xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thƣ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-------- -------

LÊ LAN PHƢƠNG

XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH

CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------------------

Lê Lan Phƣơng

XÁC ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH

CỦA BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: CH.60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội - 2012

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, ngƣời thầy

đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học

và thực hiện luận văn này.

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong Khoa Sinh học,

Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian

học tập tại Trƣờng.

Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị học viên và các bạn

sinh viên làm việc tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí

nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự

nhiên đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện

luận văn tại Phòng.

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm

giúp đỡ của các cán bộ, nhân viên thuộc Khoa Tế bào - Giải phẫu bệnh, Bệnh viện

K2, Tam Hiệp, Hà Nội. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên,

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.

Luận văn đƣợc thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số KLEPT-09-02.

Hà Nội, tháng 6 năm 2012

Học viên

Lê Lan Phƣơng

MỤC LỤC

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................... a

DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................... d

DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... e

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN .......................................................................................... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN ............................................................... 3

1.1.1. Phân loại ung thƣ gan nguyên phát ........................................................... 3

1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan ............................................................. 4

1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ gan .................................................................. 6

1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ gan ................................................. 8

1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ .......................... 9

1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ ................................................................ 9

1.2.2. Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thƣ ............................. 10

1.2.3. Các loại chỉ thị sinh học đối với ung thƣ gan ......................................... 11

1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƢ ................................................................ 13

1.3.1. Đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ .......................................................... 13

1.3.2. Kháng nguyên ung thƣ ............................................................................ 13

1.3.3. Chỉ thị ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch ................................... 14

1.4. NGHIÊN CỨU PROTEOMICS MIỄN DỊCH UNG THƢ GAN ................. 15

1.4.1. Khái quát về proteomics và ứng dụng của proteomics ........................... 15

1.4.2. Hệ protein gan ngƣời ............................................................................... 16

1.4.3. Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thƣ gan ...................................... 17

Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................ 24

2.1. NGUYÊN LIỆU ............................................................................................. 24

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................. 24

2.1.2. Hóa chất .................................................................................................. 24

2.1.3. Thiết bị .................................................................................................... 25

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 25

2.2.1. Xử lý mẫu mô gan ................................................................................... 25

2.2.2. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford .................................... 27

2.2.3. Điện di hai chiều ..................................................................................... 27

2.2.4. Western Blot............................................................................................ 28

2.2.5. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot ...... 29

2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều .............................. 30

2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein ................................................ 31

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................................................................. 33

3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN ...................................................... 33

3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU ...................... 34

3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều ................... 34

3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều ............... 36

3.3. NHẬN DẠNG PROTEIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP MALDI-TOF MS ...... 41

3.4. THẨM TÁCH MIỄN DỊCH - WESTERN BLOT HAI CHIỀU ................... 44

3.4.1. Xác định tỷ lệ pha loãng kháng thể bậc một thích hợp ........................... 44

3.4.2. Kết quả Western Blot hai chiều .............................................................. 46

3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT .... 47

3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis ................................. 50

3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể ................... 52

3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào .............................................................. 53

3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất............................................ 54

3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến .............. 55

3.5.6. Protein có phản ứng miễn dịch với huyết tƣơng ..................................... 56

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 60

KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 62

PHỤ LỤC .................................................................................................................... i

Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân ung thƣ tế bào gan ......................................... i

Phụ lục 2. Phân tách protein mô gan của 5 bệnh nhân HCC trên bản gel điện di

hai chiều ............................................................................................................. ii

Phụ lục 3. Kết quả nhận dạng protein bằng cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phần

mềm Mascot ...................................................................................................... vi

Phụ lục 4. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của 3 bệnh nhân HCC

......................................................................................................................... viii

a

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

α1AT Alpha-1-antitrypsin

ABC Ammonium bicarbonate

AcCN Acetonitrile

ACTB Beta-actin

AFP Alpha fetoprotein

AFB1 Aflatoxin B1

CATD Cathepsin D

CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid

CHCA α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid

cs Cộng sự

Da Dalton

DTT Dithiothreitol

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

(Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme)

GS Glutamine synthetase

HBV Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)

HBsAg Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm

gan B)

HCC Hepatocellular carcinoma (Ung thƣ tế bào biểu mô gan)

HCV Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)

HLPP Human Liver Proteome Project (Dự án Proteome gan ngƣời)

HPT Haptoglobin

HUPO Human Proteome Organisation (Tổ chức Proteome ngƣời)

HRP Horse - radish peroxidase

b

HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt)

IAA Iodoacetamide

IEF Isoelectric Focusing (Điện di phân vùng đẳng điện)

IPG Immobilized pH gradient (Gradient pH cố định)

LC-MS/MS Liquid Chromatography coupled with tandem Mass Spectrometry

(Sắc ký lỏng kết nối với khối phổ)

MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight

MFAP3 Microfibrillar-associated protein 3

MHC Mayjor Histocampatibility Complex

(Phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu)

MS Mass spectrometry (Khối phổ)

Mw Molecular weight (Khối lƣợng phân tử)

