnější v alkalickém prostředí (pH Alumina – stabilnější v alkalickém prostředí (pH 2-12), vhodná pro látky bazického charakteru2-12), vhodná pro látky bazického charakteru

Adsorbenty na bázi organických polymerůAdsorbenty na bázi organických polymerů Mobilní fáze nepolární rozpouštědla Mobilní fáze nepolární rozpouštědla

(hexan, heptan,..) s malým množstvím (do (hexan, heptan,..) s malým množstvím (do 1%) modifikátoru (voda, alkoholy, 1%) modifikátoru (voda, alkoholy, acetonitril, tetrahydrofuran)acetonitril, tetrahydrofuran)

Vhodná pro separaci látek lišících se Vhodná pro separaci látek lišících se funkčními skupinami a izomerů. Nevhodná funkčními skupinami a izomerů. Nevhodná pro dělení v homologických řadách.pro dělení v homologických řadách.

LC na chemicky vázaných LC na chemicky vázaných fázíchfázích

Chemicky vázané fáze (hlavně nepolární-Chemicky vázané fáze (hlavně nepolární-reverzní) v součastné době nejpoužívanějšíreverzní) v součastné době nejpoužívanější Umožňují aplikace pro analyty s širokým rozsahem Umožňují aplikace pro analyty s širokým rozsahem

polarity (80% všech aplikací)polarity (80% všech aplikací) Široký sortiment fázíŠiroký sortiment fází Levné mobilní fáze a rychlé ustavování rovnováhyLevné mobilní fáze a rychlé ustavování rovnováhy Reverzní chromatografie je jednodušší, rychlejší a Reverzní chromatografie je jednodušší, rychlejší a

reprodukovatelnějšíreprodukovatelnější RP – umožňují přímé aplikace na biologické vzorky RP – umožňují přímé aplikace na biologické vzorky

(vodné roztoky)(vodné roztoky) NevýhodyNevýhody

Složitý retenční mechanizmusSložitý retenční mechanizmus Chemicky vázané fáze na silikagelu jsou stabilní v Chemicky vázané fáze na silikagelu jsou stabilní v

omezeném rozsahu pH (2,5-8)omezeném rozsahu pH (2,5-8) Přítomnost nezreagovaných silanolových skupin Přítomnost nezreagovaných silanolových skupin

vede k nežádoucí adsorpci a je příčinou vede k nežádoucí adsorpci a je příčinou kompllikovaného mechanizmukompllikovaného mechanizmu


Silikagel je nejběžnějším nosičem Silikagel je nejběžnějším nosičem pro chemicky vázané fáze – pro chemicky vázané fáze – obsahuje silanolové skupiny, ve obsahuje silanolové skupiny, ve kterých může být aktivní vodík kterých může být aktivní vodík snadno nahrazen různými snadno nahrazen různými funkčními skupinami –R. Většina funkčními skupinami –R. Většina fází je siloxanového typu Si-O-Si-fází je siloxanového typu Si-O-Si-RR

Reakcí s monochlororganosilany Reakcí s monochlororganosilany vznikají fáze s monomolekulární vznikají fáze s monomolekulární vrstvou vázané fáze, zatímco vrstvou vázané fáze, zatímco reakcí s di- a trichlorsilany reakcí s di- a trichlorsilany dochází k sesíťování a vzniku dochází k sesíťování a vzniku polymerní vrstvypolymerní vrstvy

v poslední době se používají i jiné v poslední době se používají i jiné materiály jako oxid zirkoničitý a materiály jako oxid zirkoničitý a titaničitý, které jsou stálé v širším titaničitý, které jsou stálé v širším rozsahu pHrozsahu pH

Lze použít i polymerní nosiče, Lze použít i polymerní nosiče, které jsou stálé v širokém rozsahu které jsou stálé v širokém rozsahu pH, neobsahují zbytkové aktivní pH, neobsahují zbytkové aktivní skupiny, ale mohou uplatňovat skupiny, ale mohou uplatňovat hydrofobní a vylučovací efektyhydrofobní a vylučovací efekty


