UNIVERSIDAD DE CHILEFACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE QUIMICALABORATORIO DE BIOORGANICA

Unidad de Investigación

“Caracterización de las oxidasas de Giberelinas en cepas de Fusarium konzum”

Alumna: María Teresa Cortés Fuentealba.Docente: Dra. María Cecilia Rojas Garrido.

Santiago, 2006

Introducción

Las giberelinas (GAs) corresponden a ácidos carboxílicos diterpenoides tetracíclicos presentes en plantas y en algunos hongos (Fig.1A; MacMillan, 1997).En las plantas superiores son fitohormonas, y en los hongos son metabolitos secundarios por lo que son utilizados para aplicaciones agrónomicas (Fig.2). El hongo productor de GAs más conocido es Fusarium fujikuroi, patógeno del arroz, que causa la enfermedad de la superelongación de los tallos, o “bakanae” (Phinney et al., 1983). Este hongo produce principalmente GA3 (ácido giberélico), giberelina lactónica e hidroxilada en las posiciones 3 y 13 (fig. 1C).

A)

Fig.1.Estructura de las giberelinas A). Giberelinas C20 y numeración del esqueleto del ent-giberelano. B) y C) Algunas giberelinas biológicamente activas (C19).

Fig. 2. Efecto del ácido giberélico sobre el crecimiento de bayas de uva de la variedad Thompson Seedless. Izquierda: uvas no tratadas. Derecha: tratadas con GA3

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B) C)

El hongo F.fujikuroi pertenece a un gran complejo de especies denominado Gibberella fujikuroi, que comprende al menos nueve especies sexualmente fértiles distintas, denominadas poblaciones de apareamiento (MPs, A-I) (Malonk et al., 2005). Estas especies producen variados metabolitos secundarios y son patógenos para distintos cultivos como el maíz (Leslie et al., 1990), el mango (Varma et al., 1974), el pino (Correll et al., 1992) y el arroz (Leslie, 1995) entre otros. De estas nueve especies, sólo F.fujikuroi, que corresponde a la población de apareamiento C (MP-C) algunas cepas estudiadas de Fusarium konzum (MP-I), la cepa I3, son capaces de producir giberelinas (Malonek et al., 2005). Los patrones de GAs en estas especies son distintos, produciendo la cepa I3 principalmente GA1 además de GA3 (Fig. 1B y 1C).

En los últimos años se han aislado y caracterizado los genes y enzimas de la síntesis de GAs en F.fujikuroi lo que permitió estudiar en detalle las reacciones más relevantes de la secuencia y determinar cómo está estructurada a nivel molecular esta vía metabólica (Tudzynski y Holter, 1998; Tudzynski et al., 2001; Rojas et al., 2001; Tudzynski et al., 2002; Tudzynski et al., 2003; Rojas et al., 2004). Se ha encontrado que participan 7 enzimas, de las cuales 5 son oxidasas. De estas, 4 corresponden a monooxigenasas (MO) relacionadas con el citocromo P450 (P450-1, P450-2, P450-3 y P450-4). Un aspecto interesante de esta vía es el hecho de que varias enzimas son multifuncionales, actuando en varios pasos en la síntesis de GA3. Descrita brevemente, la vía consiste en la producción de geranigeranil difosfato (GGPP) a partir de farnesil difosfato por una GGPP sintasa especifica de la vía, este GGPP es luego tomado por una enzima bifuncional, ent-copalil difosfato sintasa / ent-kaureno sintasa, que transforma al GGPP en ent-kaureno. Este es transformado en ácido ent-kaurenoico en tres pasos de oxidación catalizados por la monooxigenasa P450-4, seguido por la transformación del ácido en GA14 por la monooxigenasa P450-1, esta cataliza 4 pasos secuenciales: la 7β- hidroxilación, la contracción del anillo B del ácido ent-kaurenoico por oxidación en C6, 3β- hidroxilación y oxidación en C7. P450-1 también es responsable de la síntesis de los productos laterales de la vía, los ácidos fujenoicos y los kaurenolidos. P450-2 remueve el C20 de GA14 en forma de CO2 para producir GA4, y luego una desaturasa transforma el GA4 en GA7 mediante la generación de un doble enlace en la posición 1,2. Finalmente, la monooxigenasa P450-3 cataliza la 13-hidroxilación del GA7 produciendo el ácido giberélico (GA3) (Fig. 3).

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Fig.3 Vía de síntesis de GA3 en F. fujikuroi. (Tomado de Malonek et al, 2005, Appl. Environ. Microbiol., 71, 6014.)

