Mikrobiologiske processer og sundhed – øvelser i forbindelse med studieretningsprojekt (SRP)

1. CASE: Hjælp en landmand med sundhedsproblemer i svinebesætning

En landmand, der fodrer sine grise med vådfoder oplever døde grise og grise med diarre. Han frygter for trivslen i sin svinebestand og hermed også for sit levebrød. Dør hans grise, får han ingen indkomst og grise, der ikke trives, er et dyreetisk problem.

Landmanden har kontaktet Aarhus Universitet i Foulum, som har bedt ham om at indsende prøver af det vådfoder, grisene bliver fodret med. Under dit besøg i Foulum, skal du hjælpe med at analysere de indsendte prøver.

2. BAGGRUND

Fermentering (gæring) er en proces, hvorunder mikroorganismer frigør kemisk energi fra sukkerarter eller andre organiske molekyler under iltfri (anaerobe) eller næsten iltfri betingelser.

Fermentering er en meget gammel og udbredt praksis, der bruges i produktionen af f.eks. vin, øl, brød, spegepølse, yoghurt og ost. Fermentering giver anledning til ændringer i smag, konsistens og udseende og til dannelse af f.eks. alkohol, mælkesyre eller andre stoffer med konserverende virkning. I mange dele af verden er fermenterede fødevarer de største fødekilder, et eksempel er kassava i Afrika. Afrikanerne river først kassavaen, hvorefter de sætter den i blød i 24 timer. Herved fermenteres kassavaen og de cyanogene glucosider, som er giftige stoffer for mennesker, uskadeliggøres. Formålet med fermentering af disse produkter er derfor, at konservere og afgifte, og derved at gøre det muligt at spise dem.

Fermentering af foder til dyr har været brugt også historisk. Man talte før i tiden om at sætte foderet i støb, hvilket ganske enkelt betyder at blande det med vand og lade det stå natten over, før man gav det til dyrene. Man kan sammenligne det med surdej eller yoghurt, hvor der også sker en vækst af mælkesyrebakterier – enten spontant eller ved tilsætning af en starterkultur.

Når vand og foder blandes, går fermenteringen i gang (Figur 2). I den første fase (Fase 1) stiger antallet af mælkesyrebakterier og gær, og koncentrationen af mælkesyre, eddikesyre og ethanol øges og pH reduceres. I Fase 1, grundet den stadigvæk høje pH og den relative lave koncentration af mælkesyre, kan patogene bakterier vokse f.eks. enterobakterier, der inkluderer E. coli og Salmonella. Den lave pH og den høje koncentration af mælkesyre i Fase 2 giver vådfoderet ’biosafety’. Dette betyder, at potentielle patogene bakterier har svært ved at vokse eller dør. Derfor, som vist i Figur 1, stiger antallet af

1

Fig. 1. DET ER NOGET VÆRRE SVINERI

En landmand oplever pludselig at mange af hans svin lider af diarre. Desværre medfører dette at flere at svinene dør på grund af alvorlige tarmproblemer.

enterobakterier i den første fase for bagefter at blive reduceret. Konklusionen er derfor, at vådfoder i den første fase af fermenteringen ikke har en god mikrobiologisk kvalitet, mens kvaliteten i den anden fase er god.

Fodring af grisene med fermenteret foder af god kvalitet (Fase 2) fremmer lav pH i maven samt øger koncentrationen af mælkesyre i mave og tyndtarm. Dette medfører lave niveauer af enterobakterier i hele mavetarmkanalen, der igen medvirker til at forebygge fravænningsdiarré og reducerer risikoen for Salmonella i slagtesvin. Fodring med god kvalitet fermenteret vådfoder har derfor en positiv effekt på dyrenes tarmsundhed og reducerer risikoen for infektioner med zoonotiske (’zoonose’: sygdomme og infektioner, der kan overføres fra dyr til mennesker) bakterier fra svinekød. Endvidere reducerer fodring med fermenteret vådfoder brug af antibiotika i svineproduktion. Dette er med til, at mindske risikoen for udvikling af antibiotikaresistente bakterier, hvilket er et stigende sundhedsproblem.

Yderligere har det vist sig, at smågrise, der fodres med vådfoder, har lettere ved at tillære sig de nye spisebetingelser forbundet med fravænning fra soen, hvilket forebygger dehydrering og fald i foderoptagelse. Nedsat foderoptagelse gør dyrene mere modtagelige overfor infektioner i forbindelse med fravænning. Desværre går det ud over dyrenes vækst at bruge fermenteret vådfoder, formentlig som følge af den sure smag (dyrene spiser mindre) samt nedbrydning af tilsatte aminosyrer (lysin) under fermenteringen. Fermentering af korndelen alene har dog vist sig at kunne forebygge den vækstnedsættelse, der ses ved brug af fermenteret fuldfoder.

På den anden side øger fodring med fermenteret vådfoder af dårlig mikrobiologisk kvalitet risikoen for diarré og andre infektioner hos grisene.