RP – reversní fáze, NP – normální fázeRP – reversní fáze, NP – normální fázeSEC – vylučovací chromatografieSEC – vylučovací chromatografie


Mechanizmus separace na reversních chemicky Mechanizmus separace na reversních chemicky vázaných fázích je kombinací tří interakcívázaných fázích je kombinací tří interakcí Interakce solutu s mobilní fází (vodou) – rozhodujícíInterakce solutu s mobilní fází (vodou) – rozhodující

Přídavkem organických rozpouštědel povrchové napětí vody Přídavkem organických rozpouštědel povrchové napětí vody klesá a klesá i retenceklesá a klesá i retence

Přídavkem solí povrchové napětí roste a zvyšuje se i retencePřídavkem solí povrchové napětí roste a zvyšuje se i retence Interakce mobilní fáze se stacionární fází - při větším Interakce mobilní fáze se stacionární fází - při větším

obsahu organického rozpouštědla (nad 50%)jsou alkyly obsahu organického rozpouštědla (nad 50%)jsou alkyly solvatovány a slut reaguje s celým řetězcemsolvatovány a slut reaguje s celým řetězcem

Rozdělování solutu mezi mobilní a stacionární fázi – Rozdělování solutu mezi mobilní a stacionární fázi – retence roste s množstvím vázaného uhlíku (10-60%) a retence roste s množstvím vázaného uhlíku (10-60%) a délkou řetězcedélkou řetězce

Nejpoužívanější je oktadecylová fáze (RP C-18)Nejpoužívanější je oktadecylová fáze (RP C-18) Lze separovat nepolární látky (voda + organická Lze separovat nepolární látky (voda + organická

rozpouštědla)rozpouštědla) Látky polarizovatelné a slabé kyseliny a báze (potlačit Látky polarizovatelné a slabé kyseliny a báze (potlačit

disociaci volbou pH)disociaci volbou pH) Látky iontového charakteru, přidáme li do mobilní fáze Látky iontového charakteru, přidáme li do mobilní fáze

iontově párové činidlo s opačným nábolem (laurylsulfát, iontově párové činidlo s opačným nábolem (laurylsulfát, tetraalkylamonné soli,..) – tvorba asociátu – tetraalkylamonné soli,..) – tvorba asociátu – iontově iontově párová chromatografiepárová chromatografie

Iontově výměnná Iontově výměnná chromatografiechromatografie

Jako stacionární fáze se používají Jako stacionární fáze se používají organické polymery organické polymery materiály na bázi silikagelu – jsou účinnější, materiály na bázi silikagelu – jsou účinnější,

rychleji se ustavuje rovnováha, umožňují práci rychleji se ustavuje rovnováha, umožňují práci s gradientovou elucís gradientovou elucí

Využívají s následující funkční skupinyVyužívají s následující funkční skupiny Karboxylová (-COOH) – slabý měnič kationtůKarboxylová (-COOH) – slabý měnič kationtů Sulfoskupiny (-SOSulfoskupiny (-SO33H) – silný měnič kationtůH) – silný měnič kationtů Aminoskupina (-NHAminoskupina (-NH22) – slabý měnič aniontů) – slabý měnič aniontů Tetraalkylamoniová (-NTetraalkylamoniová (-N++(R)(R)33) – silný měnič ) – silný měnič

aniontůaniontů Jako mobilní fáze se používají vodné Jako mobilní fáze se používají vodné

tlumivé roztoky, jejichž ionty jsou v tlumivé roztoky, jejichž ionty jsou v dynamické rovnováze s ionty měniče – čím dynamické rovnováze s ionty měniče – čím větší koncentrace, tím rychlejší elucevětší koncentrace, tím rychlejší eluce

Iontově výměnná Iontově výměnná chromatografiechromatografie Retenci lze ovlivňovatRetenci lze ovlivňovat

