Wichtige (Säulen-)chromatographische Trennmethoden in der Proteinanalytik: Gelfiltration

Trennung nach Molekülgröße Ionenaustauschchromatographie

Trennung nach Ladung Adsorptions-/Verteilungschromatographie

Trennung nach Molekülpolarität Affinitätschromatographie

Trennung nach spezifischen Eigenschaften

Gelfiltration:

Start

Proteingemisch

Elution

kleine Proteinedringen in dieMatrix ein

großen Molekülensteht nur das Volumenausserhalb der Matrixzur Verfügung

Trennung

Trennung nach Molekülgröße

Charakteristische Größen eines Chromatographie-Gels

Vt VxVo

Vt = +Vo Vx

Gesamt-Volumen

Volumen derGelmatrix

Volumen derumgebenden

Lösung

VeREV =

Vo

Ve

relatives Elutionsvolumen

K av =Vo

Vx

Ve -

Verteilungskoeffizient

Vo Vt

Säulenvolumen

Absorp

tion

Ve1

Elutionsvolumen der jeweiligenProteinkomponente

K av

REV:

:

:

Ve3

Ve5

Eichkurve fürSephadex G-200

zur Trennung eignet sich derannähernd lineare Bereich der Kurve:

Fraktionierungsbereich

K av

1,0

0,7

0,1

Ausschluss-volumen

log Mr

empirirsche Beziehung zwischen dem Verteilungskoeffizientenund dem Molekulargewicht der eluierten Substanz

Trennung von Proteinen an Superdex 200 HR 10/30

1

4

5

6

7

Thyreoglobulin (Mr 669 kDa)

Ferritin (Mr 440 kDa)

Human-IgG (Mr 150 kDa)

Human-Transferrin (Mr 81 kDa)

Ovalbumin (Mr 43 kDa)

Myoglobin (Mr 17,6 kDA)

Vitamin B12 (Mr 1355)

(Chromatogramm nach GE Healthcare)

2

3

0.30

0.20

0.10

0

5.0 10.0 15.0 20.0 25.0

Volume (ml)

0

A 280 nm

Materialien für die Gelfiltration

Bezeichnung Materialtyp

Sephadex Dextran Sepharose Agarose Bio-Gel A Agarose Bio-Gel P Polyacrylamid

Zum Teil werden die Gele durch kovalente Quervernetzungen strukturell stabilisiert (Sephadex z.B. ist mit Epichlorhydrin quervernetzt). Die Porengröße ist abhängig von der Konzentration an Gelmaterial und Quervernetzer. So könne Gele mit optimalen Trennbereichen für unterschiedliche Proteine hergestellt werden, z.B.:

Bezeichnung Trennbereich (kDa)

Sephadex G-25 1,5 – 5,0 Sephadex G-50 1,5 – 30 Sephadex G-75 3,0 – 70 Sephadex G-200 5,0 - 800

Kationen-Austausch-Chromatographie

R

R

Träger-material

(poröse) Trägermaterialien:- Polystyrol-Harze,- Dextran - und Agarose-Gele

Ligand

+

3

Substituenten R:anionische Gruppen, z.B.

-SO (starker Austauscher)-COO (schwacher Austauscher)

Trennung von physiologisch im Blut vorkommenden Aminosäurendurch Kationenaustauschchromatographie

(Detektion mit Ninhydrin)

Anionen-Austausch-Chromatographie

R

R

Träger-material

(poröse) Trägermaterialien:- Polystyrol-Harze,- Dextran - und Agarose-Gele

Ligand

+

Substituenten R:kationische Gruppen, z.B.

