Wykład 3 – Procesy biotechnologiczne · 2014-12-02 · Wykład 3 – Procesy biotechnologiczne Kontrola procesów biotechnologicznych Wielkości fizyczne mierzone w bioreaktorach

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Wykład 3 – Procesy biotechnologiczne

Rodzaje przemysłowych procesów fermentacyjnych

- procesy, w których produktem jest biomasa

- procesy, w których produktem jest białko, najczęściejenzym

- procesy, w których produktem jest metabolit (biosynteza)

- procesy, których celem jest przekształcenie związku dodanego do mieszaniny fermentacyjnej (biotransformacja)

- procesy mikrobiologicznej degradacji makromolekuł(biodegradacja)

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot:


TECHNOLOGIA CHEMICZNAPodstawy Biotechnologii

Rodzaje bioprocesów

Biosynteza

Biotransformacja

Biohydroliza

Fermentacja

Bioługowanie

Biodegradacja



Blokowy schemat technologiczny procesu biosyntezy mikrobiologicznej





Cechy charakterystyczne procesu biotechnologicznegotrzy wyraźne fazy:

przygotowanie produkcji (upstream processing)

właściwa fermentacja

obróbka poprodukcyjna (downstream processing)

• przygotowanie produkcji odbywa się w warunkach laboratoryjnych

• konieczność kilkukrotnego powiększania skali

• konieczność utrzymania i przechowywania szczepów produkcyjnych

• konieczność zapewnienia warunków aseptycznych

• konieczność rygorystycznej kontroli parametrów fermentacji





Sposoby prowadzenia procesów biotechnologicznych

A – proces okresowy; B – proces okresowy z zasilaniem; C – proces ciągły w układzie homogenicznym;D – proces ciągły homogeniczny z częściową recyrkulacją ; E – proces ciągły dwustopniowy; F – procesciągły heterogeniczny w reaktorze z przepływem tłokowym; G – proces ciągły heterogeniczny z częściowąrecyrkulacją; H – proces ciągły dwustopniowy w układzie mieszanym; I – proces z odprowadzeniem produktu metodą dializy; J – proces okresowy w kolumnie ze złożem biokatalizatora, z recyrkulacją cieczy;K – proces ciągły w kolumnie ze złożem biokatalizatora; L – proces jak w K, z częściową recyrkulacją



Sposoby prowadzenia procesów biotechnologicznychz wykorzystaniem drobnoustrojówHodowle w podłożach ciekłych: wgłębne lub powierzchniowe;

z unieruchomionym materiałem biologicznym

Hodowle w podłożach stałych (jedynie dla grzybów strzępkowych)

Procesy okresowe – prostota technologiczna, łatwość utrzymania warunków jałowych, odnawialność zaszczepki, ale konieczność powtarzaniaw każdym cyklu operacji przed- i poprocesowych, niska produkcyjność -m.in. produkcja enzymów i białek terapeutycznych.Hodowle wielokrotne – browarnictwo, produkcja octu

Procesy ciągłe – m.in. wytwarzanie białka paszowego, fermentacja alkoholowa,fermentacja octanowa, oczyszczanie ścieków metodą osadu czynnego

Procesy okresowe z zasilaniem – namnażanie drożdży w celu produkcji SCP,produkcja antybiotyków, witamin, aminokwasów. Szczególne zastosowanie –nietypowe źródła węgla.



Hodowla okresowa (ang. batch culture) – system zamknięty

Q – natężenie dopływupożywki

X – gęstość komórekS – stężenie składników

odżywczych

Bilans biomasy

µ- szybkość wzrostuα - szybkość obumieraniaXX

dtdX αµ −=

µ jest funkcją stężenia substratu limitującego wzrost

Zakładając α ≈ 0, r-nie upraszcza się do postaci:

XdtdX µ=



Hodowla okresowa z zasilaniem (ang. fed batch culture)



odżywczych

Bilans biomasyBiomasa akumulowana = biomasa dopływająca + przyrost biomasy – komórki martwe