PBS Phosphate Buffer Saline (Đệm muối phosphate)

PCNA Proliferating cell nuclear antigen

PDIA1 Protein disulfide-isomerase

PDIA3 Protein disulfide-isomerase A3

PMF Peptide Mass Fingerprint (Đặc trƣng khối peptide)

PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride

PVDF Polyvinylidene fluoride

p53 Cellular tumor antigen p53

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(Điện di trên gel polyacrylamide có SDS)

SEREX Serological Analysis of Recombinant cDNA Expression Libraries

(Phân tích huyết thanh bằng thƣ viện biểu hiện cDNA tái tổ hợp)

SODC Superoxide dismutase [Cu-Zn]

c

SODM

Mn-SOD

Superoxide dismutase [Mn]

Manganese superoxide dismutase

Spot Điểm protein

ST7L Suppressor of tumorigenicity 7 protein-like

TAA Tumour Associated Antigen

(Kháng nguyên liên quan đến ung thƣ)

TAP Transporters of Antigen Peptide

(Phân tử vận chuyển peptide kháng nguyên)

TFA Trifluoroacetic acid

TNM Tumor Node Metastasis

(Kích thƣớc khối u - Hạch Lympho - Di căn)

TSA Tissue Specific Antigen (Kháng nguyên đặc hiệu mô)

TSTA Tumour Specific Transplantation Antigen

(Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thƣ)

d

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thƣ gan ........................................... 7

Bảng 2. Các chỉ thị ung thƣ gan mới đƣợc công bố (20 năm gần đây) .................... 12

Bảng 3. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 24

Bảng 4. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm ........... 28

Bảng 5. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều .......................................... 36

Bảng 6. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan

bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10 ...................... 39


bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7 .......................... 39

Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thƣ

so với mô gan bình thƣờng đƣợc xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL ................ 40

Bảng 9. Danh sách các protein đƣợc xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô

gan ung thƣ so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC ............................. 42

Bảng 10. Tóm tắt chức năng chính của các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan

ung thƣ so với mô gan đối chứng đã đƣơc nhận dạng .............................................. 48

e

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Ung thƣ gan xuất phát từ chính tế bào gan .................................................... 3

Hình 2. Cơ chế gây ung thƣ của các tác nhân ung thƣ gan ......................................... 5

Hình 3. Quy trình chiết protein từ mô gan ................................................................ 26

Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix . 30

Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thƣờng và

mô gan ung thƣ trên gel polyacrylamide 10% có SDS ............................................. 33

Hình 6. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều

................................................................................................................................... 35

Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều .................................. 37

Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thƣ so với bản

gel mô bình thƣờng ................................................................................................... 37

Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thƣ so với

mô gan bình thƣờng của bệnh nhân HCC mã 8935 .................................................. 38

Hình 10. Phân tích khối phổ các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân spot protein

C-256-B bằng trypsin ................................................................................................ 41

Hình 11. Phân tách protein chiết từ mô gan bệnh nhân HCC trên gel polyacrylamide

và màng PVDF chuẩn bị cho phản ứng Western Blot .............................................. 45

Hình 12. Kết quả phản ứng Western Blot khi ủ màng với dung dịch kháng thể bậc 1

có độ pha loãng khác nhau ........................................................................................ 45

Hình 13. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977 ........... 47

Hình 14. Tỷ lệ các nhóm protein tham gia vào các quá trình sinh học khác nhau ... 50

Hình 15. Sơ đồ nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC lớp I ............................ 58

LuËn v¨n cao häc Lª Lan Ph¬ng

1

MỞ ĐẦU

Ung thƣ gan hiện là một trong các loại ung thƣ phổ biến nhất trên thế giới và

Việt Nam, đây là bệnh ung thƣ có tỷ lệ tử vong cao, hơn nữa, tỷ lệ mắc bệnh đang có

xu hƣớng tăng lên. Theo thống kê năm 2008, ƣớc tính trên thế giới có khoảng

748.300 trƣờng hợp mắc ung thƣ gan và 695.900 ca tử vong do ung thƣ gan. Việt

Nam thuộc khu vực Đông Nam Á là nơi có tỷ lệ mắc ung thƣ gan cao nhất [18]. Theo

thống kê của bệnh viện K, nƣớc ta có tỷ lệ mắc ung thƣ gan nguyên phát cao do

nhiễm virus viêm gan B và virus viêm gan C [41]. Do đó, việc nghiên cứu về tác

nhân gây bệnh, cơ chế và phƣơng pháp chẩn đoán, phát hiện sớm ung thƣ gan có vai

trò quan trọng đối với việc giảm tỷ lệ mắc và giảm tỷ lệ tử vong ở loại ung thƣ này.

Hiện nay, các phƣơng pháp xét nghiệm lâm sàng nhƣ: sinh thiết gan, chụp

cắt lớp vi tính, siêu âm chẩn đoán hình ảnh và xác định các chỉ thị sinh học nhƣ

anpha fetoprotein là các “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán ung thƣ gan. Tuy nhiên,

các xét nghiệm này có nhiều hạn chế do chỉ phát hiện đƣợc bệnh vào giai đoạn

muộn làm giảm khả năng sống sót của bệnh nhân ung thƣ gan [38]. Nhu cầu đặt ra

là phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học mới giúp chẩn đoán, phát hiện ung thƣ gan ở

giai đoạn sớm.

Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu tìm

kiếm các chỉ thị ung thƣ gan sử dụng công cụ proteomics. Phần lớn các protein có

trong huyết tƣơng đều đƣợc tổng hợp từ gan. Mô gan của bệnh nhân ung thƣ gan

cũng có khả năng tổng hợp nhiều protein liên quan đến khối u. Do đó, các tín hiệu

protein trong mô gan có thể dùng làm công cụ để chẩn đoán sự tiến triển của bệnh

gan, phát triển chẩn đoán phân tử [29]. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu đã chứng minh

rằng các protein nội bào có liên quan đến quá trình hình thành khối u, kích thích đáp

ứng miễn dịch sinh ra các tự kháng thể [26] và nhiều kháng nguyên ung thƣ đã đƣợc

xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thƣ [27]. Vì thế, các tự kháng thể có thể đƣợc

dùng để chẩn đoán lâm sàng ung thƣ và dùng trong phân tích proteomics để nhận

dạng các kháng nguyên liên quan đến khối u có khả năng liên quan đến sự chuyển


2

dạng ác tính của tế bào. Đây là hƣớng nghiên cứu mới nhằm tìm kiếm các chỉ thị

sinh học ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch.

Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan”

nhằm mục đích:

- Tìm hiểu sự biểu hiện của các protein ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình

thƣờng của bệnh nhân ung thƣ gan thông qua các điểm protein trên bản gel điện di

hai chiều.

- Nhận dạng đƣợc một số protein khác biệt đặc trƣng giữa mô gan ung thƣ so

với mô gan bình thƣờng.

- Xác định đƣợc protein có phản ứng miễn dịch (kháng nguyên ung thƣ gan)

đặc hiệu với các kháng thể trong huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ gan.

Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc

Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trƣờng Đại học

Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.


3

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ GAN

Ung thƣ gan là một trong các dạng bệnh lý phổ biến nhất trên thế giới và tỷ

lệ tử vong do ung thƣ gan xếp hàng thứ ba trên tổng số các trƣờng hợp tử vong do

ung thƣ. Tại Mỹ, từ năm 2004 đến 2008, tỷ lệ mắc mới ung thƣ gan mỗi năm tăng

3,6% ở nam giới và 3% ở nữ giới, xu hƣớng này đã tồn tại từ năm 1992. Các nhà

nghiên cứu dự đoán trong năm 2012 sẽ có khoảng 28.720 trƣờng hợp mắc mới ung

thƣ gan, hơn 80% trong số đó là ung thƣ tế bào biểu mô gan [8].

Ung thƣ gan gồm hai dạng là ung thƣ gan nguyên phát và ung thƣ gan thứ

phát (di căn). Ung thƣ gan nguyên phát là ung thƣ xuất phát từ các loại tế bào gan

(hình 1). Ung thƣ gan thứ phát là do các tế bào ung thƣ của các cơ quan, bộ phận

khác trong cơ thể di chuyển theo dòng máu hoặc mạch bạch huyết tới gan và định

khu tại đây, hình thành khối u. Ung thƣ di căn gan không mang các đặc trƣng của

ung thƣ xuất phát từ gan, vì vậy, trong phạm vi luận văn này, chúng tôi chỉ đề cập

tới ung thƣ gan nguyên phát với dạng phổ biến nhất là ung thƣ tế bào biểu mô gan

(Hepatocellular Carcinoma - HCC) thƣờng gọi là ung thƣ gan [49].

Hình 1. Ung thƣ gan xuất phát từ chính tế bào gan [49]

1.1.1. Phân loại ung thƣ gan nguyên phát

Dựa vào phân loại mô bệnh học và loại tế bào phát sinh ung thƣ, ung thƣ gan

nguyên phát đƣợc phân thành các loại chính nhƣ sau [42]:


4

- Ung thƣ tế bào biểu mô gan là dạng ung thƣ biểu mô hay gặp nhất trong ung

thƣ gan. Ung thƣ bắt nguồn từ các tế bào biểu mô, đây là loại tế bào gan chủ yếu, do

đó, HCC chiếm 85 - 95% các trƣờng hợp ung thƣ gan nguyên phát [32].

- Ung thƣ tế bào ống mật, đây là dạng ung thƣ bắt đầu ở các đƣờng mật nhỏ

trong gan. Dạng ung thƣ này chỉ chiếm khoảng 5 - 15% [32]. Nguy cơ mắc dạng

ung thƣ này sẽ tăng cao khi bệnh nhân bị sỏi mật, loét đƣờng tiêu hóa hay nhiễm

các dạng ký sinh trùng trong gan.

- Ung thƣ biểu mô hỗn hợp, đây là dạng ung thƣ hiếm gặp, tế bào ung thƣ gồm

cả tế bào biểu mô gan và tế bào ống mật.

