乙蒜素亚砜抗真菌活性及机制研究复 旦 大 学 戚 飞 龙

（ 复 旦 大 学 药 学 院 ， 上 海 市 ， 200433 ）

指 导 教 师 ： 叶 丽 副 教 授 中 文 摘 要 ： 本 课 题 研 究 大 蒜 素 衍 生 物 乙 蒜 素 亚 砜 （ Allicin E ， ALE ） 抗 真 菌 活 性 并 与 天 然大 蒜 素 比 较 ， 进 一 步 探 索 其 作 用 机 制 ， 为 将 其 应 用 于 霉 菌 污 染 的 治 理 和 真 菌 感 染 的 防 治 奠 定理 论 与 实 验 基 础 。 采 用 生 长 速 率 法 、 扫 描 电 子 显 微 镜 、 XTT 比 色 法 研 究 乙 蒜 素 亚 砜 的 抗 霉 菌活 性 ； 采 用 活 性 氧 检 测 试 剂 盒 、 流 式 细 胞 术 、 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 以 及 FITC-VAD-FMK 检 测 试 剂盒 探 索 其 作 用 机 制 。 结 果 表 明 ALE 可 明 显 抑 制 真 菌 孢 子 萌 发 和 菌 丝 生 长 ， 导 致 孢 子 萎 缩 变 形 ，显 著 降 低 真 菌 的 细 胞 活 力 （ IC50 为 0.92 μg/ml ） ， 抗 真 菌 活 性 显 著 高 于 大 蒜 素 。 进 一 步 机 制 研究 表 明 ， ALE 诱 导 真 菌 细 胞 内 ROS 的 产 生 、 细 胞 凋 亡 以 及 Metacaspase 酶 活 性 的 增 强 。 因 此 ，ALE 通 过 激 发 霉 菌 胞 内 活 性 氧 的 产 生 并 诱 导 Metacaspase 依 赖 的 细 胞 凋 亡 ， 从 而 发 挥 优 良 的 抗 真菌 活 性 。 英 文 摘 要 ： S-ethyl ethanethiosulfinate (ALE) is a derivative of allicin synthesized in our laboratory. In this study, we

explored its antifungal activity and underlying mechanism. Observation through inverted microscope and scanning electron

microscope confirmed that ALE had an excellent capability of inhibiting spore germination and mycelial growth of Penicillium

chrysogenum. XTT assay indicated ALE could decrease cell viability and IC 50 was 0.92 μg/ml. ROS Assay Kit and flow cytometry

assay together with confocal immunofluorescence revealed ROS generation and metacaspase-dependent apoptosis triggered by

ALE. These results prove that ALE induces metacaspase-dependent apoptosis through ROS generation, thus performs an effective

antifungal activity. ALE might be developed as a potential alternative with high efficiency and low toxicity to conventional

fungicides for fungal contamination and infection.

关 键 词 ： 乙 蒜 素 亚 砜 ； 抗 真 菌 ； 活 性 氧 ； 凋 亡 ； Metacaspase

一、 引言霉 菌 污 染 是 古 文 物 保 护 和 粮 食 储 存 中 面 临 的 主 要 问 题 [1 ][2 ] 。 目 前 主 要 采 用 化 学 除 菌 法 ，

但 化 学 残 留 造 成 的 文 物 损 坏 和 对 人 体 健 康 的 威 胁 不 容 忽 视 [3 ] 。 故 安 全 有 效 的 防 霉 药 物 的开 发 是 文 物 保 护 与 粮 食 储 存 领 域 亟 待 解 决 的 问 题 。 与 此 同 时 ， 由 于 耐 药 性 的 存 在 ， 真 菌 感 染一 直 是 困 扰 着 医 学 界 的 难 题 [4 ] ， 随 着 广 谱 抗 生 素 、 免 疫 抑 制 剂 的 广 泛 应 用 ， 系 统 性 真 菌 感染 日 益 增 多 [5 ] 。 故 新 型 抗 真 菌 药 物 的 研 发 同 样 迫 在 眉 睫 。

