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Wirkung von Imidazolinen auf den „triggering pathway“ der Insulinsekretion
Von der Fakultät für Lebenswissenschaften
der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina
zu Braunschweig
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
genehmigte
D i s s e r t a t i o n
von Timm Große Lackmann aus Berlin-Schmargendorf
1. Referent: Prof. Dr. Ingo Rustenbeck 2. Referent: Prof. Dr. Uwe Panten eingereicht am: 11.07.2006 mündliche Prüfung (Disputation) am: 28.03.2007 Druckjahr 2007
Vorveröffentlichungen der Dissertation
Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung der Fakultät für Lebenswissen-schaften, vertreten durch den Mentor der Arbeit, in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht:
Publikation:
GROSSE LACKMANN T, ZÜNKLER BJ, RUSTENBECK I (2003): Specifity of non- adrenergic imidazoline binding sites in insulin-secreting cells and relation to the block of ATP-sensitive K+ channels. Ann NY Acad Sci 1009: 371-377
WIENBERGEN A, BLECK C, GROSSE LACKMANN T, RUSTENBECK I (2007):
Antagonism of the insulinotropic action of first generation imidazolines by openers of KATP channels. Biochem Pharmacol 73: 94-102
Tagungsbeiträge:
GROSSE LACKMANN T, RUSTENBECK I (2000): Quinine blocks ATP-dependent K+ channels by binding to the imidazoline site at the pore-forming subunit. Naunyn-
Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 359: R78.
RUSTENBECK I, GROSSE LACKMANN T (2000): Molecular mechanism of quinine- induced insulin secretion. Exp Clin Endocrinol Diabetes 108 (Suppl. 1): S76.
RUSTENBECK I, FRICKE K, GROSSE LACKMANN T, DICKEL C (2001): Antagonism of the imidazoline block of ATP-sensitive K+ channels by nucleotides and diazoxide. Naunyn-Schmiedeberg´s Arch Pharmacol 360: R79
RUSTENBECK I, FRICKE K, GROSSE LACKMANN T, DICKEL C (2001): Antagonismus zwischen Imidazolinen und physiologischen und pharmakologischen Kaliumkanal-öffnern am KATP Kanal der B-Zelle. Diabetes und Stoffwechsel Band 10 (Suppl.1): 4-09
RUSTENBECK I, FRICKE K, DICKEL, C, GROSSE LACKMANN T (2002): Antagonis- mus of imidazoline induced KATP channel block by diazoxide. Diabetologia 45: A167
Meiner Familie
Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Juli 1999 bis Dezember 2001 am Institut für
Klinische Biochemie der Medizinischen Hochschule Hannover und von Januar 2002 bis
Oktober 2002 am Insitut für Pharmakologie und Toxikologie der Technischen Universität
Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig angefertigt.
Mein großer Dank gilt Herrn Prof. Dr. I. Rustenbeck für die Bereitstellung und der intensiven
Betreuung dieser Arbeit. Mein besonderer Dank gilt Frau C. Dickel (Institut für
Pharmakologie; Göttingen) für die Einarbeitung in die Patch-Clamp-Technik und der Hilfe
bei den inside-out Versuchen, Frau K. Fricke (Institut für Pharmakologie; Göttingen) für die
Hilfe bei der Messung der cytosolischen Ca2+-Konzentrationen, Herrn Dr. M. Elsner, Herrn
Dr. S. Lortz und Frau A. Hager (Institut für Klinische Biochemie der MH Hannover) für die
Einführung in die molekularbiologischen Methoden sowie der bereitwilligen Antworten
meiner häufigen Fragen, Frau U. Sommerfeld (Institut für Klinische Biochemie der MH
Hannover) für die Hilfe der Messung der Membranpotentiale und der Einzelkanalkinetiken,
Prof. F. Ashcroft für die cDNA von Kir6.2∆C26 und Prof. J. Bryan (Baylor College of
Medicine, Houston, USA) für die cDNA vom SUR1 der Ratte. Außerdem danke ich den
Kolleginnen und Kollegen des Instituts für Klinische Biochemie der MH Hannover für ihre
helfenden Hände und offenen Ohren ganz herzlich.
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der Abkürzungen V
1 Einleitung 1
1.1 Die Bedeutung von oralen Antidiabetika in der Therapie des
Typ II Diabetes 1
1.2 Physiologische und pharmakologische Regulation der Insulinsekretion 2
1.3 Imidazoline als Stimulatoren der Insulinsekretion 4
2 Zielsetzung und Fragestellung der Arbeit 12
3 Material und Methoden 13
3.1 Materialien 13
3.2 Zellkultur und Gewebegewinnung 16
3.2.1 Zellkulturlinien 16
3.2.1.1 HEK293-Zellen 16
3.2.1.2 HIT-Zellen 16
3.2.2 Medien und Lösungen für die Zellkultur 16
3.2.2.1 Kulturmedium DMEM 16
3.2.2.2 Kulturmedium RPMI 1640 16
3.2.2.3 PBS 17
3.2.2.4 EDTA-Stammlösung 17
3.2.2.5 Trypsin-EDTA-Lösung 17
3.2.2.6 Krebs-Ringer-HEPES-Puffer 17
3.2.3 Zellpassagierung 17
3.2.4 Gewinnung von Pankreasinseln 18
3.3 Molekularbiologische Methoden 19
3.3.1 Geräteliste 19
Inhaltsverzeichnis
II
3.3.2 Ausgangs- und Expressionsplasmide 19
3.3.3 Manipulation der Plasmid-DNA 20
3.3.4 Herstellung elektrokompetenter E.coli-Bakterien 21
3.3.5 Transformation kompetenter E.coli-Bakterien durch Elektroporation 22
3.3.6 Isolierung und Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien 23
3.3.7 Agarosegelelektrophorese 23
3.3.8 Technik der transienten Transfektion 24
3.3.9 Technik der stabilen Transfektion 25
3.4 Die Patch-Clamp-Technik 26
3.4.1 Aufbau des Messstands 26
3.4.2 Zellbad und Umströmungssystem 27
3.4.3 Herstellung der Patch-Pipetten 28
3.4.3.1 Stammlösungen der Testsubstanzen 30
3.4.4 Lösungen für Patch-Clamp-Versuche 30
3.4.4.1 Badlösungen 31
3.4.5 Allgemeine Versuchsdurchführung der Patch-Clamp-Technik 31
3.4.6 Cell-attached Konfiguration 32
3.4.7 Inside-out Konfiguration 32
3.4.8 Whole-cell Konfiguration 33
3.4.9 Auswertung und Statistik 33
3.4.9.1 Einzelkanalmessungen 33
3.4.9.2 Inside-out Messungen 34
3.4.9.3 Messungen des Membranpotentials 34
3.5 Mikrofluorimetrische Messung der cytosolischen Ca2+
-Konzentration 35
3.5.1 Eigenschaften und Anwendung von fluoreszierenden Ca2+-Indikatoren 35
3.5.2 Die Mikrofluorimetrie mit digitaler Bildverarbeitung 36
3.5.3 Versuchsdurchführung 37
4 Ergebnisse 39
4.1 Hemmung des nativen KATP -Kanals in HIT-Zellen durch
Clonidin und Chinin 39
Inhaltsverzeichnis
III
4.2 Wirkung von Clonidin und Chinin auf die porenbildende
Untereinheit des KATP-Kanals 40
4.2.1 Charakterisierung der Eigenschaften des heterolog exprimierten
Kir6.2∆C26-Kanals in HEK293-Zellen 40
4.2.2 Vergleich der Kinetik des nativen KATP-Kanals in HIT-Zellen mit
dem heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanal in HEK293-Zellen 41
4.2.3 Hemmung des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanals in
HEK293-Zellen durch Clonidin und Chinin 42
4.2.4 Hemmung des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanals in
HEK293-Zellen durch Alinidin 43
4.3 Heterologe Expression von Kir6.2∆C26/SUR1 in HEK293-Zellen
und Hemmung durch Chinin 44
4.4 Antagonismus von MgGDP und Diazoxid auf die durch
Phentolamin, Alinidin, Tolbutamid und Chinin gehemmten
KATP-Kanäle im inside-out Modus 46
4.5 Vergleich der repolarisierenden Wirkung von Diazoxid in Gegenwart
von den Imidazolinen Phentolamin, Alinidin und Idazoxan, sowie
Tolbutamid und Chinin 48
4.6 Antagonistische Wirkung von Diazoxid auf den Imidazolin-induzierten
Anstieg der cytosolischen Ca2+
-Konzentration 52
4.7 Wirkung des Stoffwechselinhibitors Natriumcyanid auf den
Alinidin-induzierten und den Tolbutamid-induzierten KATP-Kanalblock 57
5 Diskussion 60
5.1 Kir6.2 als gemeinsamer Wirkort von Imidazolinen und Chinin 60
5.2 Kir6.2 als Korrelat von nichtadrenergen Imidazolinbindungsstellen in
insulinsezernierenden Zellen 62
5.3 Wechselwirkung zwischen Imidazolinen und physiologischen und
pharmakologischen KATP-Kanalöffnern 65
5.4 Konsequenzen der Hemmung des Energiestoffwechsels der
B-Zellen für den Imidazolin-induzierten Schluß von KATP-Kanälen 68
Inhaltsverzeichnis
IV
6 Zusammenfassung 70
7 Literaturverzeichnis 74
Abkürzungsverzeichnis
V
Abkürzungsverzeichnis A Ampere
Abb. Abbildung
ADP Adenosin-5´-Diphosphat
ATP Adenosin-5´-Triphosphat
bp Basenpaare
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
Ci Curie, veraltete Einheit der Aktivität
dd H2O doppelt destilliertes Wasser
et al. et alii (und andere)
g Erdbeschleunigung
GDP Guanosin-5´-Diphosphat
Hz Hertz
[3H] Titium (Isotop des Wasserstoffs)
h Stunde(n)
I1 Imidazolin-1-Rezeptor
I2 Imidazolin-2-Rezeptor
IC50 halbmaximal inhibitorisch wirksame Konzentration
KATP-Kanal ATP-sensitiver Kaliumkanal
kB Kilobasenpaare
KD Dissoziationskonstante
kV Kilovolt
l Liter
LB Luria-Bertani
M molar
mg Milligramm
MgGDP Magnesium2+-GDP-Komplex
min Minute(n)
ml Milliliter
mM millimolar
ms Millisekunden
N Normal
nM nanomolar
nm Nanometer
Abkürzungsverzeichnis
VI
ng Nanogramm
OD optische Dichte
Ω Ohm
pA Picoampere
pH negativer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
rpm Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
s Sekunde(n)
s. siehe
SEM Standardfehler der Mittelwerte (Standard Error of Means)
t-Test Student´s t-Test, zweiseitig
U Unit
UV ultraviolett
v/v Volumenanteile bezogen auf das Gesamtvolumen
V Volt
% Prozent
°C Grad Celsius
° Grad
µF Mikrofarad
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM mikromolar
µm Mikrometer
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Die Bedeutung von oralen Antidiabetika in der Therapie des Typ II Diabetes
Die Zunahme der Lebenserwartung geht in allen Ländern mit einer Zunahme der Prävalenz
des Altersdiabetes (Typ II Diabetes) einher. Durch die sog. „Spätschäden“, vor allem die
diabetische Makroangiopathie, ist der Typ II Diabetes eine der Hauptursachen für Morbidität
im höheren Lebensalter. Die Ergebnisse der Langzeitstudie der englischen
Diabetesgesellschaft (UK Prospective Diabetes Study = UKPDS) zeigen, dass eine
Behandlung mit oralen Antidiabetika oder Insulin die Blutzuckerkontrolle gegenüber
alleiniger Diätbehandlung signifikant verbessert, aber nicht normalisiert. Die verbesserte
Stoffwechselkontrolle, sei sie durch orale Antidiabetika oder Insulin bewirkt, konnte das
Auftreten von diabetischen Spätschäden verzögern aber nicht verhindern. Günstig beeinflusst
wurde das Auftreten der diabetischen Mikroangiopathie, die für Organschäden wie
Nephropathie, Retinopathie und Neuropathie verantwortlich ist, nicht aber die
Makroangiopathie (STRATTON et al., 2000). Das Ausmaß der diabetischen
Makroangiopathie wurde nur durch Metformin vermindert, ohne dass die BZ-Einstellung
besser war. Hier mag die Hyperlipidämie eine Rolle spielen (UKPDS GROUP 16, 1995;
UKPDS GROUP 34, 1998).
Allen Antidiabetika ist zu eigen, daß sie im Verlauf des Typ II Diabetes an
Wirksamkeit verlieren (KARAM et al., 1986; KAWAKI et al., 1999; TURNER et al., 1999).
Ursächlich ist hierfür wahrscheinlich ein Fortschreiten der dem Typ II Diabetes zugrunde
liegenden metabolischen Störung. Dieser Wirkungsverlust kann durch Kombination
verschieden wirkender oraler Antidiabetika zumindest zeitweilig kompensiert werden
(FONSECA et al., 2000; WOLFFENBUTTEL et al., 2000). Es werden daher sowohl
insulinsekretionssteigernde orale Antidiabetika als auch insulinwirkungssteigernde orale
Antidiabetika benötigt. Begrenzend für den Einsatz von insulinsekretionssteigernden oralen
Antidiabetika ist das Auftreten von Hypoglykämien (BERGER et al., 1986, CRYER, 2002).
Die Entwicklung von insulinsekretionsteigernden Antidiabetika, die keine Hypoglykämien
bewirken können, wäre ein Fortschritt in der Therapie des Typ II Diabetes.
Einleitung
2
1.2 Physiologische und pharmakologische Regulation der Insulinsekretion
Praktisch einziger physiologischer Auslöser der Insulinsekretion ist ein Anstieg der
Blutglucosekonzentration. Das Besondere der Stimulus-Sekretionskopplung der B-Zelle des
Pankreas besteht darin, dass das Signal für die Exozytose der insulinhaltigen Sekretgranula
aus dem Energiestoffwechsel der B-Zelle entsteht (MEGLASSON und MATSCHINSKI,
1986; PANTEN und LENZEN, 1988; LENZEN 1990). So führt eine Erhöhung des
Glucoseangebots an die B-Zelle zu einem vermehrten Durchsatz durch die Glykolyse und den
Citratzyklus und schlussendlich zu einer Steigerung der mitochondrialen ATP-Synthese. Die
Kopplung zwischen Metabolismus der Glucose und der Sekretionsauslösung wird v.a. durch
einen K+-Kanal in der Plasmamembran vermittelt, den ATP-sensitiven K+-Kanal
(ASHCROFT und RORSMAN, 1989 und 1990). Die Offenwahrscheinlichkeit dieses Kanals
bestimmt das Ruhemembranpotential der B-Zelle, das bei ca. -70 mV liegt. Steigt der
Quotient der cytosolischen Konzentrationen von ATP und ADP, so sinkt die
Offenwahrscheinlichkeit dieses Kanals. Durch einen bisher nicht identifizierten
Einwärtsstrom kommt es zur Depolarisation der Plasmamembran und dadurch zum Öffnen
von spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen (AGUILAR-BRYAN et al., 1998; PANTEN et al.,
1992; PANTEN et al., 1996). Ein Einstrom von Ca2+ aus dem Extrazellulärraum ist in den
meisten sekretorischen Zellen ebenso wie in synaptischen Endigungen von Neuronen ein
unmittelbares Signal zur Auslösung der Exozytose (GERBER und SÜDHOF, 2002). Dieser
Ablauf wird als der KATP-Kanal-abhängige Signalweg oder nach einem Vorschlag von
Henquin „triggering pathway“ genannt (Abb. 1 / HENQUIN, 2000). Außer Glucose gibt es
eine Reihe von physiologischen Stimuli der Insulinsekretion, wie z.B. das Glucagon-like
Peptide 1 (GLP-1), das Cholecystokinin (CCK-PZ) oder die Aktivierung der
parasympathischen Innervation der B-Zelle (MALAISSE et al., 1966). Es handelt sich hierbei
jedoch nicht um Auslöser, sondern um Verstärker der Sekretion, d.h. sie sind nicht wirksam in
Abwesenheit von Glucose.
Sulfonylharnstoffe, die derzeit am häufigsten verwendeten oralen Antidiabetika,
steigern die Insulinsekretion. Therapeutisch relevante extrapankreatische Wirkungen, die für
einige Sulfonylharnstoffe postuliert werden, konnten bisher nicht überzeugend belegt werden
(JOOST, 1985; MOORADIAN, 1987; PANTEN et al., 1996). Sulfonylharnstoffe können die
Insulinsekretion von isolierten Langerhansschen Inseln auch in Abwesenheit von Glucose
stimulieren, sie sind deshalb sekretionsauslösende Substanzen und nicht nur Modulatoren der
Insulinsekretion (MALAISSE et al., 1967; GORUS et al., 1988). Der molekulare
Einleitung
3
Mechanismus der insulinsekretionsauslösenden Wirkung der Sulfonylharnstoffe (Abb. 1)
wurde verständlich, als Mitte der achtziger Jahre mit Hilfe der damals neuen
elektrophysiologischen Patch-Clamp-Technik gezeigt wurde, dass Sulfonylharnstoffe den
ATP-sensitiven-K+-Kanal in den B-Zellen direkt schließen (NOMA, 1983; STURGESS et al.,
1985). Damit bewirken sie das, was der Glucosemetabolismus vermittels eines erhöhten
ATP/ADP-Verhältnisses bewirkt (ASHCROFT und RORSMAN, 1990; AGUILAR-BRYAN
et al., 1998): wiederum kommt es zur Depolarisation der Plasmamembran, Ca2+-Einstrom und
Exozytose (HENQUIN, 1987; ASHCROFT und RORSMAN, 1989)).
Abb. 1 Schema des „triggering pathways“ der Stimulus-Sekretionskopplung in der B-Zelle des Pankreas. Die Steigerung des Energiestoffwechsels durch die Aufnahme von Glucose führt zum Anstieg des ATP/ADP- Konzentrationserhältnisses im Cytosol. Dadurch kommt es zum Schließen der KATP-Kanäle und so zu einer Depolarisierung der Plasmazellmembran. Die Depolarisation führt zur Öffnung spannungsabhängiger Calciumkanäle (VDCC) und zum vermehrten Einstrom von Ca2+ in das Cytosol. Der Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration ([Ca2+]i) ist das unmittelbare Signal für die Freisetzung von Insulin.
Auf welche Weise schließen Sulfonylharnstoffe den KATP-Kanal? Mitte der neunziger Jahre
wurde gezeigt, dass der ATP-abhängige Kaliumkanal aus zwei Untereinheiten besteht: dem
eigentlichen porenbildenden Kanalprotein Kir6.2 und einem zusätzlichen regulatorischen
Protein, auf dem die Bindungsstelle für Sulfonylharnstoffe lokalisiert ist (AGUILAR-
BRYAN et al., 1995; INAGAKI et al., 1995). Da andere Funktionen und endogene Liganden
nicht bekannt waren, wurde das regulatorische Protein dementsprechend „sulfonylurea
receptor“ (SUR) genannt. Es sind bisher drei Isoformen beschrieben, SUR1, SUR2A und
Einleitung
4
SUR2B. Die B-Zelle des Pankreas hat, ebenso wie neuronale Zellen, den Isotyp SUR1
(INAGAKI et al., 1996; ISOMOTO et al., 1996). Es ist derzeit allgemein akzeptiert, dass die
öffnende Wirkung von ADP über eine Bindung von MgADP an den SUR vermittelt wird,
während die schließende Wirkung von ATP durch eine Bindung von ATP4- an Kir6.2
vermittelt wird (ASHCROFT und GRIBBLE, 1999).
Allerdings hat die B-Zelle durch diesen Wirkmechanismus der Sulfonylharnstoffe keinen
Energiegewinn, im Gegensatz zur glucoseinduzierten Insulinsekretion, so dass wegen der
ausgeprägten Energieabhängigkeit der Exozytose in der B-Zelle (DETIMARY et al., 1994;
RUSTENBECK et al., 1997b; TAKAHASHI et al., 1999) nur eine mäßige
Sekretionssteigerung zustande kommt. Die Tatsache, dass der gesteigerte Energiestoffwechsel
zusätzlich zum Schluss des KATP-Kanals und Anstiegs der cytosolischen Ca2+-Konzentration
Signale produziert, die die ausgelöste Sekretion verstärken, hat zur Hypothese eines
„amplifying pathways“ geführt (HENQUIN, 2000), dessen einzelne Elemente jedoch noch
nicht identifiziert sind. Für die therapeutische Anwendung ist diese geringe Wirkung der
Sulfonylharnstoffe in Abwesenheit von Glucose jedoch nur vorteilhaft, da sonst das Risiko
einer Hypoglykämie, die die wichtigste unerwünschte Wirkung von Sulfonylharnsstoffen
darstellt (BERGER et al., 1986; FERNER und CHAPLIN, 1987), noch größer wäre.
Tolbutamid (Abb. 2) ist die Leitsubstanz der Sulfonylharnstoffe der 1. Generation. Als
Sulfonylharnstoffe der 1. Generation werden solche Sulfonylharnstoffe definiert, die
Tagesdosen in Grammmengen haben, und von diesen ist nur noch Tolbutamid (Orabet®) auf
dem deutschen Markt erhältlich. Sulfonylharnstoffe der 2. Generation sind solche die in
Milligrammmengen dosiert werden. Die Leitsubstanz für die zweite Generation ist
Glibenclamid.
1.3 Imidazoline als Stimulatoren der Insulinsekretion
Die Verstärkung der glucoseinduzierten Insulinsekretion durch den α-
Adrenozeptorantagonisten Phentolamin (Abb. 2) ist ein seit langem bekanntes Phänomen und
galt ursprünglich als Hinweis auf eine tonische Hemmung der Insulinsekretion durch das
adrenerge Nervensystem (ROBERTSON und PORTE, 1973). Dieser tonischen Hemmung
sollte eine besondere Rolle im Typ II Diabetes zukommen (AHRÉN und LUNDQUIST,
1985). Aus dieser Vorstellung heraus wurden auch Therapieversuche begonnen, die zum Ziel
hatten, über eine Hemmung der α2–Adrenozeptoren auf den B-Zellen den Einfluss des
Einleitung
5
sympathischen Nervensystems zu vermindern und dadurch die Ansprechbarkeit der B-Zellen
auf einen Anstieg der Blutglucosekonzentration zu verbessern. Als spezifische α2-
Adrenozeptorantagonisten wie Idazoxan (Abb. 2) zur Verfügung standen, wurde jedoch
deutlich, dass die mit Phentolamin zu beobachtende Verbesserung der Glucosetoleranz
offenbar nicht auf einer Hemmung des sympathischen Nervensystems beruht (ÖSTENSON et
al., 1988).
Experimentell gelang der Nachweis, dass die Steigerung der Insulinsekretion nur von solchen
α-Adrenozeptorantagonisten bewirkt wurde, die eine Imidazolinstruktur aufwiesen (SCHULZ
und HASSELBLATT, 1988; 1989a). Auch Clonidin (Abb. 2), ein α2-Adrenozeptoragonist mit
Imidazolinstruktur, der ein typischer Hemmstoff der Insulinsekretion ist, konnte die
Insulinsekretion steigern, wenn die α2-Rezeptoren der B-Zellen irreversibel blockiert waren
(SCHULZ und HASSELBLATT, 1989b). Der Befund, dass Phentolamin, Clonidin und
andere Imidazoline den ATP-sensitiven K+-Kanal der B-Zelle schließen, bot eine logische
Erklärung für die sekretionssteigernde Wirkung der Imidazoline (PLANT und HENQUIN,
1990; DUNNE, 1991; CHAN und MORGAN, 1991). Andererseits war die ausgeprägte
Glucoseabhängigkeit des sekretionssteigernden Effekts des Imidazolins Efaroxan (CHAN und
MORGAN, 1990) Hinweis darauf, dass die Sekretionssteigerung durch Imidazoline nicht nur
auf denselben Mechanismen wie die Sulfonylharnstoff-induzierte Sekretion beruhen konnte.
