Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej

Anna Majewska

Warszawa, 2018

WIRUSY CHOROBOTWÓRCZE DLA CZŁOWIEKA

TOK BADANIA WIRUSOLOGICZNEGO

METODY STOSOWANE W DIAGNOSTYCE

WIRUSOLOGICZNEJ

OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA WIRUSÓW

• Małe rozmiary (20 nm-300 średnicy)

• Brak budowy komórkowej

• Zależą całkowicie od żywych komórek

• Nie rosną na podłożach sztucznych

• Bezwzględne pasożytnictwo wewnątrzkomórkowe

• Posiadają jeden rodzaj kwasu nukleinowego

• Nie namnażają się przez podziały

• Są niewrażliwe na antybiotyki

kwas nukleinowy (DNA lub RNA)

DNA jest zwykle dwuniciowy (wyjątek parwowirusy)

RNA jest zwykle jednoniciowy (wyjątek reowirusy)

jednoniciowy RNA - o dodatniej (mRNA) lub ujemnej polarności (transkrypcja

do kopii o dodatniej polarności)

Budowa wirusa

kwas nukleinowy + kapsyd = nukleokopsyd

Funkcje kapsydu:

• ochronna

• udział w adsorpcji i wnikaniu wirusa do komórki przez interakcje

z receptorami błony komórkowej

pojedynczy segment

wielosegmentowy

Nukleokapsyd o symetrii ikosaedralnej

liczba kapsomerów

jest cechą taksonomiczną

adenowirusy

herpeswirusy

pikornawirusy

Nukleokapsyd o symetrii helikalnej (spiralnej)

• kapsomery spiralnie otaczają

kwas nukleinowy

• wydłużony kształt

rabdowirusy

filowirusy

wirus Ebola

Osłonka

nabyta z błony komórkowej podczas późnych faz replikacji

glikoproteiny

przyleganie do receptorów komórkowych

pobudzanie interakcji z białkami nukleokapsydu

(dojrzewanie potomnych cząstek wirusa)

osłonka wirusa

wszystkie wirusy o symetrii helikalnej

wirusy o symetrii ikosaedralnej:

togawirusy

herpeswirusy

retrowirusy

flawiwirusy

wirusy bezosłonkowe

oporne na wysuszenie, detergenty,

ekstremalne pH i temperatury

przenoszone droga oddechową i fekalno-oralną

wirusy osłonkowe

wymagają wilgotnego środowiska,

wrażliwe na kwasy i detergenty

Białka wirusowe

strukturalne

enzymatyczne

polimerazy wirusowe (replikacja)

proteazy

modyfikacja dużych protein w procesie translacji,

uwolnienie kwasu nukleinowego z nukleokapsydu

endonukleazy i ligazy (replikacja)

Postaci

pozakomórkowa

spoczynkowa – wirion

wewnątrzkomórkowa

aktywna – pozbawiony

białkowego płaszcza

komórka zakażona wirusem wścieklizny:

liczne wirusy (szare, pałeczkowate struktury)

i większe, ciemniejsze ciałka wtrętowe Negriego

Kryteria uwzględniane w klasyfikacji wirusów

wygląd, kształt i wielkość,

cechy kwasu nukleinowego,

• typ,

• liczba nici i ich postać (s, ds, liniowy, kolisty),

• liczba segmentów,

• masa cząsteczkowa,

• polarność genomu wirusowego,

symetria nukleokapsydu,

obecność osłonki lub jej brak,

stopień pokrewieństwa antygenowego,

Replikacja wirusów

• adsorpcja

• wniknięcie

• odpłaszczenie

• synteza białek wczesnych

• powielenie genomu

• synteza białek późnych

• składanie i dojrzewanie wirionów potomnych

• uwolnienie dojrzałych wirionów

WIRUS RECEPTOR RECEPTOR

KOMÓRKOWY WIRUSOWY

Reowirusy

HIV cząstka CD4 gp120

Ortomyksowirus

Wirus grypy sialyloligosacharydy hemaglutynina

Rabdowirus

Wirus wścieklizny receptor acetylocholinowy białko G

Hepadnawirusy

HBV receptor hepatocytowy Pre-S

Fuzja wirusowej osłonki z błona komórkową

Białko fuzji, doprowadza do połączenia osłonki wirusowej z błoną

komórkową, do cytoplazmy dostaje się nukleokapsyd, z którego uwalnia się

kwas nukleinowy (odpłaszczanie)

Translokacja – bezpośrednie przejście wirusa przez błonę komórkową, małe

wirusy

Penetracja

Endocytoza

Wpuklenie błony komórkowej. Wirus zamknięty w pęcherzyku pokrytym klarytyną, który wędruje w głąb cytoplazmy

penetracja

odpłaszczanie

proteazy wirusowe trawią białka ochronne

uwolnienie kwasów nukleinowych

synteza

Replikacja kwasu nukleinowego

Synteza białek wirusowych

DNA przemieszcza się do jądra komórkowego

Dojrzewanie – formowanie wirionów potomnych

wirusy osłonkowe

egzocytoza, odzyskanie osłonki lipoproteinowej

(ortomyksowirusy, paramyksowirusy)

wirusy nagie – liza komórki

Wirusy lityczne

Cykl rozwojowy wirusa doprowadzający do rozpadu (lizy) atakowanej

komórki

Wirus wnika do komórki, „zmusza” ją do powielenia wirusowego kwasu

nukleinowego i do syntezy wirusowych białek.