由 于 天 然 产 物 具 有 高 效 低 毒 的 优 点 ， 许 多 研 究 者 开 始 着 眼 于 对 天 然 产 物 的 开 发 以 解 决 上述 问 题 。 大 蒜 素 是 从 大 蒜 鳞 茎 中 提 取 的 活 性 成 分 ， 对 真 菌 、 细 菌 以 及 寄 生 虫 均 具 有 较 强 的 抗性 [6 ] ， 且 结 构 新 颖 ， 不 易 产 生 耐 药 [7 ] 。 但 其 稳 定 性 差 ， 难 以 大 量 制备和 储 存 。 而 且最小抑 菌浓度较 大 ，严重限制了其 实际应 用 [8 ] 。 故 本 课 题 前期研 究 通 过改变 抗 菌 活 性 基团之外的 结 构合成了衍 生 物 乙 蒜 素 亚 砜 ， 以 解 决 其缺点 （图1 ） 。

作者简介：戚飞龙（1996-），男，安徽人，复旦大学药学专业本科生，研究方向为微生物与生化药学。1

图 1. 大 蒜 素 （ Allicin ） 与 乙 蒜 素 亚 砜 （ Allicin E ） 的 结 构该衍 生 物 保 留了抗 菌 活 性部位——硫代亚磺酸酯结 构 ， 实 验 表 明 其 具 有更强 的 抗 霉 菌 活

性 。 不含有双键， 稳 定 性好， 可规模化 生 产 ， 故 可 以 应 用 于 真 菌 感 染 的 防 治 。 且 ALE 易 挥 发无残 留使其能更好的 用 于 文 物 和 粮 食 的熏蒸防 霉处理 。 本 课 题 以 产黄青霉 菌 为模型 菌株，拟通 过 对 ALE 抗 霉 菌 活 性 和 机 制 的 研 究 ，掌握该衍 生 物 抗 真 菌 作 用 的规律， 为更好的利用 其众多 优 良特性 并推广到实际应 用 中 奠 定 理 论 和 实 验 基 础 。

二、 实验材料与方法（一）菌株

产黄青霉 Penicillium chrysogenum ATCC 10106 为 本 实 验室保 存 菌株。（二）实验方法

通 过 显 微 镜观察ALE 对青霉 菌 孢 子 萌 发 和 和 菌 丝 生 长 的影响， 采 用 扫 描 电 镜观察霉 菌 细胞 微观结 构 的改变 ， 然后通 过 XTT 比 色 法计算得到 IC50 。 采 用 流 式 细 胞仪检 测 细 胞 凋 亡 ， 活性 氧 试 剂 盒 检 测 ROS 水平，最后通 过 FITC-VAD-FMK 试 剂 盒 检 测 metacaspase 活 性 。

三、 实验结果（一）ALE 对孢子萌发和菌丝生长的影响

显 微 镜观察结 果 表 明 ， 大 蒜 素 AL 和 衍 生 物 ALE 对 孢 子 萌 发 和 菌 丝 生 长 均 有 抑 制 效 果 。ALE 低 剂 量组菌 丝 明 显 变少、 变短， 中等剂 量组则受到明 显 抑 制 ； 而 高 剂 量组完全被抑 制 。且 0.6 μg/ml 的 ALE 显示出比 25 μg/ml 的 AL 更强 的 抑 制 效 果 （图2 ） ， 表 明 ALE 具 有更好的抗 霉 菌 活 性 ， 且杀伤效 果呈剂 量 依 赖 性 。

图 2 （ 左 图 ） . 光 学 显 微 镜 观 察 大 蒜 素 AL 和 衍 生 物 ALE 对 青 霉 菌 形 态 的 影 响

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图 3 （ 右 图 ） . 扫 描 电 镜 观 察 ALE 对 青 霉 菌 形 态 的 影 响（二）扫描电镜观察 ALE 对青霉菌形态的影响

扫 描 电 镜 结 果 表 明 对照组菌 丝 生 长密集， 孢 子饱满圆滑。 而 0.5 μg/ml 的 ALE 给药组菌 丝几乎不 生 长 ， 孢 子 形态未发 生 明 显 变 化 。 1 μg/ml组菌 丝 生 长完全被抑 制 ， 孢 子 形态发 生 明 显改变 ，呈干瘪萎 缩状（图3 ） 。