Koncentrací solíKoncentrací solí Hodnotou pHHodnotou pH TeplotouTeplotou Přídavkem organického modifikátoruPřídavkem organického modifikátoru

Používá se pro Používá se pro látky iontové povahy – silné i slabé elektrolytylátky iontové povahy – silné i slabé elektrolyty Aminokyseliny – fáze ze silného katexu a C-18Aminokyseliny – fáze ze silného katexu a C-18 Pro čištění peptidů a proteinůPro čištění peptidů a proteinů některé neutrální látky lze převést na nabité ionty některé neutrální látky lze převést na nabité ionty

(komplexy diolů a cukrů s kyselinou boritou)(komplexy diolů a cukrů s kyselinou boritou) Speciální případ je Speciální případ je iontová chromatografieiontová chromatografie na na

silných katexech či anexech s vodivostní silných katexech či anexech s vodivostní detekcí. Aby byla detekce citlivá, je nutno detekcí. Aby byla detekce citlivá, je nutno potlačit vodivost mobilní fáze (uhličitany pro potlačit vodivost mobilní fáze (uhličitany pro anionty a HCl pro kationty). Před detektor je anionty a HCl pro kationty). Před detektor je zařazena potlačovací ionexová kolona zařazena potlačovací ionexová kolona opačného charakteru, která zamění opačného charakteru, která zamění disociovanou fázi za málo disociovanou- tedy disociovanou fázi za málo disociovanou- tedy málo vodivou.málo vodivou.

Vylučovací chromatografie Vylučovací chromatografie (SEC, GPC)(SEC, GPC)

Molekuly se dělí podle své velikosti na Molekuly se dělí podle své velikosti na základě základě vylučovacíhovylučovacího nebo nebo síťového síťového efektuefektu

Rozhodující úlohu hraje velikost a tvar Rozhodující úlohu hraje velikost a tvar solutu a velikost a tvar pórů stacionární solutu a velikost a tvar pórů stacionární fáze (gelu)fáze (gelu)

Jiné symboly pro retenční charakteristikyJiné symboly pro retenční charakteristiky VVii – objem mobilní fáze uvnitř pórů – objem mobilní fáze uvnitř pórů

stacionární fázestacionární fáze VV00 – objem mobilní fáze mezi částicemi – objem mobilní fáze mezi částicemi VVtt – celkový objem mobilní fáze v kolony – celkový objem mobilní fáze v kolony

VVtt = V = V00 + V + Vii Molekuly větší než objem pórů se Molekuly větší než objem pórů se

nedostanou do stacionární fáze a eluují v nedostanou do stacionární fáze a eluují v objemu Vobjemu VRR=V=V00

Malé molekuly, které mohou pronikat Malé molekuly, které mohou pronikat všemi póry eluují v celkovém objemu všemi póry eluují v celkovém objemu mobilní fáze Vmobilní fáze VRR=V=Vt.t.

Ostatní látky eluují v retenčním objemu Ostatní látky eluují v retenčním objemu VVR R (V (V 00<<VVRR<<VVtt))

Vylučovací chromatografie Vylučovací chromatografie (SEC, GPC)(SEC, GPC) Frakce objemu uvnitř pórů dosažitelná pro difúzi Frakce objemu uvnitř pórů dosažitelná pro difúzi

solutu se nazývá distribuční konstanta Ksolutu se nazývá distribuční konstanta K00

KK00 = (V = (VRR-V-V00)/V)/Vi i V VRR = V = V00 + K + K00VVii

Velké molekuly VVelké molekuly VRR = V = V00 a tedy K a tedy K00 = 0 = 0 malé molekuly Vmalé molekuly VRR= V= Vtt a K a K00 = 1 = 1 KK0 0 (0 – 1)(0 – 1)

