WIELKIE RELIGIE ŚWIATA WOBEC ROŚLIN I ICH MODYFIKACJI · Dalajlama XIV ( Tenzin Giaco ) - duchowy i polityczny przywódca Tybetańczyków na emigracji powiedział: „Zawsze podkreślam,

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2006 z. 523: 11-32 WIELKIE RELIGIE ŚWIATA WOBEC ROŚLIN I ICH MODYFIKACJI Jerzy Brusiło Zakon Braci Mniejszych Konwentualnych, Międzywydziałowy Instytut Bioetyki Papieskiej Akademii Teologicznej w Krakowie Wprowadzenie

Najbardziej pierwotne zainteresowanie człowieka przyrodą wiązało się z jej zrozumieniem i wykorzystaniem, szczególnie jeśli chodzi o rośliny. Stanowiły one jego bezpośrednie otoczenie, były pierwszym poŜywieniem, paliwem, lekarstwem, bronią i materiałem do budowy domów. Bez względu na to, czy pierwotny człowiek rozpoczął swoją ewolucję na afrykańskich sawannach, czy Ŝe stworzony został przez Boga w Rajskim Ogrodzie - Edenie, jako istota z natury religijna stawał przed czczonymi przez niego bóstwami lub Bogiem w otoczeniu roślin. To one właśnie prawdopodobnie były jako pierwsze składane w ofierze. Sięgając do historii róŜnych religii, szczególnie tych najbardziej znanych i mających najliczniejszych wyznawców, rośliny jako otoczenie i poŜywienie w buddyzmie, hinduizmie, islamie, judaizmie i chrześcijaństwie odgrywały i nadal odgrywają waŜną rolę. Ich kształty, właściwości i specyfika powodują, Ŝe są obiektem kulturowym, przemysłowym i naukowym. Religia „stanowi integralną część świata ludzkiego zanurzonego w naturze”1 i jest obszarem badań prowadzonych od staroŜytności. Nas jednak w tym miejscu interesuje religijny wymiar tylko wąskiego wycinka szeroko pojętej natury, który jest najbliŜej człowieka, tj. trawa i kwiaty pod nogami, liście i drzewa w zasięgu ręki, rośliny pól, lasów, mokradeł, oaz na pustyni i wysokich gór. Najstarsze religijne odniesienia do świata roślin

1 BURKERT W. 2006. Stwarzanie świętości. Ślady biologii we wczesnych wierzeniach religijnych. Wydawnictwo Domini, Kraków: 12.

J. Brusiło

12

Rośliny jako środowisko Ŝycia na Ziemi zaczęły się rozwijać z pierwszych sinic w oceanach, aby około 500 mln lat temu na błotnych brzegach ówczesnych mórz w formie zielonych glonów rozpocząć fotosyntezę z powietrza atmosferycznego i słońca. Przez kolejne miliony lat powstawały rośliny zarodnikowe i zaląŜkowe, zróŜnicowane na wiele gatunków o coraz bardziej skomplikowanej budowie i funkcji2. Gdy mniej więcej 12 tysięcy lat temu homo sapiens rozpoczął etap Ŝycia osiadłego (neolit), zwiększyła się jego ingerencja w środowisko przyrodnicze, pojawiło się rolnictwo, udomowił niektóre gatunki roślin i zwierząt3. Powstały warunki do rozwoju miast, gospodarki i handlu oraz na tym tle zaczęła funkcjonować kultura i zorganizowana religia (najstarsze groby z prostymi oznakami wiary w Ŝycie pośmiertne są znacznie wcześniejsze i pochodzą sprzed 28 tys. lat; Sungira, Rosja)4.

Rośliny, zwłaszcza o cechach leczniczych, wydają się być szczególnie waŜnym elementem o charakterze religijnym w powstawaniu i rozwoju relacji nadprzyrodzonej między ubóstwianym światem przyrody a człowiekiem, i to znacznie wcześniej niŜ rolnicza rewolucja neolityczna5. Nic dziwnego, Ŝe w dojrzalszych religiach staroŜytnych ok. II tysiąclecia przed Chrystusem, niektóre rośliny stają się duchowymi „narzędziami” w kontaktach z wiecznością. W mezopotamskiej epopei „Gilgamesz” pojawia się wiele magicznych opisów przyrody. Czytamy tam o cedrowym lesie zamieszkałym przez bogów6 i tajemniczym zielu, które ma niezwykłe właściwości: „To zioło, Urszanabi, to kwiat niezwykły, który leczy z niepokoju, człowiek moŜe dzięki niemu Ŝycia dostąpić. Do Uruku warownego wezmę to zioło, lud nim nakarmię i mocy doświadczę”7.

Podobnie drzewa i rośliny występują w opisie stworzenia świata8, ogrodu rajskiego i drzewa Ŝycia w Starym Testamencie, w muzułmańskim Koranie i w starych opowiadaniach chińskich, sprzed kilku tysięcy lat, o wyspach Penglai, Fangzhang i Yingzhou z magicznymi ziołami nieśmiertelności9. BliŜej naszego kręgu kulturowego,

2 SWERDLOW J.L. 1001. Medycyna naturalna. Rośliny, które leczą. National Geographic Society. Wydawn. G+J RBA, Warszawa: 8. 3 Udomowienie roślin i zwierząt nastąpiło w róŜnym czasie i w róŜnych rejonach świata, gdzie rozwinęły się najpierw ośrodki rolnicze a później staroŜytne cywilizacje: Bliski Wschód (tzw. śyzny PółksięŜyc w deltach rzek): uprawy pszenicy samopsza i płaskurka, jęczmień, soczewica, groch oraz zwierzęta: kozy, owce, bydło (10.000 lat temu); Ameryka Środkowa: kukurydza, dynia, fasola, bawełna, tykwa pospolita (9.000 lat temu); Chiny: ryŜ, proso, soja, pochrzyn, kolokazja, groch i ze zwierząt - świnie (7.000 lat temu). LEWIN R. 2002. Wprowadzenie do ewolucji człowieka. Prószyński i S-ka, Warszawa: 379-383. 4 NOWAK B. (rRed.) 2006. Encyklopedia Świat Człowieka. Wydawn. Nauk. PWN, Warszawa: 33. 5 Na terenie obecnego Iraku, w odkrytym przez archeologów grobowcu z okresu neandertalskiego (sprzed 60.000 lat) znaleziono pyłek co najmniej ośmiu gatunków roślin do dziś występującym w tym kraju, lecz zastanawiające jest, Ŝe siedmiu z nich uŜywa się do leczenia ran, dyzenterii, astmy, stanów zapalnych, bólów zębów i innych. Bardzo prawdopodobne, Ŝe zebrano je w celach leczniczych a jeden z pochowanych w jaskimi osobników mógł być np. uzdrowicielem... SWERDLOW J.L. Medycyna naturalna. dz. cyt.: 9. 6 „Widzą górę cedrów, mieszkanie bogów, tron śmiertelnej Irnini. Przed górą cedry pysznie się wznoszą, cień ich dobry i wielce przyjemny. Porosły w nim ciernie, porosły krzaki, pod cedrami wonny rósł oleander”. GILGAMESZ, STILLER R. 1967, (oprac. i tłum.), PIW, Warszawa: 39. 7 TamŜe: 86. 8 Bóg rzekł: „Niechaj ziemia wyda rośliny zielone: trawy dające nasiona, drzewa owocowe rodzące na ziemi według swego gatunku owoce, w których są nasiona” (Rdz 1, 11), Pismo Święte Starego i Nowego Testamentu, wyd. III popr., Pallottinum, Poznań 1980: 24. Wszystkie cytaty biblijne pochodzą z tego wydania Pisma Świętego. 9 SWERDLOW J.L. Medycyna naturalna. dz. cyt.: 9.

WIELKIE RELIGIE ŚWIATA WOBEC ROŚLIN I ICH MODYFIKACJI

13

rzymscy autorzy staroŜytni opisują mistyczne ogrody w Grecji (poświęcone Zeusowi dęby), Galii, i Germanii (z Yggdrasill, mitycznym świętym jesionem, wiecznie zielonym centrum świata, pod którym zbierali się bogowie na narady), a u Celtów istotną rolę w ich religii odgrywały święte gaje (drunemetony) stanowiąc centra kultu i element łączący poszczególne plemiona. U Skandynawów, Germanów i Słowian, w okresie przedchrześcijańskim, gdy północną Europę porastały nieprzebrane puszcze, święte lasy i poszczególne drzewa (zwłaszcza wybrane dęby) były oczywistą częścią ówczesnych religii. Poza dębem i jesionem, w przedchrześcijańskich tradycjach religijnych Europy, czczono takŜe jabłoń, cis, jarzębinę, lipę, jawor, klon i brzozę. Nawet kiedyś na wzgórzach wokół pogańskiego Rzymu (na Watykanie i wzgórzu Tibur) - jak wspomina Pliniusz - rosły święte dęby, pod którymi wyrocznie wróŜyły z szumu drzew10.

Nieprzypadkowo wiele elementów roślinnych, jak wspomniane drzewa, mają podobne znaczenie teologiczne w wielu starych religiach juŜ nieistniejących i stanowią waŜny element duchowy we współczesnych, nie tylko wielkich religiach świata, ale i w wierzeniach prymitywnych, o mniejszych zasięgu geograficznym i kulturowym. W wierzeniach animistycznych, ubóstwiających przyrodę, dziś istniejących jeszcze w Afryce, niektórych częściach Ameryki Południowej, Azji i Australii, nie tylko drzewa, ale i inne egzotyczne rośliny, zwierzęta, a nawet nieoŜywione części krajobrazu utoŜsamia się z duchami i demonami. Dla afrykańskich Pigmejów najwyŜszym bogiem-stwórcą świata jest Las i wiele drzew (najczęściej wiekowe baobaby), stanowiące miejsce kultu jako łącznik między niebem i ziemią.

Przyroda i jej rośliny miały znaczenie nie tylko w dawnych religiach pogańskich, ale dziś w chrześcijańskiej kulturze zachodniej przeniosły dawne znaczenie w nowe formy Ŝycia codziennego. Kwiaty, np. róŜe, które w staroŜytności stanowiły atrybut bogiń miłości - Afrodyty i Wenus, dziś utraciły co prawda swoją „boskość”, lecz pozostały symbolem miłości. Lilia, w staroŜytnej Grecji uznana za atrybut Hery, patronki kobiet, opiekunki małŜeństwa i rodziny, wierności (ale teŜ i zazdrości), w tradycji chrześcijańskiej nie ma juŜ znaczenia boskiego, lecz symbolizuje dziewictwo i czystość, takŜe w kontekście poświęcenia Bogu. Koniczyna, u kapłanów germańskich i celtyckich (druidów) była rośliną świętą i czarodziejską, dziś trójlistna koniczyna jest symbolem Trójcy Świętej11 (ale nie uosabia Boga), natomiast czterolistna koniczyna zapowiada w powszechnym rozumieniu szczęście. Nic więc dziwnego, Ŝe przyroda, a zwłaszcza rośliny słuŜące za pokarm dla ludzi, drzewa, rośliny ozdobne i lecznicze stanowią środek w kontaktach ze światem nadprzyrodzonym we współczesnych, wielkich systemach religijnych świata. Buddyzm (buddyzm tybetański)

Buddyzm to religia (światopogląd, filozofia), która swoim zasięgiem dociera najbardziej na wschód (Japonia, buddyzm zen) i rozkłada się na dwa główne nurty. Pierwszy, therawada (doktryna starszych) występuje głównie w Tajlandii, Laosie, KambodŜy i na Cejlonie i jest prostszą formą buddyzmu o charakterze realistycznym i konserwatywnym. Drugi nurt mahajana występuje głównie w Nepalu, Chinach, Korei i

10 BANEK M. 2003. Rośliny, w: Religia. Encyklopedia PWN, Gadacz T., Milerski B. (Red.), t. 8, Wydawn. Nauk. PWN, Warszawa: 485-486. 11 TamŜe: 487.

J. Brusiło

14

Japonii12, o charakterze bardziej nadprzyrodzonym i duchowym. Buddyzm (wszystkich większych szkół) liczy ok. 800 milionów wyznawców13 i w trakcie swego rozwoju, poza wspomnianymi głównymi nurtami, ukształtował szereg odłamów, np. buddyzm tybetański, buddyzm zen, które w istocie są późniejszymi, rozwiniętymi formami wcześniejszych źródeł buddyzmu „indyjskiego”, np. buddyzm tantryczny (wadŜrajana).

W kosmologii buddyjskiej występuje wiele światów (poziomów istnienia), koło ponownych narodzin i róŜne sfery duchowych. Trudno tam wyróŜnić dokładnie świat roślin czy podobnych materialnych bytów, chociaŜ mówi się o reinkarnacji w postacie zwierząt. W tym wszechogarniającym kosmosie moŜna wyróŜnić nawet 31 pięter, światy powstają, mijają lub odpoczywają przed kolejnym cyklem przemijania14. Rośliny (drzewa, kwiaty) pojawiają się w opowiadaniach związanych z początkiem buddyzmu, w Both Gaji, miejscu przebudzenia Buddy rośnie pęd drzewa pod którym Budda doznał oświecenia, na ołtarzach stawia się kwiaty i kadzidła jako oznaki oddania bóstwu przez osoby składające ofiary15.

W wykładach współczesnych buddyjskich autorytetów religijnych, w temacie roślin mówi się, Ŝe nie są to istoty czujące, obdarzone świadomością; do tego - mówiąc językiem zachodnim - potrzeba nie tylko procesów chemicznych, ale coś w rodzaju procesów (impulsów) elektrycznych, zatem u roślin brak świadomości, woli, a jedynie występuje nieintencyjna reaktywność na bodźce. Częściej mówi się o całej przyrodzie i środowisku. Dalajlama XIV (Tenzin Giaco) - duchowy i polityczny przywódca Tybetańczyków na emigracji powiedział: „Zawsze podkreślam, Ŝe musimy się zastanawiać, jak nasze działania mogą wpłynąć na środowisko i na naszych bliźnich. Przyznaję, Ŝe często trudno to przewidzieć. Nie wiemy, jakie będą dalekosięŜne skutki karczowania lasów, jak wpłynie ono na glebę, lokalne opady czy wreszcie na klimat całej planety. śadnych wątpliwości nie budzi tylko fakt, Ŝe my ludzie, jesteśmy jedynym gatunkiem, który moŜe zniszczyć Ziemię. Nie zrobią tego ptaki, nie zrobią owady, nie zrobi Ŝaden inny ssak. JeŜeli jednak moŜemy Ziemię zniszczyć, to moŜemy teŜ ją chronić”16.

Biorąc pod uwagę buddyjskie spojrzenie na przyrodę jako całość, zwraca uwagę buddyzm tybetański, który rozwinął się na Dachu Świata na bazie przedbuddyjskiej religii bon. W Tybecie, na wysokości ok. 4000-5000 m n.p.m. przyroda ukazuje, zarówno swoje piękno, jak i surowość, stąd religia bon oraz buddyzm w tamtym kraju otacza kaŜdą trawkę, drzewo czy kwiat szczególną czcią. Ofiary z kwiatów, jedzenia i kolorowe ozdoby, to charakterystyczne przejawy ubóstwienia wszelkich przejawów Ŝycia, mocy i mistyki. Nigdzie na świecie, Ŝadna inna religia nie oddaje czci takiej liczbie bóstw, duchów i demonów, jak w Tybecie. Drzewa, skały, góry i jeziora, w Tybecie uwaŜa się za oŜywione. W czasach przedbuddyjskich wyobraŜano je sobie jako potęŜniejsze od ludzi, duchowe postacie o kształtach ludzkich z wielkimi kłami, wywieszonym jęzorem, potęŜnych ramionach i olbrzymich brzuchach. Całą przyrodę oŜywioną i nieoŜywioną oraz samych siebie Tybetańczycy uwaŜają za skupisko energii a surowość klimatu, niedostępność miejsc oraz ubóstwo materialne nadają buddyzmowi tybetańskiemu cechy mistyczne. W tych warunkach problemem jest wyŜywienie oparte na zwierzętach i roślinach przy jednoczesnym zachowaniu odnawialnych zasobów

12 Buddyzm, w: Encyklopedia Audiowizualna Britannica. Filozofia i religia. Wydawn. Kurpisz, Poznań 2006: 25. 13 Dane podawane przy liczbie wyznawców wielkich religii są szacunkowe, na podstawie średniej z wielu źródeł. 14 BARTZ U. Buddyzm. Oficyna Wydawn. „Interspar”, Warszawa b.r.w.: 37-38. 15 TamŜe: 86-87. 16 Dalajlama, Etyka na nowe tysiąclecie, Politeja, Warszawa 2000: 116-117.


15

przyrody. W Tybecie podstawowym poŜywieniem jest praŜona mąka jęczmienna, masło, ser i mięso, uprawia się warzywa, zbiera rośliny dziko rosnące (np. pokrzywę stanowiącą poŜywienie pustelników), zioła, a w cieplejszych dolinach wykorzystuje się owoce i orzechy17.

Z religijnego punktu widzenia, ciekawą formą ukazania przyrody, kwiatów i motywów roślinnych w buddyzmie tybetańskim jest sztuka ikonograficzna zwojów malowanych. W niezwykle barwnych i wieloelementowych malowidłach buddyjskich chodzi o jak najdokładniejsze i umiejętne ukazanie wizji oświecenia, symboliki religijnej, psychologicznej i kosmologicznej18. Nie brak tam elementów roślinnych o religijnym znaczeniu. Biała Tara, jedna z najbardziej czczonych bogiń sprzyjającej nieśmiertelności, jest przedstawiona na malowidle z jedwabiu, z przełomu XIX i XX wieku, na lotosowym tronie w pozycji medytacyjnej, trzymając w lewej ręce lotos współczucia dla wszystkich istot czujących. Na jednej łodydze znajduje się trójkwietny, biały lotos w róŜnym stadium rozkwitu. Zamknięte lub opadające kwiaty symbolizują buddów przeszłości, otwarte - buddów teraźniejszości, zaś pączki - buddów przyszłości. Pośrodku otwartego kwiatu lotosu znajduje się sylaba TA - związana z imieniem Tary19. Lotos jest jednym z ośmiu najwaŜniejszych, najstarszych znaków buddyzmu - symbol spontanicznego rodzenia się i boskiego pochodzenia, płodności i czystego ducha, czystości umysłu, niewinności i dobra. Zamknięty kwiat lotosu w kształcie jaja przedstawia stworzenie wynurzające się z pierwotnych wód. Dla indyjskiej filozofii lotos był ucieleśnieniem bóstwa, a dla buddystów przedstawia narodziny i naturę Buddy. W tej roślinie wykorzystuje się symbolikę koloru kwiatu (czerwone - Nelumbium speciosum, N. nucifera, N. rubrum plenum; niebieskie - Nymphaea caerulea; białe - Nymphaea alba, N. pubescens), liczbę płatków, zamknięcie czy otwarcie pąku20.

Z punktu widzenia wykorzystania roślin i ich modyfikacji, według pierwszej zasady etyki buddyjskiej, „powstrzymanie się od zabijania wszystkich oddychających istot i troska o pomyślność wszystkich stworzeń” dotyczy przede wszystkim ludzi i zwierząt21, stąd moŜna wnioskować, Ŝe wykorzystywanie roślin, ich przetwarzanie i spoŜywanie nie jest niemoralne. Biorąc pod uwagę całą przyrodę, Padmasiri da Silva przedstawił zasady współczesnej buddyjskiej etyki środowiska naturalnego: a) środowiskiem jest człowiek, zwierzę, roślina, ziemia i zasoby wodne; człowiek jest odpowiedzialny za całe środowisko, ale poszczególne sfery środowiska nie mają takiej

17 RAWSON Ph. 1994. Święty Tybet. Wydawn. Artes, b.m.w.: 6-7. 18 „(...) Dzieła sztuki tybetańskiej są czymś więcej aniŜeli zwykłymi dekoracjami o estetycznej wartości. Są one przedstawieniami wyŜszej rzeczywistości zrodzonymi z wizji wewnętrznego przeŜycia. Ich język formalny jest tak precyzyjny jak na przykład język mapy czy formuły naukowej, a jednocześnie tak naturalny i bezpośredni w swym działaniu jak piękno jakiegoś kwiatu czy zachodu słońca”. LEWANDOWSKA-MICHALSKA K. 2003. Ikonografia buddyjskich zwojów malowanych ze zbiorów Muzeum Narodowego w Warszawie, Wydawn. Neriton, Warszawa: 28. 19 TamŜe: 89-90. 20 Według Jogi Kundalini gałązka lotosu to duchowa oś świata, na której rosną kwiaty coraz bardziej rozwinięte i doskonałe aŜ do boskiej korony kwiatu z 1000 płatków i przepięknym blasku. LEWANDOWSKA-MICHALSKA K. Ikonografia buddyjskich zwojów malowanych, dz. cyt.: 111-112. 21 „Budda krytykował zabijanie i męczenie zwierząt; jego zdaniem, władca powinien chronić dzikie zwierzęta Ŝyjące na terenie jego włości (...) Ponadto zabraniał mnichom kopania ziemi, poniewaŜ moŜna w ten sposób uszkodzić Ŝyjące w niej stworzenia”. Cyt. za: GRELA J. 2005. Etyka buddyzmu, w: Wartości etyczne w róŜnych tradycjach religijnych. KUDELSKA M. (Red.), Wydawn. Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków: 117.

J. Brusiło

16

samej wartości, np. zwierzęta stoją w hierarchii wyŜej niŜ rośliny, b) etyka środowiska wymaga rozwagi, postępowania zgodnie z zasadami, c) obok prawa do przetrwania stawia się prawo do godności człowieka, zwierząt i środowiska, d) naleŜy obchodzić się z bogactwami naturalnymi, wodą, powietrzem, gospodarką rolną i przemysłem w taki sposób, Ŝeby respektować prawa innych (...)”22. Hinduizm

Hinduizm, jedna z najstarszych religii świata dzieli się na trzy grupy wyznań liczących w sumie ok. 900 milionów wiernych (głównie w Indiach): wisznuizm (ok. 70% wyznawców), śiwaizm (25-30% wyznawców) i śaktyzm (3-4% wyznawców).

Cechą charakterystyczną hinduizmu jest potraktowanie całego wszechświata jako całości, dlatego nie mówi się osobno o człowieku czy przyrodzie, ale o całym świecie, którego częścią jest człowiek, zwierzę i roślina. Myśl hinduska nie widzi róŜnicy między istnieniem człowieka a istnieniem innego stworzenia. Wszystko jest podporządkowane dharmie („porządkowi istnienia i powinności”) i ta fundamentalna zasada świata, przyrody i człowieka konstytuuje pięć form materii. Jedną z form ukazujących wegetację są drzewa w Indiach i one razem z innymi roślinami posiadają narządy duchowe i zmysłowe. Na przykład drzewo figowe pipal (ficus religiosa) symbolizuje trójcę najwaŜniejszych bóstw hinduskich: Brahmę (korzenie), Wisznu (pień) i Siwę (liście i gałęzie). Poza tym jeszcze w okresie istnienia religii przedhinduskiej całe lasy były traktowane jako święte, zwłaszcza, jeśli pokrywały góry - siedlisko bogów (nie tylko w hinduizmie). Do dziś w Ghatach Zachodnich w stanie Maharasztra (Indie) istnieje ponad 200 chronionych, świętych lasów, w których występuje prawie 90 gatunków roślin poświęconych bóstwom. W tych świętych gajach zabronione są polowania i wypas zwierząt, a wolno zbierać tam tylko uschłe drewno. W XV wieku z racji religijnych guru MaharadŜ DŜambadŜi przywódca Bisznoi, wydał nakaz sadzenia drzewa i zakaz zabijania wszelkich istot Ŝywych. Z ochroną przyrody nie tylko ze względów religijnych, ale takŜe ekonomicznych i społecznych moŜna spotkać się w Indiach w naszych czasach z powodu wycinania lasów, wysuszenia wód gruntowych i stosowania nawozów, co sprawiło wielkie straty na Ŝyznych równinach Indusu i Gangesu. Współcześnie ruchy społeczne w Indiach przeciwne dewastacji środowiska, oprócz akcji protestacyjnej, nabierają ponownie cech religijnych (hinduistycznej jedności całej przyrody) w głoszonych hasłach: „Czyńcie pokój z górami i rzekami, lasami i drzewami, ptakami i zwierzętami”23.

Hinduizm posiada wiele świętych ksiąg. Historie i opowiadania o bóstwach przyrody, tajemne nauki hinduskie przekazane ludziom zawierały nie tylko hymny, modlitwy i rytualne formuły, ale takŜe informacje o uŜyciu roślin leczniczych. W Wedach, Brahma bóg-stworzyciel przekazał „mądrość długiego Ŝycia” innym bóstwom oraz ludziom - oświeconym mędrcom, aby zapobiec ludzkiemu cierpieniu. W scenie, która odsłania istotę wedyjskiego podejścia do roślin, lekarz przygotowuje się do leczenia osoby cięŜko chorej. Po medytacji nad stu uzdrawiającymi ziołami błogosławi je, następnie błogosławi pacjenta. Wysławia go jako tego, „w którym rośliny zbierają się jak królowie na apelu” i wyraŜa nadzieję, Ŝe „rośliny usunęły wszystkie rany, które były w ciele” i Ŝe „zstępując z nieba powiedziały: ten człowiek nie dozna szkody...”. Prezentując roślinę, której zamierza uŜyć, lekarz mówi: „Jesteś najwyŜsza, [jesteś]

22 KLÖCKER M., TWORUSCHKA M, TWORUSCHKA U. 2002. Etyka wielkich religii. Mały słownik, Wydawn. Verbinum, Warszawa: 126. 23 TamŜe: 127-128.


17

lekiem stosownie do potrzeb i błogosławieństwem dla serca”. Następnie przemawia do wszystkich roślin, prosząc je o przyjście z pomocą swojemu współplemieńcowi i dopełnienie kuracji (...)”24. Jest to część Ajurwedy (sanskryt: połączenie słów „Ŝycie” i „wiedza”), sztuki leczenia związanej z hinduizmem, która opiera się przede wszystkim na preparatach roślinnych. Inna nauka medyczna o roślinach jest zawarta w Rygweda, która mówi o uzdrawianiu w kontekście duchowym, a pozostałe teksty wedyjskie takŜe zawierają treści lecznicze25. Związek medycyny ajurwedyjskiej z religią jest bardzo silny, uzdrowiciele są święci i do dziś w tradycyjnej sztuce uzdrawiania roślinami czy minerałami uwaŜa się, Ŝe jednocześnie z ciałem uzdrawia się umysł i duszę.

Szczególne znaczenie roślin (równieŜ w taoizmie i medycynie chińskiej) ma podwójny wymiar: leczniczy i kultowy. Najbardziej rozwinięty sposób wykorzystania setek gatunków roślin znajdujemy w formułach ziół leczniczych (kwiatów, nasion, kory, łodyg, liści), które dawniej stosowane w ścisłej zaleŜności z religią, dziś znajdują zastosowanie nie tylko w mistycznej Ajurwedzie, ale takŜe w Tradycyjnej Medycynie Chińskiej (racjonalnej i empirycznej)26. Niektóre rośliny znajdujące się w chińskich zielnikach medycznych znajdują takŜe zastosowanie w ofiarach rytualnych np. Hong Hua (krokosz barwierski) - wykorzystuje się kwiaty do przygotowania oleju, którym namaszcza się wiernych w ceremoniach inicjacyjnych; Huo Xiang (brodziec paczułki, Agastache) - wytwarza się z tej rośliny barwnik do celów obrzędowych27. W celach religijnych, do kadzideł i balsamów uŜywa się teŜ znanych w chrześcijaństwie: mirry (Mo-yao) oraz Ŝywice do kadzidła Cartera (Ru Xiang).

Podobnie, jak w opisanym wcześniej buddyzmie (faktycznie hinduizm jest wcześniejszy od buddyzmu i symbolika buddyjska pochodzi z hinduizmu), szczególne znaczenie religijne ma lotos, przedstawia stworzenie świata (z niego Brahma formułuje trzy światy), jest symbolem czystości. W malarstwie religijnym, z pępka śpiącego Wisznu wyrasta lotos a z kielicha kwiatu ukazuje się Brahma. Innymi świętymi roślinami hinduizmu są: tulasi (poświęcone Wisznu), kuśa i darbha28.

Współczesny hinduizm nie ma jednolitego stosunku do roślin czy zwierząt, ale jego cechą charakterystyczną przeniesioną z przeszłości jest szczególna relacja do krowy, którą utoŜsamia się z Matką Ziemią - stąd zakaz zabijania krów (od 1000-800 r. przed Chr.)29. Jednocześnie ze względu na krowy i inne zwierzęta, hinduizm (zwłaszcza

24 SWERDLOW J.L. Medycyna naturalna. dz. cyt.: 14. 25 „Kora z wysokiego wiecznie zielonego drzewa dita (Alstonia scholaris), uprawianego w całych Indiach, jest uŜywana do leczenia malarii, chronicznej biegunki, gorączki i chorób skórnych. Owoce z drzewa kleszcza smakowitego (Aegle marmelos) leczą biegunkę, dyzenterię oraz schorzenia jelit; jego korzenie usuwają melancholię i uspokajają palpitację serca; liści zaś moŜna uŜywać w postaci okładu dla złagodzenia oparzeń. Dwa gatunki szkarłatu (Amaranthus) - czerwono i biało kwitnący - uŜywane są do leczenia anemii, chorób serca, kaszlu, kolki jelitowej i ukąszeń Ŝmij. Czerwono kwitnący szkarłat leczy takŜe bezsenność, reumatyzm i przewlekły alkoholizm (...) Ćaraka samhita zawiera opisy i wskazówki uŜycia 500, a Suśrata Samhita 760 roślin leczniczych”. SWERDLOW J.L., Medycyna naturalna. dz. cyt.: 15. 26 OU XING LIN. Classical and Modern Chinese Herbal Formule and Research. b.r. m.w. 27 HIM-CHE YEUNG 1996. Handbook of Chinese Herbs. Institute of Chinese Medicine, Los Angeles: 263. 28 BANEK M. Rośliny. dz. cyt.: 487-488. 29 W kontekście szacunku dla Ŝycia, niezabijanie zwierząt i nie niszczenie roślin, istotną tendencją w najnowszej historii Indii (i hinduizmu) jest upolitycznienie staroindyjskich ideałów ascetycznych przez Mahatmę Gandhiego. Ideały: niestosowania przemocy, Ŝycie w prawdzie, nieposiadanie majątku, opanowanie ciała przez ducha i celowo podjęte posty, zostały wykorzystane przez Gandhiego w wymiarze społecznym jako „najwyŜsza forma religii”. Te ideały wprowadzane w Ŝycie w czasie przemian politycznych w Indiach (zdobycie

J. Brusiło

18

w krajach ubogich) z troską i szacunkiem odnosi się do roślin (uprawnych) i pasz, które stanowią waŜny składnik poŜywienia świętej krowy. Biorąc pod uwagę ogólne załoŜenia hinduizmu (wszechświat jako całość i kaŜda roślina jako Ŝywa część tej całości) nie moŜna przeceniać szczególnego stosunku hinduizmu do roślin i ich modyfikacji, poniewaŜ ta religia traktuje przyrodę jako jeden, połączony system Ŝycia w róŜnych formach (reinkarnacja). śycie w formie roślinnej w innym wcieleniu moŜe być zwierzęciem, w innym owadem, a w jeszcze innym - człowiekiem ... Islam

Islam jest religią monoteistyczną i w odróŜnieniu od religii (filozofii) Dalekiego i Środkowego Wschodu, ma wiele punktów wspólnych z chrześcijaństwem i judaizmem. Sięga teŜ do tych samych korzeni i tradycji (głównie biblijnych), co nie przeszkadza muzułmanom współcześnie stanowić główne wyzwanie dla chrześcijaństwa (w zachodnich krajach Europy), oraz zagraŜać judaizmowi (państwo Izrael w konfrontacji z krajami arabskimi Bliskiego Wschodu). W islamie liczącym ok. 1 miliarda 200 milionów wyznawców (Bliski Wschód, Północna Afryka i Indonezja) moŜna wyróŜnić trzy nurty: sunnizm, charydŜyzm i szyizm.

Religia muzułmanów powstała w Arabii w VII wieku za przyczyną proroka Mahometa w oparciu o cztery źródła: Koran (święta księga), sunna (tradycja), idŜma (konsensus) oraz idŜtihad (indywidualne myślenie). Surowe warunki pustynne w środowisku powstania religii niewątpliwie były przyczyną dowartościowania roślinności, zarówno jako źródła poŜywienia jak i lekarstwa. W jednej surze Koranu czytamy: „Proszę popatrz na to, co cię otacza na ziemi: rośliny, zwierzęta, ptaki, owady, ryby, przedmioty codziennego uŜytku... Czy nie widzisz w tym wszystkim doskonałej harmonii, która kontroluje kaŜdą z istot i ukierunkowuje ją? (...) Ten, który stworzył te wszystkie stworzenia, i który je kontroluje, jest Jeden, Jedyny, bowiem gdyby miał wspólnika w tworzeniu wszechświata, to całe to stworzenie uległoby zniszczeniu. Ten Jeden, Jedyny to Allach, prawdziwy Bóg”. W ten sposób roślina w islamie jest dowodem na istnienie Boga i większość tekstów przyrodniczych miało taki cel teologiczny: ukazanie stwórczej, sprawiedliwej, litościwej wszechmocy Boga30.

Głównie moc stwórcza Boga jest podkreślona w teologii muzułmańskiej, a jej wyrazem staje się w Koranie stworzenie roślin: „On jest tym, który spuścił z nieba wodę i dzięki niej wyrastają wszelkie rośliny. Z nich wyprowadziliśmy zieleń, a potem ziarna skupione w kłosach; a z palmy daktylowej kiście daktyli nisko zwisających; i ogrody winnej latorośli, drzewa oliwne i drzewa granatu podobne do siebie i niepodobne. Popatrzcie na ich owoce, gdy one owocują i dojrzewają! Zaprawdę, w tym są znaki dla ludzi, którzy wierzą” (6, 99).

W kontekście wykorzystania roślin jako lekarstwa, w ziołolecznictwie często opartym na doświadczeniach religii Wschodu, w islamie wykorzystuje się tytoń i marihuanę jako substytut zabronionego przez Mahometa alkoholu. Marihuana jest

niepodległości) mogą w dalszej perspektywie rzutować nie tylko na stosunki społeczne ale i na relację człowiek-przyroda (pośrednio: człowiek-roślinność środowiska naturalnego). Por. MEISIG

K. 2006. Wojna i przemoc w hinduizmie, w: Wojna i przemoc w religiach świata. Fakty i przyczyny. Khoury A. Th., Grundmann E., Müller H.-P. (oprac.), Wydawn. Jedność, Kielce: 82-84. 30 „Zwierzęta i ptaki, podobnie jak ludzie, są pod pieczą Boga i w dniu sądu ostatecznego równieŜ będą odpowiadać za swoje czyny. Wolno jeść mięso zwierząt, z wyjątkiem padliny, wieprzowiny i krwi, jeśli tylko nad zarzynanym zwierzęciem wzywane było imię Boga”. Koran, rozdz. VI.


19

obecna wśród wielu wyznań świata juŜ od tysiącleci i była uznawana za środek komunikacji ze światem nadprzyrodzonym. Muzułmanie w celach towarzyskich palą shishę (fajkę wodną) często z domieszką słabych narkotyków, natomiast zdarza się - częściej w religiach Dalekiego Wschodu - Ŝe do celów religijnych (stany mistyczne i ekstazy) uŜywa się grzybów halucynogennych i pewnych roślin narkotycznych (konopie indyjskie - haszysz w muzułmańskiej sekcie asasynów)31.

Z religijnego punktu widzenia, muzułmanie przede wszystkim w tradycji i komentarzach teologicznych zajmują się obecnie bardziej problemami politycznymi, społecznymi i rodzinnymi (etyką ludzkiej prokreacji), niŜ normami Ŝywienia32 i zagadnieniami przyrodniczymi („Jedzcie i pijcie, ale nie trwońcie” - Koran 7, 29). Mimo tego praktycznego podejścia, w islamie znajdujemy pewne dane antropologiczne, z których moŜna określić miejsce roślin w hierarchii stworzeń poza sferą ludzi i zwierząt. Człowiek jednoznacznie przewyŜsza zwierzęta (w przeciwieństwie do „niewiernego bydła” ma rozum i jest zdolny do wiary i niewiary - Koran 5, 1; 8, 22; 8, 57), ale istnieje zasadnicza społeczna równość między człowiekiem a zwierzęciem: „I nie ma zwierząt na ziemi i ptaków latających na skrzydłach, które by nie tworzyły społeczności podobnych do waszych” (Koran 6, 38).

W podobieństwach do poglądów biblijnych moŜna zaakcentować prawdę o Bogu, który stwarza cały świat istot Ŝywych (w tym równieŜ rośliny), oraz mocno zaznaczone jest potępienie ludzkiej pychy (głównie w kontekście braku szacunku dla zwierząt gospodarskich - waŜne dla koczowników, właścicieli zwierząt). Podobnie jak w Biblii, Koran udowadnia, Ŝe zlecone przez Boga człowiekowi zadanie panowania nad światem jest obwarowane określonymi warunkami („nie czynić zła” - afsada) i człowiek będzie musiał zdać sprawę z ingerencji („obchodzeniem się”) ze środowiskiem. Poza tym, główne nurty islamu nie podejmują dyskusji o środowisku naturalnym (w krajach muzułmańskich prowadzi się często nadmierną eksploatację lasów, stepów i zasobów wodnych), i za najwaŜniejsze uwaŜa się problemy rozwojowe, a nie ekologiczne (wyjątkiem są opinie mistyków muzułmańskich, środowiska sufickie, afirmujące przyrodę). Są to poglądy teocentryczne, zwracające uwagę na ziemię i rośliny nie tylko ze względu na człowieka, ale głównie ze względu na przestrzeganie przykazań BoŜych33.

W porównaniu z religiami Wschodu, islam wnosi nową cechę w rozumienie religijnych znaczeń świata roślin i całej przyrody. Są to mianowicie wartości kulturowe, estetyczne i ekonomiczne (rolnicze i domowe wykorzystanie roślin), związane ze środowiskiem naturalnym. Pierwszą dziedziną związaną z praktycznym zastosowaniem religii Mahometa było ogrodnictwo i rozwój duchowości tzw. „raju muzułmańskiego”. Nie moŜe dziwić troska muzułmanów w całej swej historii, o kwiaty, drzewa czy rośliny ogrodowe tam, gdzie islam zmagał się z pustynią, surowym klimatem i niegościnnym środowiskiem Ŝycia. Zachwyca skala i bogactwo bajecznych ogrodów w Bagdadzie, Kairze, Damaszku w Azji, a takŜe w hiszpańskiej Sewilli, w europejskiej części dawnego imperium muzułmańskiego. Geometria, regularność, obfitość gatunków roślin, a jednocześnie swoboda i spontaniczność z jaką przyroda ukazywała się

31 BANEK M. Rośliny. dz. cyt.: 488. 32 „Powiedz: »Ja nie znajduję w tym, co mi zostało objawione, niczego zakazanego dla człowieka w jego poŜywieniu z wyjątkiem tego, co jest martwe, albo rozlanej krwi, albo mięsa świni – bo to jest obrzydliwe – albo tego, co zostało złoŜone na ofiarę czemuś innemu niŜ Bogu. A kto został zmuszony, nie będąc ani buntownikiem, ani przestępcą, to, naprawdę, twój Pan jest przebaczający, litościwy!«„ (6, 145). 33 KLÖCKER M., TWORUSCHKA M, TWORUSCHKA U. Etyka wielkich religii. dz. cyt.: 122-124.

J. Brusiło

20

troszczącym się o nią ludziom, to zasługa nie tyle estetów arabskich, co wiernych muzułmanów, którzy ze względu na Boga dobierali kolory, zapachy i kompozycje roślinne w oazach, przy meczetach i domach sunnitów czy szyitów (kojarzy się tu kontynuacja ze staroŜytnym cudem świata: wiszące ogrody królowej Semiramidy w Babilonie).

Tam, gdzie na sztukę tworzenia ogrodów nakładały się ograniczenia przepisów religijnych, gaje z mnóstwem egzotycznych roślin zostały utrwalone w mozaikach meczetów, np. w Damaszku, dając nadprzyrodzone wyobraŜenie raju dla wiernych, którym Allach obiecywał nagrodę za poboŜność i sprawiedliwość. Drzewa, gęstwina zieleni i kwiatów, kolory i cuda ogrodów ze snu34, to nie tylko arcydzieło artystyczne, ale i swoista „katecheza” o nagrodzie nieba, zarówno dla bogatego kalifa w Mekce (święte miasto islamu), jak i ubogiego muzułmanina na Pustyni Arabskiej.

Na przykładzie arabskiej Hiszpanii, moŜna się przekonać o drugiej „świeckiej” dziedzinie (poza tworzeniem bajecznych ogrodów tarasowych) religijnego znaczenia roślin w islamie. Z całego świata na Półwysep Iberyjski sprowadzano nasiona i rośliny obce w Europie. Uprawiano odmiany jęczmienia i pszenicy znane wcześniej tylko ze starych ksiąg przyrodniczych. Nowymi roślinami strączkowymi były groch, soczewica i łubin, zaś z warzyw bakłaŜany, ogórek, czosnek, kapusta, burak, marchew, por, szpinak, karczoch, melon i arbuz. Z roślin przemysłowych Arabowie sprowadzili bawełnę, len, konopie, szafran, sumak i trzcinę cukrową. Islam przyniósł Hiszpanii nie tylko zmianę religii, ale takŜe rozwój rolniczy i gospodarczy. Uboga chrześcijańska Hiszpania została przekształcona na wzór Syrii w bogaty kalifat. Uprawa roślin z klimatu monsunowego wymagała szczególnych zabiegów agrotechnicznych, wprowadzono więc nawadnianie (koła nawadniające, szadufy, zegary wodne), nawoŜenie i pielęgnacje roślin nieznanych wcześniej w tym kraju. W tak zmienione środowisko wprowadzano drzewa cytrusowe i palmę daktylową - symbol arabskich i muzułmańskich tradycji.

Islam i kultura arabska to równieŜ bogactwo przypraw z całego świata. Zaczęto więc importować i uprawiać w Hiszpanii majeranek, kolendrę, kmin rzymski, sezam, kapary, koperek i anyŜ. W ogrodach pojawiły się drzewa ozdobne (mirt, dąb, pinie), które wzbogaciły kwiaty roślin juŜ zadomowionych: róŜe, chryzantemy, fiołki, kosaćce i lilie wodne. Większość z tych roślin do dziś moŜna spotkać w miastach hiszpańskich. Z Hiszpanii, poprzez rozwój islamu, wiele arabskich osiągnięć rolniczych i ogrodowych rozpowszechniło się na całą Europę35. Rozwój rolnictwa, wprowadzanie nowych gatunków roślin, ich systemowa i naukowa aklimatyzacja, towarzyszyły ekspansji nowej religii. Islam stworzył warunki do naukowych badań i gromadzenia wiedzy na temat przyrody, nowoczesnych upraw rolniczych i hodowli roślin36.

34 LORREY DE E., BERCHEM VAN M. 1929. Les Mosaîques de la Mosquée des Ommaiades ŕ Damas, w: Mon. Piot. t. XXX: 111-139. 35 Dla przykładu: system uprawy lasów przejęto z arabskiej Hiszpanii do Niemiec. DANECKI J., Co zawdzięczamy islamowi, http://www.opoka.org.pl/biblioteka/I/IR/co_islamowi. html, (13 IV 2007). 36 Do dziś zachowane dzieła w oryginale, bądź w tłumaczeniu na hiszpański i kataloński zdumiewają objętością i poziomem, a autorów było teŜ bardzo wielu: Ibn Wafida, Ibn Bassala, Abu al-Chajra, Ibn HadŜdŜadŜa, At-Tighnariego, Ibn al-Awamma. Ten pierwszy, znany był później w średniowieczu jako farmakolog Abenguefith i przypisuje mu się autorstwo MadŜmu al-filaha (Zbiór o rolnictwie) a jego praktyczne dokonania to projekt i wykonanie słynnych ogrodów w Toledo, załoŜonych tuŜ przed rekonkwistą (powrotem) chrześcijan do Hiszpanii. Późniejsze renesansowe juŜ dzieła agronomiczne (np. Gabriela Alonso de Herrera Agricultura general) to w duŜej mierze nic innego jak dzieła uczonych muzułmańskich. WATSON A.M. 1974. Agricultural Innovation in the Early Islamic World. Cambridge 1983 oraz tenŜe, The Arab Agricultural


21

Powiązanie zasad wiary z wykorzystaniem rolnictwa, ogrodnictwa i całego środowiska naturalnego to przykład na szersze pojęcie religii w środowisku mu-zułmańskim. Wpływ islamu na kulturę, gospodarkę i środowisko przyrodnicze, tak jak w religiach Wschodu wpływ, np. buddyzmu czy taoizmu na rozwój medycyny, jest cechą charakterystyczną nowego podejścia do świata i człowieka. W islamie, tak jak w judaizmie i chrześcijaństwie, moŜemy mówić o większym wpływie religii na całe Ŝycie człowieka, niŜ tylko na sferę nadprzyrodzoną, duchową. W islamie teŜ, z tego powodu, pojawiają się pierwsze w religiach monoteistycznych, oceny dotyczące modyfikacji, zmian i wykorzystania roślin. Jedna z sur Koranu (5, 76) brzmi: „Nie szerzcie zepsucia na ziemi po jej udoskonaleniu” a to sugeruje granice, której z nakazu Boga człowiek nie powinien przekraczać w swojej ingerencji w naturę37. Judaizm

Religia śydów jest duchem Starego Testamentu bardzo blisko chrześcijaństwa. ChociaŜ obecnie oficjalnie judaizm wyznaje tylko około 12 milionów wiernych (głównie w Izraelu i USA), to ze względu na prastare źródła i wpływ, jaki judaizm wywarł na cywilizację zachodnią i historię całego świata, religia ta jest uznawana za jeden z najwaŜniejszych wielkich systemów religijnych na Ziemi. WyróŜniającą cechą judaizmu jest jego związek z jednym narodem - Izraelem, dla którego przez długie lata utraty niepodległości, jedyną ostoją jedności i kultury była właśnie religia. Do dziś, przez prawo i tradycje świętych ksiąg Biblii, Tory, Miszny i Talmudu, religia ta znacząco wpływa na wszelkie dziedziny Ŝycia śydów, w tym równieŜ na kwestie przyrodnicze38. W literaturze hagadycznej i Talmudzie naturę uwaŜa się za „Ŝyjącą, czującą i myślącą”, a wypracowane na tej podstawie prawo o charakterze religijnym moŜna dziś uznać za pierwsze w historii zasady etyczne w ochronie środowiska naturalnego. NaleŜy do nich zasada dotycząca ograniczania „cierpienia zwierząt” (caar baale chajjim) i zasada „nie niszcz” (bal taszchit)39. W pierwszej chodzi o niezdawanie bólu zwierzętom (tylko ludzie mogą cierpieć - czyli rozumowo, intencyjnie przeŜywać ból), w drugiej zasadzie punktem wyjścia jest werset z Księgi Powtórzonego Prawa, dotyczący konkretnie drzew: „JeŜeli przez wiele dni będziesz oblegał miasto i walczył z nim, nie zetniesz jego drzew podkładając siekierę, bo będziesz spoŜywał z nich owoce. Dlatego ich nie zniszczysz. Czy drzewo to człowiek, byś je oblegał” (20, 19).

W zapisach Starego Testamentu (głównie Księgi Rodzaju) znajduje się podstawowa treść religijnej hierarchii stworzeń (rośliny jako pokarm dla zwierząt i ludzi), roli człowieka w kształtowaniu przyrody i potrzeby szacunku dla Ŝycia zarówno

Revolution and its diffusion 700-1100, Journal of Economic History 34: 8-35. 37 W islamie, szeroko pojęte zasady bioetyczne (nie tylko związane z roślinami) nie są jeszcze dokładnie określone i wiele z nich opiera się nie na danych biomedycznych lecz na ustaleniach religijnych i tradycyjnych, np. wg Koranu za osobę ludzką przyjmuje się zarodek po trzech miesiącach i jednym tygodniu od zapłodnienia (setny dzień ciąŜy) a w na sztuczne zapłodnienie religia muzułmańska zezwala tylko legalnym małŜonkom i z udokumentowanym pochodzeniem dawcy gamet wg słów proroka Mahometa: „Poznajcie waszą genealogię, co pozwoli wam baczyć na związki krwi” (Hadis). 38 Po odzyskaniu niepodległości, państwo Izrael na terenach Palestyny rozpoczęło wielkie dzieło odbudowy ekologicznego rolnictwa, zalesiania wzgórz, osuszania bagien, zagospodarowywania pustyń i ugorów. Powstały ogrody i wydajne pola uprawne wykorzystano staroŜytne i współczesne sposoby upraw roślin gromadzących sól. KLÖCKER M., TWORUSCHKA M, TWORUSCHKA U. Etyka wielkich religii. dz. cyt.: 121. 39 TamŜe: 120.

J. Brusiło

22

na poziomie roślin, jak i zwierząt: „Wszystko, co się porusza i Ŝyje, jest przeznaczone dla was na pokarm, tak jak rośliny zielone, daję wam wszystko. Tylko nie wolno wam jeść mięsa z krwią Ŝycia” (Rdz 9, 3-4). Silny wpływ religii na postawę wobec przyrody ujawnia się nawet w sadzeniu drzew (chodzi o święto Nowego Roku Drzew Rosz-ha-Szana la-Ilanot obchodzonym współcześnie w Izraelu). Wywodzi się to z nakazu Księgi Kapłańskiej (19, 23-25), Ŝeby przez trzy lata nie spoŜywać owoców nowo posadzonych drzew, a czwartego roku owoce ofiarować w świątyni. Poza religijnym znaczeniem drzew (ochrona wobec drzew figowych), szczególną wartość miały winna latorośl, dąb (w Mamre, pod którym Abraham miał zbudować ołtarz), oliwka (zwiastun końca potopu dla Noego), czy palma (symbol pełnego Ŝycia)40. Zniszczenie winnicy lub upraw rolniczych wiązało się z cięŜką karą BoŜą. Kto załoŜył winnicę, albo nie zebrał jeszcze plonów, był zwolniony nawet ze słuŜby wojskowej (Pwp 20, 6).

Księga Mądrości sławi obecność Boga we wszechświecie przypominając, Ŝe „z wielkości i piękna stworzeń poznaje się przez podobieństwo ich Stwórcę” (Mdr 13, 5). Wysławia ją równieŜ Ŝydowska tradycja chasydzka: „Gdziekolwiek idę, Ty! Gdziekolwiek przystaję, Ty (...), gdziekolwiek się zwracam, gdziekolwiek spoglądam, znowu Ty, zawsze Ty” (M. Buber „Opowieści chasydów”). Poza Pismem Świętym, tradycja judaistyczna podaje szereg zapisów, które świadczą o znaczeniu roślin nie tylko w Ŝyciu religijnym, ale i świeckim. Jedno ze źródeł odnotowuje wypowiedź rabina Joachima ben Zakaja (I w. po Chr.): „Gdy trzymasz w ręku roślinę i ktoś ci mówi »Mesjasz przyszedł«, zasadź ja najpierw, a później idź Go powitać”. W Ŝydowskim „Rozdziale Pieśni” (Pereg szira), którego treść wskazuje na pochodzenie od mistyków, kilka rozdziałów omawia świat fizyczny, świat roślin i drzew, świat zwierząt pełzających, świat ptaków i zwierząt lądowych. Omówienie kaŜdego rozdziału opiera się na cytatach z Pisma Świętego i przedstawia ścisły związek opisywanej przyrody z porządkiem społecznym, zasad moralnych, ludzkiej pomyślności oraz troski człowieka o stworzenie41. Nieprzypadkowo wybór tekstów biblijnych uzasadnia takie integralne widzenie rzeczywistości. Opisy przyrody, księgi poetyckie i psalmy, cała Biblia ukazuje prawdę o Bogu, człowieku i m.in. o roślinności, która towarzyszy dziejom zarówno całego narodu izraelskiego, jak i kaŜdemu religijnemu śydowi. Słowo „roślina” jest uŜyte w Starym Testamencie tylko 19 razy ale juŜ słowo „drzewo” występuje w róŜnych kontekstach 310 razy, owoc - 162 razy, las - 46 razy a kwiat - 50 razy (nie licząc oczywiście tekstów Nowego Testamentu).

Wszystkie nauki judaizmu pozwalają sformułować zasadę: wszelkie zmiany w obszarze przyrody, wykorzystanie, spoŜywanie roślin jest moŜliwe na podstawie znanego tekstu „czynienia sobie ziemi poddaną”, ale działanie człowieka ma: a) być zgodne z wolą BoŜą; b) słuŜyć dobru człowieka; c) budować jedność świata stworzonego. Nawet przez analogię moŜna zaryzykować twierdzenie o religijnym przyzwoleniu na modyfikację genetyczną roślin, poniewaŜ niektóre autorytety religijne judaizmu dopuszczają techniki genetyczne u człowieka, przynajmniej w celu leczenia człowieka (rabbi Azriel Rozenfeld)42.

W judaizmie, jeszcze bardziej niŜ w islamie i zupełnie inaczej niŜ w innych wielkich Religach Wschodu, przyroda jest podporządkowana człowiekowi, a rośliny wykorzystywane przez człowieka. Podstawową zasadą w Ŝydowskim stosunku do świata jest koncepcja istoty ludzkiej, w której ciało i dusza tworzą nierozdzielną całość. Na tym tle naleŜy analizować kwestie „ekologiczne” i „biotechnologiczne”. Człowiek

40 BANEK M. Rośliny. dz. cyt.: 485-487. 41 KLÖCKER M., TWORUSCHKA M, TWORUSCHKA U. Etyka wielkich religii. dz. cyt.: 119. 42 DORFF E.N. 1998. Matters of Life and Heath. A Jewish Approach to Modern Medical Ethics, The Jewish Publication Society, Philadelphia and Jerusalem 5758: 162-163.


23

przedstawia sobą mikrokosmos, składający się z wielu duchowych i fizycznych komponentów, zharmonizowanych w doskonałą jedność, tworzących precyzyjną, idealną równowagę, której zakłócenie przynosi natychmiast negatywne skutki (rabin E. Munk). W tej jedności zawarta jest równieŜ wartość roślin, drzew, upraw rolnych i piękna przyrody, lecz wkomponowana w hierarchię waŜności i podporządkowana człowiekowi43. Chrześcijaństwo

Religia chrześcijańska44, najlepiej znana w naszym kręgu kulturowym, ma chyba najwięcej elementów i symboli roślinnych związanych z wiarą i tradycjami duchowymi. Są one często wpisane w zwyczaje i Ŝycie codzienne wielu katolików w Polsce. W związku z tym, problematyka chrześcijaństwa wobec roślin i ich modyfikacji wymaga osobnego opracowania (zwłaszcza wśród mistyków środowiska naturalnego - na przykładzie św. Franciszka z AsyŜu i w czasach najnowszych, co wynika z nauczania Kościoła katolickiego na temat środowiska naturalnego i ekologii), i w tym miejscu będzie jedynie zasygnalizowana.

Podstawowym punktem wyjścia w powiązaniu religii i roślin, wspólnym dla judaizmu i chrześcijaństwa, jest opis stworzenia roślin w dniu trzecim: „I rzekł [Bóg]: »Niechaj ziemia wyda rośliny zielone: trawy dające nasiona, drzewa owocowe rodzące na ziemi według swego gatunku owoce, w których są nasiona «.I stało się tak” (Rdz 1, 11). W dziejach chrześcijaństwa rośliny były poświęcane, błogosławione i egzorcyzmowane. Były takŜe poŜywieniem, lekarstwem, miały znaczenie ekonomiczne, społeczne i kultowe (w Eucharystii, najdoskonalszej ofierze, wykorzystuje się mąkę zbóŜ i sfermentowany moszcz winnej latorośli). Bardzo rozpowszechnione były motywy roślinne w dekoracji świątyń chrześcijańskich45, w sztuce, architekturze, w symbolice religijnej i w analizach teologicznych (jako znaki i atrybuty)46.

W Europie i w kręgu kultury zachodniej w naukach o roślinach, czy to pro-wadzonych w sposób tradycyjny, czy w zaawansowanych modyfikacjach roślin (takŜe genetycznych), religia chrześcijańska ma znaczący udział w kształtowaniu nie tylko etyki środowiska roślinnego człowieka, ale takŜe w budowaniu oryginalnej koncepcji szeroko rozumianego Ŝycia, które w pięknie, zastosowaniach i moŜliwościach świata roślin stanowi część chrześcijańskiej duchowości. Jest ona oparta o dane Pisma Świętego, teologii i filozofii chrześcijańskiej tradycji oraz współczesnych dokumentów

43 Jedność powinna dotyczyć takŜe ludzkiego serca i rozumu, takŜe sprawiedliwość i miłosierdzie stapiają się w jedno: tsedek. W etyce tsedek oznacza to samo: sprawiedliwość i miłosierdzie. GUIGUI A. 1996. Moralność Ŝydowska wobec medycyny i biotechnologii, w: Medycyna a prawa człowieka. Normy i zasady prawa międzynarodowego, etyki oraz moralności katolickiej, protestanckiej, Ŝydowskiej, muzułmańskiej i buddyjskiej. Kleczewska B. (red.), przekład Iwona Kaczyńska, Wydawn. Sejmowe, Warszawa: 42. 44 Chrześcijaństwo naleŜy rozumieć w połączeniu trzech części: katolicyzm, prawosławie i protestantyzm, w sumie ok. 1 miliarda 700 milionów wiernych, i w tym ujęciu jest to największa i najbardziej rozpowszechniona religia na świecie. W niniejszym opracowaniu religijne role roślin mogą być rozumiane, zarówno w pierwszych wiekach chrześcijaństwa niepodzielonego, jak i w tradycjach róŜnych kościołów w dobie współczesnej. 45 Piękną syntezę teologii stworzenia (witraŜ „Bóg Stwórca”), motywów roślinnych na poli-chromiach Stanisława Wyspiańskiego oraz franciszkańskiego przeŜywania przyrody znaleźć moŜna w Bazylice Franciszkanów w Krakowie. 46 KOBIELUS St. 2006. Florarium christianum. Symbolika roślin - chrześcijańska staroŜytność i średniowiecze. Tyniec. Wydawn. Benedyktynów, Kraków: 13-15.

J. Brusiło

24

Kościoła katolickiego. Nowy Testament daje podstawy do całkiem nowej w historii wszystkich religii teologii wszystkich istnień Ŝywych, które wraz z człowiekiem (na odpowiednim dla siebie poziomie) bierze udział w dziele odkupienia i doskonalenia przez Boga: „Stworzenie z upragnieniem oczekuje objawienia się synów BoŜych. Stworzenie bowiem zostało poddane marności - nie z własnej chęci, ale ze względu na Tego, który je poddał - w nadziei, Ŝe równieŜ i ono zostanie wyzwolone z niewoli zepsucia, by uczestniczyć w wolności i chwale dzieci BoŜych. Wiemy przecieŜ, Ŝe całe stworzenie aŜ dotąd jęczy i wzdycha w bólach rodzenia” (Rz 8, 19-22).

Św. Paweł w „Liście do Rzymian” otwiera głęboko duchową perspektywę świata stworzonego, świata roślin, który nie tylko „jest dobry”, jak mówi Bóg przy stworzeniu (Księga Rodzaju), ale mimo skaŜenia złem i śmiercią (wskutek grzechu człowieka), odradza się i dostępuje „wyzwolenia z niewoli zepsucia”. Świat roślin jest zatem miejscem objawienia się Boga, miejscem przyjścia Syna BoŜego i miejscem zamieszkania Ducha Świętego w ludzkim ciele. Świat ten nie jest jednak światem na sposób panteistyczny, jak w innych religiach, lecz jest światem świętości, mistyki, uczestnictwa w Ŝyciu Stwórcy. Jest to obecność w świecie stworzonych roślin wszystkich Trzech Osób Boskich i spirytualizacja materii47 (m.in. wspomniany symbol trójlistnej koniczyny niesie w swoim kształcie tą treść teologiczną). Chrześcijaństwo uczy, Ŝe Chrystus jako „ośrodek wszechświata i historii”48 przez Wcielenie wkracza w Ŝycie świata, a przez dzieło Odkupienia wybawia świat z grzechu, cierpienia i śmierci. Jednak świat to człowiek i stworzenie, dlatego moŜemy mówić, Ŝe Chrystus odkupił nie tylko samego człowieka, ale równieŜ przyrodę, rośliny i zwierzęta. „KaŜda roślina, której nie sadził mój Ojciec niebieski, będzie wyrwana” (Mt 15, 13) powiedział Jezus do faryzeuszy, którzy odrzucili Dobrą Nowinę o zbawieniu. Świata stworzonego jednak nie potępił. W sensie ścisłym, w myśl Pisma Świętego, nauczania Kościoła i refleksji teologicznej, moŜna powiedzieć, Ŝe fakt zmartwychwstania Chrystusa jest obietnicą i nadzieją dla całej przyrody49, i roślin równieŜ. Nieprzypadkowo, świat roślin był dla Chrystusa nie tylko środowiskiem Ŝycia, lecz takŜe pozwalał na wykorzystanie do gło-szonych przez siebie prawd. Jezus mówił o liliach, które były piękniejsze od przepychu Salomona (Mt 6, 27-29), o ziarnku gorczycy (Mt 13, 31-32), o trzcinie (Mt 12, 20), o chwaście (Mt 13, 37-38), o kłosach zbóŜ (Mt 12, 1), o drzewie figowym (Łk 21, 29-30). Tak jak w ludzkiej historii zbawienia, dopełnieniem stworzenia jest paruzja, powtórne przyjście Chrystusa na końcu czasów, tak teŜ obecny świat przyrody (świat roślin) równieŜ zostanie odrodzony, pozbawiony niedoskonałości („I ujrzałem niebo nowe i ziemię nową” Ap 21, 1). Będzie to świat rzeczywisty, a zarazem doskonały, złoŜony tak samo, jak obecnie z roślin i krajobrazu, lecz przekształcony na doskonałe środowisko Ŝycia dla nowego człowieka. Bóg mocą zmartwychwstania odnowi świat na końcu czasów i rośliny nie przestaną istnieć, tylko zostaną przeniknięte BoŜą miłością, która nie unicestwia, lecz wyzwala z „niewoli znikomości”50. (MoŜe taką namiastką wiecznej miłości w świecie roślin jest kwiat róŜy ...)

Ta głęboka teologia przyrody była bliska początkom chrześcijańskiej nauki (w prostej katechezie), oraz średniowiecznym dziełem scholastycznym. Zawsze

47 URBAŃSKI St. 2001. Mistyka ekologicznej duchowości świata, w: Ochrona środowiska społe-czno-przyrodniczego w filozofii i teologii. Dołega J.M., Czartoszewski J.W., Skowroński A. (Red.), Wydawn. Uniwersytetu Kardynała Stefana Wyszyńskiego, Warszawa: 313-314. 48 Jan Paweł II, Encyklika Redemptor hominis 1. 49 KĘDZIERSKI P. 1997. Kościół i ekologia. WyŜsze Seminarium Duchowne w Rzeszowie, Rze-szów: 64, 70. 50 Konstytucja duszpasterska o Kościele w świecie współczesnym Soboru Watykańskiego II (KDK 39). Cyt. za: Paruzja dopełnieniem stworzenia, (oprac. zespołu), w: Konferencje eko-logiczne, Fetkowski A. (Red.), Zakład Ekologii Człowieka KUL, Lublin 1995: 104-105.


25

chrześcijańskie widzenie świata roślin i zwierząt było przeniknięte Duchem, a wielu świętych i uczonych tamtych czasów opierało swoją wiarę i wiedzę przede wszystkim na Bogu i na interpretacji dzieła stworzenia. Na przykład Filon z Aleksandrii udowadniał, Ŝe stworzenie roślin w trzecim dniu, przed słońcem w czwartym dniu, ma pokazać człowiekowi, Ŝe nie słońce jest dawcą Ŝycia i wzrostu, lecz Bóg51. W wiekach średnich panowała nawet oryginalna doktryna teologiczno-przyrodnicza zwana „egzemplaryzmem” - sztuką odnajdywania Boga we wszystkich stworzeniach, które są Jego symbolem lub obrazem. W staroŜytnych i średniowiecznych florariach moŜna znaleźć przeróŜne symbole religijne roślin, drzew, ziół, przypraw, zbóŜ, jarzyn i kwiatów52 oraz opisy religijnych znaczeń części roślin: kłosu, kory, korzenia, skórki owocu, kwiatu, liści, słomy (łodygy), czy ziarna.

Przedmiotem religijnej refleksji poddawano nie tylko Ŝywe rośliny, ale takŜe, np. drewno, materiał czysty, szlachetny, wzbudzający szacunek i sympatię. W średniowieczu chrześcijańskim uwaŜano drewno za materia prima, wykorzystując je w rzeźbie sakralnej (aniołowie, święci), oraz sięgając głębiej - do ideału drewna Świętego KrzyŜa, nieprzypadkowo podkreślając teŜ, Ŝe Jezus był synem cieśli53.

Z średniowiecznych chrześcijańskich tradycji religijno-filozoficznych na uwagę zasługuje postawa świętych (Ojcowie pustyni, św. Antoni Pustelnik, św. Benedykt), którzy zarówno w postępowaniu, jak i w swoich pismach (nauczaniu) ukazali praktyczny wymiar biblijnej i teologicznej nauki o stworzeniu oraz - powiedzielibyśmy dzisiaj - „ekologicznego” traktowania roślin czy zwierząt. Wybitną postacią w tym zakresie był św. Franciszek z AsyŜu (ur. latem lub jesienią 1181 r. w AsyŜu, zm. 3 X 1226 r. w Porcjunkuli pod AsyŜem), który stworzył nie tylko swoistą etykę szacunku dla stworzeń, ale w swojej mistyce i odniesieniu do Boga pokazał, jak bardzo waŜnym elementem Ŝycia i ducha osoby ludzkiej są nawet najprostsze organizmy Ŝywe54. Rośliny, zwłaszcza w swoim pięknie ubogacają otaczający świat i są odbiciem piękna i mądrości Stwórcy. Św. Franciszek rozpoczął swoją medytację przyrody od krzyŜa w zaniedbanym kościółku San Damiano. Doszedł do takiego mistycznego zrozumienia stworzeń, Ŝe w słynnej „Pieśni Słonecznej” nie zawarł ani jednego słowa o zmartwychwstaniu Chrystusa, a świat widział juŜ odkupionym, uduchowionym i doskonałym: „(...) Pochwalony bądź, Panie mój, przez siostrę naszą matkę ziemię, która nas Ŝywi i chowa, wydaje róŜne owoce z barwnymi kwiatami i trawami”.

Św. Franciszek z AsyŜu uznaje „wszelkie stworzenie” za „drabinę, po której wstępował, aby spotkać Tego, który jest cały godny pragnienia (Pnp 5, 16)”. Cały świat przyrody (a więc i rośliny) w ujęciu pism, prac teologicznych i tradycji św. Franciszka zyskuje nie tylko znane w innych religiach oceny etyczne, ale poprzez mistykę stworzenia i ducha BoŜego obecnego w roślinach, zwierzętach, ptakach i owadach, franciszkanizm wchodzi głęboko w samą istotę Ŝycia i pozwala na „uduchowienie” Ŝycia nawet na poziomie molekularnym, stawiając ingerencjom genetycznym jeszcze

51 KOBIELUS St.. Florarium christianum. Symbolika roślin. dz. cyt.: 10. 52 ostatnio wydanym zbiorze chrześcijańskich symbolów roślinnych, samych roślin jest opi-sanych około 120 gatunków, por. KOBIELUS St. Florarium christianum. Symbolika roślin. dz. cyt. 53 PASTOUREAU M. 2006. Średniowieczna gra symboli. Oficyna Naukowa, Warszawa: 93-95. Dyskusyjna jest moim zdaniem argumentacja cytowanego autora, Ŝe „teksty kanoniczne nie określały dokładnie zawodu Józefa” (s. 94). Powszechnie uŜywany tekst Biblii Tysiąclecia wyraźnie wskazuje na Jezusa jako „syna cieśli” (Mt 13, 55) i bezpośrednio mówi o Jezusie „jest to cieśla” (Mk 6, 3) [przyp. mój: J. B.]. 54 „RozwaŜając początek wszystkich stworzeń [Franciszek] oŜywiał coraz bardziej swą po-boŜność i wszystkie stworzenia, choćby najmniejsze, nazywał braćmi lub siostrami, poniewaŜ wiedział, Ŝe razem z nim pochodzą z tego samego Źródła”. Św. Bonawentura, śyciorys Większy św. Franciszka, rozdz. VIII 6: 1-11.

J. Brusiło

26

większe wymagania religijne i filozoficzne niŜ „zwykłe” etyczne zakazy czy warunki w modyfikacjach roślin.

Zarówno św. Franciszek, jak i teologia średniowieczna głęboko afirmują rośliny i całe stworzenie. BliŜsza naszym czasom, św. Teresa Benedykta od KrzyŜa - Edyta Stein, badając filozofię i teologię św. Augustyna i św. Tomasza z Akwinu przeprowadziła ciekawą refleksję nad duszą roślin. Według niej dusza rośliny istnieje przede wszystkim w powiązaniu ze światem zewnętrznym, nie tylko w kształtowaniu materii, ale takŜe istnieniem samym w sobie55. Współczesne kwestie dotyczące hierarchii wartości w przyrodzie, znaczenia roślin w Ŝyciu człowieka i biosfery (zawłaszcza na tle ostatnio nagłaśnianego problemu ocieplania klimatu i redukcji dwutlenku węgla) przekładają się zazwyczaj na poszukiwania rozwiązań etycznych i poprawnych eko-filozofii. Alternatywne do chrześcijańskiej, „nowoczesne” wizje równości między człowiekiem a naturą (czyli np. zrównanie statusu osoby ludzkiej z istnieniem roślin), nie pomogą w Ŝyciu na naszej planecie ani człowiekowi, ani roślinom. Nawet tworzenie panteistycznych pseudoreligii (jak w koncepcji E. Haeckla56, czy znane idee New Age) nie mogą zmienić wielowiekowych, bogatych tradycji wielkich religii w kontekście świata przyrody dawnych i obecnych cywilizacji. Współczesne nauczanie Kościoła katolickiego o roślinach

Najmłodszą częścią w chrześcijańskiej koncepcji Ŝycia roślin są wypowiedzi Nauczycielskiego Urzędu Kościoła, które nie tylko uzupełnia, rozbudowuje biblijną i tradycyjną myśl religijną o stworzeniu, ale - zwłaszcza w nauczaniu Jana Pawła II - kreśli nowe, adekwatne do współczesnych problemów ekologicznych i cywilizacyjnych koncepcje troski o zagroŜony świat przyrody, odpowiedzialności człowieka za przyszłość środowiska oraz apeluje o zachowanie zasad i praw Stwórcy wszelkiego Ŝycia.

Analizę całości bogatego nauczania Kościoła katolickiego na temat roślin, przyrody i ekologii pewnie trzeba będzie odłoŜyć na inną okazję, objętościowo wykraczałaby ona poza ramy tego artykułu, ale z punktu widzenia religijnego, warto w tym miejscu odnotować przynajmniej jeden dokument: „Wspólna deklaracja PapieŜa Jana Pawła II i Patriarchy Bartłomieja I, O obowiązku szanowania świata stworzonego”57. W pełnych nadziei słowach, nie tylko z racji religijnych, ale teŜ humanistycznych Deklaracja ta kreśli perspektywę odnowy ludzkiego spojrzenia na przyrodę, rośliny i zwierzęta tak, by moŜna było wrócić do „przywrócenia pierwotnej harmonii”. Dokument formułuje trzy postulaty:

„Po pierwsze, musimy na nowo przyjąć postawę pokory i uznać ograniczoność naszej władzy, a co waŜniejsze — naszej wiedzy i zdolności wydawania sądów. Podejmujemy decyzje, działamy i ustalamy wartości, które oddalają nas od takiego świata, jakim powinien on być, od BoŜego planu stworzenia, od wszystkiego, co istotne 55 DYDUCH-FALNIOWSKA A., GRZEGORCZYK M. 2000. Dusze roślin i zwierząt, w: Między niebem a ziemią. Ku etyce ekologicznej. Dyduch-Falniowska A., Grzegorczyk M., Kijas Z., Mirek Z. (Red.), Instytut Ochrony Przyrody PAN, Kraków: 178. 56 ŁUKOMSKI J. 2000. Próba zbudowania chrześcijańskiej etyki środowiska naturalnego. Wydaw-n. Jedność, Kielce: 123. 57 W dniach 5-10 czerwca 2002 r. odbyło się w Wenecji pod patronatem Ekumenicznego Patriarchy Konstantynopola Bartłomieja I sympozjum poświęcone «Religii, nauce, środowisku». Podczas ostatniej sesji, 10 czerwca w weneckim Pałacu DoŜów, została podpisana przez Jana Pawła II i Bartłomieja I wspólna deklaracja o ochronie dzieła stworzenia. ”L’Osservatore Romano”, wyd. pol. n., 10-11/2002: 4-5.


27

dla zdrowia naszej planety oraz całej wspólnoty ludzkiej. Potrzeba nowego podejścia i nowej kultury, opartych na przekonaniu o centralnym miejscu osoby ludzkiej w dziele stworzenia oraz na postępowaniu zgodnym z etyką środowiskową wywodzącą się z trojakiej więzi: z Bogiem, samym sobą i ze stworzeniem. Taka etyka sprzyja wzajemnej zaleŜności i kładzie nacisk na zasady powszechnej solidarności, sprawiedliwości społecznej i odpowiedzialności, dzięki czemu moŜliwe staje się krzewienie prawdziwej kultury Ŝycia.

Po drugie, musimy uczciwie przyznać, Ŝe ludzkość ma prawo do czegoś lepszego niŜ to, co dostrzegamy wokół siebie. My sami, a tym bardziej nasze dzieci i przyszłe pokolenia, mamy prawo do lepszego świata, świata wolnego od zniszczenia, przemocy i rozlewu krwi, świata, w którym panują wspaniałomyślność i miłość.

Po trzecie, świadomi wartości modlitwy, musimy wytrwale prosić Boga Stwórcę, by oświecił wszystkich ludzi i przekonał ich o obowiązku szanowania i strzeŜenia z troską świata stworzonego”58.

Dzięki wspomnianemu papieŜowi, którego nauczanie proekologiczne stanowi współcześnie nie tylko najnowszą wykładnię dokumentów Kościoła katolickiego o człowieku i przyrodzie, ale którego etyka pozwala na zbudowanie w przyszłości jeszcze lepszych rozwiązań ekoetycznych dla nauki, technologii i postępu cywilizacyjnego świata. Wydaje się waŜniejszym, nie tylko to co ludzkość zrobi obecnie ze zniszczonym środowiskiem i skutkami globalnego ocieplenia, ale to jak według ducha doskonałości stworzenia (który wyraŜają wielkie religie) dla dobra człowieka potraktować przyszłość inŜynierii genetycznej roślin, wykorzystać bezpiecznie Ŝywność zmodyfikowaną genetycznie, zachować róŜnorodność genetyczną i ocalić moŜliwie wszystkie gatunki roślin i zwierząt w skali globalnej dla wielu następnych pokoleń. Mimo wielu nieznanych jeszcze konsekwencji tych głębokich ingerencji, Kościół katolicki wyraŜa bardziej ostroŜne przyzwolenie, niŜ kategoryczny zakaz, pod warunkiem zachowania odpowiedniej perspektywy antropologicznej i teologicznej.

W najnowszych interpretacjach ekoetyki Jana Pawła II, jako reprezentanta chrześcijaństwa w temacie modyfikacji roślin i przyrody mówi się o umiarkowanym antropocentryzmie aksjologicznym albo o teocentryzmie. W istocie, ostatecznie w działaniu człowieka to Bóg powinien być ostateczną racją wszelkich zmian środowiska i modyfikacji in vivo i in vitro roślin. Jan Paweł II słusznie uznaje, Ŝe przyszłość świata stworzonego przez Boga wykracza poza to, co jest potrzebne ze środowiska człowiekowi59. Człowiek posiadający potęŜne narzędzia budowania (i niszczenia...) zawsze sobie poradzi, ale przyroda nie ma takich moŜliwości, dlatego teŜ nie tylko racje nadprzyrodzone, religijne (jak w religiach Wschodu), lecz pogłębiona refleksja teologiczna i antropologiczna (jak w chrześcijaństwie) jest w stanie ochronić świat przyrody przed zniszczeniem. To jest zadanie dla szeroko pojętego duszpasterstwa, teologii praktycznej chrześcijan zatroskanych o dziką i zmodyfikowaną przyrodę, oraz dla nauki i wiary60.

58 TamŜe: 5. 59 SZEBESTA A. 2007. Ekoetyka w nauczaniu Jana Pawła II, w: Ks. Karol Wojtyła - Jan Paweł II miłośnik gór i przyrody. Mat. z konf. nauk. zorganizowanej w Akademii Wychowania Fizycznego w Krakowie, 13 października 2005 roku, Wójcik W.A. (Red.), AWF Kraków, Polskie Towarzystwo Turystyczno-Krajoznawcze Centralny Ośrodek Turystyki Górskiej, Kraków: 126. 60 „W sferze badań przyrodniczych rozpowszechniła się stopniowo mentalność pozytywistyczna, która nie tylko zerwała wszelkie powiązania z chrześcijańską wizją świata, ale - co waŜniejsze - zrezygnowała teŜ z wszelkich odniesień do wizji metafizycznej i moralnej. W wyniku tego zaistniało niebezpieczeństwo, Ŝe niektórzy ludzie nauki, rezygnując z jakichkolwiek odniesień etycznych, nie stawiają juŜ w centrum swej uwagi osoby ludzkiej i całości jej Ŝycia. Co więcej, część z nich, świadoma moŜliwości otwartych przez rozwój techniki, wydaje się ulegać nie tylko

J. Brusiło

28

Zakończenie

Z perspektywy wielkich duchowości świata, religie Wschodu i Zachodu z szacunkiem odnoszą się do istnienia zarówno wieloletniego, potęŜnego dębu, w którym wiele ludów widzi wieczne bóstwo, jak i do delikatnego, jednodniowego źdźbła trawy, która stanowi pokarm dla zwierząt i stanowi dowód na potęgę Ŝycia, które pochodzi od Stwórcy. Z biegiem historii, poszczególne systemy religijne w swoim stosunku do przyrody przechodzą pewną ewolucję: od ubóstwienia roślin i zwierząt, poprzez wkomponowanie przyrody w słuŜbę człowiekowi, ustalenie charakterystycznej dla duchowości hierarchii przyrody i skierowanie całego Ŝycia ku Bogu, aŜ po włączenie świata istot Ŝywych w BoŜe dzieło odkupienia człowieka i udoskonalenia natury. Zawsze człowiek jest szczególną częścią tej ewolucji i dziś lekkomyślnie zawłaszczając biosferą całej planety, musi bardziej sięgać do filozofii i religii, aby nie zniszczyć siebie i przyrody. Ani ekocentryczne uduchowienie przyrody, ani desakralizacja Ŝycia środowiska naturalnego nie jest duchową przyszłością dla najmniejszej nawet roślinki. Są to jednak wartości nadprzyrodzone. Zachowanie BoŜych zasad w wielkich religiach w perspektywie globalnych moŜliwości modyfikacji świata przyrodniczego są szansą dla integralnego, adekwatnego i transcendentalnego Ŝycia człowieka. Człowiek ten został umieszczony w świecie, który po całym dziele stworzenia przez Boga był przecieŜ „bardzo dobry” (Rdz 1, 31).