Der Befund, dass Efaroxan bei niedrigen Glucosekonzentrationen nicht sekretionssteigernd
wirkt, ließ annehmen, dass es möglich sein sollte, aus dieser Substanzgruppe
sekretionssteigernde Antidiabetika zu entwickeln, die nicht das Risiko einer
Hypoglykämieauslösung mit sich tragen (MORGAN und CHAN, 2001). Um die
insulinotrope Wirkung der Imidazoline aufzuklären, wurden Anstrengungen unternommen,
die Bindungsstelle für diese Substanzen auf den B-Zellen zu identifizieren.
Verschiedene Untersuchungen zum Mechanismus zur antihypertensiven Wirkung von
Clonidin führten Mitte der achtziger Jahre zur Hypothese, dass nicht allein die agonistische
Wirkung an α-Adrenozeptoren die Ursache sein könnte, sondern dass es Rezeptoren geben
müsse, die spezifisch Imidazolingruppen erkennen (BOUSQUET et al., 1984). Im Laufe der
letzten Jahre hat die Ansicht, dass es spezifische Imidazolinbindungsstellen gibt, allgemeine
Anerkennung gefunden. Diejenigen Bindungsstellen, die von Clonidin und Clonidinanaloga
mit hoher Affinität erkannt werden, werden als I1-Rezeptoren bezeichnet (MICHEL und
ERNSBERGER, 1992). Diese Rezeptoren sollen wesentlichen Anteil an der Vermittlung des
hypotensiven Effekts von Clonidin haben (DE VOS et al., 1994). Davon sind diejenigen
Einleitung
6
Bindungsstellen abzugrenzen, die von Idazoxan und einigen Guanidinsubstanzen erkannt
Abb. 2 Strukturformeln der verwendeten Imidazoline, sowie des Sulfonylharnstoffs Tolbutamid und es
Chinabaumrindenalkaloids Chinin. Das gemeinsame Strukturmerkmal des Imidazolinrings bedingt eine hemmende Wirkung auf den KATP-Kanal, nicht aber einen Antagonismus an α2-Adrenozeptoren. Innerhalb der Imidazoline sind Idazoxan und Phentolamin α-Antagonisten, Clonidin ist ein α2-Agonist und Alinidin besitzt nur eine sehr geringe Affinität zu α-Rezeptoren.
Einleitung
7
werden; diese werden als I2-Rezeptoren klassifiziert. Ein Teil der als I2 klassifizierten
Bindungsstelle entspricht einer allosterischen Bindungsstelle auf der Monoaminoxidase,
einem Enzym auf der äußeren Mitochondrienmembran, andererseits werden mit I2-
Rezeptoren oder I2-ähnlichen Rezeptoren auch natriuretische Wirkungen an der Niere
assoziiert (REGUNATHAN und REIS, 1996), die nicht durch eine Änderung der
Monoaminoxidaseaktivität erklärt werden können.
Somit war die Vermutung naheliegend, dass auch die Wirkung der Imidazoline auf die
Insulinsekretion durch spezifische Imidazolinrezeptoren vermittelt wird. Die Gruppe um
Morgan veröffentlichte Befunde, die auf die Existenz eines Imidazolinrezeptors in den B-
Zellen schließen lassen: 1.) die Stereoisomere des insulinsekretionssteigernden Imidazolins
Efaroxan wiesen deutlich Unterschiede in ihrer Wirksamkeit auf (CHAN et al., 1993); 2.)
stimulatorisch wirksame Imidazoline wie Phentolamin und Efaroxan, nicht aber unwirksame
Imidazoline wie Idazoxan, bewirken eine homologe Desensitisierung (CHAN et al., 1994);
3.) der mögliche endogene Imidazolin-Agonist CDS (clonidine-displacing substance) steigert
die Insulinsekretion (CHAN et al., 1997a), was durch das Imidazolinderivat RX801080
antagonisiert werden konnte. Dieser Reihe von Befunden, die auf eine Existenz eines
Imidazoline erkennenden Rezeptors in den B-Zellen des Pankreas hinweisen, stehen Befunde
aus der Gruppe um Henquin entgegen. Diese belegen eine Stereoselektivität nur für die über
α-Rezeptoren vermittelten Wirkungen eines Imidazolins (SL84.0418) an der B-Zelle, nicht
aber für den Schluss des KATP-Kanals, und weisen damit auf eine weniger spezifische
Interaktion mit dem KATP-Kanalprotein hin (JONAS et al., 1994). Ein ähnlicher Mechanismus
wird auch für die insulinsekretionssteigernde Wirkung von Chinin (Abb. 2) und Klasse IA-
Antiarrhythmika vermutet (KAKEI et al., 1993). Diese Ansicht wird durch einen Befund aus
der Gruppe von F.Ashcroft unterstützt: eine C-terminal trunkierte Variante von Kir6.2, die im
Gegensatz zum Wildtyp auch ohne die gleichzeitige Expression von SUR1 an die
Plasmamembran gelangt und Kanalaktivität zeigt (TUCKER et al., 1997), war durch
Phentolamin in den Konzentrationen zu hemmen, in denen Phentolamin auch den
natürlichen, aus Kir6.2 und SUR1 bestehenden KATP-Kanal hemmt (PROKS und
ASHCROFT, 1997). Dieser Befund spricht dafür, dass zumindest Phentolamin den
Ionenkanal durch direkte Blockade der Ionenpore des KATP-Kanals hemmt. Darüber hinaus
besitzen Imidazoline aber noch zusätzliche Effekte, die sich als Sensitisierung der
Exozytosemaschinerie gegenüber der intrazellulären Ca2+-Konzentration beschreiben lassen
(ZAITSEV et al., 1996). Dieser Effekt der Imidazoline ähnelt der direkten Wirkung auf die
Exozytose, die von Sulfonylharnstoffen berichtet wurde (ELIASSON et al., 1996). Die
Einleitung
8
Relevanz dieser „distalen“ Effekte für die Insulinsekretionssteigerung ist jedoch bisher noch
unklar.
Mit Rezeptor-Bindungsstudien konnten nichtadrenerge Imidazolinbindungsstellen an
Membranen von insulinsezernierenden RINm5F-Zellen (CHAN et al., 1997b) und HIT-
Zellen nachgewiesen werden (RUSTENBECK et al., 1997a). In den letzteren Versuchen
wurde [3H]Clonidin als Radioligand verwendet, da Clonidin der etablierte Ligand für I1-
Bindungsstellen ist (REGUNATHAN und REIS, 1996) und Clonidin die Insulinsekretion
steigert, vorausgesetzt die α2-Adrenozeptoren der B-Zelle sind durch Antagonisten besetzt
(SCHULZ und HASSELBLATT, 1989b). Somit konnte angenommen werden, dass Clonidin
an die funktionell relevanten Stellen bindet und die Ergebnisse der Verdrängungsbindung
konnten direkt mit den an anderen Geweben erhaltenen Ergebnissen verglichen werden. Der
Nachweis, dass es an HIT-Zellmembranen nichtadrenerge Imidazolinbindungsstellen gibt
(RUSTENBECK et al., 1997a), ist durch den Befund gegeben, dass Noradrenalin markiertes
Clonidin nur unvollständig zu verdrängen vermochte (Abb. 3). Mit einem Überschuss an
Noradrenalin ließen sich nun die Adrenozeptoren maskieren und [3H]Clonidin konnte nur an
die nichtadrenergen Imidazolinbindungsstellen binden.
Abb. 3 Homologe Verdrängung von [
3H]Clonidin durch unmarkiertes Clonidin () verglichen mit der
Verdrängung von [3H] Clonidin durch Noradrenalin () von HIT-Zellmembranen. Die Verdrängung durch
Clonidin ist vollständig, die durch Noradrenalin unvollständig. Die durch Noradrenalin nicht verdrängbare Aktivität von [3H]Clonidin (ca. 30%) ist Ausdruck von nichtadrenergen Imidazolinbindungsstellen.
Einleitung
9
Die Verdrängungsbindungen, die in Gegenwart von Noradrenalin erhalten wurden, waren
biphasisch (Abb. 4). Die homologe Verdrängung von markiertem durch unmarkiertes
Clonidin ergab einen KD-Wert von 61 nM für die hochaffine Stelle und einen solchen von 4,5
µM für die niederaffine Stelle. Die Bindungskapazitäten (Bmax) betrugen 41 fmol/mg für die
hochaffine Stelle und 20,1 pmol/mg für die niederaffine Stelle. Da Tolbutamid [3H]Clonidin
nur in Konzentrationen von mehr als 1 mM verdrängte (RUSTENBECK et al., 1999b), war
SUR1 nicht als Korrelat dieser Bindungsstelle anzunehmen. Die Charakteristika der
hochaffinen Stelle unterschieden sich sowohl von denen von I1- als auch von denen von I2-
Rezeptoren. Die schließende Wirkung der Imidazoline auf den KATP-Kanal erforderte bei
einigen Substanzen solche Konzentrationen, bei denen sie nur an die hochaffine Stelle
banden, bei anderen Imidazolinen waren die notwendigen Konzentrationen so hoch, daß auch
eine Bindung an die niederaffine Stelle möglich war. Zudem ließ sich eine Korrelation
zwischen den Affinitäten für die hochaffine und für die niederaffine Stelle nachweisen, so daß
die Frage entstand, ob es sich hier überhaupt um zwei unabhängige Entitäten oder um zwei
verschiedene Formen der gleichen Bindungsstelle handelt (RUSTENBECK et al., 1997a).
Insofern blieb die Beziehung zwischen der Bindung der Imidazoline an diese Stellen und ihrer
hemmenden Wirkung auf den KATP-Kanal unklar.
Ein Hinweis darauf, dass die mit [3H]Clonidin nachgewiesenen
Imidazolinbindungsstellen möglicherweise doch in einem Zusammenhang mit dem KATP-
Kanal stehen, ergab sich durch den Befund, dass auch Chinin [3H]Clonidin von den
nichtadrenergen Bindungsstellen verdrängte (RUSTENBECK, unveröffentliche Beobachtung;
Abb. 4). Chinin steigert in mikromolaren Konzentrationen die Insulinsekretion durch
Hemmung des KATP-Kanals (HENQUIN et al., 1975; BOKVIST et al., 1990a). Auch hier war
die Verdrängung biphasisch mit einem Ki-Wert von 75 nM und einem weiteren von 133 µM.
Die Bindungskapazitäten dieser Stelle entsprachen 17 % und 83 % des verdrängten
Radioliganden. Im Unterschied zu der Verdrängung durch Imidazoline war die Verdrängung
durch Chinin inkomplett (Abb. 4). Es stellte sich also die Frage, ob Chinin den KATP-Kanal
durch Angriff an der porenbildenden Untereinheit (Kir6.2) blockiert, so wie es für das
Imidazolin Phentolamin beschrieben worden war. Dementsprechend könnte Kir6.2 also den
gemeinsamen Bindungsort oder genauer, einen gemeinsamen Bindungsort von Chinin und
Imidazolinen an der B-Zelle darstellen. Deshalb sollte geprüft werden, ob sowohl Clonidin als
auch Chinin in der Lage sind, die Kanalaktivität von Kir6.2 zu hemmen. Diese Wirkungen
sollten dann mit derjenigen auf native KATP-Kanäle und dem Bindungsverhalten verglichen
werden.
Einleitung
10
Abb. 4 Verdrängung von [
3H]Clonidin durch Clonidin und Chinin von HIT-Zellmembranen. Die Inkubationen
wurden in Gegenwart von 100 µM Noradrenalin durchgeführt, so dass α2-Adrenozeptoren maskiert waren, und nur nichtadrenerge Imidazolinbindungsstellen dargestellt sind. Die homologe Verdrängung durch nichtmarkiertes Clonidin () ergab eine biphasische Kurve mit einem Kd-Wert für die hochaffine Stelle von 61 nM, sowie für die niederaffine Stelle von 4,5 µM. Auch Chinin () verdrängte markiertes Clonidin von den nichtadrenergen Bindungsstellen. Die Verdrängung war biphasisch, jedoch nicht vollständing. Die Ki-Werte betrugen 75 nM und 133 µM. Für beide Substanzen ergab sich eine signifikant bessere Kurvenanpassung, wenn ein Modell mit zwei Bindungsstellen statt eines solchen mit einer Bindungsstelle gewählt wurde.
Mit dem Nachweis des KATP-Kanal-unabhängigen distalen Effekts (ZAITSEV et al., 1996)
stellte sich einerseits die Frage, ob die besondere Glucoseabhängigkeit einiger Imidazoline
auf diesem Effekt beruht, andererseits die Frage, ob es nicht überhaupt möglich sein sollte,
durch Strukturvariationen Substanzen zu erhalten, die zwar noch die Insulinsekretion steigern,
nicht mehr aber Hemmstoffe des KATP-Kanals sind. So wurde kürzlich über eine Substanz
(BL11282) mit Imidazolinstruktur berichtet, welche in Gegenwart einer stimulatorischen
Blutglukosekonzentration die Insulinsekretion zu steigern vermochte, ohne die KATP-
Kanalaktivität zu reduzieren (EFANOV et al., 2001).
Sicher ist bei den bisher verwendeten Imidazolinen die Blockade des KATP-Kanals
entscheidend für den insulinotropen Effekt. Diejenigen Imidazoline, die eine starke
stimulatorische Wirkung auf die Insulinsekretion haben, wie z.B. Phentolamin, haben auch
eine ausgeprägte hemmende Wirkung auf den KATP-Kanal (RUSTENBECK et al., 1997a).
Entsprechend diesem Effekt auf den KATP-Kanal zeigte die cytosolische Ca2+-Konzentration
in den B-Zellen bei Phentolamin einen deutlichen Anstieg, wobei die träge Kinetik des durch
Phentolamin induzierten Ca2+-Konzentrationsanstiegs gut mit der langsam einsetzenden
Einleitung
11
Hemmung des KATP-Kanals und dem langsamen Anstieg der Insulinsekretion korrelierte
(RUSTENBECK et al., 1995 und 1997a). Wahrscheinlich ist die Substanzgruppe der
Imidazoline bezüglich der Insulinsekretionssteigerung heterogen, d.h. es ist die Beeinflussung
mehrerer Mechanismen anzunehmen, die, je nach Substanz in unterschiedlichem Ausmaß die
Insulinsekretionsrate beeinflussen. So ist auch die Glucoseabhängigkeit des
sekretionssteigernden Effekts durchaus unterschiedlich. Phentolamin steigerte die
Insulinsekretion auch bei nichtstimulatorischen Glucosekonzentrationen, während Alinidin
und Idazoxan hier nahezu ineffektiv waren (RUSTENBECK et al., 1999a).
Ein Imidazolin, das die gewünschte Selektivität für stimulatorische
Glucosekonzentrationen mit einem starken sekretionssteigernen Effekt verbindet, ist Efaroxan
(MORGAN und CHAN, 2001). Nun hemmt auch Efaroxan den KATP-abhängigen K+-Kanal,
so dass sich durchaus die Perspektive ergibt, dass auch solche Imidazoline, die den KATP-
Kanal blockieren, klinisch verwendbare Substanzen ergeben können. In Hinsicht auf die
mögliche therapeutische Anwendung von Imidazolinen, die den KATP-Kanal schließen, stellte
sich jedoch die Frage, ob ein durch Imidazoline herbeigeführter Schluss des KATP-Kanals
durch physiologische und pharmakologische Kaliumkanalöffner antagonisiert werden kann.
Hierzu lagen nur wenige Daten vor, und sie wiesen darauf hin, dass nur eine minimale
Antagonisierbarkeit möglich ist (PLANT und HENQUIN, 1990).
Zielsetzung und Fragestellung
12
2 Zielsetzung und Fragestellung der Arbeit
Vertreter der Substanzgruppe der Imidazoline sind interessant als potentielle orale
Antidiabetika, da einige von ihnen die Insulinsekretion nur in Gegenwart einer
stimulatorischen Insulinsekretion steigern. Es gibt Hinweise darauf, dass neben dem Schluss
des ATP-abhängigen Kaliumkanals weitere Mechanismen an der Sekretionsauslösung
beteiligt sind. Umstritten ist, ob es einen spezifischen Imidazolinrezeptor (I3-Rezeptor) an der
B-Zelle des Pankreas gibt, und wie seine Beziehung zum KATP-Kanal und den zusätzlichen
insulinotropen Mechanismen ist. In der vorliegenden Arbeit soll die Wirkung der Imidazoline
auf Elemente des „triggering pathways“ der Insulinsekretion genauer charakterisiert werden.
Folgende Fragen sollen bearbeitet werden:
1. In welcher Beziehung steht der KATP-Kanal zu den nichtadrenergen
Imidazolinbindungsstellen, die in der Membran von insulinsezernierenden HIT-Zellen
beschrieben wurden?
1.1. Ist die Hemmung des KATP-Kanals durch Imidazoline ebenso wie diejenige durch
Chinin auf eine Interaktion mit der porenbildenden Untereinheit Kir6.2 des KATP-
Kanals zurückzuführen und kann dadurch die Bindung von Chinin an nichtadrenerge
Imidazolinbindungsstellen von HIT-Zellmembranen erklärt werden?
1.2. Die heterologe transiente Expression der trunkierten porenbildenden Untereinheit
Kir6.2∆C26 sollte etabliert werden und die Wirkung von Imidazolinen und Chinin
auf diesen Kanal mit derjenigen auf den nativen KATP-Kanal verglichen werden.
2. Lässt sich der insulinotrope Effekt, den Imidazoline durch Blockade von Kir6.2 bewirken,
durch physiologische und pharmakologische Kaliumkanalöffner antagonisieren?
2.1. Dazu sollte der Antagonismus der schließenden Wirkung von Imidazolinen auf den
nativen KATP-Kanal durch Diazoxid und GDP in der inside-out Konfiguration geprüft
werden.
2.2. Das Ausmaß der Diazoxid-induzierten Repolarisation sollte unter current-clamp
Bedingungen in der whole-cell Konfiguration geprüft werden.
2.3. Die Auswirkung der Repolarisation auf die cytosolische Ca2+-Konzentration sollte an
intakten perifundierten B-Zellen gemessen werden.
Material und Methoden
13
3 Material und Methoden 3.1 Materialien
[3
H] Clonidin (spez. Aktivität 63,5 Ci/mmol) NEN DuPont, Dreieich
Agar GibcoBrl, Karlsruhe
Agarose Amresco, Solon, Ohio, USA
Agarose (low-melting) FMC Bio Products, Rockland, Me, USA
Alinidin Boehringer, Ingelheim
ATP (Adenosintriphosphat) Boehringer, Mannheim
Ampicillin Boehringer, Mannheim
Bakto-Trypton GibcoBrl, Karlsruhe
Bakto-Yeast-Extrakt GibcoBrl, Karlsruhe
Borsäure Merck, Darmstadt
BSA (Rinderserumalbumin); Fraktion V Bayer Diagnostics GmbH, München
Calciumchlorid Merck, Darmstadt
Chinin Sigma, Taufkirchen
CIAP (calf intestinal alkaline phosphatse) GibcoBrl, Karlsruhe
Clonidin Boehringer, Ingelheim
Collagenase P Boehringer, Mannheim
Diazoxid Sigma, Taufkirchen
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) GibcoBrl, Karlsruhe
DMSO (Dimethylsulfoxid) Sigma, Taufkirchen
E. coli (Escherichia coli) JM109 Stratagene, La Jolla, USA
E. coli (Escherichia coli) XL1Blue Stratagene, La Jolla, USA
EDTA (Ethylendiamin-N,N,N´,N´- Sigma, Taufkirchen
tetraessigsäure)
EGTA (Ethylenglykol-bis-(ß-aminoethylether)- Sigma, Taufkirchen
N,N,N´,N´-tetraessigsäure)
Elektroporationsküvetten, BioRad, München
2 mm Elektrodenabstand
Ethanol Baker, Deventer, Niederlande
Ethidiumbromid Merck, Darmstadt
Filterpapiere Schleicher & Schüll, Dassel
FCS (Fötales Kälberserum) GibcoBrl, Karlsruhe
Fura-2/AM Molecular Probes, Eugene, OR, USA
Material und Methoden
14
G418 (Geneticin) GibcoBrl, Karlsruhe
GFX PCR DNA Gel Band Purification Kit Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Glibenclamid Boehringer, Ingelheim
Glucose Merck, Darmstadt
Glycerol GibcoBrl, Karlsruhe
HEPES (4-(-Hydroxyethyl)-1- Sigma, Taufkirchen
piperazinethansulfonsäure
Idazoxan Research Biochemicals, Natick, MA,
USA
Isopropanol Baker, Deventer, Niederlande
Kaliumchlorid Merck, Darmstadt
Kanamycin Roche Molecular Biochemicals,
Mannheim
Lipofectamine TM GibcoBrl, Karlsruhe
Magnesiumchlorid Merck, Darmstadt
Magnesiumsulfat Merck, Darmstadt
Mineralöl Sigma, Taufkirchen
Natriumchlorid Merck, Darmstadt
Natriumdihydrogenphosphat Merck, Darmstadt
Natriumhydrogencarbonat Merck, Darmstadt
Natriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid Merck, Darmstadt
Natrium-Laurylsarcosin Sigma, Taufkirchen
Noradrenalin Sigma, Taufkirchen
Orange G (8-(Benzolazol),7-hydroxyl, Sigma, Taufkirchen
1,3-naphthlindisulfonsäure)
Penicillin GibcoBrl, Karlsruhe
Phentolamin Ciba-Geigy, Lörrach
Puffer R+ Fermentas, St. Leo-Rot
Puffer Y+/TANGOTM Fermentas, St. Leo-Rot
QIAex II Gel Extraction Kit Qiagen, Hilden
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden
Material und Methoden
15
Restriktionsenzyme Fermentas, St.Leo-Rot
EcoRV
SalI
XbaI
RPMI (Roswell Park Memorial Institute)- GibcoBrl, Karlsruhe
1640 Medium
Salzsäure (37%) Merck, Darmstadt
SDS (Natriumdodecylsulfat) Sigma, Taufkirchen
Spritzenvorfilter, steril, 0,2 µm Porengröße Schleicher & Schüll, Dassel
Streptomycin GibcoBrl, Karlsruhe
Sylgard 184 Silikon Gel Dow Corning Corp., Midland, MI, USA
Komponenten: Silicone Elastomer, Curning Agent
T4-DNA-Ligase GibcoBrl, Karlsruhe
Tolbutamid Serva, Heidelberg
Tris Merck, Darmstadt
Trypsin Biochrom, Berlin
Vektor pAdTrack CMV Qbiogene, Heidelberg
Vektor pcDNA 3 Invitrogen, Karlsruhe
Vektor pECE ratSUR1 Prof. J. Bryan, Baylor College of
Medicine, Houston, USA
Sterile Zellkulturgefäße und Plastiklaborartikel wurden von den Herstellern Biozym,
Eppendorf, Greiner, Nunc und Sarstedt bezogen.
Zur Datenverarbeitung wurde folgende Software verwendet: Microsoft Word 2000,
Microsoft Exel 2000, Adobe Photoshop 6.0, DNASIS 2.1, Graph Pad Prism 3.01, Heka Pulse
3.0, TAC V3.0, TAC Fit und EndNote 3.