-C H -NH-(C H ) + Diethylaminoethyl, DEAE( )

2 5 2 5 2schwacher Austauscher

+

-C H -N(CH ) + quarternäre Trimethyl-aminoethyl, Q(starker Austauscher)

2 5 3 3

Adsorptionschromatographie:

Verteilungschromatographie:

Trennung von Substanzen durch unterschiedlicheAdsorption/Desorption an Oberflächen

Trennung von Substanzen durch Verteilung zwischenzwei unterschiedlichen flüssigen Phasen

Si

Si

OH

OH

O

Si

Si

OH

OH

O

O

O

O

O

O

H

H

H

H

HH

H

H

H

H

CHCl3

CHCl3

Adsorptions-/Verteilungschromatographie

Probe

Probe

“ ” ChromatographieNormal Phase “ ” ChromatographieReversed Phase

stationäre Phase:meist Kieselgel (+ Wasserfilm)

polar stationäre Phase:(derivatisiertes Kieselgel)

unpolar

mobile Phase:(z.B. Wasser/Acetonitril)

polarmobile Phase:( z.B. Chloroform)

unpolar

Reversed-Phase-Chromatographie

Derivatisierung des Kieselgels mit Silanen: Oberfläche wird unpolar

stationäre Phase mobile Phase

unpolar polar

Die Phasen sind im Vergleich zur“normalen” Chromatographie an Kieselgelumgekehrt, daher der NameReversed-Phase-Chromatogaphie(RP-Chromatogaphie)

+ ClSi OH Si

R

R

2( )CH 17 CH3 Si O Si

R

R

2( )CH 17 CH3

HCl

R

Si O

O

Si O

SiR

R2

( )CH 17 CH3

SiR

2( )CH 17 CH3

CH3 CN H O2/

Silan

Analyt

-

Abs

orpt

ion

[220

nm]

Retentionszeit [min]

0.05

0.01

20 40 600

Sta

rt

Trennung tryptischer Peptide von Ferritin durchReversed-Phase-Chromatographie

Isokratische Elution, Gradientenelution

isokratisch:

Die Zusammensetzung des Fließmittelsbleibt während der Trennung konstant

Die Zusammensetzung des Fließmittelsändert sich während der Trennung hinzu höherer Elutionskraft

Gradient:

A BC

D

A B C D

A B C D

Zeit

Abs

orpt

ion

Abs

orpt

ion

Abs

orpt

ion

Zeit

Fließmittel 2(höhere Elutionskraft)

Fließmittel 1

Zeit

Det

ekto

r-S

igna

l

t R2t R1t 0

Zeit

Det

ekto

r-S

igna

l

t R2t R1t 0

Zeit

Det

ekto

r-S

igna

l

t R2t R1t 0

schlechte Auflösung,breite Peaks

gute Auflösung,scharfe Peaks (aufgrundhöherer Bödenzahl)

gute Auflösung aufgrundhöherer Selektivität

HPLC

Hochdruckgradientensystem (pro Fließmittel eine Pumpe)

Niederdruckgradientensystem

(High Pressure Liquid Chromatography,)Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Affinitätschromatographie Der Reinigungseffekt basiert auf der

- spezifischen Erkennung eines Proteins durch einen Antikörper oder - spezifischen Affinität eines Enzyms zu einem Inhibitor, Substrat oder Cofaktor

(bei Enzymen) Antikörper können direkt chemisch an geeignete Säulenmaterialien gekoppelt

werden. Das zu isolierende Proteine bindet beim Passieren der Säule an den Antikörper, die übrigen Proteine werden durch Waschen entfernt. Das gebundene Protein wird mit einem geeigneten Puffer, der den Komplex dissoziiert, isoliert.

Alternativ kann der Antikörper-Protein-Komplex über Protein A- oder Protein G-

gekoppelte Säulen isoliert werden.

Protein A and Protein G sind bakterielle Zellwandkomponenten, die primär die Fc-Region von Immunoglobulinen binden. Meist werden rekombinante Formen verwendet.

Species Subclass Protein A

binding Protein G binding

Human IgA variable — IgD — — IgE — — IgG1 ++++ ++++ IgG2 ++++ ++++ IgG3 — ++++ IgG4 ++++ ++++ IgM* variable — Goat — ++ Horse ++ ++++ Mouse IgG1 + ++++ IgG2a ++++ ++++ IgG2b +++ +++ IgG3 ++ +++ IgM* variable — Rabbit ++++ +++ Rat IgG1 — + IgG2a — ++++ IgG2b — ++ IgG3 + ++ Sheep +/— ++ * Purified using HiTrap™ IgM Purification HP columns Tabelle aus GE Healthcare Data File 18-1012-91 AC, zu Protein G Sepharose 4 Fast Flow