Chrześcijaństwo, czerpiące swe źródła ze Starego i Nowego Testamentu (który jest takŜe wielką księgą o stworzeniu przyrody), wraz ze współczesnym nauczaniem Kościoła katolickiego o przyrodzie, jej przemianach i przyszłości wyraŜa dla całego świata istotne przesłanie. Szacunek naleŜy się kaŜdemu Ŝywemu stworzeniu, kaŜdej roślinie (jak np. w buddyzmie i hinduizmie), takŜe zachwyt nad pięknem przyrody (jak np. w islamie), potrzebna jest jednak przede wszystkim troska o przyszłość (istnienie) przyrody nietkniętej jeszcze przez cywilizację oraz praktyczne, odpowiedzialne i wręcz mistyczne (jak u św. Franciszka z AsyŜu) podejście do jakichkolwiek modyfikacji przyrodniczych61, aby Ziemia i jej zasoby nadal cieszyła ludzkość nie w duchu uŜyteczności dla człowieka, ale w duchu stworzenia przez Boga. Słowa kluczowe: Bóg, buddyzm, etyka, hinduizm, ochrona śeodowiska, przyroda Streszczenie

Człowiek od początku swojego istnienia rodził się, wzrastał i umierał wśród roślin, stąd w religiach pierwotnych i współczesnych przyroda miała dla ludzkości znaczenie teologiczne.

W buddyzmie, zwłaszcza w odmianie tybetańskiej (Tibetan Buddhism), wśród wysokich gór i surowych warunkach klimatycznych, rośliny były leczniczym darem bogów, źródłem energii, uosobieniem licznych tybetańskich demonów i bóstw. W

logice rynku, ale takŜe pokusie zdobycia demiurgicznej władzy nad przyrodą, a nawet nad samym bytem ludzkim”. Jan Paweł II, Encyklika o relacjach między wiarą a rozumem Fides et ratio, 46. 61 Świadomie pomijam kwestię jak poprawnie interpretować nakaz dany dla człowieka w Księdze Rodzaju „abyście zaludnili ziemię i uczynili ją sobie poddaną” (1, 28), poniewaŜ biblijne znaczenie tego zapisu nie dotyczy wprost rozumienia „modyfikacji” w naszym temacie i znajduje wyczerpujące przedstawienie w innych analizach. Por. SYNOWIEC J. St., Na początku. Pradzieje biblijne: Rdz 1, 1-11, 9, wyd. II popr. i rozszerz., Bratni Zew, Kraków 1996: 74-75.


29

hinduizmie (Hindoo) oprócz funkcji Ŝyciodajnej i leczniczej, rośliny stanowią część porządku istnienia, posiadają funkcje duchowe i zmysłowe. Islam przynosi jeszcze jedno znaczenie teologiczne roślin – są one dowodem na istnienie Boga i darem Boga dla ludzi, stąd często pełnią funkcję estetyczną, słuŜą do ozdabiania świątyń i domów mieszkalnych.

W świętych księgach judaizmu, rośliny i całą naturę uwaŜa się za czującą i myślącą, dlatego teŜ w tej religii pojawiają się pierwsze przepisy religijno-etyczne chroniące środowisko przyrodnicze – Bóg jest w Biblii dawcą przykazań i prawa chroniącego całą przyrodę, która ma słuŜyć człowiekowi. Chrześcijaństwo, ściśle związane ze światem zachodnim, rozwija judaistyczne wątki etyki środowiska na-turalnego m.in. w formie mistyki św. Franciszka z AsyŜu oraz rozbudowanego w naszych czasach nauczania Kościoła katolickiego na temat środowiska naturalnego. Pismo Święte i tradycja chrześcijańska wykorzystywały przykłady roślin do ukazywania prawd religijnych, włączały przyrodę w dzieło zbawienia i dały podstawę do współczesnej chrześcijańskiej etyki środowiska naturalnego. Nauczanie Kościoła katolickiego, szczególnie w dokumentach papieŜa Jana Pawła II, włącza się w globalną debatę na temat problemów ekologicznych i cywilizacyjnych. Jednym z waŜnych apeli o zachowanie zasad i praw zagroŜonej przyrody jest Deklaracja wspólna papieŜa Jana Pawła II i patriarchy Bartłomieja I: „O obowiązku szanowania świata stworzonego” (2002 r.), (Common Declaration of John Paul II and The Ecumenical Patriarch His Holiness Bartholomew I on Environmental Ethics – 2002). GREAT RELIGIONS OF THE WORLD IN RELATION TO PLANTS AND THEIR MODIFICATIONS Jerzy Brusiło Order of the Conventual Minor Brother, Interfaculty Department of Bioethic, Papal Theological Academy, Kraków Key words: God, Buddhism, environmental protection, ethic, Hinduism, Islam,

Judaism, nature Summary

Since the beginning of his existence man was born, grew up, and died among plants, thus both in primeval and contemporary religions nature has theological meaning for human beings.

In Buddhism, especially in its Tibetan version (Tibetan Buddhism), among high mountains and in serious environmental conditions plants were considered to be medical gift from gods, energy source and personification of numerous Tibetan gods and demons. In Hinduism (Hindoo) apart from life-giving and medical functions, plants are a part of the order of universe playing spiritual and sensual functions. Islam brings another theological meaning of plants – they are the proof for God existence and gift from God to people, thus they often play an esthetic role as temple and house decoration.

In the Judaic Holly Books plants and the entire nature are considered to be beings that are able to feel and think, thus this religion presents us with the first religious-ethic rules protecting the environment. God in the Bible is a donor of commandments and the law protecting the entire environment that should serve human beings. Christianity, as

J. Brusiło

30

close connected with the western world develops the Judaic trends of environmental ethic, e.g. in the form St. Francis of Assisi mysticism as well as the teaching of the Church on the natural environment, greatly developed at the present time. Both the Scriptures and Christian tradition used the examples of plants to demonstrate the religious truth, including nature into the act redemption and giving the base for the present Christian ethic of natural environment. The teachings of Catholic Church especially in the documents by John Paul II joins the global discussion on ecological and civilization problems. One of the very important appeal for the preservation of rules and rights of endangered nature is „Common Declaration of John Paul II and The Ecumenical Patriarch His Holiness Bartholomew I on Environmental Ethics” (2002). Dr ks. Jerzy Brusiło Międzywydziałowy Instytut Bioetyki Papieska Akademia Teologiczna ul. Franciszkańska 1 31-004 KRAKÓW

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 33-41 WPŁYW SUBSTANCJI WZROSTOWYCH NA PLOIDALNOŚĆ TKANEK ŚNIEśYCZEK ROZMNAśANYCH TECHNIKĄ in vitro 1 Anna Bach, BoŜena Pawłowska Katedra Roślin Ozdobnych, Akademaia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp

ŚnieŜyczki naleŜą do popularnych i cenionych cebulowych roślin wiosennych. ŚnieŜyczka Elwesa (Galanthus elwesii HOOK) pochodząca z Azji Mniejszej jest masowo pozyskiwana ze stanowisk naturalnych i stanowi jedną z najwaŜniejszych ozdobnych roślin cebulowych eksportowanych z Turcji do Europy Zachodniej. ŚnieŜyczka przebiśnieg (Galanthus nivalis L.) jest chronionym gatunkiem krajowym występującym na Podkarpaciu i uprawianym w ogrodach od XVI wieku. Tradycyjny, wegetatywny sposób rozmnaŜania śnieŜyczek z cebul przybyszowych jest powolny i mało wydajny, a osobniki rozmnaŜane generatywnie nie powtarzają cech roślin matecznych. Jednym ze sposobów zwiększenia wydajności tego procesu jest zastosowanie metody in vitro [BACH i in. 2002, 2003; BACH, PAWŁOWSKA 2005; CANTLIFFE 2001; TIPIRDAMAZ i in. 2000].

Liczne przykłady w literaturze wskazują na istnienie genetycznej zmienności w kulturach in vitro, która moŜe być związana ze zmianą wielkości genomu roślin oraz poziomu ploidalności. Szczególnie komórki tworzące kalus nie stanowią jednolitej pod względem genetycznym populacji i przynajmniej część z nich moŜe ulec daleko idącym modyfikacjom [KONONOWICZ 1990; VAN HERMELEN i in. 1997]. Poziom ploidalności moŜna określić na podstawie zawartości DNA w jądrach komórkowych. Znając stopień ploidalności roślin kontrolnych, poprzez porównanie połoŜenia pików odpowiadających tym samym fazom cyklu komórkowego, moŜna oznaczyć stopień ploidalności badanych roślin [DOLEZEL 1991; DOLEZEL i in. 1998; ŚLIWIŃSKA 2002].

1 Badania realizowano w ramach projektu badawczego nr 3 P0 4G 11625 finansowanego przez Komitet Badań Naukowych.

Materiał i metody

Badaniom cytometrycznym poddano łuski cebulowe pobrane z młodych cebul śnieŜyczek (Galanthus elwesii HOOK i Galanthus nivalis L.). Cebule te uzyskano wyniku rozmnaŜania techniką in vitro na drodze organogenezy i somatycznej

A. Bach, B. Pawłowska

34

embriogenezy, a materiałem wyjściowym do załoŜenia kultur były łuski cebulowe pobierane z cebul roślin rosnących na kolekcji Katedry Roślin Ozdobnych Akademii Rolniczej w Krakowie.

Przebadano rośliny z 3-6 letnich kultur in vitro, uprawiane na poŜywce według MURASHIGE, SKOOG [1962] zestalonej agarem (7 g⋅dm-3) lub płynnej, z dodatkiem róŜnych substancji wzrostowych (cytokinina BA, auksyny: NAA, IAA, Picloram).

Analizom poddano łącznie 9 grup cebul, w tym 7 grup Galanthus elwesii (w kaŜdej przebadano 5 obiektów) pochodzących z następujących kultur: Kultury załoŜone w roku 2000: 1. inicjacja na poŜywce 25 µM BA i 0,1 µM NAA, dojrzewanie na poŜywce

zawierającej 1 µM BA i 0,1 µM NAA; 2. inicjacja na poŜywce 10 µM Picloram i 1 µM BA, róŜnicowanie i dojrzewanie na

poŜywce zawierającej 10 µM BA i 1 µm NAA, a potem 1 µM BA i 0,1 µM NAA;

3. inicjacja na poŜywce 25 µM Picloram i 1 µM BA, róŜnicowanie i dojrzewanie na poŜywce zawierającej 10 µM BA i 1 µm NAA, a potem 5 µM BA i 0,1 µM NAA;

4. inicjacja na poŜywce 10 µM Picloram i 1 µM BA, róŜnicowanie i dojrzewanie na poŜywce zawierającej 10 µM BA i 1 µm NAA, a potem 5 µM BA i 0,1 µM NAA;

5. inicjacja kalusa na poŜywce 25 µM Picloram i 1 µM BA, namnaŜanie w bioreaktorze na identycznej lecz płynnej poŜywce przez 40 dni (gęstość ino-kulum 5 g na 150 ml poŜywki), dojrzewanie na poŜywce stałej 10 µM BA i 1 µm NAA, a potem 5 µM BA i 0,1 µM NAA.

Kultury załoŜonych w roku 2003: 1. inicjacja i uprawa na poŜywce zestalonej agarem zawierającej 1 µM IAA i 0,1

µM BA; 2. inicjacja i uprawa na poŜywce wzbogaconej w 1 µM BA i 0,1 µM IAA

Analizom poddano takŜe 2 grupy cebul Galanthus nivalis (w kaŜdej przebadano 5 obiektów), pochodzące z kultur załoŜonych w roku 2003: 1. inicjacja i namnaŜania na poŜywce 5 µM BA i 0,5 µM NAA; 2. inicjacja i namnaŜania na poŜywce 5 µM BA i 0,5 µM NAA, następnie uzyskane

cebule (łuski) uprawiano w bioreaktorze na identycznej lecz płynnej poŜywce przez 40 dni (gęstość inokulum 5 g na 150 cm3 poŜywki), potem na poŜywce zestalonej agarem bez regulatorów wzrostu.

Kontrolę w badaniach cytometrycznych stanowiły cebule obu gatunków śnieŜyczek, które nie były uprawiane in vitro, pozyskano je z uprawy polowej, z Kolekcji Katedry Roślin Ozdobnych AR w Krakowie.

Przeznaczone do badań łuski cebulowe rozdrabniano pojedynczo na płytce Petriego, za pomocą Ŝyletki, w obecności 1 cm3 buforu lizującego i barwnika fluorochromowego indolo-4’,6-dwuamidyno-2-fenylidyny (DAPI, DNA staining solution, Partec, Munster, Niemcy). Następnie dodawano 2 cm3 wody destylowanej i zawartość filtrowano przez filtr nylonowy o średnicy oczek 50 µm. Przefiltrowana próba była analizowana za pomocą cytometru przepływowego Partec CA II (Munster, Niemcy). Dla kaŜdej próby badano 1500-2000 komórek. W sumie dokonano analizy łusek cebulowych z 55 roślin.

WPŁYW SUBSTANCJI WZROSTOWYCH NA PLOIDALNOŚĆ TKANEK ...

35

Wyniki i dyskusja

Zastosowana wydajna metoda rozmnaŜania śnieŜyczek (Galanthus elwesii i Galanthus nivalis) na poŜywkach zawierających cytokininę pozwoliła na uzyskanie pąków przybyszowych, z których rozwijały się cebule przybyszowe [BACH, PAWŁOWSKA 2005]. UŜycie poŜywki wzbogaconej w Picloram zwiększyło współczynnik namnaŜania, a powstałe licznie zarodki somatyczne rozwijały się w rośliny [BACH i in. 2002, 2003].

Mechanizmy warunkujące zmienność genetyczną komórek w kulturach in vitro wynikają z ukrytej zmienności komórek eksplantatu albo stanowią efekt samej hodowli [JOACHIMIAK, ILNICKI 1997]. Cytometria przepływowa jest szybkim narzędziem diagnostycznym, które moŜe być zastosowane do określenia wielkości genomu - ilości DNA w komórkach roślin rosnących na stanowisku naturalnym, uzyskanych w wyniku prac hodowlanych oraz uprawianych w warunkach in vitro [BARBA-GONZALEZ i in. 2005; PALOMINO 2000; SILJAK-YAKOVLEV i in. 2003; ZONNEVELD i in. 2003]. Galanthus elwesii oraz Galanthus nivalis są roślinami diploidalnymi 2 n = 2x = 24 [SVESHNIKOVA 1965, 1975].

Wykonane na cytometrze przepływowym badania stopnia ploidalności uzys-kanych z zarodków somatycznych cebul śnieŜyczek Elwesa wykazały w testowanych próbach obecność osobników o zwiększonej liczbie chromosomów (3 n). Wszystkie poddane badaniom rośliny, pochodzące z kultur załoŜonych w roku 2000, gdy kalus embriogeniczny był indukowany i namnaŜany na poŜywce zawierającej auksynę Picloram (10-25 µM), (poŜywka stała lub płynna w bioreaktorze) były triploidalne. Podobnie VAN HARMELEN i in. [1997] w regenerantach uzyskanych z 3-letniej kultury kalusa L. longiflorum odm. Gelria stwierdzili zmiany w poziomie ploidalności.

Natomiast w testowanych próbach cebul śnieŜyczki Elwesa, pochodzących z kultur pąków przybyszowych inicjowanych w 2000 roku lub w 2003 roku, na po-Ŝywkach zawierających cytokininę BA, nie stwierdzono obecności haploidów ani poliploidów (rys. 1A-C). TakŜe w badanych próbach śnieŜyczki przebiśniegu nie znaleziono osobników o zmienionej ploidalności, gdy kultury inicjalne były wykładane na poŜywkę stałą, zawierającą cytokininę BA (5 µM). Podobnie WICKREMESINHE i in. [1994] oraz KĘDRA, BACH [2005] badając regeneranty lilii uzyskane z pąków przybyszowych na poŜywkach stałych, stwierdzili tylko obecność osobników diploidalnych, o poziomie ploidalności identycznym jak u roślin kontrolnych, nie pochodzących z kultur in vitro. Wprowadzenie uzyskanych łusek cebulowych snie-Ŝyczek do bioreaktora i namnaŜanie ich w płynnej poŜywce z cytokininą pozwoliło na uzyskanie pąków przybyszowych i cebul. Jednak spośród badanych w tej grupie cebul, 20% nowopowstałych roślin, miało zwiększoną ploidalnośc (3 n), (rys. 1D-E).


36

File: Sample_055 Date: 09-11-2006 Time: 00:34:35 Particles: 999 Acq.-Time: 17 s

0 100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100

FL4

counts

0 100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100

FL4

counts

RN1RN2

RN3

RN4

partec PAS

Region Gate Ungated Count Count/ml %Gated Mean-x CV-x% Mean-y CV-y%RN1 <None> 0 0 - 0.00 - - - - RN2 <None> 0 0 - 0.00 - - - - RN3 <None> 0 0 - 0.00 - - - - RN4 <None> 0 0 - 0.00 - - - -

A


1 10 100 10000

20

40

60

80

100

FL4

counts

1 10 100 10000

20

40

60

80

100

FL4

counts

RN1RN2

RN3

RN4

partec PAS

Region Gate Ungated Count Count/ml %Gated Mean-x CV-x% Mean-y CV-y%RN1 <None> 0 0 - 0.00 - - - - RN2 <None> 1 1 - 0.15 3.86 0.00 - - RN3 <None> 0 0 - 0.00 - - - - RN4 <None> 0 0 - 0.00 - - - -

D


0 100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100

FL4

counts

0 100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100

FL4

counts

RN1RN2

RN3

RN4

partec PAS


B


1 10 100 10000

20

40

60

80

100

FL4

counts

1 10 100 10000

20

40

60

80

100

FL4

counts

RN1RN2

RN3

RN4

partec PAS

Region Gate Ungated Count Count/ml %Gated Mean-x CV-x% Mean-y CV-y%RN1 <None> 0 0 - 0.00 - - - - RN2 <None> 1 1 - 0.15 3.86 0.00 - - RN3 <None> 0 0 - 0.00 - - - - RN4 <None> 0 0 - 0.00 - - - -

E


0 100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100

FL4

counts

0 100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100

FL4

counts

RN1RN2

RN3

RN4

partec PAS


C


0 100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100

FL4

counts

0 100 200 300 400 5000

20

40

60

80

100

FL4

counts

RN1RN2

RN3

RN4

partec PAS


F

Rys. 1. Zawartość DNA w jądrach komórkowych liści śnieŜyczek określona na cytometrze

przepływowym: Galanthus elwesii (A-C): A. rośliny diploidalne (2n) nie namnaŜane w kulturach in vitro (kontrola), B. rośliny namnaŜane in vitro na drodze organogenezy, w poŜywkach z dodatkiem cytokininy BA, C. rośliny (3n) uzyskane drogą somatycznej embriogenezy na poŜywkach z dodatkiem Picloramu; Galanthus nivalis (D-E): D. rośliny diploidalne nie namnaŜane w kulturach in vitro (kontrola), E. rośliny namnaŜane in vitro na drodze organogenezy, w poŜywkach stałych z dodatkiem cytokininy BA, F. rośliny triploidalne (20%) uzyskane z namnaŜania


37

łusek cebulowych w bioreaktorze drogą organogenezy Fig. 1. DNA content in nuclei of leaves of snowdrops determined by flow cytometry:

Galanthus elwesii (A-C): A. diploid plants (2n) not cultured in vitro (control), B. plants after organogenesis (medium contained BA), C. plants after somatic embryogenesis (medium contained Picloram); Galanthus nivalis (D-E): D. diploid plant (2n) not cultured in vitro (control), E. plants after organogenesis (solid medium contained BA), F. triploid plants (20%) after organogenesis (liquid medium contained BA - bioreactor culture)

Wnioski 1. Wydajna metoda rozmnaŜania śnieŜyczek Elwesa (Galanthus elwesii HOOK) w

kulturach in vitro, przez wzbudzanie pąków przybyszowych pod wpływem cyto-kininy BA nie wpłynęła na zmianę stopnia ploidalności uzyskanych roślin.

2. Somatyczna embriogeneza śnieŜyczki Elwesa w kulturach in vitro, zainicjowana Picloramem, skutkowała w przeprowadzonych badaniach powstawaniem roślin triploidalnych; wszystkie analizowane rośliny miały zwiększoną ploidalność.

3. 20% roślin śnieŜyczki przebiśniegu (Galanthus nivalis L.) powstałych na łuskach cebulowych pod wpływem cytokininy BA i namnaŜanych w bioreaktorze miało zwiększoną ploidalność (triploidy) w porównaniu do roślin kontrolnych (diploidy).

Literatura BACH A., PAWŁOWSKA B. 2005. Regeneracja śnieŜyczki przebiśniegu (Galanthus nivalis L.) w kulturach in vitro. Zmienność genetyczna i jej wykorzystanie w hodowli roślin ogrodniczych. Monografia, ISiK Skierniewice: 389-393.

BACH A., WARCHOŁ M., SAVONA M. 2002. Wpływ substancji wzrostowych na organoge-nezę i somatyczną embriogenezę u śnieŜyczki Elwesa (Galanthus elwessi Hook). Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 488: 565-569.

BACH A., WARCHOŁ M., PAWŁOWSKA B. 2003. RozmnaŜanie śnieŜyczki Elwesa (Galanthus elwessi Hook) w poŜywkach płynnych. Folia Horticulturae, Suplement 2003/2: 19-21.

BARBA-GONZALEZ R., LIM K.B., RAMANNA M.S., VAN TUYL J.M. 2005. Use of 2n Gametes for Induction intergenomic recombination in Lily Hybrids. IXth Inter. Symp. On Flower Bulbs. Acta Hortic. 673: 161-166.

CANTLIFFE D.J. 2001. Bioreaktor technology in plant cloning. Acta Horticulturae 560: 345-351.

DOLEZEL J. 1991. Flow cytometric analysis of nuclear DNA content in higher plants. Phytochem. Analysis 2: 143-154.

DOLEZEL J., GREILHUBERS J., LUCRETTI S., MEISTER A., LYSAK M.A., NARDI L., OBERMAYER

R. 1998. Plant genome size estimation by flow cytometry: inter-laboratory comparison. Annals of Botany 82 (supl. A): 17-26.

JOACHIMIAK A., ILNICKI T. 1997. Wpływ róŜnych stęŜeń 2,4-D na zróŜnicowaną prolife-rację linii komórkowych obecnych w kalusie Allium fistulosum. Zesz. Nauk. AR Poznań 318: 339-33.


38

KĘDRA M., BACH A. 2005. Morphogenesis of Lilium martagon L. explants in callus culture. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 47/1: 65-73.

KONONOWICZ H. 1990. Embriogeneza roślin in vitro. Biotechnologia 2-3: 52-59.

MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium on the growth and bioassays with tabacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497.

PALOMINO G. 2000. Genome analysis of Mexican flora. Genetics and Molecular Biology 23(4): 921-924.

SILJAK-YAKOVLEV S., PECCENINI S., MURATOVIC E., ZOLDOS V., ROBIN O., VALLES J. 2003. Chromosomal differentiation and genome size in three European mountain Lilium species. Plant Systematics and Evolution 236(3-4): 165-173.

SVESHNIKOVA L.I. 1965. Chromosome numbers of species of the genus Galanthus L. (Amaryllidaceae). Bot. Zhurn. (Moscow and Leningrad) 50: 689-692.

SVESHNIKOVA L.I. 1975. On the origin of the karyotype of genus Galanthus L. Bot. Zhurn. (Moscow and Leningrad) 60: 1760-1768.

ŚLIWIŃSKA E. 2002. Wykorzystanie cytometrii przepływowej w biotechnologii roślin. Biotechnologia 1(56): 122-128.

TIPIRDAMAZ R., ELLIALTIOGLU S., CAKIRLAR H. 2000. The micropropagation of snowdrop (Galanthus ikariae Baker.). Turkish Journal of Agriculture and Forestry 23: 823-839.

VAN HERMELEN M.J., LOEFFLER H.J.M., VAN TUYL J.M. 1997. Somaclonal variation in lily after in vitro cultivation. Acta Horticulturae 430: 347-350.

WICKREMESINHE E.R.M., HOLCOM E.J., ARTECA R.N. 1994. A practical method for pro-duction of flowering Easter lily from callus cultures. Scientia Horticulturae 60: 143-152.

ZONNEVELD B.J.M., GRIMSHAW J.M., DAVIS A.P. 2003. The systematic value of nuclear DNA content in Galanthus. Plan Systematics and Evolution 241(1-2): 89-102. Słowa kluczowe: Galanthus elwesii HOOH, Galanthus nivalis L., cytometria przepły-

wowa, ploidalność Streszczenie

ŚnieŜyczka Elwesa (Galanthus elwesii HOOK) pochodząca z Azji Mniejszej jest cenioną w ogrodnictwie ozdobnym wiosenną rośliną cebulową. Jest masowo pozyskiwana ze stanowisk naturalnych i stanowi jedną z najwaŜniejszych ozdobnych roślin cebulowych eksportowanych z Turcji do Europy Zachodniej. ŚnieŜyczka przebiśnieg (Galanthus nivalis L.) jest chronionym gatunkiem krajowym występującym na Podkarpaciu i uprawianym w ogrodach od XVI wieku. Tradycyjny wegetatywny sposób rozmnaŜania śnieŜyczek z cebul przybyszowych jest powolny i mało wydajny, a osobniki rozmnaŜane generatywnie nie powtarzają cech roślin matecznych. Jednym ze sposobów zwiększenia wydajności tego procesu jest zastosowanie metody in vitro. Inicjację kultur przeprowadzono w latach 2000-2003, a materiałem wyjściowym były łuski cebulowe pochodzące z roślin rosnących na kolekcji Katedry Roślin Ozdobnych. NamnaŜanie śnieŜyczek prowadzono drogą organogenezy na poŜywkach MS wzbogaconych w cytokininę BA (0,1-25 µM) i zawierających dodatkowo auksynę IAA lub NAA (0-1 µM). Somatyczną em-briogenezę indukowano na poŜywkach MS


39

zawierających Picloram (10-25 µM) i BA (1 µM), a uzyskany kalus embriogeniczny namnaŜano na poŜywkach o identycznym składzie. Do produkcji kalusa i łusek cebulowych zastosowano takŜe bioreaktor. Znany jest fakt istnienia genetycznej zmienności w kulturach in vitro, dlatego uzyskane z pąków przybyszowych i z zarodków somatycznych rośliny poddano analizie cytometrycznej. Wykonane na cytometrze przepływowym badania stopnia ploidalności roślin powstałych na drodze somatycznej embriogenezy pod wpływem Picloramu w poŜywce wykazały zwiększoną liczbę chromosomów (3 n) u wszystkich testowanych osobników. Natomiast w analizowanych próbach pochodzących z pąków przybyszowych śnieŜyczek nie stwierdzono obecności haploidów ani osobników o zwiększonej liczbie chromosomów, z wyjątkiem pochodzących z kultur bioreaktorowych. W tym przypadku 20% badanych roślin było triploidami. EFFECT OF PLANT GROWTH REGULATORS ON PLOIDY OF SNOWDROP TISSUES Galanthus elwesii HOOK AND Galanthus nivalis L. PROPAGATED in vitro Anna Bach, BoŜena Pawłowska Department of Ornamentals, Agricultural University, Kraków Key words: ploidy, flow cytometry, in vitro, Galanthus elwesii HOOK, Galanthus

nivalis L. Summary

Giant snowdrop (Galanthus elwesii HOOK), native to Asia Minor, is a highly valued spring bulbous ornamental plant. It is commonly gathered from natural sites and is one of the most important bulbous ornamental plants exported form Turkey to Western Europe. Common snowdrop (Galanthus nivalis L.) is a protected species commonly occurring in Poland, in Carpathian Foothills, that is cultivated in gardens from 16th century. Efficiency of this process can be augmented by the use of in vitro methods. Cultures were initiated between 2000 and 2003 from plant bulb scales derived from the collection of the Chair of Ornamental Plants. Snowdrops were propagated using the method of organogenesis on MS media supplemented with a cytokinin (BA 0.1-25.0 µM) and auxin (IAA or NAA, 0-1 µM). Somatic embryogenesis was induced on solid MS media containing Picloram (10-25 µM) and BA (1 µM). Embryogenic callus obtained in this way was propagated on media of identical composition. Produc-tion of the callus and bulb scales was also carried out in a bioreactor. It is a well known genetic variability of material from in vitro cultures. For this reason, plants obtained from adventitious buds and somatic embryos were subjected to cytometric analysis. Flow cytometric studies of ploidy of plants generated by somatic embryogenesis on media containing Picloram showed a higher number of chromosomes (3n) in all tested specimens. Contrary the examination of samples originating from adventitious buds of snowdrop did not demonstrate haploids or specimens with a higher number of chromosomes, except for those cultivated in a bioreactor. In the latter case, 20% of plants under study were triploids.


40

Prof. dr hab. Anna Bach Katedra Roślin Ozdobnych Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja Al. 29 Listopada 54 31-425 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 43-49 MICROPROPAGATION OF Physalis ixocarpa L. Katarzyna Bergier, Marzena Wielanek, Ewa Gajewska, Maria Skłodowska Department of Plant Physiology and Biochemistry, University of Łódź Introduction

Genus Physalis was described for the first time by Linnaeus in 1753. It comprises about 90 species, nearly 70 of which grow in Mexico, most of them are endemic [PEREZ-CASTORENA et al. 2004]. Physalis ixocarpa often called „tomatillo” or „husk tomate” belongs to Solanaceae family and is an annual plant growing in Mexico and Guatemala. Specialists call it Physalis philadelphica Lam. Recently it has been grown more and more often in California due to the increasing popularity of Mexican food in the United States of America [MORICONI et al. 1990]. Tomatillo is a very important diet component in Mexico and Central America. This small tomato-like fruit contains about 10% sucrose, mineral salts, carotens, vitamins B, E and C. In addition to its taste and decorative values tomatillo is also a medicinal plant. It is a valuable source of biologically active substances - withanolides which include: ixocarpalacton A and B, 18-hydroxywithanolide D and withaphysacarpine [SU et al. 2002]. Withanolides extracted from the leaves and apical parts of plants are used to purify blood and to cure stomach disorder. In Mexico they are used as an antidote against one of the local poisons. In folk medicine, extracts from this plant are used to treat sore throat and fever. Its antitumor properties were also observed [GU et al. 2003]. Developing an effective method of in vitro propagation of Ph. ixocarpa seems justified since this plant is not only an important agricultural plant but it is also a source of potentially valuable secondary metabolites used in medicine. The aim of the present research was to design a quick method of Ph. ixocarpa in vitro propagation. Materials and methods Seed germination and shoot multiplication

Seeds of Ph. ixocarpa were obtained from the Botanical Garden of University of Masarykiana (Czech Republic). The seeds were surface sterilized by shaking in 70% (v/v) ethanol for 3 min and rinsed two times with sterile distilled water, than by dipping in 35% commercial bleach for 5 min and again rinsed five times with sterile distilled water. Finally, the sterilized seeds were used to initiate the culture. These cultures were carried out in 100 ml Erlenmeyer flasks containing 25 ml of MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] basal medium supplemented with 3% (w/v) sucrose and 0.7% agar (w/v). The medium pH was adjusted to 5.8 prior to the addition of agar. The cultures were grown at

K. Bergier et al.

44

23 ± 2°C under 16 h/8 h photoperiod (40 µmol⋅m-2⋅s-1, cool fluorescent light, Philips

40W). Four-week-old seedlings of Ph. ixocarpa were the source of explants for multiple shoot development. Shoot tips (0.5-1.0 cm long) were used as initial explants. These cultures were carried out in 330 ml jam jars with vertilated polypropylene twist lids containing 50 ml of MS medium with BAP (6-benzylaminopurine), KIN (6-furfurylaminopurine) or 2iP 6-(γ,γ-dimethylallylamino)purine at different concentrations (1-20 µmol⋅dm-3) and combinations. For subculturing, multiplied shoots were transferred to the same fresh medium at 4-week intervals (growth conditions as described above). Rooting and acclimatization of regenerated shoots

For rooting, four-week-old shoots (5-6 cm long) were separated individually and transferred to MS medium supplemented with different auxins: NAA, IBA and 2,4-D at concentrations of 1 µmol⋅dm-3. For acclimatization to ex vitro conditions the rooted plantlets (two-week-old) were washed in sterile distilled water to remove traces of MS medium and than transferred to plastics pots containing perlit under the controlled growth chamber condition (23±2°C, 16 h/8 h photoperiod, 70% relative humidity and 40 µmol m-2 s-1 light intensity) and covered for 6-7 days with glass. After two weeks the plants were transferred to pots containing soil and grown in a greenhouse. Observations were recorded on the multiplication rate (number of shoots per explant), shoot length, frequency of roots and roots per shoot.

Each treatment consisted of four explants per flask in six replicates. Each experiment was conducted twice. Sample variability is given as the standard deviation of the mean. The significance of differences between treatment mean values was determined by Student’s t-test. Differences at p < 0.05 were considered significant. Results and discussion

Plant micropropagation is more and more widely used in breeding of agri-culturally important plants. Each plant has specific needs concerning culture conditions and nutrition that is why micropropagation methods should be designed individually. In order to achieve optimal micropropagation conditions media varying in composition and in combination of growth factors were used. Murashige and Skoog medium was used for proliferation and rooting, as it is most commonly used in in vitro cultures. At the preliminary stage of the experiment the medium was supplemented with various concentrations of KIN, BAP or 2iP. The highest numbers of shoots were obtained for 5 µmol⋅dm-3 KIN and 2.5 µmol⋅dm-3 BAP, both resulting in about 5.9 shoots per explant after 4 weeks of culture (Tab. 1). Table 1; Tabela 1 Effect of different cytokinins on Ph. ixocarpa shoot multiplication (shoots/explant) during the first 4 weeks of culture on MS medium. Values are mean ± SD, n = 48 Wpływ róŜnych cytokinin na namnaŜanie pędów Ph. ixocarpa (ilość pędów/eksplantat) w czasie 4 tygodni hodowli na poŜywce MS. Wartość średnia ± SD, n = 48

Cytokinins Cytokininy (µmol⋅dm-3)

Culture time (weeks); Czas hodowli (tygodnie)

1

2

3

4

MICROPROPAGATION OF Physalis ixocarpa L.

45

BAP 1

2.09 (±0.63)

3.61 (±0.70)

4.32 (±1.01)

5.04 (±0.78)

BAP 2.5

1.33 (±0.35)

2.41 (±0.76)

4.57 (±0.66)

5.87 (±1.60) BAP 5

1.27 (±0.24)

1.80 (±0.63)

2.91 (±0.59)

5.38 (±1.33)

KIN 1

1.47 (±0.42)

1.85 (±0.50)

2.18 (±0.57)

2.42 (±0.36) KIN 2.5

1.38 (±0.55)

3.14 (±0.91)

3.75 (±0.68)

4.52 (±0.98)

KIN 5

1.37 (±0.30)

2.23 (±0.56)

4.09 (±0.71)

5.90 (±0.82) 2iP 1

1.66 (±0.29)

2.55 (±0.65)

4.55 (±0.73)

5.16 (±1.16)

2iP 2.5

1.37 (±0.22)

2.80 (±0.74)

4.37 (±0.65)

5.33 (±1.00) 2iP 5

1.08 (±0.15)

1.53 (±0.61)

1.87 (±0.56)

3.70 (±1.27)

KIN 5 + BAP 1

1.86 (±0.54)

2.70 (±0.52)

5.03 (±0,97)

6.71 (±1.37) KIN 2.5+BAP 0.5

2.12 (±0.75)

3.21 (±0.83)

5.32 (±1.57)

6.20 (±1.44)

KIN 2.5 + BAP 1

1.33 (±0.34)

2.06 (±0.66)

4.09 (±0.81)

4.83 (±0.97) KIN 1 + BAP 2.5

1.23 (±0.27)

1.46 (±0.35)

3.13 (±1.50)

3.26 (±1.03)

Similar effects of KIN and BAP were observed for Feronia limonia [HIREGOUDAR et al. 2003], Dionaea muscipula [JANG et al. 2003] and Centaurea paui [CUENCA et al. 1999]. Among 2iP concentrations used in our experiment 2.5 µmol⋅dm-3 of 2iP gave the best multiplication rate, 5.33 shoots per explant within 4 weeks. At the next stage the combination of KIN and BAP was used while 2iP was excluded as it caused deformations and quick senescence of shoots at all concentrations. After 4-week culture 14% higher multiplication rate (p < 0.05), was observed in the medium supplemented with 5 µmol⋅dm-3 KIN + 1 µmol⋅dm-3 BAP, in comparison with 5 µmol⋅dm-3 KIN. The plants were morphologically correct, green and did not produce callus tissue. Other studies reported that the combination of KIN with BAP in a medium resulted in a better proliferation rate of Symonanthus bancroftii than the combination of KIN with other growth regulators [PANAIA et al. 2000]. These results are also in agreement with those presented by KOMALAVALLI and RAO [2000] who observed better effects of the KIN and BAP combination than of each cytokinin alone. The micropropagated plants differed in shoot length (Tab. 2). In contrast to multiplication rate the longest ones were produced in the presence of the highest concentration of KIN alone (4.60 cm). The addition of 1 µmol dm-3 BAP caused the decrease in shoot length by 38% (p < 0.001). However, in other Solanaceae like Scopolia parviflora shoot elongation was better on growth regulator-free half-strength B5 medium [KANG et al. 2004]. Under the influence of BAP and 2iP they were shorter (Tab. 2). In the presence of KIN (2.5 µmol⋅dm-3) with BAP (0.5 µmol⋅dm-3), the shoots were also shorter - 3.49 cm due to BAP presence. NAA was most effective among the three auxin supplements used to induce root formation in the regenerated shoots (Tab. 3). Table 2; Tabela 2 Effect of different cytokinins on Ph. ixocarpa shoot elongation (cm) during the first 4 weeks of culture on MS medium (values are mean ± SD, n = 48) Wpływ róŜnych cytokinin na długość pędów Ph. ixocarpa (cm) w czasie 4 tygodni hodowli na poŜywce MS (wartość średnia ± SD, n = 48)

Cytokinins Cytokoniny (µmol⋅dm-3)

Culture time (weeks); Czas hodowli (tygodnie)

1

2

3

4

BAP 1

1.34 (±0.13)

1.97 (±0.32)

2.42 (±0.46)

2.57 (±0.53)

BAP 2.5

1.41 (±0.32)

1.56 (±0.19)

1.85 (±0.06)

2.33 (±0.39) BAP 5

1.35 (±0.26)

1.52 (±0.20)

1.60 (±0.35)

1.67 (±0.79)

K. Bergier et al.

46

KIN 1 1.47 (±0.26) 1.99 (±0.29) 2.90 (±0.53) 3.16 (±0.55) KIN 2.5

1.27 (±0.32)

2.09 (±0.37)

2.59 (±0.20)

3.03 (±0.55)

KIN 5

1.75 (±0.30)

2.14 (±0.25)

2.76 (±0.44)

4.60 (±0.52) 2iP 1

1.49 (±0.23)

1.94 (±0.30)

2.50 (±0.30)

2.98 (±0.27)

2iP 2.5

1.36 (±0.23)

1.51 (±0.12)

1.95 (±0.07)

2.22 (±0.35) 2iP 5

1.63 (±0.35)

1.76 (±0.35)

1.92 (±0.24)

2.65 (±0.33)

KIN 5 + BAP 1

1.54 (±0.24)

2.13 (±0.32)

2.47 (±0.23)

2.86 (±0.59) KIN 2.5+BAP 0,5

1.83 (±0.34)

2.50 (±0.35)

3.13 (±0.34)

3.49 (±0.52)

KIN 2.5 + BAP 1

1.30 (±0.27)

1.50 (±0.17)

2.13 (±0.44)

2.19 (±0.22) KIN 1 + BAP 2.5

1.13 (±0.25)

1.28 (±0.17)

1.49 (±0.24)

1.76 (±0.24)

Table 3; Tabela 3 Effect of auxins (1 µmol⋅dm-3) on the rooting of Ph. ixocarpa in vitro shoots (%) Wpływ auksyn (1 µmol⋅dm-3) na ukorzenianie się pędów Ph. ixocarpa (%)

Auxins Auksyny

One-week-old shoots

Jednotygodniowe pędy

Two-week-old shoots Dwutygodniowe pędy

% of rooted

shoots % ukorzenio-nych pędów

number of

roots/explant ilość korzeni/

eksplantat

% of rooted shoots % ukorzenionych

pędów

number of

roots/explant ilość korzeni/

eksplantat

IBA

38

4 (±0.09)

62 (±0.42)

6 (±0.11) NAA

-

0

75 (±0.61)***

5 (±0.20)***

2,4-D

-

0

17 (±0.81)***

2 (±0.16)*** mean values ± SD, n = 48; wartość średnia ± SD, n = 48 *** values that differ significantly at p < 0.001 (IBA versus NAA and 2,4-D treatment); wartości róŜniące

się istotnie przy p < 0,001 (wariant z IBA względem wariantów z NAA i 2,4-D) In the NAA series of the 2-week cultures 75% of shoots were rooted, in the IBA series the result was lower by 13% (p < 0.001) than in the case of NAA, but the roots appeared already in the first week. The worst results (17%) were observed in the 2,4-D series. Moreover, in the latter case the roots were deformed (short and thick) and callus was produced at the basis of all explants. SHRIVASTAVA and ROJANI [1999] also observed the callus formation in the presence of 2,4-D. What is more, the roots became dark during culture. In Solanum species the hormon-free medium was more effective for rooting of regenerated shoots [El-ASHAAL et al. 1999; KANG et al. 2004]. The rooted plants were acclimatized to in vivo conditions first in pots with perlit and than with soil with 91% efficiency (for plants rooted with NAA and IBA). The micropropagated plants exhibited a phenotypic morphology similar to that of their wild parents within less than 2 months. Conclusions

The method described in our study could be used for fast multiplication of Ph. ixocarpa as an alternative source of bioactive secondary metabolites for commercial exploitation. The highest number of shoots per explant of Ph. ixocarpa was obtained on the medium supplemented with the combination of KIN (5 µmol⋅dm-3) and BAP (1 µmol⋅dm-3). The presence of KIN alone resulting the longest shoots of the

MICROPROPAGATION OF Physalis ixocarpa L.

47

micropropagated plants in comparision to BAP and 2iP. The best rooting with 75% efficiency was observed in the presence of NAA. References CUENCA S., AMO-MARCO J.B., PARRA R. 1999. Micropropagation from inflorescence stems of the Spanish endemic plant Centaurea paui Loscos Willk. (Composite). Plant Cell Rep. 18: 674-679.

El-ASHAAL H.A., GHANEM S.A., MELEK F.R., KOHAIL M.A., HILAL S.H. 1999. Alkaloid production from regenerated Solanum plants. Fitoterapia 70: 407-411.

GU J.Q., LI W., KANG Y.H., SU B.N., FONG H.H. 2003. Minor withanolides from Physalis philadelphica: structures, quinone reductase induction activities, and liquid chro-matography (LC)-MS-MS investigation as artifacts. Chem. Pharm. Bull. 51: 530-539.

HIREGOUDAR L.V., MURTHY H.N., HEMA B.P., HAHN E.J., PAEK K.Y. 2003. Multiple shoot induction and plant regeneration of Feronia limonia (L.) Swingle. Sci. Hort. 98: 357-364.

JANG G.W., KIM K.S., PARK R.D. 2003. Micropropagation of Venus fly trap by shoot culture. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 72: 95-98.

KANG Y.M., MIN J.Y., MOON H.S., KARIGAR C.S., PRASAD D.T., LEE C.H., CHOI M.S. 2004. Rapid in vitro adventitious shoot propagation of Scopolia parviflora through rhizome cultures for enhanced production of tropane alkaloids. Plant Cell Rep. 23: 128-133.

KOMALAVALLI N., RAO M.V. 2000. In vitro micropropagation of Gymnema sylvestre - A multipurpose medicinal plant. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 61: 97-105.

MORICONI D., RUSH M.C., FLORES H. 1990. Tomatillo: A potential Vegetable Crop for Louisiana in Advances in new crops. Janick J., Simon J.E. (Eds) Timber Press: 407-413.

MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497.

PANAIA M., SENARATNA T., BUNN E., DIXON K.W., SIVASITHAMPARAM K. 2000. Micropro-pagation of the critically endangered Western Australian species, Symonanthus banc-roftii (F. Muell.) L. Haegi (Solanaceae). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 63: 23-29.

PEREZ-CASTORENA A.L., GARCIA M., MARTINEZ M., MALDONADO E. 2004. Physalins from Physalis solanaceus. Biochem. System. Ecol. 32: 1231-1234.

SHRIVASTAVA N., RAJANI M. 1999. Multiple shoot regeneration and tissue culture studies on Bacopa monnieri (L.) Pennell. Plant Cell Rep. 18: 919-923.

SU B.N., MISICO R., JUNG PARK E., SANTARSIERO B.D., MESECAR A.D., FONG H.H.S.,

PEZZUTO J.M., KINGHORN A.D. 2002. Isolation and characterization of bioactive prin-ciples of the leaves and stems of Physalis philadelphica. Tetrahedron 58: 3453-3466. Key words: auxins, cytokinins, micropropagation, shoot tips, Solanaceae Summary

A rapid micropropagation method was developed from the shoot tip explants of Physalis ixocarpa L. (Solanaceae). The high frequency of shoot formation was achieved

K. Bergier et al.

48

on MURASHIGE and SKOOG [1962] medium containing the combination of KIN 5 µmol⋅dm-3 and BAP 1 µmol⋅dm-3, 6.71 shoots per explant, within 4 weeks. The maximum elongation of shoots was obtained with KIN at 5 µmol⋅dm-3 (4.60 cm). The best results with rooting of the micropropagated shoots of Ph. ixocarpa was observed on the medium individually supplemented with 1 µmol⋅dm-3 NAA or IBA, 75% and 62%, respectively. After rooting period the plantlets were acclimatized in vivo with 91% efficiency. MIKROROZMNAśANIE Physalis ixocarpa L. Katarzyna Bergier, Marzena Wielanek, Ewa Gajewska, Maria Skłodowska Katedra Fizjologii i Biochemii Roślin, Uniwersytet Łódzki, Łódź Słowa kluczowe: auksyny, cytokininy, mikrorozmnaŜanie, Solanaceae, wierzchołki

pędów Streszczenie

Opracowano szybką metodę mikrorozmnaŜania Ph. ixocarpa (Solanaceae) stosując jako eksplantaty wierzchołki pędów. Największą liczbę pędów uzyskano na podłoŜu MURASHIGE i SKOOG [1962] zawierającym kombinację 5 µmol⋅dm-3 KIN z 1 µmol⋅dm-3 BAP, 6,71 pędów/eksplantat po 4 tygodniach hodowli. NajdłuŜsze pędy (4,60 cm) osiągnęły rośliny hodowane na podłoŜu z dodatkiem KIN w stęŜeniu 5 µmol⋅dm-3. Najlepsze rezultaty w ukorzenianiu namnoŜonych pędów Ph. ixocarpa obserwowano na podłoŜu zawierającym 1 µmol⋅dm-3 NAA lub IBA, odpowiednio 75 i 62%. Ukorzenione rośliny były aklimatyzowane do warunków in vivo z 91% wydajnością. Dr Katarzyna Bergier Katedra Fizjologii i Biochemii Roślin Uniwersytet Łódzki ul. Banacha 12/16 90-237 ŁÓDŹ e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 51-57 KWITNIENIE MIESZAŃCA Cattleya (Orchidaceae) W KULTURACH in vitro Teeresa Cybularz-Urban

1, Anna Bach

2

1 Katedra Botaniki, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie 2 Katedra Roślin Ozdobnych, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp

W literaturze moŜna spotkać liczne doniesienia o kwitnieniu odmian i gatunków storczyków. Pojawiało się ono zarówno na siewkach, jak równieŜ u roślin rozmnaŜanych na drodze organogenezy za pomocą kultur tkankowych w warunkach in vitro. Kwiaty były formowane spontanicznie, bądź indukowane specyficznymi czynnikami środowiskowymi. Wśród nich są wymieniane: pH i zasobność poŜywki, obecność oligocukrów, fenoli, poliamin, sterydów, chelatów i innych suplementów. Współdziała z nimi rodzaj, poziom egzo- i endogennych substancji wzrostowych, czas i kolejność aplikacji, temperatura i fotoperiod [CHIA i in. 1999; CAMPOS, KERBAUY 2004; VAZ i in. 2004]. Kluczowy dla przebiegu kolejnych etapów morfogenezy i wejścia rośliny w stadium rozwoju generatywnego jest takŜe: genotyp, rodzaj, wiek oraz kondycja zdrowotna pobieranych eksplantatów [TRAN THAN VAN 1999; YU, GOH 2000a, 2000b; YU i in. 2000; HSU, YANG 2002; MUDALIGE, KUEHNLE 2004; VAZ i in. 2004; TSAI i in. 2005; WILSON i in. 2005].

Celem pracy była analiza przyczyn spontanicznego kwitnienia mieszańca storczyka z rodzaju Cattleya namnaŜanego techniką in vitro. Materiał i metody

Materiał donorowy stanowił okazały, blado-fioletowo kwitnący, mieszaniec Cattleya waltersiana × C. marone pochodzący z Ogrodu Botanicznego UJ, poraŜony wirusem pierścieniowej plamistości Odontoglossum (ORSV), (fot. 1). Inicjacja kultur in vitro nastąpiła przez izolację merystemów z wierzchołków wzrostu pędów. Merystemy wielkości 2-4 mm3 umieszczano w płynnej poŜywce inicjalnej (fot. 2). Była to poŜywka MS w modyfikacji KOZAK [1991] z dodatkiem 2,0 mg⋅dm-3 siarczanu adeniny, 9,7 mg⋅dm-3 kwasu askorbinowego, 0,5 mg⋅dm-3 zeatyny, 4,95 mg⋅dm-3 BA i 1,0 mg⋅dm-3

NAA; pH wynosiło 5,5; źródło węgla stanowiła 3% sacharoza. Pędy otrzymane z eksplantatów pierwotnych mnoŜono na poŜywce zestalonej 0,8% agarem Difco (fot. 3). Zawartość zeatyny w poŜywce namnoŜeniowej obniŜono do 0,2 mg⋅dm-3, pozostawiając inne parametry niezmienione. Kulturę pędową prowadzono w naczyniach szklanych o pojemności 350 cm3, zawierających 50 cm3 poŜywki, w stałej temperaturze 25°C±2°C, przy wilgotności względnej wynoszącej ok. 70%, w warunkach fotoperiodu 16/8 godz. (dzień/noc), pasaŜując ją w cyklach 8-tygodniowych. Źródłem światła były lampy fluorescencyjne o białej barwie światła i natęŜeniu promieniowania 80 µmol⋅m-2

⋅sek-1.

T. Cybularz-Urban, A. Bach

52

Do oznaczenia obecności wirusa w roślinach donorowych i namnaŜanych w kulturach in vitro posłuŜono się testem biologicznym [WISLER 1989] i serologicznym DAS-ELISA [CLARK, ADAMS 1977].

Fot. 1. Roślina donorowa mieszańca Cattleya waltersiana × C. marone poraŜona wirusem

ORSV z wyraźnym rozbiciem barwy kwiatów (pomniejszenie 2,5 ×)

KWITNIENIE MIESZAŃCA Cattleya (Orchidaceae) ...

53

Photo 1. Donor plant of the ORSV-infected hybrid Cattleya waltersiana × C. marone showing notable color break of flowers (diminished 2.5 ×)

Fot. 2. Wielopędowa roślina storczyka - końcowy etap w płynnej poŜywce inicjalnej Photo 2. Multistem orchid plant - final stage of culture on the initial liquid medium

Fot. 3. Meryklony mieszańca na poŜywce zastalonej (powiększenie 3 ×) Photo 3. Mericlones of the hybrid on a solidified medium (magnification 3 ×) Wyniki i dyskusja


54

W 14 miesiącu prowadzenia kultury pędowej badanego mieszańca (w trakcie piątego cyklu), trzy spośród trzydziestu roślin rosnących w jednym ze szklanych naczyń wykształciły spontanicznie kwiaty. Ich trwałość wynosiła około 3 tygodnie. Kwitnące pędy wysokości około 17 mm, charakteryzowały się brakiem wyraźnych zmian u liści, jednakŜe kwiaty nie były w pełni wykształcone morfologicznie. W obrębie okwiatu zaobserwowano słabo wykształcone działki z wyjątkiem warŜki, o wymiarach 13 × 6 mm (po jej rozwinięciu). Osłaniała ona zdeformowany, niewielki prętosłup (fot. 4). Barwa szczątkowego okwiatu była zbliŜona do barwy kwiatów roślin donorowych. Obecność wirusa w kwitnących pędach potwierdzono testem serologicznym DAS-ELISA i biologicznym z uŜyciem Nicotiana tabacum odm. Xsanthi nc.

Fot. 4. Pęd z miniaturowym, zniekształconym, kwiatem wytworzonym w kulturze in vitro

(powiększenie 3 ×) Photo 4. Shoot with a tiny deformed flower developed in in vitro culture (magnification 3 ×)

Zastosowana przez autorki poŜywka była dobierana wyłącznie pod kątem przydatności do regeneracji eksplantatów i namnaŜania kultur tkankowych w celu ich odwirusowania [CYBULARZ-URBAN, HANUS-FAJERSKA 2006]. Charakteryzowała się stosunkowo wysokim stęŜeniem cytokinin, które mogły wywołać zakwitanie 10% pędów badanego mieszańca Cattleya.

Stymulujący wpływ cytokinin, (zwłaszcza BA) na zakwitanie w kulturach in vitro był opisywany dla wielu gatunków storczyków z rodzajów: Aranda, Cymbidium, Dendrobium, Oncidium, Phalaenopsis, Vanda, mieszańców Doriella i Doriteanopsis i licznych roślin spoza rodziny Orchidaceae [SCORSA 1982; DUAN, YAZAWA 1994, 1995; CHIA 1999; KOSTENYUK 1999; YU, GOH 2000a, 2000b; YU i in. 2000; CHANG, CHANG 2003; TAYLOR i in. 2005].

Istotnym zdaje się być obecność wirusa w eksplantatach i zregenerowanych pędach. Mogła ona, wywołując zaburzenia w poziomie endogennych substancji wzrostowych [NOWAK 1999; TSAO i in. 1999], w wyniku akumulacji metabolitów stresu


55

[GRANT, MANSFIELD 1999] i wytwarzania substancji związanych z odpornością przeciw patogenom (m.in. kwasu salicylowego - MARTINEZ i in. [2004]), wpłynąć modyfikująco na rozwój wywołując kwitnienie mnoŜonego storczyka.

Analizując budowę morfologiczną kwiatów badanego mieszańca Cattleya stwierdzono niedorozwój okwiatu i organów generatywnych. Podobne zjawisko nawet u zdrowych storczyków obserwowali liczni autorzy [KERBAUY 1984; DUAN, YAZAWA 1995; YON i in. 2003]. Zdecydowanie jednak przewaŜają doniesienia o wytwarzaniu w kulturach in vitro typowych morfologicznie, płodnych kwiatów, czasem owoców. Dotyczą one zwłaszcza kwitnienia sterowanego u storczyków. Wnioski 1. Spontaniczne zakwitanie mieszańca Cattleya w kulturach in vitro mogło być

wynikiem stosowania wysokich dawek cytokinin lub/obecności ORSV w kul-tywowanej tkance.

2. Interesującym i godnym kontynuacji wydaje się zagadnienie sterowanego, wczesnego, zakwitania w kulturach in vitro tego i innych mieszańców (zwłaszcza uwolnionych od wirusów).

Literatura CAMPOS K.O., KERBAUY G.B. 2004. Thermoperiodic effect of flowering endogenous hormonal status in Dendrobium (Orchideaceae). Journal of Plant Physiol. 161: 1385-1387.

CHANG C., CHANG W.C. 2003. Cytokinins promotion of flowering in Cymbidium ensi-folium var. misericors in vitro. Plant Growth Regul. 39: 217-221.

CHIA T.F., ARDITTI J., SEGREN M.J., HEW Ch.S. 1999. Review: in vitro flowering in orchids. Lindleyana 14 (2): 60-76.

CLARK M.F., ADAMS S.M. 1977. Characteristics of the microplate method of enzyme - linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol. 34: 457-483.

CYBULARZ-URBAN T., HANUS-FAJERSKA E. 2006. Therapeutic effect of cytokinin sequence application on virus-infected Cattleya tissue cultures. Acta Biol. Crac. Series Bot.48/2: 27-32.

DUAN J.X., YAZAWA S. 1994. In vitro floral development in x Doriella Tiny (Doritis pulcherrima × Kingiella phillipinensis). Scientia Hort. 59: 253-264.

DUAN J.X., YAZAWA S. 1995. Floral induction and development in Phalaenopsis in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 43: 71-74.

GRANT M., MANSFIELD J. 1999. Early events in host - pathogen interactions. Curr. Opin. Plant Biol. 2/4: 312-319.

HSU H.F., YANG CH.H. 2002. An orchid (Oncidium Grower Ramsey) A P3-like MADS gen regulates floral formation and invitation. Plant Cell Physiol. 43(10): 1198-1209.

KERBAUY G.B. 1984. In vitro flowering of Oncidium varicosum mericlones (Orchida-ceae). Plant Sci. Lett. 35: 73-75.

KOSTENYUK J., OH B.J., SO I.S. 1999. Induction of early flowering in Cymbidium niveo-marginatum Mak in vitro. Plant Cell Rep. 19: 1-5.

KOZAK D. 1991. Shoot regeneration from various parts of Narcissus cv. Carlton through tissue culture. Prace ISiK, Ser. B 16: 41-47.


56

MARTINEZ C., PONS E., PRATS G., LEON J. 2004. Salicylic acid regulates flowering time and links defence responses and reproductive development. Plant J. 37: 209-217.

MUDALIGE G.R., KEUHNLE R.K. 2004. Orchid biotechnology in production and improvement. Hort Science 39(1): 11-17.

NOWAK B. 1999. Regeneracja śliwy (Prunus domestica L.) odmiany Węgierka Zwykła z eksplantatów poraŜonych wirusem ospowatości śliw. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 469: 581-586.

SCORSA R. 1982. In vitro flowering. Hort. Rev. 4: 106-127.

TAYLOR N.J., LIGHT M.E., VAN STADEN J. 2005. In vitro flowering of Kniphofia leuco-cephala: influence of cytokinins. Plant Cell. Tissue and Organ Culture 83: 327-333.

TRAN THANH VAN K. 1999. Floral and vegetative defferentiation in vitro and in vivo, w: Morfogenesis in Plant Tissue Cultures. Soh W.Y, Bhojwani Sat S. (Eds), Kluwer, Dordrecht, The Netherlandes: 215-233.

TSAI W.C., LEE P.F., CHEN H.I., HSIAO Y.Y., WEI W.J., PAN Z.N., CHUANG M.H., KUOH

C.S., CHEN H.H. 2005. PeMADS6, a GLOBOSA/PISTILLATA-like gen in Phalaenopsis questris involved in petaloid formation and correlated with flower longevity and ovary development. Plant Cell Physiol. 46(7): 1125-1139.

TSAO C.V., POSTMAN I.D., REED B.M. 1999. Single and multiple virus infections reduce in vitro multiplication of ‘Malling Landmark’ raspberry. In vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 35/3, 41A: 1013.

VAZ A.P.A., FIGUEIREDO-RIBEIRO R.C.L., KERBAUY G.B. 2004. Photoperiod and tempera-ture effect on growth and flowering of P. pussilla,an epiphyc orchid. Plant Physiology and Biochemistry 42: 411-415.

WILSON W.J., KENNEDY G.C., PEACOCK W., DENNIS S.E. 2005. Microarray analysis reveals vegetative molecular phenotypes of Arabidopsis flowering-time mutants. Plant Cell Physiol. 46(8): 1190-1201.

WISLER G.C. 1989. How to control orchid viruses: The complete guidebook. Published by Maupin Hause Publishers.

YON H.E., SUN Y.J., HWAN I.K., TAE Y., HEE CH.L., SU T.K., YOEOP P.K. 2003. Growth flowering and variation of somaclones as affected by subcultures and natural materials supplemented to media in Phalenopsis. Korean Journal of Horticultural Science and Technology 21(4): 362-368.

YU H., GOH C.J. 2000a. Differential gene expression during floral transition in an orchid hybrid Dendrobium Madame Thong-In. Plant Cell Rep. 19: 926-93.

YU H., GOH C.J. 2000b. Identification and characterization of three orchid MADS box genes of the AP1/AGL9 subfamily during floral transition. Plant Physiol. 123: 1325-1336.

YU H., YANG S.H, GOH C.J. 2000. DOH 1, a class I knox gene, is required for mainte-nance of the basic plant architecture and floral transition in orchid. Plant Cell 12: 2143-2159. Słowa kluczowe: storczyki, Cattleya, kultury in vitro, kwitnienie, fitohormony,

meriklony, wirus pierścieniowej plamistości Odontoglossum (ORSV)

Streszczenie


57

Materiałem doświadczalnym był blado-fioletowo kwitnący mieszaniec Cattleya

waltersiana × C. marone pochodzący z Ogrodu Botanicznego UJ, poraŜony wirusem pierścieniowej plamistości Odontoglossum (ORSV). Materiał ten został wprowadzony w warunki kultury in vitro przez izolację merystemów z wierzchołków wzrostu pędów (wielkości około 2-4 mm), a następnie namnaŜany w formie kultury pędowej na poŜywce MS w modyfikacji KOZAK [1991]. Kulturę prowadzono w stałej temperaturze 25°C±2°C, przy wilgotności względnej wynoszącej około 70%, w warunkach fotoperiodu 16/8 godz. (dzień/noc) i natęŜeniu promieniowania światła białego wynoszącego 80 µmol⋅m-2

⋅s-1, pasaŜując w 8-tygodniowych cyklach. Po 14 miesiącach kultury na niektórych eksplantatach pędowych wykształciły się spontanicznie drobne zniekształcone kwiaty. Kwitnące w kulturach in vitro pędy charakteryzowały się brakiem wyraźnych zmian u liści, jednakŜe kwiaty nie były w pełni wykształcone morfologicznie. Najokazalsza część okwiatu odpowiadała warŜce osłaniającej niedokształcony prętosłup. Wybarwienie kwiatów było zbliŜone do wybarwienia okazałych kwiatów roślin donorowych prezentujących typowe dla obecności tego wirusa rozbicie barwy. Ich zakwitanie mogło być wywołane wysokim poziomem cytokinin lub/i obecnością ORSV. FLOWERING OF Cattleya HYBRID (Orchidaceae) in vitro CULTURES Teresa Cybularz-Urban

1, Anna Bach

2 1 Department of Botany, Agricultural University, Kraków 2 Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków Key words: orchid, Cattleya, in vitro cultures, flowering, phytohormones, meri-

clons, Odontoglossum ringspot virus (ORSV) Summary

The study was conducted on a hybrid Cattleya waltersiana x C. marone having light-violet flowers, derived from the Botanical Garden of Jagiellonian University. The plant was infected with Odontoglossum ringspot tobamovirus (ORSV). Shoot apical meristem (2-4 mm long) was isolated from this material, transferred into in vitro culture and then, propagated as a shoot culture on the MS medium with KOZAK’s modification [1991]. The culture was maintained at 25°C±2°C, relative humidity 70%, under 16 h photoperiod from white light of 80 µmol⋅m-2

⋅s-1 intensity, and with 8-week subcultures.

Some shoot explants spontaneously developed tiny deformed flowers after 14 months of culture. The shoots flowering in in vitro cultures were characterized by unchanged leaves but flowers were not fully developed morphologically. The most manifest part of the perianth corresponded to the lip covering underdeveloped column. The color of flo-wers was similar to large flowers of the donor plants, showing color break typical for the presence of the virus. The flowering might have been caused by a high level of cytokines and/or ORSV infection. Dr Teresa Cybularz-Urban Katedra Botaniki Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja Al. 29 Listopada 54 31-425 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 59-67 WSTĘPNA CHARAKTERYSTYKA MORFOLOGICZNA, ANATOMICZNA I BIOCHEMICZNA MIESZAŃCA Cattleya (Orchidaceae) W KULURACH in vitro W ŚWIETLE UV-A Teresa Cybularz-Urban 1, Ewa Hanus-Fajerska 1, Adam Świderski 2 1 Katedra Botaniki, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie 2 Zakład Biochemii, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp

Większość gatunków Cattleya to epifityczne storczyki, rosnące naturalnie w międzyzwrotnikowej strefie Ameryki. śyją one w rozwidleniach konarów drzew do wysokości 30-40 m. W dolnych partiach drzew lokują się storczyki lubiące cień lub półcień, potrzebujące bardzo wilgotnego powietrza. Natomiast rośliny rosnące wysoko na drzewach lub skałach będąc wystawione na silne oddziaływanie promieniowania słonecznego, są równocześnie zraszane obficie przez deszcze i okresowo wysuszane przez wiatr. W tym stale zmieniającym się środowisku bytują storczyki o budowie kseromorficznej lub gruboszowate [OSZKINIS 2004].

Badany mieszaniec Cattleya intermedia × C. aurantiaca pochodził z kolekcji storczyków szklarniowych Ogrodu Botanicznego UJ. W szklarniach i w kulturach in vitro na ogół nie spotykamy nadmiaru ultrafioletu. Co więcej, dla roślin mnoŜonych in vitro światło odgrywa rolę raczej w procesie morfogenezy, a nie fotosyntezy, gdyŜ źródłem energii są dla nich polisacharydy zawarte w poŜywce. Równocześnie promieniowanie ultrafioletowe, podobnie jak daleka czerwień, nie są roślinom niezbędne do celów troficznych [MICHALCZUK 2000].

Celem prezentowanego doświadczenia było opracowanie charakterystyki morfologicznej i anatomicznej roślin uzyskanych w wyniku mikrorozmnaŜania mieszańca Cattleya. Badanie róŜnic pomiędzy mikroroślinkami poddanymi ekspozycji na UV-A i kontrolnymi uzyskanymi w kulturach naświetlanych światłem białym, dotyczyło zmian morfologiczno-anatomicznych, a takŜe zawartości chlorofili i karotenoidów, co jest bezpośrednio związane z wydajnością fotosyntetyczną materiału przeznaczanego do aklimatyzacji do warunków ex vitro. Materiał i metody

Mieszaniec Cattleya intermedia × C. aurantiaca został przeniesiony do wa-runków kultury in vitro przez izolację merystemów z wierzchołków wzrostu pędów poprzez fazę ciał protokormopodobnych (protocorm-like bodies, PLBs), a następnie namnaŜany w formie kultur pędowych na zmodyfikowanej poŜywce MS KOZAK [1991] o

T. Cybularz-Urban, E. Hanus-Fajerska, A. Świderski

60

pH 5,5, zestalanej 0,8% agarem Difco, z dodatkiem 2,0 mg⋅dm-3 siarczanu adeniny, 9,7 mg⋅dm-3 kwasu askorbinowego, 0,2 mg⋅dm-3 zeatyny, 4,95 mg⋅dm-3 BA i 1,0 mg⋅dm-3 NAA. Jako źródło węgla stosowano 3% sacharozę.

Doświadczenie dotyczące wpływu UV-A na budowę i metabolizm mnoŜonego materiału zakładano z wierzchołkowej części pędów wysokości 5 mm.

PasaŜe przeprowadzano cyklicznie, co osiem tygodni, przenosząc na świeŜą poŜywkę o tym samym składzie, nie rozdzielając proliferujacych pąków przybyszowych od eksplantatów. Kultrę prowadzono w stałej temperaturze 25°C±2°C, przy dniu trwającym 16 godz. Jako źródło światła stosowano monochromatyczne lampy firmy Philips TLD 36W o długości fal 360-450 nm, w przypadku kontroli, lampy firmy Tungsram 40W F33 o białej barwie światła [BACH, ŚWIDERSKI 2000]. NatęŜenie promieniowania światła białego na poziomie kultury roślin wynosiło 60 µmol⋅m-2

⋅s-1. Wilgotność względna kamery fitotronowej wynosiła 80%.

Przez sześć miesięcy prowadzono pomiary biometryczne. Oceniano następujące cechy: liczba pędów uzyskana z pojedynczego eksplantatu, długość namnoŜonych pędów oraz liczba i długość korzeni powietrznych o ile doszło do ich regeneracji na poŜywce proliferacyjnej, świeŜa masa pędów, korzeni i kalusa, jeśli następowało kalusowanie, sucha masa tkanek zregenerowanych z pojedynczego eksplantatu. Reprezentatywne próby liści utrwalano w aldehydzie glutarowym, a następnie po odwodnieniu i nasyceniu, zatapiano w Eponie 812. Tak przygotowane bloczki krojono przy uŜyciu ultramikrotomu Tesla 490A na skrawki o grubości 1µm. Dokumentację fotograficzną wykonywano przy uŜyciu mikroskopu świetlnego.

Zawartość barwników w liściach oznaczano zgodnie z metodyką uŜytą przez BACH i ŚWIDERSKIEGO [2000]. Do oznaczania stęŜenia chlorofili i karotenoidów pobierano próbki pędów o masie 200 mg. ZamroŜone próbki homogenizowano w moździerzu porcelanowym w acetonie z dodatkiem węglanu wapnia i piasku kwarcowego. Ekstrakt sączono do kolbki miarowej 10 ml, a następnie zmierzono absorbancję na spektrofotometrze Jasco V-530 w kuwetach 0,5 cm przy wybranych długościach fali 662, 645 i 470 nm. StęŜenie barwników obliczono według wzorów LICHTENTHALER i WELLBRUN [1983].

Doświadczenie prowadzono dwukrotnie w 23 powtórzeniach dla materiału hodowanego w UV i w takiej samej liczbie powtórzeń dla kontroli naświetlanej światłem białym. Uzyskane wyniki oceniano statystycznie z zastosowaniem programu Statistica 6,1 oraz testu F. Wyniki i dyskusja

Zielono zabarwione tkanki ciał protokormopodobnych hodowane na stałej poŜywce regenerowały liczne pędy, które po osiągnięciu stadium 2-3 liści pobierano do doświadczenia z UF-A. JuŜ w trakcie pierwszego pasaŜu kultur pędowych zaobserwowano pojawianie się pąków przybyszowych. Naświetlanie kultur ultra-fioletem wywołało ograniczenie liczby regenerowanych struktur. Liczba pędów uzyskana w trakcie sześciomiesięcznego okresu trwania kultury na świetle UV-A była statystycznie istotnie niŜsza aniŜeli liczba pędów namnoŜonych w kulturze kontrolnej hodowanej na świetle białym i wynosiła średnio 5,13 dla UV oraz 11,61 dla światła białego (tab. 1). ŚwieŜa masa pędów równieŜ okazała się istotnie zróŜnicowana w tym układzie doświadczalnym. Większość uzyskanych w trakcie mikrorozmnaŜania pędów regenerowała korzenie powietrzne, przeciętnie od 1 do 7, jednak statystycznie istotną róŜnicę wykazano w przypadku pomiaru ich świeŜej masy (tab. 1).

WSTĘPNA CHARAKTERYSTYKA MORFOLOGICZNA, ANATOMICZNA ...

61

Tabela 1; Table 1 Proliferacja i potencjał morfogenetyczny kultur pędowych Cattleya hodowanych w świetle UV oraz w świetle białym (* oznacza statystycznie istotne róŜnice dla α = 0,05) Proliferation and morphogenetic potential of Cattleya shoots cultured under UV and white light (*are significantly different at α = 0.05)

Rodzaj stosowanego światła

Light treatment

Liczba pędów (szt.) No. of shoots

Liczba korzeni (szt.)

No. of roots

ŚwieŜa masa pędów

Fresh matter of shoots

(g)

ŚwieŜa masa

korzeni Fresh matter

of roots (g)

ŚwieŜa masa kalusa

Fresh matter of callus

(g)

Sucha masa Dry

matter (g)

UV

5,13*

3,04

0,27*

0,029*

0,08

0,019*

Kontrola (białe) Control (white)

11,61*

4,04

0,45*

0,078*

0,11

0,039*

σ (UV)

2,81

2,20

0,18

0,031

0,11

0,005

σ (kontrola; control)

4,22

4,32

0,19

0,058

0,09

0,014

ó odchylenie standardowe; standard deviation

Pod względem budowy morfologicznej organy zregenerowane w trakcie kultury w świetle UV-A nie odbiegały od kontroli, lecz osiągały mniejsze rozmiary (fot. 1a i b). Wyraziste róŜnice dotyczyły budowy anatomicznej liści regenerowanych w zastosowanym zakresie światła. Ultrafiolet spowodował przerost komórek epidermy liści, zaburzenia w procesie róŜnicowania mezofilu i zniekształcenie struktury elementów waskularnych, przy jednoczesnym ograniczeniu liczby wiązek przewodzących w liściu (fot. 2a i b).

StęŜenie barwników fotosyntetycznych czynnych u roślin naświetlanych pro-mieniowaniem zakresu UV-A było znacząco niŜsze w porównaniu do analogicznego stęŜenia w roślinach kontrolnych (rys. 1). W przeliczeniu na świeŜą masę stęŜenie sumy chlorofili i karotenoidów było 1,7 razy niŜsze i wynosiło odpowiednio 21,24 i 4,15 mg⋅100 g-1 świeŜej masy. Odpowiadały im odpowiednio niŜsze stęŜenia chlorofili a i b (rys. 1), jednak większy spadek stęŜenia zanotowano dla chlorofilu a - prawie dwukrotny.

W badaniach dotychczas prowadzonych w warunkach in vitro, dotyczących wpływu rozkładu spektralnego światła na wzrost i morfogenezę kultur, zwykle uŜywano roślin dwuliściennych. JeŜeli chodzi o jednoliścienne, BACH i ŚWIDERSKI [2000] opublikowali wyniki dotyczące kultur hiacynta, MENKE-MILCZAREK i in. [2001] wykorzystali w tym celu rośliny zboŜowe, GABRYSZEWSKA i in. [2002] funkię, Przedstawicieli Orchidaceae wprowadzili do badań TANAKA i in. [1998].


62


63

Fot. 1. Wpływ naświetlania kultur Cattleya intermedia × C. aurantiaca światłem białym (1a) oraz ultrafioletem (1b) na proces organogenezy w eksplantatach pędowych

Photo 1. The influence of white (W) (1a) and UV light (1b) on Cattleya intermedia × C.

aurantiaca organogenesis in shoot explants cultivated in vitro me - mezofil; mesophyll ep - epiderma; epidermis v.b. - wiązka przewodząca; vascular bundle Fot. 2. Szczegóły budowy anatomicznej liści zregenerowanych w świetle białym (W) i w

ultrafiolecie (UV) Photo 2. Anatomical features of leaves regenerated under white (W) and ultraviolet (UV) light

Rys. 1. StęŜenie chlorofili i karotenoidów w pędach mieszańca Cattleya po 6 miesiącach kultury

in vitro Fig. 1. Concentration of chlorophyls and carotenoids in hybryd Cattleya shoots cultivated in vitro

for 6 months

Klon uŜyty w prezentowanym doświadczeniu charakteryzuje się powolnym wzrostem organów wegetatywnych. Optymalny wzrost roślin uzyskuje się w świetle rozproszonym [OSZKINIS 2004], z tego względu ten właśnie materiał roślinny wydawał się odpowiedni dla uzyskania wyrazistych wyników w odpowiedzi na naświetlanie UV-A. Naświetlanie młodych roślin mieszańca w sposób ciągły w okresie półrocznym wywołało wyraźne zmiany anatomiczne, morfologiczne i biochemiczne w porównaniu z kontrolą. Ich niezbyt ostry przebieg tłumaczyć moŜe częściowy udział niebieskiej części widma, co wynika z charakterystyki uŜytej lampy.

Rolę światła w morfogenezie łączy się z działaniem światła na substancje wzrostowe. Światło moŜe wpływać na indukowanie lub hamowanie biosyntezy, rozpadu i transportu regulatorów wzrostu, moŜe takŜe zmieniać wraŜliwość tkanek na regulatory endogenne i egzogenne [BALARDI i in. 1988; KOPCEWICZ i in. 1992; DASILVA, DEBERGH 1997].

JednakŜe informacje na temat wpływu barwy światła na róŜnicowanie, wzrost i

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

UV Control UV Control UV Control UV Control

Chlorophyll a Chlorophyll b Carotenoids Chlorophylls

Pig

men

ts c

once

ntr

atio

n [m

g/10

0g]


64

rozwój pędów oraz korzeni są w wielu przypadkach niejednoznaczne. Wynika to zapewne z porównania róŜnego rodzaju materiału roślinnego, a takŜe stosowania do badań roślin w róŜnych stadiach rozwoju i odmiennej metodyki oraz róŜnych źródeł światła [MICHALCZUK 2000].

Wyniki przedstawione w niniejszej publikacji stanowią podstawę do kontynuacji prac doświadczalnych nad wpływem promieniowania ultrafioletowego na kultury Cattleya.

Planowane jako kolejne doświadczenie łagodniejsze traktowanie UV-A (częściowy udział światła białego i skrócony czas ekspozycji) moŜe ujawnić spo-dziewane korzyści między innymi w postaci wytworzenia podwyŜszonego poziomu fenoli. Substancje te jako antyoksydanty chronią rośliny nie tylko przed ujemnymi skutkami stresu świetlnego, ale takŜe, wpływając na podniesienie ich odporności na patogeny, mogą decydować o lepszym przygotowaniu roślin do przejścia w warunki ex vitro [STREB i in. 1998; LAPLAZE i in. 1999; KRIZEK 2004; PFÜNDEL i in. 2006]. Zastosowanie UV-A stwarza takŜe moŜliwość bardziej naturalnego kształtowania określonego pokroju roślin, przykładowo zwiększenia ich zwartości przy równoczesnym ograniczeniu udziału drogich fitohormonów.

Celowe wydaje się równieŜ przeprowadzenie eksperymentów z wykorzystaniem krótszego zakresu widma, mianowicie UV-B (280-320 nm), które moŜe równieŜ indukować szereg waŜnych procesów morfogenetycznych roślin. Literatura BACH A., ŚWIDERSKI A. 2000. The effect of light quality on organogenesis of hyacynthus orientalis L. in vitro. Acta Biol. Cracow. Ser. Bot. 42/1: 115-120.

BALARDI R., ROSSI F., LECARI B. 1988. In vitro shoot development of Prunus GF655-2: interaction between light and benzyladenine. Physiol. Plant. 74: 440-443.