Omezená separační kapacita (eluce mezi VOmezená separační kapacita (eluce mezi V00 a V a Vii). ). Pro dosažení vyšší účinnosti separace nutno použít Pro dosažení vyšší účinnosti separace nutno použít

dlouhé kolonydlouhé kolony V případě ideálního chování v SEC (o retenci V případě ideálního chování v SEC (o retenci

rozhoduje jen velikost a tvar pórů sttacionární fáze rozhoduje jen velikost a tvar pórů sttacionární fáze a analytu), je retenční čas (objem) přímo úměrný a analytu), je retenční čas (objem) přímo úměrný logaritmu molekulové hmotnosti Mlogaritmu molekulové hmotnosti Mrr

ttrr = a – b log M = a – b log Mrr a,b - konstantya,b - konstanty

Vylučovací chromatografie Vylučovací chromatografie (SEC, GPC)(SEC, GPC) V případě ideálního chování v V případě ideálního chování v

SEC (o retenci rozhoduje jen SEC (o retenci rozhoduje jen velikost a tvar pórů velikost a tvar pórů stacionární fáze a analytu), je stacionární fáze a analytu), je retenční čas (objem) přímo retenční čas (objem) přímo úměrný logaritmu molekulové úměrný logaritmu molekulové hmotnosti Mhmotnosti Mrr

ttrr = a – b log M = a – b log Mrr

a,b – konstantya,b – konstanty Odchylky od ideálního Odchylky od ideálního

chování jsou způsobeny chování jsou způsobeny interakcemi solutu se interakcemi solutu se stacionární fází (iontová stacionární fází (iontová výměna, adsorpce, solvofobní výměna, adsorpce, solvofobní interakce) Lze je někdy interakce) Lze je někdy eliminovat složením mobilní eliminovat složením mobilní fáze- přídavek organické fáze, fáze- přídavek organické fáze, solísolí


Stacionární fázeStacionární fáze V klasické gelové chromatografii se používají hydrofilní V klasické gelové chromatografii se používají hydrofilní

zesíťované agarosové a dextranové gely – bobtnají a jsou zesíťované agarosové a dextranové gely – bobtnají a jsou stlačitelné – nelze používat v HPLCstlačitelné – nelze používat v HPLC

Pro HPLC semirigidní a rigidní náplně na bázi styren-Pro HPLC semirigidní a rigidní náplně na bázi styren-divinylbenzenového kopolymeru nebo methakrylátových divinylbenzenového kopolymeru nebo methakrylátových polymerůpolymerů

Pro biopolymery – hydrofilní polymery nebo anorganické Pro biopolymery – hydrofilní polymery nebo anorganické stacionární fáze (porézní sklo, silikagel) – nebezpečí stacionární fáze (porézní sklo, silikagel) – nebezpečí adsorpce solutů a složek mobilní fázeadsorpce solutů a složek mobilní fáze

Mobilní fáze by neměla vykazovat interakce s Mobilní fáze by neměla vykazovat interakce s analyty ani stacionární fázíanalyty ani stacionární fází Musí rozpouštět analyty (vyšší pracovní teplota)Musí rozpouštět analyty (vyšší pracovní teplota) Musí dobře smáčet povrch stacionární fáze, ale nesmí s ní Musí dobře smáčet povrch stacionární fáze, ale nesmí s ní

interagovatinteragovat Nemá solvatovat soluty – zvýšení jejich zdánlivé Nemá solvatovat soluty – zvýšení jejich zdánlivé

molekulové hmotnostimolekulové hmotnosti Kompatibilní s detektorem (pro UV nelze používat Kompatibilní s detektorem (pro UV nelze používat

aromáty)aromáty)


SEC se využívá hlavně pro SEC se využívá hlavně pro vysokomolekulární látky v polymerní vysokomolekulární látky v polymerní chemii a biochemii s molekulovou chemii a biochemii s molekulovou hmotností nad 2 000.hmotností nad 2 000. Pro předseparaci komplexních vzorků Pro předseparaci komplexních vzorků