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Al analizar los genes que codifican para las enzimas de la ruta de síntesis de giberelinas en F.fujikuroi se observó que están agrupados en un “cluster” ubicado en un fragmento de 26 Kb del cromosoma IV del hongo (Tudzynski y Holter, 1998; Hedden et al., 2002). Siete genes codifican para las siete enzimas que catalizan 15 etapas específicas de la secuencia (Fig 4)

Fig.4 Mapa físico del cluster de genes de la biosíntesis de giberelinas (Tomado de Malonek et al, 2005)

Al estudiar la presencia de este cluster en las distintas poblaciones de apareamiento, se descubrió que todas las especies del complejo poseen el cluster de genes, o bien parte de este (Malonek et al .2005).

A diferencia de F.fujikuroi, que infecta al arroz y que es de origen asiático, F. konzum es de origen americano, y fue aislado por primera vez desde césped nativo de Kansas (native prairie grasses). En gran parte de las cepas estudiadas de la MP-I el cluster esta presente pero sin el gen de la monooxigenasa P450-3. Estas cepas además no producen GAs, y no expresan los genes del cluster. La cepa I3 de F. konzum posee el cluster completo, incluyendo la P450-3, expresa los genes y sintetiza GAs, aunque produce principalmente GA1, GA3 y GA13, y una gran variedad de otras GAs no 3-hidroxiladas en menor proporción, como GA20, giberelina no encontrada en cultivos de F. fujikuroi. En este trabajo se inicio el estudio del metabolismo de GAs en distintas cepas de F.konzum utilizando precursores marcados con 14C .

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Objetivo

Estudiar el comportamiento funcional de las oxidasas de GAs en F.konsum en diversas cepas productoras y no productoras de GAs, mediante la metabolización de precursores de GAs, marcado isotopicamente con 14C por cultivos líquidos. Específicamente se investigarán las reacciones posteriores al GA12 aldehído (hidroxilación en 3β, oxidación en C20 y 13-hidroxilación).

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Materiales y Métodos.

Cultivos: Las cepas de F. konzum estudiadas fueron mantenidas en placas de agar papa dextrosa. Para los experimentos de metabolización se crecieron por 3 días en un medio líquido conteniendo 1,92 g/L de nitrato de amonio además de glucosa y sales (40% ICI, Geissman et al., 1966). La síntesis de giberelinas se indujo traspasando el cultivo a un medio con la misma composición pero carente de compuestos nitrogenados (0% ICI).

Metabolización de precursores marcados con carbono 14: Se agregaron entre 30000 y 150000 dpm de los precursores 14C-GA12 aldehído, 14C-GA12 14C-GA9 o 14C-GA4 a 5 mL de cultivo suspendido en medio 0% ICI (sin nitrógeno). Después de 3 días de metabolización a 30° C con agitación, se separó el micelio por filtración y las giberelinas se extrajeron con acetato de etilo después de acidificar el filtrado hasta pH 3,0. Las muestras se purificaron por cromatografía en fase sólida y se analizaron por HPLC.

Extracción de 14 C-GAs desde el filtrado de cultivo : El filtrado obtenido desde el micelio y lavarlo con H2O a pH 7,0 fue acidificado hasta pH 3,0 con HCL 2N. Las giberelinas se extrajeron por partición con acetato de etilo (1x 10 mL; 2x 5 mL). Las fases orgánicas combinadas fueron evaporadas a presión reducida en un Rotavapor R10 (Büchi) a 38˚ C y las GAs fueron disueltas en 2 mL de metanol al 20%. La muestra se aplicó en una columna de extracción en fase sólida C18 (Bakerbond,J.T. Baker) y se separaron los productos por HPLC.

Purificación de giberelinas marcadas con 14 C : Se utilizaron columnas de extracción en fase sólida C18 (Bakerbond,J.T. Baker) previamente activadas con metanol. Las columnas se equilibraron con 2 mL de agua acidificada a pH 3,0 antes de aplicar la muestra. Después de aplicar la muestra se lavó la columna con 2 mL de agua acidificada a pH 3,0 y finalmente las GAs se fluyeron con 2 mL de metanol. El eluido fue evaporado a presión reducida en un equipo SpeedVac plus SC110A (Termo Savant) o mediante flujo superficial de nitrógeno. Cromatografía líquida de alta resolución: Los productos de metabolización fueron separados por HPLC en una columna C18 mediante una gradiente lineal de 60-100% MeOH en H2O acidificada a pH 3 seguida por 15 min de flujo isocrático de MeOH 100%. Se colectaron fracciones de 1 mL y se determinó la radiactividad en el eluido mediante centelleo líquido y los productos se identificaron a través de su tiempo de retención, por comparación con GAs estándar.

Cuantificación de la radiactividad por centelleo líquido: La radiactividad de las muestras se cuantifico en el contador Tracor Analitic Delta 300. El líquido de centelleo contenía 0,125g de POPOP y 4g de PPO en 1 L de tolueno grado técnico. Esta mezcla se diluyó con 500 mL de Arcopal después de su disolución.