Powstają potomne cząsteczki wirusa, które opuszczają komórkę, niszcząc ją.

Wirusy lizogenne

Wirus nie powoduje śmierci komórki, ulega włączeniu do komórkowego DNA.

DNA wirusa jest przekazywany komórkom potomnym w procesach podziałów

komórkowych.

Zjawisko to uznaje się za przyczynę niektórych zmian nowotworowych, a wirusy

je wywołujące nazywamy wirusami onkogennymi.

Drogi zakażenia

powietrzna

inhalacyjna

pokarmowa

fekalno-oralna

wertykalna

krwiopochodna

kontakt płciowy

wektory

autoinokulacja

kontakt bezpośredni (zakażone powierzchnie)

Zakażenie pierwotne

Zakażenie wtórne (latencja)

Zakażenie miejscowe

Zakażenie narządowe

Wiremia

zakażenie narządów docelowym

(tropizm OUN, wątroba, płuca, jelita, skóra, wirusy pantropowe)

latencja

zakażenie latentne, utajone

komórki nerwowe – HSV-1, HSV-2, HHV-3

limfocyty B – HHV-4 (EBV)

limfocyty T – HHV-5 (CMV)

reaktywacja ze stanu latencji – czynniki reaktywacji:

bodźce termiczne, psychiczne, fizyczne, hormonalne, zakaźne

OBJAWY ZAKAŻENIA

pierwsze objawy: gorączka, bóle mięśniowe, złe samopoczucie –

aktywacja dopełniacza i uwalnianie cytokin

objawy miejscowe – wysypka, obrzęk ślinianek, nieżyt nosa –

działanie cytopatogenne wirusa

objawy narządowe – ostra faza choroby

procesy nowotworowe

zakażenia przetrwałe – retrowirusy, papillomawirusy

zakażenia wertykalne – zakażenie płodu, noworodka

materiał diagnostyczny

wczesna postekspozycja

faza objawów klinicznych (wirusy oddechowe)

ozdrowieńcy

kontrola postępów leczenia

wymaz z błony śluzowej nosa i gardła

plwocina

krew/surowica krwi

moc, kał

wymazy ze zmian skórnych, zeskrobiny

aspiraty

fragmenty tkanek

metody diagnostyczne

obraz kliniczny

hodowla komórkowa,

obserwacja mikroskopowa: CPE, immunofluorescencja, mikroskopia

elektronowa

wykrywanie „składników” wirusowych

wykrywanie przeciwciał

Hodowla wirusów

diagnozowanie zakażeń

badania naukowe

produkcja antygenów (szczepionki, testy diagnostyczne)

Metody hodowli

hodowle komórkowe

żywe układy:

zwierzęta laboratoryjne

zarodki ptasie

ZARODKI PTASIEKURZE - 1931 rok - KACZE, PRZEPIÓRKI JAPOŃSKIE

wirus świnki

wirus grypy

zwierzęta laboratoryjne

(myszy, świnki morskie, króliki, chomiki)

HODOWLE KOMÓRKOWE (1925rok – WIRUS KROWIANKI W

HODOWLI TKANKOWEJ, F. PARKER )

PIERWOTNE

Komórki uzyskane ze świeżo izolowanych tkanek lub narządu

WTÓRNE - USTABILIZOWANE

PÓŁCIĄGŁE CIĄGŁE

diploidalne, aneuploidalne,

ograniczona liczba pasaży (40-50), najczęściej wywodzą się

utrzymują swój garnitur chromosomalny, z tkanki nowotworowej,

ulegają aberracji i degeneracji, VERO, HeLa,

(MRC-5, WI-38),

Hodowle komórkowe

Hodowla w naczyniach – szkło, nietoksyczny plastik – przyleganie do

powierzchni tworząc jednowarstwową hodowlę – monolayer

Hodowla w zawiesinie – mieszadła magnetyczne

Hodowle komórkowe

Pożywki do hodowli komórkowych zawierają

- cukry,

- aminokwasy,

- witaminy,

- sole mineralne,

- związek buforujący (do pH 7,2-7,4),

- wskaźnik barwny pH,

- antybiotyki,

- surowicę (najczęściej płodową cielęcą)

w stężeniu 10-20% pożywka wzrostowa

w stężeniu 2-5% pożywka utrzymująca

WARUNKI HODOWLI

temperatura 37ºC, stężenie CO2 5%, wilgotność

Permisywność

Wirus zakaża się i replikuje tylko w tych liniach komórkowych, których

komórki zawierają odpowiedni dla gatunku wirusa receptor (komórki

permisywne, zezwalające)