DASILVA M.H.M., DEBERGH PC. 1997. The effect of light quality on the morphogenesis of in vitro cultures of Azorina vidalii (Wets.) Feer. Plant Cell, Tiss.Org. Cult. 17: 133-142.

GABRYSZEWSKA E., WOJTANIA A., TUŁACZ L. 2002. Wpływ regulatorów wzrostu, paklobu-trazolu oraz rodzaju światła na wzrost i rozwój pędów Hosta sieboldiana (Hook.) Engl. in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 448: 611-621.

KOPCEWICZ J., TRETYN A., CYMERSKI M. 1992. Fitochrom i morfogeneza roślin. PWN, Warszawa: 252 ss.

KOZAK D. 1991. Shoot regeneration from various parts of Narcissus cv. Carlton through tissue culture. Prace ISiK, Ser. B 16: 58-106.

KRIZEK D.T. 2004. Influence of PAR and UV-A in determining plant sensitivity and photomorphogenic responses to UV-B radiation. Invited review. Photochemistry and Photobiology 79(4): 307-315.

LAPLAZE L., GHERBI H., FRUTZ T., PAWLOWSKI K., FRANCHE C., MACHEIX J., AUGUY F., BOGUSZ D., DUHOUX E. 1999. Flawan-containg cells delimit Frankia-infected compar-tments in Casuarina glauka nodules. Plant Physiol. 121: 113-122.

LICHTENTHALER H.K., WELLBRUN A.R. 1983. Determination of total carotenoids and chlorophyll a and b of leaf extracts in different solvents. Biochem. Soc. Trans. 603: 591-592.

MENKE-MILCZAREK I., śEBROWSKI J., ZIMNY J. 2001. Wpływ jakości światła na somaty-czną embriogenezę pszenicy. Biotechnologia 2/53: 99-103.

MICHALCZUK B. 2000. Wpływ jakości światła oraz eksplantatu na morfogenezę pędów


65

petunii w kulturach in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 473: 177-184.

OSZKINIS K. 2004. Storczyki. PWRiL Warszawa: 32-36.

PFÜNDEL E.E., AGATI G., CEROVIC Z.G. 2006. Optical properties of plant surface, w: Bio-logy of the plant cuticule. Rieder M., Müller C. (Eds), Annual Plant Review. Blackwell Publishing 23: 216-249.

STREB P., SHANG W., FEIERABEND J., BLIGNY R. 1998. Divergent strategies of photoprote-ction in high mountain plants. Planta 207: 313-324.

TANAKA M., TAKAMURA T., WATANABE H., ENDO M., YANAGI T., OKAMOTO K. 1998. In vitro growth of Cymbidium platlets cultured under superbright red and blue light emmiting diodes (LEDs). Journ. Hort. Science and Biotech. 73/1: 39-44. Słowa kluczowe: storczyki, mikrorozmnaŜanie, UV-A, światło białe Streszczenie

Licznie występujące w naturalnych warunkach gatunki Cattleya rozwijają się najlepiej w świetle rozproszonym. Mieszaniec C. intermedia × C. aurantiaca został przeniesiony do warunków kultury in vitro przez izolację merystemów z wierzchołków wzrostu pędów poprzez fazę ciał protokormopodobnych a następnie namnaŜany w formie kultur pędowych na zmodyfikowanej poŜywce MS z dodatkiem 2,0 mg⋅dm-3 siarczanu adeniny, 9,7 mg⋅dm-3 kwasu askorbinowego, 0,2 mg⋅dm-3 zeatyny, 4,95 mg⋅dm-3 BA, i 1,0 mg⋅dm-3 NAA, 3,0 g⋅dm-3 sacharozy i 8,0 g⋅dm-3 agaru Difco.

Kulturę prowadzono w stałej temperaturze 25°C±2°C, w warunkach fotoperiodu 16/8 godz. Jako źródło światła stosowano monochromatyczne lampy firmy Philips TLD 36W o długości fal 360-450 nm oraz, w przypadku kontroli, lampy firmy Tungsram 40W F33 o białej barwie światła. NatęŜenie promieniowania światła białego na poziomie kultury wynosiło 60 µmol⋅m-2

⋅s-1. Naświetlanie kultur pędowych ultrafioletem wywołało ograniczenie liczby oraz świeŜej masy regenerowanych pędów przybyszowych. Na większości pędów uzyskanych w trakcie mikrorozmnaŜania nastąpiła spontaniczna regeneracja korzeni powietrznych. W kulturach eksponowanych na światło UV-A świeŜa masa zregenerowanych korzeni była istotnie niŜsza w porównaniu z kontrolą. Organy wegetatywne zregenerowane w trakcie kultury w ultrafiolecie nie odbiegały od kontroli pod względem budowy morfologicznej, pomimo iŜ osiągały znacznie mniejsze rozmiary. Natomiast wyraziste róŜnice dotyczyły budowy anatomicznej liści regenerowanych w trakcie naświetlania UV-A i liści roślin kontrolnych. Ultrafiolet spowodował przerost komórek epidermy liści, zaburzenia w procesie róŜnicowania mezofilu i zniekształcenie struktury elementów waskularnych, przy jednoczesnym ograniczeniu liczby wiązek przewodzących w liściu. StęŜenie barwników fotosyntetycznych czynnych u roślin naświetlanych promieniowaniem zakresu UV-A było znacząco niŜsze względem roślin kontrolnych naświetlanych światłem białym. PRELIMINARY MORPHOLOGICAL, ANATOMICAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTIC OF MICROPROPAGATED Cattleya HYBRID UNDER UV-A AND WHITE LIGHT ILLUMINATION


66

Teresa Cybularz-Urban 1, Ewa Hanus-Fajerska 1, Adam Świderski 2 1 Department of Botany, Agricultural University, Kraków 2 Department of Biochemistry, Agricultural University, Kraków Key words: orchid, micropropagation, UV-A, white light Summary

Numerous Cattleya species occuring in nature are developing in scattered light. Tissue culture was obtained by isolation of meristems from Cattleya intermedia x C. aurantiaca.

Protocorm-like bodies were regenerated in the liquid medium, and afterwards shoot cultures was initiated on the modified MS medum supplemented with 2.0 mg⋅dm-3 adenine sulphate, 5.0 mg⋅dm-3 benzylaminopurine, 0.2 mg⋅dm-3 zeatin, 1.0 mg⋅dm-3 naphtaleneacetic acid, 3% (w/v) sucrose and solidified with 0.8% (w/v) agar Difco. Cultures were kept at 25°C±2°C, with 16-h light and 8-h dark period per day, under UV-A and white light respectively. The exposure of shoot culture to UV-A resulted in reduction of the number and fresh weight of regenerated adventitious shoots. The after-effect observed in the majority of regenerated shoots was spontaneous rhizogenesis. In cultures exposed to UV-A fresh weight of regenerated aerial roots was significantly lower as compared to the control. Vegetative organs regenerated during the submission to ultraviolet illumination were of considerably smaller size, still their morphology was undisturbed. Instead, the distinct dissimilarities were observed in the anatomy of leaves regenerated in UV-A and in white light. UV-A induced excessive growth of epidermal cells, disturbances in mesophyll differentiation, deformation of vascular elements and reducing of vascular bundle number were observed. Concentration of photosynthetically active pigments was lower in plants exposed to UV-A. Dr Teresa Cybularz-Urban Katedra Botaniki Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja Al. 29 Listopada 54 31-425 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 69-82 WPŁYW DIOD ELEKTROLUMINESCENCYJNYCH (LED) NA WZROST I MORFOLOGIĘ KALUSA BOBIKU Ilona Czyczyło-Mysza

1, Franciszek Dubert

1, Izabela Marcińska

1,

Iwona Kacińska 2

1 Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego, Polskiej Akademii Nauk w Krakowie 2 Katedra Fizjologii Roślin, Akademia Rolnicza im H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp

Zastosowanie diod elektroluminescencyjnych (LED ang. light emitting diodes) jako źródła promieniowania dla roślin wywołuje w ostatnich latach duŜe zainteresowanie. LED posiadają wiele zalet: są energooszczędne, bezpieczne dla środowiska naturalnego i dla człowieka, gdyŜ nie zawierają niebezpiecznych związków rtęci i łatwiej niŜ lampy fluorescencyjne ulegają utylizacji po ich zuŜyciu. Ponadto charakteryzują się długą Ŝywotnością, są odporne na wibracje, działanie w szerokim zakresie temperatur (-40°C - +70°C), nie promieniują w podczerwieni i w ultrafiolecie, są bardziej niezawodne aniŜeli konwencjonalne źródła światła, są łatwe w sterowaniu, zasilaniu, obsłudze oraz mają bardzo małe rozmiary [BROWN, SCHUERGER 1993; HEO i in. 2002; NHUT i in. 2003; ORZECHOWSKI 2004; PAWLIKOWSKI 2004; SCHUERGER i in. 1997; WILANOWSKI 2004]. LED emitują promieniowanie monochromatyczne w bardzo wąskim zakresie widmowym. Szacuje się, Ŝe dają nawet o 130% bardziej czystą barwę niŜ w przypadku filtrowanego światła widzialnego. Ich wiązka światła moŜe być w dowolny sposób ukierunkowana, co sprzyja idei tworzenia oświetlenia dostosowującego się do aktualnej sytuacji. TakŜe tania produkcja masowa czyni prawdopodobnym dalsze obniŜenie kosztów ich wytwarzania, ze względu na ostrą konkurencję. Z powyŜszych powodów wydaje się wielce obiecującą moŜliwość zastosowania LED do uprawy roślin w kontrolowanych warunkach, gdzie mogłyby stanowić elementarne źródła światła w komorach wegetacyjnych, a nawet w szklarniach produkcyjnych.

W 2001 roku w NASA prowadzono badania, w których wysiłek naukowców był skoncentrowany na znalezieniu odpowiedniego źródła światła do upraw roślin na statkach kosmicznych. Panele LED, dające niebieskie i czerwone światło mogłyby pomóc w uprawie tych roślin, przyczyniając się do poprawienia komfortu Ŝycia kosmonautów oraz zmniejszenia ilości zapasów Ŝywności zabieranych w podróŜe kosmiczne [http://news.astronet.pl]. LED dzięki moŜliwości uzyskania z nich specyficznej długości fali i emisji światła, w bardzo wąskim zakresie widma promieniowania, były uŜywane do badań fitobiologicznych, dotyczących m.in. syntezy chlorofilu [TRIPATHY, BROWN 1995], przebiegu fotosyntezy oraz odporności na choroby pewnych gatunków roślin przetrzymywanych w ich obecności [KNOTT, WHEELER 2005]. Były teŜ uŜywane w fotobioreaktorach glonów [LEE, PALSON 1994] i do badań fotomorfogenezy [BARTA i in. 1992]. LED wpływają korzystnie na wzrost róŜnych gatunków roślin, takich jak: sałata, papryka, ogórek, pszenica, rzodkiewka, szpinak,

I. Czyczyło-Mysza i inni

70

szałwia i nagietek [HEO i in. 2002; HYEON-HYE i in. 2005]. Pojawiło się teŜ kilka publikacji dotyczących zastosowania LED w warunkach in vitro, dla takich gatunków jak: ziemniak, Rehmannia glutinosa, Cymbidium, Allium, truskawka, Azorina Vidalii [MOREIRA DA SILVA, DEBERGH 1997; NHUT i in. 2003]. Badania te były jednak realizowane zwykle w skali mikro (niewielka liczba diod, niewielka oświetlana powierzchnia). Pomimo, iŜ technologia LED jest stosunkowo nową i mało zbadaną dziedziną, to moŜe jednak w przyszłości stać się alternatywnym źródłem światła w uprawie roślin.

Rośliny motylkowe, w tym strączkowe, są oporne w hodowli in vitro. Do chwili obecnej opracowano indukcję i regenerację kalusa bobiku, lecz dla tej grupy roślin słabą stroną jest ukorzenianie regenerantów i ich aklimacja w warunkach ex vitro [SKRZYPEK 2002].

Celem badań była ocena wpływu światła czerwonego, dalekiej czerwieni, niebieskiego i białego, pochodzącego od LED na wzrost i róŜnicowanie kalusa bobiku. Materiał i metody System świetlny

Zastosowano pleksiglasowe płytki (o wymiarach 15 cm × 15 cm) paneli LED, emitujące światło niebieskie - 470 nm, czerwone - 660 nm, dalekiej czerwieni - 730 nm, a takŜe światło białe (rys. 1). Na kaŜdej płytce umieszczono po 25 diod o określonej barwie. Płytki zostały wykonane w porozumieniu z Centrum Wysokich Ciśnień PAN w Warszawie, które zajmuje się doświadczalną produkcją LED o zróŜnicowanych parametrach emitowanego promieniowania (prof. Michał Leszczyński, mgr Robert Jachymek). długość fali; wave length (mm) Rys. 1. Charakterystyka spektralna zastosowanych LED w doświadczeniu Fig. 1. Spectral characteristics LED used in experiment Materiał roślinny

Materiał do badań stanowiły rośliny bobiku, odmiany Sonet. Z roślin, wy-hodowanych w warunkach polowych, do kultur in vitro pobierano strąki. Poddawano je dezynfekcji: inkubacji przez 1 min w 70% etanolu, 20 min w 10% domestosie (w/v) oraz 4-krotnym płukaniu dejonizowaną wodą sterylną. Następnie ze strąków izolowano

300 400 500 600 700 800 900 1000

niebieskie/blue czerwone/red daleka czerwień/far redbiałe/white

WPŁYW DIOD ELEKTROLUMINESCENCYJNYCH (LED) ...

71

zarodki. Do indukcji kalusa, po odcięciu wierzchołka wzrostu pędu, korzenia oraz liścieni, pobierano z kaŜdego zarodka środek osi o długości 2-3 mm. Takie eksplantaty wykładano na sterylne płytki, z 25 kratkami, wypełnionymi poŜywką wg MURASHIGE i SKOOG (MS) [1962], którą modyfikowano dodając do 1 dm3 regulatory wzrostu: 0,5 mg

NAA, 1,0 mg BAP, 0,25 mg GA3, 1000 mg hydrolizatu kazeiny oraz 750 mg inozytolu. pH poŜywki ustalano na poziomie 5,8. Płytki te umieszczano pod panelami diodowymi emitującymi światło: niebieskie, czerwone, białe lub daleką czerwień LED (1 eksplantat na 1 kratkę). Kontrolę prowadzono w płytkach Petriego o średnicy 90 mm, wypełnionych poŜywką MS o tym samym składzie, w warunkach świetlnych panujących w komorach wegetacyjnych in vitro (białe światło widzialne, pochodzące ze świetlówek Philips TL MF 140Wat/33RS), przy 16-godz. fotoperiodzie, w temperaturze 20°C. Na kaŜdy obiekt przypadało po 15 eksplantatów jako powtórzenia. Eksplantaty poddawano 3-tygodniowemu naświetlaniu w/w wymienionych rodzajów LED. Po 3 tygodniach kultury, tworzące się na eksplantatach kalusy, w obecności LED i w warunkach kontrolnych (świetlówki), pasaŜowano na świeŜą poŜywkę o tym samym składzie i umieszczano w komorach wegetacyjnych in vitro (jw.) na okres 7 tygodni. Pomiary i obserwacje

W jednotygodniowych odstępach czasu określano świeŜą masę i barwę (stopień brązowienia) poszczególnych kalusów. Stopień brązowienia kalusów określano wg arbitralnie przyjętej skali, której szczegółowy opis znajduje się w tabeli 1. Bezpośrednio po 3-tygodniowym naświetleniu (tydzień 0) i po 7-tygodniowej kulturze w komorze wegetacyjnej pobierano tkanki takŜe do oznaczania zawartość chlorofilu a, b oraz karotenoidów. Pomiary zawartości tych barwników fotosyntetycznych zostały wykonane spektrometrycznie (spektrofotometr UV/VIS, prod. LKB, Szwecja) poprzez pomiar absorbancji przy długości fali: 470, 645 i 662 nm, zmodyfikowaną metodą wg LICHTENTHALERA i WELLBURNA [1983]. Wyniki Masa kalusa

Naświetlanie eksplantatów bobiku przez okres 3 tygodni róŜnymi rodzajami LED wywołało zróŜnicowany następczy wpływ na przyrost świeŜej masy kalusów bobiku podczas dalszych 7 tygodni kultury w obecności jedynie białych świetlówek typu Philips (rys. 2). Obserwowano równomierny, sukcesywny przyrost masy wszystkich kalusów i równocześnie wykazano, Ŝe w ostatnich tygodniach 7-tygodniowej kultury przyrost ten był statystycznie istotnie większy dla kaŜdego rodzaju LED, w odniesieniu do kontroli.

Największy przyrost masy kalusów wystąpił po naświetlaniu LED o barwie białej, szczególnie począwszy od 3 tygodnia kultury po naświetlaniu. Jedynie w dwóch początkowych tygodniach kultury, przyrost masy kalusów naświetlanych tym rodzajem światła był porównywalny z kontrolą. Po 3, 4, 5, 6 i 7 tygodniach kultury masa kalusów była większa odpowiednio o 19,1; 48,3; 71,8; 92 i 120,2% niŜ w tym samym czasie u kontroli. Były to znacznie wyŜsze wartości w odniesieniu do pierwszego tygodnia kultury po naświetlaniu.


72

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

0 1 2 3 4 5 6 7

tygodnie; weeks masa kalusa (% kon

troli)

mass calus (%

of control)

niebieskie; blue biale; white czerwone; red daleka czerwień; far red

Rys. 2. Następczy wpływ 3-tygodniowego naświetlania LED (światłem białym, czerwonym,

dalekiej czerwieni i niebieskim) na przyrost masy tworzącego się kalusa bobiku odmiany Sonet, po: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7 tygodniach oraz światłem pochodzącym ze świetlówek (kontrola). Wartości średnie z 9 powtórzeń wyraŜone w procentach kontroli ± SD

Fig. 2. Consequent influence of 3-weeks LED irradiation (white, red, far red and blue light)

on the increase of produced faba bean cv. Sonet mass callus, after: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7 week and light derived from fluorescent lamp (control). Means values from 9 replicates in percentage of control ± SD

Kalusy wytworzone na eksplantatach naświetlanych LED o barwie czerwonej

oraz dalekiej czerwieni początkowo miały najmniejszą masę, ale począwszy od 2 tygodnia obserwowano intensywny jej przyrost. W 7 tygodniu kultury po naświetlaniu tym rodzajem LED odnotowano o 39,0%, natomiast po LED dalekiej czerwieni o 36,7% większą masę kalusów, niŜ w tym samym czasie u kontroli.

TakŜe LED o barwie niebieskiej stymulowały przyrost masy kalusów, jednak w mniejszym zakresie. Po pierwszym tygodniu kultury w obecności świetlówek Philipsa, miały masę porównywalną z kalusami wytworzonymi w obecności LED o barwie białej, po 7 tygodniach nastąpił o 26,3% większy przyrost masy w odniesieniu do kontroli. Była to jednak najniŜsza masa spośród wszystkich kalusów naświetlanych róŜnymi rodzajami LED. Barwa kalusa

Kalusy bobiku zazwyczaj brunatnieją w warunkach in vitro ze względu na utlenianie się zawartych w nich związków fenolowych. Stopień brunatnienia (brą-zowienia) kalusów był zaleŜny zarówno od rodzaju LED jak i czasu trwania kultury po naświetlaniu. Obserwacje morfologii kalusów dokonywano począwszy od 2 tygodnia kultury w obecności świetlówek Philipsa. Wykazano, Ŝe wszystkie rodzaje LED wpływały korzystnie morfologię kalusa. W większym stopniu kalusy były barwy zielonej i w mniejszym stopniu brunatne (tab. 1). NaleŜy zaznaczyć, Ŝe najbardziej przydatne do regeneracji bobiku są kalusy o barwie zielonej. Tabela 1; Table 1 Następczy wpływ 3-tygodniowego naświetlania LED


73

(światłem białym, monochromatycznym: czerwonym, dalekiej czerwieni i niebieskim) na barwę tworzącego się kalusa bobiku odmiany Sonet po: 2, 3, 4, 5, 6 i 7 tygodniach oraz światłem pochodzącym z świetlówek (kontrola), (wartości średnie z 6-9 powtórzeń) Consequent influence of 3 weeks LED irradiance (white, monochromatic: red, far red and blue light) on the colour of produced faba bean cv. Sonet callus after: 2, 3, 4, 5, 6 and 7 weeks and light derived from fluorescent lamp (control), (means values from 6-9 replicates)

Światło; Light

Kalus; Callus

Liczba kalusów; Number of callus (%)

tygodnie kultury po naświetlaniu LED weeks culture after LED irradiation

2

3

4

5

6

7

1

2

3

4

5

6

7

8

Niebieskie

Blue

zielony; green

0

14,3

14,3

28,6

42,9

14,3

zielony lekko brązowiejący

green slightly brown

71,5

57,2

57,2

57,2

42,9

71,5

zielony z > 80% brązowiejący

green with > 80% brown

14,3

14,3

14,3

14,3

14,3

0

kremowy lekko brązowiejący

cream slightly brown

14,3

0

0

0

0

0

kremowy z > 80% brązowiejący

cream with > 80% brown

0

14,3

14,3

14,3

14,3

14,3

Czerwone

Red

zielony; green

0

0

16,7

16,7

16,7

33,3



50,0

83,4

83,4

88,3

88,3

66,7



50,0

16,7

0

0

0

0



0

0

0

0

0

0



0

0

0

0

0

0

Daleka czerwień

Far red

zielony; green

11,1

11,1

11,1

11,1

22,2

22,2



11,1

11,1

77,7

88,9

77,7

77,8



0

0

0

0

0

0



22,2

22,2

11,1

0

0

0



55,6

55,6

0

0

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Białe White

zielony; green

0

14,3

14,3

14,3

28,6

28,6



28,6

57,2

57,2

57,2

57,2

57,2



0

0

0

0

0

0



57,2

28,6

28,6

28,6

14,3

14,3


74

kremowy z > 80% brązowiejący cream with > 80% brown

14,3 0 0 0 0 0

Kontrola Control

zielony; green

0

0

0

0

0

0



85,7

85,7

71,5

85,7

100,0

67,2



14,3

14,3

28,6

14,3

0

28,6



0

0

0

0

0

14,3



0

0

0

0

0

0

W drugim tygodniu kultury po uprzednim, 3-tygodniowym naświetlaniu LED

(tydzień 2), jak równieŜ w kontroli, podczas dalszego wzrostu kultury w ciągu kolejnych tygodni (2, 3, 4, 5, 6 i 7) w komorze wegetacyjnej (świetlówki typu Philips), nie tworzyły się kalusy o barwie czysto zielonej. Zaś po naświetlaniu wszystkimi rodzajami LED obserwowano stopniowe pojawianie się fragmentów kalusów o barwie zielonej (11,1-22,2%), ale dopiero począwszy od 2 tygodnia kultury w komorze wegetacyjnej.

Po 6 tygodniach kultury następowało zwiększenie zazieleniania kalusów. Najwięcej fragmentów kalusów koloru zielonego obserwowano na eksplantatach naświetlanych LED o barwie niebieskiej (42,9%) i białej (28,6%). Po naświetlaniu LED o barwie czerwonej, wzrost procentowej zawartości zielonych fragmentów kalusów obserwowano dopiero w 7 tygodniu kultury (w obecności świetlówek). Kalusy pochodzące z naświetlanych eksplantatów nie traciły zielonej barwy, bowiem ich zawartość utrzymywała się, w 7 tygodniu było ich 57,2-77,8%. Pozostała część kalusów ulegała lekkiemu brązowieniu (w tab. 1 zielony lekko brązowiejący). LED o barwie dalekiej czerwieni najdłuŜej zapobiegało brązowieniu kalusów, pojawiało się ono o dwa tygodnie później, w porównaniu z pozostałymi LED i kontrolą. Było ich wówczas niewiele powyŜej 10%. Tak więc naświetlanie wszystkimi rodzajami LED zapobiegało drastycznemu ciemnieniu kalusów, w porównaniu z kontrolą. W 7 tygodniu kultury nie obserwowano juŜ w ogóle silnego brązowienia (w tab. zielony z > 80% brązowiejący). U kontroli zaś prawie całkowitemu brązowieniu uległo ok. 30% kalusów zielonych.

W kulturze po naświetlaniu LED pojawiały się takŜe kalusy o barwie kremowej. Ulegały one równieŜ częściowemu brązowieniu w trakcie dalszej kultury. W kolejnych tygodniach, w porównaniu z kontrolą, naświetlanie LED powstrzymywało i hamowało ich brązowienie. Najbardziej efektywne okazało się naświetlanie LED o barwie czerwonej i niebieskiej. Wówczas zanikało brązowienie kalusów, ściemniałych fragmentów było niewiele powyŜej 14%. Po naświetlaniu LED o barwie dalekiej czerwieni do 3 tygodnia kultury występowało więcej niŜ 50% silnie zbrązowiałych kremowych kalusów, ale juŜ po dwóch tygodniach ich zawartość zmniejszyła się do 0. Zatem następczy wpływ tego rodzaju LED był długotrwały.

Podsumowując, większemu przyrostowi świeŜej masy, towarzyszyło zmniej-szenie stopnia brunatnienia kalusów bobiku oraz wzrost zawartości fragmentów kalusów o barwie zielonej i kremowej. W 7 tygodniu kultury, największą procentową zawartość kalusa koloru zielonego, oraz najmniej brunatnych i ciemniejących tkanek obserwowano po naświetlaniu kolejno: LED o barwie czerwonej, następnie białej oraz dalekiej czerwieni. Najmniej zielonego kalusa, bez nekroz, obserwowano po naświetlaniu LED o barwie niebieskiej. NaleŜy podkreślić, Ŝe w kontroli nie obserwowano tworzenia się czysto zielonego kalusa.


75

Zawartość chlorofilu a, b i karotenoidów w kalusie

Zmiany zawartości barwników fotosyntetycznych, w kalusach bobiku, pod wpływem uprzedniego naświetlania LED, określonych bezpośrednio (tydzień 0) oraz po 7 tygodniach kultury po naświetlaniu przedstawiono na rys. 3a i 3b. W „tygodniu 0” (rys. 3a) najniŜszą zawartość chlorofilu a, b oraz karotenoidów w kalusach, w stosunku do kontroli, odnotowano po naświetlaniu LED o barwie dalekiej czerwieni. W przypadku chlorofilu a, największą jego zawartość obserwowano w kalusach tworzących się podczas naświetlania LED o barwie białej oraz niebieskiej. Było go odpowiednio ok. 2,6 i 2,3-krotnie więcej w stosunku do kontroli. RównieŜ kalusy naświetlane LED o barwie białej i niebieskiej wykazywały odpowiednio 3,0 i 2,5-krotnie większą niŜ u kontroli, zawartość chlorofilu b. Naświetlanie LED o barwie czerwonej nie wykazało istotnego wpływu na zawartość tych barwników. Najmniejszy wpływ uprzedniego naświetlania LED wykazano na zawartość karotenoidów, niemniej jednak równieŜ światło białe i niebieskie stymulowało kilkuprocentowy wzrost ich zawartości.

Po 7 tygodniach kultury kalusów bobiku w komorze wegetacyjnej, obserwowano znaczący spadek zawartości wszystkich barwników (chlorofilu a, b i karotenoidów) w porównaniu z „tygodniem 0” (rys. 3b). Nastąpił wówczas kilkukrotny spadek zawartości zarówno chlorofilu a jak i b oraz nieco mniejszy spadek równieŜ zawartości karotenoidów po naświetlaniu LED o barwie białej i niebieskiej. Obserwowano zbliŜone do kontroli pewne wyrównanie zawartości barwników w kalusach, brak było zawartości skrajnie odbiegających. W przypadku LED o barwie dalekiej czerwieni obserwowano niewielkie zwiększenie, zaś LED o barwie czerwonej obniŜenie zawartości chlorofilu a i b, w porównaniu z „tygodniem 0”. Dyskusja

Długość fali świetlnej, czyli barwa światła ma istotny wpływ na zmiany fizjo-logiczne, szczególnie dla roślin rozmnaŜanych metodą kultur in vitro, gdyŜ komórki w początkowym stadium róŜnicowania i regeneracji są szczególnie wraŜliwe na działanie zewnętrznych czynników fizycznych. Podczas wzrostu i rozwoju roślin w warunkach in vitro, światło działa głównie jako czynnik morfogenetyczny [GABARKIEWICZ i in. 1995]. Podstawowym czynnikiem regulującym morfogenezę in vitro są egzogenne regulatory wzrostu. Niezwykle istotnym problemem byłoby zbadanie współdziałania pomiędzy tymi czynnikami. Wydaje się, Ŝe dzięki zastosowaniu światła o odpowiedniej jakości i intensywności, moŜna będzie sterować przebiegiem morfogenezy w warunkach in vitro.


76

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

chlorofil a; chlorophyll a chlorofil b; chlorophyll b karotenoidy; karotenoids

niebieskie; blue czerwone; redbiałe-kontrol; white-control białe; whitedaleka czerwień; far red

a

a

a

a

a abb b b b

cc

bc b

Rys. 3. Zawartość chlorofilu a, b i karotenoidów w kalusie po 3-tygodniowym naświetlaniu

eksplantatów bobiku światłem LED (białym, czerwonym, dalekiej czerwieni i niebieskim) oraz światłem pochodzącym z świetlówek (kontrola) określanych: bezpośrednio po naświetlaniu (0 tygodni kultury) (A) oraz po 7 tygodniach kultury w komorze wegetacyjnej, pod wpływem światła pochodzącego z świetlówek (B). Wartości oznaczone tą samą literą nie są istotnie, róŜne przy (α < 0,05) wg wielokrotnego testu Duncana (n = 3)

Fig. 3. Chlorophyll a, b and carotenoids content in callus after 3 weeks irradiation of faba bean

explants by LED light (white, red, far red and blue) and light derived from fluorescent lamp (control) determined: just after irradiation (0 weeks of culture) (A) and after 7 weeks of culture in vegetative chamber under light derived from fluorescent lamp (B). Values signed with the same letters do not differ significantly according to multiplate Duncana test (α < 0.05); (n = 3)

Światło czerwone i niebieskie wykazuje szczególnie istotny wpływ na wzrost

świeŜej masy kalusa. Kultury kalusa Pelargonium zonale HORT. rosły najintensywniej w warunkach 3-tygodniowego ciągłego naświetlania światłem niebieskim (450 nm) o

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

chlorofil a; chlorophyll a chlorofil b; chlorophyll b karotenoidy; karotenoids

niebieskie; blue czerwone; redbiałe-kontrola; white-control białe; whitedaleka czerwień; far red

b b ab ab

ab b ab ab

a a

a a a a a


77

intensywności 15000 µW⋅cm-2, w porównaniu ze światłem zielonym, czerwonym i ciemnością. Jednak wzrost kalusa Haplopappus gracilis, podanego ciągłemu działaniu światła niebieskiego przez okres 33 dni, został zahamowany po przeniesieniu do ciemności. RównieŜ ciągłe działanie światła czerwonego (1000 µW⋅cm-2) hamowało wzrost kalusa, w przeciwieństwie do dalekiej czerwieni o tej samej intensywności, wzmagającej jego wzrost. Ciągłe naświetlanie kultury kalusa Daucus carota L. światłem czerwonym powodowało wzrost masy kalusa w porównaniu z kulturą kalusa tej rośliny na świetle niebieskim, zielonym czy białym [cyt. za GABARKIEWICZ i in. 1995]. Światło niebieskie i czerwone pozytywnie wpływało na rozwój pędów w kulturach kalusa kapusty pekińskiej [LEE i in. 1985]. Rodzaj światła, zastosowany podczas kultury in vitro, takŜe wpływał na indukcję i ustępowanie spoczynku. Światło czerwone zapobiegało indukcji spoczynku u roślin hiacynta w kulturach in vitro, natomiast światło niebieskie pogłębiało spoczynek [VAN DER LINDE i in. 1990]. Ponadto światło niebieskie wywierało zróŜnicowany wpływ na rozwój i wytwarzanie barwników u róŜnych gatunków roślin [SZWEYKOWSKA, SZWEYKOWSKI 1974; ZENKTELER 1995]. Światło ultrafioletowe w większości przypadków miało negatywny wpływ. Przykładowo, światło ultrafioletowe nie stymulowało tworzenia się pędów przybyszowych w kulturach kalusa z zarodków sosny oraz hamowało wzrost samego kalusa [KADKADE i in. 1978]. Zielone i Ŝółte światło jedynie w niewielkim stopniu stymulowało tworzenie pąków przybyszowych z fragmentów hypokotyli tego gatunku.

Przytoczone dane literaturowe wyraźnie wskazują na istotny wpływ róŜnych rodzajów światła na wzrost i rozwój roślin w kulturach in vitro. Brakuje nadal informacji dotyczących mechanizmu działania światła w morfogenezie organów u większości gatunków roślin. Badania współdziałania między jakością światła, foto-receptorami i regulatorami wzrostu są od kilku lat intensywnie rozwijane w wielu laboratoriach na świecie. Stąd teŜ poszerzają się coraz bardziej moŜliwości wyko-rzystania światła o róŜnym charakterze spektralnym w rozmnaŜaniu róŜnych gatunków za pomocą kultur tkankowych [GABARKIEWICZ i in. 1995].

W prezentowanym doświadczeniu wykazano, Ŝe LED o barwie niebieskiej i białej najbardziej efektywnie powodowały zwiększenie zazieleniania kalusów. Po-twierdzeniem tego jest fakt, iŜ równieŜ dla tych LED obserwowano największy wzrost zawartości wszystkich barwników fotosyntetycznych. Nie ma to jednoznacznego potwierdzenia w literaturze. Wykazano bowiem, Ŝe fizjologiczna odpowiedź na zmiany spektrum światła dochodzącego do roślin moŜe być róŜna u róŜnych gatunków roślin. Jednym z głównych wymagań w hodowli roślin jest dostarczenie dostatecznej ilości i jakości światła. Potencjalne, elektryczne lekkie źródła światła powinny mieć wysoką elektryczną wydajność, małą masę i pojemność. Diody świecące, szczególnie w czerwonym spektrum, mogą spełniać te wymogi [KNOTT, WHEELER 2005].

W prezentowanej pracy opisano wyniki badań wstępnych związanych z wpływem światła monochromatycznego w postaci diod elektroluminescencyjnych na wzrost i morfologię (barwę) kalusa bobiku. Autorzy mają nadzieję, Ŝe w niedalekiej przyszłości pojawi się więcej doniesień z zastosowaniem LED do badań roślin. Działanie LED na kalusy bobiku moŜna jedynie wiązać z zawartością endogennych związków fenolowych, gdyŜ roślina ta zawiera bardzo duŜe ilości tych substancji, głównie tanin. Konsekwencją tego jest gromadzenie się w tkankach bardzo duŜej ilości produktów utleniania związków fenolowych - chinonów, które wpływają na brunatnienie tkanek i powstawanie nekroz. Ponadto fenole ze względu na moŜliwość blokowania działania auksyn i tworzenia połączeń z innymi zwiazkami mogą pełnić rolę inhibitorów wzrostu. Jednak ich rola w procesie regeneracji bobiku do tej pory nie została jednoznacznie określona [SKRZYPEK 2002].

W oparciu o wielkość masy i rodzaj barwy kalusów, nie moŜna jednoznacznie


78

wskazać, który z eksplantatów ma większy potencjał morfogenetyczny, jednak na podstawie uzyskanych wyników, wydaje się, Ŝe w przypadku bobiku, potencjalnie najlepsze pod tym względem będą kalusy o barwie zielonej i zawierające najwięcej barwników fotosyntetycznych.

Często zdarza się, Ŝe wzrost masy nie idzie w parze z większymi zdolnościami do róŜnicowania kalusa, poniewaŜ cała energia zostaje włoŜona w produkcję masy, a nie w regenerację nowego organizmu. śUR i KOŚCIELNIAK [1997] stwierdzili, Ŝe poziom aktywności metabolicznej kalusa jest silnie uzaleŜniony od stopnia zaawansowania jego morfogenezy. NieróŜnicujące się tkanki kalusowe charakteryzują się niŜszymi wartościami emisji ciepła w początkowych etapach kultury. Natomiast tkanki róŜnicujące się cechuje szybszy metabolizm komórkowy, ujawniający się juŜ we wczesnych etapach morfogenezy.

Na zakończenie naleŜy podkreślić jeszcze jedną zaletę LED, związaną z niskimi kosztami ich uŜycia. Przy zastosowaniu konwencjonalnych źródeł światła otrzymujemy zwykle szerokopasmową emisję światła, z której dopiero przy pomocy róŜnych filtrów, monochromatorów, siatek dyfrakcyjnych czy pryzmatów wycina się potrzebny zakres widma. Oznacza to, Ŝe zbędne promieniowanie zostaje zatrzymane w monochromatorze, a energia potrzebna na jego wytworzenie jest marnowana. W LED natomiast światło monochromatyczne produkowane jest od razu i nie wymaga odcinania zbędnych barw. Z tego powodu moŜe zostać w całości wykorzystane przez rośliny, obniŜając koszty energii potrzebnej na jego wytworzenie. LED są więc wielce obiecującym źródłem światła dla wzrostu i rozwoju roślin. Autorzy sądzą, Ŝe w przyszłości moŜna oczekiwać ulepszenia warunków w kulturach tkankowych stosując diody LED jako główne źródło światła. Wnioski 1. Okresowe naświetlanie kalusa bobiku przy pomocy LED stymuluje wzrost masy

kalusa i jego morfologię.

2. Następczy efekt okresowego naświetlania LED w postaci zwiększenia dynamiki wzrostu masy kalusa bobiku utrzymuje się przez wiele tygodni dalszej kultury.

3. LED, szczególnie o barwie niebieskiej i białej, zmniejszają stopień brunatnienia oraz zwiększają tworzenie się kalusów zawierających fragmenty koloru zielonego bobiku, bez nekroz.

4. LED o barwie białej i niebieskiej powodują zwiększenie, natomiast o barwie czerwonej i dalekiej czerwieni zmniejszenie zawartości chlorofilu a i b oraz karotenoidów w kalusie bobiku, jednak efekt ten zanika podczas długotrwałej kultury.

Literatura BARTA D.J., TIBBITIS T.W., BULA R.J., MORROW R.C. 1992. Evalution of light emitting diode characteristics for a space-based plant irradiation source. Adv. Spa. Res. (Abstr.) 12(5): 141-149.

BROWN C.S., SCHUERGER A.C. 1993. Growth of pepper, lettuce and cucumber under light emitting diodes. Plant Physiol (Abstr.) 102: 88.

GABARKIEWICZ B., GABRYSZEWSKA E., RUDNICKI R.M. 1995. Wpływ jakości światła na wzrost i rozwój roślin in vitro. Post. Nauk Roln. 4/95: 57-69.

HEO J., LEE CH., CHARKRABARTY D., PEAK K. 2002. Growth responses of marigold and


79

salvia bedding plants as affected by monochromic or mixture radiation by a light-emitting diode (LED). Plant Growth Regulation 38: 225-230.

HYEON-HYE K.I.M., WHEELER R.M., SAGER J.C., YORIO N.C., GOINS G.D. 2005. Light-emitting diodes as an illumination source for plants: a review of research at Kennedy Space Center. Habitation 10: 71-78.

KADKADE P.G., WETHERBEE P., JOPSON H., BOTTICELLI C. 1978. Photoregulation of organogenesis in pine embryo and seedling tissue culture. IV Intl. Congr. Plant Tissue Cell Cult: 29 (Abstracts).

KNOTT W.M. WHEELER R.M. 2005. Light-Emitting Diodes for Plant Growth. The Bio-netics Corporation MD - RES 407: 853-5142.

LEE C.G., PALSON B. 1994. High-density algal photobioreactors using light emitting diodes. Biotech. Bioeng. (Abstr.) 44: 1161-1167.

LEE S.S., YOON J.Y., OH D.G., WOO J.G. 1985. Effect of phytohormone, temperature, nitrogen concentration vs. potassium and light quality on formation of callus and organs in tissue culture of Chinese cabbage, Brassica camestris ssp. Pekinensis. J. Kor. Soc. Hort. Sci. 26(1): 34-38.

LICHTENTHALER H.K., WELLBURN A.R. 1983. Determination of total carotenoids and chlorophyll a and b of leaf extracts in different solvents. Biochem. Soc. Transitions 603: 590-592.

MOREIRA DA SILVA M.H., DEBERGH P.C. 1997. The effect of light quality on the mor-phogenesis of in vitro cultures Azorina vidalii (Wats.) Feer. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 51: 187-193.

MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

NHUT D.T, TAKAMURA T., WATANABE H., OKAMOTO K., TANAKA M. 2003. Responsem of strawberry plantlets cultured in vitro under superbright red and blue light-emitting diode (LEDs). Plant Cell Tiss. Org Cult. 73: 43-52.

ORZECHOWSKI M. 2004. Diody LED w oświetleniu - teraźniejszość i przyszłość. http:ise.pl

PAWLIKOWSKI W. 2004. Diody LED wychodzą z „cienia”. http://dzis.dziennik.krakow. pl/2004/11.08/13html.

SCHUERGER A.C., BROWN CH., STRYJEWSKI E.C., 1997. Anatomical features of pepper plants grown under red light-emitting diodes supplemented with blue of far-red light. Ann. Bot. 79: 273-282.

SKRZYPEK E. 2002. Wzrost, róŜnicowanie i regeneracja w kulturach in vitro bobiku (Vicia faba ssp. minor). Rozprawa doktorska, Instytut Fizjologii Roślin im F. Górskiego PAN, Kraków: 88-91; 104-105.

TRIPATHY B.C., BROWN C.S. 1995. Root-shoot interaction in the greening of wheat seedlings grown under red light. Plant Physiol. 107: 407-411.

VAN DER LINDE P.C.G., DE WAAL H.R.A., GUDE H., TE BOEKHORST A.H.T. 1990. Effects of light quality on dormancy in Hyacinthus produced in liquid medium. Abstracts VIIth International Congress on Plant Tissue and Cell Culture, June 24-29, Amsterdam: 235.

WILANOWSKI A. 2004. Obecny stan technologii diod LED i prognozy rozwoju. LED 2 Konf., Zakład Technik i Systemów Oświetlenia Instytut Elektrotechniki, 12 III 2004, Warszawa 51: 187-193.

śUR I., KOŚCIELNIAK J. 1997. Czy aktywność metaboliczna moŜe stanowić wskaźnik zdolności do róŜnicowania tkanki kalusowej rzepaku (Brasica napus) w kulturach in


80

vitro? II Ogóln. Konf. „Zastosowanie kultur in vitro w fizjologii roślin”, 21-23 XI 1996, Kraków: 255-262. Słowa kluczowe: bobik, LED, kalus, chlorofil a i b, karotenoidy, morgfologię Streszczenie

Półprzewodnikowe diody elektroluminescencyjne, tzw. LED (light emitting diodes) mogą stać się alternatywnym źródłem promieniowania dla wzrostu roślin, poniewaŜ emitują promieniowanie w wąskim zakresie widmowym, mają bardzo małe rozmiary, niskie zuŜycie energii, długą Ŝywotność, minimalną emisję ciepła, są bezpieczne dla środowiska naturalnego i dla człowieka, wytrzymałe na wstrząsy i oddziaływanie otoczenia. Celem badań była ocena wpływu światła czerwonego, dalekiej czerwieni, niebieskiego i białego pochodzącego od LED na indukcję i róŜnicowanie kalusów bobiku. Materiał doświadczalny stanowiły niedojrzałe zarodki, z których indukowano kalusy bobiku. Pojedyncze zarodki, w trakcie tworzenia się na ich powierzchni kalusów na poŜywce indukcyjnej wg MURASHIGE i SKOOG [1962] poddawano 3-tygodniowemu naświetlaniu LED o barwie czerwonej, dalekiej czerwieni, niebieskiej i białej. Kontrolę stanowiły kultury prowadzone w komorze wegetacyjnej in vitro, gdzie źródło światła stanowiły białe świetlówki Philips’a TL MF 140Wat/33RS. Wytworzone kalusy przenoszono do warunków kontrolnych w komorze wegetacyjnej na okres dalszych 7 tygodni kultury. W jednotygodniowych odstępach czasu określono ich świeŜą masę oraz barwę. Dwukrotnie, po 0 i 7 tygodniach kultury po zakończeniu naświetlania i dalszej kulturze w warunkach kontrolnych dokonano takŜe pomiaru zawartości barwników fotosyntetycznych (chlorofilu a, b oraz karotenoidów). W przypadku wszystkich rodzajów LED obserwowano stymulację wzrostu masy kalusa bobiku w stosunku do kontroli, przy czym najbardziej dynamiczny jej wzrost obserwowano w obecności LED o barwie białej. Panele diodowe powodowały równieŜ zmniejszenie stopnia brunatnienia tkanek kalusowych oraz stymulowały tworzenie się kalusów zielonych, bez nekroz. Powstrzymywały takŜe brunatnienie kalusów koloru kremowego. Zawartość chlorofilu a, b oraz karotenoidów w kalusie, po bezpośrednim działaniu paneli diodowych, intensywnie wzrastała w obecności LED o barwie białej i niebieskiej, zaś LED o barwie czerwonej i dalekiej czerwieni istotnie obniŜała się. W czasie dalszej kultury następczy efekt 3-tygodniowego naświetlania LED zanikał powodując po kolejnych 7 tygodniach zmniejszenie się zawartości chlorofilu a i b w kalusie bobiku, za wyjątkiem dalekiej czerwieni, kiedy następował niewielki, choć istotny wzrost ich zawartości. W tym czasie nie obserwowano zwiększenia się zawartości karotenoidów w stosunku do kontroli. Wydaje się więc, Ŝe uzyskano potwierdzenie, Ŝe LED mogłyby stanowić dobre źródło światła w kulturach roślin prowadzonych w warunkach in vitro. INFLUENCE OF LIGHT EMITTING DIODES (LED) ON Vicia faba CALLUS GROWTH AND DIFFERENTIATION Ilona Czyczyło-Mysza 1, Franciszek Dubert 1, Izabela Marcińska 1, Iwona Kacińska 2 1 Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Kraków


81

2 Department of Plant Physiology, Agricultural University, Kraków Key words: faba bean, LED, callus, chlorophyll a i b, carotenoids, morphology Summary

Light emitting diodes (LEDs) can to be an alternative light source for the plant growth. They have been developed as for plants because of their wavelength specificity and narrow bandwidth, small mass, low energy, long life, minimum heating emission, shock- and surrounding environment influence-proof and finally for being safe for both humans and the natural environment.

The objective of this study was to examine the influence of red, far red, blue, and white radiation derived from LED on the induction and differentiation of faba bean callus. Faba bean immature embryos and formed on their surface callus were used as plant material explants. Single explants were maintained for 3 weeks on the inductive acc. MURASHIGE and SKOOG [1962] medium under red, far red, blue and white LEDs. As a control, the culture maintained in in vitro vegetation chamber under the White Philips’a TL MF 140Wat/33RS fluorescent lamps was used. Next, calli which have been formed during the irradiation time, were placed under the control conditions in in vitro vegetation chamber for 7 further weeks. In one week intervals the fresh mass and their color of each callus was determined. Also, the content of photosynthetic pigments (chlorophyll a and b, carotenoids) was measured twice, in 0 and 7th week of culture (after the irradiation with LEDs had been completed). In the case of all LEDs, the stimulation of callus mass production in faba bean, in comparison with the control was observed. The most dynamic growth of mass was observed under the white LED. LEDs caused also a decrease in calli browning and stimulated the formation of green and cream callus, without necrosis. After direct LEDs irradiation, the content of chlorophyll a, b and carotenoids in faba bean calli was changed. It was increased after white and blue light irradiation, whereas after red and distant red light it was indeed decreased. During further 7 weeks of culture, the consequent effect of LED 3-week-long treatment diminished. After that time, the content of chlorophyll a and b in faba bean calli was strongly decreased, except of the far red light treatment, where a slight, however, significant increase in these pigments content was observed. At that time an increase in the carotenoids content was not observed, in comparison with the control. It seems that the application of LED light could be a good source of light conditions for in vitro plant tissue culture. Dr inŜ. Ilona Czyczyło-Mysza Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polska Akademia Nauk ul. Niezapominajek 21 30-239 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 83-92 KLONOWANIE cDNA I EKSPRESJA GENU KODUJĄCEGO MANGANOWĄ DYSMUTAZĘ PONADTLENKOWĄ Vicia faba ssp. minor W KALUSIE REGENERUJĄCYM I NIEREGENERUJĄCYM1

GraŜyna Dąbrowska

1, Karina Kaczmarek

1, Edyta Skrzypek

2,

Magdalena Szechyńska-Hebda 2

1 Zakład Genetyki, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu 2 Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polskiej Akademii Nauk w Krakowie Wstęp

Liczne czynniki biotyczne i abiotyczne powodują wzmoŜoną generację reak-tywnych form tlenu, które w normalnych warunkach powstają jako nieuchronny produkt metabolizmu tlenowego. Do stresu oksydacyjnego dochodzi wówczas, gdy zaburzona zostaje fizjologiczna równowaga pomiędzy produkcją reaktywnych form tlenu a działaniem mechanizmów je usuwających. W bezpośrednią regulację komórkowego stęŜenia anionorodnika ponadtlenkowego O2⋅⋅⋅⋅_ i H2O2 zaangaŜowane są dysmutazy ponadtlenkowe (E.C.1.15.1.1; SOD - ang. superoxide dismutase), metaloproteiny katalizujące reakcję dysproporcjonowania (dysmutacji) dwóch anionorodników ponadtlenkowych do nadtlenku wodoru i tlenu cząsteczkowego [DAT i in. 2001]. Dysmutazy ponadtlenkowe eliminują zatem pierwszy produkt jednoelektronowej redukcji tlenu przekształcając go w nadtlenek wodoru, który usuwany jest następnie przez katalazy i/lub peroksydazy [SCANDALIOS 2005]. Roślinne dysmutazy ponadtlenkowe tworzą złoŜony i bardzo skuteczny system pierwszej linii obrony przed stresem oksydacyjnym [ALSCHER i in. 2002]. ChociaŜ rodzina SOD obejmuje kilka izozymów, to udowodniono, Ŝe jedynie MnSOD (ang. manganese superoxide dismutase) jest niezbędna do przetrwania organizmów w środowisku tlenowym [BAEK, SKINNER 2005].

1 Badania realizowano w ramach projektu badawczego nr 3 P06A 009 25 finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa WyŜszego.

Regulacja ekspresji genu MnSod w stanie stresu oksydacyjnego pozwala komórce na precyzyjną, zróŜnicowaną w sile i czasie trwania odpowiedź na czynniki wywołujące stres [SKRZYCKI, CZECZOT 2004]. Stres jest powszechnie postrzegany jako niekorzystny czynnik środowiskowy, prowadzący do miejscowego uszkodzenia lub nawet zamierania tkanek oraz efektów metabolicznych, głównie podwyŜszonego poziomu oddychania i nagromadzenia się substancji szkodliwych, takich jak reaktywne formy tlenu i fenole [DUBERT 2003].

Metoda kultur in vitro jest niewątpliwie jedną z cenniejszych technik wspo-magających postęp w biologii molekularnej roślin. Kultury tkankowe stanowią ponadto

G. Dąbrowska i inni

84

dogodny system modelowy do badania mechanizmów róŜnicowania się tkanek i regeneracji roślin.

Vicia faba ssp. minor jest gatunkiem o znaczeniu gospodarczym. Opracowano wydajny sposób regeneracji bobiku, gdzie oś niedojrzałych zarodków (bez merystemów wierzchołkowych pędu i korzenia) tworzy kalus regenerujący, a oś dojrzałych zarodków (bez merystemów wierzchołkowych pędu i korzenia) - kalus nieregenerujący [SKRZYPEK 2001].

Wstępne badania przeprowadzono w celu uzyskania sondy molekularnej dla Vicia faba ssp. minor, umoŜliwiającej sprawdzenie czy gen kodujący manganową dysmutazę ponadtlenkową ulega róŜnicowej ekspresji u bobiku rosnącego w kulturach in vitro. Materiał i metody

Materiał doświadczalny stanowił kalus bobiku odmiany Nadwiślański (Vicia faba ssp. minor). Po około 10 tygodniach od wysiania nasion bobiku na poletkach doświadczalnych, z roślin pobrano 4-5 cm strąki. Strąki i nasiona dezynfekowano 1 min. w 70% etanolu, 30 min w 10% Domestosie i płukano 5 razy wodą sterylną. Z niedojrzałych zarodków izolowano osie zarodków, tworzące kalus regenerujący (R). Osie dojrzałych zarodków, z których otrzymano kalus nieregenerujący (NR), pobierano ze sterylnie skiełkowanych nasion bobiku rosnących na agarze w temperaturze 20°C w warunkach 18/6 godz. - dzień/noc. Kalus regenerujący i nieregenerujący indukowano na poŜywce MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] z dodatkiem 3% sacharozy, 600 mg⋅dm-3 myo-inozytolu, 1000 mg⋅dm-3 hydrolizatu kazeiny, 1 mg⋅dm-3 NAA, 0,5 mg⋅dm-3 BAP i 0,25 mg⋅dm-3 GA3, w 16 godz. fotoperiodzie i w temperaturze 20°C. Uzyskany w ten sposób materiał przechowywano w temperaturze -80°C.

Materiał do izolacji całkowitego RNA uŜytego jako matryca w reakcji RT-PCR stanowiły siewki bobiku odmiany Nadwiślański. Nasiona moczono przez około 24 godziny w wodzie destylowanej w 30°C, po czym wysiewano do doniczek wypełnionych mieszaniną wilgotnego piasku i wernikulitu (2 : 1). Doniczki z roślinami przenoszono do komory klimatyzacyjnej, gdzie rosły na świetle ciągłym w temperaturze 26°C. Izolacja i oznaczanie stęŜenia kwasów nukleinowych

Izolację RNA ze 100 mg tkanki roślinnej (zarówno z siewek jak i z kalusa) przeprowadzano zgodnie z protokołem odczynnika TRI-Reagent firmy MRC, Cincinnati [CHOMCZYŃSKI, SACCHI 1987]. Wyizolowane RNA przechowywano w temperaturze -80°C.

DNA plazmidowe otrzymywano metodą lizy alkalicznej przeprowadzonej zgodnie z protokołem [SAMBROOK i in. 1989]. Podczas badań do analizy restrykcyjnej DNA uŜywano enzymów EcoRI i XhoI w buforze 2×Y+/Tango (Fermentas).

Ilość i jakość kwasów nukleinowych (stosunek A260/A280) mierzono spektro-fotometrycznie przy pomocy urządzenia GeneQuant (Pharmacia). Reakcje odwrotnej transkrypcji, PCR i ligacja

Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzono według protokołu opisanego przez SZYP i in. [2001]. W celu namnoŜenia fragmentu cDNA kodującego MnSod Vicia

KLONOWANIE cDNA I EKSPRESJA GENU KODUJĄCEGO ...

85

faba ssp. minor przeprowadzono reakcje amplifikacji ze starterami MnSOD1 (5’-ATTCAACGGCGGAGGTCAT3-’) i MnSOD2 (5’-GTAGTAGG-CATGTTCCCAAAC-3’) zaprojektowanymi przy pomocy programu OligoAnalyzer 3.0 dla sekwencji konsensusowej, powstałej w wyniku zestawienia sekwencji MnSod Pisum sativum z homologiczną sekwencją Arabidopsis thaliana (MSD1), obie sekwencje zdeponowane są w banku genów NCBI, pod numerami odpowiednio: X60170 i NP_187703. Do projektowania starterów dla cDNA kodującego MnSod bobiku wykorzystano sekwencję o najwyŜszej homologii pomiędzy MnSod grochu i rzodkiewnika, obejmującą fragment długości 318 pz. Mieszaninę reakcyjną stanowiły: 2 µg cDNA, 0,6 U polimerazy Taq (EurX), startery MnSOD1 i MnSOD2 i 5 mM dNTP (Promega). Reakcja przebiegała w następujących warunkach: 94°C - 10 min, 33 cykle (94°C- 45 s, 51°C - 45 s, 72°C - 45 s).

Produkt RT-PCR, fragment sekwencji genu kodującego MnSod V. faba, izolowano z Ŝelu agarozowego za pomocą zestawu QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen). Produkt PCR ligowano z wektorem pCR®II-TOPO (Invitrogen) według dołączonego protokołu. Transformacja komórek bakteryjnych i izolacja DNA plazmidowego

Kompetentne komórki E. coli szczepu DH5α transformowano mieszaniną ligacyjną poprzez zastosowanie szoku cieplnego. Z wybranych kolonii bakteryjnych (transformantów) wyizolowano DNA plazmidowego potrzebnego do reakcji sekwencjonowania wykonanej z uŜyciem uniwersalnego startera M13_rev (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’) w Pracowni Sekwencjonowania i Syntezy Oligo-nukleotydów Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie. Hybrydyzacja RNA (technika northern)

Rozdziału cząsteczek całkowitego RNA dokonywano w 1,2% denaturującym Ŝelu agarozowym z zawartością formaldehydu w temperaturze 4°C. RNA po elektroforezie przenoszono na membranę nylonową (SIGMA) według protokołu [SAMBROOK i in. 1989]. Następnie membranę naświetlano UV w celu związania RNA (GS Gene Linker, BioRad). Sondami molekularnymi do hybrydyzacji było wyznakowane jednoniciowe RNA bobiku i pszenicy uzyskane z cDNA kodującego manganową dysmutazę ponadtlenkową w reakcji transkrypcji in vitro z uŜyciem zestawu T7 Transcription Kit (Fermentas). Hybrydyzację prowadzono w buforze Denhardta (1% w/v Ficoll (typ 400), 1% w/v poliwinylopirolidon, 1% w/v BSA) w temperaturze 65°C przez noc. Niezwiązaną sondę molekularną usuwano poprzez 3-krotne odpłukiwanie błony (10 minut w temperaturze 50°C) w roztworze 0,2 x SSC i 0,5% SDS. Wizualizację przeprowadzano przy pomocy zestawu Phosphoimager FLA3000 (Fuji). Wyniki i dyskusja

Kultury tkankowe są szczególnie naraŜone na wpływ czynników stresogennych, gdyŜ juŜ sama hodowla in vitro jest w znacznym stopniu stresująca. W warunkach in vitro dochodzi do zmiany stęŜenia i kierunku transportu substancji troficznych obecnych w poŜywce. RównieŜ stęŜenia regulatorów wzrostu oraz skład atmosfery otaczającej hodowane kultury, w tym warunki tlenowe i stęŜenie etylenu zmieniają się w trakcie prowadzenia kultur. Ponadto, uwaŜa się, Ŝe same kultury tkankowe, zwłaszcza izolacja eksplantatów, moŜe generować stres oksydacyjny, chociaŜby na skutek ekspozycji tkanek, leŜących in vivo w głębi, na bezpośrednie działanie tlenu atmosferycznego. JednakŜe, pomimo tak wielu negatywnych skutków, stres moŜe mieć


86

równieŜ charakter pozytywny - indukujący procesy rozwojowe. W kulturach in vitro, warunki odbiegające od optymalnych wydają się odgrywać waŜną rolę czynnika sprawczego, stymulującego procesy róŜnicowania komórek. Bodźce stresowe mogą przyczyniać się do przywrócenia komórkom zdolności mitotycznej, a następnie do ponownego róŜnicowania, kończącego się często regeneracją nowej, kompletnej rośliny [DUBERT 2003].

Szerokie zastosowanie w badaniach procesów róŜnicowania oraz zmian ge-netycznych zachodzących w kulturach in vitro znalazły markery biochemiczne i molekularne. W wyniku analizy tkanki uzyskanej w kulturze, stwierdzono zróŜni-cowane wzory izoenzymatyczne dla hodowli embriogennej i nieembriogennej [KUCHARSKA 1994]. Od kilkunastu lat podejmowane są próby identyfikacji enzymów antyoksydacyjnych jako markerów róŜnicowania. Wydaje się, Ŝe aktywności peroksydazy, dysmutazy ponadtlenkowej i katalazy mogą słuŜyć do oceny kompetencji kultur tkankowych do regeneracji.

W celu określenia wzorca ekspresji genu MnSod w eksplantatach, z których otrzymano kalus regenerujący i nieregenerujący przeprowadzono analizę typu northern dla bobiku odmiany Nadwiślański. W tym celu wyizolowano całkowite RNA z eksplantatów oraz siewek bobiku, a jego jakość sprawdzano spektrofotometrycznie oraz wizualnie poprzez elektroforezę w Ŝelu agarozowym. Obrazy rozdziału elektroforetycznego charakteryzowała obecność róŜnego rodzaju rybosomowego RNA (rys. 1). Mimo duŜej zawartości związków fenolowych w tkankach bobiku [SKRZYPEK, DUBERT 2002] pomiary spektrofotometryczne równieŜ potwierdziły wysoką jakość wyizolowanego RNA. Początkowo jako sondę molekularną wykorzystano MnSod3.1 pszenicy wielkości 702 pz [WU i in. 1999]. JednakŜe, nie uzyskano specyficznej hybrydyzacji do mRNA bobiku (rys. 1). Jakość sondy molekularnej z pszenicy MnSod3.1 była wcześniej sprawdzona poprzez wykorzystanie jej do przeszukania biblioteki cDNA P. nil [DĄBROWSKA i in. 2005]. Brak hybrydyzacji cDNA MnSod3.1 do mRNA manganowej dysmutazy ponadtlenkowej bobiku, świadczy raczej o niewystarczającej homologii między tymi sekwencjami, która moŜe wynikać z niskiego stopnia pokrewieństwa obu gatunków oraz ze zmienności somaklonalnej kultur in vitro, aniŜeli o zastosowaniu zbyt restrykcyjnych warunków hybrydyzacji czy odpłukiwania membran. Słuszność powyŜszego załoŜenia wydaje się potwierdzać niespecyficzna hybrydyzacja sondy MnSod3.1 do rRNA. Dlatego sondę molekularną MnSod dla kultur V. faba przygotowano poprzez reakcję RT-PCR wykonaną na matrycach cDNA otrzymanych na drodze odwrotnej transkrypcji całkowitego RNA, pochodzącego z dwóch niezaleŜnych izolacji. W wyniku obu reakcji PCR otrzymano spodziewany produkt wielkości około 318 pz (rys. 2).

NR R NR R


87

A B

Rys. 1. A - Całkowite RNA z eksplantatów nieregenerujących (NR) i regenerujących (R) bobiku rozdzielone w 1,2% agarozowym Ŝelu denaturującym. B - Autoradiogram uzyskany po hybrydyzacji z sondą molekularną MnSod3.1 pszenicy wyznakowaną radioizotopowo (32P)

Fig. 1. A - Total RNAs from nonregenerating and regenerating explants of V. faba separated

on 1.2% denaturing agarose gel. B - Autoradiograph obtained after hybridisation with the 32P-labeled probe MnSod of wheat

M K 1 2 3 4

Rys. 2. Produkty reakcji PCR przeprowadzonej na cDNA bobiku ze starterami MnSOD1 i

MnSOD2. Poszczególne ścieŜki Ŝelu zawierają: M - markerowe DNA PerfectTM 100 bp, K - kontrola negatywna reakcji PCR, 1-2 - produkty reakcji PCR przeprowadzonej na matrycach cDNA z siewki I bobiku, 3-4 - produkty reakcji PCR przeprowadzonej na matrycach cDNA z siewki II bobiku

Fig. 2. The PCR products of reaction carried out with MnSOD1 and MnSOD2 primers using

cDNA of faba bean. The pathways of gel contained: M -DNA PerfectTM 100 bp marker, K - negative control of PCR reaction, 1-2 - PCR products obtained using cDNA from first seedling of faba bean, 3-4 - PCR products obtained using cDNA from second seedling of faba bean

Produkt reakcji RT-PCR oczyszczono z Ŝelu, a efektywność przeprowadzonej izolacji

300 pz


88

sprawdzono elektroforetycznie w Ŝelu agarozowym, a następnie wklonowano do wektora pCR®II-TOPO i przeprowadzono transformowację bakterii E. coli. Z uzyskanych kolonii bakteryjnych wyizolowano DNA plazmidowe, które poddano analizie restrykcyjnej enzymem EcoRI w celu kontroli wektora na obecność poŜądanej wstawki cDNA (dane niepokazane). W ten sposób uzyskano klon cDNA wielkości 318 pz, który następnie zsekwencjonowano (rys. 3). Otrzymaną sekwencję nukleotydową MnSod V. faba zestawiono w programie ClustalW z sekwencją cDNA genu MnSod3.1 Triticum aestivum (GenBank numer dostępu U72212). Analiza porównawcza wykazała 72,3% podobieństwo między tymi sekwencjami na odcinku długości 318 pz. Prawdopodobnie zbyt niska homologia między sekwencjami bobiku i pszenicy była przyczyna niepowodzeń we wstępnych etapach badań. Natomiast homologia cDNA bobiku z sekwencją cDNA MnSod P. sativum wynosi 95% (rys. 3). V. faba minor

ATTCAACGGCGGAGGTCATATCAACCATTCTATTTTCTGGAAAAATCTGGCTCCTGTTCG 60

P. sativum

ATTCAACGGCGGAGGTCATATCAACCATTCCATTTTCTGGAAAAATCTGGCTCCTGTTAG 422

****************************** *************************** *

V. faba minor

TGAAGGAGGTGGTGAACCACCAAAGGAATCCTTGGGCTGGGCCATTGACACAAATTTTGG 120

P. sativum

TGAAGGAGGTGGTGAACCACCAAAGGAATCCCTGGGCTGGGCCATTGACACCAATTTTGG 482

******************************* ******************* ********

V. faba minor

ATCTCTTGAAGCATTGATACAAAAGATTAATGCTGAAGGTGCAGCTCTTCAGGGGTCTGG 180

P. sativum

ATCTTTGGAAGCATTGATACAAAAGATTAATGCCGAAGGTGCAGCTCTTCAGGCGTCTGG 542

*** * ************************** ******************* ******

V. faba minor

ATGGGTGTGGCTTGGTCTCGACAAAGAGTTGAAGAGGCTTGTGGTTGAAACCACTGCAAA 240

P. sativum

ATGGGTGTGGCTTGGTCTCGACAAAGACTTGAAGAGGCTTGTGGTTGAAACCACTGCAAA 602

*************************** ********************************

V. faba minor

CCAGGACCCACTGGTCACTAAAGGAGCAAGTTTGGTTCCATTGCTTGGAATAGATGGTTT 300

P. sativum

CCAGGACCCACTGGTGACTAAAGGAGCAAGTTTGGTTCCATTGCTTTGGATAGAT-GTTT 661

*************** ****************************** * ****** ****

V. faba minor GGGAACCATGCCTACTAC 318

P. sativum GGGAA-CATGCCTACTAC 678

***** ************ Rys. 3. Porównanie sekwencji nukleotydowej cDNA V. faba z cDNA genu MnSod

P. sativum wykonane w programie ClustalW. Podkreślono sekwencje przyłączania starterów MnSOD1 i MnSOD2. Gwiazdkami zaznaczono pozycje identycznych nukleotydów

Fig. 3. The comparison of nucleotide cDNA V. faba sequence with cDNA sequence of the

P. sativum MnSod gene performed by ClustalW. Sequences of MnSOD1 and MnSOD2 primers are underlined. Asterisks indicate identical nucleotides

Sklonowane cDNA bobiku uŜyto do kolejnej hybrydyzacji z całkowitym RNA V. faba (rys. 4). Wykazano, Ŝe gen MnSod bobiku ulega wyŜszej ekspresji w kalusie zdolnym regeneracji niŜ kalusie nieregenerującym. Sonda molekularna specyficznie hybrydyzowała z transkryptem wielkości około tysiąca par zasad. Zademonstrowane eksperymenty pokazały, Ŝe sklonowany fragment cDNA genu MnSod V. faba moŜe być


89

z powodzeniem wykorzystany jako sonda molekularna do badania poziomu ekspresji genu manganowej dysmutazy ponadtlenkowej w tkankach bobiku uzyskanych z kultur in vitro. W związku z tym zaplanowano szereg kolejnych eksperymentów takich jak badanie poziomu ekspresji w warunkach stresu termicznego i osmotycznego, które pozwolą na określenie stopnia zaangaŜowania badanego genu w odpowiedź na warunki stresu oksydacyjnego w kulturach in vitro. NR R NR R

Rys. 4. A - Całkowite RNA z eksplantatów nieregenerujących (NR) i regenerujących (R) V.

faba rozdzielone w 1,2% agarozowym Ŝelu denaturującym. B - Autoradiogram uzyskany po hybrydyzacji z sondą molekularną MnSod bobiku wyznakowaną radioizotopowo (32P)

Fig. 4. A - A total RNAs from nonregenerating and regenerating explants of V. faba

separated on the 1.2% denaturing agarose gel. B - Autoradiograph obtained after the hybridisation with the 32P-labeled probe MnSod of faba bean

Wnioski 1. Kalus bobiku zdolny do regeneracji wykazuje wyŜszą ekspresję genu kodującego

manganową dysmutazę ponadtlenkową w porównaniu z kalusem nieregenerującym.

2. Ekspresja genu kodującego MnSOD moŜe być jednym z markerów róŜnicowania tkanek w warunkach in vitro.

Literatura ALSCHER R.G., ERTURK N., HEATH L.S. 2002. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. J. Exp. Bot. 53: 1331-1341.

BAEK K-H., SKINNER D.Z. 2005. Differential expression of manganese superoxide dis-mutase sequence variants in near isogenic lines of wheat during cold acclimation. Plant Cell Rep. 25: 223-230.


90

CHOMCZYŃSKI P., SACCHI N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid gua-nidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162: 156-159.

DAT J.F., INZÉ D., VAN BREUSEGEM F. 2001. Catalase-deficient tabacco plants: tools for in planta studies on the role of hydrogen peroxide. Redox Rep. 6: 37-42.

DĄBROWSKA G., PRUSIŃSKA J., GOC A. 2005. Identyfikacja cDNA genu RSH (RelA/SpoT homolog) zaangaŜowanego w odpowiedź Pharbitis nil na warunki stresowe. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 509: 333-341.

DUBERT F. 2003. Reakcje tkanek roślinnych in vitro na stres temperaturowy. X Ogól-nopolska konferencja kultur in vitro i biotechnologii roślin. Biotechnologia roślinna w biologii, farmacji i rolnictwie. Wydawnictwa Uczelniane Akademii Techniczno-Rolniczej, Bydgoszcz, 18.

KUCHARSKA M. 1994. Markery biochemiczne i molekularne w badaniach kultur in vitro. Prace Ogrodu Botanicznego PAN, Warszawa - Powsin, 5/6: 9-18.


SAMBROOK J., FRITSCH E.F., MANIATIS T. 1989. Molecular cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 10.38-10.40.

SCANDALIOS J.G. 2005. Oxidative stress: molecular perception and transduction of sig-nals triggering antioxidant gene defenses. Braz. J. Med. Biol. Res. 38: 995-1014.

SKRZYCKI M., CZECZOT H. 2004. Ekspresja genów dysmutazy ponadtlenkowej w stanie stresu oksydacyjnego. Post. Biol. Kom. 31: 81-92.

SKRZYPEK E. 2001. Optimization of the regeneration abilities of field bean (Vicia faba L. minor) in in vitro culture. Biol. Bull. Poznań 38(1): 87-95.

SKRZYPEK E., DUBERT F. 2002. Wzrost, róŜnicowanie i regeneracja bobiku (Vicia faba L. minor) w kulturach in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 488: 555-564.

SZYP I., DĄBROWSKA G., TRETYN A. 2001. Wykorzystanie tkanki kalusowej w badaniach nad molekularnymi podstawami fotoperiodycznej indukcji kwitnienia. Biotechnologia 2(53): 165-169.

WU G., WILEN R.W., ROBERTSON A.J., GUSTA L.V. 1999. Isolation, chromosomal loca-lization, and differential expression of mitochondrial manganese superoxide dismutase and chloroplastic copper/zinc superoxide dismutase genes in wheat. Plant Physiol. 120: 513-520. Słowa kluczowe: Vicia faba ssp. minor, kultury in vitro, manganowa dysmutaza

ponadtlenkowa Skróty: RT-PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy na matrycy cDNA (ang. reverse transcription-PCR), dNTP - trifosforany deoksyrybonukleotydów, SDS - dodecy-losiarczan sodu (ang. sodium dodecyl sulfate), BSA - albumina z surowicy bydlęcej (ang. bovine serum albumin), 20 × SSC - (3 mol NaCl⋅dm-3, 0,3 mol⋅dm-3 cytrynian sodu). Streszczenie


91

Dysmutazy ponadtlenkowe pełnią kluczową rolę w systemie antyoksydacyjnym, a ich obecność stwierdzono zarówno u bakterii tlenowych i droŜdŜy, jak i u roślin wyŜszych i zwierząt. Badania dotyczące wpływu warunków stymulujących bądź hamujących dyferencjację kalusa na wzorzec ekspresji genu manganowej dysmutazy ponadtlenkowej przeprowadzono na bobiku odmiany Nadwiślański (Vicia faba ssp. minor). W oparciu o sekwencje dostępne w banku genów NCBI (National Center for Biotechnology Information), zaprojektowano startery i wykonano reakcję PCR w celu uzyskania fragmentu 318 pz, który wklonowano do wektora pCR®TOPII, zsekwencjonowano i uŜyto jako sondę do hybrydyzacji typu northern. Sondę wyznakowano radioizotopowo metodą transkrypcji in vitro, a po hybrydyzacji otrzymano sygnał dla transkryptu wielkości około tysiąca nukleotydów. Badania wykazały, Ŝe gen MnSod ulega wyŜszej ekspresji w kalusie regenerującym niŜ nieregenerującym bobiku. cDNA CLONING AND EXPRESSION OF GENE ENCODING MANGANESE SUPEROXIDE DISMUTASE OF Vicia faba ssp. minor IN REGENERATING AND NON-REGENERATING EXPLANTS GraŜyna Dąbrowska

1, Karina Kaczmarek

1, Edyta Skrzypek

2,

Magdalena Szechyńska-Hebda 2

1 Nicolas Copernicus University, Department of Genetic, Toruń 2 Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Kraków Key words: faba bean, in vitro cultures, manganese superoxide dismutase Summary

Superoxide dismutases play a key role in the antioxidant system that explains their presence not only in aerobic bacteria and yeast, but also in higher plants and animals. The study concerning the effect of various conditions that stimulate or inhibit the differentiation of callus on manganese superoxide dismutase gene expression pattern was carried out on material derived from Vicia faba ssp. minor cv. Nadwiślański. On the basis of sequences contained in the GenBank National Center for Biotechnology, primers were designed and used in PCR reaction aiming at the amplification of 318 bp product, which was cloned into a vector pCR®TOPOII, sequenced and used as a probe in northern hybridization. The probe was radiolabelled by in vitro transcription, and after the hybridization, signals were obtained for about 1000 bp transcript. The study showed a higher expression of MnSod gene in regenerating and non-regenerating faba bean callus. Dr GraŜyna Dąbrowska Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Zakład Genetyki Uniwersytet Mikołaja Kopernika ul. Gagarina 9 87-100 TORUŃ e-mail: [email protected]


92

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 93-103 KULTURY in vitro JAKO MODEL W BADANIACH PROCESÓW FIZJOLOGICZNYCH U ROŚLIN Franciszek Dubert

1, 2, Agnieszka PłaŜek

1 1 Katedra Fizjologii Roślin, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie 2 Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polskiej Akademii Nauk w Krakowie Definicja modelu, jego zalety i wady

Model uŜyty w miejsce faktycznego obiektu jest to obiekt zastępczy, ułatwiający wykonanie badań lub wnioskowanie. Aspekt pierwszy ma zastosowanie wówczas, gdy cecha, którą badamy, jest w obiekcie modelowym szczególnie wyraźna, np. przyjmuje wyjątkowo wysokie wartości lub zmienia się silnie pod wpływem warunków otoczenia. W tym bowiem przypadku analizy są łatwiejsze do wykonania, moŜna zastosować prostsze techniki pomiarowe lub wykonać mniej pomiarów dla uzyskania statystycznie istotnych róŜnic między obiektami. Do najbardziej znanych roślin uŜywanych jako modele zaliczyć moŜna Pharbitis nil, Xanthium strumarium czy Hyoscyamus niger w badaniach fotoperiodyzmu, Mesembryanthemum crystallinum w badaniach stresu oksydacyjnego, a do badania przebiegu całej ontogenezy roślin stosuje się rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana) lub rzepak o szczególnie krótkim cyklu rozwojowym. Modelem dla kultur in vitro były przez wiele lat kultury roślin psiankowatych (Solanaceae). Cenną cechą modelu moŜe być jego uproszczona struktura i sieć zaleŜności, w wyniku czego przy interpretacji wyników wystarczy uwzględnić mniej czynników, których zmienność mogłaby zakłócić pomiary lub utrudnić uzyskanie wiarygodnych wyników, w porównaniu z badaniami wykonanymi na rzeczywistym obiekcie.

Przy wyborze rośliny modelowej bierze się pod uwagę róŜne aspekty: • łatwiejszy dostęp lub tańszy w utrzymaniu niŜ obiekt właściwy, • mniejsza niŜ właściwy obiekt (np. Arabidopsis), przez co moŜna uzyskać do

badań znacznie więcej osobników, • mniejszy genom (takŜe Arabidopsis) co upraszcza wiele badań genetycznych czy

molekularnych, lub genom rośliny modelowej jest juŜ zmapowany, • podwojony haploid i stąd znakomicie ułatwia badanie zaleŜności pomiędzy

genotypem i fenotypem, • prostsza struktura, np. kultury in vitro jako model rzeczywistej rośliny.

Modelowaniem są takŜe zabiegi upraszczające lub ułatwiające badania takie jak: • wyrównanie populacji przez usunięcie osobników najbardziej odbiegających od

przeciętnych, • wykonanie eksperymentu w ustabilizowanych i kontrolowanych warunkach

wegetacji, nie czekając, aŜ warunki takie nastąpią podczas wegetacji roślin w polu,

F. Dubert, A. PłaŜek

94

• ujednolicenie warunków troficznych u roślin, np. poprzez ustalenie liczby liści i strąków,

• znormalizowanie warunków świetlnych wzrostu roślin (zastosowanie lamp emitujących światło o określonym natęŜeniu i składzie spektralnym, takŜe zastosowanie określonego fotoperiodu),

• poddanie roślin znormalizowanemu stresowi (określone natęŜenie i czas działania),

• uŜycie genotypów o skrajnych wartościach badanej cechy, co ułatwia badanie jej wpływu na inne cechy roślin, np. do badań wpływu mrozoodporności na plon, najlepiej uŜyć odmian skrajnie odpornych i wraŜliwych na mróz,

• zastosowanie takich izotopów radioaktywnych, jak 14C, 3H, 35S, 32P, które umoŜliwiają śledzenie szlaków transportu metabolitów zawierających „zna-kowane” atomy; naleŜy jednak pamiętać, Ŝe izotopy te róŜnią się masą atomową od atomów nieradioaktywnych, a zatem róŜnią się takŜe szybkością dyfuzji i transportu,

• zastąpienie rzeczywistego obiektu jego matematycznym modelem i badanie wpływu modelowanych matematycznie czynników zewnętrznych na przebieg wirtualnych procesów wewnętrznych,

• wykonanie tzw. „doświadczenia myślowego” (termin zaproponowany przez Einsteina), czyli eksperymentu prowadzonego w wyobraźni badacza, przy „uŜyciu” wszelkich potrzebnych urządzeń pomiarowych, pracujących bezbłędnie i w pełnym zakresie moŜliwości fizycznych; doświadczenia takie pozwalają określić nieprzekraczalne granice poznania świata, wyznaczone przez podstawowe prawa fizyki.