- U nguyên bào gan là loại u gan ác tính ở trẻ em, hiếm gặp ở ngƣời lớn. U

nguyên bào gan xuất hiện có thể do các gene hoạt động bất thƣờng.

- Ung thƣ tế bào mạch là loại ung thƣ rất hiếm gặp, nó bắt nguồn từ mạch máu

trong gan do gan tiếp xúc với các hóa chất công nghiệp nhƣ vinyl chlorid hoặc các

hóa chất gây ung thƣ.

1.1.2. Nguyên nhân dẫn tới ung thƣ gan

Mặc dù vẫn còn nhiều tranh cãi về cơ chế chính xác dẫn đến ung thƣ gan,

song các nghiên cứu đều chỉ ra rằng tác nhân gây ung thƣ là đa nhân tố và quá trình

tiến triển thành ung thƣ rất phức tạp, phải trải qua nhiều bƣớc [39]. Các yếu tố nguy

cơ chính có thể tiến triển thành HCC bao gồm: các tác nhân gây bệnh nhƣ nhiễm

virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV), virus viêm gan C (Hepatitis C virus -

HCV) dẫn tới viêm gan mạn tính; xơ gan; các loại hóa chất nhƣ: rƣợu, aflatoxin B1,

vinyl chlorid, asen hoặc các rối loạn trao đổi chất nhƣ nhiễm sắt ở mô, bệnh thiếu

hụt α1 - antitrypsin [38]. Tuy rằng, các yếu tố nguy cơ có thể tác động đến tế bào

gan theo các con đƣờng khác nhau nhƣng cuối cùng đều làm biến đổi di truyền và

dẫn đến hình thành tế bào ung thƣ (hình 2).


5

Hình 2. Cơ chế gây ung thƣ của các tác nhân ung thƣ gan [13]

Theo số liệu hồi cứu năm 2006 của Wong và cộng sự (cs) cho thấy, nhiễm

HBV mạn tính đƣợc xem nhƣ là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến HCC. Các bệnh nhân

có phản ứng dƣơng tính với kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg) có

nguy cơ phát triển thành HCC cao gấp 70 lần so với ngƣời có phản ứng âm tính

HBsAg. Nhiễm HBV là một bệnh phổ biến ở các nƣớc Đông Nam Á, Trung Quốc,

Đài Loan, Hàn Quốc, Châu Phi, tại những vùng này có tới 85% - 95% bệnh nhân

HCC dƣơng tính với HBsAg. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng việc HBV chèn

DNA của mình vào hệ gene ngƣời bệnh sẽ làm mất tính ổn định của nhiễm sắc thể,

hoạt hóa các gene gây ung thƣ hoặc gây bất hoạt các gene ức chế khối u nhƣ TP53.

Ngoài ra, các sản phẩm protein của HBV có thể gây rối loạn chu trình tế bào, tạo

điều kiện cho sự tiến triển của các tác nhân gây ung thƣ, đồng thời hoạt hóa các yếu

tố phiên mã và promoter của các gene cần thiết cho hoạt động sống của virus [38].

Nhiễm virus viêm gan C mạn tính cũng là một yếu tố nguy cơ dẫn đến ung

thƣ gan. Ở các nƣớc phát triển nhƣ Nhật Bản, Ý, Pháp và một số nƣớc thuộc Nam

Âu, tỷ lệ bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử viêm gan C chiếm đa số [14]. Các nhà


6

nghiên cứu đã phát hiện ra rằng protein lõi của HCV có thể tác động tới quá trình

sinh trƣởng tế bào bằng cách kìm hãm hoạt động phiên mã của promoter p53 [38].

Đồng nhiễm HCV và HBV làm tăng nguy cơ mắc ung thƣ gan từ 2 đến 6 lần so với

nhiễm độc lập một loại virus.

Aflatoxin là những chất gây ung thƣ có độc tính cao đƣợc hình thành khi

thực phẩm và nƣớc bị nhiễm nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Ở

các nƣớc đang phát triển thuộc Châu Phi hay một số nơi ở Châu Á, ngƣời dân ăn

các thực phẩm nhiễm aflatoxin thì nguy cơ mắc ung thƣ gan cũng tăng. Aflatoxin có

thể trực tiếp làm tổn thƣơng gene TP53 gây bất hoạt protein p53. Đồng nhiễm

aflatoxin B1 (AFB1) và HBVsẽ gây ra biến đổi p53 ở gốc serine 249. HBV làm hoạt

hóa các cytochrome P450 gây bất hoạt quá trình trao đổi AFB1 tạo ra chất gây đột

biến là AFB1-8,9-epoxide và các hợp chất chứa oxy có khả năng hoạt động hóa học

mạnh làm tế bào mẫn cảm với AFB1 [14].

Ngoài ra, các yếu tố khác nhƣ tuổi, giới tính và chủng tộc cũng góp phần làm

tăng nguy cơ bị ung thƣ gan. Nam giới có nguy cơ bị ung thƣ gan cao hơn nữ giới

từ hai đến ba lần. Một số nghiên cứu về nội tiết đã chỉ ra rằng, thụ thể hormone giới

tính có biểu hiện thay đổi trong khối u HCC [29]. Kết quả điều tra dân số Mỹ cho

thấy những ngƣời gốc Châu Á có tỷ lệ ung thƣ cao nhất, ngƣời Mỹ da đen cũng có

tỷ lệ mắc ung thƣ cao hơn so với ngƣời da trắng.

Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê tại bệnh viện Việt Đức trong năm 2008,

số bệnh nhân nam mắc u gan cao gấp 3 lần so với bệnh nhân nữ; số bệnh nhân bị u

gan có phản ứng dƣơng tính với HBsAg chiếm 65,9% tổng số bệnh nhân u gan;

bệnh nhân u gan trong độ tuổi từ 20 đến 60 tuổi chiếm 73,88%, bệnh nhân u gan

thuộc nhóm tuổi dƣới 20 và trên 60 tuổi chỉ chiếm 26,12% [tài liệu chƣa công bố].

1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ gan

Căn cứ theo Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng Quốc tế bệnh ung thư (năm 1993),

thông qua các chẩn đoán lâm sàng, sử dụng kỹ thuật hình ảnh để xác định kích cỡ

khối u nguyên phát và tình trạng bị xâm lấn các mạch máu, các giai đoạn của ung


7

thƣ gan đƣợc mô tả ở bảng 1 [45, 32]. Ngoài cách phân giai đoạn theo kích thƣớc u,

hạch lympho, di căn (Tumor Node Metastasis - TNM), ung thƣ gan còn đƣợc phân

loại thành 4 giai đoạn, gồm: giai đoạn I, II, IIIA/B/C và giai đoạn IV [32].

Bảng 1. Tiêu chuẩn phân kỳ lâm sàng bệnh ung thƣ gan [32]

Phân loại TNM T N Giai đoạn

T1 - Có 1 khối u không xâm

lấn đến mạch máu xung quanh.

N0 - Không có hạch di căn.

M0 - Không có sự di căn tới

vùng xa.

Giai đoạn I

T1, N0, M0

T2 - Một khối u đã xâm lấn

mạch máu hoặc nhiều khối u

trên một lá gan, đƣờng kính u

không quá 5cm.

Giai đoạn II

T2, N0, M0

T3 - Có nhiều khối u đƣờng

kính lớn hơn 5cm hoặc một

khối u xâm lấn đến tĩnh mạch

cửa hoặc phân nhánh chính của

tĩnh mạch cửa gan.

Giai đoạn IIIA

T3, N0, M0

T4 - Một hoặc nhiều khối u

xâm lấn trực tiếp tới các cơ

quan khác hoặc làm thủng phúc

mạc tạng.

N1 - Có hạch bạch huyết di căn

Giai đoạn IIIB

T4, N0, M0

Giai đoạn IIIC

T bất kỳ

N1, M0

M1 - Có di căn tới vùng xa

Giai đoạn IV

T bất kỳ

N bất kỳ

M1


8

1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ gan

Gan đƣợc cấu tạo chủ yếu bởi các tế bào biểu mô gan, loại tế bào này có khả

năng tái sinh mạnh nhờ phân bào liên tục, do đó, ung thƣ gan phát triển rất nhanh,

kích thƣớc gan có thể tăng gấp đôi sau 4 tháng. Các triệu chứng của HCC thƣờng

bộc lộ khi bệnh đã nghiêm trọng và khối u đã lớn, vì vậy, việc phát hiện HCC vào

giai đoạn muộn gây khó khăn trong việc điều trị, đây chính là lý do dẫn đến tỷ lệ tử

vong do HCC rất cao, chiếm khoảng 70% các trƣờng hợp tử vong do ung thƣ trên

toàn thế giới [14].

Hiện nay, phát hiện HCC chủ yếu dựa vào việc xét nghiệm máu để định

lƣợng alpha fetoprotein (AFP) trong huyết thanh. AFP là một glycoprotein có khối

lƣợng 70kDa, đƣợc tổng hợp ở gan và túi noãn hoàng của thai, sau đó đƣợc tiết vào

huyết thanh ở tuần thứ 13 của thai kỳ. Sau khi sinh, nồng độ AFP trong huyết thanh

giảm và ở ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh chỉ còn 3 - 5ng/ml, rất khó để phát hiện

đƣợc ở ngƣời trƣởng thành. AFP có thể đƣợc dùng để sàng lọc ngƣời có nguy cơ bị

ung thƣ gan cao [39]. Tuy vậy, AFP trong máu không đặc trƣng cho ung thƣ gan vì

nồng độ AFP có thể cũng tăng trong một số trƣờng hợp khác: thai nghén bình

thƣờng, viêm gan ở giai đoạn phục hồi, viêm gan mạn tính, ung thƣ tế bào mầm nhƣ

ung thƣ tinh hoàn hay mắc một số dạng ung thƣ khác nhƣ ung thƣ dạ dày, ung thƣ

đƣờng mật [5]. Xét nghiệm AFP cũng không nhạy bởi có khoảng 15% - 30% bệnh

nhân ung thƣ gan mà hàm lƣợng AFP vẫn không tăng [39], nhất là đối với các khối

u gan nhỏ hơn 3cm.