XVXVQX

dtVXd αµ −+= 0)( µ- szybkość wzrostu

α - szybkość obumierania

Zakładając α ≈ 0 i brak zasilania biomasą, r-nie upraszcza się do postaci:

VXdtVXd µ=

)(



Hodowla ciągła (ang. continuous culture)



odżywczych

Biomasa akumulowana = biomasa dopływająca + przyrost biomasy –biomasa usuwana – komórki martwe

µ- szybkość wzrostuα - szybkość obumieraniaX

VQXX

VQX

dtdX αµ −−+= 0

Wprowadzając: D = Q/V – szybkość rozcieńczania, zakładając α ≈ 0i brak zasilania biomasą, r-nie upraszcza się do postaci:

VQXX

dtdX

−= µ



Hodowla ciągła z recyrkulacją biomasy (Chemostat)

Bilans biomasyBiomasa akumulowana = biomasa dopływająca + przyrost biomasy –

biomasa usuwana – komórki martwe



odżywczychγ - współczynnik recyklingu C – współczynnik zatężenia biomasy zawracanej

XVQXX

VXQC

VQX

dtdX αγµγ

−+

−++=)1(0

µ- szybkość wzrostuα - szybkość obumierania

0=dtdX

Wprowadzając: D = Q/V – szybkość rozcieńczania, zakładając α ≈ 0i brak zasilania biomasą oraz uzyskanie stanu równowagi, czyli otrzymujemy:

µ = D(1 + γ - γC)



BIOTECHNOLOGICZNE PROCESY CIĄGŁE

Zalety:

1. Wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany warunków w pożywce i fizjologię drobnoustrojów

2. Możliwość prowadzenia hodowli dowolnie długo w ustalonych, optymalnych warunkach3. Możliwość regulacji stanu fizjologicznego komórek przez dobór zasilania

i składu podłoża zasilającego hodowlę4. Jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli5. Możliwość automatyzacji procesu6. Większa szybkość i wydajność wielu procesów7. Możliwość maksymalnego wykorzystania aparatury i jej równomiernego obciążenia

Wady:

1. Możliwość degeneracji szczepów lub pojawienia się niekorzystnych mutacji i opanowaniahodowli przez populacje komórek o pogorszonych właściwościach produkcyjnych

2. Trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłuższy czas

3. Niekorzystny sposób rozwoju niektórych drobnoustrojów, tworzących układy wielokomórkowe, skupiska w postaci kłaczków i kuleczek, obrastanie przewodów

4. Niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów, a tworzeniem niektórych produktów metabolizmu syntezowanych przez komórki nie rosnące



Porównanie profili wzrostu drobnoustrojów i produkcji antybiotyku w warunkachhodowli okresowej i hodowli okresowej z zasilaniem



Podstawowe typy bioreaktorów do tlenowych procesów wgłębnych

A – bioreaktor z mieszadłem tarczowo-turbinowym i bełkotką; B – bioreaktor z mieszadłem aeratorem;C – bioreaktor strumienicowy z pompą zewnętrzną i eżektorowym zasysaniem powietrza; D – bioreaktorkolumnowy z bełkotką; E – bioreaktor kolumnowy z inżektorowym doprowadzeniem powietrza i rurącyrkulacyjną; F – bioreaktor z mieszadłem śmigłowym, dyszą doprowadzającą powietrze i rurą cyrkulacyjnąG – bioreaktor z hydrostatyczną cyrkulacją zewnętrzną



BIOREAKTORY

Bioreaktory przemysłowe Bioreaktor laboratoryjny



Bioreaktor(1) korpus; (2) płaszcz; (3) izolacja; (4) zamocowanie; (5) króciec do podawania inokulum; (6) króćce czujników pH, temperatury i poziomu tlenu; (7) mieszadło;(8) bełkotka; (9) uszczelka mechaniczna; (10) sprzęgło;

(11) napęd; (12) króciec odbioru produktu; (13) króćce doprowadzenia czynnika chłodzącego do płaszcza; (14) króciec do poboru próbki z podłączeniem do przewodu dostarczającego parę; (15) wziernik boczny; (16) króćce przewodów podawania czynników regulujących pH oraz środków antypieniących; (17) króciec wlotu powietrza; (18) pokrywa; (19) króciec dopływu pożywki; (20) dysza wylotowa gazów; (21) inne podłączenia; (22) mechaniczny rozbijacz piany; (23) wziernik w pokrywie i podłączenie do przewodu odprowadzającego parę; (24) dysza z zaworem bezpieczeństwa.