UŜycie modelu ułatwia wykonanie pomiarów, analizę statystyczną wyników i

wnioskowanie. Zdarza się jednak, Ŝe eksperymentatorzy zapominają po wykonaniu eksperymentu, Ŝe posłuŜyli się modelem i sformułowane przez nich wnioski mogą być zastosowane jedynie do opisu tego modelu. Nie moŜna zatem przenosić ich i uogólniać na inne obiekty roślinne i inne warunki doświadczenia. Doświadczenie modelowe wymaga więc weryfikacji na rzeczywistym obiekcie, a w szczególności badania wykonane na roślinach uprawnych wymagają weryfi-kacji w warunkach polowych. Podział procesów zachodzących w roślinach na podstawie poziomu organizacji obiektu, w którym zachodzą

Dokonany tu podział moŜe wydać się zbyt kategoryczny, bowiem rzeczywiste procesy fizjologiczne mają często charakter mieszany, nie ograniczony do jednego poziomu organizacji strukturalnej rośliny. W takim przypadku przyjęto, Ŝe jeden z tych poziomów dominuje i dany proces został zakwalifikowany do tego właśnie poziomu organizacji albo, przypisano mu mieszany komórkowo-systemiczny charakter.

Do procesów zachodzących głównie w strukturach subkomórkowych naleŜą faza jasna i ciemna fotosyntezy roślin C-3 (struktury lamellarne chloroplastów), fosforyzacja oksydacyjna (wewnętrzna błona mitochondriów), transport do i z komórki (plazmolema), wewnątrzkomórkowa transmisja sygnałów (plazmolema i błony organelli), synteza białek (rybosomy), kwasów nukleinowych (jądro komórkowe), tłuszczów (wieloenzymowe kompleksy cytoplazmatyczne), węglowodanów (np. struktury plazmolemy syntetyzujące włókienka celulozowe), transport jonów i asymilatów (kanały jonowe i inne), a takŜe równowaga pomiędzy procesami hydrolizy i syntezy skrobi (amylazy). Do tej grupy moŜna teŜ zaliczyć przepływ wody przez

KULTURY in vitro JAKO MODEL W BADANIACH ...

95

plazmolemę (akwaporyny), który przy suboptymalnym uwodnieniu komórki prowadzi do stresu osmotycznego. Powstają wówczas pod wpływem kwasu abscysynowego lub kwasu jasmonowego specyficzne białka dehydryny. Zatrzymują one jony w komórce podwyŜszając stęŜenie soku komórkowego i zapobiegając jej odwodnieniu. Wykazują teŜ właściwości ochronne wobec białek cytoplazmy. Dzięki domenom hydrofilowym i hydrofobowym przywracają właściwą konformację częściowo rozwiniętym łańcuchom białkowym [KACPERSKA 2002].

Do procesów rozgrywanych głównie na poziomie całych komórek naleŜą takie, jak transmisja sygnałów (egzogenne substancje sygnałowe), komórkowe aspekty gospodarki wodnej (transport wody między komórkami), czy komórkowe aspekty odporności roślin na stresy (mróz, chłód, suszę i metale cięŜkie).

Procesy o charakterze mieszanym, komórkowym i systemicznym rozgrywają się w komórkach i poza nimi. Typowym przykładem jest odporność roślin na mróz. Znane są wprawdzie komórkowe mechanizmy hartowania na mróz (gromadzenie cukrów, proliny i białek ochronnych), ale dla wypadkowej mrozoodporności rośliny kluczowa moŜe okazać się podwyŜszona wraŜliwość szyjki korzeniowej na przemarzanie w wyniku czego roślina usycha.

Procesem o charakterze mieszanym jest odporność roślin na metale cięŜkie. Są one wprawdzie wiązane w komórkach w nierozpuszczalne połączenia (procesy komórkowe), jednak na granicy korzeń/łodyga pojawia się bariera dla cięŜkich metali. W wyniku jej obecności stęŜenie cięŜkich jonów w częściach nadziemnych jest wielokrotnie mniejsze niŜ korzeniach, chociaŜ właśnie w organach transpirujących metale te powinny się akumulować. Specyficznymi białkami biorącymi udział w reakcji odpornościowej na jony metali cięŜkich są fitochelatyny, których składnikiem jest glutation, zawierający reszty tiolowe. Wychwytują one jony metali cięŜkich, a powstające kompleksy deponowane są w wakuoli [KACPERSKA 2002].

Procesy obronne uruchamiane w czasie patogenezy przebiegają głównie na poziomie komórkowym. Po rozpoznaniu patogena przez receptory błonowe uruchamia się kaskada sygnałów, co prowadzi do ekspresji genów kodujących enzymy szlaków metabolicznych, na których znajdują się związki waŜne dla odporności. Kluczowym enzymem jest amoniakoliaza fenyloalaniny, która umoŜliwia syntezę takich związków fenolowych, jak kwas salicylowy, lignina, czy fitoaleksyny. Powstają teŜ białka typu PR (ang: pathogenesis-related proteins) takie jak glukanaza, chitynaza, tioniny, osmotyny czy taumatyny [Mauch i in. 1988; HAMMOND-KOSACK, JONES 1996; MAUCH-MANI, MÉTRAUX 1998]. Wymienione komórkowe procesy składają się jednak na proces obrony systemicznej, określany jako SAR (ang: systemie acquired resistance), w którym kwas salicylowy jako cząsteczka sygnałowa przekazywany jest wiązkami przewodzącymi z organów poraŜonych do zdrowych, gdzie indukuje syntezę białek PR, fitoaleksyn i RFT (reaktywne formy tlenu). Innym mechanizmem systemicznym jest reakcja nad-wraŜliwości (ang: HR - hypersensitive response). Dochodzi wówczas do zaprogra-mowanej śmierci komórek zaatakowanych przez patogen oraz komórek otaczających miejsce infekcji. W tym drugim przypadku śmierć zdrowych komórek następuje w wyniku otrzymania przez nie zewnętrznego (systemicznego) sygnału.

Najbardziej typowym procesem komórkowo-systemicznym jest jednak zdolność roślin do wzrostu i rozwoju przy ograniczonym zuŜyciu wody. Maksymalizacja współczynnika efektywności uŜytkowania wody WUE (water use efficiency) następuje w wyniku współdziałania procesów zachodzących na róŜnych poziomach struktury rośliny. Na poziomie komórek moŜe to być mechanizm utrzymujący metabolizm przy wyŜszym stęŜeniu soku komórkowego. Na poziomie liści moŜe to być okresowe przymykanie aparatów szparkowych i większy stopień zatrzymywania i reasymilacji dwutlenku węgla pochodzącego z oddychania. Na poziomie systemicznym natomiast,


96

oszczędne uŜytkowanie wody moŜe wynikać z ograniczonego pobierania wody przez korzenie lub ich ograniczonego wzrostu. Z procesem tym wiąŜe się odporność roślin na suszę. Uczestniczy tu szereg zjawisk komórkowych. Powstają specyficzne białka wiązane początkowo z szokiem cieplnym i stąd nazwane HSP (ang. heat shock proteins) o zróŜnicowanej lokalizacji w komórce (grupa I i II - cytozol, III -chloroplasty, IV - mitochondria, V - retikulum endoplazmatyczne i VI - nieznana lokalizacja). Stabilizują one białka błonowe i inne, pełnią funkcje opiekuńcze jako czaperony (ang. chaperons) i stymulują mechanizmy naprawcze. Powstają teŜ w wyniku wzrostu stęŜenia ABA, zranienia czy zasolenia. Białko opiekuńcze kontroluje pofałdowanie innych białek. Brak białek opiekuńczych groziłby powstaniem przypadkowych konformacji, a nawet splątaniem łańcucha polipeptydowego powstającego białka [KACPERSKA 2002].

Procesami systemicznymi lub organizmalnymi są te, w których dominuje strategia celu całego organizmu, realizowana takŜe przez cały organizm. MoŜna tu zaliczyć apoptozę, termo- i fotoindukcję kwitnienia, obfitość kwitnienia, plonowanie, architekturę rośliny, strukturę plonu, spoczynek nasion oraz długość cyklu wegetacyjnego.

W przypadku roślin uprawnych najwyŜszy stopień organizacji wykazują procesy rozgrywane na poziomie populacji lub łanu, a więc odnoszone do relacji pomiędzy roślinami w ich zbiorowisku. NaleŜą do nich plonowanie łanu, gospodarka wodna, mineralna i energetyczna łanu, kształtowanie architektury roślin decydujące o pionowym rozkładzie natęŜenia i składu spektralnego światła oraz powierzchni asymilacyjnej w łanie, czy teŜ konkurencja pomiędzy roślinami w powietrzu i w glebie (allelopatia). Kultury in vitro jako model o unikalnych właściwościach

Model ten jest często stosowany dla opisu róŜnych procesów w roślinach. Dzieje się tak poniewaŜ kultury in vitro: • pozwalają obniŜyć koszty eksperymentu poprzez ograniczenie powierzchni

hodowli, ograniczenie potrzeby klimatyzacji tylko do naczyń hodowlanych, zmniejszenie intensywności światła, itp. walory te mogą zrekompensować większy koszt podłoŜa dla hodowli in vitro w porównaniu z substratem gle-bowym,

• pozwalają eliminować wpływ mikroorganizmów na wartości mierzonych parametrów fizjologicznych w roślinach; udział masy mikroorganizmów w masie rośliny jest wprawdzie znikomy, jednak ze względu na wielką intensywność ich metabolizmu, mogą mieć znaczący udział w obserwowanej sumarycznej intensywności procesów metabolicznych w roślinie,

• w kulturach in vitro moŜliwa jest selekcja komórek i tkanek o ujednoliconych i ulepszonych właściwościach,

• w naczyniach hodowlanych wegetacja kultur odbywa się w lepiej regulowanych i stabilizowanych warunkach w porównaniu z warunkami zewnętrznymi,

• w ustabilizowanych kulturach in vitro moŜna przez długi czas utrzymywać na stałym poziomie stan fizjologiczny (wiek?) komórek, pozwala to powtarzać eksperyment, co jest trudne przy uŜyciu kompletnych roślin, gdyŜ naleŜy uwzględnić zachodzące w nich procesy wzrostu, rozwoju i starzenia komórek, organów i całych roślin.


97

Kultury in vitro jako model rośliny - głosy za i przeciw

Przeciwnicy zgłaszają obawy płynące z przeświadczenia, Ŝe kultury in vitro są „sztucznymi tworami” rosnącymi w warunkach, nie pozostającymi w Ŝadnej relacji do rzeczywistych warunków wegetacji roślin. Przyjrzyjmy się bowiem krytycznie „zewnętrznym warunkom wegetacji” tak, jak są one odbierane przez komórki mieszczące się we wnętrzu rośliny. Czy jeŜeli będziemy utrzymywać w komorze wegetacyjnej określone i stabilne natęŜenie i skład spektralny światła, temperaturę, skład i wilgotność powietrza, a takŜe wilgotność i skład mineralny gleby, to czy z tego wynika, Ŝe wszystkie komórki w roślinie będą tak samo odbierać te warunki? OtóŜ, absolutnie nie. KaŜda roślina wytwarza bowiem wewnętrzne środowisko, którego parametry bardzo odbiegają od tych na zewnątrz. Przykładowo, w komorach powietrznych w owocu papryki, czy w łodygach niektórych roślin stęŜenia dwutlenku węgla sięgają wartości 2-3%, są więc niemal stukrotnie wyŜsze od stęŜenia tego gazu w atmosferze. Z zawartością tlenu jest przeciwnie - komórki leŜące w głębi tkanek sąsiadują z przestworami powietrznymi o obniŜonej jego zawartości. StęŜenia innych gazowych składników wewnętrznej atmosfery takich jak etylen, tlenek azotu, czy izopren, takŜe są róŜne w róŜnych organach rośliny. Skład wewnętrznej atmosfery w liściach zaleŜy od ruchów aparatów szparkowych, a nie od działania aparatury klimatyzacyjnej w komorze wegetacyjnej. Nawet tak oczywisty parametr jak temperatura ma inne znaczenie dla komórek w liściach nasłonecznionych i zacienionych, a wewnątrz łanu natęŜenie światła spada do ok. 1% wartości mierzonej w szczytowych partiach łanu. Wreszcie, w roślinach występują gradienty stęŜeń substancji pokarmowych, hormonów i jonów nieorganicznych, silnie róŜnicujące warunki Ŝycia komórek w róŜnych częściach rośliny.

Nastawione parametry wegetacji roślin są zatem istotne jedynie dla powta-rzalności eksperymentu. Natomiast parametry te w bardzo małym stopniu określają wartości parametrów wewnętrznego środowiska rośliny, odbierane przez komórki zlokalizowane w róŜnych miejscach organizmu rośliny. Reakcja rośliny na określone warunki klimatyczne jest więc jedynie średnią z jednostkowych reakcji poszczególnych komórek, przy czym nie mamy pojęcia jak bardzo rozrzucone są wartości składające się na tę średnią. Ponadto trzeba wziąć pod uwagę, Ŝe rośliny zbudowane są z organów w róŜnym wieku, a poszczególne organy takŜe składają się z komórek starszych i młodszych, pozostających w róŜnych etapach rozwoju. Wypadkowa reakcja rośliny jest więc takŜe uśrednieniem reakcji komórek w róŜnym wieku, a udział poszczególnych klas wiekowych jest poza kontrolą eksperymentatora.

W kulturach in vitro parametry ekofizjologiczne takŜe przyjmują inne wartości aniŜeli te charakteryzujące rośliny. W warunkach in vitro wszystkie parametry wzrostu są inne, niŜ w tzw. warunkach naturalnych: natęŜenie i spektrum światła, skład i wilgotność atmosfery, kompozycja poŜywki, w tym stosunki hormonalne, i wreszcie gradienty składników pokarmowych. Nie musi to jednak deprecjonować kultur in vitro jako modelu roślin, poniewaŜ z poprzednich rozwaŜań wynikało, Ŝe warunki w róŜnych miejscach in planta takŜe odbiegają od warunków zewnętrznych zapewnionych przez aparaturę klimatyczną. Kultury in vitro wnoszą jednak wiele korzyści do badań roślin. Oprócz powtarzalności eksperymentalnej porównywalnej z kulturami ex vitro, kultury sterylne pozwalają uzyskać nieporównywalnie większą jednolitość badanego materiału. Komórki w warunkach in vitro są bowiem wystawione bezpośrednio na wpływ zastosowanych parametrów wegetacji, które dzięki temu oddziałują jednakowo na wszystkie komórki w kulturze. W kulturach in vitro moŜemy ponadto kontrolować udział komórek w róŜnym wieku, a jeśli ich róŜnorodność jest mimo wszystko za


98

wysoka, moŜemy ją zawęzić poprzez segregację komórek określonego typu. Kultury in vitro pozwalają więc daleko lepiej zdefiniować przedmiot badań, nawet jeśli nie wiadomo, jak dalece model ten odbiega od rzeczywistej rośliny. Nie powinno się jednak stosować ich bezkrytycznie w modelowaniu wszelkich procesów roślinnych, choć dla niektórych z nich mogą stanowić cenny model. Podział kultur in vitro w zaleŜności od poziomu organizacyjnego

Jako kultury subkomórkowe moŜna wymienić izolowane organella komórkowe: jądra, chloroplasty, mitochondria, rybosomy czy błony komórkowe. Uzyskuje się je zwykle z protoplastów, choć moŜliwa jest takŜe izolacja z tkanek czy organów roślin. W tym drugim przypadku wydajność uzyskiwania organelli jest jednak duŜo niŜsza z uwagi na uszkodzenia mechaniczne występujące w trakcie homogenizacji tkanek. Ponadto, izolowanie organelli z protoplastów następujące w płynnej poŜywce jest dla nich mniejszym stresem, niŜ w przypadku izolacji z organów roślinnych, zwłaszcza, gdy wydobycie organelli wymaga mechanicznego zniszczenia ściany komórkowej.

Do kultur komórkowych naleŜą głównie kultury protoplastów i zawiesin komórkowych. Czasami kultura komórek w ustabilizowanych zawiesinach moŜe stanowić lepszy model aniŜeli protoplasty, poniewaŜ komórki w zawiesinie nie zostały uprzednio poddane stresowi izolacji. W badaniach przepuszczalności plazmolemy jednak najwaŜniejszą zaletą protoplastów jest właśnie brak ściany komórkowej, która bardzo utrudnia prowadzenie tych badań na innych obiektach. Do modeli komórkowych moŜna zaliczyć takŜe kultury niezróŜnicowanego kalusa. Jest to wprawdzie system ponadkomórkowy, jednak w kalusie niezróŜnicowanym dominują właściwości pojedynczych komórek. NaleŜy jednak podkreślić, Ŝe właściwości komórek kalusa określone są nie tylko przez warunki hodowli, ale takŜe przez rodzaj uŜytego eksplantatu. To zróŜnicowanie właśnie, zaleŜnie od źródła pochodzenia, moŜe się utrzymywać przez długi okres hodowli in vitro.

Kulturę ponadkomórkową, ale nie systemiczną, stanowi kalus róŜnicujący. W zaleŜności od genotypu, rodzaju eksplantatu i warunków hodowli róŜnicowanie moŜe dotyczyć elementów wiązek przewodzących, fragmentów quasi skórki jako zaczątków tkanki okrywającej, organogenezy (róŜnicowanie korzeni, liści i pędów) i w najdoskonalszej formie embriogenezy. Do tego poziomu organizacyjnego naleŜą teŜ kultury fragmentów liści, korzeni wierzchołków wzrostu, czy organów generatywnych. Zaletą ich jest moŜliwość standaryzacji poprzez stosowane powtarzalnych warunków kultury.

NajwyŜszą formę organizacyjną kultur in vitro stanowią kultury systemiczne, a więc kultury regeneratów i np. zarodków somatycznych. Specyficzne problemy z zastosowaniem protoplastów jako modelu

Wraz z opanowaniem techniki masowej izolacji protoplastów pojawiło się duŜo prac, w których obiekty te zostały zastosowane. Pamiętać trzeba, Ŝe o ile protoplasty uŜywane w pracach hodowlanych, czy w inŜynierii genetycznej lub biotechnologii, są rzeczywistymi obiektami, w fizjologii i biochemii roślin stanowią one wprawdzie unikalny, ale jednak tylko model, którego zadaniem jest ułatwienie poznania natury procesów zachodzących w roślinach.

Protoplasty mogą z natury swojej stanowić dogodny model błony komórkowej. Preparacja fragmentów błon z organów roślin jest trudna, gdyŜ mechaniczna


99

dezintegracja ścian komórkowych, uszkadza delikatne struktury błon lipidowo-białkowych. W wyniku osmotycznego pękania protoplastów uzyskuje się znacznie większe fragmenty błon, a nawet nie niszcząc tych komórek moŜna odrywać z nich małe fragmenty plazmolemy (tzw. łatki) zawierające pojedyncze kanały jonowe lub receptory. Stwarza to unikalną moŜliwość badania subtelnej struktury błony komórkowej i jej składników, nawet oddzielnie na obydwu stronach plazmolemy, tj. zewnętrznej i wewnętrznej.

Protoplasty zmieniają w pewnym zakresie swoje wymiary w zaleŜności od potencjału wody w poŜywce. UmoŜliwia to zastosowanie tego modelu do badań nad biosyntezą i degradacją plazmolemy, oraz określenie bezpośredniego wpływu składu poŜywki na skład nowopowstałych fragmentów plazmolemy. W badaniach tych przydatne mogą być teŜ zawiesiny komórkowe, które takŜe zapewniają jednolitość warunków stwarzanych wszystkim komórkom zawiesiny, aczkolwiek obecność ściany komórkowej stanowi znaczne utrudnienie. Pamiętać jednak naleŜy, Ŝe proces izolacji protoplastów jest dla tych komórek silnym stresem. Dotyczy to zwłaszcza wstępnej plazmolizy i zbyt długiego czasu trawienia. Poza fizycznymi skutkami usunięcia ściany komórkowej, naleŜy zwrócić uwagę takŜe i na to, Ŝe enzymy trawiące składniki ściany komórkowej wykazują teŜ niewielką aktywność proteazową. Mogą więc uszkodzić białka plazmolemy. Przeciwdziała się temu dodając albuminę do mieszaniny uwalniającej protoplasty, nie ma jednak pewności, czy albumina zabezpiecza w pełni białka błonowe przed uszkodzeniem.

Warto równieŜ wspomnieć, Ŝe protoplasty powstają w wyniku strawienia ściany komórkowej oraz przerwania plazmodesm łączących komórki. Są to więc obiekty inne od komórek w tkankach, a do tego same poddane wcześniej działaniu stresu. Budzi to wątpliwość, czy np. moŜna badać stres na obiektach poddanych wcześniej stresowi izolacji. W zamian jednak protoplasty stanowią unikalny model komórek roślinnych o ujednoliconych właściwościach, co uzyskuje się rozdzielając populację protoplastów w gradiencie gęstości na frakcje moŜliwie zbliŜone do modelowanych komórek. I wreszcie ostatnia ich zaleta - protoplasty traktowane jako oddzielne obiekty stanowią zwykle wielomilionowe populacje, na których duŜo łatwiej, taniej i efektywniej moŜna prowadzić ostrą selekcję komórek o poŜądanych właściwościach, w szczególności o podwyŜszonej odporności na stresy. Zasada koniecznej zgodności stopnia organizacji modelu i procesu fizjologicznego do badania którego model ten został uŜyty

Zasada ta, sformułowana przez autorów, stwierdza, Ŝe określony proces moŜna modelować jedynie przy pomocy modelu o poziomie organizacji nie niŜszym od tego, jaki jest wymagany dla zajścia tego procesu w roślinie. Badacze często o tym zapominają i, stosując nieadekwatny do sytuacji model, uzyskują wyniki nie poddające się interpretacji, albo prowadzące do błędnych wniosków. W szczególności procesy zachodzące głównie w komórkach mogą być modelowane przez obiekt o strukturze komórkowej, np. protoplasty, zawiesiny komórkowe czy niezróŜnicowany kalus. Natomiast te same obiekty stają się nieprzydatne jako model w badaniach procesów zachodzących w całej roślinie (np. indukcja kwitnienia). Przykłady udanego zastosowania kultur in vitro jako modelu dla procesów fizjologicznych zachodzących w roślinach


100

Do procesów, które badane są standardowo przy wykorzystaniu kultur in vitro

naleŜą takie jak badanie w celach porównawczych rozwoju zarodka somatycznego i gametycznego, zapłodnienie in vitro (które czasem umoŜliwia obejście barier niekrzyŜowalności) oraz ograniczone tylko do wewnątrzkomórkowych aspektów badanie odporności roślin na metale cięŜkie, herbicydy i inne stresy w kulturach kalusowych, protoplastów i zawiesiny komórkowej. Przykłady ograniczonej przydatności kultur in vitro jako modelu dla procesów fizjologicznych

Do procesów, w badaniu których naleŜy ostroŜnie rozwaŜać zastosowanie kultur in vitro naleŜy zaliczyć procesy o charakterze mieszanym komórkowo-systemicznym, niezaleŜnie od tego czy w procesach tych dominują aspekty komórkowe czy ponadkomórkowe. Charakterystycznym przykładem jest odpowiedź na stres, w której współdziałają ze sobą procesy komórkowe i tkankowo/organowe. W tym przypadku kultury in vitro umoŜliwiają badanie i ingerencję w badany proces jedynie na poziomie komórkowych reakcji na stres (zmiana płynności i przepuszczalności membran, aktywacja enzymów antyoksydacyjnych, indukcja szlaku fenolowego. Stwierdzenie zmian wartości tych parametrów w związku z działającym stresem nie upowaŜnia bowiem do uogólnień przenoszących związki pomiędzy wartościami tych parametrów a odpornością na stres komórek takŜe na odporność całych roślin. Parametry takie mogą jednak być swego rodzaju wstępnymi markerami ale wymagają weryfikacji odpowiedzi całych roślin na stres [RAPACZ, DAWID 1999]. Te same uwagi dotyczą badań nad wymianą sygnałów pomiędzy bakteriami brodawkowymi rodzaju Rhizobium lub Bradyrhizobium, a komórką roślinną, jako wstępem do nawiązania symbiozy, która w dalszych etapach jest procesem o charakterze systemicznym. Przykłady procesów, których nie moŜna modelować przy pomocy kultur in vitro

Do procesów tych naleŜy plonowanie, które jest procesem systemicznym zachodzącym w całej roślinie, a w rozwaŜaniach agronomicznych staje się procesem kolektywnym określanym przez związki i wzajemne oddziaływania wielu roślin w łanie. Do tej grupy procesów moŜna teŜ zaliczyć zaawansowany etap symbiozy roślin motylkowych z bakteriami Rhizobium, a więc wymianę metabolitów pomiędzy brodawkami korzeniowymi a systemem korzeniowym rośliny, a takŜe obfitość kwitnienia, plonowanie rośliny i łanu oraz procesy dojrzewania i starzenia organów roślinnych i całych roślin. Podsumowanie

Modele są nieodłącznym elementem pracy badawczej. Uświadomienie sobie przez badaczy, Ŝe moŜliwe jest zastąpienie rzeczywistego obiektu przez jego upro-szczony model, przyspieszyło z pewnością rozwój wielu eksperymentalnych dyscyplin nauki.

W przypadku kultur in vitro zwykle nie ma wątpliwości, Ŝe pełnią one funkcję


101

modelu. Natomiast często jest tak, Ŝe róŜnica pomiędzy rzeczywistym a modelowym obiektem zaciera się powodując, Ŝe badacz interpretuje uzyskane wyniki jako obiektywne, nie uświadamiając sobie, Ŝe na pewnym etapie eksperymentu zastosował działanie modelujące.

Modelowanie jest więc cenną zdobyczą nauk eksperymentalnych pod warunkiem jednak, Ŝe po wykonaniu eksperymentu określi się granice stosowalności uzyskanych wyników. W przeciwnym razie nawet tak oczywiste stwierdzenie zamieszczone w metodyce publikacji „Rośliny do badań zostały starannie wyselekcjonowane” moŜe zostać zinterpretowane inaczej jako „Na odrzuconych roślinach uzyskuje się wyniki zupełnie inne”. Literatura HAMMOND-KOSACK K.E., JONES J. 1996. Resistance gene-dependent plant defense response. Plant Cell 8: 1773-1791.

KACPERSKA A. 2002. Reakcje roślin na abiotyczne czynniki stresowe, w: Fizjologia roś-lin. Praca zbiorowa S. Lewak, J. Kopcewicz (Red.): 613-678.

MAUCH F., MAUCH-MANI B., BOLLER T. 1988. Antifungal hydrolases in pea tissue. II. Inhibition of fungal growth by combinations of chitinase and β-1,3-glucanase. Plant Physiol. 88: 936-942.

MAUCH-MANI B., MÉTRAUX J.P. 1998. Salicylic acid and systemic acquired resistance to pathogen attack. Ann. Bot. 82: 535-540.

RAPACZ M., DAWID HURA K. 1999. An opportunity for Fast and reliable evaluation of winter oilseed rape frost resistance using in vitro cultures. J. Agron. Crop Sci. 182: 193-198. Słowa kluczowe: kalus, protoplasty, stres, poziom subkomórkowy, komórkowy,

mieszany, systemiczny; reakcje odpornościowe; zawiesina komórkowa

Streszczenie

Podjęto próbę określenia, które procesy fizjologiczne mogą być badane przy uŜyciu kultur in vitro jako modelu. Zdefiniowano pojęcie „modelu” oraz określono jaki jego cechy powodują, Ŝe eksperymentatorzy podejmują na nim swoje badania. Przeprowadzono podział procesów ze względu na poziom struktury rośliny w której przebiegają. WyróŜniono poziom subkomórkowy, komórkowy, mieszany (komórkowy i systemiczny), systemiczny oraz poziom populacji lub łanu. Do poziomu subkomórkowego zaliczono procesy przebiegające w organellach komórkowych (w błonach cytoplazmatycznych, jądrze, plastydach) oraz w cytoplazmie. Do poziomu głównie komórkowego zaliczono procesy inicjowane w ramach reakcji odpornościowej pojedynczych komórek na mróz, suszę, jony metali cięŜkich, patogeny czy transport jonów i wody pomiędzy komórkami. Do procesów o charakterze mieszanym, komórkowym i systemicznym zaliczono reakcje na suszę, mróz i patogeny, a takŜe nadwraŜliwość i apoptozę. Do procesów systemicznych zakwalifikowano termo- i fotoindukcję kwitnienia, obfitość kwitnienia, plonowanie i architekturę rośliny, strukturę plonu, spoczynek nasion oraz długość cyklu wegetacyjnego. Wreszcie jako procesy o charakterze populacyjnym wymieniono produktywność łanu czy


102

współczynnik efektywności uŜytkowania wody (WUE). Wymieniono główne „za” i „przeciw” stosowania kultur komórek i tkanek w

warunkach in vitro jako modeli roslin. Do procesów, które moŜna badać w tych warunkach zaliczono porównanie rozwoju zarodka somatycznego i gametycznego, zapłodnienie in vitro dla obejścia barier niekrzyŜowalności, badanie komórkowych aspektów odporności roślin na metale cięŜkie, herbicydy i inne stresy oraz badanie wpływu genomu na cechy fenotypowe organizmów haploidalnych lub podwojonych haploidów. Wśród procesów, których nie moŜna badać in vitro wymieniono plonowanie, symbiozę roślin motylkowych z bakteriami Rhizobium, transport metali cięŜkich poprzez barierę na odcinku korzeń - łodyga, oraz dystrybucję asymilatów i jonów przez granicę łodyga - owoc.

Sformułowano hipotezę o koniecznej zgodności stopnia organizacji danego procesu fizjologicznego i zastosowanego do jego badania modelu. In vitro CULTURE AS A MODEL IN THE STUDIES OF PHYSIOLOGICAL PROCESSES IN PLANTS Franciszek Dubert

1, 2, Agnieszka PłaŜek

1 1 Department of Plant Physiology, Polish Academy of Science, Kraków 2 Department of Plant Physiology, Agricultural University, Kraków Key words: callus, cell suspension, defence responses, protoplasts, stress, sub-

cellular, cellular, mixed, systemic level Summary

An effort was made to estimate, which of plant physiological processes might be studied using in vitro culture as a model. The concept of „model” was defined and it was described which of its properties are deciding what researchers choose that model for their investigations. The classification of processes taking place in plants was done depending on which plant structure level they take place. Subcellular, cellular, mixed systemic and plant population level were distinguished. Processes taking place in cell organella (cell membranes, nucleus, plastids) and in cytoplasm were included into the subcellular level. Processes within defence response of individual cells to various abiotic and biotic stresses (drought, frost, heavy metals, pathogens) as well as water and ion transport between cells were included into the cellular level. Such processes as the reactions to drought, frost, pathogens, and apoptosis and hypersensitive response were defined as belonging to mixed (cellular and systemic) level. Thermo- and photoinduction of flowering, abundance of florescence, yielding, plant architecture, yield structure, seed dormancy and length of plant vegetative cycle were classified as systemic processes. Finally, field crop productivity or water use efficiency (WUE) were included among processes of population character.

The pros and cons related to in vitro culture used as a model were listed. The comparison of development of somatic and gametic embryos, in vitro fertilization allowing to avoid the natural crossing barrier, cellular responses to heavy metals, herbicides and other stresses, influence of genom on phenotype of haploids and double haploids may be studied in vitro conditions. Processes, which should not be investigated in vitro include yielding, symbiosis between Rhizobium or Bradyrhizobium and Papiliaceae plants, heavy metal transport across barrier in root-stem distance and distribution of assimilates and ions between stem and fruits. Finally, the hypothesis about the necessary agreement between organization of physiological processes and the model used to their study was formulated.


103

Prof. dr hab. Franciszek Dubert Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego PAN ul. Niezapominajek 21 30-239 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 105-116 STAN BADAŃ NAD ZAPŁODNIENIEM in vitro GATUNKÓW Z RODZAJU Prunus Ewa Dziedzic, Włodzimierz Lech, Monika Małodobry Katedra Sadownictwa i Pszczelnictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp

Wraz z pojawieniem się technologii in vitro otworzyły się nowe moŜliwości badania procesów fizjologicznych, które w warunkach naturalnych zachodzą głęboko w tkankach roślinnych. Jednym z takich procesów jest zapłodnienie zaląŜków, z których powstają nasiona, dające szanse na rozwój następnego pokolenia. Zapłodnienie in vitro moŜe być alternatywną metodą, mniej inwazyjną, w porównaniu do transformacji tkanek roślinnych, umoŜliwiającą w ogólnym pojęciu uzyskiwanie nowych form roślin. Znajduje zastosowanie przy eliminacji niezgodności gametofitycznej, umoŜliwia wykonywanie krzyŜówek odległych form oraz skrócenie czasu otrzymywania wyników prac hodowlanych, stwarza moŜliwość badań dotyczących kontroli zapłodnienia roślin wyŜszych (mikrokultury zarodka i bielma), jak równieŜ moŜe być wykorzystane do badań związanych z doborem zapylaczy dla odmian gatunków sadowniczych. W tym ostatnim przypadku moŜe odegrać duŜą rolę dla gatunków z waŜnego gospodarczo rodzaju Prunus, dla którego wprowadzane są aktualnie nowe technologie hodowli [MARTINEZ-GÓMEZ i in. 2003].

Jednak przeprowadzenie zapylenia i zapłodnienia zaląŜków gatunków drzew owocowych z rodzaju Prunus jest trudnym zadaniem, ze względu na krótki okres kwitnienia roślin, co stwarza duŜe trudności w prawidłowym określeniu czasu efektywnego zapylenia, warunku niezbędnego do przeprowadzenia zapylenia in vitro. Wymagane są ponadto duŜe zdolności manualne przy izolacji zaląŜka i ziaren pyłku, jak równieŜ znajomość składu i doboru poŜywek odpowiednich dla kiełkowania ziaren pyłku. Potwierdzeniem powyŜej wymienionych trudności badań jest fakt, Ŝe częściej podejmowane są badania na gatunkach krzewów owocowych, które posiadają wiele zaląŜków w zaląŜni [GRAY i in. 1990] niŜ na gatunkach drzew pestkowych. DuŜo trudności sprawiają równieŜ, kultury zapłodnionych zaląŜków i zarodków w początkowych etapach swojego wzrostu, ze względu na heterotroficzny sposób odŜywiania się tych ostatnich w bardzo wczesnych stadiach rozwoju. Mało danych literaturowych potwierdza fakt udanej kultury wczesnych etapów rozwoju zarodka [TRONCOSO i in. 2003], dlatego częściej prowadzi się hodowlę zarodków bardziej zaawansowanych w rozwoju, które są juŜ zdolne do samodzielnego odŜywiania się. Badania tego typu, które prowadzi się na znacznie szerszą skalę, mają szczególne znaczenie w przypadku, gdy nowopowstałe zarodki są odrzucane przez tkanki macierzyste z powodu istniejących niezgodności między nimi. Znajduje równieŜ zastosowanie w przypadku otrzymywania roślin z nasion, których zarodki nie są zdolne do kiełkowania, takŜe przy ominięciu barier post-zygotycznych oraz do uzyskiwania roślin mieszańcowych, w przypadku braku rozwoju bielma. Technika ta, zwana „embryo rescue”, umoŜliwia wyizolowanie zarodków, powstałych po zapyleniu zaląŜków w warunkach naturalnych, oraz ich hodowlę na odpowiednich poŜywkach z

E. Dziedzic, W. Lech, M. Małodobry

106

wykorzystaniem kultur in vitro. Pełny sukces, w postaci prawidłowo rozwiniętych roślin, osiąga się z zarodków izolowanych z tkanek matecznych 60 dni po kwitnieniu, jednak dąŜy się do pobierania zarodków, w jak najkrótszym czasie po kwitnieniu.

W Katedrze Sadownictwa i Pszczelnictwa AR w Krakowie przez szereg lat prowadzono doświadczenia na dwóch gatunkach z rodzaju Prunus, tj. śliwach i czereśniach. Badania te polegały, z jednej strony na zapylaniu zaląŜków w warunkach in vitro i podejmowaniu prób hodowli zapłodnionych zaląŜków, natomiast z drugiej na hodowli w warunkach sztucznych zarodków, izolowanych z kwiatów zapylanych w warunkach naturalnych, w bardzo wczesnych stadiach rozwojowych.

W prezentowanej publikacji przedstawiono część wyników wieloletnich prac, w porównaniu do osiągnięć prezentowanych w literaturze światowej. Materiał i metody

Zapylanie zaląŜków śliw i czereśni przeprowadzano na poŜywkach w warunkach in vitro. Kwiaty przeznaczone do izolacji pyłku pobierano z sadu dwa dni przed kwitnieniem i przechowywano w chłodni. Natomiast zaląŜki izolowano z zaląŜni kwiatów w pełni kwitnienia. Sterylizację materiału roślinnego, tzn. zaląŜni i pylników oraz zapylanie zaląŜków śliw i czereśni przeprowadzano według metodyki opracowanej przez autorów i przedstawionej w kolejnych doniesieniach [LECH i in. 1993; DZIEDZIC i in. 1997, 1999]. Trzy dni po zapylaniu, z zaląŜków zdejmowano osłonki i wydobyte ośrodki wraz z woreczkami zaląŜkowymi (dalej określonymi jako „ośrodki”) przenoszono na poŜywki MURASHIGE i SKOOGA [1962] - MS z dodatkiem 3% sacharozy, zestalone 0,4% agarem poŜywki P1, P2, P3 (tab. 1). W trakcie hodowli prowadzono obserwacje tkanek na poŜywkach, a z części obiektów wykonano preparaty parafinowe. Tabela 1; Table 1 PoŜywki stosowane w doświadczeniach dotyczących zapylania zaląŜków i kultury zarodków Media used for pollination of ovules and culture of embryos

PoŜywka MS

Medium MS

Symbol Symbol

BAP

(mg⋅dm-3)

GA3

(mg⋅dm-3)

IAA

(mg⋅dm-3)

IBA

(mg⋅dm-3)

L-glutamina L-glutamine

Sacharoza Saccharose

ZaląŜki Ovules

P1

0,2

0,1

-

-

-

3%

P2

0,2

-

-

-

-

3%

P3

-

-

-

-

-

3% Zarodki Embryos

P4

1,0

-

-

0,1

-

3%

P5

1,0

-

-

-

-

3%

P6

1,0

-

0,2

-

-

3%

P7

0,5

0,1

0,1

-

-

3%

P8

1,0

0,1

0,1

-

--

3%

P9

-

0,5

1,0

-

400

2%

P10

0,5

0,1

-

-

-

3%

Stosunkowo łatwiejszym zadaniem jest hodowla zarodków zaawansowanych w

rozwoju tzn. takich, które są juŜ zdolne do samodzielnego odŜywiania się. Z zaląŜni kwiatów zapylanych w sadzie pobierano zarodki i wykładano na poŜywki w celu umoŜliwienia ich rozwoju. Zarodki pozostawały początkowo w zaląŜku (pod postacią „niańki”), a potem izolowano zarodki z tkanek zaląŜka. Zarodki kilku odmian śliw, pochodzące z kwiatów po swobodnym zapyleniu w sadzie, pobierano 34, 41, 46 oraz 52

STAN BADAŃ NAD ZAPŁODNIENIEM in vitro ...

107

dni po kwitnieniu umieszczając następnie na poŜywkach: P5, P6, P7, P8 (tab. 1). Wykonywano równieŜ zapylanie odmian czereśni: Kordia × Hedelfińska, Van ×

Hedelfińska oraz Hedelfińska × Van w sadzie. Po upływie 60 dni, od czasu zapylania, z nasion izolowano zarodki i wykładano na poŜywki P1, P2, P3 oraz P4. Po swobodnym zapyleniu czereśni ptasiej w warunkach naturalnych pobrano zaląŜki w dwóch terminach - 8 oraz 15 dni od kwitnienia. Z zaląŜków usunięto integumenty i tylko ośrodki wyłoŜono na poŜywkę P10 (tab. 1). Wyniki i dyskusja

Podstawowym warunkiem umoŜliwiającym przeprowadzenie zapylenia zaląŜków na poŜywkach jest chemotropizm łagiewek pyłkowych. Z powodu braku tkanek szyjki słupka, które w warunkach naturalnych biorą udział w kierowaniu wzrostem łagiewki, udowodnienie występowania chemotropizmu łagiewek pyłkowych w pobliŜu zaląŜków potwierdza moŜliwość skierowania łagiewek do mikropyle zaląŜków, a następnie do woreczka zaląŜkowego. Występowanie chemotropizmu w przypadku śliw zostało udowodnione i potwierdzone obliczeniami statystycznymi, które zamieszczono w publikacjach [DZIEDZIC i in. 1997, 1999; DZIEDZIC 2004].

W trakcie kultury ośrodków na poŜywkach obserwowano zmiany w ich wyglądzie, część ośrodków nie podejmowała rozwoju, tkanki ciemniały i zamierały stopniowo, część powiększała się nadmiernie wykazując przerosty tkanek, tzw. hiperplazję, czemu towarzyszyło kurczenie się woreczka zaląŜkowego, obserwowane na przekrojach parafinowych tych tkanek. Jednocześnie w nielicznych przypadkach, obserwacje woreczka zaląŜkowego wskazały, na obecność pojedynczych wolnych jąder bielmowych od mikropyle do końca chalazalnego, co moŜe świadczyć o zapłodnieniu, jak sugerują to badania RUBIO-CABETAS, SOCIAS [1996].

Natomiast nadmierny rozwój tkanki, od strony mikropyle, powodował pow-stawanie, tzw. kalotki, warstwy bardzo mocno zbitych komórek o grubych ścianach, która uniemoŜliwiała prawidłowe pobieranie składników odŜywczych z poŜywki i w efekcie zamieranie nowopowstałych struktur [DZIEDZIC i in. 2001]. Pozytywne symptomy rozwoju zaląŜków obserwowano w przypadku zaląŜków czereśni odmiany Hedelfińska, zapylanych pyłkiem tej samej odmiany. Po dziewiętnastu dniach od zapylania zaląŜków (szesnastu od usunięcia osłonek zaląŜków) i przeniesienia ośrodków na poŜywkę P1 w jednym spośród 45 sztuk hodowanych ośrodków zaobserwowano zamiany w wyglądzie i rozwoju. Stwierdzono pojawienie się zawiązka korzonka oraz liścieni w kolorze mlecznobiałym. Zygotyczny zarodek wykazywał strukturę polarną, wyraźnie oddzielającą się od pozostałej części ośrodka. W czasie dalszej hodowli na poŜywce nie nastąpiło jednak otwarcie się liścieni i uwolnienie stoŜka wzrostu pędu. Z kalusa, którym pokryły się liścienie, wyrosła jasnozielona, delikatna struktura podobna do pędu, zakończona słabo wykształconym liściem. Struktura ta nie wykazywała oznak rozwoju, nie obserwowano równieŜ zmian nekrotycznych hodowanych tkanek.

Drugim kierunkiem badań były kultury in vitro zapłodnionych zaląŜków oraz zarodków (pobieranych we wczesnych etapach rozwoju).

W przypadku śliw, po swobodnym zapyleniu kwiatów w sadzie, oraz czereśni po krzyŜowym zapyleniu kwiatów zarodki izolowano w róŜnym czasie od kwitnienia i prowadzono ich kulturę na poŜywkach (tab. 2). Jest to zgodne ze spostrzeŜeniami HU i ZANETTINI [1995], według których, wiek izolowanych zarodków decyduje o sukcesie kultury i naleŜy kaŜdorazowo doświadczalnie takie zaleŜności określić. JuŜ po kilku dniach od wyłoŜenia na poŜywki zarodków, na nielicznych kulturach obserwowano zazielenienie i otworzenie się liścieni, dzięki czemu uwalniał się merystem wierz-


108

chołkowy pędu. Równocześnie zaobserwowano wzrost i wydłuŜanie się korzonka zarodkowego. Stosowane poŜywki róŜniły się rodzajem i zawartością substancji wzrostowych. Prawidłowością był fakt, Ŝe im młodsze zarodki były wykładane na poŜywki tym więcej czasu potrzebowały, aby rozwinąć się w prawidłowo ukształto-wane rośliny (tab. 2). Z ogólnej liczby 54 zarodków przeniesionych na trzy poŜywki najwięcej zarodków (12) podjęło wzrost w kombinacji Kordia × Hedelfińska na poŜywce P4 i po 14 dniach z tych zarodków rozwinęły się rośliny. Natomiast młode zarodki śliwy odmiany Węgierka Zwykła izolowane 34 dni po kwitnieniu wymagały znacznie dłuŜszego czasu - 42 dni, aby rozwinęły się rośliny. Tabela 2; Table 2 Liczba dni potrzebnych do rozwoju zarodków śliwy i czereśni w rośliny, po wyłoŜeniu na poŜywkę, w zaleŜności od liczby dni po kwitnieniu (pobieranie zarodków śliw i czereśni) Number of days needed for plum and cherry embryo development, after placing them on the media, depending on a number of days after flowering

Gatunek/ Odmiana Species/cultivar

Liczba dni po kwitnieniu, w

których pobrano zarodki Days after flowering on the embryos when were isolated

PoŜywka dla

kultury Medium

Liczba dni potrzebnych do

rozwoju zarodków w rośliny po wyłoŜeniu na poŜywkę

Number of days needed for full development of embryos

Czereśnia; Cherry Kordia × Hedelfińska

60 dni; 60 days

P3, P1, P4

14 dni; 14 days

Śliwa; Plum Vrogue Toulse

52 dni; 52 days

P9

15 dni;15 days

Śliwa; Plum Węgierka Zwykła

46 dni; 46 days

P8

29 dni; 29 days

Śliwa; Plum Čačak Najbolia

41 dni; 41 days

P7

33 dni; 33 days

Śliwa; Plum Węgierka Zwykła

34 dni; 34 days

P6

42 dni; 42 days

W kolejnych etapach badań skracano czas po kwitnieniu, w którym pobierano

zapłodnione zaląŜki. I tak dla czereśni ptasiej zapłodnione zaląŜki pobrano 8 oraz 15 dni po kwitnieniu, po czym na poŜywki wyłoŜono jedynie ośrodki z woreczkami. W chwili wykładania ośrodków na poŜywkę wyróŜniono trzy klasy wielkości. W tabeli 3 przedstawiono wyniki, jakie uzyskano po 30 dniach kultury ośrodków na poŜywce.

Ośrodki pobierane 8 dni po kwitnieniu rozróŜniono wg trzech grup długości: średnia długość 2,1; 2,9 oraz 3,3 mm. Ośrodki izolowane z zaląŜków pobieranych w pierwszym terminie odznaczały się jedynie większą długością, ale nie stwierdzono w nich zróŜnicowania tkanek. Natomiast ośrodki pobieranie w terminie drugim (o średniej długości 4,3 i 4,5 mm) znacznie powiększyły swoją wielkość i odznaczały się zaawansowaniem w rozwoju. MoŜna było w nich wyróŜnić rozwijające się zarodki, o prawidłowej strukturze. Liścienie - początkowo o mlecznobiałej barwie - wykazywały rozwój, pojawiały się zielonawe struktury przypominające liście, jednak z oznakami zaburzenia fizjologicznego, jakim jest szklistość tkanek. W kolejnych dniach początko-we szybkie tempo rozwoju stopniowo słabło i miesiąc później nie zanotowano spodziewanych kolejnych etapów rozwoju zarodków. Tabela 3; Table 3 Procent oraz długość ośrodków czereśni ptasiej (pobranych 8 oraz 15 dni po kwitnieniu) wykazujących rozwój po 30 dniach kultury na poŜywce


109

Per cent and length of Prunus avium nuceluses showing the development after 30 days of culture (ovules isolated 8 and 15 days after flowering)

Wykładanie na poŜywkę Placing the nucelluses on the media

Ocena po 30 dniach kultury ośrodków na poŜywce Estimation of nuceluses after 30 days of culture

liczba ośrodków

number of nuceluses

średnia długość

ośrodków mean length of nuceluses

(mm)

procent ośrodków

wykazujących rozwój percent of nuceluses

showing development

średnia długość

ośrodków mean length of nuceluses

(mm)

8 dni po kwitnieniu; 8 days after flowering

28

2,1

0

0

27

2,9

18,5

4,5

22

3,3

22,7

4,5

15 dni po kwitnieniu; 15 days after flowering

4

4,3

20,0

5,2

10

4,5

45,0

7,6

Porównując powyŜsze wyniki, jakie uzyskano po izolacji zapłodnionych za-

ląŜków w stosunkowo krótkim czasie po kwitnieniu wydaje się, Ŝe naleŜy je traktować jako pierwsze osiągnięcie na drodze pokonywania trudności w kulturach wczesnych etapów rozwoju zapłodnionych zaląŜków i zarodków drzew owocowych. Potwierdzeniem powyŜszego stwierdzenia niech będzie porównanie dotychczasowych badań w tej dziedzinie prowadzonych na świecie w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat (tab. 4).

W tabeli 3 przedstawiono osiągnięcia uzyskane przez wielu autorów dotyczące prowadzenia badań nad niedojrzałymi zarodkami izolowanymi z zaląŜni od 28 do 60 dni po kwitnieniu.

Zarodki regenerują w wysokim procencie, a następnie przekształcają się w prawidłowo uformowane rośliny, kiedy są pobierane z nasion z niedojrzałych owoców. Takie doświadczenia prowadzone były na brzoskwiniach [PINTO i in. 1993, 1994; RIZZO i in. 1998; SCOZZOLI, PASINI 1992; SRIVASTAV i in. 2004], czereśniach [KUKHARCHYK, KASTRICKAYA 2006].


110

Izolowane w tym terminie zarodki kiełkowały na poŜywkach w trakcie kultury w wysokim procencie (73%) dając prawidłowo zregenerowane rośliny. Szansą rozwoju zarodków powstałych po wykonaniu krzyŜowań oddalonych oraz w obrębie pokolenia F2 mieszańców międzygatunkowych jest izolacja z tkanek macierzystych i hodowla na poŜywkach. Metoda ta stanowi uproszczenie tradycyjnych metod hodowli dzięki mniejszym wymaganiom dotyczącym miejsca i czasu kultury. Na stosunkowo niewielkiej przestrzeni moŜna hodować wiele zarodków, które dają szansę otrzymania obiecujących mieszańców. I tak na przykład spośród 25 000 hodowanych zarodków czereśni ponad 500 adoptowano do warunków ex vitro i wysadzono do sadu [KUKHARCHYK, KASTRICKAYA 2006].

Metoda izolacji zarodków, po krzyŜowym zapyleniu, stosowanym w badaniach hodowlanych stwarza moŜliwość znacznie szybszej oceny otrzymanych siewek, tak jak w przypadku siewek brzoskwini, gdy juŜ w sześć miesięcy po wykiełkowaniu zarodków moŜna było dokonać oceny siewek [ARBELOA i in. 2003].

WaŜny jest termin pobierania niedojrzałych zarodków z nasion, powinien mieć miejsce natychmiast po zbiorze owoców. Przetrzymywanie owoców, nawet trzytygodniowe, jak w przypadku brzoskwini znacznie obniŜyło procent uzyskanych z zarodków roślin i ich Ŝywotność [ANDERSON i in. 2006].

Najkorzystniejszym cukrem, spośród kilku przebadanych w poŜywkach, dla rozwoju młodych zarodków brzoskwini okazały się sacharoza i glukoza, które umoŜliwiły otrzymanie silnych roślin, przydatnych do uprawy w szklarni [SCOZZOLI, PASINI 1992]. W niektórych przypadkach korzystna jest dwu etapowa kultura, najpierw indukowanie wzrostu zarodka wewnątrz zaląŜka, a następnie przenoszenie na nową poŜywkę. Taka procedura została zastosowana dla wczesnych odmian brzoskwini, umoŜliwiając uzyskanie z zarodków izolowanych 46 dni po kwitnieniu, nawet 50% zregenerowanych roślin [ENJI i in. 1992].

Bardzo waŜnym zagadnieniem, w trakcie kultury zarodków w zaląŜku, jest prawidłowe odŜywienie rozwijających się zarodków. W tym przypadku tkanki zaląŜka ograniczają kontakt zarodka z poŜywką, co skutkuje brakiem dopływu substancji odŜywczych oraz brakiem lub nieprawidłowym rozwojem młodych struktur. Dlatego polecana jest metoda perforacji zaląŜków, które następnie są zagłębiane mikropylarnym końcem w poŜywkę. Opracowana i zastosowana dla zarodków brzoskwini metoda umoŜliwiła 2-4-krotnie większy ich wzrost [PINTO i in. 1993, 1994], ponadto dodatek aminokwasu L-glutaminy równieŜ wpłynął korzystnie na wzrost i rozwój zaląŜków. Wnioski 1. Po zapylaniu w warunkach in vitro zaląŜków czereśni odm. Hedelfińska pyłkiem

tej samej odmiany uzyskano rozwój zarodków do stadium liścieni.

2. Zarodki izolowane z niedojrzałych nasion śliw oraz czereśni (od 34 do 60 dni po kwitnieniu) po wyłoŜeniu na poŜywki wykazały prawidłowy rozwój w rośliny.

3. Powodzenie w warunkach in vitro kultury zarodków pobieranych we wczesnych etapach rozwoju w większym stopniu zaleŜy od stopnia zaawansowania w rozwoju niŜ składu zastosowanej poŜywki.

Literatura ANDERSON N., BYRNE D.H., RAMMING D.W. 2006. In ovule culture success as affected by sugar source and fruit storage duration in nectarine. Acta Hort. 713: 89-92.


111

ARBELOA A., DAORDEN M.E., GARCIA E., MARIN J.A. 2003. Successful establishment of in vitro culture of Prunus cerasifera hybrids by embryo culture of immature fruits. Acta Hort. 616: 375-378.

BROOKS H.J., HOUGH L.F. 1958. Vernalization studies with peach embryos. Proc. Am. Soc. Hortic. Sci. 71: 95-102.

CHEÉ R., POOL R.M. 1987. Improved inorganic media constituents for in vitro shoot multiplication of Vitis. Scientia Horticulturae 32: 85-95.

DZIEDZIC E. 2004. Applying of in vitro method at the plum flowering studies. Scientific Works of the Lithuanian Institute of Horticulture and Lithuanian University of Agriculture 23(2): 92-104.

DZIEDZIC E., LECH W., MAŁODOBRY M., JANKUN A. 1997. Studies on fertilization of plum in vitro. Acta Hort. 478: 113-118.

DZIEDZIC E., LECH W., MAŁODOBRY M., JANKUN A. 1999. Badania zapłodnienia śliw w warunkach in vitro. Bibliotheca Fragmenta Agronomia 6: 75-80.

DZIEDZIC E., LECH W., MAŁODOBRY M. 2001. Wczesne stadia embriogenezy po zapyleniu śliw w warunkach in vitro. Biotechnologia 2(53): 54-61.

DRUART PH., GRUSELLE R. 1986. Plum (Prunus domestica), w: Biotechnology in Agri-culture and Forestry. Bajaj Y.P.S. (Ed.) Vol. 1 Trees I. Springer Vg. Berlin: 131-154.

ENJI Z., QIANG Y., YULANG W., DECHUN W. 1992. Studies on in-ovule embryo culture technique of early-maturing and very early maturing peach. Acta Hort. 300: 325-330.

GERCHEVA P., ZHIVONDOV A. 2002. Embryo rescue of early ripening plum cultivars. Acta Hort. 577: 165-168.

GRAY D.J., MORTENSTEN J.A., BENTON C.M., DURHAM R.E., MOORE G.A. 1990. Ovule cul-ture to obtain progeny from hybrid seedless bunch rapes. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 15(6): 1019-1024.

HU C.Y., ZANETTINI M.H.B. 1995. Embryo culture and embryo rescue for wide cross hybrids, w: Plant Cell Tissue and Organ Culture. Gamborg O.L., Philips G.C. (Red), Springer: 129-141.

IVANIČKA J., PRETOVA A. 1986. Cherry (Prunus avium L.), w: Biotechnology in Agri-culture and Forestry, Bajaj Y.P.S. (Ed.), Vol. 1 Trees I. Springer Vg. Berlin: 154-169.

KUKHARCHYK N., KASTRICKAYA M. 2006. Embryo rescue techniques in Prunus L. bree-ding. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research 14 suppl 1: 129-135.

KÜDEN A.B., BÜYÜKALACA S., TANRIVER E., GÜLEN H. 1996. Embryo rescue of peach breds. Eucarpia Symposium, Horticulturae Research International, East Malling: 125.

LECH W., MAŁODOBRY M., LECH M., NOWAK B. 1993. In vitro fertilization of plum. Acta Hort. 359: 269-276.

LLOYD G., MCCOWN B. 1980. Commerially-feasible micropropagation of mountain laurel Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Proc. Int. Plant. Prop. Soc. 30: 421-427.

MARTINEZ-GÓMEZ P, SOZZI G.O., SÁNCHEZ-PÉREZ R., RUBIO M., GRADZIEL T.M. 2003. New approaches to Prunus tree crop breeding. Food, Agriculture & Environmental 1(1): 52-63.

MONNIER M. 1976. Culture in vitro de l’embryon immature de Capsella bursa-pastoris. Moench. Rev.Cytol. Biol. Vég. 39: 1-120.


PINTO A.C., BYRNE D.H., ROGERS S.M.D. 1993. Influence of ovule perforation, plant


112

growth regulators and L-glutamine on in vitro growth of immature peach embryos. In Vitro Cell Dev. Biol. 29: 55-58.

PINTO A.C., ROGERS S.M.D., BYRNE D.H. 1994. Growth of immature peach embryos in response to media, ovule support method and ovule perforation. HortScience 29(9): 1081-1083.

RIZZO M., BASSI D., BYRNE D., PORTER K. 1998. Growth of immature peach [Prunus persica (L.) Batsch.] embryos on different media Acta Hort. 465: 141-147.

RUBIO-CABETAS M.J., SOCIAS R. 1996. Fertilization assessment and postzygotic develop-ment in several ontra- and interspecific Prunus hybrids. Euphytica 90: 325-330.

SCHMIDT H., KETZEL A. 1993. Regeneration of adventitious shoots in vitro cherries IV. Adventitious shoot regeneration of cotyledons and embryo rescue as tools in cherry breeding. Gartenbauwissenschaft 58(2): 64-67.

SCOZZOLI A., PASINI D. 1992. Effects of different media constituents on the development of peach embryos cultured in vitro. Acta Hort 300: 265-268.

SRIVASTAV M., SINGH S.K., ARORA R.L., KRISZNA B. 2004. Embryo culture studies in sub-tropical peach (Prunus persica Batsch.). Acta Hort 662: 297 -301.

STEWART J.M., HSU C.L. 1977. In ovule embryo culture and seedling development of cotton (Gossypium hirsutum L). Planta 137: 113-117.

TRONCOSO A., CANTOS M., LINAN J., TRONCOSO J., RAPOPORT F. 2003. In vitro development and germination of immature olive embryos. J. Hort. Sci. and Biotech. 78(5): 728-733. WHITE P.R. 1943. A handbook of plant tissue. Cattel. Lancaster. Słowa kluczowe: zapłodnienie in vitro, Prunus, kultury zaląŜków, zarodek Streszczenie

Stosowane metody biotechnologiczne, polegające na transformacji tkanek roślinnych wzbudzają często liczne kontrowersje, dlatego poszukuje się obecnie alternatywnych, mniej inwazyjnych, sposobów prowadzenia badań z roślinami. Jedną z waŜnych metod, która stwarza potencjalnie duŜe moŜliwości naukowych zastosowań, jest zapłodnienie in vitro. Badania dotyczące tego zagadnienia są prowadzone głównie na roślinach takich jak tytoń, czy kukurydza. Natomiast niewiele jest doniesień dotyczących doświadczeń wykonywanych na roślinach drzewiastych. W omawianej prezentacji podjęto próbę przedstawienia obecnego stanu wiedzy na temat zapłodnienia in vitro gatunków z rodzaju Prunus. Badania dotyczące poznania tego zagadnienia prowadzone są dwutorowo. Z jednej strony opracowywane są metody doprowadzające do zapłodnienia zaląŜków na poŜywkach, na których umieszczane są zarówno zaląŜki jak i ziarna pyłku, a takŜe podejmowane są próby uzyskania pierwszych podziałów zygoty i prazarodka. Z drugiej strony pobierane są niedojrzałe zarodki powstające po zapyleniu i zapłodnieniu w warunkach naturalnych, które są następnie prowadzone w kulturach sterylnych w celu uzyskania z nich prawidłowo rozwiniętych roślin. Zarodki pobierane są w róŜnych etapach rozwoju, od kilku do 60 dni po kwitnieniu. Przedstawiono dotychczasowe osiągnięcia w badaniach, z uwzględnieniem stoso-wanych poŜywek, warunków kultury i etapów rozwoju, jaki osiągnięto dla posz-czególnych gatunków z rodzaju Prunus.


113

CURRENT INVESTIGATIONS ON FERTILIZATION in vitro OF Prunus SPECIES Ewa Dziedzic, Włodzimierz Lech, Monika Małodobry Department of Pomology and Apiculture, Agricultural University, Kraków Key words: in vitro fertilization, Prunus, ovule culture, embryo Summary

Biotechnology methods relying on transformation works cause much controversy, therefore presently less invasive methods concerning the studies on plants are investigated. One of the important method which make possible the practical applications is the fertilization in vitro. There are a few reports presenting the investigations performed on the fruit trees. In this paper the current achievement concerning fertilization in vitro of Prunus species is presented. The studies covering that problem are conducted in two ways. On one hand, the methods of ovule fertilization on the media and obtaining the first zygote and proembryo divisions are elaborated. On the other hand the immature embryos are isolated after pollination of flowers in natural conditions and cultivated on the artificial media up to the stage of correctly developed plants. The embryos are taken at different times after flowering, from several days up to 60 days. The current status of the investigation regarding the of media used, culture con-ditions and stage of embryo development achieved for Prunus species are presented. Dr inŜ. Ewa Dziedzic Katedra Sadownictwa i Pszczelnictwa Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja Al. 29 Listopada 54 31-425 KRAKÓW e-mail: [email protected]

Tab

ela

4; T

able

4

K

ultu

ry z

arod

ków

kilku

gat

unkó

w z

rod

zaju

Prunus iz

olow

anyc

h w

róŜ

nych

term

inac

h po

kw

itni

eniu

Cul

ture

of so

me Prunus sp

ecie

s em

bryo

isol

ated

at d

iffe

rent

tim

es a

fter

flo

wer

ing

G

atun

ek/

odm

iana

Spe

cies

/ cu

ltiva

r

Iz

olac

ja z

arod

ków

(d

ni p

o kw

itni

eniu

)

Em

bryo

isol

atio

n

(day

s af

ter flow

erin

g)

PoŜ

ywka

M

ediu

m

W

arun

ki k

ultu

ry

Cul

ture

con

dition

s

O

siąg

nięc

ie A

chie

ve-

men

t

A

utor

zy (ro

k)

Aut

hors

(ye

ar)

Śliw

a; P

lum

Rut

h

Ger

stet

ter

60

dni

; 60

days

poŜy

wka

; med

ium

B

RO

OK

S, H

OU

GH [19

58]

ch

łodz

enie

2°C - 3

-5 m

ies,

kieł

kow

anie

zar

odkó

w, c

ie-

mno

ść 1

6°C, w

ysad

zani

e do

sz

klar

ni; c

ooling

2°C - 3

-5

mon

ths, e

mbr

yo g

erm

inat

ion,

da

rkne

ss 1

6°C, p

lant

ing

in th

e gr

eenh

ouse

pr

awid

łow

y ro

zwój

ro

ślin

pro

per de

velo

p-m

ent o

f pl

ants

D

RU

ART,

GRU

SELLE

[198

6]

Śliw

a; P

lum

Bur

mos

a

60

dni

; 60

days

MU

RA

SHIG

E, S

KO

OG [19

62]

ch

łodz

enie

4°C, k

ultu

ra 1

6/8

godz

. 24°

C; c

ooling

4°C, c

ultu

re

16/8

h 2

4°C

kieł

kow

anie

zar

odkó

w

100%

; ger

min

atio

n of

em

bryo

s -1

00%

G

ER

CH

EV

A,

ZH

IVO

ND

OV

[200

2]

Brz

oskw

inia

Pea

ch

Spr

ingc

rest

Ear

ligr

ande

50

, 60,

70

dni p

o za

pyle

niu,

ni

edoj

rzał

e za

rodk

i 4,0

-8,7

mm

; 50

, 60,

70

days

after

pol

lina

tion

, im

mat

ure

embr

yos 4.

0-8.

7 m

m

MO

NIE

R [19

76] M

URA

SH

IGE, S

KO

OG

[196

2] S

TEW

ART, H

SU [19

77] 6-

10%

sa

char

ozy;

6-1

0% sac

char

ose

25°C - 4

0 dn

i cie

mno

ść, p

er-

fora

cja

zalą

Ŝków

; 25°

C -

hoda

ys, d

arkn

ess, p

erfo

ration

of

ovul

es

kilk

akro

tnie

leps

zy roz

-w

ój z

arod

ków

per

-fo

row

anyc

h; sev

eral

tim

es b

ette

r de

velo

p-m

ent o

f pe

rfor

ated

em

bryo

s

P

INTO i

in.

[199

3, 1

994]

Brz

oskw

inia

(n

ekta

ryna

) Pea

ch

60

dni

nie

dojrza

łe z

arod

ki

8,6-

14,3

mm

; 60

days

, im

mat

ure

embr

yos 8.

6-14

.3 m

m

po

Ŝyw

ka; m

ediu

m

MCC

OW

N, L

LO

YD

S [1

981]

3%

sac

haro

za; 3

% sac

char

ose

stra

tyfika

cja

-4,4°C p

rzez

60

dni,

pote

m k

ultu

ra 2

5°C, 1

2/12

go

dz.;

stra

tifica

tion

-4.

4°C for

60

day

s, th

en c

ultu

re 2

5°C,

12/1

2 h

pr

awid

łow

y ro

zwój

ro

ślin

; pro

per de

vel-

opm

ent o

f pl

ants

R

IZZO

i in

. [1

998]

Brz

oskw

inia

Pea

ch

60

dni

zar

odki

0-1

5 m

m z

na-

sion

; 60

days

, em

bryo

, 0-1

5 m

m

from

see

ds

po

Ŝyw

ka; m

ediu

m

STEW

ART, H

SU [19

77], 0

,03

mg⋅

dm-3

GA

3,

róŜn

e cu

kry;

var

ious

sug

ars

stra

tyfika

cja

2°C - 2

mie

s.,

kultu

ra 2

0-25°C, 1

6/8

godz

.; stra

tifica

tion

2°C for

2 m

onth

s,

cultu

re 2

0-25°C, 1

6/18

h

praw

idło

wo

rozw

inię

te

rośl

iny;

pro

perly

de-

velo

pmen

t pla

nts

S

CO

ZZO

LI,

P

ASSIN

I [19

92]

cd. t

abel

i 4; c

ont.

Tab

le 4

Brz

oskw

inia

Pea

ch

60

dni

; 60

days

MU

RA

SHIG

E, S

KO

OG [19

62],

sach

aroz

a 4%

; 4%

sac

char

ose,

2,

0 m

g⋅dm

-3 B

A,

0,5

mg⋅

dm-3

IAA

, L-g

luta

min

a 20

0 m

g⋅dm

-3;

L-g

luta

min

e 20

0 m

g⋅dm

-3, h

ydro

liza

t ka

zein

y 20

0 m

g⋅dm

-3; c

asei

n hy

dro-

lysa

te 2

00 m

g⋅dm

-3

ciem

ność

do

stab

iliz

acji, k

ultu

ra

12/1

2 go

dz.;

dark

ness

for

stab

iliz

atio

n,

cultu

re 1

2/24

h

kieł

kow

anie

zar

odkó

w;

germ

inat

ion

of e

mbr

yos

SRIV

ASTO

V i

in.

[200

4]

Prunus

cerasifera ×

armeniaca

63

dni

; 63

days

poŜy

wka

; med

ium

C

HEÉ, P

OO

L [19

87]

stra

tyfika

cja

4°C, k

ultu

ra 1

6/8

godz

. - 2

4°C; s

trat

ific

atio

n 4°

C,

cultu

re 1

6/8

h - 24°C

kieł

kow

anie

zar

odkó

w

73%

, uzy

skan

o pr

awid

-ło

wo

rozw

inię

te roś

liny;

ge

rmin

atio

n of

em

bryo

s 73

%, p

rope

rly

deve

lope

d pl

ants o

b-ta

ined

ARB

ELO

A i

in.

[200

3]

Cze

reśn

ia

mie

dzy

gatu

nkow

e m

iesz

ańce

z

rodz

Prunus

Che

rry

hybr

ids

from

Prumus

fam

ily

60

dni

; 60

days

MCC

OW

N, L

LO

YD

S [1

981]

, M

UR

ASH

IGE, S

KO

OG [19

62],

2-3%

sac

haro

za; 2

-3%

sac

char

ose,

0,

5-5,

0 m

g⋅dm

-3 G

A3,

0,3-

0,9

mg⋅

dm-3

BA

, 0,

1-4,

0 m

g⋅dm

-3 IB

A,

0,01

-0,0

2 m

g⋅dm

-3 kw

as fer

ulow

y;

feru

lic

acid

stra

tyfika

cja

60-6

5 dn

i, 3-

5°C,

pote

m 2

4°C

; strat

ific

atio

n 60

-65

days

, 3-5°C

then

- 2

4°C

zr

egen

erow

anyc

h pr

awid

łow

o 50

0 ro

ślin

z

25 0

00 z

arod

ków

; pr

oper

ly reg

ener

ated

50

0 pl

ants, o

ut o

f 25

000

embr

yos

KU

KH

ARCH

YK,

KA

STR

ICK

AY

A

[200

6]

Brz

oskw

inia

Pea

ch

46

dni

; 46

days

STEW

ART, H

SU [19

77],

4% sac

haro

za; 4

% sac

char

ose,

1,

0 m

g⋅dm

-3 B

A,

1,0

mg⋅

dm-3

IBA

zaro

dki w

zal

ąŜku

, pot

em k

ul-

tury

nie

dojrza

łych

za

rodk

ów;

embr

yos in

the

ovul

e, th

en

cultu

res of

imm

atur

e em

bryo

s

zreg

ener

owan

ie roś

lin

z 75

% z

arod

ków

; re-

gene

ration

of pl

ants o

ut

of 7

5% e

mbr

yos

EN

JI i

in. [

1992

]

Cze

reśn

ia

Che

rry

K

ares

ova

30

-40

dni; 3

0-40

day

s

MU

RA

SHIG

E, S

KO

OG [19

62]

2% sac

haro

za; 2

% sac

char

ose,

0,

5 m

g⋅dm

-3 G

A3

stra

tyfika

cja

40 d

ni - 2°C

stra

tifica

tion

40

days

- 2°C

kieł

kow

anie

zar

odkó

w

80%

; ger

min

atio

n of

em

bryo

s 80

%

IV

AN

IČK

A,

PRETO

VA

[198

6]

cd. t

abel

i 4; c

ont.

Tab

le 4

Cze

reśn

ia

Che

rry

30

-40

dni; 3

0-40

day

s

MU

RA

SHIG

E, S

KO

OG [19

62]

bez

subs

tanc

ji w

zros

tow

ych

aŜ d

o ch

wili g

dy li

ście

nie

biał

e, p

otem

w

arun

ki k

ultu

ry, 2

4°C, 1

6/8

godz

.; co

nditio

ns o

f th

e cu

ltur

e,

24°C, 1

6/8

h

zreg

ener

owan

e pę

dy z

15

-21%

zar

odkó

w; r

e-ge

nera

ted

shoo

ts fro

m

S

CH

MID

T,

KETZEL [19

93]

do

date

k 2,

0 m

g⋅dm

-3 B

A,

1,0

mg⋅

dm-3

IAA

; with

out g

row

th

subs

tanc

es u

ntil

the

tim

e of

whi

te

coty

ledo

n 2.

0 m

g⋅dm

-3 B

A, t

hen

the

addi

tion

of 1.

0 m

g⋅dm

-3 IA

A

15-2

1% e

mbr

yos

Brz

oskw

inia

Pea

ch

Spr

ingt

ime ×

Fla

vorc

rest

30

dni

; 20

days

MU

RA

SHIG

E, S

KO

OG [19

62]

1,0

mg⋅

dm-3

NA

A,

2,0

mg⋅

dm-3

IBA

kieł

kow

anie

zar

odkó

w;

germ

inat

ion

of e

mbr

yos

K

ÜD

EN i

in.

[199

6]

Cze

reśn

ia

wcz

esne

od

mia

ny

Che

rry

early

culti

vars

28

dni

; 28

days

WH

ITE [19

49],

MU

RA

SHIG

E, S

KO

OG [19

62]

hydr

oliz

at k

azei

ny, e

kstrak

t dr

oŜdŜ

owy;

cas

ein

hydr

olys

ate,

yea

sts

extrac

t, 2,

0 m

g⋅dm

-3 G

A3

0,1

mg⋅

dm-3

kin

etyn

a; k

inet

in

w

arun

ki k

ultu

ry, 8

-10°

C

cond

itio

ns o

f th

e cu

lture

, 8-1

0°C

dz

iesi

ęcio

krot

ne p

o-w

ięks

zeni

e za

rodk

ów w

stad

ium

ser

cow

atym

; te

n fo

ld e

nlar

gem

ent o

f em

bryo

s at

the

hear

t stag

e

I V

AN

IČK

A,

PRETO

VA

[198

6]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2006 z. 523: 117-126 IMPACT OF AUXIN ANALOGUES ON in vitro XYLEM FORMATION IN SWEET COMMON PRUNE CALLUS TISSUE Ewa Hanus-Fajerska Botany Department, Faculty of Horticulture, Agricultural University, Kraków Introduction

A plant body is composed of several types of specialized cells which have a constitutional developmental program. However, plant cells possess a unique transdifferentiation mechanism by which they can initiate a new program of differentiation [RAVEN et al. 1999; DEMURA et al. 2002]. The culture medium and appropriate external milieu together with the suitable cell or tissue type, became the guarantor of possible perpetual cultivation of cells and tissues in vitro. Even mature somatic cells may be induced to dediferentiate, go through a series of mitoses and eventually redifferentiate to form organs or somatic embryos de novo. They may also be maintained in the least differentiated of all the mature cell types of the plant, that is in the form of callus. The two classes of plant growth regulators - auxins and cytokinins are mostly required in culture media, as considered to be among the highest importantance factors used for regulating the growth and development in the tissue culture. In genus Prunus, like in many others, the manipulation of plant growth regulator level and balance is a suitable strategy for either studying pattern of cell division and development or cell competence for regeneration [BHANSALI et al. 1991; ESCALETTES, DOSBA 1993].

Sweet Common Prune is a Prunus domestica cultivar of very significant eco-nomic importance, especially in Europe. Previous reports have desribed results of experiments performed in our laboratory to improve the cultivation protocols of stock and callus cultures, where appropriate procedures have been worked out [NOWAK, MICZYŃSKI 1996, 2002; HANUS-FAJERSKA, NOWAK 2001]. We also tried to asses the influence of exogenous application of chosen auxin or its analogues and cytokinin or its analogues on cultures derived from the same mother plant [NOWAK 1999; HANUS-FAJERSKA 2006]. The conclusion was reached, that the experiment is worth to be repeated once more with two media types, that is for friable callus tissue (FT), and nodular tissue (NT) used as the growth control. The objective was a verification of the assumption if working with a broadened system of this kind, a certain shift in differentiation pattern in prune tissues cultured on a medium containing single auxin or combinated auxins treatment could be confirmed. The approached problem deals with the role of auxins in the initiation of tracheary element formation in cultured callus tissues [ALONI 1980], up till now not documented for temperate fruit trees. It seems to be interesting, as the process of xylem differentiation is not yet fully understood [KUBO et al. 2005]. The clarification of the subsequent xylogenesis stages is important to the understanding of genetic control of wood formation in trees [CHAFFEY et al. 2002; DEMURA et al. 2002].

E. Hanus-Fajerska

118

Materials and methods

The clone used was derived from Prunus domestica Węgierka Zwykła cv. two years old and virus free mother plant. Shoot culture was performed for about seven months on Murashige-Skoog medium supplemented with 0.1 mg⋅dm-3 IBA and 0.25 mg⋅dm-3 BA and solidified with 0,8% w/v Difco Agar. The medium pH was adjusted to 5.6. The designed experimental system focused on inducing callus tissue from leaf explants, and further maintaning of proliferative tissue lines in order to carry out morphological and histological observations of such cell populations against time. The callus induction medium was MS modified according to NOWAK and MICZYŃSKI [1996], adjusted to pH 5.5 before autoclaving, and supplemented with different plant growth regulators (PGR) as indicated in Table 1. Table 1; Tabela 1 Plant growth regulator regime used in experimental design to induce and to maintain P. domestica odm. Węgierka Zwykła callus tissue initiated from explanted leave tissue StęŜenia regulatorów wzrostu stosowane w trakcie indukcji kalusa na eksplantatach liściowych oraz proliferacji tkanki kalusowej P. domestica Węgierka Zwykła cv.

Control Kontrola

Induction/maintenance Indukcja/proliferacja

Auxin/cytokinin dose Auksyny/cytokininy

(mg⋅dm-3)

Auxin : cytokinin ratio; Stosunek aksyn : cytokinin

3.1/6D9-NT*

2,4-D/BA

2.0/0.1

20 : 1

2,4-D/BA

1.0/0.1

10 : 1

4.1/9D8-FT**

dicamba/BA

1.5/0.225

6.6 : 1

dicamba/BA

1.5/0.225

6.6 : 1

Xylogenic media

PoŜywki ksylogeniczne

Induction/maintenance Indukcja/proliferacja

Auxin dose (mg⋅dm-3)

Dawka auksyny (mg⋅dm-3)

Auxin : auxin ratio

Stosunek auksyna : auksyna

1.1/4D11

picloram

0.2

-

picloram

0.2

-

2.1/3D10

2,4-D + IBA

1.1 + 0.1

11 : 1

picloram

0.2

-

2.1/5D12

2,4-D + IBA

1.1 + 0.1

11 : 1

2,4-D + IBA

1.1 + 0.1

11 : 1 *NT nodular tissue; tkanka ziarnista **FT fiable tissue; luźna tkanka After three weeks of induction, in order to maintain callus lines, tissue pieces showing callus proliferation were twice transferred biweekly to the medium freshly prepared with the same (treatment 1.1/4D11 and 2.1/5D12) or not the same (treatment 2.1/3D10) PGR handling, with the level of sucrose kept constant, that is 30 g⋅dm-3. Erlenmeyer flasks containing 25 cm3 of culture medium, with 5 explants, were kept in continuous darkness at 24°C. 50 explants were induced in each treatment, and the experimental block was conducted three times. Cultures were evaluated every week for callus growth, texture and histology and representative samples were collected for fresh weight determination. For histological examination segments of tissue were fixed in a solution of 2% (w/v) glutaraldehyde during at least a weeek before embedding. The tissue was dehydrated by passage through ethanol series and embedded in Epon 812 The material

IMPACT OF AUXIN ANALOGUES ON in vitro ...