Material und Methoden
16
3.2 Zellkultur und Gewebegewinnung
3.2.1 Zellkulturlinien
3.2.1.1 HEK 293-Zellen
Adenovirus5-transformierte HEK (human embryonic kidney) 293-Zellen (GRAHAM et al.,
1977) wurden in DMEM Medium bei 37°C, 5% CO2 (v/v) und wasserdampfgesättigter
Atmosphäre im Brutschrank kultiviert. Dem Medium wurde noch 10% FCS (v/v), sowie
Penicillin G und Streptomycin zugesetzt. Alle 3-4 Tage wurde das Zellkulturmedium
abgesaugt und durch neues ersetzt.
3.2.1.2 HIT-Zellen
Kultiviert wurde der Subklon T15 der SV40-transformierten, insulinsezernierenden Hamster-
B-Zelle (HIT-Zelle) (SANTERRE et al., 1981). Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium,
dem 10% FCS (v/v), Penicillin G und Streptomycin zugesetzt war, bei 37°C, 5% CO2 (v/v)
und wasserdampfgesättigter Atmosphäre im Brutschrank kultiviert. Alle 3-4 Tage wurde das
Zellkulturmedium abgesaugt und durch neues ersetzt.
3.2.2 Medien und Lösungen für die Zellkultur
3.2.2.1 Kulturmedium DMEM (DMEM Trockenmedium, NaHCO3 , FCS 10% (v/v), 100
µg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin)
50,75 g Trockenmedium und 18,5 g NaHCO3 wurden in 4 l autoklaviertem dd H2O unter
Rühren gelöst. Der pH-Wert wurde mit 37-prozentiger HCl auf 7,2 eingestellt. Nach Zugabe
von 500 ml hitzeinaktiviertem FCS und 50 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung wurde das
Volumen auf 5 l mit autoklaviertem dd H2O aufgefüllt und sofort sterilfiltriert.
3.2.2.2 Kulturmedium RPMI 1640 (RPMI 1640 Trockenmedium, NaHCO3 26 mmol/l, FCS
10% (v/v), 100 µg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin)
52 g Trockenmedium und 11 g NaHCO3 wurden in 4 l autoklaviertem dd H2O unter Rühren
gelöst. Der pH-Wert wurde mit 37-prozentiger HCl auf 7,15 eingestellt. Nach Zugabe von
500 ml hitzeinaktiviertem FCS und 50 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung wurde das
Volumen auf 5 l mit autoklaviertem dd H2O aufgefüllt und sofort sterilfiltriert.
Material und Methoden
17
3.2.2.3 PBS (Phosphate buffered saline):
137 mM NaCl 2,7 mM KCl 8,1 mM Na2HPO4 1,8 mM KH2PO4
Die Lösung wurde auf pH 7,4 eingestellt, autoklaviert und bei Raumtemperatur gelagert. 3.2.2.4 EDTA-Stammlösung:
2,0 % (w/v) EDTA
Das EDTA wurde in sterilem PBS gelöst. Die Lösung wurde auf pH 7,4 eingestellt und
autoklaviert. Die Lösung wurde in 5 ml Aliquoten bei –20 °C gelagert.
3.2.2.5 Trypsin-EDTA-Lösung:
10 ml 0,25 % (w/v) Trypsin-Stammlösung 5 ml 2,0 % (w/v) EDTA-Stammlösung 85 ml PBS
Die Lagerung der Lösung erfolgte bei –20 °C. 3.2.2.6 Krebs-Ringer-HEPES-Puffer (für Einzelzellen):
789 mg NaCl [135 mM] 36 mg KCl [4,8 mM] 16 mg KH2PO4 [1,2 mM]
30 mg MgSO4 •7H20 [1,2 mM] 596 mg HEPES [25 mM] 19 mg EGTA [500 µM] 54 mg Glucose [3,0 mM]
Die Elektrolyte, EGTA, Glucose und HEPES wurden in 100 ml dd H2O gelöst und mit 1N
NaOH auf pH 7,4 titriert. Nach Erreichen des gewünschten pH´s wurde 1% (v/v) BSA
hinzugefügt.
3.2.3 Zellpassagierung
Alle 6-8 Tage, bei den HEK293-Zellen eher noch in kürzeren Abständen, waren die 10 cm
Petrischalen dicht bewachsen, so dass die Zellen umgesetzt werden mussten. Das
Kulturmedium wurde abgesaugt, danach wurden die anhaftenden Zellen vorsichtig mit 4 ml
PBS gewaschen, da FCS die Trypsinaktivität hemmt. Zur Ablösung der Zellen von der
Petrischale wurden 2,5 ml Trypsin/EDTA-Lösung zugegeben und 3 min im Brutschrank
inkubiert. Durch Zugabe von 2 ml FCS-haltigem Zellkulturmedium wurde die
Trypsinwirkung gestoppt. Das Medium wurde mit einer Pipette aufgenommen und zum
Material und Methoden
18
Abspülen der Zellen verwendet. Etwa dreimal wurde die Petrischale abgespült und das
Medium mit den abgelösten Zellen in einem sterilen 15 ml Zentrifugenröhrchen
aufgenommen. Die Zellen wurden bei 300 g zentrifugiert (Biofuge primo, Heraeus) und der
Überstand verworfen. 1,3 µl (Erfahrungswert) des Zellpellets wurden abgenommen und in 10
ml Zellkulturmedium auf einer neuen 10 cm Petrischale gründlich resuspendiert.
Die Zellkonzentration in einer Suspension wurde mittels einer Neubauer-Zählkammer
bestimmt. In einem definierten Volumen wurde unter dem Lichtmikroskop die Zellzahl
ausgezählt. Die Neubauer-Zählkammer besteht aus 16 Quadraten, wobei jedes Quadrat eine
Fläche von 1 mm2 hat. Dies ergibt bei einer Tiefe von 0,1 mm ein Volumen von 0,1 µl. Die
Multiplikation des berechneten Mittelwerts mit 104 ergibt somit die Zellzahl pro ml. Der
Verdünnungsfaktor der Zellsuspension multipliziert mit der Zellzahl pro ml ergibt die
Gesamtzellzahl.
3.2.4 Gewinnung von Pankreasinseln
Eine NMRI Maus wurde mit Diethylether betäubt und durch Genickschnitt getötet. Das Fell
wurde mit Ethanol geglättet. Im unteren Bauchbereich wurde die Haut bis zum Brustbein
durchtrennt. Danach wurde das subkutane Fettgewebe von der Abdominalmuskulatur getrennt
und die Muskulatur aufgeschnitten. Das Pankreas wurde dargestellt und möglichst
fettgewebefrei herauspräpariert. Das Pankreas wurde in Krebs-Ringerlösung überführt und
von verbliebenem Fettgewebe getrennt. Nach Überführung in eine neue Petrischale mit 2 ml
Krebs-Ringer wurde das Pankreas sorgfältig mit einer Schere zerkleinert. Die
Gewebesuspension wurde mit einer Pipette aufgenommen und zu 1 mg Kollagenase in ein 5
ml Glasgefäß gegeben. Die Suspension wurde kräftig durchmischt, in einem auf 37 °C
temperiertem Schüttelwasserbad eingespannt und für 10 min unter Schütteln (5 Hz) inkubiert.
Der Reaktionsstop erfolgte durch das Auffüllen der Flasche mit kaltem Krebs-Ringer-
Medium. Anschließend sedimentierten die Inseln für 5 min bei RT. Der Überstand wurde
verworfen und das Glasgefäß mit neuem Krebs-Ringer-Medium aufgefüllt. Der Inhalt wurde
in eine 10 cm Petrischale gegeben. Das Glasgefäß wurde mit 5 ml Krebs-Ringer nachgespült,
und der Inhalt wiederum in die Petrischale gegeben.
Material und Methoden
19
3.3 Molekularbiologische Methoden
3.3.1 Geräteliste
AvantiTM J-25 Zentrifuge Beckmann, München
BIORAD Gene Pulser BioRad, München
Kodak Digitalkamera Kodak, Rochester, USA
(Kodak Digital ScienceDC40)
Electrophoresis Power Supply EPS 200 Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Elektrophoresekammer Horizon 58 GibcoBrl, Karlsruhe
(+ Gelträger, Kämme und Keile)
Eppendorf Jürgens Zentrifuge 5417C Eppendorf, Hamburg
Gelgußdeck GibcoBrl, Karlsruhe
GFL 3032 Schüttler GFL, Gesellschaft f. Labortechnik, Burgwedel
Lambda Bio UV/VIS Spektrometer Perkin Elmer, Überlingen
Quarzküvette Hellma, Mühlheim/Baden
UV Transilluminator (254/366 nm) Vetter GmbH, Wiesloch
3.3.2 Ausgangs- und Expressionsplasmide
Die cDNA der trunkierten porenbildenden Untereinheit des KATP-Kanals (Kir6.2∆C26)
wurde freundlicherweise von F. Ashcroft im Expressionsvektor pcDNA3 (Abb. 5B) zur
Verfügung gestellt. Dieser Vektor enthielt Resistenzmarker für Ampicillin und Neomycin und
konnte direkt für stabile Transfektionen verwendet werden. Ferner konnte die cDNA von
Kir6.2∆C26 mit den geeigneten Restriktionsendonukleasen EcoRV und XbaI aus dem
pcDNA3 Vektor geschnitten werden, um sie in das pAdTrackCMV Plasmid (HE et al., 1998)
zu subklonieren. Dieses cDNA-Fragment war ca. 1,4 kB groß. pAdTrackCMV Kir6.2∆C26
(Abb. 5A) enthielt außerdem die codierende Sequenz für das grünfluoreszierende Protein
(GFP). GFP ermöglichte die Detektion erfolgreich transient transfizierter Zellen, mit denen
Patch-Clamp Experimente durchgeführt wurden (CHALFIE et al., 1994). Die cDNA von
SUR1, der regulativen Untereinheit des KATP-Kanals der Ratte, lag im pECEratSUR1 Vektor
(Abb. 5C) vor. Die cDNA der ratSUR1 konnte mit den Restriktionsendonukleasen SalI und
XbaI herausgetrennt werden und ebenfalls in den pAdTrackCMV subkloniert werden. Das
cDNA-Fragment war ca. 5 kB groß. Mit pAdTrackCMV ratSUR1 wurde wiederum die
Grünfluoreszenz zur Detektion der erfolgreichen Koexpression von SUR1 in HEK293
Kir6.2∆C26 Zellen genutzt.
Material und Methoden
20
Abb. 5 Strukturen des klonierten Expressionsvektors pAdTrackCMV Kir6.2∆C26 (A) und der Ausgangs- und
Expressionsvektoren pcDNA3 mit den relevanten Schnittstellen EcoRV und XbaI (B) und pECE ratSUR1 mit den relevanten Schnittstellen SalI und XbaI (C).
3.3.3 Manipulation der Plasmid-DNA
Die Plasmid-DNA wurde mit Restriktionsendonukleasen in dem vom Hersteller
mitgelieferten Puffersystem bei empfohlener Temperatur- (Trio-Thermoblock, Biometra),
Mengen- und Zeitkonstante hydrolysiert. Neben dem präparativen Zweck der Restriktion
wurden zur Überprüfung einer erfolgreichen Subklonierung Restriktionsanalysen
durchgeführt. Nach dem Restriktionsverdau schloss sich ein Aufreinigungsschritt an.
Material und Methoden
21
Durch die Inkubation mit alkalischer Phosphatase (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase
CIAP) wurden die Phosphatreste an den 5´- und 3´-Enden der Plasmid-DNA abgespalten.
Dadurch wurde eine Religation des Vektors vermieden und die Effizienz der Subklonierung
erhöht. Die Dephosphorylierung wurde mit 1 U CIAP in dem vom Hersteller gelieferten
Reaktionspuffer (50 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,5) bei 37°C für 30 min durchgeführt. Das
Reaktionsvolumen betrug 50 µl. Das nachfolgende Erhitzen auf 72°C für 10 min führte zur
Inaktivierung des Enzyms.
Die Aufreinigung der beim Restriktionsverdau entstandenen DNA-Fragmente erfolgte mit
dem GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit von Amersham Pharmacia Biotech oder
dem QIAex II Gel Extraction Kit von Qiagen nach Herstellerangaben.
Die komplementären kohäsiven Enden der jeweiligen cDNA und des Plasmids, die nach dem
Restriktionsverdau entstanden sind, wurden im molaren Verhältnis von 3:1 für 16 h bei 16°C
ligiert. Die Inkubation von insgesamt 300 ng DNA erfolgte mit 0,1 U T4-DNA-Ligase in
Ligasepuffer (66 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1mM ATP, pH 7,5). Das
Reaktionsvolumen betrug 20 µl.
3.3.4 Herstellung elektrokompetenter E.coli-Bakterien
Um eine Bakterienmembran für Plasmide permeabel zu machen, kann neben chemischen
Verfahren mit divalenten Kationen (Ca-Phosphat) ein starkes elektrisches Feld verwendet
werden (Elektroporation). Um E.coli-Bakterien durch Elektroporation mit Plasmid-DNA
transformieren zu können, ist es erforderlich, die Bakterien mit sequenziellen Waschschritten
in ein salzarmes Medium zu überführen. Wenn ein starkes elektrisches Feld (5 kV/cm)
angelegt wird, kann die Membran für 4 ms desintegriert werden, ohne dass die Bakterien
sterben. Die Aufnahme der Plasmid-DNA wird damit möglich.
Folgende E.coli-Stämme wurden verwendet: E.coli JM109 mit dem Genotyp: EndA, recA1,
gyrA96, thi, hsdR17 (rk-, mk
+), relA1, supE44, λ-, ∆(lac-proAB), [F´,traD36, proA+B+,
laclqZ∆m15] und E.coli XL1 Blue mit dem Genotyp: RecA1, endA, gyrA96, thi-1, hsdR17,
supE44, relA1, lac, [F´, proA+B+, laclqZ∆m15, Tn10 (Tetr)].
Material und Methoden
22
400 ml LB-Medium (1% (w/v) Bakto-Trypton, 0,5% (w/v) Bakto-Yeast-Extrakt, 1% (w/v)
NaCl, pH 7,0) wurden mit 4 ml einer E.coli-Vorkultur angeimpft und in einem Rundschüttler
(GFL 3032) bei 37°C und 220 rpm inkubiert, bis eine OD660 nm von 0,7 erreicht wurde.
Anschließend wurde die Bakteriensuspension für 30 min auf Eis gekühlt, bevor die Bakterien
15 min bei 4°C und 4000 g pelletiert (AvantiTM J-25 Zentrifuge, Beckman) wurden. Der
Überstand wurde dekantiert und das Pellet vorsichtig in 400 ml 10%igem (v/v) Glycerol
resuspendiert. Es folgten weitere Zentrifugations- und Waschschritte, in denen das Volumen
der 10%igen (v/v) Glycerollösung schrittweise verringert wurde. Am Ende waren die
Bakterien in 1 ml 10%igem (v/v) Glycerol konzentriert. Sie wurden in 60 µl Aliquoten bei
–70°C gelagert.
3.3.5 Transformation kompetenter E.coli-Bakerien durch Elektroporation
Zunächst kühlte man die Elektroporationsküvette (BioRad, 2 mm Elektrodenabstand) auf Eis
vor. In der Zwischenzeit wurden 40 µl einer Suspension elektrokompetenter E.coli-Bakterien
aus den gelagerten Aliquoten schonend auf Eis aufgetaut und in die Küvette überführt. 1 µl
des Ligationsansatzes (entsprechend ca. 50 ng Plasmid-DNA) wurde auf die
Bakteriensuspension pipettiert und gut durchmischt. Die Kontakte an der Küvette wurden
getrocknet und in die Elektroporationskammer (BioRad Gene-Pulser) eingesetzt. Die
Bakterien wurden für 4-5 ms einer elektrischen Spannung von 2,5 kV bei einer Kapazität von
25 µF und einem Widerstand von 200 Ω ausgesetzt. Im Anschluss wurden die gepulsten
Bakterien in 0,5 ml SOC-Medium aufgenommen. Das SOC-Medium wurde aus dem LB-
Medium entwickelt und bestand aus: 2% (w/v) Bakto-Trypton, 0,5% (w/v) Bakto-Yeast-
Extrakt und sowie 0,5% (w/v) NaCl; vor dem Gebrauch wurde das Medium mit 5 mM MgCl2
und 20 mM Glucose komplettiert. Um die Expression der Resistenzgene zu gewährleisten,
wurde der Ansatz für 1 h bei 37°C und 220 rpm im Rundschüttler inkubiert.
Danach wurden 100-250 µl der Kultur mit einem sterilen Glasspatel auf eine LB-
Agarplatte mit Selektionsmedium ausplattiert, und die Platte über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die gewachsenen Klone waren antibiotikaresistent und konnten auf das rekombinante
Plasmid untersucht werden. Der LB-Agar wurde folgendermaßen hergestellt: 1% (w/v)
Bakto-Trypton, 0,5% (w/v) Bakto-Yeast-Extrakt, 1,2% (w/v) Agar und 1% (w/v) NaCl
wurden in 1000 ml dd H2O suspendiert und autoklaviert. Die Agarlösung wurde auf 50°C
abgekühlt, und dann Kanamycin (Endkonzentration 25 µg/ml) als Antibiotikum
hinzupipettiert. Je 20 ml Agarlösung wurden in eine 9 cm Petrischale gegossen und nach dem
Aushärten bis zu einem Monat bei 4°C gelagert.
Material und Methoden
23
3.3.6 Isolierung und Aufreinigung von Plasmid-DNA aus Bakterien (Mini-, Maxiprep)
Die auf den Agarplatten gewachsenen Klone wurden mit einer ausgeglühten Öse in 2 ml
kanamycinhaltiges (25 µg Kanamycin/ml) LB-Medium überführt und im Rundschüttler bei
37°C und 220 rpm über Nacht (ca. 16 h) inkubiert. 1 ml der Bakterienkulturen wurde zur
Isolation der Plasmid-DNA von der bakteriellen DNA mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit
(Qiagen) nach Herstellerangaben einer alkalischen SDS-Lyse unterzogen. Das erhaltene, reine
Plasmid der positiven Klone wurde in 75 µl dd H2O aufgenommen und für Transfektions-
oder Transformationszwecke bei –20°C gelagert. Die positiven Klone selbst wurden mit
Glycerol stabilisiert und bei –70°C gelagert. Es wurden dafür 150 µl Glycerol in einem
Eppendorfgefäß vorgelegt und 850 µl der Übernachtkultur hinzupipettiert und gut gevortext.
Maxipreps wurden zur Isolation größerer Mengen hochreinen Plasmids benötigt. Dazu
wurden 15 µl des bei RT aufgetauten stabilisierten Bakterienstocks in 250 ml LB-Medium mit
Kanamycin (25 µg/ml) im Rundschüttler bei 37°C und 220 rpm über Nacht vermehrt. Die
Isolation erfolgte nach dem gleichen Prinzip wie bei der Miniprep nur in anderem Maßstab
mit dem QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben.
3.3.7 Agarosegelelektrophorese
Zu analytischen und präparativen Zwecken wurden die DNA-Fragmente mittels horizontaler
Agarosegelelektrophorese aufgetrennt (Abb. 6A u. 6B). Die Konzentration des Agarosegels
ist dabei abhängig vom Molekulargewicht der aufzutrennenden DNA. Für DNA >1000 bp
wird in der Regel ein 1%iges Agarosegel verwendet, bei DNA < 1000 bp ein 3%iges
Agarosegel.
Abb. 6A Auftrennung der Plasmid-DNA isolierter Bakterienklone durch Gelelektrophorese. 10 Klone (Bahnen 3 – 12) aus der Transformation von E.coli JM109 mit dem ligierten pAdTrackCMVKir6.2 ∆C26 liefen gegen einen Längenstandard (kB-Leiter; Bahn 1) und den ursprünglichen Vektor pAdTrackCMV (Bahn 2) in einem 0,8 %-igen Agarosegel. Die aus den Klonen 1-9 isolierten Plasmide hatten eine geringere Wanderungs-geschwindigkeit als der ursprüngliche Vektor, was auf ein höheres Molekulargewicht schließen ließ und darauf, dass das Insert erfolgreich aufgenommen wurde. Klon 10 hatte eine höhere Wanderungsgeschwindigkeit, war daher negativ und wurde verworfen.
Material und Methoden
24
Die hier verwendete Agarosekonzentration betrug 0,8 %. Dazu wurde die Agarose unter
Aufkochen in der Mikrowelle in TBE-Puffer gelöst und mit 1 µl Ethidiumbromid zur
Fluoreszenzmarkierung der DNA-Banden versetzt. Anschließend wurde die Lösung auf den
im Gelgußdeck (Gibco Brl) fixierten Gelträger + Kamm (Gibco Brl) luftblasenfrei gegossen.
Nach dem Aushärten des Gels wurde der Gelträger in die Elektrophoresekammer (Horizon 58
Elektrophoresekammer, Gibco Brl) überführt und der Kamm entfernt. Die aufzutrennenden
DNA-Fragmente wurden mit 0,1 Vol. Orange G-Puffer gemischt und in die Geltaschen
gefüllt. In eine Geltasche wurde ein DNA-Längenstandard (kB-Leiter) zur Orientierung
pipettiert. Die Elektrophorese vollzog sich bei einer Spannung von 60-120 V. Die
Spannungsdifferenz ergab sich aus der verwendeten Agarose. Musste eine In-Gel-Ligation
durchgeführt werden, um z.B. einen Aufreinigungsschritt zu sparen, wurde eine low-melting-
Agarose verwendet, die sich bei Spannungen oberhalb von 60 V zersetzen würde. Mit einem
UV-Transilluminator (Vetter) wurden die DNA-Fragmente bei einer Wellenlänge von 254 nm
sichtbar gemacht und mit einer Digitalkamera (Kodak) dokumentiert. Für präparative Zwecke
wurden die Banden aus dem Gel geschnitten und aufgereinigt.
Abb. 6B Restriktionsschnittanalyse der Plasmid-DNA
isolierter Bakterienklone aus der Transformation von
E.coli JM109 mit dem ligierten pAdTrackCMVKir6.2
∆C26. Dafür wurde die Plasmid-DNA von den
Restriktionsenzymen EcoRV und XbaI geschnitten und in
einem Agarosegel gegen einen Längenstandard (kB-
Leiter; Bahn 1) laufen gelassen. Die Fragmente
entsprachen den Größen des Inserts (~ 1,4 kB) und des
linearisierten Plasmids (~ 9,2 kB). Abgebildet ist ein
Ausschnitt des Gels mit der kB-Leiter des
Längenstandards und 3 positiven Klonen.
3.3.8 Technik der transienten Transfektion
Neben den Möglichkeiten mittels divalenter Kationen oder Dextranen Zellen zu transfizieren,
gelingt dies auch mit Lipofectamine™, einem kationischen Liposomkomplex. Dazu wurden
am Vortag der Transfektion die zu transfizierenden HEK293-Zellen abtrypsiniert, ausgezählt
und in einer Zahl von 3x105 Zellen auf 35 mm Petrischälchen ausgesät. Die Schälchen
wurden im Brutschrank über Nacht kultiviert. Die transiente Transfektion wurde
folgendermaßen durchgeführt: 1 µg Plasmid (pAdTrack CMV Kir6.2∆C26) und 5 µl
Lipofectamine™ wurden in je 100 µl serumfreies DMEM pipettiert. Es musste serumfrei
Material und Methoden
25
gearbeitet werden, weil FCS die Transfektion behindern würde. Beide Ansätze wurden
vereint und 45 min bei Raumtemperatur stehengelassen. In diesem Zeitraum konnte sich der
DNA-Liposom-Komplex ausbilden. In der Zwischenzeit wurden die ausgesäten HEK293-
Zellen aus dem Brutschrank genommen und das Nährmedium abgesaugt. Anschließend
wurde der Zellrasen mit serumfreien DMEM gespült und 800 µl serumfreies DMEM
vorgelegt. Der Liposom-Plasmid-Ansatz wurde dazugegeben. Die Zellen wurden dann im
Brutschrank inkubiert. Nach 6 h wurde das Transfektionsmedium abgenommen, und die
Transfektion durch Zugabe von 2 ml FCS-haltigem DMEM abgestoppt. Die Zellen wurden
im Brutschrank weiter kultiviert. 18 bis 36 h später war eine Erfolgskontrolle unter
Fluoreszenzanregung (470 nm) möglich. Etwa 5-10 % der Zellen waren transfiziert (Abb. 7).