Rodzaje mieszadeł mechanicznych stosowanych w biofermentorach:a/ turbina Rushtona; b/ turbina z łopatkami wklęsłymi;c/ turbina hydropłatowa; d/ turbina typu śruby okrętowej



PROBLEMY ZWIĄZANE Z PIENIENIEM

1. Wzrost heterogeniczności środowiska spowodowany wynoszeniem stałych części podłoża i komórek wraz z pianą i osadzaniem ich na ścianach lub innych elementach bioreaktora

2. Utrudnienie lub wręcz uniemożliwienie kontroli stężenia składników podłoża oraz objętości hodowli, co jest szczególnie niekorzystne w przypadku procesu ciągłego

3. Zagrożenie wypienienia hodowli z bioreaktora oraz możliwość jego zainfekowania obcą mikroflorą przez zawilgocony pianą układ wentylacyjny

4. Obniżenie pojemności użytkowej bioreaktora o 30-50%5. Konieczność stosowania oprzyrządowania przeciwdziałającego pienieniu,

co podraża proces6. Możliwość przechodzenia śladowych ilości substancji przeciwpianowych

do produktów7. Możliwość pogarszania się warunków natlenienia na skutek wprowadzania

środków przeciwpianowych8. Możliwość niekorzystnego wpływu środków przeciwpianowych

na morfologię i fizjologię drobnoustrojów



Urządzenia do mechanicznego rozbijania piany

A – dysk szybkoobrotowy (1 – wylot powietrza, 2 – doprowadzenie chemicznego środka przeciwpianowego); B – mieszadło łapowe pomiędzy dwoma dyskami; C – fundafom CHEMAP(1 – zasysanie piany, 2 – wylot powietrza, 3 – wyrzut cieczy); D –cyklon (1 – pompa, 2 - wylot powietrza)



Rozwiązania techniczne bioreaktora typu air-lift



Kontrola procesów biotechnologicznych

Wielkości fizyczne mierzone w bioreaktorach

Temperatura czujniki opornościowe, termistory, termoparyNatężenie przepływu powietrza kryzy pomiarowe, rotametryNatężenie przepływu cieczy j.w., przepływomierze łopatkowePoziom cieczy czujniki pojemnościowe, oporowePoziom piany czujniki pojemnościoweCiśnienie przetworniki membranoweSzybkość obrotów mieszadła czujniki elektryczne lub optyczneLepkość płynu reometry śrubowe, rotacyjne

Wielkości chemiczne mierzone w bioreaktorach

Stężenie rozpuszczonego tlenu elektrody polarograficzne lub galwanicznepH elektrody pH-metrycznePotencjał redoks elektrody platynoweStężenie tlenu w gazach analizatory paramagnetyczneStężenie CO2 w gazach analizatory IRGęstość biomasy czujniki nefelometryczne, fluorymetryczneStężenie cukrów elektrody enzymatyczneSkład roztworu elektrody jonoselektywne, enzymatyczne



Schemat dodatkowych urządzeń kontrolnych bioreaktora

biomasa – czujnik optycznyfluorescencja - czujnik fluorescencyjnypiana – detektor pianyFFF – rozdzielanie w polu przepływuFIA – iniekcyjny analizatorprzepływuGC- chromatograf gazowyHPLC – wysokosprawny chromatograf cieczowyMS – spektrometr masredoks – czujnik potencjału redoksW – masa∆T – różnica temperaturymiędzy zawiesiną hodowlanąi płaszczem wodnym