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Resultados y Discusiones.

- Metabolización de 14C-GA12-aldehído por F. konzum. En a) cepa I3 (productora de GAs), y b) cepa 10615 (no productora de GAs). Perfiles de HPLC, en una columna C18.

a)

b)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

Tiempo(minutos)

CPM

Se aprecian diferencias entre las distintas cepas de F.Konzum, tanto por la velocidad de conversión de 14C-GA12 aldehído, como en el producto en el que es convertido.

9

Tanto como para a) y b) 14C-GA12 aldehído es completamente metabolizado, también se puede decir que el tiempo de retención de GAs estándar para 14C-GA 14 está entre 14 a 15 minutos mientras que para 14C-GA4 es de 15 minutos, por lo que habría una mezcla de productos (14C-GA4 y/o 14C-GA14). Sin embargo, no se obtienen los productos finales de metabolización de la ruta biosintetica de F.fujikuroi: 14C-GA1 y 14C-GA3 (tiempo de retención estándar para 14C-GA1 y 14C-GA3 es de 7 a 8 minutos), esto podría deberse a que las enzimas desaturasa y P450-3 no están activas, por lo menos no a niveles detectables en estas cepas de F.konsum.

-Metabolización de 14C-GA12 por F. Konzum cepa I3 (cepa productora) perfil de HPLC, columna C18.

Se logra la metabolización del sustrato (14C-GA12) con formación de la lactona 14C-GA9 (tiempo de retención estándar 19 minutos), lo que indicaría que la enzima P450-2 está activa. También por el tiempo de retención estándar del 14C-GA14 (14-15 minutos) podríamos decir que se formó 14C-GA14 explicando la actividad enzimática de la P450-1 para la 3β-hidroxilación de 14C-GA12. Sin embargo, aparece un pico en 17 minutos, al cual no se le puede asignar una identidad de giberelina conocida, al menos no de los productos esperados para esta metabolización.

10

0

5000

10000

15000

20000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23Tiempo(minutos)

CPM

- Metabolización de 14C-GA4 por F. konzum. En a) cepa I3, y b) cepa 10676. Perfiles de HPLC en una columna C18.

a) X

b)

X

No se observa metabolización a los productos finales GA1 y/o GA3 de la vía de síntesis de GAs en Fusarium fujikuroi, lo que sugiere que las etapas de desaturación y 13β-hidroxilación son muy lentas en F.konzum. Al producto “X” con un tiempo de retención de

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12-13 minutos en a), y 13 minutos en b) no se le pudo asignar una identidad según su tiempo de retención. Podría corresponder a un producto de metabolizacion inespecífica, por ejemplo utilización por otras oxidasas presentes en la célula que competirían efectivamente con la desaturasa y 13-hidroxilasa de GAs.

- Metabolización de 14C-GA9 por F. konzum, a) por la cepa I3, y en b) por la cepa 11615. Perfiles de HPLC en columna C18.

a) Y

b) Y

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Para las dos cepas estudiadas se puede ver que la velocidad de conversión de GA 9 es muy lenta, sin observarse aparición del producto esperado (14C-GA4 con tiempo de retención 14 minutos). Sin embargo se aprecia en a) un pick en 18 minutos y en b) en 17 minutos el cual podría corresponder en ambos casos a 14C-GA25 (Y). De acuerdo a esto se puede concluir que no hay 3β- hidroxilación a nivel de la lactona, por lo que la acción de P450-2 (GA20-oxidasa) esta disminuida en estas dos cepas.

De acuerdo a los experimentos realizados se formuló una probable vía de síntesis de GAs en Fusarium konzum (fig. 5), partiendo desde GA12-aldehído, según los datos obtenidos de las incubaciones con sustratos marcados, como de las GAs endógenas encontradas. Las flechas punteadas indican pasos probables, y en color rojo se destacan las etapas que estarían alteradas respecto a lo observado en F. fujikuroi.

Fig. 5 Reacciones de la biosíntesis de giberelinas propuestas para Fusarium Konzum

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H

CO2HCOH

O

OH

OH

GA1

CO2H

H

HCO2H

GA12

H

H

OHCO2H

CO2H

GA14

H

CO2HCOH

O

OH

GA4

H

CO2HCOH

O

GA9

OH

H

CO2H

CO

H

O

GA7

H

CO2HCOH

O

OH

OH

GA3

P450-2

P450-3

DES

P450-1

P450-1P450-

1

P450-1P450-1

P450-2

P450-3

X¿?