I Danmark bliver ca. 40% af slagtesvin fodret med vådfoder (som er fermenteret til en mindre eller højere grad). På verdensplan, f.eks. i Holland, Canada, Frankrig og Storbritannien, er vådfodring til svin også udbredt.

Figur 2. Vådfoderets egenskaber over tid ved inkubering ved 20°C.

2

3. FORMÅL MED ØVELSEN

Formålet med øvelsen er at analysere vådfoderprøverne for forskellige parametre, der kan hjælpe med at finde årsagen til den høje dødelighed blandt grisene.

Prøverne skal undersøges for: pH Temperatur Antal mikroorganismer: Mælkesyrebakterier, enterobakterier, hæmolytiske

Escherichia coli, Clostridium perfringens, gær og skimmelsvampe Koncentration af ethanol Koncentration af organiske syrer og mælkesyre

4. ARBEJDSGANG UNDER BESØG I FOULUM:

1) Eleven får udleveret vådfoderprøverne indsendt af landmanden.

2) pH og temperatur måles.

Spredning på agarplader:

3) Ti gram prøve afvejes i en pose, 90 ml pepton medium hældes i (fortynding 1:10) og omrystes kraftigt (stomaches) i 2 min. for at løsne bakterierne fra partiklerne.

4) Der laves en 10-folds fortyndingsrække i rør med 9 ml pepton medium ved at overføre 1 ml suspension med en pipette (se Figur 3).

.5) Der bruges fem agarplader: MRS til mælkesyrebakterier; MacConkey til enterobakterier; blod-

agar til hæmolytiske E. coli, MCA til gær og skimmel, og TSC til Clostridium perfringens. Pladerne påføres navn og fortyndingen i bunden.

6) På MRS, MacConkey, blodplader og MCA laves pladespredning ved at overføre 0.1 ml suspension med en pipette til de selektive agarplader fra fortyndingsrørene jvf. tabel 1.

7) Dråberne spredes på agarpladerne vha. en Drigalski-spatel. Spred dråben på alle medier med samme fortynding, MCA pladen som den sidste i rækken. Der bruges en ny spatel for hver fortynding.

8) Til Cl. perfringens (TSC) (se Figur 4.b) laves pladespredning ved at overføre 1ml suspension med en pipette til TSC agarplader fra fortyndingsrør jvf. tabel 1. Der hældes flydende TSC medium ovenpå og prøven blandes med mediet ved at lave cirkulære bevægelser (pour-plate metode).

9) Pladerne lukkes med låg og vendes på hovedet.

10) Jvf. tabel 1 placeres pladerne i plastikposer (aerob inkubering) eller i bøtter (jars) til anaerob inkubering.

11) Pladerne inkuberes ved 37˚C (se Tabel 1) og kolonierne tælles to dage senere.

3

Figur. 3. Procedure for at lave en fortyndingsrække.

Figur. 4. Spread-plate metode og pour-plate metode.

Tabel 1. Dyrkning af forskellige mikroorganisme grupper fra en slagtesvins gødningsprøve på selektive medier.

MacConkey Blod-agar MRS MCA TSC

Selektivitet Enterobacteriaceae Hæmolytiske E. coli

MælkesyrebakterierGær og skimmel

svampeClostridium perfringens

Fortyndinger 101til 106 101til 106 101til 106 101til 106 101til 106

Inkubering

Iltforhold Aerobt Aerobt Anaerobt Aerobt Anaerobt

Tid (døgn) 1 1 2 2 1

Temperatur 370C 370C 370C 370C 370C

4

12) Koncentrationen af mælkesyre og kortkædede fedtsyrer samt ethanol i de to prøver udleveres.

Beregning af kimtal:

Eksempel 1 (kun tælling fra én fortynding):24 kolonier talt på in 10-4 plade

cfu/g prøve = 10 (fortynding af den oprindelige prøve) x 10 (fordi vi har spredt 0.1ml) x fortynding x antal talte koloniercfu/g = 10 x 10 x 10000 x 24 = 2.4 x 107

log cfu = log af værdienlog cfu/g prøve = 7.38

Eksempel 2 (to tællinger fra to forskellige fortyndinger):146 kolonier talt på en 10-3 pladeog19 kolonier talt på en 10-4 plade

cfu/g prøve = 10 (fortynding af den oprindelige prøve) x 10 (fordi vi har spredt 0.1ml) x fortynding x antal af talte koloniertotal antal kolonier = 146 + 19 = 165total volumen = 10-3 +10-4 =1.1x10-3 mlantal kolonier per ml i gennemsnit = 165/(1.1x10-3)= 150x103/mlcfu/g prøve=10 x 10 x 1000 x 150 =1.5 x 107 log cfu/g prøve = 7.18

Morfologi under mikroskopet:

13) Der påføres en dråbe vand på et objektglas.

14) Èn koloni fra hver af de færdiglavede plader berøres med et øjenål og overføres til et objektglas.

15) Morfologi undersøges i mikroskopet (Se Figur 5).

5

Figur 5. Typisk morfologi af forskellige mikroorganismer.

6