Hàm lƣợng AFP cao có thể nghĩ đến ung thƣ gan nhƣng không thể là yếu tố

quyết định chắc chắn. Vì thế, để chẩn đoán ung thƣ gan cần kết hợp xét nghiệm định

lƣợng AFP và chẩn đoán hình ảnh bằng siêu âm, chụp cắt lớp vi tính hay chụp cộng

hƣởng từ để có thể thấy đƣợc hình dạng, kích thƣớc và kết cấu của khối u, nhƣng để

chẩn đoán chính xác u lành tính hay ác tính thì nhất thiết phải sinh thiết gan. Tuy

nhiên, sinh thiết gan gây nguy cơ chảy máu cao, dò dịch mật, vết bầm máu và nhiễm

khuẩn có thể xảy ra, đồng thời tăng nguy cơ biến u lành tính chuyển dạng thành ác


9

tính và thúc đẩy di căn [50]. Do đó, cần tìm kiếm các chỉ thị sinh học có độ nhạy và

độ đặc hiệu cao hơn để hỗ trợ cho AFP giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan [26].

1.2. NGHIÊN CỨU CHỈ THỊ SINH HỌC ĐỐI VỚI UNG THƢ

Chỉ thị sinh học là các phân tử đƣợc tìm thấy trong máu, các loại dịch của cơ

thể hoặc trong mô đặc trƣng cho một quá trình sinh lý hoặc các giai đoạn bệnh lý.

Chỉ thị sinh học có thể đƣợc dùng để xem xét đáp ứng của cơ thể đối với một phác

đồ điều trị bệnh hoặc một trạng thái nhất định [46].

1.2.1. Chỉ thị sinh học đối với ung thƣ

Ngày nay, chỉ thị sinh học là một trong những công cụ quan trọng nhất để

phát hiện sớm ung thƣ, xác định chính xác sự tiến triển của bệnh, tiên lƣợng và theo

dõi điều trị ung thƣ nhằm kéo dài thời gian sống, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân

ung thƣ. Các chỉ thị ung thƣ là những đại phân tử xuất hiện ở một bệnh ung thƣ, có

nồng độ thay đổi theo chiều hƣớng tăng lên liên quan đến sự phát sinh và tăng

trƣởng của những khối u ác tính. Chỉ thị ung thƣ là những chất do các tế bào hoặc

mô ung thƣ tổng hợp và tiết ra từ khối u bị phá vỡ hoặc đƣợc tạo ra từ các phản ứng

của cơ thể đối với khối u, gồm hai dạng: chỉ thị tế bào và chỉ thị thể dịch. Chỉ thị

ung thƣ dạng tế bào bao gồm: các kháng nguyên bề mặt các tế bào, các thụ thể

hormone và thụ thể yếu tố tăng trƣởng, những biến đổi di truyền (biến đổi gene) của

tế bào. Chỉ thị ung thƣ dạng thể dịch bao gồm: các chất đƣợc phát hiện ở những

nồng độ không bình thƣờng có mặt trong huyết thanh, nƣớc tiểu, các loại dịch của

cơ thể [3].

Dựa vào khả năng đặc hiệu với bệnh, chỉ thị ung thƣ có thể đƣợc phân loại

và đánh giá theo các tiêu chí sau [3]:

- Đặc hiệu cao: chỉ thị ung thƣ không tìm thấy ở đối tƣợng khỏe mạnh hoặc u

lành tính.

- Độ nhạy cao: chỉ thị ung thƣ dễ phát hiện ở giai đoạn sớm khi chỉ có một tế

bào ung thƣ xuất hiện.


10

- Đặc hiệu cơ quan: chỉ xuất hiện ở cơ quan bị ung thƣ.

- Xuất hiện tƣơng quan với giai đoạn ung thƣ và kích thƣớc khối u.

- Tƣơng quan với tiên lƣợng về thời gian sống.

- Có giá trị dự báo.

Đối với ung thƣ gan, chỉ thị ung thƣ đƣợc ứng dụng theo hai hƣớng chính

sau [29]:

- Sàng lọc các nhóm nguy cơ cao để xác định đƣợc ung thƣ khi kích thƣớc

khối u còn nhỏ (< 3cm) để có liệu pháp điều trị hiệu quả.

- Xác nhận chẩn đoán ung thƣ ở những bệnh nhân có khối u lớn đã đƣợc phát

hiện nhờ chụp X quang.

1.2.2. Tiếp cận nghiên cứu chỉ thị sinh học đối với ung thƣ

Hiện nay, có ba cách tiếp cận đang đƣợc áp dụng rộng rãi để nghiên cứu các

chỉ thị sinh học phục vụ cho việc chẩn đoán phân tử, phát hiện sớm ung thƣ [17].

- Sử dụng các kỹ thuật genomics để xác định, nhận dạng các gene lạ có liên

quan đến các loại ung thƣ riêng biệt. Tuy nhiên, kết quả của các nghiên cứu này mới

chỉ cung cấp thông tin về khả năng mắc bệnh chứ không thể biết đƣợc nguy cơ thực

sự của bệnh.