119

was cut at 1 µm with a Tesla 490A microtome, the sections mounted on glass slides, and the tissue was stained with toluidine blue. The sections were observed and docu-mented under a light microscope. Results

The leaf explants tissue developed callus. Heterotrophic cultures, such as those obtained, can adjust their metabolism only from the consumption of sacharides from the medium. During the course of experiment the level of sucrose was kept constant in freshly prepared media. The tissues used as control, for comparison of the type and growth rate in the performed system, were grown on media supplemented with auxin analogues (2,4-D; dicamba) combinated with BA. The control tissues were of two types, either white-yellowish smooth, rounded solid mass of the nodular higly proliferative strain (NT-treatment 6D9: 2.0-1.0 mg⋅dm-3 2,4-D and 0.1 mg⋅dm-3 BA) or loose masses of friable strain, which readily broke apart when handled (FT-treatment 9D8: 1.5 mg⋅dm-3 dicamba and 0.225 mg⋅dm-3 BA). Tissue pieces maintained a golden yellow coloration and could be seen under the microscope to manifest abundant proliferation of cells in the periferic zone. Such cells did not differentiate to any marked extent. The only degree of organisation retained at the tissue level was that, the cells produced at succesive cytokinesis exhibited a tendency to form quickly growing clusters.

It was apparent quite early in the culture that in 3D10 treatment, with the initiation on medium supplemented with 1.1 mg⋅dm-3 2,4-D combined with a low dose of indole-3-butyric acid (0.1 mg⋅dm-3 IBA) and further maintenance of callus tissue on medium with 0.2 mg⋅dm-3 picloram, the growth rate of tissue and its friability were comparable to the highly proliferative control friable tissue type (FT). Neither of conditions with a single auxin or combinated auxins was particulary favourable to initiate proliferation of cultured tissues in comparison with the control proliferative media of both types, that is either friable or nodular. However, the above mentioned 3D10 treatment was clearly the best variant in terms of the growth rate verification on xylogenic media. It would appear that more cell generations were passed through tissue inducted on 2,4-D with IBA medium and maintained on picloram (treatment 3D10) than on media with unique addition of picloram (4D11) or media supplemented with 2,4-D and IBA during the initiation and maintenance phases (5D12).

In an attempt to discern anatomical differences between cultivated tissue lines histological preparations were made. In sections of the 3D10 callus unorganized arrangement of cells was evident.

E. Hanus-Fajerska

120

Photo 1A. Transverse section through fragment of P. domestica callus tissue cultured for 35

days on modified MS with addition of picloram in the same dose of 0.2 mg⋅dm-3 during induction and maintenance periods

Fot. 1A. Przekrój poprzeczny kalusa kultywowanego 35 dni na zmodyfikowanej poŜywce MS

z dddatkiem 0,2 mg⋅dm-3 pikloramu zarówno w fazie indukcji, jak i proliferacji tkanki

Photo 1B. Representative histological section of calus cultured on xylogenic medium with 1.1

mg⋅dm-3 2,4-D and 0.1 mg⋅dm-3 BA, where strand-like arrangement of traheary ele-ments (TEs) can clearly be seen

Fot. 1B. Charakterystyczny obraz kalusa z pasmami elementów trachealnych, uzyskanego w

na poŜywce ksylogenicznej z dodatkiem 1,1 mg⋅dm-3 2,4-D i 0,1 mg⋅dm-3 BA The tissue inceased in size by continued unoriented cell divisions with irregular cellular enlargement afterwards. Signs of xylogenic activity was visible in 11% of the examined samples, from after about three weeks of culture, so on the maintenance medium with a low dose of picloram (0.2 mg⋅dm-3 ), after induction with 1.1 mg⋅dm-3 2,4-D and 0.1 mg⋅dm-3 IBA. In treatment 4D11 tissue exhibited unorganized growth, but in about 37% of samples the scattered areas of tracheary elements (TEs) with spiral secondary cell wall thickening were observed. Such areas were randomly oriented. In that particular case, the shift in proliferative pattern of callus tissue was clear, which is demonstrated in Figure 1A.

The medium with a combination of 2,4-D and IBA (1.1 + 0.1 mg⋅dm-3) was especially proved to be xylogenic (Fig. 1B). During the induction and maintenance on equal level and kind of auxin analogues, proliferation occurred in localized areas so that


121

nodular tissue fragments were formed. The tissue was compact with extensive rows of xylem cell lineages. The combination of compounds with auxin activity in ratio 11 : 1 reorganized the differentiation pattern in prune callus. Tracherary elements were differentiated in observed all phases of the callus growth. Discussion

Cell division is not a prerequisite for the initiation of xylem differentiation, as the mechanically isolated mesophyll cells can directly differentiate into tracheary elements, which was convincingly proved by KOLENBACH and SCHMIDT [1975] with cells of Zinnia elegans, and afterwards confirmed by FUKUDA and KOMAMINE [1980]. This system, serving as a model for cytodifferentiation in higher plants, has even become a tool for studying subcellular mechanisms in xylem formation [FUKUDA, HIROO 1994; MCCANN

1997; MILONI et al. 2002; DAHIA 2003; YOSHIDA et al. 2005]. On the other hand auxin and sucrose were shown to be import in the initiation of xylem differentiation. It was in 1967 that JEFFS and NORTHCOTE showed that sucrose does not simply provide an energy source for differentiating cells, but also play a role in the initiation of differentiation process. Auxin was proved to be a limiting factor in wound xylem differentiation, primary vascular differentiation, secondary xylem differentiation and in tracheary element formation of in vitro cultured cells and tissues [FOSKET, TORREY 1969; NORTHCOTE 1995].

The differentiaton of tracheary elements was studied in callus culture of many herbaceous and woody dicotyledonous species, but so far not in the genus Prunus [BESLOW, RIER 1969; MINOCHA, HALPERIN 1974; ALONI 1980; PISSARA et al. 1990; KUTERNOZIŃSKA et al. 1991], so the above mentioned results are part and parcel of auxin signal flow canalization hypothesis [SACHS 1969, 1991]. Above demonstrated experiments were at first designed to determine the hormonal requirement necessary to maintain an adequate growth rate of the appropriate fenotype of callus tissue, because especially in woody plant cultivars and even clones of the same cultivar vary in response to in vitro culture [JONES 1991]. The friability of initiated parynchymatous callus was rather high in experimental treatments with different hormonal sequence and balance, which in turn confirmed the results obtained with Hevea brasiliensis clones [MONTORO et al. 1993].

After the induction of differentiation of tracheary elements on the media with auxin analogues, they were continuously differentiated in all further phases of callus growth. Cultivating sweet common prune callus on the maintenance medium with a low dose of potent auxin-like substance, that is picloram which is rapidly utilized by growing cells [HAGEN et al. 1991], it was possible to obtain cell populations essentially free of tracheary elements. However, when such a dose was applied in both induction and maintenance media, it proved to be suboptimal. In those cell populations about 18% of cells differentiated in the nest-like arranged tracheary elements. The appearance of tissue produced on the medium containing 2,4-D but lacking cytokinin was not basically different from the tissue on the control 2,4-D medium combinated with BA. A clear shift in the differentiation pattern was visible in the medium with combinated 2,4-D and IBA, the first in a high and next in a low dose (1.1 + 0.1 mg⋅dm-3), with the growth rate only slightly different in comparison to other auxin treatments. So even in the absence of exogenous cytokinin, 2,4-D was found to promote both cell multiplication and differentiation, like in the case of Glycine max cv. Biloxi [FOSKET, TORREY 1969]. It is also consistent with the findings of ALONI [1980] and MINOCHA and HALPERIN [1974], that auxin controls quantiatively the differentiation of xylem elements in cultured calli. The

E. Hanus-Fajerska

122

nature of the proliferating tissues in a studied clone obviously depended on chemical and physical factors employed under tissue culture conditions. Well known is the fact, that the level and ratio of plant growth regulators are more important factors than the individual role of each, and their metabolism rather than content per se determine the proliferative potential of isolated colonies of cells and their further differentiation. Conclusions 1. Auxin combinated with cytokinin was more effective in either establishing the

Prunus domestica callus in vitro or its further maintaining, than treatments with single or with combinated auxins added to Murashige-Skoog medium.

2. Callus lines grown on media supplemented with different auxins may be similar in apparence, but histologically different.

3. Dichlorophenoxyacetic acid added to the medium with constant sucrose level can stimulate tracheary element formation in P. domestica callus.

4. Modified Murashige-Skoog medium with the addition of 1.1 mg⋅dm-3 2,4-D and 0.1 mg⋅dm-3 IBA was proved to be xylogenic.

References ALONI R. 1980. Role of auxin and sucrose in the differentiation of sieve and tracheary elements in plant tissue cultures. Planta 150: 255-263.

BESLOW DT., RIER K. 1969. Sucrose concentration and xylem regeneration in Coleus internodes in vitro. Plant Cell Physiol. 10: 69-77.

BHANSALI R.R., DIVERT J.A., DURZAN D.J. 1991. Adventitious embryogenesis and plant regeneration from rescued embryos of peach, Prunus persica (L.). Ind. Jour. Exp. Biol. 29: 334-337.

CHAFFEY N., CHOLEWA E., REGAN S., SUNDBERG B. 2002. Secondary xylem development in Arabidopsis: a model for wood formation. Physiol. Plant. 114: 594-600.

DAHIA P. 2003. Role of death in providing lifeline in plants. Trends in Plant Sciences 8/10: 462-465.

DEMURA T., TASHIRO G., HORIGUCHI G., KISHIMOTO N., KUBO M., MATSUOKA N., MINAMI A., NAGATA-HIWATASHI M., NAKAMURA K., OKAMURA Y., SASSA N., SUZUKI S., YAZAKI J., KIKUCHI FUKUDA H. 2002. Visualisation of comprehensive microarray analysis of gene expression programs during transdifferentiation of mesophyll cells into xylem cells. PNSA 99/24: 15794-15799.

ESCALETTES V., DOSBA F. 1993. In vitro adventitious shoot regeneration from leaves of Prunus spp. Plant Science 90: 201-209.

FOSKET DE., TORREY JG. 1969. Hormonal control of cell proliferation and xylem differentiation in cultured tissues of Glycine max var. Biloxi. Plant Physiol. 44: 871-880.

FUKUDA H., HIROO K. 1994. Redifferentiation of single mesophyll cells into tracheary elements. Int Journ. Plant Scie. 155(3): 262-272.

FUKUDA H., KOMAMINE A. 1980. Establishment of an experimental system for the study of tracheary element differentiation from single cells isolated from the mesophyll of Zinnia


123

elegans. Plant Physiol. 65: 57-60.

HAGEN SR., MUNETA P., AUGUSTIN J., LE TOURNEAU D. 1991. Stability and utilization of picloram, vitamins and sucrose in a tissue culture medium. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 25: 45-48.

HANUS-FAJERSKA E. 2006. Improvement of growth parameters of prune callus cultures destined to initiate cell suspensions. Acta Soc. Bot. Pol. 75/1: 5-9.

HANUS-FAJERSKA E., NOWAK B. 2001. The initiation, growth rate and characteristics of Prunus domestica L. ‘Węgierka Zwykła’ callus cultures. Folia Hort. 13/1A: 481-486.

JEFFS RA., NORTHCOTE DH. 1967. The influence of indol-3-acetic acid and sugar on the pattern of induced differentiation in plant tissue culture. J. Cell Sci. 2: 77-88.

JONES OP. 1991. The role of biotechnology in the multiplication and improvement of woody plants. Acta Hort. 289: 35-44.

KUBO M., UDAGAWA M., NISHIKUBO N., HORIGUCHI G., YAMAGUCHI M., ITO J., MIMURA T., FUKUDA H., DEMURA T. 2005. Transcription switches for protoksylem and metaksylem vessel formation. Genes & Develop. 19: 1855-1860.

KOLENBACH HW., SCHMIDT B. 1975. Cytodifferenzierung in Form einer direkten Umwandlung isolierter Mezophyllzellen zu Tracheiden. Z. Pflanzenphysiol. 75: 369-374.

KUTERNOZIŃSKA W., PILIPOWICZ M, KOROHODA W. 1991. Transitory pulse-like treatment with IAA solution more effectively induces xylogenesis in callus culture than permanent presence of the auxin. Biol. Plant. 33(6): 433-438.

MILONI D., SADO P., STACEY N., ROBERTS K., MCCANN M. 2002. Early gene expression associated with the commitment and differentiation of plant tracheary element is revealed by cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis. The Plant Cell 14: 2813-2824.

MINOCHA S.C., HALPERIN W. 1974. Hormones and metabolites which control tracheid differentiation with or without concomitant effect on growth in cultured tuber tissue of Helianthus tuberosus. Planta 116: 319-331.

MCCANN MC. 1997. Tracheary element formation: building up to a dead end. Trends Plant Scie. 2: 333-338.

MONTORO P., ETIENNE H., MICHAUX-FERRIERE N., CARRON MP. 1993. Callus friability and somatic embryogenesis in Hevea brasiliensis. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 33: 331-338.

NOWAK B. 1999. Regeneracja śliwy (Prunus domestica L.) odmiany Węgierka Zwykła z eksplantatów poraŜonych wirusem ospowatości śliwy. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 469: 581-586.

NOWAK B., MICZYŃSKI K. 1996. Regeneration capacity of Prunus domestica L. cv. Węgierka Zwykła from leaves explants of in vitro shoots, using TDZ. Folia Hort. Ann. 8/2: 41-49.

NOWAK B., MICZYŃSKI K. 2002. The course and efficiency of organogenesis on leaf explants of plum ‘Węgierka Zwykła’ (Prunus domestica L.) induced by cytokinins. E.J.P.A.U. www.ejpau.media.pl/series/volume5/issue1/biotechnology

NORTHCOTE DH. 1995. Aspects of vascular tissue differentiation in plants. Int. Journ. Plant Scie. 156: 245-257.

PISSARA J., SANTOS I., SALEMA R. 1990. Xylogenesis and lignification in plant tissue cultures differently affected by 8-hydroksyquinoline sulphate. Protoplasma 158: 19-25.

RAVEN PH., EVERT RF., EICHHORN S.E. 1999. Biology of plants. Freeman Co., New York.

E. Hanus-Fajerska

124

SACHS T. 1969. Polarity and the induction of organized vascular tissues. Ann. Bot. 33: 263-275.

SACHS T. 1991. Cell polarity and tissue pattering in plants. Development 91 (Suppl. 1): 83-93.

YOSHIDA S., KURIAMA H., FUKUDA H. 2005. Inhibition of transdifferentiation into tracheary elements by polar auxin transport inhibitors through intracellular auxin depletion. Plant Cell Physiol. 46/12: 2019-2028. Key words: auxins, callus lines, differentiation, histology, xylogenesis, Prunus sp. Summary

Research on kinetics of growth and morphology of Prunus domestica leaf derived callus cultured in vitro were compared with the anatomical features of proliferating cell populations. Anatomical studies revealed that callus showed particular histological features when subcultured on different types and levels of plant growth regulartors added to the modified MS medium. The addition of auxin analoques induced changes in cell populations, such as rate of cytokinesis and extent of xylogenesis. 2,4-D was found to stimulate tracheary element formation with the level of sucrose kept constant. Tissues cultivated on 2,4-D+IBA and picloram in the induction medium and maintenance medium respectively, showed a certain degree of cell type differentiation as indicated by the formation of isolated tracheary cells and in some cases organized tracheoid development. Growth, as measured by the increase in fresh weight, was more rapid in the control auxin/cytokinin media as compared to the media supplemented with piclo-ram, dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and indole-3-butyric acid (IBA), what was more pronounced against time. Maximum growth occured in a medium supplemented with 2.0-1.0 mg⋅dm-3 2,4-D and 0.1 mg⋅dm-3 BA with growth dynamic of typical sigmoid curve, whereas 0.2 mg⋅dm-3 of picloram supported only minimal callus growth. Abbreviations: BA - benzyloaminopurine, 2,4-D - dichlorophenoxyacetic acid, IBA - indole-3-butyric acid, FT - friable tissue, NT - nodular tissue, MS - Murashige-Skoog medium, PGR - plant growth regulators WPŁYW ANALOGÓW AUKSYN NA KSYLOGENEZĘ W TKANKCE KALUSOWEJ ŚLIWY DOMOWEJ W WARUNKACH in vitro Ewa Hanus-Fajerska Katedra Botaniki, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie Słowa kluczowe: auksyny, linie kalusa, róŜnicowanie, histologia, ksylogeneza,


125

Prunus sp. Streszczenie

Struktury trachealne stanowią bardzo charakterystyczny element pojawiający się w trakcie rozwoju tkanek kalusowych hodowanych na róŜnych poŜywkach, zwłaszcza na poŜywkach ksylogenicznych. Zarówno zakres spontanicznej, jak i indukowanej waskularyzacji niezróŜnicowanych komórek kalusa uzaleŜniony jest od składu i zawartości związków chemicznych obecnych w poŜywce, szczególnie cukrowców i auksyn. Na kierunek róŜnicowania wywierają równieŜ wpływ róŜnice w stopniu odŜywienia poszczególnych populacji komórek oraz warunki fizyczne kultury. Obecnie intensyfikowane są badania molekularne dotyczące aktywacji genów wywołujących depozycję lignin w ścianie komórkowej, co skutkuje zmianą szlaków metabolicznych i finalną kaskadą efektów biologicznych. Poszukuje się dogodnych modeli doświadczalnych in vitro roślin drzewiastych ze względu na ogromne wartości uŜytkowe tej grupy roślin.

Prezentowane wyniki dotyczą róŜnicowania elementów trachealnych w kalusie Prunus domestica w odpowiedzi na róŜne kombinacje stęŜeń analogów auksyn, dodawanych do zmodyfikowanej poŜywki Murashige-Skoog’a, w trakcie kultury tkanek w ciemności i stałej temperaturze 24±2°C. Kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy dodany w dawce 1,1 mg⋅dm-3 do poŜywki proliferacyjnej, zawierającej 30 g⋅dm-3 sacharozy, wywołał waskularyzację komórek kalusa. Rozmieszczenie elementów tkanki naczyniowej w obserwowanych przekrojach tkanki kalusowej było uformowane w kształcie skupisk lub pasm. Dodatek kwasu indolilo-3-masłowego, obok 2,4-D, bądź uŜycie pikloramu zarówno w poŜywce indukcyjnej, jak i proliferacyjnej wyraźnie w mniejszym stopniu spowodowały róŜnicowanie się elementów przewodzących, które były rozmieszczone w sposób bezładny w obrębie tkanki. Dr Ewa Hanus-Fajerska Katedra Botaniki Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja al. 29 Listopada 54 31-425 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 127-136 DIFFERENTIATION OF WHEAT CELL SUSPENSION CULTURED IN COLD - IMPACT OF ZEARALENONE AND 24-EPIBRASSINOLIDE Anna Janeczko, Jolanta Biesaga-Kościelniak, Andrzej Skoczowski, Izabela Marcińska Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Kraków Introduction

Regenerable cell suspension cultures offer an in vitro system for mutant selection, propagation of varieties, gene transfer experiments, secondary metabolites production and physiological and biochemical studies [MYTHILI et al. 1999; ZANG et al. 2003]. These variant cell lines are useful for research into the genetics and biochemistry of plant cells and also in biotechnology for the production of new plant varieties and secondary metabolites. Micropropagation of cereals is more difficult than that of dicotyledones plants. The main problem is obtaining stabilized cell suspension or callus culture capable of regeneration. Regenerative cell suspension cultures are initiated exclusively from embryogenic callus [VASIL 1988]. The establishment of such suspension cultures, as well as their maintenance by weekly subculture, is a difficult and time-consuming procedure. Furthermore, embryogenic callus, as well as suspensions, lose with time their morphogenetic competence [BEN AMER, BÖRNER 1997; MYTHILI et al. 1999]. To enhance the efficiency of the process of cell differentiation and plant regeneration except special hormone balance in medium various stress factors such as low or high temperature or shortages of nutrients (starvation) are used [ORSHINSKY, TOMES 1984; HOU et al. 1997; TSUGAWA, SUZUKI 2000; ZHENG 2003]. Significant increases in green plant regeneration were recorded in experiments when detached tillers of rye were cold pretreated for two or four weeks [IMMONEN, ANTTILA 1999]. In winter wheat cell suspension cultures two weeks of cold were applied to determine the treatment after-effects on its growth [MARCIŃSKA 2003].

Until now, the attempts at regenerating Polish wheat cultivars via suspension culture using auxins and cytokinins have not been successful [MARCIŃSKA 2003].

The aim of this study was to determine the impact of two regulators: zearalenone (ZEN) and 24-epibrassinolide (BR27) on differentiation of winter wheat callus developed from cell suspension cultured 0-9 weeks at 5°C. Survival of winter wheat suspension for a longer period of cold has not been studied yet; then the kinetic of growth of wheat suspension during 9 weeks in cold will also be characterized. Material and methods Cell suspension culture

Experiments were conducted on winter wheat cv. Grana. For preparation of cell suspension, calluses obtained from immature embryos isolated 14 days after plant

A. Janeczko i inni

128

flowering were used. Embryos were disinfected for 1 minute in 70% ethanol, 20 minutes in 10% Domestos (5.25% sodium hypochlorite) and rinsed with sterile water. Calluses were cultured on MS medium [MURASHIGE, SKOOG 1962] containing 30 g⋅dm-3 sucrose, 2 mg⋅dm-3 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) and 0.6% Bacto-Agar (Sigma-Poland). The culture grew at 24°C, under 16 h photoperiod (80µmol quantum⋅m-2

⋅s-1 (PAR)) [MARCIŃSKA et al. 1995]. Subculture of callus was carried out at regular periods of one month. Suspension cultures were developed by inoculating 4-5 g of 3 month-old callus into 60 cm3 of MS liquid medium, containing 30 g⋅dm-3 sucrose and 2 mg 2,4-D⋅dm-3. Cultures were maintained in 300 cm3 Erlenmeyer flasks in the dark at 28°C on a rotary shaker at 60 rpm. After 14 days, 100 cm3 of fresh liquid medium was added. After the next 2 weeks, suspensions were allowed to settle and 10 cm3 of the supernatant was removed and replaced by an equal volume of fresh medium. This procedure was repeated after 6 weeks. The cell suspension obtained in this way was poured out into Erlenmeyer 100 cm3 flasks with the amount of 50 cm3 of suspension per vessel. Next, the flasks were placed onto a rotary shaker in a refrigerator (5°C, darkness). During the next 9 weeks of culture, the medium was not changed or added too. Cell suspension growth parameters were measured weekly over a period of 9 weeks. The growth parameters of suspension cultured at 28°C, before cold treatment, were considered as a control and marked with „0”. Parameters of cell suspension growth

The dry weight of a 1 cm3 sample of the suspension was estimated after drying at 60°C for 48h. For packed culture volume evaluation (PCV), 10 cm3 of suspension was centrifuged in calibrated conical tubes for 5 min at 100 x g. Number of cells (suspension density) was estimated in a Bürker cell and calculated per 1 cm3 of suspension. Cell viability was determined qualitatively by mixing small volumes of the suspension cells with Evans Blue to give a dye concentration of 0.05% [GAFF, OKONG’O-OGOLA 1971]. Metabolic activity of cell suspension was estimated as a heat emission from the cells. Analyses were conducted in an isothermal calorimeter (BioActivity Monitor 2277) at 20°C. Suspension heat production rate (in nW) was calculated per number of cells in the measured sample (2 cm3) and standardized for 100000 cells. The number of clusters was estimated in 40 cm3 of cell suspension. Additionally, pH of suspension medium was monitored with a conductivitymeter CC-317. pH decreased from 5.9 in the beginning of culture to 5.5 in the ninth week. Measurements of suspension were carried out in four independent replicates on samples taken from randomly chosen flasks. The morphogenic potential of suspension

Cell aggregated were collected from suspension cultured in cold and plated onto MS basal medium supplemented with (a) 1 mg 2,4-D + 2 mg ZEN and (b) 1 mg 2,4-D+0.004 mg BR27 per dm3. Developing calli were cultured for four weeks at 24°C (16 h photoperiod). Statistical analysis

The data presented in the Figure 1 and Table 1 are the mean values ±SD. Statistical significance for the influence of medium composition on callus diffe-rentiation was calculated based on the Pearson χ2 test (Tab. 2). Results and Discussion

DIFFERENTIATION OF WHEAT CELL SUSPENSION CULTURED ...

129

Cell suspension growth in cold

In natural conditions winter cereals can survive long exposure to low tem-peratures due to their anatomical and morphological properties and also physico-

chemical modifications at the cellular level [CRESPI et al. 1991; EGIERSZDORFF, KACPERSKA 2001]. However, the response of isolated cells of cereals to a long period of cold was not known until now. The results of the presented paper show that it is possible to maintain winter wheat cell suspension alive for 9 weeks at 5°C and without the necessity of changing nutrient medium. However, as it was possible to predict, cold treatment slows down the growth of suspension about few times in comparison with culture kept at 26°C [MARCIŃSKA 2003]. Acclimation of oilseed rape suspensions at 2°C (1-3 weeks) also results in slowing down the growth of cells and increases freezing tolerance of cells [EGIERSZDORFF, KACPERSKA 2001].

In wheat suspension there two stages of cell response to cold are observed: the first stage: the adaptation to cold (1-2 weeks of culture), the second stage: the growth and stabilization of suspension (3-9 weeks of culture).

In the first stage, the percentage of live cells decreases from 99% (noticed at 28°C) to 83% (Fig. 1, inside). The dry weight of suspension does not grow (Tab. 1). At the same time, there is fluctuation in heat production rate (Fig. 1), which reflects intensive changes in metabolic activity of cells. It could be explained by the triggering of defensive and adaptive processes to cold stress.

At the beginning of the second stage suspension growth the number of cells stabilizes at a level about 94% and remains similar during the next 7 weeks at 5 °C (Fig. 1, inside). In the fourth week of suspension culture a significant increase in dry weight, density, as well as the number of aggregates is noticed (Tab. 1). From the fifth week the dry weight, as well as density of suspension, do not undergo essential changes (stabilization of suspension). The described exponential phase of growth and then stabilization phase is also characteristic for wheat suspensions growing at 26°C [MARCIŃSKA 2003] and is noted in cell suspensions of other plant species [BLIGNY 1977; EGIERSZDORFF, KACPERSKA 2001]. After 9 weeks of cold the weight of wheat suspension is 2.5 times higher than before cold treatment. In culture growing at 26°C a similar increase in weight is observed already after 1 week of the culture [MARCIŃSKA 2003].

The level of metabolic activity stabilizes in cold at values a few times lower than at 28°C. The average of heat emission in the suspension growing at 28°C is 179 nW, whereas in the suspension growing for several weeks in cold it is in the of range 38-63 nW (Fig. 1). The metabolic activity depends on the temperature and time of its action [BREIDENBACH et al. 1990; CRIDDLE et al. 1997; THYGERSON et al. 2002]. In the culture of tomato and carrot cells during the lowering of temperature from 35°C to 0°C a systematic decrease in metabolic activity is observed [CRIDDLE et al. 1988; HANSEN et al. 1994]. The metabolic activity of tomato callus tissue decreases just after several hours of culture at 0°C [RANK et al. 1991].

heat production rate (nW⋅100 000 cells-1) produkcja ciepła (nW⋅100 000 komórek-1)

A. Janeczko i inni

130

Fig. 1. Metabolic activity (heat production rate) and number of live cells of winter wheat

cell suspension cultured in cold Rys. 1. Aktywność metaboliczna (produkcja ciepła) i liczba Ŝywych komórek zawiesiny pszenicy

ozimej rosnącej w chłodzie Table 1; Tabela 1 Parameters of growth of winter wheat cell suspension in cold Parametry wzrostu zawiesiny komórkowej pszenicy ozimej w chłodzie

Weeks at 5°C Tygodnie w 5°C

Dry matter Sucha masa

(mg)

Density (numbers of

cells 104⋅ml-1) Gęstość (liczba

komórek 104⋅ml-1)

Packed cell

volume (PCV) Całkowita objętość komórek (PCV) (cm3⋅10 ml-1)

Number of agregates

(per 40 ml of suspension)

Liczba agregatów (w 40 ml zawiesiny)

0 (control; kontrola)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

2.0±0.8 2.3±0.7 2.1±0.9 2.3±1.1 5.5±1.1 4,9±0.5 4,5±0.4 4,8±1.1 4,0±1.2 5,0±1.0

20±02 15±01 48±15 31±11 83±17 23±07 44±05 32±09 40±07 28±06

1.4±0.2 1.3±0.5 1.5±0.4 1.6±0.6 1.1±0.1 0.5±0.2 1.4±0.2 1.8±0.3 1.4±0.3 1.5±0.2

141±27 97±45 90±22 108±16 148±15 107±40 80±08 97±09 79±17 103±09

* dry weight of cells in 1 cm3 medium after evaporation; sucha masa komórek zawiesiny po od-

parowaniu 1 cm3 poŜywki The morphogenic potential of suspension

In suspension cultured in cold, characteristic elongated and cells with large vacuoles are observed, however small isodiametric cells also appear. The greatest number of isodiametric cells with large nuclei and thick cytoplasm are found in the fourth week of the culture. These cells are considered to be potentially morphogenic [MARCIŃSKA 2003]. In fact, their tendency to colony formation is observed. Table 2; Tabela 2 Impact of zearalenone and 24-epibrassinolide on differentiation of winter wheat callus obtained from cell suspension cultured in cold


131

Wpływ zearalenonu i 24-epibrassinolidu na róŜnicowanie kalusa otrzymanego z agregatów powstałych w zawiesinie pszenicy ozimej rosnącej w chłodzie

Weeks of growth of suspension

Tygodnie wzrostu zawiesiny w chłodzie

Number of callus; Liczba kallusów

Differentiation of frequency

with respect to control*

ZróŜnicowanie częstości w

porównaniu do kontroli*

with green

spots z zielonymi centrami

with regenerated

roots regenerujących

korzenie

with

differentiation nie wykazujących

regeneracji

ZEN

0 (control; kontrol)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

20 (41) 20 (40) 25 (50) 25 (50) 25 (50) 30 (60) 30 (60) 20 (41) 24 (48) 30 (60)

20 (41) 20 (40) 12 (24) 12 (24) 23 (46) 16 (32) 16 (32) 20 (41) 22 (44) 16 (32)

9 (18) 10 (20) 13 (26) 13 (26) 2 (4) 4 (8) 4 (8) 9 (18) 4 (8) 4 (8)

+ + + + +

BR27

0 (control; kontrola)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

21 (42) 15 (30) 25 (50) 19 (38) 25 (50) 23 (46) 22 (44) 20 (40) 25 (50) 18 (36)

22 (44) 30 (60) 25 (50) 23 (46) 23 (46) 26 (52) 26 (52) 28 (56) 23 (46) 30 (60)

7 (14) 5 (10) 0 (0) 8 (16) 2 (4) 1 (2) 2 (4) 2 (4) 2 (4) 2 (4)

+ + + + + +

* in brackets percentage of all investigated calluses; w nawiasach podano udział procentowy

poszczególnych grup kalusów + significant difference acc. to χ2 test; istotność róŜnic wg testu χ2

Aggregates are used for regeneration of Monocotyledons on various hormonal media [AHMED, SÁGI 1993; GUO, PULLI 2001]. The attempts at regenerating Polish wheat cultivars via suspension culture with the use of auxins and cytokinins was not successful [MARCIŃSKA 2003]. In our experiment we propose other regulators - zearalenone and 24-epibrassinolide. Zearalenone is an active substance of multi-directional physiological influence [BIESGA-KOŚCIELNIAK 2001; BIESAGA-KOŚCIELNIAK et al. 2003]. ZEN can increase, better than 2,4-D, the number of wheat calluses (obtained from immature embryos) capable of regenerating shoots, and especially effectively, the process of regenerating shoots from poorly-differentiated wheat calluses. The 24-epibrassinolide (BR27) belongs to relatively new plant hormones (brassinosteroids) engaged mainly in the processes of growth and stress resistance [GROVE et al. 1979; MANDAVA 1988; AZPIROZ et al. 1998; KRISHNA 2003]. Brassinosteroids are already successfully used in protocols for regeneration or embryogenesis of Monocotyledons (Spartina patens (AITON) MUHL., Oryza sativa L.) and other plant species [FRANCK-DUCHENNE et al. 1998; SASAKI 2002; LU et

A. Janeczko i inni

132

al. 2003; PULLMAN et al. 2003; AZPEITIA et al. 2003; NÚŃEZ et al. 2004]. The impact of both regulators on the morphogenic potential of aggregates

obtained from suspension appears to interact with the cold derived from the suspension cultured at 28°C and treated with cold for 1-3 weeks and do not show symptoms of differentiation on media containing ZEN or BR27 (Tab. 2). Cold treatment (5-9 weeks) increased the impact of both growth regulators on differentiation processes in calluses. Zearalenone stimulates formation of green spots in calluses better then BR27; which rather stimulates root regeneration (Tab. 2). Formation of green regions “shoot primordial” is considered as the first indication of callus differentiation and regenerative activity [SEARS, DECKARD 1982]. The occurrence of green spots in cereal callus cultures was frequently noted, and a positive correlation between the presence of such spots and regeneration was reported [BEN AMER, BÖRNER 1997]. In the present experiment wheat plant regeneration was not successfully completed but the appearance of potentially morphogenic cells in suspension during cold treatment seems to be interesting for further attempts. Moreover the length of cold treatment of the cell suspension affects the later differentiation of suspension-derived callus on media containing ZEN and BR27. It is worth to emphasize that in comparison to the effects of ZEN and BR27, no symptoms of callus differentiation were observed on media containing kinetin (data not shown). Conclusions 1. The cell suspension of winter wheat may be cultured for 9 weeks in cold without

the necessity of changing the medium. Its growth is slowed down and there is observed a stage of adaptation to cold and subsequently a stage of fast growth and stabilization. Suspension may be used to study response cold of isolated cells.

2. The appearance of potentially morphogenic cells in suspension during cold treatment seems to be interesting for further attempts of winter wheat re-generation from cell suspension culture.

3. The length of cold treatment of the cell suspension affects the later differentiation of suspension on media containing ZEN and BR27.

References AHMED K.Z., SÁGI F. 1993. Culture of and fertile plant regeneration from regenerable embryogenic suspension cell-derived protoplasts of wheat (Triticum aestivum L.). Plant Cell Rep. 12: 175-179.

AZPEITIA A., CHAN J.L., SAENZ L., OROPEZA C. 2003. Effect of 22(S),23(S)-homobras-sinolide on somatic embryogenesis in plumule explants of Cocos nucifera (L.) cultured in vitro. J. Hort. Sci. & Biotech. 78(5): 591-596.

AZPIROZ R., WU Y., LOCASCIO J.C., FELDMANN K.A. 1998. An Arabidopsis brassinoste-roid-dependent mutant is blocked in cell elongation. The Plant Cell 10: 219-230.

BEN AMER I.M., BÖRNER A. 1997. The relationship between green spot initiation and plantlet regeneration of wheat callus grown under short-term conditions. Plant Cell Tissue Organ Cult. 50: 67-69.

BIESAGA-KOŚCIELNIAK J. 2001. Zearalenone as a new hypothetical regulator of the plant vegetative and generative development. 11 Monograph of The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology Kraków, Poland. (English summary, figures and tables description).


133

BIESAGA-KOŚCIELNIAK J., MARCIŃSKA I., WĘDZONY M. 2003. Effect of zearalenone treat-ment on the production of wheat haploids via the maize pollination system. Plant Cell Rep. 21: 1035-1039.

BLIGNY R. 1977. Growth of suspension-cultured Acer pseudoplatanus L. cells in auto-matic culture units of large volume. Plant Physiol. 59: 502-505.

BREIDENBACH R.W., RANK D.R., FONTANA A.J., HANSEN L.D., CRIDDLE R.S. 1990. Calo-rimetric determination of tissue responses to thermal extremes as a function of time and temperature. Thermochim. Acta 172: 179-186.

CRESPI M.D., ZABALETA E.J., PONTIS H.G., SALERNO G.L. 1991. Sucrose synthase expression during cold acclimation in wheat. J. Plant Physiol. 96: 887-891.

CRIDDLE R.S., BREIDENBACH R.W., LEWIS E.A., EATOUGH D.J., HANSEN L.D. 1988. Effects of temperature and oxygen depletion on metabolic rates of tomato and carrot cell cultures and cuttings measured by calorimetry. Plant Cell Environ. 11: 695-701.

CRIDDLE R.S., SMITH B.N., HANSEN L.D. 1997. A respiration based description of plant growth rate responses to temperature. Planta 201: 441-445.

EGIERSZDORFF S., KACPERSKA A. 2001. Low temperature effect on growth and actin cytoskeleton organization in suspension cell of winter oilseed rape. Plant Cell Tissue Organ Cult. 65: 149-158.

FRANCK-DUCHENNE M., WANG Y.W., TAHAR S.F, BEACHY R.N. 1998. In vitro stem elon-gation of sweet pepper in media containing 24-epi-brassinolide. Plant Cell Tissue Organ Cult. 53(2): 79-84.

GAFF D.F., OKONG’O-OGOLA O. 1971. The use of non-permeating pigments for testing the survival of cells. J. Exp. Bot. 22: 756-761.

GROVE M.D., SPENCER F.G., ROHWEDEDER W.K., MANDAVA N.B., WORLEY J.F., WARTHEN J.D., STEFFENS G.L., FLIPPEN-ANDERSON J.L., COOK J.C. 1979. Brassinolide, a plant growth promoting steroid isolated from Brassica napus pollen. Nature 281: 216-217.

GUO Y., PULLI S. 2001. Somatic embryogenesis and plant regeneration from suspension cultures of timothy (Phleum pratense L.). Acta Agric. Scand., Section B 51: 160-166.

HANSEN L.D., AFZAL M., BREIDENBACH R.W., CRIDDLE R.S. 1994. High- and low-tem-perature limits to growth of tomato cells. Planta 195: 1-9.

HOU B., YU H., TENG S. 1997. Effects of low temperature on induction and differentiation of wheat calluses. Plant Cell Tissue Organ Cult. 49: 35-38.

IMMONEN S., ANTTILA H. 1999. Cold pretreatment to enhance green plant regeneration from rye anther culture. Plant Cell Tissue Organ Cult. 57: 121-127.

KRISHNA P. 2003. Brassinosteroid-mediated stress responses. J. Plant Growth Regul. 22: 289-297.

LU Z., HUANG M., GE D.P., YANG Y.H., CAO X.N, QIN P., SHE J.M. 2003. Effect of bra-ssinolide on callus growth and regeneration in Spartina patens (Poaceae). Plant Cell Tissue Organ Cult. 73: 87-89.

MANDAVA N.B. 1988. Plant growth-promoting brassinosteroids. Annu. Rev. Plant Phy-siol. Plant Mol. Biol 39: 23-52.

MARCIŃSKA I. 2003. Wheat cell suspension culture. 11 Monograph of The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology, Krakow, Poland. (English summary, figures and tables description).

MARCIŃSKA I., DUBERT F., BIESAGA-KOŚCIELNIAK J. 1995. Transfer the ability to flower in winter wheat via callus tissue regenerated from immature inflorescences. Plant Cell Tissue Organ Cult. 41: 258-288.

A. Janeczko i inni

134

MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-essays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

MYTHILI P.K., SEETHARAMA N., REDDY V.D. 1999. Plant regeneration from embryogenic cell suspension cultures of wild sorghum (Sorghum dimidiatum Stapf.) Plant Cell Rep. 18: 424-428.

NÚŃEZ M., SIQUEIRA W.J., HERNÁNDEZ M., ZULLO M.A.T., ROBAINA C., COLL F. 2004. Effect of spirostane analogues of brassinosteroids on callus formation and plant re-generation in lettuce (Lactuca sativa). Plant Cell Tissue Organ Cult. 78: 97-99.

ORSHINSKY B.R., TOMES D.T. 1984. Effect of long-term culture and low temperature incubation on plant regeneration from a callus line of bridsfoot trefoil (Lotus corni-culatus L.). J. Plant Physiol. 119: 389-397.

PULLMAN G.S, ZHANG Y., PHAN B.H. 2003. Brassinolide improves embryogenic tissue initiation in conifers and rice. Plant Cell Rep. 22(2): 96-104.

RANK D.R., BREIDENBACH R.W., FONTANA A.J., HANSEN L.D., CRIDDLE R.S. 1991. Time temperature responses of tomato cells during high- and low-temperature inactivation. Planta 185: 576-582.

SASAKI H. 2002. Brassinolide promotes adventitious shoot regeneration from cauliflower hypocotyl segments. Plant Cell Tissue Organ Cult. 71(2): 111-116.

SEARS R.G., DECKARD E.L. 1982. Tissue culture variability: Callus induction and plant regeneration. Crop Sci. 22: 546-550.

THYGERSON T., HARRIS J.M., SMITH B.N., HANSEN L.D., PENDLETON R.L., BOOTH D.T. 2002. Metabolic response to temperature for six populations of winterfat (Eurotia lanata). Thermochim. Acta 394: 211-217.

TSUGAWA H., SUZUKI M. 2000. A low-temperature method for maintaining plant rege-neration activity in embryogenic callus of rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Rep. 19: 371-375.

VASIL I.K. 1988. Progress in the regeneration and genetic manipulation of cereal crops. Biotechnol. 6: 397-402.

ZANG X., MEI X., ZHANG C., LU C., KE T. 2003. Improved paclitaxel accumulation in cell suspension cultures of Taxus chinensis by brassinolide. Biotechnol. Let. 23: 1047-1049.

ZHENG M.Y. 2003. Microspore culture in wheat (Triticum aestivum) doubled haploid production via induced embryogenesis. Plant Cell Tissue Organ Cult. 73: 213-230. Key words: Triticum aestivum L., cold, cell suspension, differentiation, 24-epi-

brassinolide, zearalenone, calorimetry Summary

The aim of this study was to determine the impact of two regulators: zearalenone (ZEN) and 24-epibrassinolide (BR27) on the differentiation of winter wheat suspension cultured for 0-9 weeks at 5°C. The kinetic of growth of wheat suspension for 9 weeks in cold was also characterized. The winter wheat cell suspension was grown during 9-week growth at 5°C without the necessity of medium changing. After the adaptation period, the number of live cells in the suspension stabilized at over 90%. Metabolic activity of cells at 5°C was several times lower than at 28°C but after 9 weeks of cold, the dry mass of the suspension was higher than the initial one. The length of cold


135

treatment of cell suspension affected the later differentiation of aggregates on media containing ZEN and BR27. A longer cold treatment (4-9 weeks) caused an increase in the number of calluses with green spots, especially on media containing ZEN while BR27 rather stimulated root regeneration. WPŁYW ZEARALENONU I 24-EPIBRASINOLIDU NA RÓśNICOWANIE ZAWIESINY KOMÓRKOWEJ PSZENICY HODOWANEJ W CHŁODZIE Anna Janeczko, Jolanta Biesaga-Kościelniak, Andrzej Skoczowski, Izabela Marcińska Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polskiej Akademii Nauk w Krakowie Słowa kluczowe: pszenica ozima, chłód, zawiesiny komórek, róŜnicowanie kalusa,

24-epibrasinolid, zearalenon, kalorymetria Streszczenie

Celem eksperymentu była ocena wzrostu zawiesiny komórek pszenicy ozimej hodowanej przez 9 tygodni w temperaturach chłodowych. Po tym czasie badano wpływ zearalenonu i 24-epibrasinosteroidu na róŜnicowanie kalusa otrzymanego z chłodzonej zawiesiny. Kultura zawiesinowa pszenicy ozimej po przejściu okresu adaptacyjnego do niskich temperatur (zmiany aktywności metabolicznej, spadek procentu Ŝywych komórek) wykazywała stabilny, choć powolny wzrost. Powstałe w niej agregaty zostały wyłoŜone na poŜywkę w celu indukcji i róŜnicowania tkanki kalusowej. Na poŜywkach zawierających zearalenon kalus wytwarzał najwięcej zielonych centrów regeneracji, natomiast na poŜywkach z 24-epibrasinolidem szczególnie intensywnie zachodziła regeneracja korzeni. Zjawisko to występowało jednak tylko w przypadku kalusów pochodzących z zawiesiny chłodzonej przez dłuŜszy czas - od 4 do 9 tygodni. Kalus otrzymany z zawiesiny chłodzonej krócej lub niechłodzonej nie wykazywał symptomów róŜnicowania mimo obecności wymienionych regulatorów w poŜywce. Dr inŜ. Anna Janeczko Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polska Akademia Nauk ul. Niezapominajek 21 30-239 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 137-142 PRÓBA INDUKCJI ANDROGENEZY U POLSKICH ODMIAN OWSA Hanna Kruczkowska, Helena Pawłowska, Barbara Skucińska Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp

Owies zwyczajny (Avena sativa L.) naleŜy do zbóŜ mniej opracowanych w kul-turze in vitro ze względu na jego niewielkie znaczenie ekonomiczne i mało zachęcające wyniki dotychczasowych badań. Coraz szersze wykorzystanie haploidów w hodowli jęczmienia, pszenicy czy pszenŜyta spowodowało ostatnio wzrost zainteresowania równieŜ gatunkami i genotypami zbóŜ o niskiej wydajności androgenezy i poszukiwanie czynników kultury stymulujących indukcję i regenerację haploidów.

Pierwsze próby haploidyzacji owsa podjęto w kulturze pylników przeszło 25 lat temu w USA i Kanadzie [CHUNG 1980 - cyt. za RINES i in. 1997; RINES, MCCOY 1980 - cyt. za RINES i in. 1997], a 10 lat później zastosowano w tym celu technikę krzyŜowań oddalonych [RINES, DAHLEEN 1990], najczęściej przez zapylanie pyłkiem kukurydzy. Uzyskana w krzyŜowaniach liczba haploidalnych roślin owsa jest jednak bardzo niska, i nie zawsze wszystkie chromosomy kukurydzy ulegają eliminacji, co ogranicza przydatność tej metody dla celów hodowlanych [RINES i in. 1997; SIDHU i in. 2006]. Do tej pory nie opisano udanej androgenezy z izolowanych mikrospor owsa, a w kulturze pylników u większości badanych genotypów powstawał jedynie kalus lub nieliczne zarodki niezdolne do regeneracji roślin. W literaturze jest tylko kilka doniesień o regeneracji roślin w kulturze pylników uprawnych form owsa. Autorzy tych prac otrzymywali najczęściej od kilku do kilkunastu roślin z wielu tysięcy pylników wyłoŜonych na poŜywkę [RINES 1983; SUN i in. 1991 - cyt. za RINES i in. 1997; KIVIHARJU, TAURIAINEN 1999; KIVIHARJU i in. 2000].

Ostatnio fińskim badaczom udało się znacznie zwiększyć wydajność androgenezy u owsa zwyczajnego. U czterech badanych odmian i mieszańca odmianowego uzyskali od 2 do 30 zielonych roślin na 100 pylników wyłoŜonych na poŜywkę [KIVIHARJU i in. 2005]. Pozytywne rezultaty osiągnięte w kulturze pylników owsa w ośrodku fińskim są wynikiem bardzo intensywnych prac prowadzonych w ostatnim dziesięcioleciu. Korzystne dla powstawania zarodków i późniejszej regeneracji zielonych roślin okazało się przede wszystkim zastosowanie stresu podwyŜszonej temperatury [KIVIHARJU, PEHU 1998], uŜycie poŜywki W14 o korzystniejszym składzie i proporcji związków azotowych w porównaniu z poŜywką MS [KIVIHARJU i in. 2000], zastąpienie sacharozy wolno rozkładającą się maltozą [KIVIHARJU i in. 1998], podwyŜszenie zawartości 2,4-D i obniŜenie poziomu cytokininy - BAP lub kinetyny [KIVIHARJU i in. 2000, 2005], a takŜe wprowadzenie poŜywki dwufazowej z Ficollem w fazie płynnej [KIVIHARJU i in. 1998]. Znaczący postęp uzyskano jednak dopiero po zastosowaniu wysokiego stęŜenia

H. Kruczkowska, H. Pawłowska, B. Skucińska

138

mioinozytolu oraz zwiększeniu poziomu etylenu w kulturze przez dodanie do poŜywki etefonu. Dzięki uŜyciu L-cysteiny udało się równieŜ ograniczyć brunatnienie i przedwczesne zamieranie pylników, które stanowi powaŜny problem w kulturach in vitro owsa [KIVIHARJU i in. 2005].

Jak wynika z dotychczasowych badań zdolność owsa do androgenezy jest szczególnie zaleŜna od genotypu. Celem tej pracy było sprawdzenie reakcji kilku polskich odmian owsa na indukcję androgenezy. Równocześnie badano wpływ niektórych składników poŜywki zastosowanych przez KIVIHARJU i in. [2005], z eliminacją najbardziej kosztownego jej składnika - Ficollu i próbą zwiększenia wydajności androgenezy przez zwielokrotnienie stęŜenia jonów miedzi. Sprawdzano równieŜ potrzebę wprowadzenia dodatkowego źródła etylenu - etefonu. Materiał i metody

Badania przeprowadzono na pięciu polskich odmianach owsa: Chwat, Celer, Cekin, Cwał (oplewione) i Polar (nieoplewiona). Materiał pobrano z pola doświadczalnego Katedry Hodowli Roślin i Nasiennictwa AR w Krakowie, a odmianę Chwat dodatkowo z pomieszczenia wegetacyjnego o regulowanych warunkach wzrostu (temperatura 17°C, fotoperiod dzień/noc 16/8 godz., natęŜenie promieniowania 280 µmol⋅m-2

⋅s-1). Odcinano źdźbła, gdy wierzchołek wiechy był wyczuwalny w pochwie liściowej, powyŜej nasady drugiego liścia, i umieszczano je w kolbach z wodą w temperaturze 4°C. Po 6-7 dniach chłodzenia wiechy ukryte w pochwie liściowej dezynfekowano przez spryskanie 70% etanolem. Do kultury izolowano pylniki z dolnych kwiatów kłoska, zawierające mikrospory w stadium średnio- i późnojednojądrowym. Stadium rozwojowe mikrospor oznaczano na preparatach gniecionych, barwionych acetokarminem. Ze względu na bardzo zróŜnicowany rozwój kwiatów w wiesze, przy wyborze pylników kierowano się cechami skorelowanymi z wybranym stadium, czyli długością pylników i ich wybarwieniem.

Pylniki wykładano do płytek Petriego (o średnicy 3 cm) zawierających 2,5 ml poŜywki. W doświadczeniu zastosowano poŜywkę indukującą zalecaną przez KIVIHARJU i in. [2005], bez Ficollu, zawierającą sole mineralne i witaminy jak w poŜywce W14

[OUYANG 1989 - cyt. za KIVIHARJU i in. 2005], 50 mg⋅dm-3 cysteiny, 500 mg⋅dm-3 inozytolu, 5 mg⋅dm-3 2,4-D, 0,5 mg⋅dm-3 BA, 10% maltozy oraz 0,3% Phytagelu. Wprowadzono 4 kombinacje tej poŜywki róŜniące się zawartością etefonu i soli miedzi: A - 20 mg⋅dm-3 etefonu, 0,025 mg⋅dm-3 CuSO4, B - bez etefonu, 0,025 mg⋅dm-3 CuSO4 , AC - 20 mg⋅dm-3 etefonu, 2,5 mg⋅dm-3 CuSO4, BC - bez etefonu, 2,5 mg⋅dm-3 CuSO4. Odmianę Chwat badano we wszystkich kombinacjach poŜywki, pozostałe odmiany tylko na poŜywkach AC i BC. W kaŜdej kombinacji wyłoŜono 360 pylników z odmiany, powtórzenie stanowiło 6 płytek po 20 pylników. Z kaŜdej wiechy rozkładano równomiernie pylniki na wszystkie poŜywki. Płytki umieszczono na 5 dni w temperaturze 32°C (traktowanie wstępne), a następnie przeniesiono je do temperatury 25°C. Kulturę prowadzono w ciemności przez 8 tygodni. Powstałe w tym okresie zarodki i kalusy, większe od 1,5 mm, przenoszono na poŜywkę regeneracyjną zawierającą sole i witaminy jak w poŜywce W14, z dodatkiem 2 mg⋅dm-3 NAA, 0,5 mg⋅dm-3 KN, 2% sacharozy, 0,3% Phytagelu [KIVIHARJU i in. 2005]. Regenerację prowadzono przez 4 tygodnie na świetle o natęŜeniu promieniowania ok. 100 µmol⋅m-2

⋅s-1 , przy fotoperiodzie dzień/noc 16/8 godz. i temperaturze 25-26°C. Po zakończeniu doświadczenia zestawiono dla odmian i kombinacji udział

PRÓBA INDUKCJI ANDROGENEZY U POLSKICH ODMIAN OWSA

139

reagujących pylników, liczbę zarodków i kalusów przeniesionych na poŜywkę re-generacyjną, liczbę roślin zielonych i albinotycznych. Przeprowadzono analizę zmienności oraz obliczono błąd standardowy dla liczby zarodków i kalusów. Wyniki i dyskusja

U dwóch odmian (Celer i Polar) nie obserwowano Ŝadnej reakcji na indukcję androgenezy, u pozostałych odmian (Chwat, Cekin, Cwał) na pylnikach utworzyły się zarodki i kalusy (tab. 1). Udział pylników reagujących na indukcję androgenezy był niewielki i wahał się od 0,6% (Cekin) do 15,2% (Chwat), reszta pylników zamarła. Zarodki i kalusy większe niŜ 1,5 mm, przeniesione na poŜywkę regeneracyjną równieŜ zamierały, a tylko nieliczne z odmian Chwat i Cwał zregenerowały rośliny. Nie zauwaŜono większych róŜnic pomiędzy materiałem odmiany Chwat pochodzącym z pomieszczenia wegetacyjnego i zebranym z pola. Niewielka skuteczność zastosowanych kombinacji i duŜa zmienność wyników uniemoŜliwiły wykazanie istotnych róŜnic pomiędzy badanymi czynnikami i pozwoliły tylko na wskazanie pewnych tendencji rzutujących na tok dalszych badań. Tabela 1; Table 1 Indukcja androgenezy i regeneracja roślin w kulturze pylników owsa (w przeliczeniu na 100 pylników) Induction of androgenesis and plant regeneration in anther culture of oat (per 100 anthers)

Odmiana Cultivar

PoŜywka Medium

Liczba pylników

reagujących Reacting anthers

Liczba zarodków

i kalusów > 1,5 cm No. embryos and calli

> 1.5 cm (SE)

Liczba roślin zielonych/

albinotycznych No. of plants green/albino

Chwat*

A B

7,4 6,7

29,0 (15,74) 18,2 (8,01)

0

2,3/1,3

Chwat

A B

AC BC

9,6 11,0 15,2 14,2

32,9 (8,71) 25,4 (7,87) 29,9 (7,22) 41,3 (9,75)

0 0 0

2,2 /0,6

Cwał

AC BC

3,7 4,5

10,5 (4,74) 18,7 (6,95)

1,9/0 1,1/0

Cekin

AC BC

0

0,6

0

0,62 (0,15)

0 0

* rośliny mateczne z pomieszczenia wegetacyjnego; donor plants from growth room

Z dwóch odmian, które regenerowały pędy, lepsze wyniki pod względem wszystkich badanych parametrów otrzymano u odmiany Chwat. W badaniach (niepublikowanych) nad androgenezą u owsa, prowadzonych w IHAR Radzików, równieŜ wskazano na tę odmianę jako wyróŜniającą się zdolnością do regeneracji. Mimo, Ŝe poŜywki indukujące nie zawierały Ficollu, liczba zregenerowanych roślin była porównywalna z wynikami uzyskanymi przez autorów fińskich dla słabiej regenerujących genotypów. Pozytywny wpływ Ficollu na rozwój zarodków i rege-nerację roślin został potwierdzony w wielu pracach nad androgenezą zbóŜ, począwszy od badań KAO [1981]. Ze względu na wysoką cenę tego składnika Ŝelującego poŜywkę jego szerokie zastosowanie w hodowli byłoby jednak zbyt kosztowne. Z tego powodu w


140

doświadczeniu zastąpiono go Phytagelem. Wyniki osiągnięte u odmian Chwat i Cwał pozwalają przypuszczać, Ŝe przy uŜyciu Ficollu wydajność androgenezy mogłaby być wyŜsza.

Innym składnikiem poŜywki indukującej, który zwiększa udział reagujących pylników oraz zregenerowanych roślin, moŜe być siarczan miedzi uŜyty w zwielo-krotnionym stęŜeniu w porównaniu z ilością standardową stosowaną w poŜywkach [WOJNAROWIEZ i in. 2002]. U badanych odmian w kombinacji ze stukrotnie zwiększonym stęŜeniem CuSO4, lecz bez etefonu (kombinacja BC), obserwowano wyraźnie większą zdolność do tworzenia zarodków i kalusów niŜ z dodatkiem etefonu (kombinacja AC). Etefon dodany do poŜywki indukującej przy standardowym poziomie miedzi wpłynął równieŜ pozytywnie na powstanie tych struktur (kombinacja A). Regeneracja roślin u odmiany Chwat wystąpiła tylko w kombinacjach bez egzogennego etylenu (kombinacja B i BC). Taka reakcja na dodatkowe źródło etylenu moŜe znaleźć wyjaśnienie w literaturze, która wskazuje na genotypowe róŜnice w wytwarzaniu endogennego etylenu przez pylniki oraz odmienne zapotrzebowanie tego hormonu w procesie indukcji androgenezy i procesie regeneracji roślin [PUA 1999]. Wnioski 1. W kulturze pylników pięciu polskich odmian owsa (Chwat, Celer, Cekin, Cwał,

Polar) uzyskano regenerację u odmian Chwat i Cwał: 1,1-3,6 roślin ogółem, w tym 1,1-2,3 roślin zielonych w przeliczeniu na 100 pylników wyłoŜonych na poŜywkę (w poŜywce indukującej nie stosowano Ficollu).

2. Zaobserwowano, Ŝe stukrotne zwiększenie stęŜenia CuSO4 w poŜywce indu-kującej lub dodatek etefonu przyczyniły się do zwiększenia liczby zarodków i kalusów utworzonych na pylnikach. Równoczesne zastosowanie obu tych składników było mniej skuteczne.

3. U odmiany Chwat bardziej korzystne dla regeneracji roślin były kombinacje poŜywki indukującej bez etefonu.

Literatura KAO K.N. 1981. Plant formation from barley anther cultures with Ficoll media. Z. Pflanzenphysiol. 103: 437-443.

KIVIHARJU E., PEHU E. 1998. The effect of cold and heat pretreatments on anther culture response of Avena sativa and Avena sterilis. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 54: 97-104.

KIVIHARJU E., PUOLIMATKA M., SAASTAMOINEN M., HOVINEN S., PEHU E. 1998. The effect of genotype on anther culture response of cultivated and wild oats. Agric. Food Sci. Finl. 7: 409-422.

KIVIHARJU E., TAURIAINEN A. 1999. 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and kinetin in anther culture of cultivated and wild oats and their interspecific crosses : plant regeneration from Avena sativa L. Plant Cell Rep. 18: 582-588.

KIVIHARJU E., PUOLIMATKA M., SAASTAMOINEN M., PEHU E. 2000. Extension of anther culture to several genotypes of cultivated oats. Plant Cell Rep. 19: 674-679.

KIVIHARJU E., MOISANDER S., LAURILA J. 2005. Improved green plant regeneration rates from oat anther culture and the agronomic performance of some DH lines. Plant Cell

PRÓBA INDUKCJI ANDROGENEZY U POLSKICH ODMIAN OWSA

141

Tiss. Organ Cult. 81: 1-9.

PUA E.C. 1999. Morphogenesis in cell and tissue cultures: role of ethylene and poly-amines, w: Morphogenesis in Plant Tissue Cultures. Soh W.Y., Bhojwani S.S. (Red.). Kluwer, Dordrecht: 255-303.

RINES H.W. 1983. Oat anther culture: genotype effects on callus initiation and the production of a haploid plant. Crop Sci. 23: 268-272.

RINES H.W., DAHLEEN L.S. 1990. Haploid oat plants produced by application of maize pollen to emasculated oat florets. Crop Sci. 30: 1073-1078.

RINES H.W., RIERA-LIZARAZU O., NUNEZ V.M., DAVIS D.W., PHILLIPS R.L. 1997. Oat haplo-ids from anther culture and from wide hybridizations, w: In vitro Haploid Production in Higher Plants. Jain SM., Sopory SK., Veilleux RE. (Red.), Kluwer, Dordrecht 4: 205-221.

SIDHU P.K., HOWES N.K., AUNG T., ZWER P.K., DAVIES P.A. 2006. Factors affecting oat haploid production following oat x maize hybridization. Plant Breed. 125: 243-247.

WOJNAROWIEZ G., JACQUARD C., DEVAUX P., SANGWAN R.S., CLÉMENT C. 2002. Influence of copper sulfate on anther culture in barley (Hordeum vulgare L.). Plant Sci. 162: 843-847. Słowa kluczowe: owies zwyczajny, androgeneza, stęŜenie siarczanu miedzi, etylen Streszczenie

W kulturze pylników badano zdolność do androgenezy pięciu polskich odmian owsa. Zastosowano poŜywki zalecane przez KIVIHARJU i in. [2005], lecz bez Ficollu. Wprowadzono róŜne kombinacje poŜywek róŜniące się stęŜeniem siarczanu miedzi i etefonu. Regenerację uzyskano u odmian Chwat i Cwał: 1,1-3,6 roślin ogółem na 100 pylników wyłoŜonych na poŜywkę. Stukrotne zwiększenie stęŜenia CuSO4 lub dodatek etefonu w poŜywce indukującej sprzyjały zwiększeniu liczby zarodków i kalusów. Równoczesne wprowadzenie etefonu i podwyŜszenie stęŜenia miedzi w poŜywce było mniej korzystne. Odmiana Chwat, która okazała większą wydajność androgenezy niŜ odmiana Cwał, regenerowała rośliny jeśli pylniki wyłoŜono na poŜywki bez etefonu. ATTEMPT AT INDUCTION OF ANDROGENESIS IN THE POLISH OAT CULTIVARS Hanna Kruczkowska, Helena Pawłowska, Barbara Skucińska Department of Plant Breeding and Seed Science, Agricultural University, Kraków Key words: oat, androgenesis, concentration of copper sulfate, ethylene Summary

The experiment tested the potential for androgenesis in five Polish oat cultivars in anther culture. The various combinations, used in the experiment on the medium recommended by KIVIHARJU et al. [2005], though without Ficoll, varied in their concentration of copper sulfate and Ethephon. Regeneration was obtained in Chwat and Cwał cvs: 1.1-3.6 plants per 100 anthers. A hundredfold increase in CuSO4 concentration or an addition of Ethephon into the induction medium resulted in an increased number of embryos and calli. However, an addition of Ethephon accompanied


142

by a simultaneous increase in the copper concentration in the medium was less favorable. Chwat cv. which showed greater efficiency of androgenesis than Cwał cv., regenerated plants better when its anthers were placed on the medium without Ethephon. Dr inŜ. Hanna Kruczkowska Katedra Hodowli Roślin i Nasiennictwa Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja ul. Łobzowska 24 31-140 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 143-154 INTERACTION BETWEEN TEMPERATURE AND SUCROSE CONTENT DURING GROWTH AND DIFFERENTIATION OF WHEAT (Triticum aestivum L.) CELL SUSPENSION Izabela Marcińska, Jolanta Biesaga-Kościelniak, Maria Filek, Marta Pilipowicz, ElŜbieta Niemczyk Institute of Plant Physiology of Polish Academy of Sciences, Kraków Introduction

Our studies are devoted to searching for the optimal conditions of a long-term embryogenic suspension culture of wheat. Suspension culture provides an ideal object for protoplast and microprojectile-based transformation system because of their homogeneity and small cell cluster size. The limitation of suspension culture and protoplasts methods in wheat is the lack of real plant regeneration. VASIL et al. [1990] suggest that in the case of Graminae only totipotent suspension culture can be a source of cell colonies, producing somatic embryos and plants. PAVLOVA and KORDYUM [1996] demonstrated morphology of a totipotent Lolium multiflorum suspension culture. Cells in 20-30 µm2 of size, single or assembled in small aggregates were of meristematic type. They had isodiametric shape, dense cytoplasm and a large nucleus. They were totipotent and potentially capable of further somatic embryogenesis. The other cells growing by elongation were 120-150 µm in size with large vacuoles. To maintain regeneration potential of wheat cells, many approaches were employed such as the low temperature treatment and optimal concentration of sucrose in the medium.

It is known recognized that low temperature induces environmental stress, changes in cell metabolism and the uptake of nutrients in in vitro cultures. HOU et al. [1997] showed that a treatment at 5°C which sometime significantly improved the regeneration frequency of callus from immature inflorescence of wheat although the callus induction was decreased. The preservation of callus tissue at a low temperature was used as a method developed to maintain plant regeneration activity of rice cells [TSUGAWA, SUZUKI 2000]. The preservation of rice callus at 5°C for 8 months caused cell damage, but some surviving cells divided in the suspension culture and eventually regenerated the whole plants. In winter wheat callus 7 days after its transfer to 4°C, the accumulation of proteins was greater than in the control maintained at 20°C [KARIMZADEH et al. 2000]. Cell area was significantly smaller in cooled tissue in comparison to those maintained at 20°C. In winter rape cell suspension the cold treatment arrested the growth of cells and prevented the exhaustion of carbohydrates from cells [EGIERSZDORFF, KACPERSKA 2001].

Sucrose is necessary for cell growth and conditions the properties of culture medium. It plays the basic role as an energy source and as the osmoregulatory factor in

I. Marcińska et al.

144

the heterotrofic cell suspension culture. In most cases 3% of sucrose in a medium is applied, however, higher concentrations were also tested [FELLERS et al. 1995; ANBAZHAGAN, GANAPATHI 1999]. After the addition of the fresh medium to cell suspension culture, sucrose is rapidly hydrolysed to glucose and fructose [BOTHA, O’KENNEDY 1998]. Glucose is preferentially taken up, leading to the accumulation of fructose in the medium. EBRAHIM et al. [1999] reported that the hexose uptake systems (for glucose and fructose) of sugarcane cell suspension culture were strongly inhibited at a low temperature. In our earlier studies it was shown that the tendency in the change of sugars in the medium measured during the 17-day period of wheat cell suspension culture was similar for cells, derived both from the immature embryo and inflorescence [MARCIŃSKA et al. 2000]. The rate of cell growth and division, however, was higher for inflorescence. It was demonstrated that changes in the sugar level are involved in cell metabolism and can inform about physiological state of the tissue.

The aim of the present investigation was to compare the carbohydrate uptake from a medium during the growth and differentiation of the wheat (Triticum eastivum L.) cell suspension culture influenced by a low temperature pre-treatment and higher than standard content of sucrose in the medium or both. Moreover, on the basis of growth kinetics and morphology of cells, the interaction of both factors was evaluated. Material and methods Callus culture

Callus derived from immature inflorescence (5-10 mm long - Fig. 1a) of winter wheat (Triticum aestivum L.) cv. Almari was prepared according to the method previously described [MARCIŃSKA et al. 2001]. The incubation temperature was maintained at 26±2°C in darkness. A subculture of callus cultures was made at two week intervals. After eight weeks of culture the callus structure was friable and nodular (Fig. 1b). Suspension culture

Cell suspension cultures were developed by inoculating 1.5 g of the callus in the 300 cm3 Erlenmeyer flasks, containing 100 cm3 of a liquid MS2 medium [MURASHIGE, SKOOG 1962]. It was supplemented with an original set of vitamins and 2 mg glycine, 100 mg inositol, 2 mg 2,4-D and 30 g of sucrose per 1 dm3, at pH 5.8. Flasks were maintained on a gyratory shaker, at 60 cpm at 26°C, under 16 h-photoperiod and weak illumination under Philips TL MF 140 Wat/33RS lamp. The cultures were passaged every two weeks by changing 25 cm3 of the incubation medium for the fresh one of the same composition. After 6 weeks of culture, the content of every flask was divided into two portions and placed into new two flasks. One of them was supplemented with the same medium (3% sucrose - standard medium) and the other one with medium containing higher (6%) concentration of sucrose (the final the concentration in the flask was 4.5% of sucrose). Half of the flasks (in 4 replicates), containing two various concentrations of sugar were transferred to 6°C for 7 days and then to 10°C for the next 7 days. Flasks containing the tested suspensions, were transferred back to 26°C after that treatment. The other ones were cultured continuously at 26°C. The control suspen-sion contained the standard MS2 medium. Before the start of growth kinetics testing, as a consequent effect of the earlier pre-treatment, all objects were passaged on the standard medium, containing only 3% of sucrose. During 15 days of culture the flasks

INTERACTION BETWEEN TEMPERATURE AND SUCROSE CONTENT ...

145

were maintained continuously at 26°C and 16 h photoperiod. First measurements were taken directly after passage, it was signed as the day 0. Fig. 1. (a) Immature inflorescence of wheat cv. Almari, used as an explant, magnification

12X; (b) 8-weeks old callus tissue, as a source of cell suspension culture, magnification 12X; (c) cells in suspension in different size: E - small, embryogenic, NE - elongated, non-embryogenic, magnification 100X; (d) pro-embryogenic aggregates in suspension culture, consisted of small cells, coloured by DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol), magnification 100X

Rys. 1. (a) Niedojrzały kwiatostan pszenicy odm. Almari uŜyty jako explantat, powiększenie 12

razy. (b) 8-tygodniowy kalus, jako źródło zawiesiny komórkowej, powiększenie 12 razy, (c) komórki róŜnych rozmiarów w zawiesinie: E - małe, embriogenne, NE - wydłuŜone, nie embriogenne, powiększenie 100 razy, (d) pro-embriogenne agregaty w kulturze zawiesiny, składające się z małych komórek, wybarwione DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol), powiększenie 100 razy

Analytical procedure

Every 2-3 days over the 15-day period of the culture, the number of cells and dry mass of suspension were determined, using 4 separate flasks as replicates. Both parameters of the suspension were determined in 10 cm3 samples, taken out from each flask on the day of measurement (7 terms of measurements), using sterile, wide cut pipettes, collecting possibly homogenous portions. Cells number was calculated under a reversed Olympus microscope at 100-fold magnification (Fig. 1c), in a determined volume of Burker chamber. Simultaneously the viability of cells was determined. The cells were incubated for 10 min in water solution containing 25% (w/v) of Evans Blue. Only the dead cells were coloured dark blue. This colouring substance was not infiltrated though a membrane of live cells. Portions of 10 cm3 of the suspension were filtered on discs of blotting paper, weighed, rinsed twice with distilled water and then the dry mass (DM) was determined after drying the disks with cells at 60°C for 24


146

hours. Using the computer Lucia G/Comet-program, version 3.52a, the differences in

cell morphology were evaluated. For four different analytical conditions, two criteria: cell profile area, as the most principal size, and cell circularity, as useful parameter for the shape characteristics were taken for account. Circularity was calculated from the cell cross-section area and perimeter: 4π ⋅ area Circularity = ------------ perimeter2

Circularity is 1 only for circles, all other shapes are characterised by a lower circularity with circularity close to 1. Differentiated cells of wheat callus are usually small, isodiametric in shape, similar to a circle.

To determine the changes in morphology of cells in the suspension, influenced by 3 and 4.5% sucrose content in the medium and low temperature pre-treatment, the sucrose and hexose (glucose and fructose) contents in the medium were determined. The analysis of carbohydrate content was conducted in a Hewlett-Packard gas chromatograph 5890 series II, with capillary column DB-170 : 1 = 15 m; ID = 0.250 mm; detector FID: temp. 150-220°C. The medium, as a supernatant of centrifuged (200 g) cell suspension was transferred into vials (50 µl) evaporated under nitrogen and then mixed with 950 µl of silyating reagent TRI-SIL, containing: HMDS (hexamethyldisilarone), TMCS (trimethylchlorosilslone) and pyridine (PIR) in the ratio v:v:v 2 : 1 : 10. ISTD (metyloglucopiranoside) as the internal standard. Prepared samples were kept at a room temperature for 30 min. After that time they were centrifuged at 400 g for 10 min. Chromatographic analysis were done by the injection of 1 µl sample to the column. All data presented in figures are the mean values with the standard errors.

All data were subjected to statistical analysis using the Statistica programme, version 7.0 Results and discussion

Both tested factors, the short-term presence of a higher amount of sucrose in the medium and pre-treatment at low temperature had a significant effect (p = 0.01) on the most of the measured cell suspension parameters (Figs 2-4). It was: percentage increase of the number of cells, their dry mass, cell cross-section area, circularity of cells and concentration of sugars in the medium. Both pre-treatments caused a consequent influence on cell suspension growth kinetics.

4.5% sucrose; sacharoza, 26 oC

0

200

400

600

800

1000

0 2 4 7 11 18

days of culture; dni kultury

%


0

200

400

600

800

1000

0 2 4 7 11 18


%

3% sucrose; sacharoza, 26 oC

0

200

400

600

800

1000

0 2 4 7 11 18


%


0

200

400

600

800

1000

0 2 4 7 11 18


%


147


200

300

400

500

600

700

0 2 4 7 11 18


cell's parameter;

parametr komórek


200

300

400

500

600

700

0 2 4 7 11 18


cell's parameter;

parametr komórek


200

300

400

500

600

700

0 2 4 7 11 18


cell's parameter;

parametr komórek


200

300

400

500

600

700

0 2 4 7 11 18


cell's parameter;

parametr komórek

Fig. 2. Effect of temperature pre-treatment (26 and 6°C) and sucrose concentration in

medium (3 and 4.5%) on growth kinetics during 15 days of culture in winter wheat cv. Almari cell suspension culture. Curves representing percentage increase of number of cells (-�-) and their dry mass (-�-). Means from 4 replicates ± standard errors

Rys. 2. Wpływ wstępnego traktowania temperaturą (26 i 6°C) i stęŜenia sacharozy w poŜywce (3 i

4,5%) na kinetykę wzrostu w czasie 15 dni kultury zawiesiny komórkowej pszenicy ozimej odm. Almaro. Krzywe reprezentują procentowy przyrost liczby komórek (-�-) i ich suchej masy (-�-). Średnie pochodzą z 4 powtórzeń ± błąd stanadardowy

Effect on growth kinetics

The growth profiles presented in Fig. 2 show that the wheat cell growth depends significantly on the culture conditions. The cultures exhibited a lag phase of approximately 4 days before the cell density started to increase. The stationary phase of growth was reached between 11-15 days of culture. The viability of cells was similar and unaffected by both treatments (data not shown). Low temperature treatment twice decreased dry mass production and 1.5-fold number of cells, especially after 7th day of culture. It is in agreement with the results obtained by HOU et al. [1997] in the callus culture of wheat and it was probably due to a limited carbohydrate supply from the medium. The results suggest that a low temperature was unfavourable for growth kinetics in wheat culture, however, it stimulated the metabolism of cells, which revealed the improvement of the differentiation of cells. The direction of changes in the growth rate were similar regardless the sucrose concentration. The most visible differences between two treatments were noticed between 4th to 11th day after passage. The higher amount of sucrose in the medium enhanced the lower cell biomass production in the culture treated by a low temperature (object: 4.5% sucrose, 6°C). The present results are in accordance with findings by ANBAZHAGAN, GANAPATTI [1999] and FELLERS et al. [1995], when doubled concentration of sucrose lowers the rate of cell proliferation that results from a lowered production of biomass.