(štěpných produktů proteinů s tripsinem)(štěpných produktů proteinů s tripsinem) Oddělení nízkomolekulárních látek od Oddělení nízkomolekulárních látek od

vysokomolekulárních (gelová filtrace)vysokomolekulárních (gelová filtrace) Určení molekulové hmotnosti látek a její Určení molekulové hmotnosti látek a její

distribucedistribuce

Afinitní (biospecifická) Afinitní (biospecifická) chromatografiechromatografie

Je založena na silných Je založena na silných biospecifických interakcích analytů biospecifických interakcích analytů s komplementárními látkami s komplementárními látkami (ligandy) – interakce enzymů s (ligandy) – interakce enzymů s inhibitory, substráty,kofaktory či inhibitory, substráty,kofaktory či efektory, komplexy protilátek s efektory, komplexy protilátek s antigeny atd.antigeny atd.

Stacionární fáze- nosič s Stacionární fáze- nosič s kovalentně navázaným ligandem kovalentně navázaným ligandem (afinantem)(afinantem)

Na takovou fázi se ze vzorku zadrží Na takovou fázi se ze vzorku zadrží pouze látky s komplementární pouze látky s komplementární vazbou, ostatní se eluují s mrtvým vazbou, ostatní se eluují s mrtvým časemčasem

Analyt se z vazby na ligand uvolní Analyt se z vazby na ligand uvolní změnou pH, koncentrace solí, změnou pH, koncentrace solí, změnou teploty, přídavkem činidelzměnou teploty, přídavkem činidel

Volba separačního Volba separačního systémusystému

Instrumentace v HPLCInstrumentace v HPLC

ČerpadlaČerpadla

Pro kapilární kolony nl/min Pro kapilární kolony nl/min Pro mikronáplňové Pro mikronáplňové μμl/minl/min

ČerpadlaČerpadla

Pro běžné náplňové kolem 1ml/minPro běžné náplňové kolem 1ml/min Pro preparativní desítky ml/minPro preparativní desítky ml/min

Gradient mobilní fázeGradient mobilní fáze

Odplyněné mobilní fáze přes filtrOdplyněné mobilní fáze přes filtr Snížený tlakSnížený tlak UltrazvukUltrazvuk Probublávání heliemProbublávání heliem

DávkováníDávkování

Spektrofotometrické Spektrofotometrické detektorydetektory

Fluorescenční detektorFluorescenční detektor

Refraktometrický Refraktometrický detektordetektor

Refraktometrický Refraktometrický detektordetektor

Detektory pro HPLCDetektory pro HPLC Detektor založený na rozptylu světla s Detektor založený na rozptylu světla s

odpařením mobilní fáze (ELS – odpařením mobilní fáze (ELS – evaporative light scattering detektor) . evaporative light scattering detektor) . Použití je omezeno na netěkavé analyty a Použití je omezeno na netěkavé analyty a těkavé mobilní fáze – universální detektortěkavé mobilní fáze – universální detektor

Elektrochemické detektory (aminy, fenoly, Elektrochemické detektory (aminy, fenoly, …)…) Měření vodivosti pro iontové látkyMěření vodivosti pro iontové látky Měření elektrického proudu Měření elektrického proudu

elektrochemického děje (oxidace, redukce)elektrochemického děje (oxidace, redukce) Pracovní elektrody Pracovní elektrody

Ušlechtilý kov Au, PtUšlechtilý kov Au, Pt Různé formy uhlíku pro oxidaceRůzné formy uhlíku pro oxidace Rtuť a rtuťový film pro redukceRtuť a rtuťový film pro redukce

Spojení s AAS, IPC, Spojení s AAS, IPC, AESAES, NMR, , NMR, MSMS

Gradientová eluceGradientová eluce Během analýzy se mění složení mobilní fáze. Během analýzy se mění složení mobilní fáze.

Používá se pro vzorky s velkými rozdíly v Používá se pro vzorky s velkými rozdíly v retenčních faktorech (10 retenčních faktorech (10 << k k << 1) 1)

Documents

Vybrané metody ACh