- Phƣơng pháp proteomics xác định đƣợc hầu hết các protein có triển vọng trở

thành các protein chỉ thị ung thƣ. Các kỹ thuật proteomics có thể xác định chính xác

đặc điểm bệnh học phân tử của khối u, tiên lƣợng bệnh, dự đoán đƣợc các ảnh

hƣởng của việc điều trị và giúp phát triển lĩnh vực y học cá nhân. Hạn chế của

phƣơng pháp này là một số protein chỉ thị ung thƣ chỉ đƣợc tìm thấy ở trong mô ung

thƣ mà không có mặt trong máu.

- Sử dụng các hệ thống dò tìm dựa vào kháng thể để nhận dạng các kháng

nguyên ung thƣ. Song do có hiện tƣợng phản ứng chéo trong phản ứng miễn dịch,

do đó, kết quả của phƣơng pháp này không đảm bảo tính đặc hiệu.


11

Sự kết hợp các phƣơng pháp trên sẽ làm tăng độ tin cậy cho các chỉ thị phân

tử, tăng tính chính xác khi chẩn đoán bệnh. Kỹ thuật proteomics ở đây có vai trò rất

quan trọng, bổ sung cho kỹ thuật genomics và dò tìm kháng thể để nhận dạng kháng

nguyên khối u. Kỹ thuật này đã đƣợc áp dụng rộng rãi để nghiên cứu chỉ thị phân tử

của nhiều dạng ung thƣ khác nhau [17]. Sự phát triển của các kỹ thuật genomics,

proteomics giúp chúng ta mở rộng hiểu biết về bản chất sinh học của ung thƣ; ngày

càng phát hiện và sử dụng đƣợc nhiều phân tử chỉ thị với độ nhạy và tính đặc hiệu

cao trong chẩn đoán lâm sàng.

1.2.3. Các loại chỉ thị sinh học đối với ung thƣ gan

Đối với nghiên cứu ung thƣ gan, các phƣơng pháp trên đều đã đƣợc áp dụng

để tìm ra các chỉ thị phân tử, bao gồm cả DNA và protein, đặc biệt là các kháng thể

đặc hiệu. Một trong những hƣớng nghiên cứu quan trọng nhất là phân tích tìm ra

các chỉ thị phân tử để nhận dạng kiểu hình ác tính của tế bào. Các phân tử chỉ thị

này bao gồm: các phân tử tham gia vào quá trình tăng sinh tế bào, gây biến đổi

DNA; gene TP53; các protein khác tham gia điều khiển chu trình tế bào; các gene

gây ung thƣ và các thụ thể của chúng; các yếu tố liên quan đến sự chết theo chƣơng

trình của tế bào và sự hoạt động của telomerase. Một hƣớng nghiên cứu khác là tìm

ra các chỉ thị phân tử liên quan đến quá trình xâm lấn và di căn của ung thƣ, các chỉ

thị phân tử loại này gồm các phân tử bám dính (Adhesion), các enzyme thủy phân

protein làm giảm chất gian bào, các yếu tố sinh trƣởng tham gia vào sự hình thành

mạch giúp khối u phá vỡ vỏ bọc, di căn đến các vị trí khác trong cơ thể...[31].

Cho đến nay, ngoài AFP đã đƣợc xác định có giá trị, có nhiều chỉ thị sinh

học khác đã đƣợc nghiên cứu để chẩn đoán HCC. Trong một nghiên cứu tổng quan

về chỉ thị ung thƣ gan, tác giả Hoàng Văn Sơn (2011) đã liệt kê một số chỉ thị ung

thƣ gan đang đƣợc nghiên cứu (bảng 2). Đa số các chỉ thị mới này vẫn đang đƣợc

nghiên cứu lâm sàng, trong đó, chỉ thị huyết thanh AFP-L3, des-gamma-carboxy-

prothrombin (DCP), glypican-3 (GPC-3) có nhiều hứa hẹn [5].


12

Bảng 2. Các chỉ thị ung thƣ gan mới đƣợc công bố (20 năm gần đây) [5]

Loại STT Tên chỉ thị sinh học Năm công bố

Chỉ thị trong

huyết thanh

1 AFP gắn LCA 1991

2 AFP gắn Lectin L3 1993

3 AFP gắn concanavalin 1995

4 DCP 1997

5 Methyl hóa gene P16 1999

6 Telomerase 2000

7 Transforming Growth Factor β1 2002

8 AFP monosialyl 2002

9 Insulin-like growth Factor II 2003

10 Glutamate carboxypeptidase 2003

11 NH2 Fragment GPC-3 2004

12 Telomerase reverse transcriptase mARN 2007

13 Interleukin-6 2009

Chỉ thị ở mô

14 Glypican-3 2009

15 Heat shock protein 70 2009

16 Glutamin synthetase 2009

Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã công bố

nhiều chỉ thị ung thƣ nhằm phát hiện sớm, sàng lọc, chẩn đoán chính xác và theo

dõi điều trị HCC. Đa số các chỉ thị mới này hiện vẫn đang đƣợc nghiên cứu trên lâm

sàng. Do đó, hƣớng nghiên cứu chỉ thị sinh học ung thƣ gan vẫn đang đƣợc triển

khai và tiếp tục phát triển. Hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung theo hƣớng

nghiên cứu tìm kiếm các protein kháng nguyên liên quan đến khối u, các protein

này kích thích sinh ra kháng thể trong huyết thanh, đây cũng là các dạng chỉ thị ung

thƣ tiềm năng.