148


0

200

400

600

800

0 2 4 7 11 18


[mg/dm3]


0

200

400

600

800

0 2 4 7 11 18


[mg/dm3]


0

200

400

600

800

0 2 4 7 11 18


[mg/dm3]


0

200

400

600

800

0 2 4 7 11 18


[mg/dm3]

Fig. 3. Effect of temperature pre-treatment (26 and 6°C) and sucrose concentration in

medium (3 and 4.5%) on cell’s morphology during 15 days of culture in winter wheat cv. Almari cell suspension culture. Curves representing morphology of cells: section area (-�-) and circularity (-�-). Means from 4 replicates ± standard errors. Units of: section area (y⋅10-1), circularity (y⋅10-3)

Rys. 3. Wpływ wstępnego traktowania temperaturą (26 i 6°C) i stęŜena sacharozy w poŜywce (3 i

4,5%) na kinetykę wzrostu w czasie 15 dni kultury zawiesiny komórkowej pszenicy ozimej odm. Almari. Krzywe reprezentują morfologię komórek: powierzchnia ich przekroju (-�-) i sferyczność (-�-). Średnie pochodzą z 4 powtórzeń ± błąd standardowy. Jednostki naleŜy pomnoŜyć: powierzchnia przekroju (y⋅10-1), sferyczność (y⋅10-3)


149

Fig. 4. Effect of temperature pre-treatment (26 and 6°C) and sucrose concentration in medium (3 and 4.5%) on carbohydrates uptake (sucrose, glucose and fructose) during 15 days of culture in winter wheat cv. Almari cell suspension culture. Curves representing: concentration (mg⋅dm-3) of: sucrose (-�-), glucose (-�-) and fructose (-�-). Means from 4 replicates ± standard errors

Rys. 4. Wpływ wstępnego traktowania temperaturą (26 i 6°C) i stęŜena sacharozy w poŜywce (3 i

4,5%) na pobieranie węglowodanów (sacharoza, glukoza i fruktoza) w czasie 15 dni kultury zawiesiny komórkowej pszenicy ozimej odm. Almari. Krzywe reprezentują stęŜenie (mg⋅dm-3): sacharozy (-�-), glukozy (-�-) i fruktozy (-�-). Średnie pocho-dzą z 4 powtórzeń ± błąd standardowy

Effect on cell morphology

We suggest that embryogenic culture should comprise small cells, isodiametric, of a sphere-like shape. It was in agreement with PAVLOVA, KORDYUM [1996]. The stimulatory effect of low temperature treatment and increased concentration of sucrose could be visible as a decrease of cell area and increase of their circularity, towards the value of 1.0. In Fig. 1c small, embryogenic (E) and elongated, non-embryogenic cells (NE) are visible. The low temperature treatment of cultures, independently of sucrose concentration in the medium, caused the decrease of cell area (Fig. 3). The similar effect was observed in the studies on winter rape performed by EGIERSZDORFF and KACPERSKA [2001]. Also KARIMZADEH et al. [2000] reported that cell area of winter wheat was smaller in tissues that were treated by low temperature as compared to that in the control. Cells of these tissues accumulated a higher amount of proteins. In our experiment the highest decrease of cell area was observed on 7th day of culture, when the proliferation of cells was the faster (Fig. 2 and 3). During that time the cell area assigned 27-35 µm2 and their circularity was about 0.6. Between 11th and 15th day of culture cell area was at the similar level that on the 7th day, however, circularity slightly decreased. At this time, number of cells in the cell suspension culture treated by a low temperature in comparison to 26°C, increased 5.6 and 3.7-fold for cultures grown in the medium containing 3 and 6% of sucrose, respectively. For the suspension treated as control (3% sucrose, 26°C), the decrease of cell area in value 32-34 µm2, was assigned on 4th day of culture. It was earlier than for the remaining objects, when it took place on 7th day (Fig. 3). During further culture, at 26°C, with 3 and 4.5% of sucrose, the area of cells increased up to 1.7 and 1.2-fold, respectively, as compared to cells treated with low temperature. While on 15th day of culture cell area increased for 3% sucrose and 6°C, a decrease was observed again for 4.5% sucrose at 6°C. TSUGAVA and SUZUKI [2000], observed a high frequency of plant regeneration from the suspension cultured rice cells after preservation of callus tissue at a low temperature. Probably a low temperature acted as stress in the culture and mobilised the metabolic activity of cells. In our experiment, a higher concentration of sucrose in the medium stimulated the differentiation of cells in a stationary phase of culture (less cell area and higher circularity) even after the not optimal temperature growth conditions. Similarly, FELLERS at al. [1995], reported that in a suspension culture of wheat, a greater number of regenerated plants was obtained when a callus, as a source of cell suspension, was grown on 6% of sucrose in the medium. Effect on carbohydrates uptake

It was noticed for all cultures, that sucrose hydrolysed to glucose and fructose


150

already on 2nd day of culture. The same results were obtained in our previous studies [MARCIŃSKA et al. 2000]. Similarly to that, in the cell suspension culture of Phaseolus vulgaris [BOTHA, O’KENNEDY 1998], the observed sucrose hydrolysis was probably facilitated by an initial decrease in external pH which would ensure the optimum activity of the exogenous acid invertase. The supplement of media with 3% of sucrose during the last passage (day 0), caused a slight, 1.2-fold increase of it in the medium (Fig. 4). At that time, dependently of treatment, it was noticed also different concentration of glucose and fructose, as a product of very quick sucrose hydrolysis. The cells take up glucose more rapidly from a medium containing both glucose and fructose. It was probably the result of kinetic properties of the membrane transport. For cultures maintained at 26 and 6°C, supplemented with 4.5% of sucrose in the media, 2.8 and 2.0-fold greater amount of glucose and fructose, was observed, respectively in comparison to media containing 3% of sucrose. In cultures pre-treated with low temperature the increase of both hexoses was smaller, it was 1.3-fold, independently of the sucrose concentration. Higher concentration of hexoses after sucrose hydrolysis in the medium was observed in cultures treated with low temperature. A treatment with 3% sucrose and 6°C and the maximum amount of glucose and fructose was 2.5 and 1.3-fold greater, respectively, as compared to 3% sucrose and 26°C. It was assigned on 2nd day of culture. For treatment with 4.5% of sucrose and 6°C, the maximum took place later on 4th day of culture, it was 1.5 and 1.3-fold greater than for glucose and fructose than at 26°C. The treatment with 4.5% sucrose and 26°C caused 1.6 and 1.9-fold increase of glucose and fructose, respectively, the maximum value. After 6°C treatment that increase was lower. It was 1.3 and 1.1-fold for glucose and fructose. Standard concentration of sucrose (3%) caused a more intensive uptake of hexoses from the medium as compared to its higher amount (4.5%). In the control, the entire uptake of hexoses was observed on 11th day. Pre-treatment with higher amount of sucrose and 26°C slowed down the uptake of sugars. A low temperature inhibited the uptake of sugars in media containing 3% or 4.5% of sucrose. The effect of pre-treatment with low temperature and higher concentration of sucrose together provided a summarised inhibition of uptake of sugars till 4th day of culture. After that time the cells started to uptake hexoses, especially glucose. On the 15th day of culture, when the cells reached the stationary phase, the uptake was stopped and even slightly decreased (Fig. 4). In the studies by EBRAHIM et al. [1999], it was found that hexose uptake systems (for glucose and fructose) of sugarcane suspension cells were also strongly inhibited at a low temperature. Conclusions

Taking the cell suspension growth kinetics for glucose and fructose into account, it is very difficult to explain why the cells took up so little sugar during the first few days of culture. From day 0 onwards the concentration of glucose and fructose exceeded that required for ful saturation the of active transport through membrane and soon reached a level where the diffusion-like uptake took place. A possible explanation is that there was a very low metabolic activity/demand for hexoses, or that the uptake system was only induced after the cell growth and the division had been initiated. It is interesting to note that pre-treatment with a low temperature and higher than standard concentration of sucrose in the medium, stimulated proliferation and differentiation of cells during culture. It was revealed as the changes of cells morphology. Cells reached


151

meristematic-like shape, which is the base of totipotent cell culture character. The interaction of low temperature and high concentration of sucrose pre-treatment could be the method to culture cell suspension for a long time. Unfavourable low temperature conditions could be alleviated by a higher amount of sugars in the medium. Its leads to accelerating the hexoses uptake by cells in the culture. References ANBAZHAGAN V.R., GANAPATHI A. 1999. Somatic embryogenesis in cell suspension cul-tures of pigeonpea (Cajanus cajan). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 56: 179-184.

BOTHA F.C., O’KENNEDY M.M. 1998. Carbohydrate utilisation by cell suspension cultures of phaseolus vulgaris. Physiol. Plant. 102: 429-436.

EBRAHIM M.K.H., ZINGSHEIM O., VEITH R., ABOKASSEM E.E.M., KOMOR E. 1999. Sugar uptake and storage by sugarcane suspension cells at different temperatures and high sugar concentrations. J. Plant Physiol. 154: 610-616.

EGIERSZDORFF S., KACPERSKA A. 2001. Low temperature effects on growth and actin cytoskeleton organisation in suspension cells of winter oilseed rape. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 65: 149-158.

FELLERS J.P., GUENZI A.C., TALIAFERRO C.M. 1995. Factors affecting the establishment of embryogenic callus and suspension cultures of wheat (Triticum aestivum L). Plant Cell Rep. 231-237.

HOU B., YU H., TENG S. 1997. Effects of low temperature on induction and differentiation of wheat calluses. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 49: 35-38.

KARIMZADEH G., FRANCIS D., DAVIES S. 2000. Low temperature-induced accumulation of protein is sustained both in root meristems and in callus in winter wheat but not in spring wheat. Annals of Bot. 85: 769-777.

MARCIŃSKA I., FILEK M., BIESAGA-KOŚCIELNIAK J., NIEMCZYK E., SAGI F. 2000. Changes of carbohydrates level of cell suspension culture derived from immature embryo and inflorescence of wheat (Triticum aestivum L.). Plant Physiol. and Bioch. 38: sup. 32.

MARCIŃSKA I., SZECHYŃSKA M., BIESAGA-KOŚCIELNIAK J., FILEK M. 2001. Applicability of Polish winter wheat (Triticum aestivum L.) cultivars to long-term in vitro culture. Cer. Res. Comm. 29: 127-134.

MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobaco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497.

PAVLOVA M., KORDYUM E. 1996. Somatic embryogenesis in Lolium multiflorum sus-pension culture. Acta Soc. Bot. Pol. 65: 43-45.

TSUGAWA H., SUZUKI M. 2000. A low temperature method for maintaining plant rege-neration activity in embryogenic callus of rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Rep. 19: 371-375.

VASIL V., REDVAY F., VASIL I.K. 1990. Regeneration of plants from embryogenic suspen-sion culture protoplasts of wheat (Triticum aestivum L.). Biotechnology 8: 429-434. Key words: carbohydrates, cell morphology, low temperature, suspension, wheat


152

Summary

Wheat Triticum aestivum L. cell suspension cultures of were used to investigate the effect of a low temperature and the higher than standard sucrose concentration pre-treatments on carbohydrate (sucrose, fructose and glucose) contents in medium as a result of changed growth kinetics of cells and their morphology. Two month-old cell suspensions, maintained at 26°C and supplemented with 3 or 4.5% sucrose, were transferred to 6-10°C for 14 days before returning to 26°C. The data obtained were calculated as a result of interaction between a short-term low temperature and higher then standard concentration of sucrose in the medium pre-treatment in the cell suspension culture. Low temperature and a higher sucrose concentration in the growth medium slowed down the percentage increase of the cell number and dry mass of suspension culture. A slower uptake of fructose and glucose was accompanied by this effect. It was found, however, that a low temperature improved the differentiation frequency of cells, revealed as a decrease of their area and the increase of circularity of individual cells. A higher sucrose concentration in the medium protected cells against the disadvantageous causing stress low temperature treatment. It makes possible to maintain cells in the suspension culture for a long time and to preserve cells as a bank for using them in further studies. WSPÓŁDZIAŁANIE NISKIEJ TEMPERATURY I STRESU OSMOTYCZNEGO W CZASIE WZROSTU I RÓśNICOWANIA ZAWIESINY KOMÓRKOWEJ PSZENICY (Triticum aestivum L.) Izabela Marcińska, Jolanta Biesaga-Kościelniak, Maria Filek, Marta Pilipowicz, ElŜbieta Niemczyk Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polskiej Akademii Nauk, Kraków Słowa kluczowe: morfologia komórki, niska temperatura, pszenica, węglowodany,

zawiesina komórkowa Streszczenie

Badano efekt współdziałania niskiej temperatury i podwyŜszonego stęŜenia sacharozy na wzrost i róŜnicowanie zawiesiny komórkowej pszenicy ozimej (Triticum aestivum L.). Określano morfologię komórek zawiesiny i zawartość węglowodanów (sacharoza, glukoza i fruktoza) w 18 dniowym cyklu hodowlanym, jako następczy efekt okresowego traktowania chłodem w obecności wyŜszego stęŜenia sacharozy. Do badań wykorzystano 2-miesięczną zawiesinę komórkową pszenicy odm. Almari. Zawiesinę komórkową, hodowaną w temp. 26°C, w ciemności, w płynnej poŜywce wg MURASHIGE i SKOOG [1962] zawierającej 3 lub 4,5% sacharozy, przenoszono na okres 14 dni do warunków chłodu, czyli 6-10°C, a następnie ponownie do temperatury 26°C. Wyniki obserwacji odnoszono do współdziałania obu zastosowanych czynników. Okresowe przetrzymywanie zawiesiny komórkowej w warunkach niskiej temperatury i podwyŜszonego, w stosunku do standardowego, stęŜenia sacharozy w poŜywce


153

zmniejszało gęstość i suchą masę zawiesiny komórkowej. W czasie dalszej kultury towarzyszyło temu spowolnione pobieranie fruktozy i glukozy z poŜywki. JednakŜe niska temperatura powodowała stymulację róŜnicowania komórek, co objawiało się obniŜaniem się powierzchni przekroju i większą sferycznością pojedynczych komórek. WyŜsze stęŜenie sacharozy w poŜywce stanowiło takŜe barierę ochronną dla komórek przebywających w niskiej temperaturze. Stwarza to moŜliwość do przetrzymywania kultury zawiesiny komórkowej w niskiej temperaturze przez dłuŜszy okres czasu i wykorzystania takiej kultury jako banku komórek do dalszych badań. Doc. dr hab. Izabela Marcińska Zakład Biotechnologii Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polska Akademia Nauk ul. Niezapominajek 21 30-239 KRAKÓW

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 155-161 WPŁYW KWASU ABSCYSYNOWEGO ORAZ ŚWIATŁA NA WZROST I ROZWÓJ ZARODKÓW SOMATYCZNYCH TULIPANA (Tulipa gesneriana L.) Małgorzata Maślanka, Anna Bach Katedra Roślin Ozdobnych, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp

Tulipany naleŜą do waŜnych gospodarczo ozdobnych roślin cebulowych. Swoją popularność zawdzięczają walorom dekoracyjnym oraz wszechstronnością zastosowania. Rośliny te odznaczają się niskim współczynnikiem rozmnaŜania, dlatego wciąŜ poszukuje się nowych, wydajnych metod ich otrzymywania, a tym samym obniŜenia kosztów uprawy. Tradycyjny wegetatywny sposób rozmnaŜania tulipanów to bardzo powolny proces, a wprowadzenie nowej odmiany do produkcji zajmuje 25 lat [DE HERTOGH, LE NARD 1993]. Kultury in vitro poprzez procesy organogenezy oraz somatycznej embriogenezy stwarzają moŜliwość znacznego skrócenia tego okresu [GUDE, DIJKEMA 1997]. Opracowane do tej pory metody somatycznej embriogenezy nie pozwalają na pozyskiwanie zarodków o zadowalającej jakości [BACH, PTAK 2001].

Celem niniejszej pracy było określenie wpływu kwasu abscysynowego (ABA) na dojrzewanie i konwersję somatycznych zarodków tulipana. ABA znany jest nie tylko jako inhibitor wzrostu, ale takŜe jako związek wspomagający dojrzewanie zarodków somatycznych [WILHELM i in. 2004]. Materiał i metody

Doświadczenie przeprowadzono w Katedrze Roślin Ozdobnych Akademii Rolniczej w Krakowie. W tym celu wykorzystano cebule tulipanów odmian: Apeldoorn (naleŜących do grupy mieszańców Darwina) i Rosy Wing (pojedyncze późne) o obwodzie 11-12 cm. Cebule poddano 12-tygodniowemu chłodzeniu. Zdezynfekowane słupki, wyizolowane z cebul, cięto na 1-2 mm eksplantaty i wykładano na poŜywki do szalek Petriego. PoŜywki inicjalne zawierały sole mineralne według MURASHIGE i SKOOG [1962], 3% sacharozy oraz regulatory wzrostu: Picloram (25 i 50 µM) i BAP (0,25-10 µM). Kultury trzymano w ciemności, w 20°C i pasaŜowano na świeŜe poŜywki w odstępach 4-tygodniowych. Tworzący się Ŝółty, globularny kalus przenoszono następnie na poŜywkę ze zmniejszoną zawartością regulatorów wzrostu, w celu formowania i rozwijania zarodków somatycznych, zgodnie z procedurą według BACH i PTAK [2002].

Somatyczne zarodki w fazie statudium torpedy, długości 5-10 mm, odejmowano od kalusa embriogenicznego i umieszczano po 5 na poŜywce wzbogaconej o ABA w stęŜeniu 10 µM. Po tygodniu przenoszono je na poŜywkę zawierającą regulatory: NAA

M. Maślanka, A. Bach

156

i BAP (w stęŜeniu 0,25 i 2,5 µM) w celu dojrzewania i konwersji do roślin. W drugim, dziesięciotygodniowym etapie doświadczenia część zarodków hodowano w ciemności a część na świetle. Po tygodniu działania ABA zmierzono masę i długość zarodków oraz oceniono zawartość suchej masy. Po 11 tygodniach od inicjacji doświadczenia obserwacje wzbogacono jeszcze o stopień deformacji zarodków oraz o ich przeŜywalność. Doświadczenie wykonano w pięciu powtórzeniach.

Wyniki doświadczenia opracowano statystycznie za pomocą metody analizy wariancji, zaleŜnie od danych, w układzie dwu- lub trzyczynnikowym, z zastosowaniem testu Duncana. Oceny istotności róŜnic pomiędzy średnimi dokonano przy uwzględnieniu poziomu istotności α = 0,05. Wyniki i dyskusja

Wykazano, Ŝe ABA hamował przyrost świeŜej masy zarodków oraz ich długość w porównaniu z kontrolą. Jego wpływ dało się zauwaŜyć zarówno po tygodniu kultury, jak i po kolejnych dziesięciu tygodniach, podczas których zachowanie się zarodków było następstwem jego wcześniejszego działania (tab. 1-4). Po tygodniu kultury pod wpływem ABA, odnotowano istotnie mniejszy przyrost świeŜej masy zarodków (tab. 1). Tabela 1; Table 1 Wpływ ABA na przyrost świeŜej masy zarodków (współczynnik przyrostu świeŜej masy GV*) Effect of ABA on the weight of the embryos (weight increase factor the GV*)

Odmiana; Cultivar

PoŜywka; Medium

Ciemność; Darkness

Apeldoorn

5 µM Pic, 1 µM BAP

0,474 c**

5 µM Pic, 1 µM BAP, 10 µM ABA

0,12 a

Rosy Wing


0,242 b


0,11 a

*GV = mk-mp/mp (mk - masa końcowa; final weight; mp - masa początkowa; initial weight) ** średnie oznaczone tymi samymi literami nie róŜnią się istotnie na poziomie istotności α = 0,05; means

marked with the same letter do not differ significantly at the significance level α = 0.05 Przyrost długości zarodków pod wpływem ABA był takŜe mniejszy, choć róŜnice między średnimi z doświadczenia i kontroli nie były istotne, a w przypadku zarodków odmiany Apeldoorn tygodniowe działanie ABA przyczyniło się nawet do nieznacznego wzrostu ich długości (tab. 2, 4). WILSON i in. [1999] uzyskał podobne wyniki u zarodków Picea abies. Wykazał on, Ŝe długość zarodków poddanych działaniu ABA maleje wraz ze wzrostem jego stęŜenia w poŜywce. Pod wpływem egzogennego ABA stwierdzono równieŜ słabszy wzrost eksplantatów słupkowych tulipana [KAWA, SANIEWSKI 1986]. Biorąc pod uwagę czynnik światła, istotnie mniejszy przyrost długości oraz świeŜej masy zarodków odnotowano w ciemności, ale tylko w przypadku odmiany Apeldoorn, zarówno u zarodków poddanych wcześniej działaniu ABA jak i kontrolnych. U odm. Rosy Wing światło nie miało wpływu na omawiane cechy (tab. 3, 4). Tabela 2; Table 2 Wpływ ABA na przyrost długości zarodków (mm) Effect of ABA on length of the embryos (mm)

WPŁYW KWASU ABSCYSYNOWEGO ORAZ ŚWIATŁA NA WZROST I ROZWÓJ ...

157

Odmiana; Cultivar

PoŜywka; Medium

Ciemność; Darkness

Apeldoorn


0,48 ab


0,68 b

Rosy Wing


0,56 ab


0,1 a

Objaśnienia: patrz tabela 1; Explanations: see Table 1 Tabela 3; Table 3 Następczy wpływ ABA na przyrost świeŜej masy zarodków (współczynnik przyrostu świeŜej masy GV*) Post-treatment effect of ABA on weight of the embryos (weight increase factor the GV*)

Odmiana; Cultivar

PoŜywka; Medium Ciemność; Darkness

Światło; Light

Apeldoorn

2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA

4,042 b

16,158 d

2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA***

3,492 ab

9,804 c

Rosy Wing


2,268 ab

2,204 ab

2,5 µM BAP, 0,25 µM NAA***

0,956 a

0,708 a

*GV = mk-mp/mp (mk - masa końcowa; final weight; mp - masa początkowa; initial weight) ** średnie oznaczone tymi samymi literami nie róŜnią się istotnie na poziomie istotności α = 0,05; means

marked with the same letter do not differ significantly at the significance level α = 0.05 *** po wcześniejszym zastosowaniu ABA; after ABA treatment Tabela 4; Table 4 Następczy wpływ ABA na przyrost długości zarodków (mm) Post-treatment effect of ABA on the length of the embryos (mm)

Odmiana; Cultivar


Światło; Light

Apeldoorn


8,96 bc

15,76 d


5,44 ab

11,94 cd

Rosy Wing


4,78 ab

4,36 ab

2,5 µM BAP, o,25 µM NAA

1,44 a

1,6 a

Objaśnienia: patrz tabela 3; Explanations: see Table 3 Ze względu na identyczność warunków doświadczenia, którym poddano obie odmiany tulipanów moŜna przypuszczać, Ŝe reakcja zarodków na światło zaleŜy od genotypu rośliny. Zawartość suchej masy zarodków wskazała, Ŝe pod wpływem ABA pobierały one mniej wody z poŜywki. ABA zmniejszał więc uwodnienie zarodków. Mniejsza ilość wody w zarodkach zwiększa ich tolerancję na suszę i daje moŜliwość ich długo-trwałego mroŜenia. Zjawisko to przedstawione zostało przez SHIOTA i in. [1999] w doświadczeniu z zarodkami somatycznymi marchwii, których desykacja była moŜliwa po zastosowaniu egzogennego ABA. Według WILHELM i in. [2004], zawartość wody w komórkach jest waŜnym czynnikiem wpływającym na proces dojrzewania, a tym samym produkcję wysokiej jakości zarodków somatycznych dębu. Do większego uwodnienia zarodków przyczyniło się natomiast światło, ale tylko w przypadku odmiany Apeldoorn. Pod wpływem światła stwierdzono takŜe większy procent zdeformowanych zarodków (maksymalnie o 48%), z wyjątkiem zarodków odmiany Rosy Wing, dla których mniej korzystna w tym przypadku była ciemność (tab. 5).


158

Według WILHELM i in. [2004], ABA zapobiega formowaniu nienormalnych struktur zarodka. W naszym doświadczeniu natomiast ABA nie wpłynął istotnie na deformacje zarodków obu odmian (tab. 5). Pod wpływem światła wszystkie zarodki Apeldoorn uległy zazielenieniu. W przypadku odm. Rosy Wing wybarwiło się zaledwie 28% zarodków po zastosowaniu ABA i 62% w kontroli. VEISSEIRE i in. [1994] sugeruje hamujący wpływ ABA na zazielenienie „torped” Hevea brasiliensis. Stwierdzenia tego nie moŜna jednak odnieść do zarodków odmiany Apeldoorn. Być moŜe róŜnice między odmianami wynikają z ich przynaleŜności do innych grup tulipanów. Odmiana Rosy Wing, naleŜąca do tulipanów pojedynczych późnych, później rozpoczyna wegetację w porównaniu z odmianą Apeldoorn. Tabela 5; Table 5 Następczy wpływ ABA na stopień deformacji zarodków (%) Post-treatment effect of ABA on the malformation of embryos (%)

Odmiana; Cultivar


Światło; Light

Apeldoorn


40 ab

60 bc


20 a

68 c

Rosy Wing


40 ab

55 bc


56 bc

36 ab

Po 11 tygodniach kultury stwierdzono najmniejszą przeŜywalność kontrolnych

zarodków odm. Rosy Wing umieszczonych na świetle, kształtującą się na poziomie 64%. Zarodki tej odmiany w duŜym stopniu uległy nekrozie. PrzeŜywalność pozostałych zarodków, niezaleŜnie od zastosowanego czynnika, nie róŜniła się między sobą istotnie (tab. 6). Tabela 6; Table 6 Następczy wpływ ABA na przeŜywalność zarodków (%) Post-treatment effect of ABA on the survival of embryos (%)

Odmiana; Cultivar


Światło; Light

Apeldoorn


100 b

100 b


100 b

92 b

Rosy Wing


88 b

64 a


100 b

100 b

Objaśnienia patrz tabela 3; Explanations see Table 3

W doświadczeniu zaobserwowano takŜe, Ŝe 40% zarodków odmiany Apeldoorn tworzy pędy, które w przypadku odm. Rosy Wing pojawiły się zaledwie u 4% zarodków.

W tych samych warunkach odnotowano istotne róŜnice w zachowaniu się zarodków obu odmian, co oznaczałoby, Ŝe stopień reakcji somatycznych zarodków na ABA zaleŜy takŜe od ich genotypu.

O jakości zarodków somatycznych decydują nie tylko cechy morfologiczne ale takŜe zawartość wody w komórkach i relacje między ABA a poziomem proliny, wpływające na ich dojrzewanie [WILHELM i in. 2004], dlatego teŜ niezbędne będzie wykonanie podobnych analiz odnośnie badanych zarodków. Wnioski

WPŁYW KWASU ABSCYSYNOWEGO ORAZ ŚWIATŁA NA WZROST I ROZWÓJ ...

159

1. Kwas abscysynowy w kulturach in vitro zmniejsza przyrost świeŜej masy so-matycznych zarodków tulipanów.

2. Kwas abscysynowy zmniejsza uwodnienie zarodków.

3. Zdolność syntezy chlorofilu oraz tworzenia pędów przez somatyczne zarodki tulipanów zaleŜy od ich genotypu.

Literatura BACH A., PTAK A. 2001. Somatic embryogenesis and plant regeneration from ovaries of Tulipa gesneriana L. in vitro cultures. Acta Hort. 560: 391-394.

BACH A., PTAK A. 2002. Nowa metoda mikrorozmnaŜania tulipana (Tulipa gesneriana L.) z tkanek zaląŜni. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 483: 13-19.

DE HERTOGH A., LE NARD M. 1993. The physiology of flower bulbs. Elsevier, Amster-dam-London-New York-Tokyo: 624 ss.

GUDE H., DIJKEMA M.H.G.E. 1997. Somatic embryogenesis in tulip. Acta Hort. 430: 275-300.

KAWA L., SANIEWSKI M. 1986. The effect of gibberellic acid and abscisic acid on tulip pistil growth in vitro. Acta Hort. 177: 129-134.

MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium on the growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: 473-497.

SHIOTA H., TACHIBANA K., WATABE K., KAMADA H. 1999. Successful long-term preserva-tion of abscisic-acid-treated and desiccated carrot somatic embryos. Plant Cell Reports 18: 749-753.

VEISSEIRE P., LINOSSIER L., COUDRET A. 1994. Effect of abscisic acid and cytokinins on the development of somatic embryos in Hevea brasiliensis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 39: 219-223.

WILHELM E., PREWEIN CH., VAGNER M. 2004. Water status and physiological parameters in relation to oak somatic embryo quality and germination ability. COST 843: 37-38. Abstracts. Quality Enhancement of Plant Production through Tissue Culture. Saanen, Switzerland 2004.

WILSON G., HUNTER CH., MOYLAN E. 1999. Effect of abscisic acid on maturation and growth of somatic embryos of Picea abies. Abstracts of the Sixth Annual Meeting of the Working Group. Czech Republic 1999, COST 822: 32-33. Słowa kluczowe: tulipan, somatyczna embriogeneza, somatyczne zarodki, kwas

abscysynowy Streszczenie

Somatyczne zarodki tulipana odmian Apeldoorn i Rosy Wing, w stadium torpedy, poddano tygodniowemu działaniu kwasu abscysynowego. Większość zarodków na obecność ABA w poŜywce zareagowała mniejszym przyrostem długości (o 24-82% w zaleŜności od warunków kultury) oraz mniejszym przyrostem świeŜej masy (o 14-75%) w porównaniu z kontrolą. Sucha masa zarodków wskazuje, Ŝe pod wpływem ABA pobierały one mniej wody z poŜywki. Światło przyczyniło się do większego


160

uwodnienia zarodków (zarówno z kontroli jak i po ABA) ale tylko w przypadku odmiany Apeldoorn. Na świetle, zielone zarodki odmiany Apeldoorn wykazały blisko dwukrotnie większy przyrost długości oraz trzy- i czterokrotnie większy przyrost świeŜej masy, w porównaniu z ciemnością, co stanowi istotną róŜnicę. RóŜnic takich nie odnotowano u odm. Rosy Wing. Pod wpływem światła stwierdzono równieŜ deformacje większości zarodków (maksymalnie o 48%). Ponadto na świetle odnotowano najmniejszą przeŜywalność kontrolnych zarodków odm. Rosy Wing, kształtującą się na poziomie 64%. Po 11 tygodniach od załoŜenia doświadczenia, zaobserwowano tworzenie pędów, głównie przez zarodki odmiany Apeldoorn. Zarodki somatyczne odmiany Rosy Wing charakteryzują się mniejszą zdolnością tworzenia pędów i syntezy chlorofilu oraz mniejszą Ŝywotnością w porównaniu z zarodkami odmiany Apeldoorn. EFFECT OF ABSCISIC ACID AND LIGHT ON THE GROWTH AND DEVELOPMENT OF TULIP (Tulipa gesneriana L.) SOMATIC EMBRYOS Małgorzata Maślanka, Anna Bach Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków Key words: tulip, somatic embryogenesis, somatic embryos, abscisic acid Summary

Somatic embryos of tulip, cvs Apeldoorn and Rosy Wing at the torpedo stage were treated with abscissic acid for one week. The growth regulator contained in the medium had an influence on the majority of embryos. Their length was much lower (about 24-82% depending on the culture conditions) in comparison with the control. Moreover, their weigth was also lower (about 14-75%) in comparison with non-treated ABA embryos. Under the influence of ABA, the embryos did uptake so much water from the medium, which was indicated by the dry weight. In case of cv. Apeldoorn, the light enhanced the hydration of embryos, both ABA treated and non-treated ones. In light, the green embryos increased nearly twice in length and three to four times in weight than the embryos from darkness. It is a significant difference. Such differences were not noticed in the case of cv. Rosy Wing. Under the influence of light, the majority of embryos increased their malformation (max. 48%). What is more, in the same culture condition, the viability was the lowest in the case of non-treated ABA cv. Rosy Wings embryos. This survival rate was at the level of 64%. After 11 weeks of in vitro culture first shoots appeared. Most of these shoots came from cv. Apeldoorn. Somatic embryos of cv. Rosy Wing in comparison with embryos of cv. Apeldoorn showed a lower ability of forming shoots, chlorophyll synthesis and the lower viability. Mgr inŜ. Małgorzata Maślanka Katedra Roślin Ozdobnych Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja Al. 29 Listopada 54 31-425 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 163-168 ROLA WĘGLA AKTYWOWANEGO I BENZYLOAMINOPURYNY W MIKROROZMNAśANIU OBUWIKA POSPOLITEGO Anna Pindel

Katedra Botaniki, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp

Liczne prace donoszą o efektywnym mikrorozmnaŜaniu tropikalnych gatunków storczyków poprzez kalus lub protokormopodobne struktury (PLB), lecz bardzo niewiele jest doniesień o skutecznym rozmnaŜaniu in vitro gatunków Cypripedium, jednego z bardziej niezwykłych i znoszących klimat północny rodzaju storczykowatych. Rodzaj Cypripedium, obok innych z podrodziny Cypripedioideae, jest zaliczany do trudnych w kulturach in vitro [ARDITTI, ERNST 1993]. Nasz najokazalszy z rodzimych gatunków storczykowatych Cypripedium calceolus L., jak wszystkie pozostałe z tej rodziny, objęty jest ścisłą ochroną. MoŜliwość regeneracji in vitro mogłaby ograniczyć pozyskiwanie tych atrakcyjnych roślin ze stanowisk naturalnych do amatorskich ogrodów.

Dość często w kulturach in vitro stosowany jest węgiel aktywowany (AC), jakkolwiek jego dokładne działanie i funkcja nie są szerzej poznane. AC dzięki ogromnej wewnętrznej powierzchni moŜe adsorbować wiele substancji. Znane są doniesienia o stymulującym wpływie na somatyczną embriogenezę, androgenezę, ukorzenianie, wydłuŜanie pędów i formowanie cebul, stabilizację kultur protoplastów, czy ograniczanie ciemnienia poŜywki i/lub eksplantatów [MOHAMED-YASSEEN i in. 1993, 1994, 1995; TEIXEIRA i in. 1994; KUNITAKE i in. 1995]. Adsorbuje równieŜ regulatory wzrostu, toksyczne metabolity i wydzieliny [FRIDBORG, ERIKSSON 1975; FRIDBORG i in. 1978; EBERT, TAYLOR 1990]. Stymulujący efekt AC moŜe polegać na nieodwracalnej adsorpcji inhibitorów, toksycznych metabolitów (zwłaszcza fenoli), a uwalnianiu naturalnych stymulujących substancji zawartych w AC. Ale proces ten wciąŜ nie jest jasny. JOHANSSON i in. [1990] uwaŜają, Ŝe AC moŜe stopniowo uwalniać zaabsorbowane produkty pokarmowe i regulatory wzrostu, które stają się dostępne dla roślin.

W niniejszej pracy badano wpływ wzajemnej korelacji pomiędzy dawką AC i cytokininy 6-benzyloaminopuryny (BA) w poŜywce na powstawanie PLB na eks-plantatach inicjalnych obuwika pospolitego. Materiał i metody

Eksplantaty pobrano 20.06.2005 roku z niedojrzałych, zielonych torebek nasiennych obuwika pospolitego (Cypripedium calceolus L.) około 10 dni po prze-kwitnięciu (fot. 1), czyli w momencie osiągnięcia maksymalnej wielkości przy za-chowaniu jeszcze częściowo Ŝywych tkanek budujących owocnię. Po rutynowej powierzchniowej sterylizacji torebki cięto poprzecznie na ok. 0,5-1,0 mm talarki

A. Pindel

164

i układano płasko na poŜywce zachowując układ eksplantatu taki jak w owocu tzn. nasadową częścią do podłoŜa. Po 10 takich eksplantatów umieszczano w kolbce z poŜywką wg Murashige i Skoog (MS) zestaloną 0,2% PhytagelemTM o zróŜnicowanej zawartości CA i BA przy stałej zawartości auksyny NAA - 0,3 mg⋅dm-3 (tab. 1). Kultury prowadzono w fitotronie przy słabym oświetleniu lampami fluorescsncyjnymi (30-40 µmol⋅m-2

⋅s-1) na 16 godzinnym fotoperiodzie. Doświadczenie powtórzono po tygodniu.

Fot. 1. Torebki nasienne obuwika pospolitego Photo 1. The capsules of lady’s slipper orchid

Wyniki obliczano po 3, 6 i 12 miesiącach, przyjmując za pozytywną odpowiedź morfogenetyczną eksplantatu, gdy średnio przynajmniej 2 protostruktury PLB przypadały na jeden wyłoŜony eksplantat - oznaczenie „++”, gdy średnio tworzyła się tylko 1 taka struktura/eksplantat oznaczano pojedynczym znakiem „+”, w przypadku mniejszej liczby oznaczano „-” (tab. 1).

Analizę histologiczną tworzących się struktur przeprowadzono na ultracienkich skrawkach materiału utrwalonego aldehydem glutarowym i zatopionym w Eponie. Wyniki i dyskusja

Wywołanie odpowiedzi morfogenetycznej w kulturach obuwika trwało bardzo długo, w porównaniu do innych tego typu kultur, co stwierdzono juŜ we wcześniejszych badaniach [PINDEL, PINDEL 2004]. Po około 6 miesiącach w niektórych obiektach (tab. 1) zaczęły się pojawiać widoczne gołym okiem białe struktury, średnicy około 1 mm. Powstawały one z nie do końca jeszcze zidentyfikowanych - badania w toku - komórek owocni (miękiszu i/lub łoŜyska). Po kolejnych 6 miesiącach na poŜywce zawierającej 1 mg⋅dm-3 BA i 0,1% AC rozwijały się one w protokormo-podobne struktury (w li-teraturze określane jako PLB - protocorm-like body) wielkości 3-4 mm.

ROLA WĘGLA AKTYWOWANEGO I BENZYLOAMINOPURYNY ...

165

Tabela 1; Table 1 Wpływ AC i BA na morfogenezę eksplantatów obuwika pospolitego na poŜywce MS z 0,3 mg⋅dm-3 NAA; Effect of AC and BA on morphogenesis of Cypripedium calceolus L. explants on MS medium with the addition of 0.3 mg⋅dm-3 NAA

BA (mg⋅dm-3)

AC (%)

Zmiany morfogenetyczne/czas trwania kultury

Morphogenetic response/ time of culture

3 miesiące 3 months

6 miesięcy 6 months

12 miesięcy 12 months

0,0 (kontrola; control)

0,0

-

-

-

1,0

0,0

-

-

-

2,0

0,0

-

-

-

5,0

0,0

-

-

-

1,0

0,1

-

++

PLB

2,0

0,1

-

++

++

5,0

0,1

-

++

+

część zamarła part of them dead

1,0

0,2

-

+

zamarły; dead

2,0

0,2

-

-

-

5,0

0,2

-

-

-

- średnio mniej niŜ 1 PLB/eksplantat; mean less than 1 PLB/explant + średnio 1 PLB/ekspntat; mean 1 PLB/explant ++ średnio 2 lub więcej PLB na eksplantat; mean 2 or more PLB/explant

WyŜsze z zastosowanych stęŜeń BA (2 i 5 mg⋅dm-3) przy tej samej zawartości AC wprawdzie inicjowały początkowy rozwój eksplantatów, ale zatrzymywał się on na tym etapie. Przy braku AC w poŜywce, bez względu na zawartość BA, eksplantaty ciemniały. Obserwowano równieŜ wokół nich brązowy naciek na poŜywce.

W kulturach in vitro storczyków, generalnie z dobrym skutkiem, dodaje się do poŜywek węgla aktywowanego. W zaleŜności od gatunku stosuje się dawki od 0,5 [PARK i in. 2002], 1,0 [LEE, LEE 2003], do nawet 5 g⋅dm-3 poŜywki [MOHAMED-YASSEN 2001]. AC powinien być obecny juŜ na etapie inicjalnym, choć niektórzy badacze dodawali go dopiero do poŜywek w drugim etapie kultury, tzn. podczas procesu regeneracji roślin z PLB [PARK i in. 2002]. W doświadczeniach z innymi gatunkami storczykowatych w większości przypadków stosowaną cytokininą była równieŜ BA. W pracy HAHNA i PEAKA [2001] najlepsze wyniki przy regeneracji cymbidium uzyskano na takiej samej poŜywce jak w niniejszej pracy, tzn. MS z 1,0 mg⋅dm-3 BA + 0,1% CA.

Wykorzystanie torebek nasiennych daje moŜliwość otrzymania wielu eks-plantatów wyjściowych (nawet ponad 30 z 1 torebki), co ma niebagatelne znaczenie, biorąc pod uwagę trudności z pozyskiwaniem materiału wyjściowego, związane równieŜ z przepisami dotyczącymi ochrony gatunkowej.

Preparaty anatomiczne (fot. 2) wykazały, Ŝe zaczęły się róŜnicować pierwsze elementy tkanki przewodzącej, a w peryferyjnych komórkach PLB gromadziły się znaczne ilości skrobi. Świadczyć to moŜe o początkach formowania pędowych primordiów [ŠAMAJ i in. 1997].

A. Pindel

166

Fot. 2. Przekrój poprzeczny przez PLB na eksplantacie obwika pospolitego (powiększenie

34 x) Photo 2. Transverse section of PLB on explants of Cypripedium calceolus (x 34)

W warunkach naturalnych nasiona obuwika kiełkują i rozwijają się w roślinę bardzo wolno, pierwszy liść pojawia się dopiero w piątym roku. Dzięki metodom kultur tkankowych moŜna by znacznie skrócić ten okres. Jednak mikrorozmnaŜanie tego storczyka jest trudne. Nadzieje budzić mogą efekty prac prowadzonych z takimi gatunkami jak: Cypripedium formosanum [LEE, LEE 2003], C. macranthos odm. Rebunense [SHIMURA, KODA 2004] oraz C. flavum [YAN i in. 2006]. Wnioski 1. Obecność węgla aktywowanego (AC) w poŜywce inicjalnej zapobiega ciem-

nieniu eksplantatów obuwika pospolitego.

2. Skuteczna jest juŜ zawartość 100 g AC w dm3 poŜywki.

3. Protokormo-podobne struktury obserwowano na poŜywce MS z 0,3 mg⋅dm-3 NAA, 1,0 lub 2,0 mg⋅dm-3 BA oraz 0,1% CA.

Literatura ARDITTI J., ERNST R. 1993. Micropropagation of orchids. New York: John Wiley & Son, Inc.: 434-466.

EBERT A., TAYLOR H.F. 1990. Assessment of the changes of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid concentrations in plant tissue culture media in the presence of activated charcoal. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 20: 165-172.

FRIDBORG G., ERIKSSON T. 1975. Effects of activated charcoal on growth and morpho-genesis in cell cultures. Physiol. Plant. 34: 306-308.

ROLA WĘGLA AKTYWOWANEGO I BENZYLOAMINOPURYNY ...

167

FRIDBORG G., PEDERSEN M., LANDSTRÖM L-E., ERIKSSON T. 1978. The effect of activated charcoal on tissue cultures: adsorption of metabolites inhibiting morphogenesis. Physiol. Plant. 43: 104-106.

HAHN E-J., PEAK K-Y. 2001. High photosynthetic photon flux and high CO2 concentration under increased number of air exchanges promote growth and photosynthesis of four kinds of orchid plantlets in vitro. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37: 678-682.

JOHANSSON L.B., CALLEBERG E., GEDIN A. 1990. Correlations between activated charcoal, Fe-EDTA and other organic media ingredients in cultured anthers of Anemone canadensis. Physiol. Plant. 80: 243-249.

KUNITAKE H., NAKASHIMA T., MORI K., TANAKA M., MII M. 1995. Plant regeneration from mesophyll protoplasts of Lisanthus (Eustoma grandiflorum) by adding activated charcoal into protoplast culture medium. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 43: 59-65.

LEE Y-I., LEE N. 2003. Plant regeneration from protocorm-derived callus of Cypripedium formosanum. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 39: 475-479.

MOHAMED-YASSEEN Y. 2001. Influence of agar and activated charcoal on uptake of gibberellin and plant morphogenesis in vitro. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37: 204-205.

MOHAMED-YASSEEN Y., BARRINGER S.A., SCHNELL R.J., SPLITTSTOESSER W.E. 1995. In vitro shoot proliferation and propagation of guava (Psidium guajava L.) from germinated seedlings. Plant Cell Rep. 14: 525-528.

MOHAMED-YASSEEN Y., SPLITTSTOESSER W.E., LITZ R. 1993. In vitro bulb formation and plant recovery from onion inflorescences. Hort. Science 28: 1052.

MOHAMED-YASSEEN Y., SPLITTSTOESSER W.E., LITZ R. 1994. In vitro shoot proliferatio-nand production of sets from garlic and shallot. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 36: 243-247.

PARK S-Y., MURTHY H.N., PAEK K-Y. 2002. Rapid propagation of Phalaenopsis from floral stalk-derived leaves. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 38: 168-172.

PINDEL A., PINDEL Z. 2004. Initiation of in vitro cultures of chosen endangered European species of orchids. Folia Hort. 16: 111-117.

ŠAMAJ J., BOBAK M., OVEČKA M., BLEHOVA A., PRETOVA A. 1997. Structural features of plant morphogenesis in vitro. Veda Bratislava: 122 ss.

SHIMURA H., KODA Y. 2004. Micropropagation of Cypripedium macranthos var rebune-nse through protocorm-like bodies derived from mature seeds. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 78: 273-276.

TEIXEIRA J.B., SONDAHL M.R., KIRBY E.G. 1994. Somatic embryogenesis from immature inflorescences of oil palm. Plant Cell Rep. 13: 247-250.

YAN N., HU H., HUANG J-L., XU K., WANG H., ZHOU Z-K. 2006. Micropropagation of Cypripedium flavum through multiple shoot of seedlings derived from mature seeds. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84: 113-117. Słowa kluczowe: Cypripedium calceolus L., eksplantat, struktury protokormo-po-

dobne (PLB) Streszczenie

Badano zdolność morfogenetyczną eksplantatów pochodzących z niedojrzałych torebek nasiennych obuwika pospolitego (Cypripedium calceolus L.) na poŜywkach o

A. Pindel

168

zróŜnicowanej zawartości benzyloaminopuryny (BA) i węgla aktywowanego (AC). Powstawanie protokormo-podobnych struktur (PLB) obserwowano na poŜywce MS z 1 mg⋅dm-3 BA i 0,1% AC. Ten początkowy etap morfogenezy trwał aŜ 12 miesięcy, obserwacje anatomiczne wykazały jednak, Ŝe został zainicjowany etap róŜnicowania komórek, co daje nadzieję na regenerację pędów. Wykazano jednocześnie, Ŝe brak w podłoŜu AC prowadzi do ciemnienia eksplantatów i poŜywki co w konsekwencji skutkowało zamieraniem kultury. THE ROLE OF ACTIVATED CHARCOAL AND BENZYLAMINOPURINE IN MICROPROPAGATION OF Cypripedium calceolus L. Anna Pindel Department of Botany, Agricultural University, Kraków Key words: slipper orchid, explant, protocorm-like body (PLB) Summary

The morphogenetic ability of Cypripedium calceolus L. explants from green capsules on the medium with different additions of benzylaminopurine (BA) and activated charcoal (CA) were investigated. Protocorm-like bodies were observed on the MS medium with 1 mg⋅dm-3 BA and 0.1% AC after 12 months. The anatomical study showed that the cells are competent to caulogenesis. It was presented heat on the media without charcoal the explants turned brown and died. Dr hab. Anna Pindel Katedra Botaniki Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja al. 29 Listopada 54 31-425 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 169-174 WPŁYW STANU FIZYCZNEGO PODŁOśA NA PRAWIDŁOWOŚĆ ROZWOJU ZARODKÓW SOMATYCZNYCH SZPARAGA OZDOBNEGO Anna Pindel Katedra Botaniki, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp

Na prawidłowość rozwoju zarodków somatycznych, oprócz wielu innych czynników biotycznych i abiotycznych, wpływa w duŜej mierze rodzaj i stęŜenie, stosowanych do zestalania poŜywek, substancji Ŝelujących. „Twardość” poŜywki decyduje o statusie wodnym i dostępności róŜnych składników między innymi kwasu abscysynowego (ABA) i białek wpływających na dojrzewanie zarodków, u niektórych gatunków przez podniesienie stęŜenia agaru ogranicza się zjawisko szklistości. Wiadomo, Ŝe róŜne gatunki w specyficzny sposób reagują na ten czynnik. Podjęto więc próbę zbadania tej zaleŜności u powstających drogą somatycznej embriogenezy zarodków szparaga ozdobnego.

W większości publikacji dotyczących embriogenezy u jednoliściennych autorzy podają tylko stęŜenia stosowanych substancji zestalających, rzadko zwracając uwagę na ich rodzaj [WANG i in. 2002; VIKRANT, RASHID 2003]. Agar jest mieszaniną polisacharydów o duŜej masie cząsteczkowej otrzymywanych z glonów z rodziny Rhodophyceae, z niego produkuje się przez oczyszczanie róŜne firmowe agary (Difco, Oxoid, Agarose) natomiast PhytagelTM jest produktem fermentacji bakterii zachodzącej w kontrolowanych warunkach (gellan gum), jego jakość jest lepsza i jest 2-3 razy „twardszy” od pozostałych [TRIPLETT, JOHNSON 1999].

Celem pracy było zbadanie, czy rodzaj agaru uŜytego do zestalania poŜywek moŜe mieć wpływ na embriogenezę somatyczną u szparaga ozdobnego. Materiał i metody

Wyselekcjonowany fenotypowo jasny, ziarnisty, embriogenny kalus szparaga gęstokwiatowego odmiany Sprengeri (Asparagus densiflorus L.) uzyskany z odcinków (krąŜków) międzywęźli etiolowanych siewek na poŜywce UM [UCHIMIYA, MURASHIGE 1974] z 2,0 mg⋅dm-3 2,4-D oraz 0,25 mg⋅dm-3 kinetyny umieszczano na poŜywce, która inicjowała pierwsze stadia rozwoju zarodków. Skład poŜywki ustalono we wcześniej-szych badaniach [PINDEL 2000]. Była to poŜywka płynna LS z 0,02 mg⋅dm-3 picloramu i 0,2 mg⋅dm-3 BA) [LINSMAIER, SKOOG 1965], na której badano wpływ agarów: Difco, Oxoid (Unipath LTD.) i PhytagelTM (Sigma) zastosowanych w stęŜeniach 0,2-1,0%, a takŜe podłoŜa płynnego na rozwój otrzymywanych drogą embriogenezy pośredniej zarodków somatycznych. Kolbki z eksplantatami w poŜywce płynnej były okresowo wstrząsane (maksymalna amplituda 100).

A. Pindel

170

Wyniki i dyskusja

Wiele gatunków jednoliściennych jest mikrorozmnaŜanych, równieŜ drogą somatycznej embriogenezy, w poŜywkach płynnych. Często jednak otrzymywane tą drogą zarodki charakteryzują się nieprawidłowym rozwojem, a u zregenerowanych roślin obserwowano szklistość. Z drugiej jednak strony zwiększanie stęŜenia agaru wpływa na dostępność nie tylko wody, ale i innych waŜnych składników poŜywki a szczególnie cytokinin [DEBERGH 1983; MOHOMED-YASSEN 2001]. Nie ma jednak jedno-znacznych danych, poniewaŜ róŜne eksplantaty dają róŜną odpowiedź.

W tabeli 1 zestawiono wyniki dotyczące rozwoju zarodków somatycznych szparaga (Asparagus densiflorus ‘Sprengeri’) z embriogennego kalusa na poŜywkach zestalonych agarami, PhytagelemTM oraz w poŜywce płynnej. Tabela 1; Table 1 Rozwój zarodków somatycznych szparaga gęstokwiatowego odm. Sprengeri w zaleŜności od stopnia utwardzenia poŜywki i rodzaju substancji Ŝelującej Development of asparagus Sprengeri cv. somatic embryos depending on the medium hardness and type of gelling agents

Substancja Ŝelująca

Gelling agent

StęŜenie Concen-tration (%)

Prawidłowo rozwijające się zarodki somatyczne Normally developed somatic embryos

(%)

Obserwacje Observations

Agar Difco

0,8

brak; lack

zatrzymany rozwój zarodków w stadium ini-cjalnym the development of embryos is stopped at the initial stage

Agar Oxoid

1,0

brak; lack

jw.; see above

PhytagelTM

0,2 0,3

1,0

50 83

brak; lack

u pozostałych zarodków zakłócony rozwój przez spłaszczenie osi zarodka in some embryos the development is disturbed by flatting embryonal axis zamarły; dead

PoŜywka płynna Liquid medium

0

10

większość silnie wydłuŜonych, często bez plu-muli, liczne wtórne zarodki o nieprawidłowym rozwoju majority with elongated radicula, without plumula pole, the secondary embryos with developmental abnormalities

Z powyŜszych danych (tab. 1) wynika, Ŝe aby otrzymać zarodki szparaga odm.

Sprengeri trzeba uŜyć poŜywek zestalanych PhytagelemTM najlepiej o stęŜeniu 0,3%. Agary Difco, Oxoid, oraz wysokie stęŜenie PhytageluTM nie gwarantują prawidłowego rozwoju. Fotografia 1 ilustruje powstawanie zarodków na poŜywce z Phytagelem TM , niektóre z nich mają nietypowy rozwój, zwłaszcza przy jego 0,2% stęŜeniu. Na to, Ŝe marka handlowa agaru odgrywa waŜną rolę w kulturach in vitro, zarówno juwenilnych jak i dojrzałych roślin, zwrócili uwagę juŜ PIERIK i in. [1997]. W większości prac do stabilizacji poŜywek stałych stosuje się agary głównie Difco, choć wielu autorów nie podaje nazw firm tylko stęŜenia. Agary róŜnią się między sobą zawartością róŜnych związków mineralnych, największe róŜnice dotyczą obecności jonów Ca, K, S i Cu, w agarze Oxoid jest teŜ stosunkowo duŜo azotu [BERUTO i in. 1999]. W połączeniu ze skład-

WPŁYW STANU FIZYCZNEGO PODŁOśA ...

171

nikami poŜywki mogą one wchodzić w pewne interakcje wpływające na rozwój kultury.

Fot. 1. Zarodki somatyczne na poŜywce utwardzonej Phytagelem TM. Strzałką zaznaczony

zarodek o spłaszczonej osi Photo 1. Somatic embryos on PhytagelTM containing medium. Abnormal embryo with flatting

axis indicated by the arrow Tabela 2; Table 2 Stopień uwodnienia zarodków somatycznych szparaga odm. Sprengeri w zaleŜności od rodzaju i stęŜenia substancji Ŝelującej Water content in somatic embryos of asparagus Sprengeri cv. depending on the type and concentration of gelling agents

Substancja Ŝelująca Gelling agent

StęŜenie agaru

Agar concentration (%)

Zawartość wody w zarodkach Water content in embryos

(%)

Agar Difco

0,8

brak zarodków (w embriogennym kalusie 90,1) lack of embryos (in embryogenic tissue 90.1)

Agar Oxoid

1,0

brak zarodków (w embriogennym kalusie 90,1) lack of embryos (in embryogenic tissue 90.1)

PhytagelTM

0,2 0,3 1,0

85,1 84,9

brak zarodków; lack of embryos

PoŜywka płynna Liquid medium

0

88,5

PEREZ-TORNERO i in. [2001] stosowali np. agar Hispanlab. S.A. w stęŜ. 0,7 lub 0,8%

lub Agargel (Sigma) 0,45 lub 0,5% i stwierdzili, Ŝe im wyŜsze stęŜenie tych substancji tym mniej szklistych pędów u moreli, choć zaleŜało to w duŜym stopniu od genotypu. U jednoliściennych np. u Crocus sativus często stosowany jest PhytagelTM [LOSCUTOV i in. 1999], choć VARSHNEY i in. [2000] w kulturach lilii uŜywali 0,8% agaru Quixcel.

RównieŜ w poŜywce płynnej (tab. 1) dojrzewanie zarodków szparaga było zakłócone, być moŜe wstrząsanie przyspieszało wtórną embriogenezę, zanim pierwotny zarodek osiągnął ostateczne stadium rozwoju (fot. 2).

A. Pindel

172

Zawartość wody w zarodkach (tab. 2) była niŜsza niŜ w embriogennym kalusie (o 5,5-5,8%), najmniej uwodnione były zarodki rozwijające się na poŜywce z PhytagelemTM w stęŜeniu 0,3%, czyli na podłoŜu gwarantującym najwyŜszą liczbę prawidłowo rozwijających się zarodków. MoŜna to chyba tłumaczyć jego wysokim stopniem „czystości” i duŜą twardością w porównaniu z innymi agarami.

Fot. 2. WydłuŜone zarodki z poŜywki płynnej Photo 2. Elongated embryos from liquid medium Wnioski 1. PoŜywki płynne, oraz agary Difco i Oxoid nie są przydatne w procesie

embriogenezy somatycznej u szparaga odm. Sprengeri.

2. Najlepiej przebiega rozwój zarodków na poŜywkach zestalonych PhytagelemTM, ale w dość niskich stęŜeniach.

Literatura BERUTO M., BERUTO D., DEBERGH P. 1999. Influence of agar on in vitro cultures. I. Physicochemical properties of agar and agar gelled media. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 35: 86-93.

DEBERGH P.C. 1983. Effects of agar brand and concentration on the tissue culture medium. Physiol. Plant. 59: 270-276.

LINSMAIER E.M., SKOOG F. 1965. Organic growth factor requirements of tobacco cul-tures. Physiol. Plant. 18: 100-127.

LOSCUTOV A.V., BENINGER C.W., BALL T.M., HOSFIELD G.L., NAIR M., SINK K.C. 1999. Optimization of in vitro conditions for stigma-like-structure production from half-ovary explants of Crocus sativus L. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 35: 200-205.

MOHOMED-YASSEN Y. 2001. Influence of agar and activated charcoal on uptake of gibberellin and plant morphogenesis in vitro. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37: 204-205.

WPŁYW STANU FIZYCZNEGO PODŁOśA ...

173

PEREZ-TORNERO O., EGEA J., OLMOS E., BURGOS L. 2001. Control of hyperhydricity in micropropagated apricot cultivars. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37: 250-254.

PIERIK R.L.M., OOSTERKAMP J., MANSCHOT G.A.J. BARTH T., SCHOLTEN H.J. 1997. Agar brand, a dominating factor for shoot growth of juvenile and adult Quercus robur L. ‘Fastigiata” in vitro. Plant Tiss. Cult. and Biot. 3/1: 27-31.

PINDEL A. 2000. Przydatność róŜnych metod in vitro w rozmnaŜaniu szparagów ozdo-bnych. Zesz. Nauk. AR w Krakowie 266: 1-69.

TRIPLETT B.A., JOHNSON D.S. 1999. Adding gelling agents to cotton ovule culture media leads to subtle changes in fiber development. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 35: 265-270.

UCHIMIYA H., MURASHIGE T. 1974. Evaluation of parameters in the isolation of viable protoplasts from cultured tobacco cells. Plant Physiol. 54: 936-944.

VARSHNEY A., DHAVAN V., SRIVASTAVA P.S. 2000. A protocol for in vitro mass propagation of Asiatic hybrids of lily through liquid stationary culture. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 36: 383-391.

VIKRANT, RASHID A. 2003. Somatic embryogenesis from mesocotyl and leaf-base seg-ments of Paspalum scrobiculatum L., a Minor Millet. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 39: 485-489.

WANG Z.Y., SCOTT M., HOPKINS A. 2002. Plant regeneration from embryogenic cell sus-pension cultures of Lolium temulentum. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 38: 446-450. Słowa kluczowe: Asparagus densiflorus L. odm. Sprengeri, embriogeneza, agary Streszczenie

Zarodki somatyczne otrzymywano drogą pośredniej embriogenezy somatycznej z kalusa indukowanego z odcinków międzywęźli siewek szparaga ozdobnego odmiany Sprengeri (Asparagus densiflorus) na poŜywce UM z 2,0 mg⋅dm-3 2,4-D i 0,25 mg⋅dm-3

kinetyny [PINDEL 2000]. Embriogenną tkankę umieszczano na poŜywkach o składzie podstawowym jak w LS z dodatkiem 0,02 mg⋅dm-3 pikloramu i 0,2 mg⋅dm-3 BA: płynnej (okresowo wstrząsanej przy 100 rpm) oraz zestalanych agarem Difco, Oxoid i PhytagelemTM. Obserwowano wpływ róŜnych rodzajów agarów i ich stęŜeń na prawidłowość rozwoju zarodków somatycznych. Stwierdzono, Ŝe PhytagelTM w stęŜeniu 0,3% gwarantował największą liczbę (83%) normalnie rozwiniętych zarodków. THE EFFECT OF MEDIA HARDNESS ON THE ORNAMENTAL ASPARAGUS SOMATIC EMBRYOS DEVELOPMENT Anna Pindel Department of Botany, Agricultural University, Kraków Key words: Asparagus densiflorus L. Sprengeri cv., somatic embryogenesis, gelling

agents Summary

Somatic embryos were obtained via indirect embryogenesis from ornamental

A. Pindel

174

asparagus. Calli were induced from the internodal segments of seedlings Asparagus densiflorus Sprengeri cv. on UM medium with 2.0 mg⋅dm-3 2,4-D and 0.25 mg⋅dm-3 kinetin [PINDEL 2000]. The embryogenic tissues were grown on liquid medium (temporary immersion) on a rotary shaker at 100 rpm and on Agar Difco, Oxoid or Phytagel - solidified LS media with the addition of 0.02 mg⋅dm-3 Picloram and 0.2 mg⋅dm-3 BA.

The differences between the type and concentrations of gelling agents on somatic embryos development were observed. It was concluded that PhytagelTM was very effective for normally development of ornamental asparagus somatic embryos. At the hardness of 0.3% of Phytagel TM 83% of normal developed somatic embryos were obtained. Dr hab. Anna Pindel Katedra Botaniki Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja al. 29 Listopada 54 31-425 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 175-184 KULTURY in vitro MISKANTA OLBRZYMIEGO (Miscanthus ×××× gigantheus) Agnieszka PłaŜek 1, Franciszek Dubert 1, 2 , Iwona śur 2, Piotr Waligórski 2 1 Katedra Fizjologii Roślin, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie 2 Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego PAN w Krakowie Wstęp

Miskant olbrzymi jest mieszańcem międzygatunkowym diploidalnego gatunku miskanta chińskiego (Miscanthus sinensis) i tetraploidalnego miskanta cukrowego (Miscanthus sacchariflorus). Powstały gatunek Miscanthus × gigantheus jest sterylnym triploidem, rozmnaŜanym wegetatywnie przez kłącza (karpy). Fakt ten powoduje duŜe ograniczenia w jego hodowli, uniemoŜliwiając tradycyjne metody krzyŜowania i wykorzystywanie zmienności, którą daje rozmnaŜanie generatywne (zmienność gametyczna i zygotyczna). Znaczenie gospodarcze tej rośliny w ostatnich latach wzrasta głównie w związku z jej zastosowaniem jako biopaliwo. Miskant jest rośliną wieloletnią przeprowadzającą fotosyntezę typu C4, charakteryzującą się zatem zwiększoną absorpcją dwutlenku węgla, wysokim potencjałem plonowania oraz oszczędnym gospodarowaniem wodą. Miskant nie jest wymagający pod względem nawoŜenia i dobrze plonuje na glebach słabszych. Ponadto, w wyniku tworzenia licznych, splątanych podziemnych kłączy dobrze przytrzymuje glebę, zapobiegając jej wywiewaniu i erozji. Cecha ta ma ogromne znaczenie we współczesnym rolnictwie, nastawionym na ekologiczne gospodarowanie, a takŜe na zachowanie w dobrym stanie nieuŜytków rolnych i gleby pozostawionej odłogowaniu [LEWANDOWSKI 2006].

Miskant olbrzymi jest wraŜliwy na mróz, zwłaszcza w pierwszym roku uprawy. Wypadanie duŜej liczby roślin powoduje konieczność wiosennego ich dosadzania, co podwyŜsza znacznie koszty produkcyjne. Ze względu na bardzo małe zróŜnicowanie osobnicze roślin, które rozmnaŜają się wegetatywnie, trudno wyselekcjonować formy o podwyŜszonej mrozoodporności. W takim przypadku, wywoływanie zmienności somaklonalnej zachodzącej w kulturach tkankowych moŜe budzić coraz większe zainteresowanie hodowców. Wyprowadzenie kultur kalusowych miskanta jest jednak trudne, poniewaŜ gatunek ten charakteryzuje się wytwarzaniem duŜej ilości związków fenolowych w reakcji na stres spowodowany cięciem eksplantatów, lub zabiegiem sterylizacji tkanki wykładanej na poŜywkę, czy wreszcie warunkami hodowli in vitro. Produkty utlenienia związków fenolowych, wyraźnie widoczne dzięki ciemnemu zabarwieniu, gromadzą się wokół eksplantatów, silnie ograniczając indukcję kalusa. Gromadzenie się fenoli w kulturach in vitro zostało opisane u róŜnych gatunków roślin. LAUKKANEN i in. [1999] obserwowali to zjawisko w kulturach kalusa wyprowadzonych z dojrzałych stoŜków wzrostu Pinus sylvestris, BHAT i CHANDEL [1991] w kulturach

A. PłaŜek i inni

176

kalusowych Dioscorea alata uzyskanych z węzłów, a LORENZO i in. [2001] w płynnych kulturach stoŜków wzrostu trzciny cukrowej. W celu eliminacji związków fenolowych moŜna dodawać do poŜywek związki hamujące róŜne etapy szlaku fenolowego, bądź teŜ inhibitory oksydazy polifenolowej, ograniczające utlenianie fenoli [LEWANDOWSKI, KAHNT 1993].

Miskant wytwarza wiechy, których kwiatki zawierają słupki oraz pręciki produkujące pyłek, co stwarza moŜliwość inicjacji kalusa z niedojrzałych mikrospor. Indukowanie androgenezy w kulturach in vitro jest obecnie często wykorzystywane w hodowli wielu gatunków roślin uprawnych, w celu uzyskiwania podwojonych haploidów. Metoda ta pozwala uzyskać rośliny o róŜnych kombinacjach genów, trudnych do uzyskania techniką konwencjonalną. Androgeneza umoŜliwia bowiem ujawnienie się cech maskowanych zazwyczaj przez geny dominujące. Niektóre androgeniczne genotypy prezentują cechy zwiększonej tolerancji na róŜne stresy środowiskowe [HUMPHREYS i in. 1998].

Celem pracy było wyprowadzenie kultur kalusowych z mikrospor miskanta w róŜnych fazach rozwoju. Ponadto, podjęto próbę ograniczenia produkcji związków fenolowych przez eksplantaty stosując poŜywki o róŜnym składzie hormonalnym, a takŜe zmodyfikowanych dodatkiem związków hamujących produkcję fenoli: kwasu α-aminooksyoctowego (AOA) – inhibitora amoniakoliazy fenyloalaniny oraz poliwinylo-pirolidonu (PVP). Materiał i metody Indukcja kalusa

Kalus indukowano z wiech o długości od 0,5 do 20 cm (fot. 1). Kwiatostany zamknięte w pochwie liściowej dezynfekowano w 70% etanolu przez 1 minutę i w roztworze komercyjnego środka dezynfekującego Domestos (1 : 10) przez 20 minut, a następnie płukano trzykrotnie w sterylnej wodzie dejonizowanej. Kwiatostany o długości od 0,5 do 2 cm wykładano w całości na poŜywki, natomiast większe wiechy cięto na fragmenty o długości ok. 1 cm. Z wiech o długości 20 cm izolowano równieŜ zaląŜnie i pylniki. Kultury zakładano na poŜywkach agarowych i płynnych zawierających makro- i mikroelementy według MURASHIGE i SKOOGA [1962] uzupełnione 500 mg⋅dm-3 hydrolizatu kazeiny i 100 mg⋅dm-3 mezoinozytolu oraz: 1) 5 mg⋅dm-3 2,4-D (kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego), 2) 2 mg⋅dm-3 dikamby (kwasu 3,6-dichloro-o-anyŜowego) i 3) 5 mg⋅dm-3 2,4-D i 0,1 mg⋅dm-3 BAP (benzyloaminopuryny). PoŜywki agarowe rozlewano po 20 cm3 do szalek o średnicy 10 cm. Na jedną szalkę wykładano 20 eksplantatów. PoŜywki płynne rozlewano po 100 cm3 do kolb Erlenmayera o objętości 300 cm3. Do jednej kolby wkładano 10 eksplantatów. Wszystkie kultury przetrzymywano w ciemności w 25°C. Kultury płynne wytrząsano (60 cpm).

KULTURY in vitro MISKANTA OLBRZYMIEGO ...

177

Fot. 1. Niedojrzałe kwiatostany miskanta. A - 0,5 cm (powiększenie 10 x) B - 5-20 cm) Photo 1. Immature inforrescences of Miscanthus × gigantheus. A - 0.5 cm (magnification 10

x) B - 5-20 cm Kultury mikrospor

Kultury mikrospor wyprowadzano z niedojrzałych pylników pobieranych z całych wiech o długości około 30 cm. Mikrospory były w róŜnych fazach rozwojo-wych, jedno- lub dwujądrowe. Wiechy były sterylizowane przez 1 minutę w 70% etanolu, potem w wodnym roztworze Domestosu (w rozcieńczeniu 1 : 10) przez 20 minut, a następnie trzykrotnie płukane w wodzie sterylnej. Kwiatostany pocięte na segmenty rozdrabniano w homogenizatorze przeznaczonym do uwalniania mikrospor (tzw. blenderze Warringa) w ok. 10 cm3 0,3 M roztworze mannitolu. Zawiesinę mikrospor przesączano przez sitko o średnicy oczek 80 µm, przenoszono do probówek i odwirowywano przez 7 minut przy 100 x g. Supernatant usuwano, a zawiesinę mikrospor rozprowadzano w 2 cm3 0,3 M mannitolu. Następnie przy uŜyciu pipety Pasteur’a zawiesinę delikatnie nanoszono na warstwę 21% maltozy i ponownie odwirowywano przy 80 x g przez 10 minut. śywe komórki pozostające na granicy faz zbierano i przenoszono do ok. 5 cm3 0,3 M roztworu mannitolu i ponownie odwirowywano przy 100 x g. Supernatant usuwano, osadzone na dnie próbówek mikrospory rozprowadzano w 1,5 cm3 poŜywki ZHUANG i JIA [1983] w modyfikacji PAUK’A i in. [2000], a następnie przenoszono do szalek o średnicy 3 cm. Dodatkowo, na kaŜdą szalkę, wykładano po 10 zaląŜni, które wspomagały przetrwanie mikrospor. Kultury mikrospor przetrzymywano w ciemności w temp. 26°C przez około 6 tygodni. Ocena wpływu inhibitorów produkcji związków fenolowych

Wpływ inhibitorów na akumulację fenoli badano na poŜywkach stałych o takim samym składzie jak poŜywki 1, 2 i 3. KaŜda z nich była sporządzona w trzech wariantach a) z dodatkiem 1 mM AOA b) 2% PVP oraz c) jako poŜywka kontrolna bez inhibitorów. Ocenę wizualną przeprowadzono po 2 miesiącach kultury na podstawie akumulacji ciemnych produktów utleniania związków fenolowych wokół eksplantatów. Analiza zawartości związków fenolowych

Zawartość związków fenolowych oceniano w kontrolnych poŜywkach płynnych po 2 miesiącach kultury metodą spektrofotometryczną (Spektrofotometr LKB Ultrospec II) oraz metodą cieczowej chromatografii HPLC.

Widmo spektrofotometryczne sporządzano w zakresie długości fali 210-400 nm. Pomiar dokonywano w 3 cm3 kwarcowej kuwetce pobierając 0,2 cm3 poŜywki do 2,8 cm3 wody destylowanej. Jako ślepą próbę stosowano wodę.

W analizie chromatograficznej uŜyto standardów następujących kwasów fenolowych (SIGMA): p-kumarowy – 4,6 min., chlorogenowy – 2,37, protokatechowy – 1,89, trans-ferulowy – 5,34, kawowy – 2,98, syringowy – 3,1, p-hydroksybenzoesowy

A. PłaŜek i inni

178

– 2,53, salicylowy – 4,7, 2,6-dihydroksybenzoesowy – 2,24, 2,5-dihydroksybenzoesowy – 1,8, 2,3-dihydroksybenzoesowy – 1,77, wanilinowy – 2,85 oraz alkohol 2-hydroksybenzylowy – 2,68 oraz oznaczono ich czas retencji. Wyniki i dyskusja

Wydajność indukcji kalusa miskanta na zastosowanych poŜywkach była bardzo mała, dlatego teŜ nie podano danych dotyczących liczby uzyskanych kalusów i nie poddano ich analizie statystycznej. PETERSON [1997] takŜe donosiła o bardzo małej wydajności w uzyskiwaniu kalusów z róŜnych części wegetatywnych i generatywnych roślin Miscanthus × ogiformis, oraz próbach jej podniesienia poprzez dodawanie cytokininy do poŜywek indukujących kalusowanie. Fot. 2. Akumulacja związków fenolowych wokół ekspantantów miskanta na poŜywce agarowej

(powiększenia 3 x) Photo 2. Accumulation of phenolic compounds around Miscanthus explants on the agar

medium (magnification 3 x) W prezentowanym eksperymencie kalus uzyskano jedynie na poŜywkach

agarowych z niedojrzałych wiech o długości powyŜej 8 cm. Indukcja kalusa trwała około 2 miesięcy. Eksplantaty ciemniały juŜ po 2-3 dniach od momentu izolacji. W związku z silnym gromadzeniem się związków fenolowych wokół eksplantatów, tworzący się kalus pasaŜowano co 2 tygodnie na świeŜą poŜywkę (fot. 2). Kalus o białej grudkowatej strukturze tworzył się na poŜywce MS z dodatkiem 5 mg⋅dm-3 2,4-D (fot. 3). LEWANDOWSKI i KAHNT [1993] największą wydajność w uzyskiwaniu kalusa z niedojrzałych kwiatostanów miskanta uzyskali na poŜywce MS z dodatkiem 6,5 mg⋅dm-3 2,4-D oraz 0,25 mg⋅dm-3 BAP. W prezentowanym doświadczeniu nie wykazano pozytywnego wpływu cytokininy na ilość indukowanego kalusa, jednakŜe wynik ten moŜe być związany z toksycznym działaniem związków fenolowych produkowanych na wszystkich rodzajach poŜywek, niezaleŜnie od ich składu hormonalnego. Dodanie AOA czy PVP nie ograniczyło produkcji związków fenolowych przez eksplantaty.


179

Fot. 3. Grudkowy kalus rozwijający się z niedojrzałego kwiatostanu miskanta na poŜywce MS + 5

mg⋅dm-3 2,4-D (powiększenie 10 x) Photo 3. Globular callus developing from immature Miscanthus inflorescences on the MS

medium + 5 mg⋅dm-3 of 2,4-D (magnification 10 x)

Izolowane zaląŜnie i pylniki szybko ciemniały i obumierały juŜ w pierwszym tygodniu kultury (fot. 4). RównieŜ z kultur mikrospor nie udało się uzyskać kalusa, aczkolwiek obserwowane w ciągu pierwszych dni komórki charakteryzowały się dobrą Ŝywotnością (fot. 5). Nie wykazywały one jednak zdolności do podziałów. Przypuszcza się, Ŝe metoda ta moŜe być wykorzystywana w przyszłości, ale będzie wymagać pewnych modyfikacji np. składu poŜywki indukcyjnej, określenia optymalnego stadium rozwojowego mikrospor w momencie izolacji, wprowadzenia łagodnego stresu indukującego podziały w obrębie mikrospor, czy teŜ zmiany warunków hodowli in vitro.

A. PłaŜek i inni

180

Fot. 4. Ciemniejące pylniki i zaląŜnia miskanta (powiększenie 10 x) Photo 4. Darkened anthers and ovary of Miscanthus (magnification 10 x) Fot. 5. Mikrospory miskanta (powiększenie 400 x) Photo 5. Microspores of Miscanthus (magnification 400 x)

W poŜywkach płynnych, niezaleŜnie od składu hormonalnego, nie uzyskano tkanki kalusowej. W poŜywce nr 1 i 2 eksplantaty bardzo szybko brązowiały. W poŜywce nr 3 eksplantaty takŜe ściemniały, ale w mniejszym stopniu w porównaniu do tkanek w poŜywkach 1 i 2. PoŜywka nr 3, zawierająca oprócz auksyny takŜe BAP, była zdecydowanie jaśniejsza od pozostałych, poniewaŜ było w niej zdecydowanie mniej fenoli utlenionych, w porównaniu do poŜywek 1 i 2, jak równieŜ porównując do poŜywki agarowej nr 3 o tym samym składzie hormonalnym (rys. 1). Reakcja ta moŜe być wyjaśniona wpływem cytokininy, która moŜe częściowo łagodzić wpływ stresu, jakim jest zranienie tkanki, oraz hamować proces utleniania fenoli. Dodanie cytokininy do poŜywki agarowej nie zapobiegło jednak gromadzeniu się fenoli wokół wyłoŜonej tkanki.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

210220230240250260270280290300310320330340350360370380390400

długość fali (wave length) [nm]

PoŜywka(Medium) nr 1PoŜywka(Medium) nr 2PoŜywka(Medium) nr 3

ABS x 1000

Rys. 1. Spektrum absorbancji (210-400 mm) związków fenolowych wydzielonych w płynnych

kulturach niedojrzałych kwiatostanów miskanta. Skład poŜywek: 1) 5 mg⋅dm-3 2,4-D;


181

2) 2 mg⋅dm-3 dikamby; 3) 5 mg⋅dm-3 2,4-D i 0,1 mg⋅dm-3 BAP Fig. 1. Absorbance spectrum (210-400 mm) of phenolic compound secreted into liquid media by

the immature inforescences of Miscanthus. Composition of media: 1) 5 mg⋅dm-3 2,4-D; 2) 2 mg⋅dm-3 dicamba; 3) 5 mg⋅dm-3 2,4-D and 0.1 mg⋅dm-3 BAP

Analiza HPLC nie wykazała obecności Ŝadnego kwasu fenolowego uŜytego jako

standard. Wynik ten moŜna by uzasadnić tym, Ŝe analiza chromatograficzna była wykonana w okresie, gdy prawdopodobnie nastąpił juŜ proces utlenienia kwasów fenolowych wydzielonych do poŜywek.

Uzyskane wyniki wskazują, jak duŜą barierą w wyprowadzeniu kultur tkan-kowych miskanta olbrzymiego jest silna reakcja tego gatunku na stres, objawiająca się gwałtowną produkcją związków fenolowych. Związki te ograniczają rozwój kalusa i działają toksycznie na tkankę. Do tej pory autorom udało się podtrzymywać rozwój jedynie niewielkiej części uzyskanych kalusów, dzięki częstemu pasaŜowaniu ich na nową poŜywkę. Kalusy te jednak tworzą się na ciemnych, obumarłych częściach eksplantatów, a kaŜdy pasaŜ powoduje ponowne obumieranie części pasaŜowanego kalusa.

Problem kultur in vitro miskanta rzadko jest podejmowany przez naukowców, stąd teŜ w literaturze światowej mało jest na ten temat danych. LEWANDOWSKI i KAHNT [1993] przytaczają przykłady bezskutecznego stosowania kwasu askorbinowego, cysteiny czy węgla aktywnego w celu ograniczenia akumulacji związków fenolowych w kulturach miskanta. Autorzy ci uzyskali embriogenny kalus z niedojrzałych kwiatostanów tej rośliny w kulturach płynnych stosując tzw. „tratwy”, dzięki którym produkowane fenole były wymywane z tkanki, co zapobiegało bezpośredniemu kontaktowi toksycznych związków z tkanką. Z kolei HOLME i in. [1997] donoszą o zwiększeniu wydajności w indukcji embriogennego kalusa z niedojrzałych kwiatostanów miskanta poprzez dodawanie do poŜywki proliny, ale nie wspominają nic o brązowieniu tkanek. Rozwiązanie tego problemu będzie zatem przełomem w rozwinięciu produkcji kalusa miskanta olbrzymiego i rozpoczęciu badań nad indukcją zmienności somaklonalnej. Wnioski 1. Kwas α-aminooksyoctowy (AOA) oraz poliwinylo-pirolidon (PVP) nie hamują

gromadzenia się produktów utleniania fenoli w poŜywce indukującej kalus miskanta olbrzymiego.

2. WzmoŜona produkcja fenoli w reakcji na stres zranienia eksplantatu hamuje rozwój kalusa miskanta.

3. Obecność Ŝywotnych mikrospor miskanta stwarza moŜliwość uzyskania re-generantów jednakŜe metoda ta wymaga dopracowania.

Literatura BHAT S.R., CHANDEL K.P.S. 1991. A novel technique to overcome browning in tissue culture. Plant Cell Rep. 10: 358-361.

A. PłaŜek i inni

182

HUMPHREYS M.W., ZARE A.G., PAŠAKINSKIENË I., THOMAS H., ROGERS W.J., COLLIN H.A. 1998. Interspecific genomic rearrangements in androgenic plants derived from a Lolium multiflorum × Festuca arundinacea (2n = 5x = 35) hybrid. Heredity 80: 78-82.

HOLME I.B., KROGSTRUP P., J. HANSEN. 1997. Embryogenic callus formation, growth and regeneration in callues and suspension culture of Miscanthus x ogiformis Honda ‘Gigantheus’ as affected by proline. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 50: 203-210.

LAUKKANEN H., HIGGMAN H., KONTUNEN-SOPPELN S., HOHTOLN A. 1999. Tissue browning of in vitro cultures of Scots pine: Role of peroxidase and polyphenol oxidase. Physiol. Plant. 106: 337-343.

LEWANDOWSKI I. 2006. Miscanthus – a multifunctional biomass crop for the future, w: Alternative plants for sustainable agriculture. S. JeŜowski, M.K. Wojciechowicz, E. Zenkteler (Ed.), PAGEN, Centre of Excellence in Plant Agrobiology and Molecular Genetics, Institute of Plant Genetics, Polish Academy of Sciences 5: 83-90.

LEWANDOWSKI I., KAHNT G. 1993. Development of a tissue culture system with unemerged inflorescence of Miscanthus ‘Gigantheus’ for the induction and regeneration of somatic emrbryoids, w: Beiträge zur Biologie der Pflanzen. H. Schraudolf, S. Vogel, F. Weberling (Eds). Duncker & Humblot, Berlin: 439-451.