Y

En el siguiente cuadro se comparan algunas especies del complejo Gibberella fujikuroi, mostrando los diferentes tipos de huésped, GAs producidas, las enzimas que estan activas y la expresión de el gen de cluster para la biosíntesis deGAs.

Biosíntesis de giberelinas por tres especies del complejo Giberella fujikuroi.

Especie Huésped GAs producidas Enzimas Producidas

Expresión de genes del cluster

F.fujikuroiMP-C

Arroz

GA3( producto

principal)GA4

GA13

GA9

Todas las enzimas del cluster de la ruta de la biosíntesis de GAs están activas

Alta expresión en ausencia de compuestos nitrogenados

F.proliferatumMP-D

maízNo produce GAs aunque posee el cluster de genes completo de la biosíntesis de Gas

P450-4 y CPS/KS inactivas, P450-1 baja actividad. Desaturasa inactiva o muy baja actividad con respecto a P450-3

Muy Baja expresión

F.konsumMP-I

Pasto de praderas de kansas

GA1 (producto principal)GA3

GA20

GA13

GA4

GA9

Todas las enzimas están activas. P450-2 actividad baja. Desaturasa actividad baja con respecto a P450-3

Expresión a niveles detectables en ausencia de compuestos nitrogenados

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Conclusiones

1. La metabolización de precursores de GAs encontrada en F.Konzum es diferente de la descrita en F. Fujikuroi, y las etapas posteriores al GA4 descrita en la secuencia metabólica ocurren con una baja velocidad con respecto a F. Fujikuroi, en todas las cepas estudiadas de F. Konsum. La ausencia de 14C-GA1 y 14C-GA3 en el experimento de metabolización de 14C-GA12 aldehído, podría deberse a la baja actividad de la desaturasa y la 13-hidroxilasa P450-3. Sin embargo la obtención de producto 14C-GA4 y/o 14C-GA14, indicaría que las enzimas MO P450-1 y MO P450-2 si estarían activas en las cepas I3 y la 10663.

2. Se observa la aparición de un producto “X” al incubar con 14C-GA4, con un tiempo de retención distinto al de giberelinas conocidas. Este podría ser metabolizado por otras oxidasas de las células que competirían efectivamente con la enzima desaturasa y la MO P450-3 de GAs en la cepa I3.

3. Al incubar con 14C-GA9 a las cepas I3 (productora de GAs) y la cepa 11615 (no productora de GAs), se ve que no hay 3β-hidroxilación a nivel de la lactona, lo que indicaría una baja actividad de la enzima MO P450-2.

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Abreviaturas.

GA: Giberelina.

MPs: Poblaciones de apareamiento.

MO:Monooxigenasa.

HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución.

MeOH: Metanol.

POPO: 1,4-bis [2-(5fenil oxazolil)]-benceno,fenil-oxazolilfenil-oxazolil-fenil).

PPO: 2,5-difenil-oxazol.

2

Referencias.

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Tudzynski, B. and Hölter, K. (1998) “The gibberellin biosynthetic pathway in Gibberella fujikuroi: evidence for a gene cluster”. Fungal Genetics and Biology 25,157-170Tudzynski, B. (1999) “Biosynthesis of gibberellins in Gibberella fujikuroi”. Appl. Microbiol Biotechnol 52, 298-310Tudzynski, B., Rojas,M.C., Gaskin, P. and Hedden, P. (2002) “The Gibberella fujikuroi gibberellin 20-oxidase is a multifunctional monooxigenase” J. Biol. Chem. 277, 21246-21253Varma, A., Lele V., Raychaudhuri, S.P., Ram, A. y Sang, A. (1974) “Mango malformation a fangal disease” Phytopathol. Z. 79, 254-257 Zeller, K.A., Summerell, B.A., Leslie, J.F., (2003). “Gibberella konza (Fusarium konzum) sp. nov. from prairie grasses, a new species in the Gibberella fujikuroi species complex. Mycologia 95, 943-954

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Índice.

Pag.

Índice y Lista de figuras 1

Abreviaturas 2

Introducción 3

Objetivos 7

Materiales y métodos 8

Resultados y discusión 9

Conclusiones 15

Referencias 16

Lista de figuras.

Fig. 1. Estructura de las giberelinas. A) Giberelinas C20 y numeración del esqueleto del ent-giberelano. B) y C) Algunas giberelinas biológicamente activas (C19).Fig. 2. Efecto del ácido giberelico sobre el crecimiento de bayas de uva de la variedad Thompson Sedles. Izquierda: uvas no tratadas. Derecha: tratadas con GA3.

Fig. 3. Ruta de biosíntesis de giberelinas. Fig. 4. Mapa físico del cluster de genes de la biosíntesis de giberelinas.Fig. 5. Reacciones de la biosíntesis de giberelinas propuesta para F. konzum.

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