Die transfizierten Zellen konnten in den folgenden 48 h für Patch-Clamp Experimente genutzt
werden.
Abb. 7 Nachweis von erfolgreich transfizierten HEK293-Zellen durch GFP-Fluoreszenz. HEK293-Zellen wurden transient mit der cDNA der trunkierten porenbildenden Untereinheit des KATP-Kanals (Kir6.2∆C26) transfiziert (A). Die Zellen, die den Kanal exprimieren, sind nach Fluoreszenzanregung (470 nm) an der GFP-Fluoreszenz erkennbar (B).
3.3.9 Technik der stabilen Transfektion
Im Gegensatz zu der transienten Transfektion wird mit der stabilen Transfektion Fremd-DNA
dauerhaft in eine Zelle eingebracht. Nachteil des Verfahrens gegenüber der transienten
Transfektion ist allein der Zeitfaktor, da sich eine stabile Transfektion über Monate hinziehen
kann. Der Vorteil ist, dass alle Zellen die erwünschte genetische Information beinhalten. Als
Expressionsvektor diente das pcDNA3 Kir6.2∆C26 Plasmid, welches ein Resistenzgen für
das Aminoglykosid Geneticin (G418; Stammlösung: 500 mg/20 ml PBS) enthielt. 24 h vor
Material und Methoden
26
der Transfektion wurden 5x105 HEK293-Zellen pro 6 cm Petrischale abtrypsiniert, ausgezählt
und ausgesät. Die Zellen wurden über Nacht im Brutschrank kultiviert. Am folgenden Tag
wurden in zwei Ansätzen 7 µg pcDNA3 Kir6.2∆C26 und 15 µl Lipofectamine™ in
serumfreies DMEM-Medium pipettiert (Endvolumen: 600 µl). Beide Ansätze wurden vereint
und 45 min bei Raumtemperatur stehengelassen. In der Zwischenzeit wurden die vortags
ausgesäten HEK293-Zellen FCS-frei gewaschen und 2,4 ml serumfreies DMEM vorgelegt.
Das DNA-Lipofectamine-Gemisch wurde dazugegeben und durch vorsichtiges Schwenken
auf den Zellen gleichmäßig verteilt. Die Petrischalen wurden dann im Brutschrank inkubiert.
Nach 6 h Inkubation wurde das Tranfektionsmedium durch komplettes DMEM-Medium
ersetzt und so die Transfektion abgestoppt. Nach 48 h wurde bei jedem Mediumwechsel G418
(150 µl/5 ml Medium) hinzugefügt, so dass die Zellen unter Selektionsdruck weiterwuchsen.
Die resistenten Zellen wurden weiterkultiviert bzw. für eine spätere Verwendung eingefroren,
nicht-resistente Zellen starben ab.
3.4 Die Patch-Clamp Technik
3.4.1 Aufbau des Messstands
Zum Messstand gehörten:
1) EPC 9 Patch-Clamp-Verstärker (HEKA)
2) EPC 9 Vorverstärker mit Pipettenhalter
3) Patch-Clamp-Software (Pulse + Pulse Fit/ HEKA)
4) Hydraulischer Narishige-Mikromanipulator (XYZ-Kombination)
5) Axiovert 135 TV Mikroskop (hier: invers) mit 3 Objektiven und Objekttisch
6) Schwingungsgedämpfter Messtisch (Nanofilm Technologie GmbH)
7) Farrand Spektralfluorometer Mark 1 (Kontron Technik)
8) Pentium II Rechner
Mit der Patch-Clamp-Technik lassen sich sehr kleine elektrische Ströme (pA-Bereich)
messen. Diese Signale wurden häufig von elektrischem Hintergrundrauschen überlagert. Mit
Hilfe eines Faraday-Käfigs ließ sich das Rauschen im niederfrequenten Bereich (50
Hz/Netzbrummen) reduzieren. Ursache der elektromagnetischen Störfelder ist meist das
öffentliche Stromnetz, welches das Rauschen durch die metallischen Komponenten und
stromführenden Kabel in den Messaufbau überträgt. Der Faraday-Käfig umhüllte die
Material und Methoden
27
Messanlage, und alle Teile des Käfigs waren elektrisch leitend miteinander verbunden. Die
Komponenten der Anlage wurden sternförmig geerdet.
Patch-Clamp-Messungen werden durch geringste Bewegungen zwischen Präparat und
Pipette gestört. Deswegen war es erforderlich, den Messplatz vor mechanischen
Schwingungen und Erschütterungen abzuschirmen. Hierzu wurde ein schwingungsgedämpfter
Tisch (Nanofilm Technologie GmbH) verwendet. Auf diesem Tisch befanden sich
Mikroskop, Zellbad und Mikromanipulator mit Pipettenhalter. Der schwingungsgedämpfte
Tisch wurde von einem weiteren Tisch mit einer entsprechenden Aussparung eingerahmt, so
dass sich eine kleine Arbeitsfläche ergab, die Erschütterungen (z.B. durch Abstützen des
Bedieners) nicht auf das Messsystem übertrug.
Das inverses Mikroskop (Zeiss-Axiovert 135TV) wurde benötigt, um die Patch-Pipette an die
zu messende Zelle heranzuführen. Bei dem inversen Mikroskop ist das Objektiv unterhalb des
Tischs angeordnet. Vorteilhaft war, dass somit oberhalb des Mikroskoptischs viel Platz für die
restlichen Komponenten (Messpipette, Badperfusion etc.) verblieb. Zum Fokussieren wurde
nicht der Mikroskoptisch bewegt, sondern das Objektiv.
3.4.2 Zellbad und Umströmungssystem
In diesem Messstand wurden die Testsubstanzen mit der Badlösung an die Zellen gebracht.
Die Konzentration der Testsubstanzen am Wirkort änderte sich also nur mit der
Geschwindigkeit, mit der sich die Lösung im ganzen Zellbad austauschte. Es handelte sich
somit um ein langsames Umströmungssystem. Mittels eines Pumpsystems (Rollenpumpe/
Desaga) und zweier 25 ml Spritzen, die sich am Messtisch fixieren ließen, wurden die
entsprechenden Badlösungen gleichmäßig dem Zellbad zugeführt. Die Badlösung wurde
gefiltert in Kunststoffschläuche gedrückt, die an einem Vierwegehahn (Stämpfli-Hahn)
zusammenliefen. Der Stämpfli-Hahn war der Glastropfkammer, welche am Mikroskoptisch
fixiert wurde, vorgeschaltet. Neben den zwei zuführenden Schläuchen und dem zum Zellbad
führenden Schlauch war ein weiterer, abführender Schlauch am Stämpfli-Hahn
angeschlossen, der es ermöglichte, vor der eigentlichen Messung die Schläuche luftblasenfrei
zu füllen, um einen schnellen Lösungswechsel zu garantieren.
Das Zellbad bestand aus einem 35 mm Petrischälchen, in dessen Mitte die zu
messenden Zellen angewachsen waren. In dieses Schälchen wurde ein runder Plexiglasblock
gesetzt, der konisch ausgebohrt war, daß sich eine zentrale Öffnung ergab. In dieser Öffnung
befanden sich die angewachsenen Zellen. Weiterhin waren in den Flanken des
Plexiglasblocks drei Aussparungen für den Badzulauf, die Referenzelektrode und für die
Material und Methoden
28
Absaugung gefräst. Da die Aussparung für die Absaugung weniger tief als der Zulauf
eingefräst war, ergab sich dadurch die Pegelhöhe der Badflüssigkeit.
3.4.3 Herstellung der Patch-Pipetten
Die Pipetten wurden aus mittelhartem Borosilikatglas hergestellt. Borosilikatglas wird wegen
seiner vorteilhaften elektrischen Eigenschaften benutzt. So ist das Rauschen geringer als bei
weichen Glastypen. Die Kapillaren wurden aus Glasmeterware auf eine Länge von 7,5 cm
zugeschnitten. Die scharfkantigen Enden der Glaskapillaren wurden dann mit Hilfe eines
Bunsenbrenners abgerundet, um später beim Einspannen der Pipette in den Pipettenhalter die
Silberchloridschicht der Elektrodendrähte so wenig wie möglich anzukratzen. Die
Glasrohlinge sollten staub- und fettfrei sein. Aus den so vorbereiteten Glaskapillaren wurden
dann mit Hilfe des vertikalen Pipettenziehgerätes (L/M-3P-A; List Electronics) in einem
zweiphasigen Ziehvorgang die Patch-Pipetten hergestellt. Die 7,5 cm lange Glaskapillare
wurde so eingespannt, dass ihre Mitte von einem zirkulären, aus Nickel-Chrom-Draht
bestehenden Heizfilament umgeben war. Dann wurde durch eine Unterlegscheibe die Länge
des ersten Zuges auf 9 cm eingestellt. Die Heizstromintensität für den ersten Ziehvorgang
wurde mit dem Potentiometer A eingestellt. Das Heizfilament erwärmte sich und konnte
somit die Glaskapillare in der Mitte erweichen. Die Glaskapillare wurde durch die
Schwerkraft nach unten gezogen, bis sie durch die Unterlegscheibe gestoppt wurde. Nach
diesem Vorgang, bei dem sich die Mitte der Glaskapillare verjüngt hatte, musste die Kapillare
nach Abkühlen erneut so zentriert werden, dass ihre verengte Mitte von dem Heizfilament
umgeben war. Bei dem nun folgenden zweiten Ziehvorgang wurde durch die Unterlegscheibe
eine Ziehlänge von 12,8 cm bestimmt und die Glaskapillare in dieser Position an der oberen
Halterung fixiert. Die Unterlegscheibe wurde anschließend von der Kapillare entfernt. Nun
wurde der zweite Ziehvorgang wie oben beschrieben über das Potentiometer B mit
niedrigerem Heizstrom durchgeführt bis es zum Abreißen an der kapillär verengten Stelle
kam. Das Ergebnis waren zwei einzelne Pipetten identischen Typs. Der Strom betrug im
ersten Ziehvorgang 22 A und beim zweiten Ziehvorgang 14-15 A. Der zweite Ziehvorgang
war für den Durchmesser der Pipettenspitze ausschlaggebend. Der Strom des zweiten
Ziehvorgangs musste so eingestellt werden, dass die Pipettenspitzen einen Durchmesser von
1-2 µm hatten. Der Widerstand, der mit der Pipettenlösung gefüllten Pipetten, lag dann
zwischen 3 und 8 Megaohm.
Um die Pipetten-Bad-Kapazität und damit störendes Rauschen bei
Einzelkanalmessungen zu reduzieren, wurden die Pipetten mit einem Silikongel ummantelt.
Material und Methoden
29
Das Silikongel setze sich aus zwei Komponenten zusammen: Sylgard 184 Silicone Elastomer
und Sylgard 184 Curning Agent. Nach Vermischen dieser beiden Komponenten im Verhältnis
10:1 wurde das Silikongel auf kleine Plastikgefäße verteilt und mit entsprechenden Deckeln
verschlossen. In einer Kühltruhe konnte das Silikongel bei -40°C über mehrere Monate
gelagert werden. Durch das Ummanteln mit dem Silikongel wurde die Wandstärke der
Pipettenspitze vergrößert und somit die Kapazität gesenkt. Außerdem wurde durch die
hydrophobe Beschichtung verhindert, dass sich ein langer Wasserfilm am Schaft der Pipette
hochzog, welcher ebenso das kapazitive Rauschen erhöhen würde. Dazu wurde jede einzelne
Pipette an ihrem Schaft in der Haltevorrichtung des Pipetten-Coating/Polishing-Gerätes auf
dem inversen Labormikroskop (10-fache Vergrößerung, Fa. Nikon) gespannt. Nun wurde mit
einem dünnen Metallhäkchen die Pipettenspitze mit dem Silikongel ummantelt. Die ersten
200 µm der Spitze sollten frei bleiben, weil einige niedermolekulare Komponenten im
Silikongel mit dem Füllen der Pipette und auch mit der Herstellung des Gigaohmseals
interferieren könnten (AUERBACH und SACHS, 1985). Nach dem Umhüllen wurde das
Silikongel getrocknet, indem über die Spitze der Glaskapillare das Heizfilament des Gerätes
aus Platin-Iridium-Draht geschoben wurde. Das Heizfilament war über einen Schlauch mit
einem Druckluftanschluss verbunden, so dass bei Betätigung des Fußpedals und der zuvor
gewählten Funktion „Coating“ heiße Luft auf die Pipette gelenkt wurde. Die Stromstärke
betrug etwa 1 A.
Um eine Verletzung der Zellmembran durch eine scharfe Abrisskante an der
Pipettenspitze zu verhindern, wurden die Pipettenspitzen hitzepoliert. Zudem wurden nach
Polieren höhere Abdichtwiderstände erreicht. Nach dem Beschichten der Pipette mit
Silikongel ist das Polieren unumgänglich. Dazu verblieb die Pipette in der Haltevorrichtung
des oben beschriebenen Gerätes. Durch Umschalten der Hebel auf „Polishing“ erwärmte sich
der Draht, in dessen unmittelbare Nähe die Pipettenspitze zuvor gebracht wurde und dort für
10-20 Sekunden belassen wurde. Der Draht wurde mit etwa 2 A gespeist. Die Pipetten sollten
innerhalb von 2-3 Stunden nach Herstellung benutzt werden.
Die Pipetten wurden je nach Messkonfiguration mit der erforderlichen Lösung (EZ
bzw. IZ) gefüllt. Um das Füllen möglichst luftblasenfrei zu gewährleisten, wurde die
Pipettenspitze in einen mit Pipettenlösung gefüllten Behälter gehalten, so dass sich die ersten
1-2 mm der vorderen Spitzenverengung über Kapillarkräfte füllten. Danach wurde die
restliche Lösung mittels einer 1 ml Spritze, plus Sterilfilter und eines schmalen
Kunststoffschlauchs in die Pipette gespritzt, bis diese etwa zu einem Drittel gefüllt war.
Etwaige Luftblasen konnten durch vorsichtiges Beklopfen der Pipette gelöst werden.
Material und Methoden
30
3.4.3.1 Stammlösungen der Testsubstanzen
-Alinidin (1 mM)
2,92 mg Alinidin wurden in 10 ml dd H2O gelöst und waren bei 4°C in einem
lichtgeschützten Gefäß über mehrere Tage haltbar.
-Chininstammlösung (10 mM)
5,33 mg Chinin wurden in 2 ml dd H2O gelöst und waren bei 4°C lichtgeschützt über
mehrere Tage haltbar.
-Clonidinstammlösung (1 mM)
2,66 mg Clonidin wurden in 10 ml dd H2O gelöst und waren bei 4°C in einem
lichtgeschützten Gefäß über mehrere Tage haltbar.
-Glibenclamidstammlösung (1 mM)
4,92 mg Glibenclamid wurden in 1ml 0,05 N NaOH gelöst, mit 9 ml dd H2O auf 10 ml
aufgefüllt und waren bei 4°C über mehrere Tage haltbar.
-Phentolaminstammlösung (10 mM)
18,9 mg Phentolamin wurden in 5 ml dd H2O gelöst. Die Lösung war bei -20°C über
mehrere Wochen haltbar.
-Tolbutamid (1 mM)
2,7 mg Tolbutamid wurden in 1 ml 0,05 N NaOH gelöst und mit 9 ml dd H2O aufgefüllt.
Die Lösung war bei -20°C über mehrere Wochen haltbar.
3.4.4 Lösungen für die Patch-Clamp-Versuche
Die Pipettenlösung enthielt: 140,0 mM KCl 1,0 mM MgCl2
2,0 mM CaCl2
10,0 mM EGTA 5,0 mM HEPES Die Lösung wurde mit 1 N KOH auf einen pH-Wert von 7,15 eingestellt.
Material und Methoden
31
3.4.4.1 Badlösungen:
Die Extrazellulärlösung (EZ) für den cell-attached Modus enthielt: 140,0 mM NaCl 5,6 mM KCl 2,6 mM CaCl2
1,2 mM MgCl2 10,0 mM HEPES
Die Lösung wurde mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Die Intrazellulärlösung (IZ) für den inside-out Modus enthielt: 140,0 mM KCl 1,0 mM MgCl2 2,0 mM CaCl2 10,0 mM EGTA 5,0 mM HEPES Die Lösung wurde mit 2 N KOH auf einen pH-Wert von 7,15 eingestellt.
3.4.5 Allgemeine Versuchsdurchführung in der Patch-Clamp-Technik
Aus dem Brutschrank wurden die 35 mm Kulturschälchen mit dem zu untersuchenden
Zellmaterial entnommen. Der Großteil des Zellkulturmediums wurde mit einer
Eppendorfpipette abpipettiert. Daran wurde der Plexiglasblock mit Aussparungen für Ab- und
Zulauf sowie die Agarbrücke (s. 3.4.2) in das Schälchen eingesetzt. Das Petrischälchen wurde
in die Einfassung auf dem Objekttisch gesetzt. Zulauf, Absaugung und Agarbrücke wurden in
ihre jeweiligen Aussparungen auf dem Mikroskoptisch positioniert und über Magnete fixiert.
Über den Zulauf wurde Extrazellulärlösung zugeführt und mit dem Anstellen der
Absaugvorrichtung ein gleichmäßiger Fluss der Badperfusion sichergestellt. Dann wurden die
Zellen mit dem 10-fach Objektiv scharf gestellt. Nun wurde die gefüllte Glaspipette über den
chlorierten Silberdraht des Pipettenhalters gezogen. Der Pipettenhalter musste immer trocken
sein. An die Pipette wurde ein Überdruck von 2-3 cm H2O an dem seitlichen Eingang des
Pipettenhalters angelegt, um mit dem gleichmäßigen Austritt von Pipettenlösung ein
Verstopfen der Spitze durch Schmutzpartikel aus der Badlösung zu verhindern. Der
Vorverstärker samt Pipette wurde um etwa 45° abgesenkt und mit dem Grobmanipulator
soweit herabgelassen, dass die Pipettenspitze in die Badlösung eintauchte. Am Monitor ließ
sich im Oszilloskopmodus des Pulseprogramms das Eintauchen an einem rechteckigen
Strompuls als Antwort auf den Testpuls (eine rechteckförmige Änderung des
Pipettenpotentials) erkennen.
Material und Methoden
32
Unter starker Vergrößerung (40-fach) wurde die Pipette an die zu messende Zelle mit dem
Mikromanipulator herangefahren.
Sollte eine GFP-markierte Zelle identifiziert werden, wurde über einen
Auflichtkondensor monochromatisches Licht (470 nm) vom Farrand Spektralfluorometer zum
Objektiv geleitet. Nach Identifikation einer fluoreszierenden Zelle (s. Abb. 7) konnte der
Strahlengang wieder geschlossen werden und in normaler Durchlichtbeleuchtung gearbeitet
werden.
Befand sich die Pipettenspitze in unmittelbarer Nähe der Zelle wurde der Überdruck
abgelassen. Nach Berühren der Zellmembran, erkennbar an der Abnahme der Stromantwort
auf den Testpuls, wurde ein Sog an der Pipettenspitze angelegt. Nun sollte der Widerstand,
ablesbar vom Monitorfenster des Pulse Programms, rasch vom Megaohmbereich in den
Gigaohmbereich ansteigen. Dann wurde der Sog wieder weggenommen. Die nachfolgenden
Schritte wurden je nach gewünschter Messkonfiguration über die HEKA-Software am
Computer gesteuert. Sämtliche Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
3.4.6 Cell-attached Konfiguration
Sollten Einzelkanalmessungen durchgeführt werden oder war die Intaktheit der Zellen von
Bedeutung, so wurde die cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik verwendet
(HAMILL et al., 1981). Alle cell-attached Versuche wurden bei einem Pipettenpotential von
0 mV durchgeführt.
3.4.7 Inside-out Konfiguration
Für die Herstellung der inside-out Konfiguration wurde nach der Erlangung der cell-attached
Konfiguration die Pipette langsam von der Zelle zurückgezogen. Dadurch wurde ein
Membranstück aus der Zelle gelöst, so dass die cytosolische Seite der Plasmamembran direkt
der Badlösung zugewandt war. Wenn sich der Seal nicht deutlich veränderte, erhielt man so
die inside-out Konfiguration. Kam es beim Abziehen des Membranstücks an der
Pipettenspitze zu einer Vesikelbildung, musste die Pipette kurz aus dem Bad herausgezogen
werden. Durch den Luftkontakt entstand dann häufig die gewünschte inside-out
Konfiguration. Alle inside-out Versuche wurden bei einem Pipettenpotential von +50 mV
durchgeführt.
Material und Methoden
33
3.4.8 Whole-Cell Konfiguration
Nach Erstellung der cell-attached Konfiguration ließ sich durch Sog an der Pipette das
Membranstück unter der Pipettenmündung perforieren, so dass ein offener Zugang zum
Cytoplasma resultierte. Diese Konfiguration wurde verwendet, um unter Current-Clamp-
Bedingungen (hier wurde nicht die Spannung, sondern der Strom konstant gehalten) das
Membranpotential der Zelle zu messen.
3.4.9 Auswertung und Statistik
3.4.9.1 Einzelkanalmessungen
Die KATP-Kanalaktivität wurde mit der Halbamplituden-Schwellenwerttechnik
(COLQUHOUN und SIGWORTH, 1983) unter Verwendung des Analysenprogramms TAC
V3.0 + TAC Fit (Bruxton Corporation, Seattle, WA, USA) ausgewertet. Die Kanalaktivität I
wurde als das Produkt aus der Zahl der im Beobachtungszeitraum aktiven Kanäle (N) und der
Offenwahrscheinlichkeit (I) definiert und errechnet, indem die Gesamtoffenzeit aller Kanäle
durch die Beobachtungszeit dividiert wurden. Die Kanalaktivität wurde jeweils vor, während
und nach der Gegenwart jeder Testsubstanz bestimmt. Die Einzelkanalaktivitäten konnten in
Amplituden- und Dauer-Histogrammen dargestellt werden. Eine Kurvenanpassung an die
Dauer-Histogramme ergab die Werte für die mittlere Kanaloffenzeit.
Die konzentrationsabhängige Hemmung der Kanalaktivität jeder Testsubstanz wurde an
folgende Gleichung angepasst:
I/IC = 1 – [A] nH
/ ([A]nH
+ IC50nH
)
I ist der Strom entsprechend der Kanalaktivität bei der gegebenen Testsubstanzkonzentration,
IC die Offenwahrscheinlichkeit der Kontrolle, A die Konzentration der Testsubstanz, IC50 die
halbmaximal inhibitorisch wirksame Konzentration der Testsubstanz und nH der pseudo-
Hillkoeffizient.
Die Ergebnisse wurden angegeben als arithmetische Mittelwerte ± SEM für N unabhängige
Experimente. Zur Signifikanzberechnung wurden Vergleiche mit Hilfe des t-Tests und des
zweiseitigen U-Tests von Mann-Whitney und von Wilcoxon vorgenommen. Eine
Irrtumswahrscheinlichkeit von weniger als 5 % bei zweiseitiger Hypothese wurde als
signifikant gewertet.