LORENZO J.C., BLANCO M., PELÁEZ O., GONZÁLES A., CID M., IGLESIAS A., GONZÁLES B., ESCALONA P., ESPINOSA P., BORROTO C. 2001. Sugarcane micropropagation and phenolic excretion. Plant Cell & Org. Cult. 65: 1-8.


PAUK J., PUOLIMATKA M., TÓK L., MONOSTORI T. 2000. In vitro androgenesis of triticale in isolated microspore culture. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 61: 221-229.

PETERSEN K.K. 1997. Callus induction and plant regeneration in Miscanthus x ogiformis Honda ‘Gigantheus’ as influenced by benzyladenine. Plant Cell. Tissue Org. Cult. 9: 137-140.

ZHUANG J.J., JIA X. 1983. Increasing differentiation frequencies in wheat pollen callus, w: Cell and Tissue Culture Techniques for Cereal Crop Improvement. Hu H.,Vega M.R. (Eds), Science Press, Beijing: 431. Słowa kluczowe: cytokinina, kalus, kwas α-aminooksyoctowy, kwiatostany, mi-

krospory, poliwinylopirolidon, zaląŜnie, związki fenolowe Streszczenie

Podjęto próbę wyprowadzonia kultur kalusowych z kwiatostanów miskanta (Miscanthus × gignatheus) w róŜnych fazach rozwoju, z izolowanych kwiatków, a takŜe z zaląŜni i mikrospor. Ponadto, zbadano moŜliwość ograniczenia produkcji związków fenolowych przez eksplantaty, stosując poŜywki o róŜnym składzie hormonalnym, a takŜe zmodyfikowane dodatkiem związków hamujących produkcję fenoli: kwasu α-aminooksyoctowego (AOA) – inhibitora amoniakoliazy fenyloalaniny oraz poliwiny-lopirolidonu (PVP).

Kalus uzyskano jedynie na poŜywkach agarowych z niedojrzałych wiech o długości powyŜej 8 cm. Indukcja kalusa trwała około 2 miesięcy. Większość eks-plantatów ciemniała juŜ po 2-3 dniach od wyłoŜenia na poŜywkę. Najwięcej przy-padków tworzenia się kalusa o białej grudkowatej strukturze obserwowano na poŜywce MS z dodatkiem 5 mg⋅dm-3 2,4-D.

Nie wykazano pozytywnego wpływu cytokininy na ilość indukowanego kalusa.


183

W kulturach płynnych związek ten jednakŜe ograniczał ilość utlenionych związków fenolowych. Dodanie AOA czy PVP nie hamowało nagromadzania się związków fenolowych w kulturach. Izolowane zaląŜnie i pylniki takŜe szybko ciemniały i obumierały juŜ w pierwszym tygodniu kultury. RównieŜ z kultur mikrospor nie udało się uzyskać kalusa, aczkolwiek obserwowane w ciągu pierwszych dni hodowli komórki charakteryzowały się dobrą Ŝywotnością. Nie wykazywały one jednak zdolności do podziałów.

Uzyskane wyniki wskazują, jak duŜą barierą w wyprowadzeniu kultur tkan-kowych miskanta olbrzymiego jest silna reakcja tego gatunku na stres, objawiająca się gwałtowną produkcją związków fenolowych. Rozwiązanie tego problemu będzie zatem kluczowe dla rozwinięcia produkcji kalusa miskanta olbrzymiego i rozpoczęcia badań nad indukcją zmienności somaklonalnej. In vitro CULTURE OF Miscanthus × gigantheus Agnieszka PłaŜek 1, Franciszek Dubert 1, 2 , Iwona śur 2, Piotr Waligórski 2 1 Department of Plant Physiology, Polish Academy of Science, Kraków 2 Department of Plant Physiology, Agricultural University, Kraków Key words: α-aminoxyacetic acid, callus, cytokinin, inflorescences, microspores,

ovaries, phenolic compounds, polivinylpirrolidone Summary

The aim of the study was the initiation of callus from the immature inflorescences at different development phases, and also from isolated flowers, ovaries and microspores of Miscanthus x gigantheus. Moreover, an effort was made to limit the phenolic synthesis by explants using media supplemented with different hormones and modified with such compounds inhibiting phenolic production as α-aminoxyacetic acid (AOA) or polivinylpirrolidone (PVP).

Callus was obtained only on agar media from the immature inflorescences longer than 8 cm. Callus was obtained after 2 month-culture. The most explants darkened already 2-3 days after the isolation. White callus with globular-structure was initiated only on MS medium supplemented with 5 mg⋅dm-3 of 2,4-D.

Cytokinine had no positive effect on the number of obtained calli. However, contrary to AOA or PVP in liquid media this hormone limited the amount of oxidized phenolics. Isolated ovaries and anthers also darkened quickly and died already during the first week of culture. Isolated microspores were characterized by a high vitality but they did not divide, and no callus was induced from then.

The results obtained indicate what a big barrier for the induction of callus culture of Miscanthus is its strong reaction to stress manifested with phenolic synthesis. The solution of this problem would be crucial to the production of callus of Miscanthus x gigantheus and the beginning of studies on the somaclonal variation. Dr hab. Agnieszka PłaŜek Katedra Fizjologii Roślin Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja ul. PodłuŜna 3 30-239 KRAKÓW e-mail: [email protected]

A. PłaŜek i inni

184

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 185-193 SOMATIC EMBRYOGENESIS IN CALLUS CULTURES OF TOMATO Lycopersicon peruvianum (L.) MILL. Danuta Rzepka-Plevneš, Danuta Kulpa, Jadwiga Kurek Department of Horticulture Plant Breeding, Agricultural University, Szczecin Introduction

The continuous progress in breeding of most cultivated plants is, to a con-siderable degree, limited by a lack of material for breeding and principally its small variability. Artificially created mutants and natural populations of wild species may constitute such a source because, among them, one may find genotypes resistant to diseases and pests as well as plants well adapted to local conditions. Cultivated varieties of tomato are very susceptible to numerous bacterial, fungous and viral diseases. One must also remember their considerable susceptibility to nematodes. In the light of studies hitherto conducted genotypes occurring among L. peruvianum (L.) MILL., L. hirsutum HUMB. et BONP. and L. peruvianum (L.) MILL. var. glandulosum ined. may be considered the most valuable in breeding of tomato varieties resistant to diseases and pests [CANO et al. 1998; PICO et. al 2000, 2002].

The transfer of individual genes from one species to another is usually extremely difficult, sometimes impossible by using the conventional breeding methods [SEGEREN et al. 1993; SACKS et al. 1997]. In the case of numerous cultivated plants, including tomato it is possible by means of genetic transformation and production of somatic crosses [CHEN, ADACHI 1998; DE FARIA et al. 2002]. In both cases to multiply the forms obtained somatic embryogenesis can be used. In the last years more and more attention is paid to this method as a way of micropropagation of plants on a production scale [CANO et al. 1990, DUZYAMAN et al. 1994; CHEN et al. 1999]. Thus all studies on this subject are of extreme importance.

An attempt at multiplying L. esculentum × L. peruvianum crosses was undertaken by CHEN and ADACHI [1998]. To initiate the culture those authors used fragments of hypocotyls obtained as a result of germination of the crossed embryos. The present work concentrates on L. peruvianum and determines the optimal, for this species, level of plant growth regulators in the culture, necessary for initiation of the somatic embryogenesis and also for the subsequent regeneration of plants obtained from somatic embryos. The studies comprise a part of a wider work, devoted to the search for forms tolerant to soil salination among wild species and cultivated varieties of tomato.

The aim of the study was to determine the effects of the PGRs on the somatic embryogenesis in the cultures of Lycopersicon peruvianum (L.) MILL. Material and methods

The seeds of L. peruvianum (L.) MILL. were obtained from the Tomato Genetics Resource Centrum University of California, Davis (origin - Peru, in the vicinity of Lima). The experiment was conducted in three stages. During the first the callus was initiated and multiplied, during the second the somatic embryogenesis was initiated and

D. Rzepka-Plevneš, D. Kulpa, J. Kurek

186

during the third the mature embryoids were regenerated [BHOJWANI, RAZDAN 1990; MONNIER 1990]. The callus was initiated on the cotyledon fragments of 14-day-old seedlings of L. peruvianum grown on MS mediums supplemented with cytokinine BAP and auxins IAA and NAA (Tab. 1). The callus obtained after four weeks was measured twice. During the first transfer onto the fresh medium, different concentrations of cytokinine BAP and auxin NAA were used (Tab. 2), while during the second - 2 mg⋅dm-3 BAP and 1 mg⋅dm-3 IAA. During both stages, the callus fragments 3 mm in diameter and weighing 0.05 g were used as explants. Each multiplication stage lasted four weeks and 100 explants were analysed per experiment. Table 1; Tabela 1 Influence of plant growth regulators on callus initiation in cotyledon cultures of Lycopersicum peruvianum Wpływ roślinnych regulatorów wzrostu na inicjacje kalusa w kulturach liścieni Lycopersicum peruvianum

Growth regulators Roślinne regulatory wzrostu

(mg⋅dm-3)

Mass of

initiated callus Masa zainicjowa-

nego kalusa (g)

Colour

Zabarwienie

BAP

IAA

2,4-D

1.0

0.5

0.0

0.10e1

green, loose; zielony, luźny

1.0

1.0

0.0

0.15e


1.0

2.0

0.0

0.39de


1.0

0.0

1.0

0.05e

darkgreen, compact; ciemnozielony, zbity

1.0

0.0

2.0

0.13e


2.0

0.5

0.0

0.29e


2.0

1.0

0.0

0.59cd


2.0

2.0

0.0

0.89ab

lightgreen; jasnozielony

2.0

0.0

1.0

0.59cd


2.0

0.0

2.0

0.78bc


5.0

0.5

0.0

0.46cd

green, loose friable; zielony, luźny gruzełkowaty

5.0

1.0

0.0

0.68bc

green, loose fraible; zielony, luźny gruzełkowaty

5.0

2.0

0.0

1.09a

green, loose friable; zielony, luźny gruzełkowaty

5.0

0.0

1.0

0.64bcd

darkgreen, compact; zielony, luźny gruzełkowaty

5.0

0.0

2.0

0.72bc

darkgreen, compact; zielony, luźny gruzełkowaty

Control; Kontrola

0.05e

lightgreen; jasnozielony

1 different letters within columns indicate significant differences at p < 0.95, using Tuckey’s test, LSD

= 0.26; róŜne litery wskazują na róŜnice istotne według testu Tuckey’a przy poziomie istotności p < 0,95, NIR 0,26 Somatic embryogenesis was induced on MS medium supplemented with different

levels of auxins IBA, IAA and NAA (Tab. 3). After eight weeks of culture the mature L. peruvianum embryos were transferred to a full and half-strength MS mediums, supplemented with different concentrations of IAA and KIN (Tab. 4). Hormone-free medium was used as a control. Table 2; Tabela 2 Callus proliferation after 4 weeks on MS medium with various composition of plant growth regulators

SOMATIC EMBRYOGENESIS IN CALLUS CULTURES OF TOMATO ...

187

NamnaŜanie się kalusa po czterech tygodniach namnaŜania na poŜywkach o zróŜnicowanym składzie hormonalnym

Growth regulators; Roślinne regulatory wzrostu (mg⋅dm-3)

Mass of proliferated callus Masa namnoŜonego kalusa

(g)

BAP

NAA

1.0

0.0

0.05c

1.0

1.0

0.05c

1.0

2.0

0.12bc

1.0

4.0

0.24b

1.0

6.0

0.12bc

2.0

0.0

0.05c

2.0

1.0

0.14bc

2.0

2.0

0.21bc

2.0

4.0

0.14bc

2.0

6.0

0.12bc

5.0

0.0

0.13bc

5.0

1.0

0.45ab

5.0

2.0

0.89a

5.0

4.0

0.87a

5.0

6.0

0.67a

Control; Kontrola

0.01c

1 Different letters within columns indicate significant differences at p < 0.95, using Tuckey’s test, LSD

= 0.02; róŜne litery wskazują na róŜnice istotne według testu Tuckey’a przy poziomie istotności p < 0,95, NIR 0,02

Experiment were conducted in a phytotron at a temperature of 24°C, relative air humidity of 70-80%, fluorescent lighting of 40 PAR (µE⋅M-2

⋅s-1) and day length of 16 hours. The pH of the medium was adjusted to 5.6, the growth regulators were added to the medium before its sterilization. Results and discussion

Various plant tissues may be a source of the callus. CHEN and ADACHI [1998] inducted the callus on the cotyledons of young seedlings of L. esculentum, CANO et al. [1998] on leaf fragments obtained from cultivated tomato varieties regenerated from shoot apex in the in vitro cultures. In the present studies selected cotyledon fragments and shoot apex of 14 day-old seedlings were used as explants. The callus cultures were initiated on the cotyledon fragments. The weight, colour and structure of the callus obtained are presented in Table 1. A dark green compact callus was characteristic for 6 experimental combinations. In each of them the medium initiating the formation of the callus contained 1 or 2 mg⋅dm-3 2,4-D and 1, 2 or 5 mg⋅dm-3 BAP. A green and loose callus was obtained on 5 medium combinations in which 2,4-D was replaced by IAA. If the medium contained no 2,4-D also a light-green, friable callus was formed on the cotyledon. The callus obtained on a MS hormone free medium was light green in colour. Significantly most calluses were obtained on a MS medium supplemented with


188

5 or 2 mg⋅dm-3 BAP and 2 mg⋅dm-3 IAA. The callus was friable and light-green. The smallest amount of callus (0.05 g) was formed on the control medium and on the MS medium supplemented with 1 mg⋅dm-3 BAP and 1 mg⋅dm-3 2,4-D. A poor callus initiation was observed also on the media marked in Table 1 by numbers 1 to 6.

The callus was transferred to 15 mediums containing different levels of PGRs: BAP and NAA. A hormone free medium was the control (Tab. 2). The greatest increase in the weight of callus (0.89, 0.87, 0.67 g) was obtained on MS mediums supplemented with 5 mg⋅dm-3 BAP and 2, 4 or 6 mg⋅dm-3 NAA. However, this callus was watery, not capable to differentiate shoots and embryogenesis. During the observations of callus lines obtained, a selection was conducted for the structure desired. As far as the capability capable of embryogenesis was considered the callus of a small weight (0.14 g), was multiplied on a MS medium supplemented with 2 mg⋅dm-3 BAP and 1 mg⋅dm-3 NAA. After it was again passaged onto a medium with the same hormone composition another selection was conducted, the tissue that was not uniform was removed and the somatic embryogenesis was initiated.

The composition of the medium initiating somatic embryogenesis is one of the most important factors of the in vitro culture, decisive as regards of the possible suc-cess. Among the most often used mediums is the standard MS medium, supplemented with auxins and in particular 2,4-D - 0.5 to 1 mg⋅dm-3 [BHOJWANI, RAZDAN 1990; MONNIER

1990]. CHANDEL et al. [2000] for the initiation of embryogenesis in cultures of tomato used auxin NAA (1 mg⋅dm-3) and cytokine BAP (1,5 mg⋅dm-3). The cultures were maintained in darkness.

In the present studies embryogenesis was induced using two auxins, IAA and 2,4-D, without cytokine (four combinations) as well as 2 or 5 mg⋅dm-3 of BAP (Tab. 3). In the media without cytokine the formation of an embryogenic callus was not observed, similarly as in the samples containing 2 mg⋅dm-3 of BAP and 2 mg⋅dm-3 of IAA. The remaining experimental combinations resulted in a mean of 0.5 to 8.9 embryos (5 to 89% of the explants used). In the case of L. peruvianum, BAP was proved to be an important and necessary growth hormone in the formation of somatic embryos. Their greatest number (a mean of 8.9 and 6.7 per explant) was obtained on the medium containing 5 mg⋅dm-3 of BAP and 2 mg⋅dm-3 2,4-D and on the medium 11, containing 5 mg⋅dm-3 of BAP and 2 mg⋅dm-3 2,4-D (Tab. 3, Photo 1, 2). In the control the formation of an embryogenic callus was not observed. Table 3; Tabela 3 Number of initiated somatic embryo on medium with different growth regulators composition Liczba tworzących się zarodków somatycznych na poŜywkach o zróŜnicowanym składzie hormonalnym

Growth regulators; Roślinne regulatory wzrostu (mg⋅dm-3)

Numbers of somatic embryo per 1 g callus

Liczba zarodków somatycznych przypadających na 1 g tkanki kalusowej

BAP

IAA

2,4-D

1

2

3

4

0.0

2.0

0.0

0.0

0.0

4.0

0.0

0.0

0.0

0.0

2.0

0.0

0.0

0.0

4.0

0.0


189

2.0 2.0 0.0 0.0

2.0

4.0

0.0

0.5

2.0

0.0

2.0

2.8

2.0

0.0

4.0

2.3

5.0

2.0

0.0

3.1

5.0

4.0

0.0

4.5

5.0

0.0

2.0

6.7

5.0

0.0

4.0

8.9

Control; Kontrola

0.0

Photo 1. Embryogenic callus prolifered on medium with 5 mg⋅dm-3 BAP and 4 mg⋅dm-3 2,4-D

(bar reperesent 1 mm) Fot. 1. Kalus embriogeniczny namnaŜany na poŜywce uzupełnionej 5 mg⋅dm-3 BAP and 4

mg⋅dm-3 2,4-D (pasek oznacza 1 mm)


190

Photo 2. Somatic embryo at globular and cotyledonous stage on MS medium with 5 mg⋅dm-3

BAP and 4 mg⋅dm-3 2,4 D (bar reperesent 1 mm) Fot. 2. Zarodki somatyczne pomidora w stadium globularnym i zaraodka dojrzałego indukowane

na poŜywce MS, uzupełnionej 5 mg⋅dm-3 BAP i 4 mg⋅dm-3 2,4 D (pasek oznacza 1 mm)

Table 4; Tabela 4 Influence of medium composition on regeneration of somatic embryo Wpływ składu poŜywki na procent zregenerowanych zarodków somatycznych

Mineral composition Skład mine-

ralny

Growth regulators

Roślinne regulatory wzrostu (mg⋅dm-3)

Percent of regenerated

embryo Procent zregenerowanych

zarodków

Percent of control Procent kontroli

IAA

kinetin

MS

0.2

0.0

62

127

MS

0.4

0.0

69

141

MS

0.0

0.2

98

200

MS

0.0

0.4

87

178

1/2MS

0.2

0.0

7

14

1/2MS

0.4

0.0

9

18

1/2MS

0.0

0.2

22

45

1/2MS

0.0

0.4

29

59

Control; Kontrola

49

100

The L. peruvianum embryos, obtained in the experiment presented here,

demonstrated a good regenerating ability on the MS medium containing the basic inorganic salts and organic compounds supplemented with auxin IAA or kinetin (Tab. 4). The greatest number of regenerated embryos (80 and 78%) was observed on the medium containing 0.2 and 0.4 mg⋅dm-3 kinetin, respectively. Supplementing BAP with IAA (0.4 and 0.2 mg⋅dm-3) lowered the regeneration ability of embryos by about 20%. Reducing the nutritive components in the MS medium by half had, in the case of L. peruvianum, a negative effect on the regeneration of the embryos obtained.

The obtained results indicate that somatic embryogenesis may be successfully used for a rapid reproduction of L. peruvianum plants and all selection work conducted on this tomato species on the level of in vitro culture. References BHOJWANI S.S., RAZDAN M.K. 1990. Plant tissue culture: theory and practice. Deve-lopments in Crop Science, Elsevier 5: 125-169.

CANO E.A., MORENO V., ROMERO M, BOLARIN M.C. 1990. The role of culture medium, explants source and genotype on callus growth in cultivated and wild tomato species and interspecific hybrids. Proceedings of the XIth Eucarpia meeting on tomato genetics: 167-172.

CANO E.A., PEREZ-ALFOCEA F., MORENO V., CARO M., BOLARIN M. 1998. Evaluation o salt


191

tolerance in cultivated and wild tomato species through in vitro shoot apex culture. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 53: 19-26.

CHANDEL G., KATIYAR S.K., CHANDEL G. 2000. Organogenesis and somatic embryogene-sis in tomato (Lycopersicon esculantum Mill.). Adv. in Plant Sci. 13: 11-17.

CHEN H., ZHANG J., ZHUANG T., ZHOU G. 1999. Studies on optimum hormone levels for tomato plant regeneration from hypocotyls explants cultured in vitro. Acta Agric. Shanghai 15: 26-29.

CHEN L.Z., ADACHI T. 1998. Plant Regeneration via somatic embryogenesis from coty-ledon protoplasts of tomato (Lycopersicum esculentum Mill.). Breed. Sci. 44: 337-338.

DE FARIA R.T., DESTRO D., FILHO J.C.B. ILLG R.D. 2002. Introgression of in vitro rege-neration capability of Lycopersicon pimpenellifolium Mill. into recalcitrant tomato cultivars. Euphitica 124: 59-63.

DUZYAMAN E., TANRISEVER A, GUNVER G. 1994. Comparative studies on regeneration of tomato in vitro. Acta Horti. 235-242.

MONNIER M. 1990. Induction of embryogenesis in callus culture. Pollard J.W., Walker J.M. (Ed.), Plant Cell and Tiss. Culture Meth. in Molec. Biol. 6: 141-148.

PICO B., HERRIAZ J., RUIZ J.J., NUEZ F. 2002. Widening the genetic basis of virus resisi-tance in tomato. Sci. Hort 94: 73-89.

PICO B., SIFRES A., ELI M., DIEZ M.J., NUEZ F. 2000. Searching for new resistance sources to tomato yellow leaf curl virus within a highly variable wild Lycopersicon genetic pool. Acta Physiol. Plant. 22: 344-350.

SACKS E.J., GERHARDT L.M., GRAHAM E.B., JACOBS J., THORRUP T.A., ST. CLAIR D.A. 1997. Variation among genotypes of tomato (Lycopersicum esculentum Mill.) for crossability to L. peruvianum (L.) Mill. Ann. Bot. 80: 469-477.

SEGEREN M.I., SONDAHL M.R., SIQUEIRA W.J. MEDINA FILHO H.P., NAGAI H., LOURENCAO L.

1993. Tomato breeding: embryo rescue of interspecific hybrids between Lycopersicon esculentum Mill. and Lycopersicum peruvianum (L.) Mill. Rev. Brasileira Genet. 16: 367-380. Key words: tomato, callus, somatic embryogenesis, plant regeneration Summary

Investigations were conducted on the level of plant growth regulators, necessary for the initiation of callus, somatic embryogenesis and plant regeneration in in vitro cultures of a wild form of tomato - the Lycopersicon peruvianum. Cotyledons and shoot apex of 14-day-old seedlings were used as explant source. Explants were inoculated on the MS medium, supplemented with various concentrations of cytokines (BAP, KIN) and auxins (IAA, 2,4-D, NAA). It was observed that the formation of the callus in Lycopersicon peruvianum depended on the content of BAP and 2,4-D and IAA. The best callus development was observed on the cotyledons placed on MS medium with 5 mg⋅dm-3 BAP and 2 mg⋅dm-3 IAA (1.09 g) or 2 mg⋅dm-3 BAP and 2 mg⋅dm-3 IAA (0.89 g). In control (hormone-free medium) callus formation was not observed. For the initia-tion of somatic embryogenesis in Lycopersicon peruvianum 12 medium combinations were supplemented with BAP and IAA or 2,4-D. The largest number of emrbyoids was obtained on mediums containing 5 or 4 mg⋅dm-3 BAP and 2 mg⋅dm-3 2,4-D. On hormone free medium (control) no embryoids were observed. The obtained results


192

indicate that for Lycopersicon peruvianum a somatic embryogenesis is more efficient than the organogenesis method of plant propagation in in vitro cultures. For the regeneration of plants through somatic embryogenesis the MS medium supplemented with 0.2 g⋅dm-3 of kinetin proved to be optimal. Its higher or lower levels limited the ability of embryoids to regenerate. SOMATYCZNA EMBRIOGENEZA W KULTURACH KALUSOWYCH Lycopersicon peruvianum (L.) MILL Danuta Rzepka-Plevneš, Danuta Kulpa, Jadwiga Kurek Zakład Hodowli Roślin Ogrodniczych, Akademia Rolnicza w Szczecinie Słowa kluczowe: pomidor, kalus, somatyczna embriogeneza, regeneracja roślin Streszczenie

W pracy określono wpływ roślinnych regulatorów wzrostu niezbędnych do inicjacji kalusa, somatycznej embriogenezy i regeneracji roślin w kulturach in vitro Lycopersicon peruvianum. Źródłem eksplantatów były liścienie 14 dniowych siewek, poŜywką podstawową - poŜywka MS uzupełniona na kaŜdym etapie badań róŜną ilością cytokinin (BAP, KIN) i auksyn (IAA, 2,4-D, NAA). Stwierdzono, Ŝe formowanie się kalusa u L. peruvianum zaleŜało od ilości zastosowanej cytokiny BAP oraz auksyn 2,4-D i IAA. Najwięcej obserwowano go na liścieniach wyłoŜonych na poŜywkę MS wzbogaconą 5 mg⋅dm-3 BAP i 2 mg⋅dm-3 IAA (1,09 g) oraz 2 mg⋅dm-3 BAP i 2 mg⋅dm-3 IAA (0,89 g). W próbach kontrolnych bez hormonów wzrostu nie obserwowano formowania się kalusa. Do inicjacji somatycznej embriogenezy u L. peruvianum zastosowano 12 kombinacji poŜywek MS z udziałem BAP oraz IAA lub 2.4-D. Najwięcej embrioidów otrzymano na poŜywkach uzupełnionych 5 lub 4 mg⋅dm-3 BAP i 2 mg⋅dm-3 2.4-D, ich brak - na poŜywkach bez hormonów wzrostu (kontrola) oraz bez cytokiny BAP lub auksyny 2.4-D. Otrzymane wyniki wykazały, Ŝe somatyczna embriogeneza jest dla L. peruvianum wydajniejszą, niŜ organogeneza, metodą rozmnaŜania roślin w kulturach in vitro. Prof. dr hab. Danuta Rzepka-Plevneš Zakład Hodowli Roślin Ogrodniczych Akademia Rolnicza ul. Janosika 8 71-424 SZCZECIN

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 195-201 THE EFFECT OF INHIBITORS OF LIPOXYGENASE AND CYCLOOXYGENASE ON THE MYCELIUM GROWTH OF Phoma narcissi 1 Marian Saniewski, Alicja Saniewska Research Institute of Pomology and Floriculture, Skierniewice Introduction

Phoma narcissi (ADERH.) BOEREMA, de GRUYTER et NOORDEL. is a world wide recorded pathogen of Hippeastrum, Narcissus, Hymenocallis (syn. Ismene) and other species of Amaryllidaceae [SANIEWSKA 1998]. The pathogen causes red spots on various organs of Hippeastrum × hybr. hort. Isolates of Phoma narcissi from Hippeastrum, Narcissus and Hymenocallis were pathogenic to all three species; it indicates the possibility of infection and expansion of the disease caused by P. narcissi on different species belonging to the family Amaryllidaceae [SANIEWSKA, ORLIKOWSKI 1989].

The effect of some biotic and abiotic factors on the growth and development of Phoma narcissi in vitro and in vivo was previously studied. It was showed that polyamine biosynthesis inhibitors, DL-α-difluoromethylornithine (DFMO) and DL-α-difluoromethylarginine (DFMA) at a concentration 1.0 and 3.0 mM, greatly inhibited the mycelial growth of P. narcissi on Czapek-Dox-Agar whereas putrescine at a concentration of 1.0 mM completely or partially reversed the inhibition. DFMO and DFMA at a concentration of 3 mM evidently inhibited development of red spots on Hippeastrum leaves when applied preventively [SANIEWSKA 1996]. Thus, the endogenous polyamines are necessary compounds in the growth and development of P. narcissi.

It was found that garlic (Allium sativum L.) clove extracts and garlic-derived ajoene and diallyl disulphide applied as vapour or added into PDA medium greatly inhibited the mycelium growth of P. narcissi [SANIEWSKA 1998]. It is possible that the inhibitory effect of those garlic compounds on the mycelium growth of P. narcissi is the result of inhibition of sterols biosynthesis.

The occurrence of jasmonates, jasmonic acid (JA), methyl jasmonate (JA-Me) and many other related compounds of JA are well known also in fungi, i.e. in Botryodiplodia theobromae (syn. Lasiodiplodia theobromae) [MIERSCH et al. 1991], Gibberella fujikuroi [MIERSCH et al. 1992], Fusarium oxysporum f. sp. matthiolae [MIERSCH et al. 1999], but the role of the endogenous jasmonates in the growth and development of fungi is unknown.

1 The research was supported by Ministry of Science and Information Society Technologies, Grant No. 2 P06R 125 26.

In this work the effect of some inhibitors of jasmonic acid biosynthesis, acting on different stages of biochemical conversion of α-linolenic acid to jasmonic acid, on the mycelium growth of Phoma narcissi is presented.

M. Saniewski, A. Saniewska

196

Material and methods

The stock culture of Phoma narcissi was maintained on potato-dextrose-agar (PDA) slants at 25°C in the dark.

The effect of two inhibitors of lipoxygenase - phenidone (1-phenyl-3-pyra-zolidone) [BAKER et al. 1985] and ibuprofen [α-methyl-4-(isobutyl)phenylacetic acid] [PEŃA-CORTÉS et al. 1993], and inhibitor of cyclooxygenase - indomethacin [1-(4-chlorobenzoyl)-5-methoxy-2-methyl-3-indoleacetic acid] [PEŃA-CORTÉS et al. 1993] on the mycelium growth of Phoma narcissi on PDA medium were investigated. Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (DIECA), which reduces the conversion of 13(S)-hydroperoxylinolenic acid to 13-hydroxylinolenic acid and this way decreases the biosynthesis of jasmonic acid was also included in the experiment [FARMER et al. 1994; KOIWA et al. 1997]. All these used inhibitors, phenidone, ibuprofen, indomethacin and sodium diethyldithiocarbamate, are the inhibitors of jasmonates biosynthesis on different stages of biochemical conversion of α-linolenic acid to jasmonic acid.

These inhibitors were used at final concentration of 10, 50, 100, 250, and 500 µg⋅cm-3 in the PDA medium. Phenidone, ibuprofen and indomethacin were dissolved in ethanol and DIECA was dissolved in distilled and sterilized water and then were added to PDA medium after sterilization at temperature of about 50°C. Five mm diameter plugs were taken from 7-day-old culture of P. narcissi, and placed in the middle of 90 mm Petri dishes containing PDA medium earlier supplemented with the tested compounds. Control plates contained the culture growing on pure PDA, without any additions. Five Petri dishes were used as an experimental unit and the trial was repeated twice. Incubation was conducted in darkness at 25°C. After 6 days of the process a diameter of fungal colonies was measured in two perpendicular directions.

The data was subjected to the analysis of variance and Duncan’s multiple range test at 5% significance was used for means separation. Results and discussion

All the used inhibitors, phenidone, ibuprofen, indomethacin and sodium diethyldithiocarbamate, applied directly to PDA medium showed a great inhibitory effect on the mycelium growth of Phoma narcissi (Fig. 1-4). After 6-7 days of incubation with these inhibitors at a concentration of 500 µg⋅cm-3 in the medium the mycelium growth of the pathogen was totally or almost totally inhibited (Fig. 1-4). Lower concentration of the used inhibitors inhibited mycelium growth to a lesser degree, generally proportionally to its concentrations. The strongest inhibitory effect was caused by indomethacin, at a concentration of 10 µg⋅cm-3 it limited the mycelium growth in about 67% (Fig. 3).

THE EFFECT OF INHIBITORS OF LIPOXYGENASE ...

197

Fig. 1. The effect of phenidone on the mycelium growth of Phoma narcissi. Absolute values of the surface of mycelium growth in the control medium after 2; 4 and 7 days of incubation was 5.6; 26.4 and 60.1 cm2, respectively

Rys. 1. Wpływ fenidonu na wzrost grzybni Phoma narcissi. Bezwzględne wartości po-

wierzchni grzybni na poŜywce kontrolnej po 2; 4 i 7 dniach inkubacji wynosiły odpowiednio 5,6; 26,4 i 60,1 cm2

dd

d

c c

c

b

b

b

a a a

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0

2 4 7

D a y s o f i n c u b a t io n

inhib

itio

n o

f m

ycelium

gro

wth

(%

)

50 µg·cmֿ³

100 µg·cmֿ³

250 µg·cmֿ³

500 µg·cmֿ³


198

Fig. 2. The effect of ibuprofen on the mycelium growth of Phoma narcissi. Absolute values

of the surface of mycelium growth in the control medium after 2; 4 and 6 days of incubation was 3.9; 16.5 and 39.6 cm2, respectively

Rys. 2. Wpływ ibuprofenu na wzrost grzybni Phoma narcissi. Bezwzględne wartości po-

wierzchni grzybni na poŜywce kontrolnej po 2; 4 i 6 dniach inkubacji wynosiły odpowiednio 3,9; 16,5 i 39,6 cm2

It is interesting that ibuprofen applied at a concentration of 10 µg⋅cm-3

substantially stimulated the mycelium growth of P. narcissi; after 2, 4 and 6 days of incubation in 35, 8 and 3%, respectively (Fig. 2).

It is well known in literature that the inhibitors used in our work blocked the elicitor-induced formation of jasmonic acid.

Diethyldithiocarbamic acid inhibited the elicitor-induced production of jasmonic acid and the activation of terpenoid indole alkaloid biosynthetic genes [MENKE et al. 1999].

NOJIRI et al. [1996] showed that the treatment with ibuprofen reduced the production of momilactone A in the suspension cultured rice cells treated with N-acetylchitoheptaose, but the addition of JA increased the production of momilactone A to higher levels than those in elicited rice cells. These results strongly suggest that JA functions as a signal transducer in the induction of biosynthesis of momilactone A by N-acetylchitoheptaose in the suspension cultured rice cells [NOJIRI et al. 1996].

PEŃA-CORTÉS et al. [1993] documented that ibuprofen did not prevent activation of wound-induced JA-Me mediated genes in tomato leaves. These observations suggest that ibuprofen may be involved in a special transduction pathway unrelated to the inhibitory effect on biosynthesis of jasmonate.

c

c

c

bb

b

aaa

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2 4 6

Days of incubation

Inhib

itio

n o

f m

ycelium

gro

wth

(%

)

10 µg·cmֿ³

50 µg·cmֿ³

100 µg·cmֿ³

500 µg·cmֿ³


199

Fig. 3. The effect of indomethacin on the mycelium growth of Phoma narcissi. Absolute values of the surface

of mycelium growth in the control medium after 2; 4 and 6 days of incubation was 4.7; 19.7 and 42.4 cm2, respectively

Rys. 3. Wpływ indometacyny na wzrost grzybni Phoma narcissi. Bezwzględne wartości powierzchni grzybni

na poŜywce kontrolnej po 2; 4 i 6 dniach inkubacji wynosiły odpowiednio 4,7; 19,7 i 42,4 cm2

In the soybean (Glycine max (L.) MERR.) seedlings the lipoxygenase transcript pTK18 was found in all non-embryonic tissues examined: axes and roots and leaves of two-week plant and the transcript was elevated by methyl jasmonate in the seedlings [PARK et al. 1994]. These authors observed that ibuprofen, the known inhibitor of jasmo-nates biosynthesis [STASWICK et al. 1991], applied alone stimulated the accumulation of pTK18 transcript in soybean seedlings suggesting that this inhibitor may have other than the specific effects on endogenous jasmonic acid levels [PARK et al. 1994].

Thus, all the applied inhibitors, phenidone, ibuprofen, indomethacin and sodium diethyldithiocarbamate, which are the inhibitors of jasmonates biosynthesis on diffrent stages of biochemical conversion of α-linolenic acid to jasmonic acid, evidently inhibited the mycelium growth of Phoma narcissi.

It is probable that endogenous jasmonates play an important role in the growth and development of Phoma narcissi and other fungi; the occurrence of jasmonates in fungi is well documented [MIERSCH et al. 1991, 1992, 1999].

ccb

b

ba

bb

a

aaa

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0

2 4 6

D ays o f in cu b a tio n

Inhib

itio

n o

f m

ycelium

gro

wth

(%

)

10 µg·cmֿ³

50 µg·cmֿ³

100 µg·cmֿ³

500 µg·cmֿ³

ba

a

a aa

aa

aa a a

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0

2 4 6

D a y s o f i n c u b a t i o n

Inhib

itio

n o

f m

ycelium

gro

wth

(%

)

10 µg·cmֿ³

50 µg·cmֿ³

100 µg·cmֿ³

500 µg·cmֿ³


200

Fig. 4. The effect of sodium diethyldithiocarbamate on the mycelium growth of Phoma narcissi.

Absolute values of the surface of mycelium growth in the control medium after 2; 4 and 6 days of incubation was 5.3; 18.8 and 41.7cm2, respectively

Rys. 4. Wpływ dietyloditiokarbaminianu sodu na wzrost grzybni Phoma narcissi. Bezwzględne wartości

powierzchni grzybni na poŜywce kontrolnej po 2; 4 i 6 dniach inkubacji wynosiły odpowiednio 5,5; 18,8 i 41,7 cm2

Conclusion

On the basis of those inhibitors of jasmonate biosynthesis, i.e. phenidone, ibuprofen, indomethacin and sodium diethyldithiocarbamate, which inhibit the mycelium growth of Phoma narcissi it is suggested that jasmonates may play an important role in the growth and development of the pathogen. References BAKER J.E., WANG C.Y., TERLIZZI D.E. 1985. Delay of senescence in carnations by py-razon, phenidone analogues, and Tiron. Hort Science 20: 121-122.

FARMER E.E., CALDELARI D., PEARCE G., WALKER-SIMMONS M.K., RYAN C.A. 1994. Diethyldithiocarbamic acid inhibits the octadecanoid signaling pathway for the wound induction of proteinase inhibitors in tomato leaves. Plant Physiol. 106: 337-342.

KOIWA H., BRESSAN R.A., HASEGAWA P.M. 1997. Regulation of protease inhibitors and plant defence. Trends Plant Sci. 2: 379-384.

MENKE F.L.K., PARCHMANN S., MUELLER M.J., KIJNE J.W., MEMELINK J. 1999. Involve-ment of the octadecanoid pathway and protein phophorylation in fungal elicitor-in-duced expression of terpenoid indole alkaloid biosynthetic genes in Catharanthus roseus. Plant Physiol. 119: 1289-1296.

MIERSCH O., SCHNEIDER G., SEMBDNER G. 1991. Hydroxylated jasmonic acid and related compounds from Botryodiplodia theobromae. Phytochem. 30: 4049-4051.

MIERSCH O., BRÜCKNER B., SCHMIDT J., SEMBDNER G. 1992. Cyclopentane fatty acids from Gibberella fujikuroi. Phytochem. 32: 3835-3837.

MIERCH O., BOHLMANN H., WASTERNACK C. 1999. Jasmonates and related compounds from Fusarium oxysporum. Phytochem. 50: 517-523.

NOJIRI H., SUGIMORI M., YAMANE H., NISHIMURA Y., YAMADA A., SHIBUYA N., KODAMA O., MUROFUSHI N., OMORI T. 1996. Involvement of jasmonic acid in elicitor-induced phytoalexin production in suspension-cultured rice cells. Plant Physiol. 110: 387-392.

STASWICK P.E., HUANG J.-F., RHEE Y. 1991. Nitrogen and methyl jasmonate induction of soybean vegetative storage protein genes. Plant Physiol. 96: 130-136.

PARK T.K., HOLLAND M.A., LASKEY J.G., POLACCO J.C. 1994. Germination-associated lipoxygenase transcripts persist in maturing soybean plants and are induced by jas-monate. Plant Sci. 96: 109-117.

PEŃA-CORTÉS H., ALBRECHT T., PRAT S., WEILER E., WILLMITZER L. 1993. Aspirin pre-vents wound-induced gene expression in tomato leaves by blocking jasmonic acid biosynthesis. Planta 191: 123-128.

SANIEWSKA A. 1996. Effect of polyamine biosynthesis inhibitors on growth of Stago-nospora curtisii (Berk.) Sacc. (= Phoma narcissi (Aderh.) Boerema, de Gruyter et Noordel., comb. nov.). Phytopathol. Pol. 11: 23-30.


201

SANIEWSKA A. 1998. Czynniki biotyczne i abiotyczne hamujące wzrost i rozwój Phoma narcissi (Aderh.) Boerema, de Gruyter et Noordel., comb. nov. Zesz. Nauk. Instytutu Sadownictwa i Kwiaciarstwa, Monografie i Rozprawy, Skierniewice: 1-32.

SANIEWSKA A., ORLIKOWSKI L. 1989. Występowanie, szkodliwość i elementy biologii Stagonospora curtisii (Berk.) Sacc. na narcyzach. Prace Instytutu Sadownictwa i Kwiaciarstwa, Ser. B - Rośliny Ozdobne 14: 179-189. Key words: ibuprofen, phenidone, indomethacin, sodium diethyldithicarbamate,

mycelium growth, Phoma narcissi Summary

Phoma narcissi is a pathogen of the species from the family Amaryllidaceae, including Hippeastrum × hybr. hort. Disease symptoms may occur on all organs of Hippeastrum, the pathogen causes reddish colouration of tissues and development of red necrotic spots.

It was showed that all the applied inhibitors of jasmonates biosynthesis, i.e. phenidone, ibuprofen, indomethacin and sodium diethyldithiocarbamate, acting at different stages of biochemical conversion of α-linolenic acid to jasmonic acid, greatly inhibited the mycelium growth of Phoma narcissi on PDA medium, proportionally to the concentration used. The strongest inhibitory effect was caused by indomethacin; at a concentration of 10 µg⋅cm-3 the mycelium growth was limited in about 67%. It is suggested that inhibition of mycelium growth of P. narcissi in vitro by the applied inhibitors is caused by blocking the jasmonate biosynthesis in the mycelium of this pathogen. It should be mentioned that other action of those inhibitors on metabolic processes in mycelium hyphae, resulting to inhibition of growth and development of the Phoma narcissi can not be exluded. WPŁYW INHIBITORÓW LIPOKSYGENAZY I CYKLOOKSYGENAZY NA WZROST GRZYBNI Phoma narcissi Marian Saniewski, Alicja Saniewska Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa w Skierniewicach Słowa kluczowe: ibuprofen, fenidon, indometacyna, dietyloditiokarbaminian sodu,

wzrost grzybni, Phoma narcssi Streszczenie

Phoma narcissi jest patogenem gatunków z rodziny Amaryllidaceae, w tym głównym patogenem Hippeastrum x hybr. hort. Objawy chorobowe mogą występować na wszystkich organach Hippeastrum, a są to czerwienienie tkanek i rozwój nekrotycznych plam.

Stwierdzono, Ŝe wszystkie zastosowane inhibitory biosyntezy kwasu jasmo-nowego, tj. fenidon, ibuprofen, indometacyna i dietyloditiokarbaminian sodu, działające na róŜnych etapach przemiany kwasu α-linolenowego do kwasu jasmonowego, hamowały wzrost grzybni Phoma narcissi na poŜywce PDA proporcjonalnie do uŜytego stęŜenia. Najsilniej działającym inhibitorem na wzrost grzybni tego patogena okazała


202

się indometacyna - w stęŜeniu 10 µg⋅cm-3 hamowała wzrost grzybni Phoma narcissi w 67%. Sugeruje się, Ŝe hamowanie wzrostu grzybni Phoma narcissi w warunkach in vitro przez zastosowane inhibitory jest powodowane obniŜeniem lub zahamowaniem biosyntezy jasmonianów w strzępkach grzybni tego patogena. Nie moŜna wykluczyć takŜe innego działania tych inhibitorów w procesach metabolicznych w strzępkach grzybni, doprowadzającego do hamowania wzrostu grzybni Phoma narcissi. Prof. dr hab. Marian Saniewski Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa ul. Pomologiczna 18 96-100 SKIERNIEWICE e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 203-212 WPŁYW AKUMULACJI ZWIĄZKÓW FENOLOWYCH NA ZDOLNOŚCI REGENERACYJNE KALUSA WYBRANYCH GATUNKÓW ROŚLIN1

Edyta Skrzypek

1, Magdalena Szechyńska-Hebda

1, GraŜyna Dąbrowska

2

1 Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polskiej Akademii Nauk w Krakowie 2 Zakład Genetyki, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wstęp

Związki fenolowe są jednym z czynników decydujących o zdolnościach re-generacyjnych tkanek roślinnych w kulturach in vitro [CVIKROVÁ i in. 1996; LORENZO i in. 2001]. Ich ilość w tkankach roślinnych zaleŜy od wielu czynników zewnętrznych i wewnętrznych, np. od intensywności światła, temperatury, regulatorów wzrostu, czy zawartości składników mineralnych i cukrów w podłoŜu [TANAKA i in. 1995; LARRONDE i in. 1998; LEWIS i in. 1998; RUIZ i in. 1999; CLOSE i in. 2001]. HUTZLER i in. [1998] oraz SCHOENWAELDER i WIENCKE [2000] wykazali, Ŝe nie tyko ilość związków fenolowych, ale i miejsce ich gromadzenia (ściana komórkowa, wakuole) wpływa na potencjał morfogenetyczny tkanek. Mechanizm ich działania jest trudny do wyjaśnienia, jednak wydają się one w duŜej mierze decydować o potencjale morfogenetycznym tkanek, głównie poprzez lignifikację ścian komórkowych, oraz regulację poziomu auksyn. Polifenole stymulują utlenianie IAA i tworzenie kompleksów, przez co wpływają na poziom czynnej auksyny oraz regulują transport auksyn [MURPHY i in. 2000]. Monofenole prawdopodobnie spełniają funkcję ochronną, zabezpieczając endogenną auksynę przed jej utlenianiem. Znoszą teŜ hamujące działanie ABA na wzrost i przeciwdziałają zamykaniu aparatów szparkowych [MURPHY i in. 2000]. Uznawane są takŜe jako antyoksydanty, broniące komórki przed róŜnego rodzaju stresem środowiskowym. Działają one równieŜ jak inhibitory wzrostu, tworząc połączenia z enzymami. Związki fenolowe, głównie taniny (występujące w duŜych ilościach tkankach bobiku) hamują wzrost indukowany przez GA3. Natomiast produkty ich utleniania powodują brunatnienie tkanek i nekrozy.

Celem prowadzonych badań było określenie wpływu związków fenolowych na regenerację kalusa pszenicy, bobiku i rzepaku w zaleŜności od zdolności rege-neracyjnych tkanki i temperatury stymulującej regenerację.

1 Badania finansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa WyŜszego w ramach grantu nr 3 PO6A 009 25.

Materiał i metody

Materiał roślinny stanowiły eksplantaty oraz kalus nieregenerujący i regene-rujący: pszenicy odm. Kamila, bobiku odm. Nadwiślański, i rzepaku odm. Licosmos.

E. Skrzypek, M. Szechyńska-Hebda, G. Dąbrowska

204

Kalus pszenicy indukowano na poŜywce MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] z dodatkiem 2 mg⋅dm-3 2,4-D, bobiku na poŜywce MS zawierającej 1 mg⋅dm-3 hydrolizatu kazeiny, 750 mg dm-3 myo-inozytolu, 1 mg⋅dm-3 BAP, 0,5 mg⋅dm-3 NAA, 0,25 mg⋅dm-3 GA3 i 3% sacharozy, a rzepaku na poŜywce MS z dodatkiem 1 mg⋅dm-3 BAP, 0,5 mg⋅dm-3 2,4-D i 6% sacharozy. Kalus regenerujący indukowano z niedojrzałych zarodków (pszenica, bobik) i hypokotyli (rzepak), a nieregenerujący z dojrzałych zarodków (pszenica, bobik) i korzeni (rzepak). Po okresie 3-tygodniowej indukcji kalus przenoszono na poŜywki regeneracyjne: kalus rzepaku na poŜywkę MS bez regulatorów wzrostu, kalus bobiku na poŜywkę o takim samym składzie jak poŜywka indukcyjna, a rzepaku na poŜywkę MS z dodatkiem 3 mg⋅dm-3 BAP, 0,5 mg⋅dm-3 GA3 i 3% sacharozy. Poza tym, celem stymulacji regeneracji, część kalusa poddano działaniu temperatury 4°C i 30°C przez 3 tygodnie. Następnie kalus przeniesiono do temperatury 25°C do momentu regeneracji. Kontrolę stanowił kalus rosnący przez cały czas indukcji i regeneracji w temperaturze 25°C.

Zawartość związków fenolowych oznaczono metodą Folina i Ciocalteu [SIN-GLETON, ROSSI 1965]. 100-250 mg tkanki roślinnej (kalus, eksplantaty) homogenizowano w 2 cm3 80% etanolu i wirowano przy 2800 r.p.m. przez 20 min. Mieszanina reakcyjna zawierała: 1 cm3 rozcieńczonego ekstraktu z tkanek roślinnych, 0,5 cm3 25% Na2CO3 i 0,125 cm3 odczynnika Folina i Ciocalteu (rozcieńczonego przed uŜyciem wodą destylowaną w stosunku 1 : 1). Po 30 min. mierzono absorbancję na spektrofotometrze przy 760 nm. Zawartość fenoli określono w mg kwasu chlorogenowego na 1 g świeŜej masy tkanki roślinnej. Pomiary ilości fenoli wykonano w eksplantatach, w kalusie po 3 tygodniach indukcji i podczas regeneracji w dniach: 0, 1, 2, 4, 7, 14 i 28 po przeniesieniu na poŜywki regenerujące oraz po 3 tygodniowym okresie wzrostu w temperaturze 4°C i 30°C. Wyniki i dyskusja

Zdolności regeneracyjne roślin oraz ilość syntetyzowanych przez nie związków fenolowych regulowana jest przez wiele czynników środowiskowych oraz jest zaleŜna od gatunku rośliny. Wiele związków fenolowych jest nietrwałych, ze względu na reakcje chemiczne i biochemiczne zachodzące z ich udziałem. Do najwaŜniejszych naleŜy reakcja utleniania enzymatycznego powodująca brązowienie. To brązowienie tkanek zachodzi pod wpływem enzymu oksydazy polifenolowej. W obecności tlenu zawartego w powietrzu, enzym katalizuje pierwszą fazę biochemicznej przemiany związków fenolowych do chinonów, które dalej polimeryzują do nierozpuszczalnych polimerów o ciemnej barwie nazywanych melaninami. W kulturach in vitro ciemnienie tkanek wywołane utlenianiem polifenoli wydaje się być główną przyczyną słabej regeneracji kalusa. Reakcja utleniania polifenoli następuje zwykle po skaleczeniu tkanki lub innym mechanicznym oddziaływaniu, powodującym uszkodzenie komórek. Z przeprowadzonych eksperymentów wynika, Ŝe ilość związków fenolowych występujących w eksplantatach i kalusie bobiku była równieŜ zaleŜna od ich potencjału morfogenetycznego.

R z e p a k ; R a p e

0

5

1 0

1 5

2 0

N R R

Fenole; Phenols [mg/g FW]

P s z e n i c a ; W h e a t

0

5

1 0

1 5

2 0

N R R


E k s p l a n t a t y ; E x p l a n t s

K a l u s ; C a l lu s

B o b i k ; F i e l d b e a n

0

5

1 0

1 5

2 0

N R R

Fenole; Pheno

ls [mg/g FW]

WPŁYW AKUMULACJI ZWIĄZKÓW FENOLOWYCH ...

205

Rys. 1. Ilość endogennych związków fenolowych w nieregenerujących (NR) i regene-

rujących (R) eksplantatach i kalusie pszenicy, bobiku oraz rzepaku po 3 tygodniach indukcji w 25°C. Wartości średnie z trzech powtórzeń ± SD

Fig. 1. Endogenic amount of phenolic compounds in non-regenerable (NR) and regenerable

(R) explants and callues of wheat, field bean and rape after 3 weeks of induction at 25°C. Mean values from three replicates ± SD

Kalus pszenicy, charakteryzujący się największym potencjałem regeneracyjnym (tab. 1), zawierał najmniej związków fenolowych, a słabo regenerujący kalus rzepaku gro-madził ok. 9-krotnie więcej polifenoli (rys. 1). Tkanki eksplantatów odznaczały się znacznie wyŜszą zawartością polifenoli (ok. 7-18 mg⋅g-1 św.m.) w porównaniu z 3-tygodniowym kalusem rosnącym na poŜywkach indukujących (ok. 0,7-7 mg⋅g-1 św.m.), (rys. 1). Ponadto tkanki nieregenerujące, zarówno eksplantaty jak i kalus gromadziły większe ilości polifenoli (o ok. 20%) w porównaniu z tkankami regenerującymi. RównieŜ HRUBCOVÁ i in. [1994] oraz CVIKROVÁ i in. [1996, 1999] wykazali, Ŝe nieembriogenna zawiesina komórkowa i kalus Medicago sativa produkują więcej związków fenolowych niŜ zawiesina embriogenna. BERUTO i in. [1996] takŜe opisuje wysoki poziom fenoli w nieregenerującym kalusie Ranunculus asiaticus L. w porównaniu z kalusem regenerującym. Tabela 1; Table 1 Procent kalusów pszenicy, bobiku oraz rzepaku regenerujących pędy w zaleŜności od 3 tygodniowego okresu wzrostu w temperaturze 4°C, 25°C i 30°C (analizy wykonano na 9 tygodniowym kalusie) Per cent of wheat, field bean and rape calluses regenerating shoots in response to 3 weeks growth at the temperature of 4°C, 25°C and 30°C (analyses were done on the 9 week old calluses)

Rośliny; Plants

% kalusów regenerujących pędy; % of calluses regenerating shoots

4°C

25°C

30°C

Pszenica; Wheat

72

33

0

Bobik; Field bean

65

30

0 Rzepak; Rape

8

5

0

Powstrzymywanie reakcji brązowienia enzymatycznego polega zwykle na

inaktywacji oksydazy polifenolowej (termicznie) lub usunięciu podstawowych rea-gentów z produktu (najczęściej tlenu). Po pasaŜu kalusa na poŜywki regeneracyjne (i co za tym idzie dostarczeniu nowej porcji tlenu), wzrastała ilość związków fenolowych w nieregenerującym kalusie pszenicy i bobiku (rys. 2; 0 dzień prowadzenia kultury). W kolejnych dniach wzrostu kalusa zmiany zawartości polifenoli miały charakter


206

oscylacyjny. W kalusie zdolnym do regeneracji ich ilość wzrastała z chwilą pojawienia się centrów merystematycznych i pierwszych pędów. W przypadku kalusa pszenicy był to ok. 3-4 dzień po pasaŜu, a bobiku ok. 18 dzień po pasaŜu. Kalus rzepaku odznaczał się słabym potencjałem regeneracyjnym (ok. 5% kalusów regenerowało), co tłumaczy niŜszy poziom polifenoli w kalusie regenerującym, w porównaniu z nieregenerującym, przez cały okres prowadzenia kultury. Podobną zaleŜność obserwowali LOZOVAYA i in. [1996, 2000] w kalusie Fagopyrum esculentum, Fagopyrum tataricum i Zea mays, gdzie tkanki ze zregenerowanymi pędami charakteryzowały się zawartością związków fenolowych na poziomie tkanki nieróŜnicującej. Analizowali oni równieŜ zawartość kwasów ferulowego i wanilinowego w kalusie, w zaleŜności od zdolności regeneracyjnych tkanek. Najwięcej tych kwasów obserwowali w kalusie regenerującym, we wczesnych stadiach morfogenezy. Ok. 20% mniej w kalusie regenerującym korzenie, a w kalusie nieregenerującym ich ilość była znikoma. Autorzy sugerują, Ŝe zawartość związków fenolowych w ścianie komórkowej, a w szczególności ilość kwasu ferulowego, moŜe być biochemicznym wskaźnikiem zdolności tkanek do róŜnicowania. RównieŜ LAUKKANEN i in. [1999] oraz LORENZO i in. [2001] odnotowali zaleŜność pomiędzy ilością polifenoli i ich utlenianiem, po kolejnych pasaŜach i zdolnościami regene-

racyjnymi tkanek.

Pszenica; Wheat

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

0 1 2 4 7 14 28

Fenole; P

henols [m

g/g FW]

R

NR

Bobik; Field bean

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 1 2 4 7 14 28


Rzepak; Rape

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 1 2 4 7 14 28

Dni prowadzenia kultury; Days of culture

Fenole; P

henols [m

g/g FW]


207

Rys. 2. Ilość endogennych związków fenolowych w kalusie pszenicy, bobiku oraz rzepaku nieregenerującym (NR) i regenerującym (R) w ciągu 28 dni wzrostu na poŜywkach regeneracyjnych w 25 Fig. 2. Endogenic amount of phenolic compounds in non-regenerable (NR) and regenerable (R) calluses of wheat, field bean and rape during 28 days of growing on regeneration media at 25

Pszenica; Wheat

0

0,5

1

1,5

2

4 ºC 25 ºC 30 ºC

Fenole; Pheno

ls [mg/g FW] NR R

Bobik; Field bean

0

5

10

15

20

4 ºC 25 ºC 30 ºC

Fenole; Pheno

ls [mg/g FW]

Rzepak; Rape

0

1

2

3

4

4 ºC 25 ºC 30 ºC



208

Rys. 3. Ilość endogennych związków fenolowych w nieregenerującym (NR) i regenerującym

(R) kalusie pszenicy, bobiku oraz rzepaku po 3 tygodniach wzrostu w temperaturze 30°C, 4°C i 25°C. Wartości średnie z trzech powtórzeń ± SD

Fig. 3. Endogenic amount of phenolic compounds in non-regenerable (NR) and regenerable

(R) calluses of wheat, field bean and rape after 3-week growth at the temperature of 30°C, 4°C and 25°C. Mean values from three replicates ± SD

Temperatura wpływała równieŜ na metabolizm polifenoli. JuŜ w temperaturze

poniŜej 7°C następuje wstrzymanie aktywności oksydazy polifenolowej, choć enzym nie jest dezaktywowany. W badaniach własnych temperatura 4°C przedłuŜała Ŝywotność kalusa i stymulowała tworzenie pędów (tab. 1) oraz syntezę związków fenolowych w kalusie zdolnym do regeneracji (rys. 3). LAUKKANEN i in. [1999] stwierdzili w swoich badaniach, Ŝe czynniki które indukują róŜnicowanie, stymulują równieŜ syntezę związków fenolowych. W badaniach własnych temperatura 30°C hamowała regenerację oraz przyspieszała brunatnienie i obumieranie tkanek. Niska zawartość związków fenolowych w tej temperaturze w kalusie bobiku i rzepaku świadczy o szybkim utlenieniu związków fenolowych. Jednak w kalusie pszenicy ilość endogennych związków fenolowych była niezaleŜna od temperatury. Wnioski 1. Tkanki regenerujące (eksplantaty i kalus) charakteryzują się niŜszą zawartością

endogennych związków fenolowych w porównaniu z tkankami nie-regenerującymi. RóŜnice te są tym większe im większy jest potencjał morfo-genetyczny tkanki.

2. Niska temperatura, hamująca utlenianie polifenoli w kalusie, stymuluje re-generację.

Literatura BERUTO M., CUIRI P., DEBERGH P. 1996. Callus growth and somatic embryogenesis in thalamus tissue of Ranunculus asiaticus L. cultivated in vitro: cytokinin effect and phenol metabolism. In Vitro Cell Dev. Biol. 32: 154-160.

CLOSE D.C., DAVIES N.W., BEADLE CH.L. 2001. Temporal variation of tannins (galloylg-lucoses), flavonols and anthocyanins in leaves of Eucalyptus nitens seedlings: impli-cations for light attenuation and antioxidant activities. Aust. J. Plant Physiol. 28: 269-278.

CVIKROVÁ M., BINAROVÁ P., EDER J., VÁGNER M., HRUBCOVÁ M., ZOŃ J., MACHÁČKOVÁ I. 1999. Effect of inhibition of phenylalanine ammonia-lyase activity on growth of alfalfa cell suspension culture: Alterations in mitotic index, ethylene production, and contents


209

of phenolics, cytokinins and polyamines. Physiol. Plant. 107(3): 329-337.

CVIKROVÁ M., HRUBCOVÁ M., EDER J., BINAROVÁ P. 1996. Changes in the levels of endogenous phenolics, aromatic monoamines, phenylalanin ammonia-lyase, peroxidase and auxin oxidase activities during initiation of alfalfa embryogenic and no-nembryogenic calli. Plant Physiol. Biochem. 34(6): 853-861.

HRUBCOVÁ M., CVIKROVÁ M., EDER J. 1994. Peroxidase activities and contents of phenolic acids in embryogenic and nonembryogenic alfalfa cell suspension cultures. Biol. Plant. 36: 175-182.

HUTZLER P., FISCHBACH R., HELLER W., JUNGBLUT T. P., REUBER S., SCHMITZ R., VEIT M., WEISSENBOCK G., SCHNITZLER J. P. 1998. Tissue localization of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. J. Exp. Bot. 49(323): 953-965.

LARRONDE F., KRISA S., DECENDIT A., CHAZE C., DEFFIEUX G., MERILLON J. M. 1998. Re-gulation of polyphenol production in Vitis Vinifera cell suspension cultures by sugars. Plant Cell Rep. 17: 946-950.

LAUKKANEN H., HÄGGMAN H., KONTUNEN-SOPPELA S., HOHTOLA A. 1999. Tissue browning of in vitro cultures of Scot pine: Role of peroxidase and polyphenol oxidase. Physiol. Plant. 106: 337-343.

LEWIS CH.E., WALKER J.R.L., LANCASTER J.E., CONNER A.J. 1998. Light regulation of anthocyanin, flavonoid and phenolic acid biosynthesis in potato minitubers in vitro. Aust. J. Plant Physiol. 25: 915-922.

LORENZO J.C., DE LOS ANGELES BLANCO M., PELAEZ O., GONZALEZ A., CID M., IGLESIAS A., GONZALEZ B., ESCALONA M., ESPINOSA P., BORROTO C. 2001. Sugarcane micropropagation and phenolic excretion. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 65: 1-8.

LOZOVAYA V.V., GORSHKOVA T.A., RUMYANTSEVA N., ULANOV A.V., VALIEVA A.I., YABLO-KOVA E.V., MEI CH., WILDHOLM J.M. 2000. Cell wall-bound phenolics in cells of maize (Zea mays, Gramineae) and buckwheat (Fagopyrum tataricum, Polygonaceae) with different plant regeneration abilities. Plant Sci. 152: 79-85.

LOZOVAYA V.V., GORSHKOVA T., YABLOKOVA E., ZABOTINA O., AGEEVA M., RUMYANTSEVA

N., KOLESNICHENKO E., WARANYUWAT A., WILDHOLM J. 1996. Callus wall phenolics and plant regeneration ability. J. Plant Physiol. 148: 711-717.


MURPHY A., PEER W.A., TAIZ L. 2000. Regulation of auxin transport by aminopeptidases and endogenous flavonoids. Planta 211: 315-324.

RUIZ J.M., GARCIA P.C., RIVERO M., ROMERO L. 1999. Response of phenolic metabolism to the application of carbendazim plus boron in tobaco. Physiol. Plant. 106: 151-157.

SCHOENWAELDER M.A., WIENCKE C. 2000. Phenolic compounds in the embryo develop-ment of several northern hemisphere fucoids. Plant Biol. 2: 24-33.

SINGLETON V.S., ROSSI JR J.A. 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagent. Amer. J. Enol. Viticult. 16: 144-158.

TANAKA N., SHIMOMURA K., ISHIMARU K. 1995. Tannin production in callus cultures of Quercus acutissima. Phytochem. 40(4): 1151-1154. Słowa kluczowe: Brassica napus ssp. oleifera, związki fenolowe, kalus, regeneracja,

Triticum aestivum, Vicia faba L. minor Streszczenie

Związki fenolowe są jednym z czynników uniemoŜliwiającymi regenerację w kulturach in vitro. Produkty ich utleniania, chinony, powodują brunatnienie tkanek, nekrozy, a następnie obumieranie całego kalusa. Ich rola w procesie regeneracji nie została jednoznacznie określona, poniewaŜ są one znane zarówno jako antyoksydanty


210

jak i inhibitory wzrostu. Celem prowadzonych badań było określenie ilości endogennych związków fenolowych w zaleŜności od zdolności regeneracyjnych kalusa i warunków prowadzenia kultury. W wyniku przeprowadzonych eksperymentów stwierdzono, Ŝe endogenny poziom związków fenolowych zaleŜał od rodzaju tkanki, jej zdolności regeneracyjnych i gatunku rośliny. Eksplantaty zawierały kilkakrotnie więcej związków fenolowych niŜ kalus. Największą ilość związków fenolowych zawierały eksplantaty bobiku, ok. 15-18 mg⋅g-1 św.m., a najmniej rzepaku, ok. 8 mg⋅g-1 św.m. RównieŜ kalus bobiku zawierał ok. 10-krotnie więcej związków fenolowych w porównaniu z kalusem pszenicy i rzepaku. Eksplantaty niedojrzałych zarodków i kalus regenerujący, zawierały mniejsze ilości związków fenolowych w porównaniu z tkankami, z których regeneracja nie powiodła się. W kalusie zdolnym do regeneracji, w początkowym etapie organogenezy, kiedy obserwowano powstawanie centrów merystematycznych odnotowano znaczący wzrost zawartości związków fenolowych. Natomiast kalus ze zregenerowanymi pędami charakteryzował się ich zawartością na poziomie tkanki nieróŜnicującej. Ilość endogennych związków fenolowych była równieŜ zaleŜna od temperatury stymulującej regenerację. Po okresie wzrostu w 4°C, kalus bobiku i rzepaku zdolny do regeneracji syntetyzował większe ilości związków fe-nolowych w porównaniu z kalusem rosnącym w 25°C i 30°C. Temperatura nie miała istotnego wpływu na ilość związków fenolowych w kalusie pszenicy. THE INFLUENCE OF PHENOLIC ACUMULATION ON CALLUS REGENERATION ABILITIES OF CHOOSEN PLANT SPECIES Edyta Skrzypek



2

1 Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Kraków 2 Nicolas Copernicus University, Department of Genetic, Toruń Key words: Brassica napus ssp. oleifera, callus, phenolics, regeneration, Triticum

aestivum, Vicia faba L. minor Summary

Phenolics are one of the main factors which inhibit tissue regeneration in tissue culture. Their oxidation products, quinons, cause tissue darkening and necrosis, and next death of the whole callus. Oxidized phenolics compounds can react with enzymes, inhibit their activity and act as growth inhibitors. However, their role in the regeneration process is unambiguous, because they are also known as antioxidants. The aim of the experiment was to determine the amount of endogenous phenolics in relation to the regeneration abilities of callus and culture conditions. The results presented here indicate that the level of endogenous phenolics depends on the type of tissue, its regeneration ability and plant species. Explants contain more phenolics than callus. The highest amounts of phenolics were observed in explants of field bean, ca 15-18 mg⋅g-1 FW and the lowest in rape explants, ca 8 mg⋅g-1 FM. Field bean callus also contained more phenols (ca ten times more) than wheat or rape callus. Phenolic content in callus which is able to shoot regeneration is lower an compared with non-regenerable one. At the beginning of callus differentiation, when the formation of meristematic centers were observed, the amount of phenols increased. Then, the amount of phenolics in the callus with regenerating shoots decreased to the level observed before the differentiation. Phenolic content also depended on temperature used for stimulation of callus regeneration. Regenerable callus of field bean and rape grown at 4°C synthesized more phenolics than the callus grown at 25°C or 30°C. Temperature had no influence on phenolic content in wheat callus.


211

Dr Edyta Skrzypek Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polska Akademia Nauk ul. Niezapominajek 21 30-239 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 213-221 ZMIANY AKTYWNOŚCI ENZYMÓW ANTYOKSYDACYJNYCH PODCZAS REGENERACJI KALUSA BOBIKU (Vicia faba L. minor)1

Edyta Skrzypek 1, Magdalena Szechyńska-Hebda


2

1 Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polskiej Akademii Nauk w Krakowie 2 Zakład Genetyki, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wstęp

1 Badania finansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa WyŜszego w ramach grantu nr 3 PO6A 009 25.

Zdolności do róŜnicowania i regeneracji komórek roślinnych zakodowane są w genomie, ale na ich efektywność wpływa wiele czynników wewnętrznych (np. rodzaj i wiek eksplantatu) oraz środowiskowych (np. temperatura prowadzenia kultur in vitro), których modyfikacje uruchamiają odpowiednie procesy rozwojowe [LI i in. 2001; VRANOVA i in. 2002]. Zmiany czynników stymulujących, bądź hamujących róŜnicowanie wpływają na metabolizm komórek oraz na ich aktywność enzymatyczną. Bobik w kulturach in vitro jest trudną rośliną. Jego kalus szybko obumiera i słabo regeneruje. Temperatura oraz rodzaj eksplantatu wydaje się odgrywać szczególnie waŜną rolę jako czynnik sprawczy w kulturach in vitro bobiku i mający wpływ na aktywność enzymów antyoksydacyjnych. Wstępne traktowanie kultur in vitro niską temperaturą zwiększa znacząco efektywność indukcji kalusa i regeneracji roślin [HOU i in. 1997; JIMÉNEZ, BANGERTH 2001; XYNIAS i in. 2001; TREJO-TAPIA i in. 2002]. Zmiany aktywności enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), katalazy (CAT) oraz peroksydazy (POD) odnotowane zostały podczas somatycznej embriogenezy [RACCHI, TERRAGNA 1993; KAIRONG i in. 1999; LIBIK i in. 2005]. Przydatność POD w ocenie zdolności do róŜnicowania i regeneracji opisują w swoich badaniach: DE VRIES [1992], CORTELAZZO

i in. [1996] oraz LIMAM i in. [1998]. Peroksydazy pełnią funkcję regulatorową w kata-boliźmie auksyn [GAZARYAN i in. 1996], mają zdolność wiązania ze sobą róŜnych składników ściany komórkowej, zaangaŜowane są w metabolizm komponentów aromatycznych i proces lignifikacji [DE MARCO i in. 1999]. Wymienione enzymy antyoksydacyjne współdziałają ze sobą w regulacji stęŜenia nadtlenku wodoru (H2O2). SOD przeprowadza reakcje dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego, produkując H2O2, CAT katalizuje rozkład H2O2, a POD utlenia róŜne substraty w jego obecności. H2O2 jako słaby czynnik utleniający o relatywnie długim czasie trwania moŜe być wtórnym przekaźnikiem informacji, zdolnym do indukowania ekspresji genów i regulowania syntezy białek wspomagających regenerację. Poziom H2O2 zmieniał się podczas namnaŜania komórek w kulturach zawiesinowych [PAPADAKIS, ROUBELAKIS-ANGELAKIS 1999] oraz podczas somatycznej embriogenezy komórek kalusa [KAIRONG i in. 1999].

Celem badań było określenie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy i peroksydazy oraz ilości endogennego nadtlenku wodoru podczas róŜnicowania i


214

regeneracji kalusa bobiku w kulturach in vitro. Materiał i metody

Materiał roślinny stanowiły eksplantaty i kalus bobiku odm. Nadwiślański, indukowany na poŜywce MS [MURASHIGE, SKOOG 1962] zawierającej 1 mg⋅dm-3 hydrolizatu kazeiny, 750 mg⋅dm-3 myo-inozytolu, 1 mg⋅dm-3 BAP, 0,5 mg⋅dm-3 NAA, 0,25 mg⋅dm-3 GA3 i 3% sacharozy. Kalus regenerujący otrzymywano z niedojrzałych zarodków, a nieregenerujący z dojrzałych zarodków. Po okresie 3-tygodniowej indukcji kalus pasaŜowano i przenoszono do temperatury 4°C i 30°C na okres 3 tygodni. Następnie kalus przeniesiono do temperatury 25°C do momentu regeneracji. Kontrolę stanowił kalus rosnący przez cały czas indukcji i regeneracji w temperaturze 25°C.

Materiał roślinny do analiz enzymatycznych homogenizowano w 0,05 mol⋅dm-3 buforze fosforanowym o pH 7,0, w obecności poliwinylopyrolidonu celem usunięcia drobnocząsteczkowych fenoli zakłócających pomiar. Aktywność SOD oznaczono metodą cytochromową [MCCORD, FIODOVICH 1969], aktywność CAT mierzono wg AEBI

[1984], a aktywność POD wg LÜCK [1962]. Aktywności enzymów przeliczono na ilość białka oznaczonego spektrofotometrycznie metodą BRADFORDA [1976].

Ilość wewnątrzkomórkowego nadtlenku wodoru (H2O2) sprawdzono metodą spektrofluorometryczną wg ISHIKAWA i in. [1993] w świeŜych próbkach eksplantatów i kalusa, po uprzedniej homogenizacji w 5% TCA.

Pomiary aktywności enzymów antyoksydacyjnych i H2O2 wykonano w eks-plantatach, w kalusie po 3 tygodniach indukcji i podczas regeneracji w dniach: 0, 1, 2, 4, 7, 14 i 28 po przeniesieniu na poŜywki regenerujące oraz po 3 tygodniowym okresie wzrostu w temperaturze 4°C i 30°C. Wyniki i dyskusja

Analizy aktywności enzymów oraz ilość endogennego H2O2 wykonano w dwóch rodzajach kalusa bobiku: nieregenerującym, otrzymanym z dojrzałych zarodków i regenerującym, otrzymanym z niedojrzałych zarodków. Z przeprowadzonych badań wynika, Ŝe zdolność tkanek do regeneracji zaleŜała od stanu fizjologicznego komórek i mogła mieć bezpośredni związek z podwyŜszoną produkcją reaktywnych form tlenu czy nadtlenku wodoru, prawdopodobnie jako konsekwencja większej intensywności metabolizmu. Temperatura 4°C i 30°C nie indukowała róŜnicowania kalusa powstałego z dojrzałych zarodków. Natomiast temperatura 4°C stymulowała regenerację o 50% w porównaniu z temperaturą 25°C (kontrola), a 30°C całkowicie hamowała regenerację i przyspieszała obumieranie kalusa (tab. 1). Pozytywny wpływ okresowego działania niskiej temperatury na róŜnicowanie komórek obserwowano wielokrotnie w badaniach HOU i in. [1997], JIMÉNEZ i BANGERTH [2001], XYNIAS i in. [2001] czy TREJO-TAPIA i in. [2002]. Tabela 1; Table 1 Procent kalusów bobiku regenerujących pędy w zaleŜności od rodzaju eksplantatu i od 3 tygodniowego okresu wzrostu w temperaturze 4°C, 25°C i 30°C (analizy wykonano na 9 tygodniowym kalusie) Per cent of field bean calluses regenerating shoots in response to the type of explants and to 3 week growth at temperature of 4°C, 25°C and 30°C (analyses were done on the 9 week old callus)

Rodzaj eksplantatu; Type of explant

% kalusów regenerujących pędy % of calluses regenerating shoots

ZMIANY AKTYWNOŚCI ENZYMÓW ANTYOKSYDACYJNYCH ...

215

4°C 25°C 30°C Niedojrzałe zarodki; Immature embryos

65

30

0

Dojrzałe zarodki; Mature embryos

0

0

0

Rys. 1. Ilość endogennego H2O2 oraz aktywność SOD, CAT i POD w eksplantatach i kalusie

bobiku nieregenerujących (NR) i regenerujących (R) po 3 tygodniach indukcji w 25°C (wartości średnie z trzech powtórzeń ± SD)

Fig. 1. Endogenous amount of H2O2 and activity of SOD, CAT and POD in non-regenerable

(NR) and regenerable (R) explants and callus of field bean after 3 weeks of induction at 25°C (mean values from three replicates ± SD)

Eksplantaty oraz 3 tygodniowy kalus bobiku, zdolne do regeneracji, produkowały

większe ilości nadtlenku wodoru (H2O2) w porównaniu z eksplantatami i kalusem nieregenerującym (rys. 1). W ciągu kolejnych 7 dni prowadzenia kultury ilość H2O2 w kalusie regenerującym była nieznacznie wyŜsza niŜ w kalusie nieregenerującym i utrzymywała się na stałym poziomie (rys. 2). W kolejnych dniach prowadzenia kultury poziom H2O2 gwałtownie wzrastał zarówno w kalusie regenerującym jak i nieregenerującym, ale tym razem jego produkcja była większa w kalusie niezdolnym do regeneracji. Udział H2O2 w stymulacji regeneracji potwierdzają badania KAIRONG i in.

H2O2

0

500

1000

1500

2000

2500

Eksplantaty;Explants

Kalus; Callus

Iloś

ć H

2O2 [n

l/g F

W]

Am

ount

of H

2O2 [n

l/g F

W]

SOD

0

0,01

0,02

0,03

0,04


Kalus; Callus

Akt

ywno

ść S

OD

[U

/µg

biał

ka]

SO

D act

ivity

[U

/µg

prot

eins

]

NR R

CAT

0

0,1

0,2

0,3

0,4


Kalus; CallusAkt

ywno

ść C

AT [A

BS/µ

g bi

ałka

]

CA

T a

ctiv

ity [A

BS/µ

g pr

oteins

]

POD

0

0,5

1

1,5

2


Kalus; CallusAkt

ywno

ść P

OD

[A

BS/µ

g bi

ałka

]

PO

D a

ctiv

ity [A

BS/µ

g pr

otei

ns]


216

[1999], gdzie dodany do poŜywek podwyŜszał zdolność tkanek do embriogenezy.

Rys. 2. Ilość endogennego H2O2 oraz aktywność SOD, CAT i POD w kalusie bobiku

nieregenerującym (NR) i regenerującym (R) w ciągu 28 dni wzrostu na poŜywkach regeneracyjnych w 25°C (wartości średnie z trzech powtórzeń ± SD)

Fig. 2. Endogenous amount of H2O2 and activity of SOD, CAT and POD in non-regenerable

(NR) and regenerable (R) callus of field bean during 28 days of growing on the regeneration media at 25°C (mean values from three replicates ± SD)

SOD

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0 1 2 4 7 14 28

Dni prowadzenia kultury; Days of cultureA

ktyw

ność

SO

D [U

/µg

białka

]

SO

D a

ctiv

ity [U

/µg

prot

eins

] NR

R

POD

0

0,5

1

1,5

2

0 1 2 4 7 14 28


Akt

ywno

ść P

OD

[A

BS/µ

g bi

ałka

]

PO

D a

ctiv

ity [A

BS/µ

g pr

oteins

]

H2O2

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 1 2 4 7 14 28


Iloś

ć H

2O2 [n

l/g F

W]

Am

ount

of H

2O2 [n

l/g F

W]

CAT

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0 1 2 4 7 14 28


Akt

ywno

ść C

AT [A

BS/µ

g bi

ałka

]

CA

T a

ctiv

ity [A

BS/µ

g pr

oteins

]


217

Aktywności enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), katalazy (CAT) i peroksydazy (POD) równieŜ były wyŜsze w eksplantach i 3 tygodniowym kalusie regenerującym, w porównaniu z eksplantatami i kalusem nieregenerującym (rys. 1). Aktywności SOD i POD, podobnie jak H2O2, były wyŜsze w kalusie zdolnym do regeneracji i zmniejszały się w ciągu kolejnych 7 dni prowadzenia kultury, a w następnych dniach stopniowo wzrastały. Zmiany SOD dotyczyły głównie izoformy manganowej (dane nieprzedstawione), co wskazuje na zwiększoną produkcję rodnika ponadtlenkowego w mitochondriach i peroksysomach. Badania KAIRONG i in. [1999] wykazały, Ŝe aktywność SOD rośnie we wczesnych etapach dyferencjacji i stopniowo maleje wraz z podziałami i rozwojem wielokomórkowego zarodka. Natomiast wprowadzenie blokerów SOD obniŜało potencjał embriogenezy. PRAMANIK i in. [1996] równieŜ wykazali istotne róŜnice aktywności SOD dla kalusów regenerujących pędy i kalusów nieregenerujących. DE VRIES [1992] wyizolował izoenzym peroksydazy, która podwyŜszała potencjał embriogenny tkanek oraz stymulowała rozwój wczesnych stadiów zarodka. Aktywność CAT spadła 10-krotnie po 3 tygodniowym okresie indukcji kalusa (po pasaŜu), (rys. 2) i utrzymywała się na porównywalnym poziomie w kalusie regenerującym i nieregenerującym do 14 dnia prowadzenia kultury. Następnie aktywność CAT malała w kalusie regenerującym, a znacząco wzrastała w kalusie niezdolnym do regeneracji. Podobną zaleŜność obserwowali KAIRONG i in. [1999], czyli wyŜszą aktywności CAT w kalusie i spadającą gwałtownie w pierwszych dniach dyferencjacji.