（ 三 ） XTT 比 色 法 测 定 细 胞 活 力 与 IC50

XTT 比 色 法 结 果 表 明 霉 菌 活 力 均 随 着 AL 或ALE 剂 量 的 增加呈逐渐下降趋势， 大 蒜 素 的IC50 为 38.68 μg/ml ， 而 ALE 的 IC50 仅为 0.92 μg/ml （图4 ） ， 表 明 ALE 的 抗 霉 菌 活 性 显 著 高 于大 蒜 素 ， 为 其 42倍之多 。

图 4. XTT 比 色 法 测 定 AL 和 ALE 的 IC50

（ 四 ） ALE 诱 导 霉 菌 细 胞 内 活 性 氧 （ ROS ） 产生

活 性 氧 检 测 试 剂 盒 检 测 结 果 显示ALE 处理组ROS 水平显 著升高 ， 而加入抗 氧 化 剂 TOC后，ROS 水平明 显 降 低 （图5a ） ， 表 明 ALE 能够诱 导 胞 内 ROS 的 产 生 ， 且 诱 导 的 ROS 可被抗 氧 化剂 TOC所抑 制 。 激 光 共 聚 焦 显 微 镜观察表 明 ， 0.5 μg/ml ALE 处理后， 0 h 组细 胞 均未显示出红色荧光 ， 而 6 h 与 12 h 组则发出十分 微弱的荧光 ， 18 h 组红色荧光 明 显 增 多 ， 且 比 较 明亮；24 h 组细 胞红色荧光 较 18 h 组显 著 增 多 ，几乎所有 细 胞 均被标记为红色 ； 故 随 着 时间的延长 ，ALE 处理组的红色荧光逐渐增 强 ， 且被标记为红色 的 细 胞 比例逐渐增加，呈时间依 赖 性 ； 而加入TOC之后，几乎无荧光 产 生 （图5b ） 。该结 果 进 一 步 表 明 ALE 诱 导 霉 菌 胞 内 ROS 的 产 生 。XTT 比 色 实 验 结 果 显示加入抗 氧 化 剂 TOC后细 胞 活 力 明 显升高 （图5c ） ， 表 明 ROS 的清除能够明 显 提 高 细 胞 存 活 率 ，说明 ALE 通 过 诱 导 细 胞 产 生 ROS ， 进 而 导 致了霉 菌 细 胞 的死亡 。

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图 5. ALE 诱 导 霉 菌 胞 内 活 性 氧 （ ROS ） 的 产 生 ， ALE 或 ALE+TOC 处 理 后 ， (a)

DHR123 试 剂 盒 检 测 霉 菌 胞 内 ROS 水 平 ； (b) 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 ROS 荧 光 强 度（ 箭 头 所 示 红 色 荧 光 ） ； (c) XTT 比 色 法 检 测 细 胞 活 力

（ 五 ） ALE 诱 导 霉 菌 细 胞 凋 亡流 式 细 胞 检 测 表 明 ， 随 着 ALE 浓度的 增加， 霉 菌 细 胞 发 生早期凋 亡 和晚期凋 亡 的概率呈

整体 增 大 的趋势，尤其 是当浓度从 0 增至 0.25 μg/ml 时 ，总凋 亡 率 明 显 增 高 （图 6 ） ， 表 明ALE 能够显 著 提 高 霉 菌 凋 亡水平， 诱 导 霉 菌 细 胞 发 生 凋 亡 。

（ 六 ） ALE 诱 导 的 凋 亡 是 metacaspase 依 赖 的Caspase 是重要 的 凋 亡相关蛋白， 而 在 真 菌 细 胞 中则只存 在 同源类似物 metacaspase 。 激 光

共 聚 焦 显 微 镜观察结 果 显示， 实 验组绝大 多数细 胞被标记上 较 强 的绿色荧光 。 而加入抗 氧 化剂 TOC 组与空白对照组，几乎无细 胞 发出绿色荧光 （图 7 ） 。 此 结 果 提示ALE 能显 著 激 活matacaspase 的 活 性 ， 表 明 ALE 通 过 激 发 霉 菌 胞 内 ROS 的 产 生 ， 进 而 诱 导 霉 菌 产 生 metacaspase

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依 赖 的 凋 亡 。 图 6 （ 左 图 ） . ALE 诱 导 霉 菌 凋 亡 , 霉 菌 经 ALE 处 理 后 ， 采 用 流 式 细 胞 仪 检