Material und Methoden
34
3.4.9.2 Inside-out Messungen
Durch ATP-Applikation wurde die Grundlinie für den geschlossenen Zustand festgelegt.
Diese diente als Referenz für den Versuch. Gemessen wurde im Anschluss die in einer
definierten Zeitspanne aufgetretene durchschnittliche Stromstärke, provoziert durch die
„intrazelluläre Lösung“ bzw. der jeweiligen Testsubstanz, und diese auf die zuvor durch ATP
festgelegte Grundlinie bezogen. Die Kanalaktivität wurde in Gegenwart von ATP auf 0 % und
in Gegenwart von „intrazellulärer Lösung“ auf 100 % normalisiert.
100%(ATP) I-)(Kontrolle I
(ATP) Ianz)(Testsubst IitätKanalaktiv Relative ⋅
−=
3.4.9.3 Messung des Membranpotentials
Um das Membranpotential der Zellen zu messen wurde der Modusschalter des EPC-7 auf
Current-Clamp-(CC)-Bedingungen umgestellt. Hierbei wurde der Strom konstant gehalten.
Durch Umschaltung auf CC-Bedingungen werden im EPC-7 die RS-Kompensation und die
Abgleichungen durch Cfast und Cslow außer Kraft gesetzt (SIGWORTH in EPC-7 USER`S
MANUAL, S.49).
Zur Auswertung der Gesamtströme und des Membranpotentials wurde das Programm
Clampfit verwendet.
Zur Auswertung der Gesamtströme wurden Versuchsabschnitte von 12,8 Sekunden auf der
Festplatte gespeichert. Diese Versuchsabschnitte umfassen 5 runs von jeweils 2,56 Sekunden
Länge. Bei einem Haltepotential von -70 mV, welches nahe dem Ruhemembranpotential
liegt, sollte der Stromfluss nahe Null sein. Die Haltepotentiale betrugen entsprechend dem
oben dargestellten Stimulationsprotokoll abwechselnd -60 mV und -80 mV. Zur Auswertung
wurde die Differenz des Stromflusses bei -60 mV und -80 mV herangezogen. Nachdem alle 5
runs durch das Programm Clampfit eingelesen wurden, wurde die Trace-Average gebildet und
die Strommaxima bei -60 mV und die Stromminima bei -80 mV bestimmt. Als
Gesamtstromfluss wurde die Differenz (IDiff) zwischen den Werten festgelegt.
Um die unterschiedlichen elektrischen Aktivitäten der Zellen auszugleichen wurden die
Differenzen der Ströme in extrazellulärer Lösung gleich 100 % gesetzt. Die Werte in
Gegenwart der Testsubstanzen wurden auf diesen Wert nach folgender Formel normalisiert:
IDiff% = IDiffSubst / IDiffEZ * 100
Material und Methoden
35
3.5 Mikrofluorimetrische Messung der cytosolischen Ca2+
-Konzentration
3.5.1 Eigenschaften und Anwendung von fluoreszierenden Ca2+
-Indikatoren
Die intrazelluläre Ca2+-Ionenkonzentration wird gegenwärtig zumeist mit dem
Fluoreszenzindikator Fura-2 gemessen, der, wie eine Reihe anderer ionensensitiver
Fluoreszenzfarbstoffe auch, von der Gruppe um Roger Tsien synthetisiert wurde (SIMPSON,
1999). Fura-2 bindet mit einer funktionellen Gruppe, die dem Ca2+-Chelator BAPTA
entspricht, freies Ca2+, wodurch sich die Fluoreszenzeigenschaften des Moleküls ändern.
Hierbei ist die Eigenschaft, die den Gebrauch von Fura-2 populär gemacht hat, dass die
Fluoreszenzintensität bei einer bestimmten Anregungswellenlänge mit dem Ausmaß der Ca2+-
Bindung zunimmt, bei einer längerwelligen Fluoreszenzanregung jedoch mit dem Ausmaß
der Ca2+-Bindung abnimmt. Das Anregungsspektrum von Fura-2 bei verschiedenen Ca2+-
Konzentrationen ergibt auf diese Weise eine Kurvenschar, die bei ca. 340 nm den größten
Abstand zwischen hohen und niedrigen Ca2+-Konzentrationen aufweist, bei ca. 360 nm sich in
einem Punkt trifft und bei ca. 380 nm ein weiteres Maximum des Abstands zwischen hoher
und niedriger Ca2+-Konzentration aufweist, wobei hier jedoch die höhere
Fluoreszenzintensität in Gegenwart niedriger Ca2+-Konzentration vorliegt (GRYNKIEWICZ
et al., 1985).
Wird nun die Fura-2 Fluoreszenz abwechselnd bei 340 und bei 380 nm angeregt, so ergeben
sich zwei gegenläufige Fluoreszenzsignale, deren Intensität neben der Ca2+-Konzentration
auch Ausdruck der Indikatorkonzentration ist. Wird die bei 340 nm erzeugte Fluoreszenz
durch die bei 380 nm erzeugte geteilt, so ist die nun erhaltene Größe, die Fluoreszenzratio,
von der Indikatorkonzentration unabhängig (zur genauen Herleitung s. GRYNKIEWICZ et
al., 1985). Dies ist der wesentliche Vorteil der Messung mit Indikatoren mit zweifacher
Fluoreszenzanregung verglichen mit solchen mit einfacher Fluoreszenzanregung. Weiterhin
muss für eine Kalibrierung von Indikatoren mit einfacher Anregung die Zelle lysiert werden,
während mit Indikatoren mit zweifacher Anregung eine in-situ Kalibrierung möglich ist
(MORGAN und THOMAS, 1999). Nachdem sich jedoch herausgestellt hat, dass die mit
Fura-2 gemessene intrazelluläre Ca2+-Konzentration keine einheitliche Größe ist, sondern
dass Mikrokompartimente exstieren, in denen unter Stimulationsbedingungen andere Ca2+-
Konzentrationen vorliegen als in dem allgemeinen Cytosol (SIMPSON, 1999), wird auf eine
in-situ Kalibrierung zumeist verzichtet und nur die Fura-2 Fluoreszenzratio angegeben. Auch
in der vorliegenden Arbeit wurde die Änderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration nur als
Änderung der Fura-2 Fluoreszenzratio beschrieben.
Material und Methoden
36
Voraussetzung für die breite Anwendung von fluoreszierenden Ionenindikatoren war die
leichte Einbringung in die Zelle. Die das Ca2+-Ion komplexierenden Carboxylgruppen
verhindern eine wesentliche Membranpassage der Ca2+-Indikatoren. Werden die
Carboxylgruppen jedoch mit Acetoxymethylgruppen verestert (sog. AM-Ester), so ist der
Indikator lipophil genug, um die Zellmembran passieren zu können. Im Cytosol werden die
Esterbindungen durch unspezifische Esterasen gespalten und der nunmehr wieder polare
Farbstoff kann nicht mehr aus der Zelle heraus diffundieren. Dieser „dye-trapping“ genannte
Mechanismus hat die Messung von intrazellulären Ionenkonzentrationen verglichen mit der
Technik der Mikroinjektion fast trivial einfach gemacht (COBBOLD und RINK, 1987). Es
sind jedoch auch so noch eine Reihe von Problemen mit der Beladung möglich. Ist die Zeit
für die Farbstoffbeladung zu kurz, so ist die esteratische Spaltung unvollständig, und ein Teil
des Fluoreszenzsignals ist nicht Ca2+-sensitiv (SIMPSON, 1999). Ist die Beladungsdauer zu
lang oder werden im Bemühen um höhere Signalintensitäten hohe Konzentration des
Indikators zur Beladung verwendet, kann es vermehrt zur intrazellulären Sequestrierung
kommen, d.h. der Indikator wird in Organellen akkumuliert, deren Ca2+-Konzentrationen sich
nicht oder nur zeitversetzt mit der cytosolischen Ca2+-Konzentration ändert. Auch aus diesem
Mechanismus folgt eine Verminderung der dynamischen Breite des Indikatorsignals.
Aufgrund der bereits in vorangegangenen Versuchen gemachten Erfahrungen hatte sich für
die Beladung von isolierten Pankreasinselzellen eine Konzentration von Fura-2/AM von 2
µM, eine Dauer von 45 min und eine Beladungstemperatur von 37 °C als geeignet erwiesen.
3.5.2 Die Mikroskopfluorimetrie mit digitaler Bildverarbeitung
Obwohl die fluoreszierenden Ionenindikatoren auch verwendet werden können, um die
entsprechenden Konzentrationen in Zellsuspensionen zu messen, so ist doch die weite
Verbreitung dadurch begründet, dass es mit Hilfe der Mikrofluorimetrie möglich ist, an
Einzelzellen Messungen durchzuführen, die einen höheren Informationsgehalt haben, als
Messungen an Zellsuspensionen (COBBOLD und RINK, 1987). Für eine
mikrofluorimetrische Messung der Fura Fluoreszenz ist eine Lichtquelle erforderlich, die die
Anregungswellenlängen von 340 und 380 nm in annähernd gleicher Intensität liefert. Hierfür
eignet sich eine Xenon-Lichtbogenlampe. Die abwechselnde Exzitation der Fluoreszenz
wurde im für diese Versuche verwendeten Messstand dadurch erreicht, dass das Licht des
Xenonlichtbogens auf zwei Quarzlichtleiter projiziert wurde, deren Eingang durch
programmierbare Schnellverschlüsse (Uniblitz-Shutter) gesperrt war. Wurde einer der
Material und Methoden
37
Verschlüsse geöffnet, so fiel das Licht auf ein Beugungsgitter, das ein Spektrum auf den
Eingang eines weiteren Lichtleiters projizierte, dessen distales Ende in dem Lampenhaus des
Epifluoreszenzmikrokops (Leitz-Orthoplan) fixiert war. Durch unterschiedliche
Winkelstellung von Quarzlichtleitern und Beugungsgitter wurden die Ausschnitte aus den
Spektren verschoben, die sich auf den zum Mikroskop führenden Lichtleiter projizierten.
Somit konnten mit dieser Lichtquelle abwechselnd Licht aus zwei beliebigen, annähernd
monochromatischen Wellenlängen an das Mikroskop abgegeben werden.
Das von J. Ploem eingeführte Prinzip der Epifluoreszenz besagt, dass für die
Anregung der Fluoreszenz und die Sammlung des Fluoreszenzlichts ein und dasselbe optische
Element verwendet wird, nämlich das Mikroskopobjektiv (PLOEM, 1989). Im
Anregungsstrahlengang dient es als Kondensor, im Emissionsstrahlengang als Objektiv.
Ermöglicht wird dieser Strahlengang durch den dichromatischen oder auch Teilerspiegel. Ein
solcher Spiegel reflektiert Licht, das kurzwelliger ist als seine Teilerkante, und lässt das
längerwellige Licht passieren. In einem Winkel von 45° zum einfallenden Licht angebracht,
reflektiert ein solcher Teilerspiegel das Anregunglicht zum Objekt (=Kondensor) und lässt
das vom Objekt wieder gesammelte, längerwellige Fluoreszenzlicht zum Detektor (Multipler
oder CCD Kamera) passieren.
3.5.3 Versuchsdurchführung
Da es sich bei dem verwendeten Orthoplan Mikroskop um ein aufrechtes Mikroskop handelte,
so mussten die Umströmungskammer und die Zuleitungen ein geschlossenes System bilden.
Das Deckgläschen wurde auf die mit Medium gefüllte Umströmungskammer gelegt, so dass
die Seite mit den angewachsenen, Fura-beladenen Zellen nach unten zeigte. Durch das
Auflegen des Deckgläschens wurde die Umströmungskammer geschlossen. Mittels einer auf
der abfließenden Seite der Kammer befindlichen peristaltischen Pumpe wurde vorgewärmtes
Medium aus einen Vorratsgefäß in die Kammer gesogen. Der Wechsel des
Perifusionmediums geschah, indem die Pumpe angehalten und der zuführende Schlauch in
das nächste Vorratsgefäß eingehängt wurde. Da die 340/380 nm Bildpaare im Abstand von 1
Minute aufgenommen wurden, war diese Art des Mediumwechsels hinreichend schnell. Als
Objektiv wurde ein Zeiss Fluar mit 40-facher Vergrößerung benutzt, das auch bei 340 nm
noch eine relativ hohe Transmission aufweist. Üblicherweise waren pro Gesichtsfeld 5 bis 8
Einzelzellen oder kleinere Zellcluster zu erkennen. Mittels einer slow-scan CCD Kamera
Material und Methoden
38
wurden die Fluoreszenzbilder bei 340 und 380 nm Anregung aufgenommen und nach
Beendigung des Versuchs die Fluoreszenzratio des Bildes durch Pixel pro Pixel Division
berechnet. Die Zellen wurden im Ratiobild markiert und die Kinetik durch Auswertung aller
Ratiobilder eines Versuchs erstellt. Für den Mittelwert wurden alle auswertbaren Zellen aus
mindestens drei Versuchen verwendet.
Resultate
39
4 Resultate
4.1 Hemmung des nativen KATP -Kanals in insulinsezernierenden HIT-Zellen durch
Clonidin und Chinin
Mit der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik wurde der Einfluss von
Clonidin und Chinin auf die Kanalaktivität nativer KATP-Kanäle in intakten HIT-Zellen
bestimmt. Weil die Effekte Chinins vor allem bei höheren Konzentrationen nur schwer
reversibel waren, wurde die cell-attached Konfiguration gewählt, um den Einfluss eines
Kanal-„Run-Downs“ zu minimieren. Nach jedem Experiment wurden frische HIT-Zellen
verwendet.
Beide Substanzen hemmten konzentrationsabhängig die Kanalaktivität der nativen KATP-
Kanäle (Abb. 8). Beide Substanzen schlossen die Kanäle vollständig, Chinin hemmte die
Kanalaktivität potenter als Clonidin. Es ergaben sich IC50-Werte von 44,2 ± 14,6 µM für
Clonidin und 5,3 ± 1,2 µM für Chinin. Die korrespondierenden Hill-Koeffizienten waren 1,0
für Clonidin und 1,7 für Chinin. Die Werte wurden aus 5 bis 8 unabhängigen
Einzelexperimenten pro getesteter Konzentration bestimmt. Die Einzelkanalamplitude war in
allen Experimenten im getesteten Konzentrationsbereich nicht verändert.
Abb. 8 Konzentrationsabhängige Hemmung der KATP-Kanalaktivität in HIT-Zellen durch Clonidin und Chinin,
gemessen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Die Kanalaktivitäten in Gegenwart der Testsubstanz sind dargestellt in Prozent bezogen auf die durchschnittlichen Kanalaktivitäten der Kontrolle vor und nach der Zugabe der Testsubstanzen. Die IC50-Werte waren 44,2 ± 14,6 µM für Clonidin und 5,3 ± 1,2 µM für Chinin (n = 5-8 für jede Konzentration).
Resultate
40
4.2 Wirkung von Clonidin und Chinin auf die porenbildende Untereinheit des KATP-
Kanals
4.2.1 Charakterisierung der Eigenschaften des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-
Kanals in HEK293-Zellen
Für die weitere Charakterisierung der nichtadrenergen Bindungsstellen bzw. des möglichen
Angriffspunkt der Imidazoline sowie Chinin wurde die trunkierte porenbildende Untereinheit
des KATP-Kanals (Kir6.2∆C26) in HEK293-Zellen, die keine eigenen KATP-Kanäle aufweisen,
transient exprimiert (s. 3.3.8). Die typischen Eigenschaften der exprimierten Kir6.2∆C26-
Kanäle wurden mit der Patch-Clamp-Technik in der cell-attched Konfiguration geprüft.
Phentolamin und Clonidin hemmten in der eingesetzten Konzentration von 100 µM die
Kanalaktivität (Abb. 9). Zum Vergleich wurde der Sulfonylharnstoff Glibenclamid eingesetzt.
Glibenclamid wurde in einer Konzentration von 1 µM getestet, welches die maximal effektiv
blockierende Konzentration für native KATP-Kanäle darstellt (GRIBBLE et al., 1998). Hier
jedoch war Glibenclamid nicht in der Lage die Kir6.2∆C26-Kanalaktivität zu hemmen
(Abb.9). Es konnte also angenommen werden, daß die Kanalaktivität tatsächlich allein auf
Kir6.2∆C26 zurückzuführen war und nicht mit einer SUR-Untereinheit verbunden war.
Abb. 9 Originalregistrierungen der Hemmung von Kir6.2∆C26-Kanälen exprimiert in HEK293-Zellen. 100 µM Phentolamin (obere Bahn) und 100 µM Clonidin (mittlere Bahn), nicht jedoch 1 µM Glibenclamid (untere Bahn) hemmten die Kanalaktivität im cell-attached Modus der Patch-Clamp-Technik. Die Pfeile markieren Anfang und Ende der Testsubstanzzugabe. In dieser Registrierung sind die Einwärtsströme nach oben ausschlagend dargestellt.
100 µM Phentolamin
100 µM Clonidin
1 µM Glibenclamid
1 min 5 pA
Resultate
41
4.2.2 Vergleich der Kinetik des nativen KATP-Kanals in HIT-Zellen mit dem heterolog
exprimierten Kir6.2∆C26-Kanal in HEK293-Zellen
Der exprimierte Kanal wurde weiter charakterisiert durch die Messung der
Einzelkanalamplitude und der Kinetik des Kanalöffnens und –schließens. Mit durchschnittlich
5 pA war die Einzelkanalamplitude vom nativen KATP-Kanal und vom Kir6.2∆C26-Kanal
nicht unterschiedlich, jedoch war die durchschnittliche Offenzeit (mean open time) des
Kir6.2∆C26-Kanals deutlich kürzer (Abb. 10). Während die mittlere Kanaloffenzeit vom
nativen Kanal 1,54 ± 0,2 ms betrug, betrug die mittlere Kanaloffenzeit des Kir6.2∆C26
Kanals 0,81 ± 0,1 ms (p = 0,023; t-Test). Die mittlere Kanaloffenzeit des Kir6.2∆C26-Kanals
wurde durch die Gegenwart von Imidazolinen nicht beeinflusst, in Gegenwart von 100 µM
Alinidin betrug sie 0,75 ± 0,06 ms, nach Auswaschen von Alinidin 0,86 ± 0,06 ms.
Abb. 10 Vergleich der Orginalregistrierungen von Aktivitäten von nativen KATP-Kanälen und Kir6.2∆C26-
Kanälen im cell-attached Modus. Native KATP-Kanäle von HIT-Zellen sind in den Registrierungen a + b dargestellt, die in HEK293-Zellen heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanäle in den Registrierungen c + d. Die Badlösung enthielt Chinin während der Registrierungen b (3 µM) und d (10 µM), während die Registrierungen a und c einen repräsentativen Ausschnitt aus der Kontrolle zeigen.
Resultate
42
4.2.3 Hemmung des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanals in HEK293-Zellen
durch Clonidin und Chinin
Die Effektivität beider Substanzen, native KATP-Kanäle zu hemmen, konnte in den
vorangegangenen Experimenten gezeigt werden. Auch die Aktivität der transient exprimierten
Kir6.2∆C26-Kanäle in HEK293-Zellen wurde durch Clonidin und Chinin signifikant
gehemmt. Analog der cell-attached Experimente an nativen KATP-Kanälen wurde an
transfizierten HEK293-Zellen (s. 3.3.8) eine Konzentrationsreihe vermessen. Pro
Konzentration wurden 4 bis 6 unabhängige Einzelexperimente durchgeführt. Beide
Substanzen zeigten eine konzentrationsabhängige Hemmung der Kir6.2∆C26-Kanalaktivität
bis hin zu einem kompletten Block des Kanals bei 1 mM für Clonidin bzw. 300 µM für
Chinin (Abb. 11). Für Clonidin ergab sich ein IC50-Wert von 40,1 ± 13,7 µM mit einem Hill-
Koeffizienten von 0,7 und für die Chinin-induzierte Hemmung ein IC50-Wert von 14,6 ± 2,1
µM mit einem Hill-Koeffizienten von 1,4.
Der IC50-Wert für die Chinin-induzierte Hemmung des Kir6.2∆C26-Kanals war hier
signifikant (P = 0,0006, t-Test) größer als der IC50-Wert für die Hemmung von nativen
Kanälen durch Chinin.
Abb. 11 Konzentrationsabhängige Hemmung des Kir6.2∆C26 in intakten HEK293-Zellen durch Clonidin und
Chinin gemessen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Dargestellt sind die Kanalaktivitäten in Gegenwart der Testsubstanz in Prozent bezogen auf die durchschnittlichen Kanalaktivitäten in der Kontrolle vor und nach Zugabe der Testsubstanzen. Die IC50-Werte waren 40,1 ± 13,7 µM für Clonidin und 14,6 ± 2,1 µM für Chinin. (n = 4-6 für jede Konzentration).
Resultate
43
4.2.4 Hemmung des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanals in HEK293-Zellen
durch Alinidin
Als ein nahes strukturelles Derivat des Clonidins wurde Alinidin (Abb. 2) eingesetzt. Alinidin
hat im Vergleich mit Clonidin eine wesentlich geringere Affinität zu α2-Adrenozeptoren, ist
aber mindestens ebenso effektiv wie Clonidin, den KATP-Kanal zu schließen.
Mittels Patch-Clamp-Technik in der cell-attached Konfiguration wurde eine
Konzentrationsabhängigkeit auf die Kanalaktivität der trunkierten porenbildenen Untereinheit
untersucht. Es zeigte sich, dass Alinidin wesentlich potenter als Clonidin Kir6.2∆C26-Kanäle
hemmen konnte (Abb. 12). Der IC50-Wert für Alinidin betrug 0,38 ± 0,05 µM (Hill-
Koeffizient 0,9).
Abb. 12 Konzentrationsabhängige Hemmung des Kir6.2∆C26 in HEK293-Zellen durch Alinidin, gemessen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Dargestellt sind die Kanalaktivitäten in Gegenwart der Testsubstanz in Prozent bezogen auf die durchschnittlichen Kanalaktivitäten in der Kontrolle vor und nach Zugabe der Testsubstanzen. Der IC50-Wert betrug 0,38 ± 0,05 µM (n = 4-5 für jede Konzentration).
Resultate
44
4.3 Heterologe Expression von Kir6.2∆C26/SUR1 in HEK293-Zellen und Hemmung
durch Chinin
Um zu prüfen, ob die signifikant unterschiedlich erhaltenen IC50-Werte der Chinin-
induzierten Hemmung von nativen KATP-Kanälen und Kir6.2∆C26-Kanälen durch die
Anwesenheit des Sulfonylharnstoffrezeptors bedingt ist, wurden Kir6.2∆C26 und SUR1
zusammen in HEK293-Zellen exprimiert. Wie in 3.3.9 beschrieben wurde hier eine den
Kir6.2∆C26 stabil exprimierende Zelllinie mit SUR1 transient transfiziert. Die Expression
von SUR1 wurde durch eine GFP-Fluoreszenz nachgewiesen. Dieser Kanal hatte eine ähnlich
schnelle Kinetik von Öffnen und Schließen wie der allein exprimierte Kir6.2∆C26-Kanal: die
mittlere Kanaloffenzeit betrug 0,69 ± 0,06 ms. In Gegenwart von 30 µM Chinin betrug die
mittlere Kanaloffenzeit 0,66 ± 0,07 ms, nach Auswaschen betrug die mittlere Kanaloffenzeit
0,68 ± 0,06 ms (Abb. 13).