Standardowe zmienne bioprocesowe

F – objętościowe natężenie przepływuzasilania; p – ciśnienie; pH – wartość pHcieczy; pO2 – prężność cząstkowa tlenurozpuszczonego; P – moc pobierana napędu mieszadła; rpm – częstotliwośćobrotów mieszadła; T – temperatura cieczy; vvm- szybkość napowietrzania;VL – objętość cieczy; W – masa reaktora

Schemat układu pomiarowego i sterującego bioreaktora



Schematy wybranych bioreaktorów do procesów z biokatalizatoramiimmobilizowanymi

A – kolumna ze złożem upakowanym; B – kolumna ze złożem zraszanym; C – kolumna ze złożem fluidalnym;D – bioreaktor z mieszadłem mechanicznym; E – bioreaktor z wkładami unieruchomionego biokatalizatora;F – bioreaktor z krzyżowym przepływem fazy ciekłej i gazowej; G – bioreaktor rurowy z wkładami (włóknami)z materiału półprzepuszczalnego





Sposoby sterylizacji

- jałowienie termiczne parą wodną – podłoża, biofermentory, rury, zawory

-- sterylizacja chemiczna lub fizyczna (tlenek etylenu, lizol, chloraminy, UV)pomieszczenia

- sterylizacja przez filtrację (filtry membranowe) – powietrze, tlen



Metody wyjaławiania podłoża

A – okresowa; B- ciągła przeponowa, wymienniki płytowe; C – ciągła bezprzeponowa1- inżektor parowy, 2 – rura sterylizacyjna, 3 – komora „próżniowa”



Sterylizacja podłoża z użyciem wymienników spiralnych



Instalacja do sterylizacji gazów odlotowych





Schemat postępowania podczas przygotowania materiału posiewowego do procesu biosyntezy



Przemysłowymi producentami antybiotyków są szczepy wysokowydajne

Cechy szczepu wysokowydajnego

maksymalna wydajność pożądanego produktu

minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych

stabilność genetyczna

odporność na zakażenia wirusowe

Przykład wyniku optymalizacji szczepu:Penicillium chrysogenum wytwarzający Penicylinę G

oryginalny szczep producencki 0.1 mg/ml- szczep zoptymalizowany 30 mg/ml



Schemat namnażania inokulum do procesu biosyntezy



Namnażanie zaszczepki

Dane dotyczą wytwarzania sagamycyny przez Micromonospora sagamiensis



Trójstopniowa instalacja przemysłowa do namnażania zaszczepki



Parametry przykładowego procesu fermentacyjnego



Porównanie składów pożywek dla fazy wzrostu i fazy produkcyjnej

Biofermentor produkcyjny

Glukoza 0,5 – 0,8 %Skrobia 3 – 5%WNK 5 – 8%Mąka sojowa 1 – 5%Siarczan amonu 0,5 – 1%

+ uzup. periodyczneFosforan 0,1 – 1,0%Olej roślinny 1% + uzup. stałeSyrop kukurydziany zasilanie stałe

Zaszczepka w kolbie

Glukoza 3 – 5 %WNK 3 – 5%Węglan wapnia 0,5 – 1 %Fosforan 0,1 – 0,5%Siarczan amonu 0,1 – 1,0%Mocznik 0,1 – 0,5%Olej roślinny 0,1 – 0,5%



Różnice warunków hodowli w kolbie i w fermentorze

Hodowla w kolbie Hodowla w biofermentorze

10 – 50 ml w kolbie 100 - 500 ml objętości 10 – 100 000 litrów

tylko hodowla okresowa hodowle okresowe, okresowe z zasilaniem, chemostat, ciągłe

możliwość kontroli T, brak kontroli O2 kontrola temperatury, pH, poziomu O2

wysokie początkowe stężenia możliwość stopniowanego dodawaniasubstratów, prekursorów, induktorów

ciśnienie normalne możliwe nadciśnienie do 2 atn

utrudnione pobieranie próbek łatwość pobierania próbek

zmniejszanie objętości hodowli możliwość zwiększania objętości

wzrost drobnoustrojów na ściankach wzrost jednorodny

brak problemów z pienieniem konieczność stosowania antypieniaczy





Sterylne stanowisko pracy z zastosowaniemlaminarnego przepływu powietrza1 – komora; 2 – filtr wstępny; 3 – filtr HEPA4 – wentylator; 5 – regulacja tyrystorowa; 6 - wskaźniki