218

Rys. 3. Ilość endogennego H2O2 oraz aktywność SOD, CAT i POD w kalusie bobiku nieregenerującym (NR)

i regenerującym (R) po 3 tygodniach wzrostu w temperaturze 30°C, 4°C i 25°C (wartości średnie z trzech powtórzeń ± SD)

Fig. 3. Endogenous amount of H2O2 and activity of SOD, CAT and POD in non-regenerable (NR) and

regenerable (R) callus of field bean after 3-week growth the temperature of 30°C, 4°C and 25°C (mean values from three replicates ± SD)

Aktywności enzymów zmieniały się takŜe w zaleŜności od warunków hodowli,

modyfikujących róŜnicowanie kalusa (rys. 3). Warunki stymulacji (temperatura 4°C) i inhibicji (temperatura 30°C) zwiększały aktywność SOD, CAT i POD w komórkach kalusa nieregenerującego, w porównaniu z kalusem rosnącym w temperaturze 25°C. Zmiany te nie były widoczne w przypadku aktywności SOD i POD w kalusie regenerującym. Obserwowano natomiast istotne zmiany aktywności CAT a kalusie regenerującym, 4°C obniŜały jej aktywność, a 30°C zwiększały ją w porównaniu z aktywnością CAT w 25°C.

Zmiany aktywności enzymów oraz ilości endogennego H2O2 w badanych tkankach sugerują, Ŝe nadtlenek wodoru moŜe być jednym z czynników stymulującym regenerację.

H2O2

0

500

1000

1500

2000

2500

4 ºC 25 ºC 30 ºC

Iloś

ć H

2O2 [n

l/g F

W]

Am

ount

of H

2O2 [n

l/g F

W]

SOD

0

0,05

0,1

0,15

0,2

4 ºC 25 ºC 30 ºC

Akt

ywno

ść S

OD

[U

/µg

białka

]

SO

D a

ctiv

ity [U

/µg

prot

eins

]

NR R

CAT

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

4 ºC 25 ºC 30 ºC

Akt

ywno

ść C

AT [A

BS/µ

g bi

ałka

]

CA

T a

ctiv

ity [A

BS/µ

g pr

oteins

]

POD

0

0,5

1

1,5

2

2,5

4 ºC 25 ºC 30 ºC

Akt

ywno

ść P

OD

[A

BS/µ

g bi

ałka

]

PO

D a

ctiv

ity [A

BS/µ

g pr

otei

ns]


219

Wnioski 1. Tkanki zdolne do regeneracji (eksplantaty i kalus) charakteryzują się wyŜszą

aktywnością dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy oraz peroksydazy, w porównaniu z tankami nieregenerującymi.

2. Wysoka zawartość nadtlenku wodoru w kalusie regenerującym przy niskiej aktywności katalazy, moŜe być czynnikiem zwiększającym potencjał regene-racyjny tkanek.

Literatura AEBI H. 1984. Catalase in vitro. Metch. Enzymol. 105: 121-12.

BRADFORD M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microprogram quantitaties of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.

CORTELAZZO A.L., MARAIC M.F., JOSELEAU J.P. 1996. Changes in peroxidases in suspen-sion culture of Rubrus fructicosus during growth. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 46: 27-33.

DE MARCO A., GUZZARDI P., JAMET E. 1999. Isolation of tobacco isoperoxidases accu-mulated in cell suspension culture medium and characterisation of activities related to cell wall metabolism. Plant Physiol. 120: 371-381.

DE MARCO A., ROUBELAKIS-ANGELAKIS K.A. 1996. The complexity of enzymic control of hydrogen peroxide may affect the regeneration potential of plant protoplasts. Plant Physiol. 110: 137-145.

DE VRIES S.C. 1992. Secreted proteins as modulators of plant embryogenesis, w: Procesy róŜnicowania w kulturach tkanek i komórek roślinnych. Szweykowska A. 1994, Prace Ogrodu Botanicznego PAN 5/6: 9-18.

GAZARYAN I.G., LAGRIMINI L.M., ASHBY G.A., THORNELEY R. 1996. The mechanism of indolile-3-acetic acid oxidation by plant peroxidases: anaerobic stopped-flow spectro-photometric studies on horsedish and tobacco peroxidases. Biochem. J. 313: 841-847.

HOU B., YU H., TENG S. 1997. Effects of low temperature on induction and differentiation of wheat calluses. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 49: 35-38.

ISHIKAWA T., TAKEDA T., SHIGEOKA S., HIRAYAMA O., MITSUNAGA T. 1993. Hydrogen per-oxide generation in organelles of Euglena gracilis. Phytochemistry 33: 1297-1299.

JIMÉNEZ V.M., BANGERTH F. 2001. Endogenous hormone levels in explants and in embryogenic and non-embryogenic cultures of carrot. Physiol. Plant. 111: 389-395.

KAIRONG C., GENGSHENG X., XINMIN L., GENGMEI X., YAFU W. 1999. Effect of hydrogen peroxide on somatic embryogenesis of Lycium barbanum L. Plant Sci. 146: 9-16.

LI W.Z., SONG Z.H., GUO B.T., XU L.J. 2001. The effects of DNA hypomethylating drugs on androgenesis in barley (Hordeum vulgare L.). In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 37: 605-608.

LIBIK M., KONIECZNY R., PATER B., ŚLESAK I., MISZALSKI Z. 2005. Differences in the activities of some antioxidant enzymes and in H2O2 content during rhizogenesis and somatic embryogenesis in callus cultures of the ice plant. Plant Cell Rep. 23(12): 834-41.

LIMAM F., CHAHED K., OUELHAZI N., GHRIR R., OUELHAZI L. 1998. Phytohormones regu-


220

lation of isoperoxidases in Catharanthus roseus suspention culture. Phytochemistry 49: 1219-1225.

LÜCK 1962. Methoden der enzymatisch en Analyse. Verlag Chemie, GmbH Weinheim: 895-897.

MCCORD J.M., FIODOVICH I. 1969. Superoxide dismutase an enzymic function for ery-trocuperein (hemocuperein). J. Biol. Chem. 244: 6049-6055.


PAPADAKIS A.K., ROUBELAKIS-ANGELAKIS A. 1999. The generation of active oxygen spe-cies differs in tobacco and grapevine mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 121: 197-205.

PRAMANIK S., RAYCHAUDHURI S.S., CHAKRABORTY S. 1996. Changes in esterase and su-peroxide dismutase isosymes during in vitro morphogenesis in Plantago ovata Forssk. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 44: 123-127.

RACCHI M., TERRAGNA C. 1993. Catalase izozymes are useful markers of differentiation in maize tissue cultures. Plant Sci. 93: 195-202.

TREJO-TAPIA G., AMAYA U.M., MORALES G.S., SANCHEZ A.J., BONFIL B.M., RODRIGUEZ-MONROY M., JIMENEZ-APARICIO A. 2002. The effect of cold-pretreatment and carbon source on anther culture of rice. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 71: 41-46.

VRANOVA E., INZE D., VAN BREUSEGEM F. 2002. Signal transduction during oxidative stress. J. Exp. Bot. 372: 1227-1236.

XYNIAS I.N., ZAMANI I.A., GOULI-VAVDINOULI E. 2001. Effect of cold pre-treatment and incubation temperature on bread wheat (Triticum aestivum L.) anther culture. Cer. Res. Com. 29: 331-338. Słowa kluczowe: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza (CAT), nadtlenk

wodoru (H2O2), peroksydaza (POD), regeneracja, Vicia faba L. minor

Streszczenie

W pracy określono zmiany aktywności enzymów antyoksydacyjnych podczas róŜnicowania i regeneracji kalusa bobiku w kulturach in vitro. Badania prowadzono na dwóch rodzajach kalusa: regenerującym, otrzymanym z niedojrzałych zarodków i nieregenerującym, otrzymanym z dojrzałych zarodków. Eksplantaty oraz 3 tygodniowy kalus bobiku, zdolne do regeneracji produkowały większe ilości nadtlenku wodoru (H2O2) w porównaniu z eksplantatami i kalusem nieregenerującym. W ciągu kolejnych 7 dni prowadzenia kultury ilość H2O2 utrzymywała się na stałym poziomie, a następnie gwałtownie wzrastała niezaleŜnie od zdolności regeneracyjnych kalusa. Aktywności enzymów antyoksydacyjnych: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), katalazy (CAT) i peroksydazy (POD) były wyŜsze w eksplantatach i kalusie regenerującym po 3 tygodniach indukcji, w porównaniu z eksplantatami i kalusem nieregenerującym. Aktywności te zmieniały się równieŜ w zaleŜności od warunków hodowli, modyfikujących róŜnicowanie kalusa. Warunki stymulacji regeneracji (temperatura 4°C) i inhibicji (temperatura 30°C) istotnie zwiększały aktywność SOD, CAT i POD w komórkach kalusa nieregenerującego, w porównaniu z kalusem rosnącym w temperaturze 25°C. Kalus regenerujący rosnący w 25°C charakteryzował się większą aktywnością SOD i POD niŜ kalus nieregenerujący. Ich aktywność stopniowo malała do 7 dnia prowadzenia kultury, a w kolejnych dniach ponownie wzrastała. Aktywność CAT w kalusie regenerującym i nieregenerującym utrzymywała się na porównywalnym poziomie do 14 dnia prowadzenia kultury, następnie jej aktywność malała w kalusie


221

regenerującym, a znacząco wzrastała w kalusie niezdolnym do regeneracji. Z przeprowadzonych badań wynika, Ŝe zdolność tkanek do regeneracji zaleŜy od stanu fizjologicznego komórek i moŜe mieć bezpośredni związek z produkcją nadtlenku wodoru i reaktywnych form tlenu. Zmiany aktywności enzymów oraz ilości endogennego H2O2 w badanych tkankach sugerują, Ŝe H2O2 moŜe być jednym z czynników stymulującym regenerację. CHANGES OF ANIOXIDATIVE ENZYME ACTIVITIES DURING REGENERATION OF FIELD BEAN (Vicia faba L. minor) CALLUS Edyta Skrzypek



2

1 Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Kraków 2 Department of Genetic, Nicolas Copernicus University, Toruń Key words: superoxidase dismutase (SOD), catalase (CAT), hydrogen peroxide

(H2O2), peroxidase (POD), regeneration, Vicia faba L. minor Summary

The aim of the experiment was to determine changes in antioxidative enzyme activities during the differentiation and regeneration of field bean in the tissue culture. The experiment was carried out with two types of callus: regenerable, obtained from immature embryos and non-regenerable, obtained from mature embryos. Explants and 3-week-old callus of field bean, able to regenerate, produced more hydrogen peroxide (H2O2) than explants and callus not able to regenerate. During the next 7 days of culture, the amount of H2O2 was constant and then sharply increase independently of the regeneration abilities of calli. Activities of antioxidative enzymes: superoxidase dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) were higher in regenerable explants and callus after 3 weeks of induction as compared to explants and non-regenerable callus. These activities also changed in relation to the culture condition, which modified callus differentiation. Both conditions: stimulating (4°C) and inhibiting (30°C) regeneration increased the activities of SOD, CAT and POD in non-regenerable callus as compared to callus grown at 25°C. Regenerating callus grown at 25°C had a higher activity of SOD and POD, than non-regenerating one. Their activities decreased till day 7 of the culture, and again increased in the subsequent days of the culture. CAT activity in callus able and not able to regenerate was on the same level till day 14 of the culture. Than, the activity of CAT decreased in regenerable callus and significantly increased in non-regenerable ones. The conducted experiment showed that the abilities of tissues to regenerate depended on the physiological state of cells and might be correlated with the production of hydrogen peroxide and reactive oxygen species. Changes of antioxidative enzyme activities and endogenous H2O2 level in the examined tissues suggest that hydrogen peroxide might be one of the factors stimulating regeneration. Dr Edyta Skrzypek Instytut Fizjologii Roślin im. F. Górskiego Polska Akademia Nauk ul. Niezapominajek 21 30-239 KRAKÓW e-mail: [email protected]


222

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 223-227 PRÓBY STYMULACJI PRODUKCJI METABOLITÓW WTÓRNYCH W KULTURACH in vitro Ginkgo biloba L. Agnieszka Szewczyk Katedra i Zakład Botaniki Farmaceutycznej Collegium Medicum, Uniwersytet Jagielloński w Krakowie Wstęp

Miłorząb japoński (Ginkgo biloba L.) jest jedynym i reliktowym przedstawi-cielem klasy Ginkgopsida. Liście Ginkgo biloba L. są źródłem farmakologicznie czynnych laktonów z grupy di- i seskwiterpenoidów oraz związków flawonoidowych (o strukturze mono- i dimerycznej). Preparaty z liści są stosowane w lecznictwie, głównie w zaburzeniach krąŜenia mózgowego i obwodowego [WICHTL 1997]. Badania biogenezy terpenoidów oraz moŜliwości pozyskiwania tych związków metodami biotechnologicznymi, z róŜnego typu kultur in vitro tego gatunku, są przedmiotem wielu prac naukowych. W dostępnym piśmiennictwie jest natomiast niewiele doniesień na temat występowania innych metabolitów wtórnych w kulturach in vitro Ginkgo biloba. W tkance kalusowej oraz kulturach zawiesinowych stwierdzono obecność katechin i oligomerycznych proantocyjanidyn. Zawartość związków farmakologicznie czynnych jest niŜsza niŜ w roślinach gruntowych [BEEK 2000].

Celem niniejszej pracy było zbadanie moŜliwości zwiększenia produkcji fla-wonoidów poprzez zastosowanie metody elicytacji jasmonianem metylu kultur zawiesinowych z okazów Ŝeńskich Ginkgo biloba. Liczne doniesienia literaturowe wskazują, Ŝe jasmonian metylu moŜe stymulować kultury in vitro róŜnych gatunków roślin do zwiększenia produkcji biogenetycznie róŜnych grup metabolitów wtórnych m.in. antocyjanów, hyperycyny, saponin triterpenowych [LU 2001; WALKER 2002; PLATA 2003]. Materiał i metody Kultury in vitro

Komórkowe kultury zawiesinowe zainicjowano z tkanki kalusowej wyprowa-dzonej z liści okazów Ŝeńskich Ginkgo biloba L. otrzymanych z Ogrodu Botanicznego UJ w Krakowie. Wytrząsanie kultur zawiesinowych prowadzono w kolbach Erlen-meyera na poŜywce płynnej wg Murashige-Skooga [MURASHIGE, SKOOG 1962] z dodat-kiem pikloramu (4 mg⋅dm-3) oraz BA (2 mg⋅dm-3), pH 5,6, w temp. 25°C±1°C, przy ciągłym, sztucznym oświetleniu (ok. 2000 lx).

A. Szewczyk

224

Elicytacja

W ramach prowadzonych badań przetestowano ilość i sposób dodawania jasmonianu metylu: ilość dodawanego do hodowli jasmonianu metylu – 250 µM,125 µM, 50µM, 25 µM, sposób dodawania elicytora – po 0, 1, 2, 3 tygodniach hodowli. Hodowle po elicytacji likwidowano co 24 godz. w ciągu 5 dni. Biomasę oraz poŜywki zbierano i liofilizowano. Hydroliza

Badany materiał poddano hydrolizie roztworem wodnym kwasu solnego (25% HCl) w celu odłączenia reszt cukrowych od aglikonów. 0,5 g zliofilizowanego surowca zalewano 5 ml 25% wodnego roztworu HCl oraz 25 ml MeOH i wytrząsano przez 60 min. Otrzymane hydrolizaty oczyszczono wstępnie od substancji balastowych techniką SPE (kolumna C18). Analizy HPLC

Analizy prowadzono z wykorzystaniem aparatu Merck Hitachi (detektor UV L-7400, kolumna LiChrospher 100 RP-18e). Warunki analizy dla monomerycznych flawonoidów: λ = 370 nm, faza ruchoma metanol: 0,5% kwas fosforowy 1 : 1 v/v; sub-stancje wzorcowe (Sigma), czasy retencji (min.): apigenina RT = 34,7; kemferol RT = 31,7; kwercetyna RT = 16,1; luteolina RT = 18; mirycetyna RT = 6,85. Warunki analizy dla biflawonoidów: λ = 330 nm, faza ruchoma tetrahydrofuran : woda : 85% kwas fosforowy 40 : 60 : 1 v/v/v; substancje wzorcowe (Promochem), czasy retencji (min): amentoflawon RT = 16,54; bilobetyna RT = 22,5; ginkgetyna RT = 25,19. Wyniki i dyskusja

Na podstawie doniesień literatury stwierdzono, Ŝe stosowane dotychczas stęŜenia jasmonianu metylu (JM) jako elicytora zaleŜały od rodzaju gatunku rośliny i rodzaju kultury in vitro. W kulturze zawiesinowej Ipomoea batatas PLATA i in. [2003] zastosowali 4,5-44,5 µM JM, natomiast ZHAO i in. [2004] w kulturze zawiesinowej Caesalpinia pulcherrima 0,3 mM tego związku. W korzeniach transformowanych Scutellaria baicalensis najlepsze okazało się stęŜenie 100 µM jasmonianu metylu [KUZOVKINA i in. 2001]. Po przeprowadzeniu optymalizacji procesu elicytacji w prezen-towanej pracy stwierdzono, Ŝe najlepsze wyniki uzyskano w przypadku uzupełnienia poŜywki 25 µM jasmonianu metylu po 2 tygodniach hodowli. W wyniku analizy chromatograficznej HPLC biomasy stwierdzono zwiększenie produkcji mono- i dimerycznych flawonoidów po elicytacji jasmonianem metylu. Tabela 1 przedstawia wyniki analizy ilościowej flawonoidów w kulturach kontrolnych i poddanych elicytacji. Zaobserwowano 50% wzrost produkcji kwercetyny i kemferolu po 48 godz. od dodania elicytora. W przypadku biflawonoidów zaobserwowano zmiany ilościowe i jakościowe. Po elicytacji znacząco zwiększyła się produkcja bilobetyny (87% po 48 godz.), wykryto równieŜ ginkgetynę oraz śladowe ilości amentoflawonu, nieobecne w próbach kontrolnych. W poŜywkach pobranych po 24 godz. i 48 godz. elicytacji stwierdzono śladową zawartość obu grup flawonoidów. W dostępnej literaturze nie znaleziono doniesień o występowaniu flawonoidów w kulturach in vitro Ginkgo biloba oraz o próbach zwiększenia ich produkcji metodą elicytacji. Po elicytacji jasmonianem metylu kultur korzeni transformowanych Scutellaria baicalensis, zawartość flawonoidów po 72 godz. wzrosła 2,3-krotnie [KUZOVKINA i in. 2001].

PRÓBY STYMULACJI PRODUKCJI METABOLITÓW WTÓRNYCH ...

225

Tabela 1; Table 1 Zawartość flawonoidów w kulturach in vitro Ginkgo biloba L. Content of flavonoids in in vitro cultures of Ginkgo biloba L.

Zawartość flawonoidów Content of flavonoids (mg⋅g-1 s.m.;

DM)

Czas dodania prekursora; Elicytor-adding time

kontrola control

24 godz.; 24 h

48 godz.; 48 h

72 godz.; 72 h

96 godz.; 96 h

Kwercetyna Quercetin

0,006±0,0003

0,0078±0,00009

0,0091±0,00003

0,009±0,0002

0,0086±0,0009

Kemferol

Kaempferol

0,0021±0,0002

0,0029±0,0002

0,0044±0,0001

0,0041±0,0001

0,0037±0,00005

Ginkgetyna Ginkgetin

0,0005±0,0001

0,0007±0,00006

0,000935±0,0002

0,0009±0,0001

0,0008±0,0004

Wnioski

Zastosowanie elicytora w ilości 25 µM nie powoduje zamierania hodowli zawiesinowych w ciągu 5 dni. Wyniki analizy chromatograficznej HPLC pozwalają stwierdzić, Ŝe elicytacja jasmonianem metylu moŜe stymulować kultury Ginkgo biloba do zwiększenia produkcji flawonoidów. Literatura BEEK T.A. 2000. Ginkgo biloba. Harwood Academic Publishers, Amsterdam.

KUZOVKINA I.N., GUSEVA A.V., ALTERMAN I.E., KARNACHUK R.A. 2001. Flavonoid pro-duction in transformed Scutellaria baicalensis roots and ways of its regulation. Russian J. Plant Physiol. 48: 523-528.

LU M.B., WONG H.L., TENG W.L. 2001. Effects of elicitation on the production of saponin in cell culture of Panax ginseng. Plant Cell Rep. 20: 674-677.

MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-497.

PLATA N., KONCZAK-ISLAM I., JAYRAM S., MCCLELLAND K., WOOLFORD T., FRANKS P. 2003. Effect of methyl jasmonate and p-coumaric acid on anthocyanin composition in sweet potato cell suspension culture. Biochem. Engineering Journ. 14: 171-177.

WALKER T.S., BAIS H.P., VIVANCO J.M. 2002. Jasmonic acid-induced hypericin produc-tion in cell suspension cultures of Hypericum perforatum L. (St. John’s wort). Phytochemistry 60: 289-293.

WICHTL M. 1997. Teedrogen und Phytopharmaka. Wissenschaft. Verl., Stuttgart: 257-260.

ZHAO P., YUKO I., ISAO K., YASUKUNI E., HIROBUMI Y. 2004. Stimulating the production of homoisoflavonoids in cell suspenion cultures of Caesalpinia pulcherrina using cork tisssue. Phytochemistry 65: 2455-2461. Słowa kluczowe: flawonoidy, Ginkgo biloba L., zawiesinowe komórkowe kultury,

A. Szewczyk

226

jasmonian metylu Streszczenie

Kultury zawiesinowe Ginkgo biloba L. wyprowadzono z tkanek kalusowych regenerowanych z liści okazów Ŝeńskich. Kultury prowadzono na podłoŜu Murashige-Skooga z dodatkiem pikloramu (4 mg⋅dm-3) oraz BA (2 mg⋅dm-3). Zbadano wpływ stęŜenia i sposobu dodawania elicytora - jasmonianu metylu na akumulację fla-wonoidów oraz wzrost hodowli zawiesinowych. Stwierdzono, Ŝe najlepszą metodą jest dodatek 25 µM jasmonianu metylu w 14 dniu hodowli. Analizy ekstraktów metanolowych prowadzono metodą HPLC. Detekcję aglikonów flawonoidów pro-wadzono po hydrolizie glikozydów 25% wodnym roztworem HCl. Wyniki sugerują, Ŝe dodatek jasmonianu metylu moŜe stymulować kultury zawiesinowe Ginkgo biloba do zwiększenia produkcji flawonoidów. THE STUDIES OF STIMULATION OF THE SECONDARY METABOLITE PRODUCTION IN in vitro CULTURES OF Ginkgo biloba L. Szewczyk Agnieszka Chair and Department of Pharmaceutical Botany, Collegium Medicum, Jagiellonian University, Kraków Key words: flavonoids, Ginkgo biloba L., cell suspension cultures, methyl ja-

smonate Summary

Cell suspension cultures of Ginkgo biloba L. were initiated from female plant callus cultures. Cultures were maintained on the Murashige-Skoog medium supplemented with picloram (4 mg⋅dm-3) and BA (2 mg⋅dm-3). The aim of this study was to investigate the impact of elicitor concentration and elicytor-adding time on the flavonoid accumulation and the cell growth of Ginkgo biloba cell suspensions. Methyl jasmonate was used as the elicytor. The optimum concentation of methyl jasmonate (25 µM) and time to add elicitor (14 the day of inoculation) was found. The analyses of methanol extracts were conducted by the HPLC method. Aglycons of flavonoids were detected after the hydrolisis of glycosides in 25% aqueous HCl. The results suggest that the addition of an elicytor to Ginkgo biloba cell suspension cultures could stimulate the production flavonoids. Mgr Agnieszka Szewczyk Katedra i Zakład Botaniki Farmaceutycznej Collegium Medicum Uniwersytet Jagielloński ul. Medyczna 9 30-688 KRAKÓW e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 229-236 POTENCJAŁ MORFOGENETYCZNY EKSPLANTATÓW Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH. W KULTURACH in vitro Kinga Szczypińska, Robert Cegielski, Lucyna Drozdowska Katedra Fizjologii Roślin, Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy im. J.J. Śniadeckich w Bydgoszczy Wstęp

Tworzenie de novo pędów jest procesem złoŜonym, warunkowanym przez szereg endo- i egzogennych czynników i nie do końca poznanym. U Arabidopsis thaliana waŜnym czynnikiem róŜnicującym zdolności do regeneracji roślin in vitro jest genotyp. Polimorfizm genetyczny w obrębie gatunku rzutujący na zmienny profil ekspresji genów, jest na tyle duŜy, Ŝe część z ekotypów takich jak: Columbia, czy C-24 i Landsberg, szeroko wykorzystywanych do badań podstawowych, cechuje niski potencjał morfogenetyczny [ZHU i in. 2001]. DuŜą rolę w morfogenezie in vitro pełnią równieŜ fitohormony. Stąd wyjaśnienie mechanizmu działania cytokinin przez wykorzystanie w badaniach mutantów i roślin transgenicznych Arabidopsis z nadekspresję izopentenylotransferazy (ipt), jak i wykazujących niski poziom cytokinin przez zastosowanie nadekspresji oksydazy cytokininowej, oraz wyjaśnienie roli cytokinin w transdukcji sygnałów w procesie morfogenezy, są w kręgu zainteresowań badaczy [CARY i in. 2001; CATTEROU i in. 2002; HOWELL i in. 2003]. Regenerację roślin Arabidopsis moŜna uzyskać na drodze organogenezy pośredniej [FELDMANN, MARKS

1986; CHAUDHURY, SINGER 1989; AKAMA i in. 1992; NABIAŁKOWSKA i in. 1997] oraz bezpośredniej somatycznej embriogenezy [GAJ 2001; GAJ, CZUBIN 2004], przy czym efektywność procesu nie zawsze jest zadawalająca.

W pracy podjęto próbę opracowania wydajnej metody regeneracji Arabidopsis thaliana ekotyp Columbia w kulturach in vitro oraz pośrednio potwierdzenia róŜnic genotypowych dotyczących zdolności do odpowiedzi morfogenetycznej eksplantatów. Materiał i metody

Materiałem roślinnym do badań był rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana (L.) HEYNH.) ekotyp Columbia. Nasiona sterylizowano w 70% (v/v) etanolu (1 min), a następnie w 2,5% (v/v) podchlorynie sodu (5 min), po czym płukano sterylną wodą destylowaną. Sterylne nasiona kiełkowały na poŜywce MS0, którą była zmodyfikowana poŜywka MURASHIGE i SKOOGA [1962] (tab. 1).

Z 2-tygodniowych siewek rzodkiewnika izolowano liście oraz 0,5 cm segmenty korzeni, które wykładano na poŜywkę indukującą tworzenie kalusa CIM (ang. callus inducing medium). Zastosowano dwa warianty poŜywki CIM: R3 oraz PG1 róŜniące się rodzajem i stęŜeniem regulatorów wzrostu (tab. 1) [FELDMANN, MARKS 1986].

K. Szczypińska, R. Cegielski, L. Drozdowska

230

Źródłem eksplantatów były równieŜ korzenie utrzymywane w płynnej pre-kulturze, którą wyprowadzono z korzeni 2-tygodniowych siewek. Prekulturę pro-wadzono przez 4 tygodnie na poŜywce MS1 (tab. 1), na wytrząsarce przy obrotach 150 rpm. Eksplantaty pobierano po 2 i 4 tygodniach prekultury i umieszczano na poŜywce CIM. Tabela 1; Table 1 Skład poŜywek uŜytych w doświadczeniu Composition of media used in the experiment

Wyszczególnienie Specification

MS0

MS1

CIM

SIM

RIM

PG1

R3

Sole; Salts

MS

MS

MS

MS

MS

MS

Sacharoza; Sucrose (g⋅dm-3)

20

20

20

20

20

20

Witaminy; Vitamins

B5

B5

B5

B5

B5

B5

IAA (mg⋅dm-3)

-

-

-

5,0

0,15

-

2,4 D (mg⋅dm-3)

-

-

2,2

0,5

-

-

2iP (mg⋅dm-3)

-

-

-

-

5,0

-

Kinetyna; Kinetin (mg⋅dm-3)

-

-

0,05

0,3

-

0,1

IBA (mg⋅dm-3)

-

-

-

-

-

12

Agar (g⋅dm-3)

7

-

7

7

7

7

pH

5,7

5,7

5,7

5,7

5,7

5,7

MS sole MURASHIGE i SKOOG’A [962]; MURASHIGE and SKOOG salts mixture [1962] B5 witaminy B5 w/g Gamborg’a; Gamborg's B5 vitamin

- inozytol; inositol (100 mg⋅dm-3) - tiamina-HCl; thiamine-HCl (10 mg⋅dm-3) - kwas nikotynowy; nicotinic acid (1 mg⋅dm-3) - pirydoksyna-HCl; pyridoxine-HCl (1 mg⋅dm-3)

CIM poŜywka do indukcji kalusa; callus inducing medium SIM poŜywka do indukcji pędów; shoot inducing medium RIM poŜywka do indukcji korzeni; root inducing medium IAA kwas indolilo-3-octowy; indole-3-acetic acid (Sigma) 2,4 D kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy; 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (Sigma) 2iP 6(γ, γ, dimetyloalliloamino)-puryna; 6-(γ, γ-dimethylallylamino)-purine IBA kwas indolilo-3-masłowy; indole-3-butyric acid

Po 7 dniach kultury eksplantaty liści i korzeni wraz z tworzącą się tkanką kalu-sową pasaŜowano na poŜywkę indukującą regenerację pędów SIM (shoot inducing medium) [FELDMANN, MARKS 1986].

Pędy rozwinięte na eksplantatach oddzielano od tkanki kalusowej i pasaŜowano na poŜywkę stymulującą tworzenie korzeni RIM (root inducing medium) [FELDMANN, MARKS 1986].

Przedstawione wyniki są średnią z dwóch powtórzeń. KaŜda kombinacja zawie-rała 100 eksplantatów. Wyniki i dyskusja

Indukcja organogenezy w kalusie pochodzącym z róŜnych eksplantatów jest powszechnie stosowaną metodą regeneracji pędów u Arabidopsis thaliana w kulturach in vitro. Próby opracowania bądź ulepszenia istniejących metod regeneracji nie zawsze kończyły się powodzeniem, szczególnie, gdy dotyczyły ekotypu Columbia [CHAUDHURY,

POTENCJAŁ MORFOGENETYCZNY EKSPLANTATÓW ...

231

SINGER 1989; AKAMA i in. 1992]. W niniejszym doświadczeniu wykorzystano dwuetapową metodę regeneracji pędów rzodkiewnika z eksplantatów liści opisaną przez FELDMANNA i MARKSA [1986], dokonując jej modyfikacji. Źródłem eksplantatów były młodsze, 14-dniowe siewki, z których izolowano liście i korzenie umieszczając je na zestalonej poŜywce do indukcji kalusa (PG1, R3). Dodatkowo jako eksplantaty wykorzystano korzenie utrzymywane w ciągłej kulturze płynnej.

Na eksplantatach liści rzodkiewnika wyłoŜonych na poŜywkę CIM tworzył się zielony kalus. W większości przypadków formował się on na ogonkach liściowych, blaszki natomiast po krótkim okresie inkubacji na poŜywce bielały (fot. 1). Zaproponowana metoda okazała się więc nieskuteczna dla regeneracji pędów z liści ekotypu Columbia. FELDMANN i MARKS [1986], prowadząc badania na ekotypach Wassilewskija oraz RLD, uzyskali kalus a następnie regenerację pędów na wszystkich eksplantatach liści rzodkiewnika. Z kolei NABIAŁKOWSKA i in. [1997], VELAZQUEZ i in. [2004], DAL CORSO i in. [2005] podają, Ŝe liście rzodkiewnika róŜnych genotypów, w porównaniu z innymi eksplantatami, posiadają najniŜszy potencjał morfogenetyczny.

Fot. 1. Liście A. thaliana po 4 tygodniowej inkubacji na poŜywce do indukcji pędów Photo 1. Leaves of A. thaliana after four week culture on the shoot inducing medium

Eksplantaty korzeni badanego ekotypu wykazały zróŜnicowany potencjał morfogenetyczny. W pierwszym etapie doświadczenia (inkubacja na poŜywce CIM), na segmentach korzeni izolowanych z 2-tygodniowych siewek oraz z korzeni po 2 lub 4 tygodniach prekultury tworzył się kalus. W drugim etapie, po przeniesieniu eksplantatów z kalusem na poŜywkę SIM róŜnicowały się pędy (fot. 2). Najwięcej eksplantatów zdolnych do regeneracji pędów izolowano z korzeni 2-tygodniowych siewek oraz z korzeni po 2 tygodniach prekultury na poŜywce płynnej. WydłuŜenie czasu prekultury do 4 tygodni znacznie obniŜało potencjał morfogenetyczny eksplantatów. Następczy wpływ na regenerację pędów miały równieŜ rodzaje regulatorów wzrostu i ich stęŜenia zastosowane w poŜywce do indukcji kalusa (tab. 2). Stwierdzono efektywniejsze działanie auksyn i cytokinin zawartych w poŜywce R3 niŜ PG1. Najwięcej, 27% eksplantatów, którymi były odcinki korzeni izolowane bez-pośrednio z siewek, jak i z korzeni po 2 tygodniowej prekulturze wykazało zdolność do tworzenia pędów po inkubacji na poŜywce R3. Tygodniowa inkubacja na poŜywce PG1 ograniczała zdolność do pędogenezy, która w zaleŜności od sposobu przygotowania eksplantatów wahała się w granicach 23,5-5,5%. Obserwowano takŜe róŜnice w liczbie korzeni przybyszowych formowanych na eksplantatach. Znaczniej więcej korzeni tworzyło się na eksplantatach po inkubacji na poŜywce R3 niŜ na PG1. Wskazuje to, Ŝe następczy wpływ rodzaju poŜywki zastosowanej w pierwszym etapie doświadczenia (do


232

indukcji kalusa), jest waŜnym czynnikiem decydującym o wydajności regeneracji pędów. WyŜszy poziom cytokininy w poŜywce R3 oraz szersze spektrum jakościowe auksyn w stosunku do poŜywki PG1 zapewniało wyŜszy poziom kompetencji eksplantatu i co za tym idzie moŜliwość zadawalającej odpowiedzi morfogenetycznej wyraŜającej się pędogenezą.

Fot. 2. Regeneracja pędów z eksplantatów korzeni siewek A. thaliana inkubowanych przed pasaŜem na poŜywkę do indukcji pędów na poŜywce CIM R3

Photo 2. Shoot formation from A. thaliana root explants. Explants were incubated on CIM R3

and then transferred to the shoot inducing medium Tabela 2; Table 2 Potencjał morfogenetyczny eksplantatów korzeni rzodkiewnika Morphogenetic potential of Arabidopsis thaliana root explants

Źródło eksplantatu Source of explant

Eksplantaty

tworzące pędy Explants forming

shoots (%)

Całkowita liczba

pędów Total number

of shoots

Średnia liczba

pędów/eksplantat Mean number of

shoots per explant

Rośliny kwitnące Flowering

plants (%)

PG1

R3

PG1

R3

PG1

R3

PG1

R3

2-tyg. siewki 2 week-old seedlings

23,5

27,0

58,0

61,5

2,5

2,3

43,6

46,5

2-tyg. kultura płynna 2 week-old liquid culture

16,5

27,0

29,5

57,0

1,8

2,1

54,9

50,9

4-tyg. kultura płynna 4 week-old liquid culture

5,5

6,0

12,5

10,0

2,3

1,7

34,0

47,8

Średnia liczba pędów przypadających na eksplantat była zbliŜona dla wszystkich

wariantów doświadczenia i zawierała się w przedziale od 1,7 do 2,5. Zregenerowane pędy umieszczano na poŜywce ukorzeniającej. Zaobserwowano trudności w formowaniu korzeni przez pędy. JednakŜe wytworzenie korzeni nie było warunkiem koniecznym do zakwitnięcia. Po około 3 tygodniach kultury na pędach pojawiały się kwiaty (fot. 3).


233

Fot. 3. Kwitnące rośliny A. thaliana po 4 tygodniach inkubacji na poŜywce ukorzeniającej Photo 3. Flwering A. thaliana plants after 4 week culture on the root inducing medium

Procent zregenerowanych pędów, które kwitły w warunkach in vitro wahał się w granicach od 34% do 55%. Najwięcej kwitnących pędów pochodziło z eksplantatów fragmentów korzeni po 2 tygodniowej prekulturze (tab. 2).

Przeprowadzone badania wykazały, Ŝe w celu regeneracji pędów w kulturach in vitro u ekotypu Columbia mogą być wykorzystane eksplantaty korzeni siewek, jak i korzenie z 2 tygodniowej prekultury. Te ostatnie mogą być stałym źródłem eksplantatów, poniewaŜ prekultura na poŜywce płynnej bez dodatku regulatorów wzrostu nie powoduje zmian ploidalności [CZAKO i in. 1993]. Jak jednak wykazali CZAKO i in. [1993] czas, w ciągu którego korzenie inkubowane w kulturze płynnej zachowują zdolności morfogenetyczne zaleŜy od genotypu. Korzenie ekotypu RLD utrzymywane przez 21 miesięcy w kulturze płynnej nie traciły zdolności morfogenetycznych i były podatne na transformację za pomocą Agrobacterium tumefaciens. Dodatkowym zabiegiem umoŜliwiającym zachowanie ich zdolności regeneracyjnych było osuszanie eksplantatów przed kaŜdym pasaŜem.

W niniejszej pracy wykazano równieŜ, iŜ skład poŜywki zastosowanej do indukcji kalusa jest jednym z czynników warunkujących nabycie kompetencji przez komórki eksplantatów korzeni do odpowiedzi na sygnał pobudzający morfogenezę, pochodzący z poŜywki indukującej pędy.

Wyjaśnienie przyczyn nabywania morfogenetycznej kompetencji przez komórki, na przykładzie modelowej rośliny A. thaliana, z uwzględnieniem molekularnego podłoŜa tego procesu [CARY i in. 2001; CHE i in. 2002] moŜe przyczynić się do efektywnego i powtarzalnego zastosowania metod regeneracji roślin in vitro w laboratorium badawczym, jak i w produkcji roślin. Wnioski 1. Najlepszą zdolność do tworzenia pędów wykazały fragmenty korzeni A. thaliana,

izolowane z 2-tygodniowych siewek oraz pochodzące z 2-tygodniowej prekultury.

2. Następczy wpływ na zwiększenie efektywności regeneracji pędów, miała


234

inkubacja fragmentów korzeni na poŜywce CIM R3, która poprzedzała pasaŜ eksplantatów na poŜywkę stymulująca organogenezę.

Literatura AKAMA K., SHIRAISHI H., OHTA S., NAKAMURA K., KIYOTAKA O., SHIMURA Y. 1992. Efficient transformation of the Arabidopsis thaliana: comparison of the efficiences with organs, plant ecotypes and Agrobacterium strains. Plant Cell Rep. 12: 7-11.

CARY A., UTTAMCHANDANI S.J., SMETS R., VAN ONCKELEN H.A., HOWELL S.H. 2001. Ara-bidopsis mutants with increased organ regeneration in tissue culture are more com-petent to respond to hormonal signals. Planta 213: 700-707.

CATTEROU M., DUBOIS F., SMETS R., VANIET S., KICHEY T., ONCKELEN H.V., SANGWAN-NORREEL B.S., SANGWAN R.S. 2002. hoc: an Arabidopsis mutant overproducing cytokinins and expressing high in vitro organogenic capacity. Plant J. 30: 273-287.

CHAUDHURY A.M., SINGER E.R. 1989. Relative regeneration proficiency of Arabidopsis thaliana ecotypes. Plant Cell Rep. 8: 368-369.

CHE P., GINGERICH D.J., LALL S., HOWELL S.H. 2002. Global and hormone-induced gene expression changes during shoot development in Arabidopsis. The Plant Cell. 14: 2771-2785.

CZAKO M., WILSON J., YU X., MARTON L. 1993. Sustained root culture for regeneration and vegetative propagation of transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Cell Rep. 12: 603-606.

DAL CORSO G., BORGATO L., FURINI A. 2005. In vitro plant regeneration of the heavy metal tolerant and hyperaccumulator Arabidopsis halleri (Brassicaceae). Plant Cell Tissue Org. Cult. 82: 267-270.

FELDMANN K.A., MARKS M.D. 1986. Rapid and efficient regeneration of plants of explants of Arabidopsis thaliana. Plant Sci. 47: 63-69.

GAJ M.D. 2001. Regeneracja roślin Arabidopsis thaliana (L) Heynh. drogą bezpośre-dniej somatycznej embriogenezy. Biotechnologia 2(53): 90-98.

GAJ M.D., CZUBIN M. 2004. Efficiency of direct somatic embryogenesis in Arabidopsis thaliana(L.) Heynh. under various in vitro culture conditions. Biotechnologia 1(64): 221-235.

HOWELL S.H., LALL S., CHE P. 2003. Cytokinins and shoot development. Trends in Plant Science 8: 453-459.

MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497

NABIAŁKOWSKA D., SZAREJKO I., MAŁUSZYŃSKI M. 1997. Regeneration ability of different explants derived from mutagenically treated Arabidopsis thaliana (L.) Heynh plants. Zesz. Nauk. AR Kraków 318: 433-436.

VELAZQUEZ I., VALENCIA S., LOPEZ-LERA A., DE LA PENA A., CANDELA M. 2004. Analysis of natural allelic variation in in vitro organogenesis of Arabidopsis thaliana. Euphytica 1973: 73-79.

ZHU T., BUDWORTH P., HAN B., BROWN D., CHANG H.S., ZOU G., WANG X. 2001. Toward elucidating the global gene expression patterns of developing Arabidopsis: parallel analysis of 8300 genes by high-density oligonucleotide probe array. Plant Physiol. Biochem. 39: 221-242.


235

Słowa kluczowe: kultury in vitro, morfogeneza, Arabidopsis thaliana L. HEYNH,

ekotyp Columbia Streszczenie

Ekotypy Arabidopsis thaliana L. HEYNH takie jak Columbia, C-24, czy Landsberg, które są powszechnie wykorzystywane w biologii molekularnej, cechuje niski potencjał morfogenetyczny w kulturach in vitro.

W pracy podjęto próbę optymalizacji warunków dla regeneracji pędów Ara-bidopsis thaliana ekotyp Columbia w kulturach in vitro. Eksplantaty izolowano z 2-tygodniowych siewek hodowanych na zmodyfikowanej poŜywce MURASHIGE i SKOOGA [1962] zestalonej agarem (eksplantaty korzeni i liści), bądź z prekultury korzeni prowadzonej w poŜywce płynnej (eksplantaty korzeni) i wykładano na poŜywki indukujące kalus. PoŜywki zawierały następujące rodzaje i stęŜenia regulatorów wzrostu: 2,2 mg⋅dm-3 2,4-D + 0,05 mg⋅dm-3 K (poŜywka CIM PG1) oraz 5,0 mg⋅dm-3

IAA + 0,5 mg⋅dm-3 2,4-D + 0,3 mg⋅dm-3 K (poŜywka CIM R3). Po tygodniu kultury, eksplantaty przenoszono na poŜywkę indukującą tworzenie pędów z 0,15 mg⋅dm-3 IAA + 5,0 mg⋅dm-3 2iP.

Na eksplantatach liści tworzył się tylko kalus. Najlepszą zdolność do tworzenia pędów wykazały fragmenty korzeni, izolowane z 2-tygodniowych siewek oraz pochodzące z 2-tygodniowej prekultury. Wykazano, iŜ następczy wpływ na zwiększenie efektywności regeneracji pędów, miała inkubacja fragmentów korzeni na poŜywce CIM R3, która poprzedzała pasaŜ eksplantatów na poŜywkę stymulująca organogenezę. MORPHOGENETIC POTENTIAL OF Arabidopsis thaliana L. HEYNH EXPLANTS CULTURED in vitro Kinga Szczypińska, Robert Cegielski, Lucyna Drozdowska Department of Plant Physiology, Faculty of Agriculture, University of Technology and Life Sciences, Bydgoszcz Key words: in vitro culture, morphogenesis, Arabidopsis thaliana L. HEYNH, ecotype

Columbia Summary

Arabidopsis thaliana ecotypes such as Columbia, C-24 or Landsberg, widely used in molecular biology, present low regeneration efficiency.

The influence of explants and growth regulators that were added to MURASHIGE and SKOOG [1962] medium supplemented with Gamborg’s B5 vitamins on shoots regeneration of Arabidopsis thaliana ecotype Columbia were compared. The number of obtained fertile plants, was also evaluated.

Sources of explants were 14 days old seedlings (leaf and root explants), sterile grown on solid medium or precultured roots (root explants) maintained in a liquid medium. Explants were placed on the medium inducing callus containing: 2,4-D 2.2 mg⋅dm-3; kinetin 0.05 mg⋅dm-3 (CIM PG1 medium), and IAA 5.0 mg⋅dm-3; 2,4-D 0.5 mg⋅dm-3; kinetin 0.3 mg⋅dm-3 (CIM R3 medium). After 7 days they were transferred onto the shoot inducing medium supplemented with IAA 0.15 mg⋅dm-3; 2iP 5.0 mg⋅dm-3.


236

The leaf explants formed callus only. The highest organogenesis rate was observed on root explants incubated on the CIM R3 medium before being replaced onto the shoot inducing medium. Prof. dr hab. Lucyna Drozdowska Katedra Fizjologii Roślin Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy im. J.J. Śniadeckich ul. Bernardyńska 6 85-029 BYDGOSZCZ e-mail: [email protected]

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 237-245 WPŁYW REGULATORÓW WZROSTU NA REGENERACJĘ in vitro GATUNKÓW Z RODZAJU Carlina Alina Trejgell, Agata Kowalczyk, Andrzej Tretyn Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Wstęp

Cytokininy, które są izopentenylowymi pochodnymi adeniny, odkryto ponad 50 lat temu podczas badań nad czynnikami stymulującymi podziały komórkowe [MILLER i in. 1955]. ZaangaŜowane są one w indukcję odpowiedzi morfogenetycznej w roślinnych kulturach tkankowych, gdzie szczególnie istotny wpływ ma stosunek ilościowy cytokinin do auksyn w procesie organogenezy, która przebiega najczęściej na drodze pośredniej poprzez rozwój kalusa z eksplantatu wyjściowego, a następnie inicjację nowych organów [WAREING, PHILLIPS 1985]. Ponadto cytokininy znoszą dominację wierzchołkową, przez co stymulują rozgałęzianie się pędów, wpływają na rozwój chloroplastów i metabolizm składników pokarmowych, co spowalnia starzenie się liści, a takŜe hamują tworzenie się korzeni [KOPCEWICZ, LEWAK 2002; KAKIMOTO 1996].

Celem naszych badań było określenie wpływu róŜnych cytokinin na zdolności regeneracyjne wybranych gatunków dziewięćsiłów (Carlina acaulis L., C. caulescens LAM. i C. onopordifolia BESSER). Gatunki z rodzaju Carlina są obięte całkowitą ochroną gatunkową w Polsce, poniewaŜ obserwuje się zmniejszanie liczebności populacje tych gatunków. Źródłem zagroŜenia dla dziewięćsiłów jest sukcesja roślinności na śródleśnych polanach i wtórnych murawach oraz bezpośrednie niszczenie (zrywanie) ze względu na walory dekoracyjne. Dlatego wydaje się zasadne zastosowanie czynnej ochrony dla gatunków z rodzaju Carlina polegającej na opracowaniu wydajnej metody mikronamnaŜania. Z wcześniejszych doniesień wiadomo, Ŝe Carina acaulis regenerawano z niedojrzałych zarodków [GRUBISIĆ i in. 2004] i pędów kwiatonośnych [GALEK, KUKUŁCZANKA 2000]. Natomiast w przypadku C. caulescens i C. onopordifolia jest to pierwsze doniesienie dotyczące regeneracji tych gatunków. Materiały i metody

Materiałem wyjściowym do badań były wierzchołki wzrostu oraz fragmenty liścieni, hypokotyli i korzeni 10-dniowych siewek wybranych gatunków dziewięćsiłów (Carlina acaulis, C. caulescens i C. onopordifolia). Zastosowano zmodyfikowaną poŜywkę MURASHIGE i SKOOG [1962] uzupełnioną róŜnymi kombinacjami cytokinin: benzyloaminopuryna (BA), kinetyna (Kn) i zeatyna (Zea) w stęŜeniach 1 i 3 mg⋅dm-3 z kwasem naftalenooctowym (NAA) w stęŜeniu 0,1 mg⋅dm-3. Eksplantaty wykładano na poŜywki zestalone agarem i prowadzono hodowlę w temperaturze 26°C i natęŜeniu

A. Trejgell, A. Kowalczyk, A. Tretyn

238

światła 40 µM⋅m-2⋅s-1. Po 4 tygodniach hodowli w przypadku C. acaulis i C. caulescens

oraz 10 tygodniach w przypadku C. onopordifolia dokonano oceny zdolności morfogenetycznej eksplatantów. Analizowano następujące parametry: procent eksplantatów zdolnych do wytwarzania pędów i liczbę pędów przybyszowych na eksplant (wskaźnik namnaŜania). Ponadto dokonano analizy morfologicznej uzyskanych pędów przybyszowych (długość liści oraz obecność kutneru). Wyniki i dyskusja

Eksplanty badanych gatunków wykazywały zróŜnicowaną reakcję na zasto-sowane cytokininy (rys. 1).

0

20

40

60

80

100

BA Kn Zea BA Kn Zea BA Kn Zea BA Kn Zea

wierzchołek

pędu; shoot tip

hypokotyl;

hypocotyl

liścień;

cotyledon

korzeń; root

% o

rga

no

ge

ne

zy

pę

dó

w

%

of

sh

oo

t o

rga

no

ge

ne

sis

Carina caulescens

0

20

40

60

80

100


wierzchołek

pędu; shoot tip

hypokotyl;

hypocotyl

liścień;

cotyledon

korzeń; root

% o

rga

no

ge

ne

zy

pę

dó

w

%

of

sh

oo

t o

rga

no

ge

ne

sis

Carlina acaulis

WPŁYW REGULATORÓW WZROSTU NA REGENERACJĘ in vitro ...

239

0

20

40

60

80

100


wierzchołek

pędu; shoot tip

hypokotyl;

hypocotyl

liścień;

cotyledon

korzeń; root

% o

rga

no

ge

ne

zy

pę

dó

w

%

of

sh

oo

t o

rga

no

ge

ne

sis

1 mg.dm-3 1 mg.dm-3

Carlina onopordifolia

Rys. 1. Wpływ róŜnych rodzajów cytokinin i typu eksplantatu na regenerację pędów

u Carlina caulescens, C. acaulis i C. onopordifolia Fig. 1. Effect of the different cytokinins and type of explants on shoot regeneration of

Carlina caulescens, C. acaulis i C. onopordifolia C. caulescens wykazała największe moŜliwości regeneracyjne. Indukcja pędów przybyszowych była obserwowana na wszystkich uŜytych w doświadczeniu eksplantach na poŜywce uzupełnionej BA. NajwyŜszy odsetek eksplantów wykazujących zdolność do organogenezy pędów uzyskano z wierzchołków wzrostu pędów i wynosił on 85 i 97% odpowiednio dla BA w stęŜeniu 1 i 3 mg⋅dm-3. Pozostałe typy eksplantów wykazywały znacznie niŜszą zdolność morfogenetyczną i wynosiła ona 66 i 21% dla fragmentów hypokotyli odpowiednio dla stęŜenia 1 i 3 mg⋅dm-3. Natomiast fragmenty liścieni i korzeni były zdolne do regeneracji pędów jedynie na poŜywkach uzupełnionych BA w stęŜeniu 3 mg⋅dm-3, a odsetek eksplantów wykazujących zdolność do organogenezy pędów nie przekraczał 19% dla liścieni i 5% korzeni. W przypadku zastosowania kinetyny w poŜywce zdolność do regeneracji pędów wykazało 60% wierzchołków wzrostu pędów eksponowanych na poŜywkę uzupełnioną Kn w stęŜeniu 1 mg⋅dm-3 oraz 76% w stęŜeniu 3 mg⋅dm-3. Natomiast ekspozycja eksplantów na poŜywki z zeatyną dała odpowiedź morfogenetyczną na wierzchołkach wzrostu pędów (59 i 68% odpowiednio dla stęŜenia 1 i 3 mg⋅dm-3) oraz 20% w przypadku hypokotyli wykładanych na poŜywkę uzupełnioną Zea w stęŜeniu 1 mg⋅dm-3. Średnia liczba pędów przybyszowych uzyskanych na jednym eksplancie w przypadku wierzchołków wzrostu pędów, hypokotyli i liścieni eksponowanych na poŜywce z BA w stęŜeniu 3 mg⋅dm-3

była porównywalna i wynosiła odpowiednio 12, 10 i 11, natomiast na fragmentach korzeni wynosiła około 1 (rys. 2). Wskaźnik namnaŜania pędów w przypadku za-stosowania w poŜywkach regeneracyjnych Kn i Zea nie przekraczał 5. Analizując zdolności morfogenetyczne C. acaulis stwierdzono, Ŝe do organogenezy pędów zdolne były wierzchołki wzrostu pędów na wszystkich zastosowanych poŜywkach oraz fragmenty hypokotyli eksponowane na poŜywki z BA w obu uŜytych stęŜeniach i Kn w stęŜeniu 3 mg⋅dm-3 (rys. 1). Podobnie, jak w przypadku wcześniej opisanego gatunku BA okazała się najefektywniejszą cytokininą i odsetek eksplantów, na których obserwowano indukcję pędów wynosił w przypadku wierzchołków wzrostu 90 i 100%, a w przypadku hypokotyli 10 i 63% odpowiednio dla stęŜenia 1 i 3 mg⋅dm-3. Wskaźnik


240

namnaŜania nie przekraczał 6 dla wierzchołków wzrostu (rys. 2) oraz 10 w przypadku hypokotyli. Zastosowanie kinetyny oraz zeatyny w poŜywce regeneracyjnej powodowało nie tylko zmniejszenie liczby eksplantów zdolnych do organogenezy pędów w porównaniu do poŜywki z BA, ale takŜe mniejszą liczbę pędów przybyszowych uzyskanych na jednym eksplancie. C. onopordifolia okazała się gatunkiem o najmniejszych zdolnościach regeneracyjnych i w analizowanym układzie doświadczalnym jedynie wierzchołki wzrostu wykazywały zdolność morfogenetyczną. RównieŜ u tego gatunku BA okazała się najefektywniejszą cytokininą i zdolność do organogenezy pędów obserwowana była u 43 i 91% eksplantów odpowiednio dla stęŜenia 1 i 3 mg⋅dm-3 BA, a liczba pędów uzyskanych na jednym wierzchołku wzrostu nie przekraczała 4. Zastosowanie pozostałych cytokinin w poŜywkach regeneracyjnych było znacznie mniej efektywne. Odsetek eksplantów zdolnych do regeneracji pędów w tym przypadku wynosił 25% (kinetyna 3 mg⋅dm-3) oraz 57% (zeatyna 3 mg⋅dm-3), a wskaźnik namnaŜania pędów wynosił około 2 w kaŜdym z wariantów. We wcześniejszych badaniach nad regeneracją C. acaulis, takŜe BA okazała się najskuteczniejszą cytokininą podczas regeneracji pędów [GALEK, KUKUŁCZANKA 2000; GRUBISIĆ i in. 2004]. Ponadto, ten regulator wzrostu jest najbardziej efektywną cytokininą w procesie regeneracji wielu innych gatunków roślin [VENKATACHALAM, JAYABALAN 1997; SUJATHA, REDDY 1998; CHAUDHURI i in. 2004].

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20


wierzchołek

pędu; shoot tip

hypokotyl;

hypocotyl

liścień;

cotyledon

korzeń; root

licz

ba

pę

dó

w /

ek

sp

lan

t

nu

mb

er

of

sh

oo

t/e

ks

pla

nt

Carina caulescens


241

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20


wierzchołek

pędu; shoot tip

hypokotyl;

hypocotyl

liścień;

cotyledon

korzeń; root

lic

zb

a p

ęd

ów

/ e

ks

pla

nt

nu

mb

er

of

sh

oo

t/e

ks

pla

nt

Carlina acaulis

024

68

101214

161820


wierzchołek

pędu; shoot tip

hypokotyl;

hypocotyl

liścień;

cotyledon

korzeń; root

licz

ba

pę

dó

w /

ek

sp

lan

t

nu

mb

er

of

sh

oo

t/e

ks

pla

nt

1 mg.dm-3 3 mg.dm-3

Carlina onopordifolia

Rys. 2. Wpływ róŜnych rodzajów cytokinin i typu eksplantatu na liczbę pędów przyby-

szowych u Carlina caulescens, C. acaulis i C. onopordifolia Fig. 2. Effect of different cytokinins and type of explants on the number of axilary shoots of

Carlina caulescens, C. acaulis i C. onopordifolia

Wśród uzyskanych pędów przybyszowych oprócz zmian ilościowych były obserwowane takŜe róŜnice jakościowe. Dotyczyły one długości liści oraz obecności włosków kutnerowych na powierzchni blaszki liściowej. Pędy rozwijające się na poŜywkach z dodatkiem zeatyny charakteryzowały się znacznie dłuŜszymi, ale wiotkimi liśćmi (fot. 1A) w porównaniu do tych, uzyskanych na poŜywkach uzupełnianych BA i Kn (fot. 1B, 1C), co szczególnie wyraźnie było widoczne w przypadku pędów przybyszowych C. caulescens i C. acaulis.

A

B

C


242

Fot. 1. Pędy przybyszowe Carlina acaulis uzyskane na poŜywkach z dodatkiem róŜnych

cytokinin: zeatyny (A), benzyloaminopuryny (B) i kinetyny (C) w stęŜeniu 3 mg.dm-3 Photo 1. The axillary shoots obtained on media containing the following cytokinins: zeatin

(A), benzyloaminopurin (B) i kinetin (C) in concentration 3 mg⋅dm-3 RóŜnice te mogły wynikać z szybszego tempa wzrostu nie skorelowanego z tempem rozwoju tkanki wzmacniającej na poŜywkach z zeatyną. Ponadto, obserwowano duŜe zróŜnicowanie wykształcenia powierzchni liści niezaleŜnie od zastosowanej cytokininy w poŜywce regeneracyjnej. Uzyskano pędy przybyszowe o róŜnych typach liści: całych i pierzastowrębnych oraz nie wytwarzających włosków kutnerowych na powierzchni blaszki liściowej lub z kutnerem o róŜnym stopniu gęstości: od rzadkiego do bardzo gęstego, wręcz filcowatego, nie występującego u osobników na stanowiskach naturalnych u badanych gatunków (rys. 3).

51,92%

19,23%

28,85%


243

17,30%

51,80%

30,90%

11,76%

47,06%

41,18%

gęsty kutner rzadki kutner brak kutneru

Rys. 3. Procentowy udział pędów przybyszowych z kutnerem wykształconym w róŜnym stopniu u

Carlina acaulis (A), C. caulescens (B) i C. onopordifolia (C) Fig. 3. Percentage of axillary shoots with hair on the surface lamina developed to a different

extent of Carlina acaulis (A), C. caulescens (B) i C. onopordifolia (C)

Największe zróŜnicowanie tego parametru wykazywały pędy uzyskane na poŜywkach z BA. Wszystkie opisane wyŜej róŜnice morfologiczne pędów przy-byszowych miały charakter nietrwały i po przeniesieniu do warunków ex vitro zanikały po 2-3 miesiącach uprawy w gruncie. Zaobserwowane zjawisko wskazuje na zmienność somaklonalną o charakterze epigenetycznym, która moŜe wynikać ze zmian metylacji DNA (hiper- i hypometylacje), która modyfikuje ekspresje genów [KAEPPLER i in. 2000; CASSELLS, CURRY 2001]. Wnioski 1. Benzyloaminopuryna jest najbardziej efektywną cytokininą w procesie orga-

nogenezy gatunków z rodzaju Carlina.

2. Wierzchołki wzrostu pędów wykazują największą zdolność do regeneracji pędów.

3. Obserwowane zmiany morfologiczne pędów mają charakter epigenetyczny i zanikają po przeniesieniu do warunków ex vitro.


244

Literatura CASSELLS A.C., CURRY R.F. 2001. Oxidative stress and physiological, epigenetic and genetic variability in plant tissue culture: implication for micropropagationa and genetic engineers. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 64: 145-157.

CHAUDHURI K.N., GHOSH B., JHA S. 2004. The root: a potential new source of competent cells for high-frequency regeneration in Tylophora indica. Plant Cell Rep. 22: 731-740.

GALEK R., KUKUŁCZANKA K. 2000. Regeneracja dziewięćsiłu bezłodygowego metodą kultur tkankowych. IX Ogóln. Konf. Kultur in vitro i biotechnologii roślin „Modyfi-kowanie genomu roślin”, Gdańsk-Sobieszewo 10-13 IX 2000 (Abstract): 132.

GRUBISIĆ D., SAVIKIN-FODULOVIC K., MISIC D., GIBA Z., KONJEVIC R. 2004. In vitro stem elongation of stemless carline thistle. Plant Growth Regul. 44: 65-69.

KAEPPLER S.M., KAEPPLER H.F., RHEE Y. 2000. Epigenetic aspects of somaclonal varia-tion in plant. Plant Mol. Biol. 43: 179-188.

KAKIMOTO T. 1996. CKI1, a histidine kinase homolog implicated in cytokinin signal transduction. Science 274: 982-985.

KOPCEWICZ J., LEWAK S. 2002. Regulacja procesów fizjologicznych przez czynniki endo-genne w: Fizjologia roślin. PWN Warszawa: 146 ss.

MILLER C.O., SKOOG F., SALTZA M.H. 1955. Kinetin, a cell division factor from deoxy-ribonucleic acid. J. Am. Chem. Soc. 77: 1329-1334.

MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 437-497.

SUJATHA M., REDDY T.P. 1998. Differential cytokinin effects on stimulation of in vitro shoot proliferation from meristematic explants of castor (Ricinus communis L.). Plant Cell Rep. 17: 561-566.

VENKATACHALAM P., JAYABALAN N. 1997. Effect of auxins and citokinins on efficient plant regeneration and multiple-shoot formation from cotyledons and cotyledonary-node explants of groundnut (Arachis hypogaea L.) by in vitro culture technology. Appl. Biochem. Biotech. 67: 237-246.

WAREING P.F., PHILLIPS I.D.J. 1985. Wzrost i róŜnicowanie się roślin. PWN Warszawa: 124-131. Słowa kluczowe: dziewięćsił, regeneracja, cytokinina, wierzchołki wzrostu pędów,

hypokotyl, liścień Streszczenie

Określono zdolności regeneracyjne wierzchołków wzrostu oraz fragmentów liścieni, hypokotyli i korzeni 10-dniowych siewek wybranych gatunków dziewięćsiłów (Carlina acaulis, C. caulescens i C. onopordifolia). Zastosowano zmodyfikowaną poŜywkę Murashige i Skoog uzupełnioną róŜnymi kombinacjami cytokinin (benzyloaminopuryna, kinetyna i zeatyna) w stęŜeniach 1 i 3 mg⋅dm-3 z kwasem naftalenooctowym (NAA) w stęŜeniu 0,1 mg⋅dm-3. Eksplantaty wykładano na poŜywki


245

zestalone agarem i prowadzono hodowlę w temperaturze 26°C i natęŜeniu światła 40 µM⋅m-2

⋅s-1. Obserwowano zróŜnicowaną reakcje eksplantów badanych gatunków. Najlepsze

wyniki regeneracji uzyskano stosując merystemy wierzchołkowe u wszystkich badanych gatunków. Organogeneza pędów była obserwowana na pozostałych typach eksplantów u C. acaulis i C. caulescens, ale w przypadku C. onopordifolia jedynie wierzchołki wzrostu wykazywały zdolność morfogenetyczną. Wykazano, Ŝe najbardziej efektywną cytokininą w indukcji organogenezy pędów była benzyloaminopuryna. Pędy przybyszowe uzyskane na poŜywkach uzupełnionych róŜnymi cytokininami wykazywały zróŜnicowanie morfologiczne. EFFECT OF GROWTH REGULATORS ON THE REGENERATION in vitro OF SELECTED SPECIES OF Carlina Alina Trejgell, Agata Kowalczyk, Andrzej Tretyn Institute of General and Molecular Biology, Nicolaus Copernicus University, Toruń Key words: carline thistle, regeneration, cytokinin, shoot tips, hypocotyl, cotyledon Summary

The aim of the experiment was to estimate the regeneration abilities of shoot tips and fragments of cotyledons, hypocotyls and roots exised from 10-days-old seedlings of selected species of carline thistle (Carlina acaulis, C. caulescens i C. onopordifolia). Murashige and Skoog modified medium, supplemented with different combinations of cytokinins (BA, Kn i Zea) in concentrations 1 and 3 mg⋅dm-3 with NAA in concentration 0.1 mg⋅dm-3 was used. The explants were placed on the solidified media and cultured at 26°C with light intensity of 40 µM⋅m-2

⋅s-1. There were significant differences in the number of shoots regenerated from

explants of the studied species. For all species the best regeneration was obtained from shoot tips. Shoot organogenesis from the other types of explants of C. acaulis and C. caulescens was observed, but in the case of C. onoporgifolia only shoot tips demonstrated morfogenetic ability. The results showed that the most efficient cytokinin for induction of shoot organogenesis was benzyloaminopurin. The axillary shoots which were obtained on media containing different cytokinins revealed morphological diversity. Dr Alina Trejgell Instytut Biologii Ogólnej i Molekularnej Uniwersytet Mikołaja Kopernika ul. Gagarina 9 87-100 TORUŃ e-mail: [email protected]


246

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 523: 247-252 ORGANOGENEZA PRZYBYSZOWA W ELEMENTACH KWIATU GORCZYCY BIAŁEJ (Sinapis alba L.) Łukasz Zarychta, Maciej Zenkteler, ElŜbieta Zenkteler Instytut Biologii Eksperymentalnej, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza w Poznaniu Wstęp

Gorczyca biała (Sinapis alba L.) jest waŜną rośliną uŜytkową wykorzystywaną w przemyśle spoŜywczym i farmaceutycznym. Uzyskanie nowych odmian gorczycy, o obniŜonej zawartości kwasu erukowego i glukozylanów, zwiększyłoby wykorzystanie konsumpcyjne i przemysłowe jej nasion [KUROWSKI, JANKOWSKI 2003]. Dlatego włączono kultury in vitro do prac hodowlanych, na tej podstawie wykazano, Ŝe gorczyca naleŜy do gatunków, u których szczególnie niskim potencjałem regeneracyjnym charakteryzują się liścienie [JAIN i in. 1989], a takŜe trudno zaindukować rozwój gynogenetyczny i androgenetyczny [KLIMASZEWSKA, KELLER 1983]. Próby indukowania androgenezy u odmiany Nakielska równieŜ nie powiodły się [ZARYCHTA i in. 2006a, 2006b], chociaŜ stwierdzono przy tym wysoki potencjał regeneracyjny elementów jej kwiatu.

Celem pracy było wykorzystanie słupków i pręcików jako eksplantatów w opracowaniu protokołu mikrorozmnaŜania Sinapis alba L. Materiały i metody

Kwiatostany gorczycy białej odm. Nakielska otrzymano z IHAR w Poznaniu. Zamknięte pąki kwiatowe o długości 0,5-0,8 cm odkaŜano w 70% (v/v) alkoholu etylowym i w 2% (v/m) roztworze podchlorynu sodu przez 5 min, po czym trzykrotnie płukano w sterylnej wodzie bidestylowanej. Z pąków kwiatowych gorczycy izolowano słupki i pręciki, które wykładano na wcześniej dobraną poŜywkę podstawową MS [MURASHIGE, SKOOG 1962], zawierającą 3 mg⋅dm-3 BAP, 1,6 mg⋅dm-3 2,4-D, 30 g⋅dm-3 sacharozy i 8 g⋅dm-3 agaru. Na poŜywkę wyłoŜono ok. 100 słupków i 120 pręcików. Kultury prowadzono w temperaturze 22°C +/- 3°C przy świetle ciągłym, białym o długości fali w zakresie 400-700 nm, przy natęŜeniu 20-70 µE⋅m-2

⋅s-1 i wilgotności względnej RH 70-80%. Po 45 dniach pędy przybyszowe pasaŜowano na poŜywkę ukorzeniającą MS, bez BAP i 2,4-D, z dodatkiem 1 mg⋅dm-3 IAA. Po 60 dniach rośliny aklimatyzowano w kulturze hydroponicznej, a po dalszych 21 dniach wysadzano do doniczek w podłoŜe o składzie 2 części ziemi ogrodniczej, 1 część torfu i 1 część perlitu. Wyniki i dyskusja

Uzyskane wyniki potwierdziły wysoki potencjał regeneracyjny wybranych

Ł. Zarychta, M. Zenkteler, E. Zenkteler

248

elementów kwiatu gorczycy białej (słupki i pręciki) w kulturach in vitro. Po 7-10 dniach od inicjacji kultury na zmodyfikowanej poŜywce MS, stwierdzono powiększanie się słupków i pręcików spowodowane wzrostem objętości komórek parenchymatycznych eksplantatów, przy równoczesnej proliferacji tkanki kalusowej u podstawy obydwu typów eksplantatów (fot. 1 i 3).

Fot. 1. Kalus proliferujący z nasadowej części słupka Sinapis alba L. Photo 1. Proliferation of callus from the pistil base

Foto. 2. RóŜnicujące się pąki przybyszowe z tkanki parenchymatycznej zaląŜni Photo 2. Differentiation of adventitious shoots from an ovary parenchyma tissue Zlokalizowane tam komórki merystemu interkalarnego [RAGHAVAN 1997], wykazały znaczną wraŜliwość na stymulację regulatorami wzrostu. Po 15 dniach w tkance kalusowej proliferującej w miejscu odcięcia nitki pręcika od dna kwiatowego stwierdzono formowanie się elementów trachealnych i zakładanie gniazd merystematycznych. W późniejszym okresie z gniazd merystematycznych formowały się liczne wierzchołki wzrostu pąków (fot. 3). Rozwijające się z nich pędy przybyszowe w 45 dniu kultury oddzielano od eksplantatów i ukorzeniano (fot. 4) na poŜywce MS z dodatkiem 1 mg⋅dm-3 IAA [ZARYCHTA i in. 2006b]. Rośliny otrzymane poprzez organogenezę pośrednią (fot. 5) wysadzono do doniczek po 75 dniach kultury.

ORGANOGENEZA PRZYBYSZOWA ...

249

Fot. 3. Kalus proliferujący w nasadowej części nitki pręcika Photo 3. Callus proliferation from stamen base

Fot. 4. Pąki przybyszowe rozwijające się w tkance kalusowej u podstawy pręcika Photo 4. Adventitious shoots regenerated from callus at the base of stamen

We wcześniejszej pracy, dotyczącej indukcji androgenezy u gorczycy [ZARYCHTA i

in. 2006b] wykazano aktywność proliferacyjną łącznika. Obecnie stwierdzono, Ŝe nasadowa część pręcika znacznie obficiej kalusuje i charakteryzuje się bardzo wysokim potencjałem regeneracyjnym. TakŜe u wszystkich wyłoŜonych na poŜywkę słupków występowało kalusowanie nasady i organogeneza przybyszowa w rozwijającym się tam


250

kalusie (tab. 1). NiezaleŜnie od kalusowania nasady słupka, stwierdzono równieŜ organogenezę bezpośrednią i róŜnicowanie się pąków przybyszowych z komórek parenchymatycznych ściany zaląŜni (fot. 2, tab. 1). Bezpośrednie formowanie pąków przybyszowych obserwowano wyłącznie w tkance słupków, co potwierdzono na podstawie analizy histologicznej (fot. 2). Tabela 1; Table 1 Wpływ eksplantatu inicjalnego na przebieg organogenezy w kulturach in vitro gorczycy Effect of the explant type on organogenesis in tissue culture of Sinapis alba Liczba

dni Days

Rodzaj eksplantatu; Type of explants

nasada słupka; pistil base

nitka pręcika; filament of the stamen

organogeneza

pośrednia indirect organogenesis

organogeneza bezpośrednia

direct organogenesis

organogeneza

pośrednia indirect organogenesis

organogeneza bezpośrednia

direct organogenesis

8-12

proliferacja kalusa callus proliferation

-

proliferacja kalusa callus proliferation

-

25

róŜnicowanie pąków

przybyszowych differentation of

adventitious shoots



adventitious shoots



adventitious shoots

-

45

ukorzenianie

rooting

ukorzenianie

rooting

ukorzenianie

rooting

-

60

aklimatyzacja acclimatization



-

70

wysadzanie plant potting



-

ORGANOGENEZA PRZYBYSZOWA ...

251

Fot. 5. Roślina gorczycy białej otrzymana z kultur słupka Photo 5. Plant of white mustard derived from the pistil culture

ChociaŜ aktywność regeneracyjna elementów generatywnych kwiatu u Bras-sicaceae jest juŜ od dawna przedmiotem badań [ZENKTELER 1984; ZENKTELER i in. 2006] dopiero ostatnio prowadzone badania w obrębie tej rodziny potwierdzają, Ŝe elementy kwiatu mogą być z powodzeniem wykorzystywane przy mikrorozmnaŜaniu. Literatura JAIN R.K., BRUNE U., FRIEDT W. 1989. Plant regeneration from in vitro cultures of co-tyledon explants and another of Sinapis alba its implication on breeding of Crucifers. Euphytica. 43: 153-163.

KLIMASZEWSKA K., KELLER W.A. 1983. The production of haploids from Brassica hirta Moench (Sinapis alba L.) anther culture. Z. Pflanzenphysiol. 109: 235-241.

KUROWSKI T.P., JANKOWSKI K. 2003. Wpływ nawoŜenia na zdrowotność gorczycy białej i sarepskiej. Rośliny oleiste XXIV(2): 465-488.


RAGHAVAN V. 1997. Molecular embryology of flowering plants. Cambridge University Press: 181-208.

ZARYCHTA Ł., ZENKTELER M., ZENKTELER E., CEGIELSKA-TARAS T. 2006a. Analiza mi-kroskopowa kultur pylników lnu Linium ussitattisimum L. i gorczycy białej Sinapis alba L. Abstrakty XI Ogólnop. Konf. „Kultury in vitro i biotechnologia roślin” Międzyzdroje 7-8 IX 2006: 126.

ZARYCHTA Ł., ZENKTELER M., ZENKTELER E., SAMARDAKIEWICZ S., BIELUSZEWSKI T.


252

2006b. Określanie fazy jednojądrowej mikrospory w pylnikach gorczycy białej Sinapis alba L. na podstawie pozycji pąka w kwiatostanie. Abstrakty VII Ogólnop. Konf. „Kultury in vitro w fizjologii roślin” Kraków 7-8 XII 2006: 45.

ZENKTELER M. 1984. Hodowla komórek i tkanek roślinnych. PWN, W-wa: 480 ss.

ZENKTELER M., ZENKTELER E., DOSTATNIA I. 2006. Somatic embryogenesis from broccoli stigmas in tissue culture. Acta Biol. Crac. Ser. Bot. 48/2: 109-113. Słowa kluczowe: gorczyca biała, regeneracja z elementów kwiatu, pędy przyby-

szowe Streszczenie

W pracy dokonano oceny potencjału regeneracyjnego pręcików i słupków kwiatu gorczycy białej (Sinapis alba L.) oraz sprawdzenie ich przydatności do mi-krorozmnaŜania. Eksplantaty wykładano na poŜywkę regeneracyjną MS z dodatkiem 3 mg⋅dm-3 BAP i 1,6 mg⋅dm-3 2,4-D. Pędy przybyszowe ukorzeniano na poŜywce MS z dodatkiem 1 mg⋅dm-3 IAA. Po 75 dniach otrzymane rośliny wysadzano do doniczek. Stwierdzono, Ŝe wybrane elementy kwiatu gorczycy charakteryzowały się wysokim potencjałem regeneracyjnym (organogeneza pośrednia i bezpośrednia) i mogą być zalecane jako eksplantaty inicjalne do mikrorozmnaŜania. Rośliny otrzymane tą metodą rozwijały się prawidłowo w dalszej uprawie. ORGANOGENESIS FROM FLOWER ELEMENTS OF WHITE MUSTARD (Sinapis alba L.) Łukasz Zarychta, Maciej Zenkteler, ElŜbieta Zenkteler Institute of Experimental Biology, Adam Mickiewicz University, Poznań key words: white mustard, plant regeneration, flower explants, adventitious shoots Summary

A protocol has been developed of plantlets regeneration from pistils and stamens of white mustard (Sinapis alba L.). Both explants demonstrated a high potential of direct and indirect organogenesis. Adventitious shoots were obtained from basal parts of pistils and stamens cultured on MS medium containing 3 mg⋅dm-3 BAP and 1,6 mg⋅dm-3 2,4-D. The first shoots were noticed after the fourth week following inoculation. Fully formed plantlets were developed during the 8-th week and after the next 10 th week plantlets were transferred to pots where they soon started to flower. Mgr Łukasz Zarychta Instytut Biologii Eksperymentalnej Zakład Botaniki Ogólnej ul. Umultowska 89 61-614 POZNAŃ e-mail: [email protected]

Documents

WIELKIE RELIGIE ŚWIATA WOBEC ROŚLIN I ICH MODYFIKACJI · Dalajlama XIV ( Tenzin Giaco ) - duchowy i polityczny przywódca Tybetańczyków na emigracji powiedział: „Zawsze podkreślam,