Abb. 13 Vergleich der Originalregistrierungen von heterolog exprimierten Kir6.2∆C26-Kanälen und von
koexprimierten Kir6.2∆C26/SUR1-Kanälen. Beide Kanäle wurden in HEK293-Zellen exprimiert Dargestellt sind repräsentative Ausschnitte aus cell-attached Registrierungen. Die Bahnen a + c sind jeweils die Kontrollbedingungen, während in den Registrierungen b + d jeweils das Ausmaß der Hemmung der Kanalaktivität durch die Anwesenheit von 10 µM Chinin gezeigt wird. Gegenüber Kir6.2∆C26 allein zeigte sich durch die Koexpression von Kir6.2∆C26 und SUR1 keine Veränderung der Kanaloffenzeit (s.a. Abb. 10).
a
b
c
d
200 ms
5 pA
Resultate
45
Die Wirkung von Chinin auf die Kanalaktivität wurde im Konzentrationsbereich von 0,1 bis
300 µM mit der cell-attached Konfiguration gemessen. Wie in den vorherigen Versuchen
wurde pro Versuch nur eine Konzentration getestet, anschließend wurden neue transfizierte
Zellen verwendet. Bei 300 µM hemmte Chinin die Kanalaktivität vollständig (Abb. 14). Es
ergab sich ein IC50-Wert von 29,6 ± 5,7 µM mit einem Hill-Koeffizienten von 1,45.
Abb. 14 Konzentrationsabhängige Hemmung des heterolog exprimierten Kir6.2∆C26/SUR1-Kanals in HEK293- Zellen durch Chinin, gemessen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Dargestellt sind die Kanalaktivitäten in Gegenwart der Testsubstanz in Prozent bezogen auf die durchschnittlichen Kanalaktivitäten in der Kontrolle vor und nach Zugabe der Testsubstanz. Der IC50-Wert betrug 29,9 µM.
Resultate
46
4.4 Antagonismus von MgGDP und Diazoxid auf die durch Phentolamin, Alinidin,
Tolbutamid und Chinin gehemmten KATP-Kanäle im inside-out Modus
Der Frage, wieweit eine durch Imidazoline bedingte Hemmung der Aktivität von KATP-
Kanälen durch Kanalöffner antagonisiert werden kann, wurde zunächst durch Messung der
Kanalaktivität in inside-out Patches aus normalen B-Zellen des Mauspankreas nachgegangen.
Da es zunächst um den prinzipiellen Nachweis einer Antagonisierbarkeit ging, wurde die
inside-out Konfiguration gewählt, um den Testsubstanzen einen möglichst direkten Zugang
zum Wirkort zu verschaffen. Die Konzentration der Testsubstanzen sollte hoch genug sein,
eine eindeutige Hemmung der Kanalaktivität zu bewirken, nicht aber eine komplette
Hemmung hervorzurufen. Angesichts des auch in dieser relativ niedrigen Konzentration
langsam einsetzenden Effekts von Chinin war eine Beeinflussung des Ergebnisses durch
einen „Run-down“ des Kanals nicht auszuschließen. Deshalb wurde zu Beginn und zum
Schluss des Versuchs die Kanalaktivität in Gegenwart von intrazellulärer Lösung gemessen
und die Werte gemittelt, ebenso wurde die Wirkung von MgGDP vor und nach der Wirkung
von MgGDP plus Diazoxid gemessen und die Werte gemittelt.
Abb.15 Antagonismus zwischen dem Imidazolin Alinidin und Kaliumkanalöffnern an nativen KATP-Kanälen von
normalen B-Zellen der Maus gemessen in der inside-out Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Die obere Registrierung zeigt die Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Alinidin (10 µM). Die untere Registrierung zeigt die öffnende Wirkung von MgGDP (500 µM) in Gegenwart von Alinidin (10 µM) sowie einen zusätzlichen öffnenden Effekt von Diazoxid (300 µM).
300 µM Diazoxid
10 µM Alinidin
300 µM Diazoxid
500 µM MgGDP
10 µM Alinidin
1 min
10 pA
Resultate
47
Die Effekte von Alinidin und von Chinin in der gewählten Konzentration von 10 µM waren
mit 48 bzw. 63 % Restaktivität etwas geringer als erwartet (Tab. 1), jedoch war für jede der
eingesetzten Testsubstanzen eine signifikant hemmende Wirkung festzustellen. Unerwartet
eindeutig war die öffnende Wirkung von 500 µM MgGDP bei allen Testsubstanzen. Die
durch die Imidazoline bzw. Tolbutamid oder Chinin verminderte Kanalaktivität wurde durch
MgGDP signifikant auf das drei- bis fünffache gesteigert (Tab. 1). Die zusätzliche
Anwesenheit von 300 µM Diazoxid hingegen führte nur in Gegenwart von Tolbutamid und
Alinidin zu einer signifikanten weiteren Steigerung der Kanalaktivität um ca. 40 bis 50 %
(Tab. 1).
Testsubstanz Testsubstanz
+ 500 µµµµM Mg GDP
Testsubstanz
+ 500 µµµµM Mg GDP
+ 300 µµµµM Diazoxid
Phentolamin 25.8 ± 3.8 628.3 ± 265.2 95.3 ± 16.1
Alinidin 47.8 ± 8.5 519.2 ± 161.7 141.3 ± 15.1
Tolbutamid 17.8 ± 2.6 548.9 ± 204.6 151.2 ± 28.4
Chinin 63.2 ± 13.8 302.8 ± 47.0 122.4 ± 18.0
Tab.1 Effekt von MgGDP und Diazoxid auf den Block von KATP-Kanälen durch Imidazoline, Tolbutamid und
Chinin in inside-out Patches von B-Zellen des Pankreas. Die Testsubstanzen wurden in einer Konzentration von 10 µM eingesetzt (Tolbutamid 50 µM). Die Effekte sind angegeben in Prozent der Kanaktivität unter der vorangegangenen Versuchsbedingung, d.h. die Wirkungen der Testsubstanzen sind bezogen auf die Kanalaktivität in Gegenwart von intrazellulärer Lösung und die Wirkung von 500 µM MgGDP ist bezogen auf die Kanalaktivität in Gegenwart der jeweiligen Testsubstanz (s. Originalregistrierungen Abb.15). Es handelt sich um Mittelwerte ± SEM von 6 unabhängigen Versuchen. Der schließende Effekt war für jede Testsubstanz signifikant, ebenso war die öffnende Wirkung von MgGDP bei jeder der Testsubstanzen signifikant (P < 0.05, Wilcoxon Test). Der Effekt der zusätzlichen Anwesenheit von 300 µM Diazoxid war nur bei Alinidin und Tolbutamid signifikant. (P < 0.05, Wilcoxon Test).
Resultate
48
4.5 Vergleich der repolarisierenden Wirkung von Diazoxid in Gegenwart von den
Imidazolinen Phentolamin, Alinidin und Idazoxan, sowie Tolbutamid und Chinin
Das Membranpotential wurde an Einzelzellen aus NMRI Mausinseln mit der konventionellen
whole-cell Konfiguration der Patch-Clamp-Technik unter current-clamp Bedingungen
gemessen. Das Ruhemembranpotential der Einzelzellen lag im Mittel bei –73,6 mV. Die
Imidazoline Alinidin, Idazoxan und Phentolamin, sowie der Sulfonyharnstoff Tolbutamid und
das Alkaloid Chinin führten alle zu einer starken Depolarisation der B-Zell Plasmamembran
(Abb. 16 A-E; Mittelwerte s. Abb. 17). Die Konzentration der Imidazoline und von Chinin im
Bad betrug 100 µM, die von Tolbutamid 500 µM.
Abb. 16A Repolarisierende Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Phentolamin (100 µM). An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen. Das repolarisierte Membranpotential betrug in dieser Registrierung nur –64,4 mV, war aber nicht signifikant verschieden vom Ruhemembranpotential. Bemerkenswert ist das plötzliche Aufhören der „spike“-artigen Depolarisationen, die wahrscheinlich durch die Aktivität von Ca2+-Kanälen bedingt ist.
Phentolamin führte zu einer trägen Depolarisation (Abb. 16A). Erst fünf Minuten nach der
Zugabe war das Maximum der Depolarisation der Zellmembran (-43,8 mV) erreicht. Der
Diazoxid-Antagonismus stellte sich zwei Minuten nach Einstrom von Diazoxid (300 µM) in
das Zellbad ein. Das repolarisierte Membranpotential betrug nur –64,4 mV, war aber nicht
signifikant verschieden vom Ruhemembranpotential. Auffallend war an der Diazoxid-
induzierten Repolarisierung das vollkommene Sistieren der Potentialspikes bereits bei noch
ausgeprägter Depolarisation.
Resultate
49
Abb. 16B Repolarisierende Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Alinidin (100 µM). An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen. Die Depolarisation nach Zugabe von Alinidin sowie die Repolarisation nach Zugabe von Diazoxid erfolgte mit einer raschen Kinetik.
Alinidin führte bereits eine Minute nach Zugabe zu einer Depolarisation auf -41,5 mV mit
ausgeprägten, „spike“-artigen Änderungen des Membranpotentials (Abb. 16B). Durch
Diazoxid (300 µM) erfolgte eine Repolarisation auf das Ruhemembranpotentialniveau (-75,1
mV), die eine Minute nach der Diazoxidzugabe einsetzte.
Idazoxan wies eine ähnlich schnelle Kinetik auf. Eine Minute nach der Zugabe von
Idazoxan wurde das Schwellenpotential überschritten und die Zellmembran depolarisierte
(Abb. 16C) genauso stark wie nach Phentolamin- oder Alinidin-Exposition (Abb. 17). Die
Anwesenheit von Diazoxid (300 µM) führte wiederum eine Minute nach Zugabe zu einer
plötzlichen, deutlichen Repolarisation, jedoch wurde im weiteren Verlauf dieses Versuchs die
Zellmembran nicht stärker als bis ca. -55 mV repolarisiert (Abb. 16C). Der Mittelwert des
repolarisierten Membranpotentials (-66,4 ± 7,8 mV) war jedoch nicht signifikant verschieden
vom Ruhemembranpotential (s. Abb. 17).
Tolbutamid führte prompt zu einer Depolarisation (Abb. 16D). Das Ausmaß der
Depolarisation entsprach den mit den Imidazolinen enthaltenen Werten (Abb. 17). Die
antagonistische Wirkung von Diazoxid setzte eine Minute nach dem Einstrom von Diazoxid
(300 µM) in das Bad ein. Obwohl die Wirkung von Diazoxid ebenso schnell einsetzte wie in
Gegenwart von Alinidin und Idazoxan, so verlief doch die Repolarisation zögerlicher. Die
Geschwindigkeit der Repolarisierung entsprach ungefähr derjenigen in Gegenwart von
Phentolamin. So betrug das Membranpotential nur –61,2 mV 180 s nach Zugabe von
Diazoxid, verstärkte sich jedoch noch auf –65,2 mV nach 360 s.
Resultate
50
Abb. 16C Repolarisierende Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Idazoxan (100 µM). An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen. Die De- und Repolarisation in Anwesenheit der Testsubstanzen erfolgte ebenso prompt wie bei der Gegenwart von Alinidin. In diesem Versuch wurde die Zellmembran nur bis ca. -55 mV repolarisiert. Im Mittel der Versuche war das durch Diazoxid repolarisierte Membranpotential (-66,4 ± 7,8 mV) jedoch nicht signifikant verschieden vom Ruhemembranpotential.
Abb. 16D Repolarisierende Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Tolbutamid (500 µM). An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen. Die Repolarisation in Gegenwart von Diazoxid setzte prompt ein, verlief jedoch zögerlicher als bei den Imidazolinen Alinidin und Idazoxan.
Resultate
51
Die Wirkung des Alkaloids Chinin setzte ähnlich träge ein wie die von Phentolamin. Zwei
Minuten nach der Chininzugabe wurde das Schwellenpotential erreicht, und „spike“-artige
Depolarisationen der Zellmembran wurde sichtbar (Abb. 16E). Die Gegenwart von Diazoxid
(300 µM) führte nach einer Minute zu einer Repolarisation. Das dauerhaft erreichte Potential
lag jedoch etwas oberhalb des Ruhemembranpotentials. Zum Zeitpunkt 180 s nach Zugabe
von Diazoxid war das Membranpotential (-61,9 mV) nicht signifikant verschieden vom
Ruhemembranpotential, jedoch zum Zeitpunkt 360 s (-57,5 mV). Auch das Auswaschen mit
extrazellulärer Lösung führte nicht zu einer vollständigen Repolarisation.
Abb. 16E Repolarisierende Wirkung von Diazoxid (300 µM) in Gegenwart von Chinin (100 µM). An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen. Die Gegenwart von Chinin führte zu einer trägen Depolarisation der Zellmembran. Die Repolarisation durch die Anwesenheit von Diazoxid setzte relativ schnell ein, es wurde jedoch nicht eine dauerhaft vollständige Repolarisation erreicht.
Zusammenfassend kam es durch alle Testsubstanzen zu einer praktisch gleich starken
Depolarisation der Zellmembran. Die zusätzliche Gegenwart von Diazoxid führte nicht nur
bei Tolbutamid, sondern auch bei den Imidazolinen Alinidin, Idazoxan und Phentolamin
sowie bei dem Alkaloid Chinin zu einer Repolarisation, die zumindest bei Chinin nicht
vollständig war.
Resultate
52
Abb. 17 Vergleich der repolarisierenden Wirkung von Diazoxid in Gegenwart von den Imidazolinen Alinidin, Idazoxan und Phentolamin, sowie Tolbutamid und Chinin. An Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurde mit der konventionellen whole-cell Technik das Membranpotential unter current-clamp Bedingungen gemessen, wie in Abb.16A-E dargestellt. Das Ruhemembranpotential lag im Mittel bei –73,6 mV (offene Säule). Die jeweils mittlere Säule zeigt den maximalen depolarisierenden Effekt der Testsubstanzen (Imidazoline, Chinin (100 µM); Tolbutamid (500 µM)). Die jeweils dritte Säule zeigt das Ausmaß der Repolarisierung 3 min nach Zugabe von Diazoxid (300 µM).
4.6 Antagonistische Wirkung von Diazoxid auf den Imidazolin-induzierten Anstieg
der cytosolischen Ca2+
-Konzentration
Der Antagonismus zwischen Diazoxid und den Imidazolinen sollte auch an intakten B-Zellen
(aus NMRI Mausinseln) nachgewiesen werden. Dieses erfolgte indirekt vermittels der
mikrofluorimetrischen Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration von Einzelzellen, die
mit dem Indikator Fura-2 beladen waren. Nach der Beladung wurden die an ein Deckgläschen
festgewachsenen Zellen mit Krebs-Ringer Medium (5 mM Glucose) umströmt. Nach 10 min
wurden jeweils die Imidazoline Phentolamin, Alinidin und Idazoxan sowie das Alkaloid
Chinin in einer Konzentration (100 µM) zugegeben, die als maximal wirksam für die
Insulinsekretion angesehen werden. Tolbutamid (500 µM) wurde, wie in den vorherigen
Versuchen, als Positivkontrolle eingesetzt, da hier ein Diazoxid-induzierter Abfall des durch
Tolbutamid erhöhten [Ca2+]i bekannt war. Sämtliche Imidazoline wie auch Tolbutamid und
Chinin führten zu einem deutlichen Anstieg der [Ca2+]i. Nach 20 min alleiniger Anwesenheit
der verschiedenen KATP-Kanal Blocker wurde Diazoxid (300 µM) hinzugegeben, um die
Reaktion der [Ca2+]i zu beobachten.
Resultate
53
Abb. 19A+B Antagonistische Wirkung von Diazoxid auf den Anstieg der cytosolischen Ca
2+-Konzentration von
B-Zellen des Pankreas durch die Imidazoline Phentolamin (A) und Alinidin (B). Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurden mit Fura 2/AM beladen und mit Krebs-Ringer Medium (5 mM Glucose) bei 37 °C umströmt. Nach 10 min wurde die Testsubstanz (jeweils 100 µM) zugegeben, nach weiteren 20 min zusätzlich Diazoxid (300 µM). Ein Abfall der cytosolischen Ca2+-Konzentration durch Diazoxid war bei Alinidin (B) festzustellen.
Nach Zugabe von Phentolamin (Abb. 19A) kam es zu einem trägen Anstieg der [Ca2+]i, der ab
Minute 13 einsetzte und sein Maximum bei Minute 23 erreichte. Anschließend kam es zu
einem leichten Abfall der [Ca2+]i. In Gegenwart von Diazoxid setzte sich der Rückgang träge
fort. Prästimulatorische Werte wurden jedoch auch bei Minute 50, d.h. nach 20 min
Anwesenheit von Diazoxid, nicht erreicht. Bei Betrachtung der Kontrolle (Krebs-Ringer mit
der jeweiligen Testsubstanz, jedoch ohne Diazoxid) zeigte sich kein signifikanter Unterschied
zwischen dem Ausmaß des Rückgangs der [Ca2+]i, so dass ein Antagonismus zwischen
Phentolamin und Diazoxid nicht nachweisbar war.
Resultate
54
Alinidin (Abb. 19B) führte zu einem raschen Anstieg der [Ca2+]i. Schon bei Minute 12 stiegen
die Werte stark an und erreichten um die Minute 16 ihr Maximum. Dann fielen die Werte
leicht ab und erreichten eine Plateauphase. Nach Zugabe von Diazoxid sank die [Ca2+]i
abrupt. Der Abfall bis auf die prästimulatorischen Werte erfolgte ab Minute 31, jedoch kam es
ab Minute 41 zu einem erneuten, leichten Anstieg der [Ca2+]i, der in ein Plateau überging,
dessen Werte etwas oberhalb der prästimulatorischen lagen.
Mit Idazoxan wurde ein weiteres schnell wirksames Imidazolin getestet. Die
Anwesenheit von Idazoxan (Abb. 19C) führte zu einem raschen, wenn auch nur mäßig stark
ausgeprägten Anstieg der [Ca2+]i. Ab Minute 12 stiegen die Werte und erreichten ab Minute
14 eine Plateauphase. Die zusätzliche Gegenwart von Diazoxid bewirkte eine schnelle
Umkehr des Anstiegs. Die [Ca2+]i fiel zwischen Minute 31 bis 32 deutlich und ab Minute 32
schwächer bis auf die prästimulatorischen Werte ab, welche ab Minute 40 erreicht wurden.
Die Kurve der Kontrolle verlief unterhalb der Testkurve, was darauf zurückzuführen war,
dass mit Idazoxan nur eine geringe Anzahl von Versuchen gemacht werden konnte, da die
Substanz knapp war, und sie zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung nicht zu beschaffen
war. Dennoch kann von einem effektiven Diazoxid-Antagonismus ausgegangen werden.
Der Effekt von Tolbutamid auf die [Ca2+]i war wie erwartet durch Diazoxid zu
antagonisieren. Der Anstieg der [Ca2+]i erfolgte prompt nach Zugabe von Tolbutamid ab
Minute 12. Das Maximum wurde bei Minute 13 erreicht und war die stärkste Erhöhung der
[Ca2+]i, die durch eine der Testsubstanzen bewirkt wurde. Die Werte gingen dann etwas
zurück und verliefen auf einem Plateau. Die Gegenwart von Diazoxid bewirkte einen starken
Abfall der [Ca2+]i, der bei Minute 31 einsetzte. Bei Minute 33 wurden die prästimulatorischen
Werte erreicht, jedoch setzte sich der Abfall weiter fort. Ab Minute 39 wurde wieder eine
Plateauphase erreicht, die leicht unterhalb der prästimulatorischen Werte verlief.
.
Resultate
55
Abb. 19C+D Antagonistische Wirkung von Diazoxid auf den Anstieg der cytosolischen Ca
2+-Konzentration von
B-Zellen des Pankreas durch das Imidazolin Idazoxan (C), sowie durch Tolbutamid (D). Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurden mit Fura 2/AM beladen und mit Krebs-Ringer Medium (5 mM Glucose) bei 37 °C umströmt. Nach 10 min wurde die Testsubstanz (100 µM) bzw. Tolbutamid (500 µM) zugegeben, nach weiteren 20 min zusätzlich Diazoxid (300 µM). Ein Abfall der cytosolischen Ca2+-Konzentration durch Diazoxid war bei Idazoxan (C) und Tolbutamid (D) festzustellen.
Die Zugabe von Chinin (Abb. 19E) führte ebenfalls zu einem Anstieg der [Ca2+]i. Der Anstieg
erfolgte später als bei den vorherigen Versuchen mit Alinidin und Idazoxan. Ab Minute 14
stiegen die Werte deutlich. Um die Minute 17 war der Anstieg maximal. Ab Minute 20 ging
der Anstieg etwas zurück und verharrte auf einer Plateauphase. Auch die Anwesenheit von
Resultate
56
Diazoxid erbrachte keine Reversibilität des Anstiegs. Die Werte verblieben auf einem Plateau,
welches merklich oberhalb der prästimulatorischen Werte verlief. Die Testkurve war so
aussagekräftig, dass hier auf eine Kontrolle verzichtet wurde.
Abb. 19E Antagonistische Wirkung von Diazoxid auf den Anstieg der cytosolischen Ca2+
-Konzentration von B-
Zellen des Pankreas durch Chinin (E). Einzelzellen aus NMRI Mausinseln wurden mit Fura 2/AM beladen und mit Krebs-Ringer Medium (5 mM Glucose) bei 37 °C umströmt. Nach 10 min wurde die Testsubstanz (100 µM) zugegeben, nach weiteren 20 min zusätzlich Diazoxid (300 µM).
Zusammenfassend ließ sich feststellen, dass durch zusätzliche Anwesenheit von 300 µM
Diazoxid nicht nur der Tolbutamid-induzierte Anstieg der [Ca2+]i wieder rückgängig gemacht
wurde, sondern auch der durch die Imidazoline Alinidin und Idazoxan induzierte Anstieg
wurde vollständig antagonisiert. Dagegen wurde der durch Phentolamin und Chinin bewirkte
Anstieg der [Ca2+]i nicht durch Diazoxid beeinflusst.
Resultate
57
4.7 Wirkung des Stoffwechselinhibitors Natriumcyanid auf den Alinidin-induzierten
und den Tolbutamid-induzierten KATP-Kanalblock
Um den Einfluss des Energiestoffwechsels der B-Zelle auf die Effektivität der KATP-
Kanalblockade durch Alinidin und Tolbutamid zu prüfen wurde die Kanalaktivität an intakten
B-Zellen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik gemessen.
100 µM Alinidin führten zu einer praktisch vollständigen Hemmung (Abb. 18; Abb. 18B).
Die Kanalaktivität war auf 2,0 ± 0,7 % gehemmt. 500 µM Tolbutamid bewirkten ebenfalls
eine komplette Hemmung. Die zusätzliche Gegenwart von 200 µM des Stoffwechselinhibitors
Natriumcyanid bewirkte beim Alinidin-induzierten Block eine nicht sigifikante Steigerung
der KATP-Kanalaktivität (Abb. 18; Abb. 18C) auf 5,4 ± 2,3 % des Kontrollwerts (p = 0,255; t-
Test; n = 5); beim Tolbutamid-induzierten Kanalblock jedoch eine Steigerung auf 51,4 ± 27,3
%, die signifikant war (p = 0,03; Mann-Whitney U-test; n = 5).
Abb.18 Wirkung des Stoffwechselinhibitors Natriumcyanid auf den Block von KATP-Kanälen durch das
Imidazolin Alinidin in intakten B-Zellen der Maus. Der Überblick gibt das Versuchsprotokoll anhand von repräsentativen Ausschnitten der Registrierung wieder. Die Pfeile signalisieren Start- bzw. Endpunkte der Zugabe der Testsubstanzen. Für die Zeiträume A-E wird in den Abb. 18A-E entsprechend je ein Ausschnitt mit expandierter und stark expandierter Zeitskala dargestellt.