测 凋 亡 水 平 图 7 （ 右 图 ） . ALE诱 导 metacaspase 酶 活 性 增 强 ， 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 荧 光 强

度 （ 箭 头 所 示 绿 色 荧 光 ）四、 讨论

研 究 表 明 大 蒜 素 对 真 菌 具 有很强 的 抑 制 作 用 ， 可 用 于 真 菌 感 染 的 防 治 [9 ] 。 且 其 对植物种子也具 有很好的 保 护 作 用 [10 ] ， 故亦可被应 用 于 粮 食 的 储 存 。 但 大 蒜 素含有双键， 易被各种氧 化 剂 氧 化失去活 性 ， 且 存 在最小抑 菌浓度较 大 的缺点 。 因 此 化 学合成 稳 定 的 抗 菌 效 果更强 的 衍 生 物 并 应 用 于 真 菌 感 染 ， 粮 食 的 储 存 上很可能是今后大 蒜 素 的 研 究趋势。 故 率先使用高 活 性 的 衍 生 物 ALE 是 本 课 题 的 一 大亮点 与创新 点 。该衍 生 物能高 效地抑 制 并杀死真 菌 ， 而古 文 物 的 发 霉 损 坏正是 由 霉 菌所导 致 的 ，加之易 挥 发 性 ，使得ALE 能够很好地应 用 于 文 物 的熏蒸。 因 此 将 衍 生 物 ALE 用 于 古 文 物 的 保 护 具 有十分重要 的 开创性意义。

孢 子 的 萌 发 和 菌 丝 生 长 是 真 菌侵染 的先决条件， 故 抑 制 真 菌 效 果最直接的 指标是观察药物 对 孢 子 萌 发 和 菌 丝 生 长 的影响。 光 学 显 微 镜观察， 发现ALE 能够显 著 抑 制 孢 子 萌 发 和 菌 丝生 长 ，极低浓度即可 产 生更好的 抑 菌 效 果 。 扫 描 电 镜 从 微观层面 表 明 ALE 能够改变 孢 子 形态，导 致 孢 子 萎 缩 变 形 。 测 定 表 明 ALE 的 IC50 远低 于 大 蒜 素 。 以 上 实 验 结 果 表 明 ALE 的 抗 霉 菌 作用 优 于 大 蒜 素 ， 但 其 抗 菌 的 机 制仍需进行深入研 究 。

文献表 明 ， 许 多 抗 真 菌 药 物 通 过 诱 导 ROS 的 产 生 引 发 真 菌 细 胞 凋 亡 [11 ] 。 本 实 验 结 果 表明 ， ALE 显 著 诱 导 霉 菌 细 胞 内 ROS 的 产 生 ， 且 同 样能够诱 导 霉 菌 凋 亡 。 有 研 究证实哺乳动物细 胞 内 ROS 的 产 生能够诱 导 依 赖 于 caspase 的 凋 亡 ， 而 在 真 菌 细 胞 中只存 在 同源类似物metacaspase ， 大部分 凋 亡 是 由 其被激 活 而 引起的 。 检 测 结 果 显示ALE 确实 引起了metacaspase

活 化 ， 表 明 ALE 诱 导 的 凋 亡 是 一种metacaspase 活 性 依 赖 的 凋 亡 ， 而 抗 氧 化 剂 可 以消除 ALE 诱导 的 metacaspase 的 活 化 。综合上 述 结 果 ，我们可 以得出结 论 ： ALE 通 过 激 发 霉 菌 胞 内 ROS 产生 ， 诱 导 metacaspase 依 赖 的 细 胞 凋 亡 ， 从 而 发 挥 优 良 的 抗 真 菌 活 性 （图8 ） 。

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图 8. ALE 诱导真菌细胞凋亡的信号通路图综上所述，ALE 在真菌感染的防治与古文物的保护以及粮食的储存方面潜力巨大。本研究在证实

ALE 具有远高于天然大蒜素抗真菌活性的基础上，探索其抗霉菌作用机制，为更好的利用其众多优良特性并将其推广到实际应用，特别是古文物的保护与粮食食品的储存以及真菌感染的防治奠定理论和实验基础。参考文献：

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