Budowa aseptycznej jednostki pracyI – obszar niesterylny; II – obszar czysty;III – obszar sterylnyak – autoklaw w ścianie z podwójnymidrzwiami jako śluza materiałowaszare prostokąty – śluzy powietrzne



OBRÓBKA POPRODUKCYJNA – DOWNSTREAM PROCESSINGFermentacja

brzeczka pofermentacyjna

Dezintegracja

Separacja ciecz/składniki nierozpuszczalne

osad

Zatężenie

Oczyszczanie

Formulacja

ciecz

odpady

roztwór

produkt surowy

produkt oczyszczony

produkt w formie ostatecznej

zagospodarowanieodpadów



OBRÓBKA POPRODUKCYJNA – DOWNSTREAM PROCESSING

0,25 – 5 obr/min

powierzchniafiltracji2 – 10 m2

Obrotowy filtr bębnowy próżniowy – rotary drum vacuum filter



Prasa filtracyjna

Powierzchnia filtracyjna od 100 do 15 000 cm2 na płytę



OBRÓBKA POPRODUKCYJNA – DOWNSTREAM PROCESSING

Wirówki wykorzystywane w przemysłowych procesachseparacji zawiesin pofermentacyjnych

a) kalander rurowy

b) c) wirówka talerzowa;30 – 200 talerzy pod kątem około 40°

d) wirówka ślimakowado bardzo gęstych zawiesin



Przemysłowe metody dezintegracji komórek

A. Metody mechaniczne

1. Poddawanie działaniu wysokiego ciśnienia2. Ucieranie (młyny kulowe)3. Mikrofluidyzacja

B. Metody niemechaniczne

1. Suszenie/zawieszanie w roztworze2. Szok osmotyczny3. Szok termiczny4. Traktowanie rozpuszczalnikami organicznymi lub surfaktantami5. Zastosowanie enzymów litycznych



Przemysłowe metody zagęszczania roztworów

1. Odparowywanie, w tym: odparowywanie ze spływającą warstwą,odparowywanie płytowe

2. Ekstrakcja ciecz/ciecz- prosta- dysocjatywna- reakcyjna

3. Wytrącanie- frakcjonowanie siarczanem amonu- wytrącanie powinowactwa- immunoprecypitacja

3. Adsorpcja- na węglu aktywnym- na żywicach jonowymiennych- na adsorbentach hydrofobowychmetoda złoża fluidalnego w kolumnie – proces ciągły



Ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym

Diagram fazowy pojedynczej substancjiPc – ciśnienie krytyczne; Tc – temperatura krytyczna





Zestaw do ultrafiltracji spiralnej



Zasada działania hollow fibre filtration



Przemysłowe techniki chromatograficzne

Stosowane głównie dla oczyszczania białek i DNA

Techniki:

- Chromatografia rozmiarów wykluczających (Sephadex, Sepharose)- Chromatografia jonowymienna (DEAE-, Q-, CM-, S)- Chromatografia hydrofobowa (Phenyl-Sepharose)- Chromatografia adsorpcyjna (hydroksyapatyt)- Chromatografia powinowactwa



Metody formulacji produktuLiofilizatory - krystalizacja

- suszenie- liofilizacja

Suszarka z wymuszonym obiegiem powietrza

Documents

Wykład 3 – Procesy biotechnologiczne · 2014-12-02 · Wykład 3 – Procesy biotechnologiczne Kontrola procesów biotechnologicznych Wielkości fizyczne mierzone w bioreaktorach