Resultate
58
Abb. 18 (Fortsetzung 1) Wirkung des Stoffwechselinhibitors Natriumcyanid auf den Block von KATP-Kanälen
durch das Imidazolin Alinidin in intakten B-Zellen der Maus. Nach Zugabe von 100 µM Alinidin kam es zu einer hochgradigen Hemmung der Kanalaktivität (B) verglichen mit der Kontrolle, d.h. Extrazellulärlösung ohne Glucose (A). Wurden zusätzlich 200 µM NaCN gegeben, führte das zu einer geringfügigen Steigerung der Kanalaktivität, insgesamt blieb die Kanalaktivität weiter stark vermindert (C).
Resultate
59
Abb. 18 (Fortsetzung 2) Wirkung des Stoffwechselinhibitors Natriumcyanid auf den Block von KATP-Kanälen
durch das Imidazolin Alinidin in intakten B-Zellen der Maus. Enthielt das Badmedium nur noch NaCN (D), so entsprach die Kanalaktivität im Mittel wieder den Kontrollwerten (A u. E).
Nach Auswaschen von Alinidin führte die alleinige Anwesenheit von 200 µM Natriumcyanid
im Badmedium zu einem deutlichen Anstieg der Kanalaktivität (Abb. 18; Abb. 18D). Die
Kanalaktivität stieg bei der Alinidin-induzierten Hemmung von 5,4 ± 2,3 % auf 107,6 ± 35,5
% bezogen auf den Kontrollwert (EZ ohne Glucose; Abb.18, Abb. 18A. Diese Erhöhung der
Kanalaktivität war signifikant (p = 0,032, t-Test). Beim Tolbutamid-induzierten Block führte
die alleinige Anwesenheit von Natriumcyanid zu einer Steigerung der Kanalaktivität von 51,0
± 37,3 % auf 538,3 ± 139,0 %. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte ± SEM von jeweils n
= 6 (Alinidin) bzw. n = 4 (Tolbutamid) Experimenten.
Diskussion
60
5 Diskussion
Die Fähigkeit von Imidazolingruppen-haltigen Pharmaka, die Insulinsekretion zu steigern, ist
deshalb interessant, weil sie sich von der Wirkung der Sulfonylharnstoffe durch eine stärkere
Glucoseabhängigkeit unterscheidet. Wieweit dieses Charakteristikum durch eine
Beeinflussung des „triggering pathways“ oder des „amplifying pathways“ (nach der
Definition von Henquin, 2000) bedingt ist, ist unklar. Es ist jedoch so, dass auch Imidazoline,
die den KATP-Kanal blockieren und somit den „triggering pathway“ aktivieren, diese
Eigenschaften aufweisen. Es ist daher das Anliegen der vorliegenden Arbeit die Wirkung von
Imidazolinen auf den „triggering pathway“ und hier insbesondere auf den KATP-Kanal
genauer zu charakterisieren.
5.1 Kir6.2 als gemeinsamer Wirkort von Imidazolinen und Chinin
Wie in der Einleitung beschrieben war zu Beginn dieser Arbeit bekannt, dass das
Chinabaumrindenalkaloid Chinin [3H]Clonidin von nichtadrenergen Imidazolin-
bindungsstellen an HIT-Zellen verdrängt. Außerdem war bekannt, dass Chinin in
mikromolaren Konzentrationen die Insulinsekretion durch Hemmung des KATP-Kanals
(HENQUIN et al., 1975; BOKVIST et al., 1990a) steigert. Obwohl Chinin auch andere K+-
Kanäle hemmt (FATHERAZI und COOK, 1991), wird der Block von den KATP-Kanälen in
der B-Zelle als Hauptursache für das Auftreten von Hypoglykämien als unerwünschte
Nebenwirkung von Chinin im therapeutischen Einsatz gegen Malaria angesehen (DAVIS et
al., 1990; GRIBBLE et al., 2000). Der Block ist ausreichend, um die B-Zell Plasmamembran
zu depolarisieren und die Insulinsekretion zu stimulieren, sogar in Abwesenheit von Glucose
(HENQUIN, 1982). Messungen an outside-out Patches von insulinsezernierenden Zellen
zeigten den hemmenden Effekt von 100 µM Chinin auf KATP-Kanäle in RINm5F-Zellen
(FINDLAY et al., 1985) und konzentrationsabhängig (0,01 – 1mM) an HIT-Zellen
(FATHERAZI und COOK, 1991). 100 µM blockierten komplett die KATP-Kanäle in
RINm5F-Zellen, während die KATP-Kanäle der HIT-Zellen bei dieser Konzentration zu 70%
geschlossen waren. Unsere Befunde an intakten HIT-Zellen ergaben eine ähnliche Potenz der
Wirkung von Chinin auf die KATP-Kanäle. Deren Aktivität war um 97 % vermindert.
Wesentlich geringere Konzentrationen an Chinin (10 und 20 µM) benötigten Bokvist et al.,
um an B-Zellen der Maus einen Block der KATP-Kanäle zu erzeugen (BOKVIST et al.,
1990b). Dabei war das Ausmaß der Hemmung von 10 µM Chinin ähnlich ausgeprägt wie bei
dem Block durch 20 µM Chinin, so dass die Autoren in dem Konzentrationsbereich 10-20 µM
Diskussion
61
auch den Bereich sahen, in dem die maximal inhibitorische Wirkkonzentration von Chinin
liegen sollte. Dementsprechend wäre ein IC50-Wert von 1 bis 2 µM anzunehmen. Fatherazi
und Cook bestimmten einen IC50-Wert von 25 µM, wobei diesem Wert allerdings nur drei
Konzentrationen zugrunde lagen. Unsere Messungen führten zu einem geringeren IC50-Wert
von 5,3 µM. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass unsere Messungen an intakten Zellen
durchgeführt wurden, wohingegen die Messungen von Findlay et al. und Fatherazi und Cook
an outside-out Membranen durchgeführt wurden. Es kann also eine intrazelluläre
Akkumulation von Chinin in unseren Versuchen möglich gewesen sein und zu dem
niedrigeren IC50-Wert beigetragen haben.
Die in der Einleitung dargestellten Bindungsdaten (Kap. 1.3) und der Befund, dass Chinin den
KATP-Kanal hemmt, führten zu der Hypothese, dass Chinin zumindest eine der spezifischen
nichtadrenergen Imidazolinbindungsstellen an insulinsezernierenden HIT-Zellen erkennt
(RUSTENBECK et al., 1997a), und dass die porenbildende Untereinheit Kir6.2 des KATP-
Kanals diese Stelle sein könnte. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten unterstützen diese
Hypothese insofern, als Chinin ebenso wie Clonidin die Kanalaktivität von Kir6.2∆C26
hemmte. Der IC50-Wert lag bei 14,6 µM. Ein solcher Effekt von Chinin wurde auch von
Gribble und Kollegen bestätigt, die diese Versuche an einer anderen trunkierten Variante,
Kir6.2∆C36, durchgeführt hatten. Mit 10 µM Chinin wurde in diesen Versuchen eine ca.
90%-ige Hemmung erzielt, eine Konzentrationsabhängigkeit wurde jedoch nicht erstellt
(GRIBBLE et al., 2000). Die sich in diesen Versuchen andeutende höhere Potenz der
Wirkung von Chinin kann allerdings nicht direkt mit der in unseren Versuchen erzielten
Wirkung verglichen werden, da ein unterschiedliches Versuchsmodell vorlag (transfizierte
Xenopus Oocyten, giant-inside-out Patch).
In unseren Versuchen war die schließende Wirkung von Chinin auf Kir6.2∆C26
signifikant weniger potent als diejenige auf den nativen KATP-Kanal in HIT-Zellen (IC50: 14,6
µM vs. IC50: 5,3 µM), im Gegensatz zur Wirkung von Clonidin, das an beiden Kanälen
gleiche IC50-Werte aufwies. Daher wurde die Wirkung von Chinin auf einen heterolog
exprimierten Kanal aus Kir6.2∆C26 und SUR1 getestet. Ziel dieser Versuche war es zu
klären, ob die unterschiedliche Potenz der Wirkung von Chinin auf Kir6.2∆C26 und den
nativen KATP-Kanal auf die Anwesenheit von SUR1 im nativen Kanal zurückzuführen war,
SUR1 also als Affinitätsfaktor wirkt oder auf einer unspezifischen Ursache wie z.B. einer
unterschiedlichen zellulären Akkumulation in HEK- und HIT-Zellen beruht.
Der IC50-Wert für die Hemmung der koexprimierten Kir6.2∆C26/SUR1-Kanäle durch
Chinin betrug 29,6 µM und war damit sogar noch höher als der IC50-Wert für die Hemmung
Diskussion
62
von Kir6.2∆C26-Kanälen. Somit ist der Unterschied zwischen den IC50-Werten nicht der
Gegenwart von SUR1 zuzurechnen. Es ergibt sich für Clonidin und Chinin gleichermaßen,
dass SUR1 nicht als Affinitätsfaktor für die Hemmung von Kir6.2 wirkt, im Gegensatz zur
hemmenden Wirkung von ATP4- auf Kir6.2, wo die Anwesenheit von SUR1 zu einer ca.
siebenfachen Steigerung der kanalschließenden Potenz von ATP4- führt (PROKS und
ASCROFT, 1997). Ein fehlender Effekt von SUR1 auf den Chinin-induzierten Schluss
entspricht auch den Befunden von Gribble und Kollegen (2000): an rekonstituierten
Kir6.2/SUR1 Kanälen in Xenopus Oocyten war die Hemmung durch 10 µM Chinin praktisch
ebenso stark wie an Kir6.2∆C36 Kanälen.
Um sicher zu stellen, dass der exprimierte Ionenkanal tatsächlich Kir6.2∆C26 war,
wurde die durchschnittliche Kanaloffenzeit in Einzelkanalmessungen bestimmt. Dadurch ließ
sich ein Unterschied zum nativen KATP-Kanal belegen aber auch Aussagen zum Mechanismus
machen. Die mittlere Kanaloffenzeit wurde durch die Gegenwart der Imidazoline nicht
beeinflusst. Die Hemmung des Kanals kann also nicht auf einen sogenannten „open-channel-
block“ zurückgeführt werden, sondern ist wahrscheinlich durch ein verändertes Gating
bedingt. Ein Kanalblock durch verändertes Gating kann auch durch unspezifische Substanzen,
z.B. Detergentien, hervorgerufen werden und ist daher noch nicht hinweisend auf eine
spezifische Bindungsstelle (SMITH und PROKS, 1998).
5.2 Kir6.2 als Korrelat von nichtadrenergen Imidazolinbindungsstellen in
insulinsezernierenden Zellen.
Clonidin wurde auf seine schließende Wirkung auf native KATP-Kanäle und Kir6.2-Kanäle
getestet, weil Clonidin der prototypische Ligand für I1-Rezeptoren (KD: 1-5 nM) ist
(REGUNATHAN und REIS, 1996) und in früheren Untersuchungen als Radioligand zur
Charakterisierung von Imidazolinrezeptoren an insulinsezernierenden Zellen verwendet
wurde (RUSTENBECK et al. 1997a). Auch Phentolamin und Idazoxan binden an diese Stelle
mit hoher Affinität (Ki: 1-100 nM mit [3H]Clonidin als Radioliganden). Idazoxan ist
außerdem der typische I2-Ligand (Ki Werte von 1-100 nM). Eine Reihe anderer Imidazoline,
die hochaffin an I1-Rezeptoren binden, haben jedoch eine wesentlich geringere Affinität (Ki
Werte von 1–100 µM mit [3H]Idazoxan als Radioliganden), so z.B. Phentolamin und
Rilmenidin. Während I1-Rezeptoren wahrscheinlich auf der Plasmamembran lokalisiert sind,
sind I2-Rezeptoren auf der äußeren Mitochondrienmembran und wahrscheinlich in der
Plasmamembran lokalisiert (REGUNATHAN und REIS, 1996).
Diskussion
63
I1-Rezeptoren wurden in der ventrolateralen Medulla im Hirnstamm des Rinds beschrieben
und sind dort an der Regulation des Blutdrucks mit beteiligt (BOUSQUET et al., 1984;
BOUSQUET et al., 2000). Neben der zentralen Regulation des Blutdrucks über I1-Rezeptoren
scheint zusätzlich ein Einfluss auf den Blutdruck über periphere Imidazolinrezeptoren
möglich zu sein. Die Stimulierung präsynaptischer Imidazolinrezeptoren an sympathischen
Nerven, die die glatten Muskelzellen der Blutgefäße innervieren, führte zu einer Hemmung
der Noradrenalinfreisetzung und damit zu einem Abfall des peripheren Blutdrucks
(GÖTHERT und MOLDERINGS, 1991; LIKUNGU et al., 1996). I2-Rezeptoren wurden u.a.
im Gehirn, in Astrozyten, in der Niere und in Adipozyten nachgewiesen. Substrat zumindest
eines Teils der I2-Rezeptoren scheint das Enzym Monoaminooxidase (MAO) der äußeren
Mitochondrienmembran zu sein. Auch an insulinsezernierenden Zelllinien des Pankreas
wurden I2-Bindungsstellen beschrieben, ohne dass jedoch eine Beziehung zur Insulinsekretion
hergestellt werden konnte (LACOMBE et al., 1993).
Bindungsstudien mit radioaktiv markierten Imidazolinen sprechen dafür, dass weitere
Bindungsstellen existieren, die nicht den Charakteristika der I1- und I2-Bindungsstellen
entsprechen. Diese Versuche wurden an insulinsekretorischen Zelllinien durchgeführt. So
wurde eine Bindungsstelle (KD: 145 nM) an RINm5F Zellen für das tritiierte Imidazolin
[3H]RX821002 nachgewiesen (CHAN et al., 1994). Mit [3H]Clonidin wurde an
insulinsezernierenden HIT-T15-Zellen sowohl eine hochaffine Bindungsstelle (KD: 0,4 nM)
als auch eine niederaffine Bindungsstelle (KD: 241 nM) nachgewiesen (RUSTENBECK et al,
1997a). Die Bindung an die hochaffine Stelle entsprach in der Affinität der Bindung von
Clonidin an α2-Adrenozeptoren (VAN ZWIETEN, 1988). Die niederaffine Stelle war als
nichtadrenerge Imidazolinbindungsstelle zu definieren. Wurden die Adrenozeptoren durch
Noradrenalin maskiert (Abb. 4), ließen sich nicht nur eine, sondern mindestens zwei
nichtadrenerge Bindungsstellen nachweisen (KD: 61 nM für die hochaffine Stelle; KD: 4,5 µM
für die niederaffine Stelle). Im Gegensatz dazu stehen die Daten von Olmos und Kollegen, die
in RIN-5AH Zellen eine Bindung von [125I]-para-Iodoclonidin nur an α2-Adrenozeptoren
nicht aber an Imidazolinbindungsstellen nachweisen konnten (OLMOS et al., 1994).
Bei Betrachtung der ermittelten IC50-Werte der Hemmung des nativen KATP-Kanals
(IC50: 44,2 µM) und des trunkierten Kanals Kir6.2∆C26 (IC50: 40,1 µM) durch den I1-
Rezeptorligand Clonidin, konnte keine Korrelation mit den KD-Werten ermittelt werden.
Zwischen der Potenz der Hemmung des KATP-Kanals bzw. des Kir6.2∆C26-Kanals
einerseits und der Affinität der Bindung von Clonidin und Chinin an HIT-Zellmembranen
andererseits war keine Korrelation festzustellen. Clonidin hatte sowohl zur hoch- als auch zur
Diskussion
64
niederaffinen nichtadrenergen Imidazolinbindungsstelle eine höhere Affinität als Chinin,
während Chinin eine höhere oder zumindest ebenso große Potenz wie Clonidin aufwies, die
genannten Kanalaktivitäten zu hemmen.
Im Vergleich mit Clonidin war das Clonidin-Derivat Alinidin (N-allyl-Clonidin),
welches keine α-agonistischen Eigenschaften mehr besitzt (KOBINGER et al., 1979),
wesentlich potenter in der Hemmung von Kir6.2∆C26. Hier wurde für Alinidin ein IC50-Wert
von 0,38 µM ermittelt. Dem entspricht, dass auch in Versuchen an inside-out Membranen von
normalen B-Zellen Alinidin potenter wirksam war als Clonidin (RUSTENBECK et al.,
1997a). Die höhere Potenz von Alinidin verglichen mit Clonidin spiegelt sich jedoch nicht in
den bisher vorliegenden Bindungsdaten wieder: die Bindungsstudien an HIT-Zellmembranen
ergaben für Clonidin Ki Werte von 38 nM für die hochaffine und von 4,9 µM für die
niederaffine Imidazolinbindungsstelle. Für Alinidin betrugen die entsprechenden Werte 36
nM und 84,9 µM (RUSTENBECK et al., 1997a).
Folgende Gründe können dafür verantwortlich sein, dass sich keine Entsprechung
zwischen den Bindungsaffinitäten und der Hemmung des KATP-Kanals bzw. Kir6.2∆C26-
Kanals nachweisen ließ: 1) die experimentellen Modelle waren unterschiedlich, insofern das
für die Bindungen Membranfraktionen und für die funktionellen Messungen intakte Zellen
verwendet wurden. Dadurch kann es in intakten Zellen zu unterschiedlich ausgeprägten
Akkumulationen der Testsubstanzen kommen, das die Potenz scheinbar erhöht. 2) es liegt
nicht nur eine, sondern mehrere niederaffine Bindungsstellen vor, die in den
Bindungsversuchen nicht aufgelöst werden konnten. Ein Hinweis darauf ist, dass im
Gegensatz zu den Imidazolinen Chinin den Radioliganden nur unvollständig verdrängen
konnte. 3) obgleich Chinin und Clonidin an das gleiche Protein (Kir6.2) binden, müssen die
Bindungsstellen nicht identisch sein. Hier müssten Sättigungsbindungen mit markiertem
Chinin und Clonidin Aufschluss geben.
Um die bisher charakterisierten Imidazolinbindungsstellen an B-Zellen für eine
Klärung der Funktion der Imidazoline nutzbar zu machen, bedarf es höheraffiner Liganden,
die keine Affinität zu α-Adrenozeptoren haben. Davon ausgehend könnte getestet werden, ob
sich die Verdrängung durch klassische Imidazoline wie Phentolamin oder Alinidin von der
Verdrängung durch neue, nicht KATP-kanalwirksame Imidazoline (EFENDIC et al., 2002)
unterscheidet.
Diskussion
65
5.3 Wechselwirkung zwischen Imidazolinen und physiologischen und
pharmakologischen KATP-Kanalöffnern
Die Frage, ob die Imidazolin-induzierte Hemmung des KATP-Kanals der B-Zelle durch
physiologische und pharmakologische Kanalöffner antagonisiert werden kann, wurde in der
vorliegenden Arbeit deshalb untersucht, weil die Öffnung des KATP-Kanals möglicherweise
einen wichtigen Schutzmechanismus von „gestressten“ Zellen (z.B. bei Hypoxie oder
neuronaler Überstimulation) darstellt (BALLANYI, 2004). Es wäre also potentiell gefährlich,
wenn ein solcher Schutzmechanismus durch permanente Blockade des KATP-Kanals
ausgeschaltet werden würde.
Als physiologische Kalium-Kanal-Öffner fungieren Nukleosiddiphosphate, wenn
intrazellulär Mg2+ zur Verfügung steht (ZÜNKLER et al., 1988). Der öffnende Effekt auf den
KATP-Kanal ist abhängig von der Interaktion mit den Walker A und Walker B Motiven in den
Nukleosid-Bindungs-Domänen auf der regulativen Untereinheit SUR (SHYNG et al., 1997;
GRIBBLE et al., 1997). In Abwesenheit von intrazellulärem Mg2+ haben
Nukleosiddiphosphate einen hemmenden Einfluss auf die KATP-Kanalaktivität, diese
Hemmung ist jedoch weniger effektiv als diejenige der Nukleosidtriphosphate. Verwendet
wurde in den Versuchen dieser Arbeit MgGDP, weil GDP die schwächste inhibitorische
Wirkung der Nukleosiddiphosphate auf den KATP -Kanal aufweist (SCHWANSTECHER et
al., 1994), MgGDP deshalb der reinste KATP-Kanalöffner unter den Nukleosiddiphosphaten
ist.
Als pharmakologischer Kalium-Kanal-Öffner (KCO) wurde das den Thiaziddiuretika
verwandte Diazoxid eingesetzt, das die Glucose- und Sulfonylharnstoff-induzierte
Insulinsekretion in den B-Zellen des Pankreas hemmt (SELZER und ALLEN, 1965; PORTE,
1968). Die Wirkung auf die B-Zelle wird über den gleichen KATP-Kanal vermittelt, der von
Sulfonylharnstoffen spezifisch geschlossen wird (HENQUIN und MEISSNER, 1982; TRUBE
et al., 1986). Ferner wurde auch eine öffnende Wirkung von Diazoxid an cardialen und
glattmuskulären KATP-Kanälen nachgewiesen (BABENKO et al., 1998). Während
Imidazoline einen Teil ihrer Wirkung durch einen Angriff an Kir6.2 vermitteln, liegt die
Bindungsstelle für Diazoxid wie die für die Sulfonylharnstoffe auf der regulativen
Untereinheit (ÄMMÄLÄ et al., 1996). Dabei scheint der C-Terminus der SUR-Untereinheit
eine wichtige Rolle zu spielen (BABENKO et al., 1998). Diazoxid öffnet die
Sulfonylharnstoff-geblockten KATP-Kanäle der B-Zelle und repolarisiert deren
Plasmamembran, so dass sich die spannungsabhängigen Ca2+-Kanäle schließen, und es zu
einem Abfall der intrazellulären Ca2+-Konzentration kommt (PANTEN et al., 1996).
Diskussion
66
Die bisher veröffentlichen Untersuchungen ergaben ein widersprüchliches Bild hinsichtlich
der Frage, ob KATP-Kanalblocker, die direkt auf Kir6.2 wirken (wie Imidazoline und Chinin),
durch Diazoxid antagonisiert werden können.
Henquin und Kollegen untersuchten in Umströmungsversuchen an B-Zellen der Maus
anhand des 86Rb-Effluxes den Einfluss von Diazoxid (100 µM) auf die schließende Wirkung
von 20 µM Phentolamin. Das Badmedium enthielt zusätzlich 6 mM Glucose, bei dieser
Konzentration sind unter physiologischen Bedingungen die meisten KATP-Kanäle geschlossen.
Diazoxid war nicht in der Lage, den 86Rb-Ausstrom zu verstärken (PLANT und HENQUIN,
1990). Auch in der whole-cell Konfiguration der Patch-Clamp-Technik wurde die
Kanalaktivität in Gegenwart von 20 µM Phentolamin durch 100 µM Diazoxid nur mäßig von
5,7 % auf 9,1 % vom Kontrollwert gesteigert (PLANT und HENQUIN, 1990). In die gleiche
Richtung wiesen Befunde von Bokvist et al. (1990), die fanden, dass der Chinin-induzierte
Block des KATP-Kanals in outside-out Membranen durch Diazoxid (200 µM) nicht zu
antagonisieren war. Andererseits zeigte sich jedoch bei Messungen des Membranpotentials
von B-Zellen, dass die persistierende, komplette Depolarisation, die durch 30 µM
Phentolamin hervorgerufen war, durch Diazoxid aufgehoben werden konnte. Allerdings war
bei diesen Versuchen Phentolamin vor Zugabe von Diazoxid aus dem Badmedium entfernt
(RUSTENBECK et al., 1999a). Weiterhin wurde gezeigt, dass der Phentolamin-induzierte
Ca2+-Anstieg in B-Zellen in Gegenwart von Diazoxid deutlich geringer ausfiel
(RUSTENBECK et al., 1999a). Somit waren Hinweise gegeben, dass Diazoxid einen für die
Insulinsekretion relevanten Antagonismus des Imidazolineffektes an KATP-Kanälen ausübt.