NAZWA TKANKA WIRUS

POCHODZENIE MORFOLOGIA

HeLa człowiek rak szyjki macicy nabłonkowa Polio 1, adenowirusy, herpeswirusy

Hep-2 człowiek rak krtani nabłonkowa Polio 1, adenowirusy, flawiwirusy

BHK-21 chomik nerka fibroblasty adenowirusy, herpeswirusy

Vero małpa nerka nabłonkowa SV 40, herpeswirusy

WI-38 człowiek płuca fibroblasty Polio 1, 2, VSV, adenowirusy

PK świnia nerka nabłonkowa VSV, Coxsackie B2 - B6,

flawiwirusy, herpeswirusy

nie wszystkie wirusy mogą namnażać się we wszystkich liniach komórkowych, wirus

replikuje się tylko w komórce permisywnej tj. zezwalającej, która posiada odpowiedni

dla danego wirusa receptor.

stosowane w celach

diagnostycznych, naukowych, produkcyjnych (szczepionki)

VERO

Hodowle komórkowe

Vero (komórki nabłonkowe z zielonej małpy afrykańskiej)

wielojądrowe komórki olbrzymie

Micrograph showing the viral cytopathic effect of

herpes simplex virus (multi-nucleation, ground glass chromatin).

A – okołojądrowe „halo” , powiększone hyperchromatyczne jądro

B – duże jądro, nieregularne rozmieszczenie chromatyny, nieregularna osłonka

HAdV – ludzkie adenowirusy

Metody wykrywania wirusów

ZMIANY CYTOPATYCZNE (CPE)

WTRĘTY- ciałka wtrętowe, widoczne w barwionych, zakażonych

komórkach za pomocą mikroskopu świetlnego.

Są to skupiska wirusów lub wirusy otoczone komórkowymi elementami

białkowymi i lipidowymi lub składniki komórkowe powstałe pod

wpływem zmienionego metabolizmu zakażonej komórki.

wtręty cytoplazmatyczne

wtręty jądrowe (herpeswirusy)

Wtręty A (HSV, VZV) – ostro

odgraniczone, otoczone jasną przestrzenią

od chromatyny jądrowej

Wtręty B (poliowirus, żółtej febry) –

mniejsze.

Wtręty jądrowe i cytoplazmatyczne

(wirus odry)

CPE - wirus odry w linii komórkowej HeLa, syncytia, wtręty cytoplazmatyczne

(barwienie hematoksyliną)

Hepatocyt – wewnatrzjądrowe wtręty, otoczone strefą „halo”.

barwienie H&E.

Wielojądrzaste komórki olbrzymie

syncytia np. paramyksowirusy, herpeswirusy

Skupiska powiększonych i zaokrąglonych

komórek, utrata mostków cytoplazmatycznych

(grona winogron) - adenowirusy

zaokrąglenie i obkurczenie komórek. liza (zniszczenie warstwy

komórek) np. poliowirus

hodowla prawidłowa

(linia Vero)CPE

Efekt cytopatyczny powodowany przez

wirusa HHV-1

hodowla prawidłowa

(linia Vero) CPE

c

Efekt cytopatyczny powodowany przez

poliowirusy

Efekt cytopatyczny powodowany przez

cytomegalowirusa

hodowla prawidłowa

(linia PMK)CPE

Efekt cytopatyczny powodowany przez

wirusa Coxsackie A

Transformacja nowotworowa komórek

wzrost jednowarstwowy zastąpiony jest chaotycznym i

wielowarstwowym, grudkowate skupiska, aberracje

chromosomów

HHV-8 Mięsak Kaposiego

HPV – typy onkogenne

HHV-4 (EBV) Chłoniak Burkitta

ZMIANY NIECYTOPATYCZNE

1. Hemadsorpcjaortomyksowirusy,

paramyksowirusy

2. Interferencjapodwójne zakażenie = oporność na

zakażenie komórki innym wirusem

Hemaglutynacja [Hirst 1941]

Stosowania do wykrywania wirusów

posiadających na swej otoczce

hemaglutyniny np. wirusa grypy

Uwolnione wirusy w pożywce hodowlanej

+ krwinki czerwone = aglutynacja erytrocytów

konglomeraty erytrocytarnowirusowe

Dokładna identyfikacja wirusa namnożonego w hodowli

komórkowej wymaga zastosowania

dodatkowych technik diagnostycznych

INNE METODY DIAGNOSTYCZNE

Metody molekularne

wykrywanie sekwencji materiału genetycznego np. DNA lub RNA)

• PCR

• Real-time PCR

• RT-PCR

• Nested PCR itp.

Metody serologiczne