In der vorliegenden Untersuchung wurde die Hemmung von nativen KATP-Kanälen in
der inside-out Konfiguration durch die Imidazoline Alinidin und Phentolamin durch die
Gegenwart des öffnenden Nukleotids MgGDP ebenso antagonisiert wie die Hemmung durch
Tolbutamid oder Chinin. Die zusätzliche Gegenwart von Diazoxid erbrachte nur bei der
Alinidin-induzierten Hemmung eine weitere signifikante Steigerung der Kanalaktivität. Für
Phentolamin und Chinin ergab sich keine signifikante Veränderung der Kanalaktivität durch
die Anwesenheit von Diazoxid. Eine mögliche Erklärung für die unterschiedliche Effektivität
von Diazoxid ist, dass durch die Gegenwart von MgGDP in letzteren Fällen bereits eine
maximale Öffnung der KATP-Kanäle erzielt wurde. Andererseits kamen Unterschiede
zwischen den schließenden Substanzen hinsichtlich ihres Wirkungsmechanismus in Betracht.
Durch den Nachweis jedoch, dass die von allen Testsubstanzen (Imidazoline ebenso wie
Tolbutamid und Chinin) induzierte Depolarisation der Plasmamembran von B-Zellen durch
Diazoxid zu antagonisieren waren, war die Interpretation wahrscheinlich, dass Diazoxid
Diskussion
67
grundsätzlich den über Kir6.2 vermittelten Schluss des KATP-Kanals ebenso zu antagonisieren
vermag wie den über SUR1 (z.B. durch Sulfonylharnstoffe) vermittelten Kanalschluss.
Um zu klären, ob dieser Befund auch für die intakte B-Zelle Gültigkeit hat, wurde die
Messung der cytosolischen Calciumkonzentration ([Ca2+]i) durchgeführt. Die [Ca2+]i spiegelt
die Aktivität von spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen wieder und diese sind wiederum von
der De- und Repolarisation der Plasmamembran abhängig. Hier konnte der von Phentolamin
und Chinin hervorgerufene Anstieg der [Ca2+]i nicht durch die Gegenwart von Diazoxid
rückgängig gemacht werden, während sich der Alinidin- und Idazoxan-induzierte Anstieg
durch Diazoxid antagonisieren ließ, ebenso wie der Tolbutamid-induzierte Ca2+-Anstieg.
Insofern war der Befund bestätigt, dass der KATP-Kanalschluss durch Alinidin im inside-out
Patch durch Diazoxid antagonisierbar war. Warum waren aber die Wirkungen von
Phentolamin und Chinin auf die [Ca2+]i nicht durch Diazoxid antagonisierbar, obwohl die
Ergebnisse der Membranpotentialmessungen ein solches Ergebnis erwarten ließen? Die
wahrscheinliche Erklärung ist, dass die unterschiedlichen Ergebnisse durch die
verschiedenartigen Zellkonfigurationen bedingt sein können. Durch die Herstellung der
whole-cell Konfiguration zur Messung des Membranpotentials steht das Cytosol in
Verbindung mit der Pipettenlösung und wird gewissermaßen dialysiert (NUMBERGER und
DRAGUHN, 1996). Durch diesen Vorgang können entweder mögliche Mediatorsubstanzen
der Imidazolinwirkung oder die Imidazoline (bzw. Chinin) selbst in ihrer cytosolischen
Konzentration soweit vermindert werden, dass ein Antagonismus durch Diazoxid möglich ist.
Die Relevanz der Messungen der [Ca2+]i konnte jetzt durch Messungen der Insulinsekretion an
perifundierten Inseln der Maus bestätigt werden. Die insulinsekretionssteigernde Wirkung
von Phentolamin konnte von Diazoxid nicht antagonisiert werden, wohl aber diejenige von
Alinidin (RUSTENBECK et al., 2002).
Ein Antagonismus zwischen Imidazolinen und Diazoxid wurde auch von der Gruppe
um Dunne an intakten B-Zellen beschrieben. Erstaunlicherweise war in diesen Versuchen
Diazoxid (250 µM) in der Lage, die [Ca2+]i-steigernde Wirkung einer supramaximalen
Konzentration (500 µM) von Phentolamin stark zu vermindern (SHEPHERD et al., 1996). In
weiteren Versuchen dieser Gruppe wurde jedoch gefunden, dass Phentolamin in der Lage
war, auch in der Gegenwart von Diazoxid einen deutlichen [Ca2+]i -Anstieg zu bewirken,
hingegen konnte das Imidazolin Efaroxan nur in 5 von 11 Versuchen eine solche Wirkung
aufweisen (SHEPHERD et al., 1996). Auch in diesen Versuchen deutet sich also ein
Unterschied zwischen den Wirkungen der Imidazoline an intakten Zellen an, wenngleich er in
dieser Arbeit nicht diskutiert wird.
Diskussion
68
Die Frage, ob Diazoxid den KATP-Kanal öffnet, obwohl ein Imidazolin gebunden ist, oder ob
es die Bindung des Imidazolins vermindert, kann anhand der bisherigen Daten nicht
entschieden werden. In die letztere Richtung deutet der Befund, dass Diazoxid [3H] Clonidin
mäßiggradig aber signifikant von der Bindung an HIT-Zellmembranen verdrängt
(RUSTENBECK et al., 1997a)
5.4 Konsequenzen der Hemmung des Energiestoffwechsels der B-Zellen für den
Imidazolin-induzierten Schluss von KATP-Kanälen
Der Befund, dass MgGDP die Alinidin-induzierte Hemmung der KATP-Kanäle in den inside-
out Membranen von normalen Maus B-Zellen antagonisieren konnte, führte zu der Erwartung,
dass die Imidazolin-geblockten KATP-Kanäle durch die Hemmung des Energiestoffwechsels
der B-Zelle (metabolischer Stress) zu öffnen wären. Bei länger dauernder metabolischer
Hemmung kommt es zu einem Abfall der ATP- und einem Anstieg der ADP-Konzentration
im Cytosol. An der intakten Zelle zeigte sich jedoch keine signifikante Öffnung des durch 100
µM Alinidin induzierten Blocks des KATP-Kanals durch 7,5 minütige Umströmung mit NaCN,
gemessen in der cell-attached Konfiguration der Patch-Clamp-Technik. Hingegen kann der
von Tolbutamid oder anderen Sulfonylharnstoffen induzierte Block der KATP-Kanäle durch
metabolische Blockade (d.h. wahrscheinlich durch Anstieg von MgADP) aufgehoben werden,
wie auch in dieser Arbeit bestätigt werden konnte. NaCN wirkt als Hemmstoff der
Cytochrom-Oxidase, welches in der inneren Mitochondrienmembran den Komplex IV der
Atmungskette bildet (TYLER, 1992). Als Folge unterbleibt die Phosphorylierung von ADP
zu ATP am Atmungskettenkomplex V, so dass die ATP/ADP Ratio im Cytosol sinkt. Als
mögliche Erklärung für die Diskrepanz zwischen der öffnenden Wirkung von MgGDP an
inside-out Membranen und der fehlenden Öffnung bei metabolischer Hemmung von intakten
B-Zellen kann angenommen werden, dass der ADP-Anstieg (oder ATP-Abfall) nicht stark
genug war, um die durch Alinidin gehemmten Kanäle zu öffnen.
Der Befund, dass der Alinidin-Block bei metabolischer Hemmung persistiert, steht in
Übereinstimmung mit dem Befund, dass der Cibenzolin-Block an KATP-Kanälen von B-Zellen
der Ratte durch 2,4-Dinitrophenol (DNP) nicht aufgehoben werden konnte (MUKAI et al.,
1998). Cibenzolin ist ein IA-Antiarrhythmikum und zählt aufgrund seiner Struktur zu den
Imidazolinen. Mukei et al. zeigten, dass Cibenzolin seinen hemmenden Effekt über eine
Bindungsstelle auf Kir6.2 vermittelt, so dass eine gleichartige Wirkung wie bei den hier
getesteten Imidazolinen anzunehmen ist. DNP ist ein Entkoppler der Atmungskette, es macht
die innere Mitochondrienmembran durchlässig für Protonen, wodurch das Membranpotential
Diskussion
69
der inneren Mitochondrienmembran kollabiert und die oxidative Phosphorylierung von ADP
zu ATP, ähnlich wie in Gegenwart von Cyanid, zum Erliegen kommt (TYLER, 1992). Im
Unterschied zur Wirkung von Cyanid läuft die Sauerstoffreduktion weiter, sie ist sogar
maximal erhöht (TYLER, 1992).
Im Gegensatz zum Alinidin-induzierten Block war der Tolbutamid-induzierte Block
der KATP-Kanäle in intakten B-Zellen durch NaCN abzuschwächen. Dieser Befund stimmt mit
den Beobachtungen von Findlay (FINDLAY, 1993) überein, der an ventrikulären Myocyten
der Ratte die durch die Entkoppler DNP und FCCP (Carbonylcyanid-trifluormethoxy-
phenylhydrazon) aktivierten ATP-sensitiven K+-Kanäle durch Glibenclamid und Tolbutamid
nur vorübergehend hemmen konnte. Die Abhängigkeit des durch Sulfonylharnstoffe
induzierten Blocks vom Energiestoffwechsel konnte auch an KATP-Kanälen von B-Zellen
gefunden werden (MUKAI et al., 1998). Somit bietet sich eine Erklärung an, dass die
unterschiedliche Reaktion auf eine metabolische Hemmung dadurch bedingt ist, dass
Imidazoline an Kir6.2 und Sulfonylharnstoffe an SUR1 bzw. SUR2 binden. Diese Erklärung
ist aber insofern nicht hinreichend, als auch der Block des KATP-Kanals durch Phenylalanin-
Derivate und Benzoesäure-Derivate nicht oder nur gering durch eine metabolische Hemmung
zu beinflussen ist. Beide Substanzgruppen binden an SUR1 (HU et al., 2000; HANSEN et al.,
2002). So wurde gezeigt, dass die Wirkung des Phenylalanin-Derivats Nateglinid (A-4166)
sehr viel weniger durch eine metabolische Hemmung zu beeinflussen war als die von
Sulfonylharnstoffen (FUJITANI et al., 1997). Auch das Benzoesäure-Derivat Repaglinid war
nicht durch metabolischen Stress in seiner hemmenden Wirkung auf den KATP-Kanal
vermindert (KOFOD und FUHLENDORFF, 1995). Zwar ist Repaglinid als Benzoesäure-
Derivat nicht selektiv für den B-Zell-Typ des Sulfonylharnstoffrezeptors, SUR1,
möglicherweise wird aber die Bindungsstelle von Repaglinid von SUR und Kir6.x zusammen
gebildet, wodurch sich eine Erhöhung und Differenzierung der Bindungsaffinitäten ergibt
(HANSEN et al., 2005).
In Versuchen, die gegenwärtig in der Arbeitsgruppe durchgeführt werden, hat sich
gezeigt, dass die Wirkung von Alinidin in einer geringeren, halbmaximal wirksamen
Konzentration durch metabolische Hemmung aufzuheben war. Dadurch ist der ursprüngliche
Befund, dass MgGDP Alinidin-geschlossene KATP-Kanäle öffnen kann, bestätigt worden. Es
kann angenommen werden, dass die Hemmung von KATP-Kanälen durch Imidazoline nicht
notwendigerweise zu einem Verlust der Schutzfunktion dieses Kanals bei zellulärem Stress
führt.
Zusammenfassung
70
6 Zusammenfassung
Imidazoline sind als potentielle orale Antidiabetika interessant, da einige Vertreter dieser
Substanzgruppe die Insulinsekretion nur in Gegenwart von erhöhten Glucosekonzentrationen
steigern. Hierdurch unterscheiden sie sich vorteilhaft von den bisher am meisten verwendeten
insulinsekretionssteigernden Pharmaka, den Sulfonylharnstoffen, die die Insulinsekretion
auch bei sehr niedrigen Glucosekonzentrationen steigern können. Als Wirkmechanismus ist
die Hemmung des KATP-Kanals der insulinsezernierenden B-Zellen bekannt; im Gegensatz zu
den Sulfonylharnstoffen, die an die regulative Untereinheit (SUR1) dieses Kanals binden,
binden die Imidazoline an die porenbildende Untereinheit (Kir6.2). Da die Konsequenzen der
Hemmung gleich sind, kann dieser Mechanismus jedoch nicht die unterschiedliche
Wirkcharakteristika von Imidazolinen und Sulfonylharnstoffen erklären und es sind in der Tat
zusätzliche Effekte in späteren Abschnitten der Stimulus-Sekretions-Kopplung der B-Zelle
beschrieben worden.
Seit mehreren Jahre wird die Existenz von nichtadrenergen Imidazolinrezeptoren
postuliert und von einigen Autoren wird die Auffassung vertreten, dass auch die B-Zellen des
Pankreas über einen Subtyp solcher Imidazolinrezeptoren („I3“-Rezeptoren) verfügen. In
vorangegangenen Untersuchungen waren eine hoch- und eine niederaffine nichtadrenerge
Imidazolinbindungsstelle an insulinsezernierenden HIT-Zellen charakterisiert worden. In der
vorliegenden Arbeit sollte einerseits das Verhältnis von Imidazolinbindungsstellen und KATP-
Kanal als Wirkort von Imidazolinen weiter geklärt werden und andererseits die funktionellen
Konsequenzen der Hemmung dieses Kanals (insgesamt der „triggering pathway“ nach
Henquin) weiter untersucht werden. Insbesondere interessierte in diesem Zusammenhang die
Frage, ob die über den Schluss von Kir6.2 vermittelten Wirkungen antagonisierbar sind, d.h.
einer physiologischen oder pharmakologischen Modulation zugänglich sind.
Für die erste Fragestellung wurden die Wirkungen von Clonidin und Chinin auf den nativen
KATP-Kanal von insulinsezernierenden HIT-Zellen mit ihren Wirkungen auf die heterolog
exprimierte porenbildende Untereinheit Kir6.2 verglichen. Da die Expression von Kir6.2
allein keinen funktionsfähigen Kanal ergibt, wurde stattdessen eine C-terminal deletierte
Variante, Kir6.2∆C26, eingesetzt, die auch ohne die Gegenwart der regulativen Untereinheit
(SUR1) Ionenkanalaktivität in der Plasmamembran hat.
Clonidin wurde als Testsubstanz ausgewählt weil es 1) der prototypische Radioligand
für die relativ gut charakterisierten I1-Rezeptoren ist und als solcher bereits für die
Charakterisierung von Imidazolinbindungsstellen an insulinsezernierenden Zellen eingesetzt
Zusammenfassung
71
worden ist, 2) den KATP-Kanal blockiert und 3) die Insulinsekretion steigert, wenn die α2-
Adrenozeptoren der B-Zelle blockiert sind. Chinin wurde als Testsubstanz ausgewählt, weil
es 1) den KATP-Kanal blockiert, 2) die Insulinsekretion steigert und 3) Clonidin als
Radioliganden von Imidazolinbindungsstellen von HIT-Zellmembranen verdrängt. Es stellte
sich konkret die Frage, ob Clonidin und Chinin direkt an der porenbildenden Untereinheit
wirksam sind und somit Kir6.2 einen gemeinsamen Bindungsort für diese Substanzen
darstellt. Der Vergleich mit der Wirkung auf den nativen KATP-Kanal der HIT-Zellen sollte
einerseits den Bezug zu den Bindungsstudien herstellen, andererseits die Frage beantworten,
ob die zusätzliche Gegenwart der regulativen Untereinheit SUR1 die Wirkung der beiden
Substanzen beeinflusst.
Die Expression von Kir6.2∆C26 in HEK293-Zellen wurde durch Koexpression des
grünfluoreszierenden Proteins (GFP) identifiziert. Die Identität dieses Kanals wurde durch
Bestimmung elektrophysiologischer Merkmale (mittlere Kanaloffenzeit von Kir6.2∆C26 0,81
± 0,1 ms vs. 1.54 ± 0.2 ms beim nativen KATP-Kanal) und pharmakologischer Merkmale
(Hemmung durch ATP und Imidazoline, nicht aber durch Sulfonylharnstoffe) belegt. Die
Einzelkanalamplitude und die mittlere Einzelkanalöffnungszeit wurden durch die Hemmung
mit Imidazolinen nicht beeinflusst, hierdurch kann ein unspezifischer „open channel block“
wie er typischerweise von Lokalanästhetika bewirkt wird, als ausgeschlossen gelten.
Es ließ sich nachweisen, dass sowohl Chinin als auch Clonidin in mikromolaren
Konzentrationen die Kanalaktivität von Kir6.2 ∆C26 hemmten (IC50 14,6 ± 2,1 bzw. 40,1 ±
13,7 µM) damit könnte dieser Kanal also das Korrelat der niederaffinen Imidazolin-
bindungsstelle darstellen, die auch Chinin bindet. Auch das Clonidin-Derivat Alinidin, das
keine a2-agonistische Wirkung hat, hemmte die Kanalaktivität von Kir6.2 ∆C26. Die
hemmende Wirkung dieser Substanzen wurde durch die zusätzliche Anwesenheit der
regulativen Untereinheit SUR im nativen Kanal nicht verstärkt, dieser Befund ließ sich auch
durch heterologe Koexpression von Kir6.2∆C26 mit SUR1 bestätigen. Damit unterscheidet
sich der Schluss des KATP-Kanals durch Imidazoline und Chinin von dem ebenfalls an Kir6.2
bewirkten Kanalschluss durch ATP, der durch die Anwesenheit von SUR deutlich potenter
wird.
Eine eindeutige Parallelität zwischen der hemmenden Wirkung von Clonidin und
Chinin auf den KATP-Kanal und ihrer Bindungaffinität für nichtadrenerge
Imidazolinbindungsstellen von insulinsezernierenden HIT-Zellen ließ sich jedoch nicht
belegen. Ursächlich könnten hierfür die unterschiedlichen experimentellen Systeme von
Verdrängungsbindung einerseits und Funktionsmessung andererseits sein, aber auch die
Zusammenfassung
72
Möglichkeit, dass es mehrere niederaffine Imidazolinbindungsstellen gibt, die in den
Bindungsversuchen nicht aufgelöst wurden.
Die durch Imidazoline und Chinin ausgelöste Hemmung des KATP-Kanals in inside
out-Membranen von B-Zellen ließ sich durch ein öffnendes Nukleotid, MgGDP, ebenso
antagonisieren wie der durch das Sulfonylharnstoff Tolbutamid ausgelöste Block. Eine
zusätzlich öffnende Wirkung des pharmakologischen Kaliumkanalöffners Diazoxid ließ sich
jedoch nur für Alinidin, nicht jedoch für Phentolamin belegen. Wurde jedoch als indirekter
Parameter der Hemmung des KATP-Kanals das Membranpotential in der whole cell-
Konfiguration gemessen, so war die depolarisierende Wirkung aller in maximal effektiver
Konzentration getesteten Imidazoline und auch von Chinin durch Diazoxid zu antagonisieren.
Die Ergebnisse belegen, dass nicht nur die Wirkung von solchen KATP-Kanal-Blockern, die
wie Sulfonylharnstoffe an SUR binden, sondern von solchen, die an Kir6.2 binden, durch
Diazoxid antagonisiert werden kann.
An metabolisch intakten B-Zellen, hier wurde als indirekter Parameter die
cytosolische Ca2+-Konzentration gemessen, konnte jedoch bei gleichen Konzentrationen ein
Diazoxid-Antagonismus nur mit den Imidazolinen Alinidin und Idazoxan (und
erwartungsgemäß auch mit Tolbutamid) gesehen werden, nicht aber mit dem Imidazolin
Phentolamin und mit Chinin. Als Erklärung für diese Diskrepanz bietet sich an, dass letztere
Substanzen in intakten Zellen akkumulieren oder dort zusätzliche Mechanismen auslösen, die
eine Antagonisierung durch Diazoxid behindern.
Eine weitere Eigenschaft, die nur in intakten Zellen geprüft werden kann, ist die
Aufhebung der KATP-Kanal-blockierenden Wirkung durch metabolische Hemmung,
wahrscheinlich vermittelt durch einen Anstieg der MgADP-Konzentration. Nur die
kanalschließende Wirkung von Tolbutamid, nicht aber von Alinidin war durch metabolische
Hemmung zu vermindern. Angesichts des Antagonismus zwischen MgGDP und Alinidin am
inside-out Patch war diese Beobachtung unerwartet und bedarf einer sorgfältigen Klärung.
Insgesamt weisen die Ergebnisse in dieser Arbeit darauf hin, dass die Hemmung des
KATP-Kanals durch Imidazoline ein spezifischer und durch endogene oder pharmakologische
Regulatoren der Kanalaktivität modulierbarer Effekt ist. Die o.g. vorteilhaften Charakteristika
bezüglich der Insulinsekretionssteigerung lassen sich durch die Wirkung auf den KATP-Kanal
und den dadurch aktivierten „triggering pathway“ allein nicht erklären, sie können aber als
eine Summation von Wirkungen auf den KATP-Kanal und auf spätere Ereignisse in der
Stimulus-Sekretions-Kopplung aufgefasst werden. Insofern kann es für die
Weiterentwicklung dieser Substanzklasse essentiell sein, welche Bedeutung die Hemmung
Zusammenfassung
73
des KATP-Kanals besitzt. Der Einwand, eine Hemmung des KATP-Kanals über Kir6.2 sei ein
unspezifischer und nicht regulierbarer Porenblock und würde mit einem möglichen
therapeutischen Einsatz solcher Substanzen nicht vereinbar sein, ist nach den vorliegenden
Daten nicht zutreffend.
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Lebenslauf Persönliche Daten:
Name: Timm Große Lackmann
Geburtsdatum: 20.01.1972
Geburtsort: Berlin
Eltern: Michael Große Lackmann, Apotheker
Hannelore Große Lackmann geb. Totz,
Apothekerin
Nationalität: deutsch
Familienstand: verheiratet Schulbildung: 1978 - 1982 Grundschule Elze
1982 - 1991 Jugenddorf Christophorus Schule Elze
1991 Allgemeine Hochschulreife Studium: SS 1992 - WS 1997/98 Pharmazie an der Technischen Universität Carolo
Wilhelmina zu Braunschweig
SS 1995 1. Staatsexamen
WS 1997/98 2.Staatsexamen
Januar 1998 - Juli 1998 Pharmaziepraktikant in der Löwenapotheke Hannover
Juli 1998 - Februar 1999 Diplomarbeit – Martin-Luther-Universität Halle/Saale; die Diplomarbeit wurde am Institut für Pharmazeutische Technologie der TU Braunschweig erstellt. Titel:
„Erarbeitung einer Meßroutine mit dem SPF-290 Analyzer und Überprüfung der Anwendbarkeit des In Vitro SPF-Bestimmungsverfahrens anhand ausgewählter Sonnenschutzprodukte und vier mikropigmenthaltiger Rezepturen“
März 1999 3. Staatsexamen und Approbation als Apotheker
September 1999 Erlangung des akademischen Grads eines Diplompharmazeuten
Berufstätigkeit:
März 1999 - Juni 1999 Apotheker in der Mühlenapotheke, Elze
Juli 1999 - Dezember 2001 Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Klinische Biochemie an der Medizinischen Hochschule Hannover.
Januar 2002 - Oktober 2002 Weiterführung der Promotion am Institut für Pharmazeutische Pharmakologie und Toxikologie der TU Braunschweig
November 2002 - März 2003 Apotheker in der Mühlenapotheke, Elze
April 2003 - Mai 2004 Apotheker in der Limmer Apotheke, Hannover
Seit Juni 2004 Apotheker in der Friedenstal Apotheke, Hannover