13

1.3. MIỄN DỊCH CHỐNG UNG THƢ

1.3.1. Đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ

Khi nghiên cứu ung thƣ thực nghiệm, có nhiều bằng chứng thể hiện có sự

kiểm soát của hệ thống miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên ung thƣ. Mặc

dù, một số ung thƣ có thể lẩn tránh khỏi sự kiểm soát của hệ thống miễn dịch bằng

nhiều cơ chế nhƣ dung nạp, kháng thể phong bế, gây suy giảm miễn dịch, nhƣng

phần lớn ung thƣ có đáp ứng miễn dịch [7].

Các tế bào ung thƣ có thể bị phân hủy bởi các tế bào tham gia đáp ứng miễn

dịch không đặc hiệu, gồm: đại thực bào, tế bào giết tự nhiên và bạch cầu ƣa axít.

Đáp ứng miễn dịch loại này không cần có kháng thể hay kháng nguyên đặc hiệu.

Trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống ung thƣ, vai trò của đáp ứng miễn dịch

dịch thể không rõ bằng đáp ứng miễn dịch tế bào, song các nghiên cứu cũng chứng

minh đƣợc sự có mặt của các kháng thể đặc hiệu trong ung thƣ. Nhiều nghiên cứu

ung thƣ ở động vật thực nghiệm đã chứng minh vai trò của tế bào T độc (Tc) trong

phân hủy tế bào khối u khi đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tế bào. Quá trình này đòi hỏi

phải hoạt hóa tế bào TCD8+ bởi các tế bào trình diện kháng nguyên có mang MHC

lớp I và các cytokin tƣơng ứng (Interleukin-2, Interleukin-4) [7].

1.3.2. Kháng nguyên ung thƣ

Khi tế bào bình thƣờng chuyển dạng thành tế bào ung thƣ, quá trình này làm

xuất hiện các protein mà tế bào bình thƣờng không có hoặc có rất ít. Các protein

này là các kháng nguyên ung thƣ và “lạ” đối với cơ thể và trở thành đích của các tế

bào đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Dƣới đây là một vài

loại kháng nguyên ung thƣ [7]:

- Kháng nguyên ghép đặc hiệu ung thƣ (Tumour specific transplantation

antigen - TSTA), kháng nguyên này đƣợc phát hiện khi ghép các mảnh ung thƣ. Khi

đó, TSTA sẽ kích thích cơ thể nhận sinh đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ ghép.

Đặc điểm TSTA của ung thƣ do hóa chất hoặc tia xạ là tính đặc hiệu kháng nguyên

phụ thuộc vào mô ung thƣ, chứ không phụ thuộc vào hóa chất gây ung thƣ. Ngƣợc


14

lại, TSTA của ung thƣ do virus gây ra có tính đặc hiệu phụ thuộc vào chủng virus,

không phụ thuộc vào mô ung thƣ. Tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống

TSTA chỉ mới đƣợc xác định trong thực nghiệm ghép ung thƣ.

- Kháng nguyên đặc hiệu mô (Tissue specific antigen - TSA) là kháng nguyên

có trên bề mặt các tế bào bình thƣờng và có đặc tính riêng cho từng loại tổ chức.

Ung thƣ xuất hiện từ mô nào thƣờng biểu hiện kháng nguyên đặc hiệu ở mô đó.

TSA không kích thích đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ, song nó có thể sử dụng

làm đích cho miễn dịch điều trị và làm chỉ thị tìm nguồn gốc xuất phát mô ung thƣ.

- Kháng nguyên liên quan đến ung thƣ (Tumour associated antigen - TAA) là

kháng nguyên phát hiện đƣợc trong các loại ung thƣ mà không có hoặc có rất ít

trong tế bào mô bình thƣờng. Ở ngƣời, kháng nguyên này đƣợc xác định bằng các

kháng thể đơn dòng [7].

TAA là các peptide hay protein đặc hiệu khối u, chúng có thể biểu hiện tăng

hoặc giảm bất thƣờng, bị đột biến hay cuộn gấp sai gây ra đáp ứng miễn dịch ung

thƣ. Vì vậy, nghiên cứu nhằm tìm ra các chỉ thị ung thƣ là các TAA giúp chẩn đoán

sớm ung thƣ có vai trò quan trọng. Nhiều chỉ thị sinh học là các TAA đã đƣợc xác

định, nhƣ kháng nguyên ung thƣ phôi thai (Carcino embryonic antigen - CEA) đặc

trƣng cho ung thƣ ruột kết, protein AFP đặc trƣng cho ung thƣ gan, CA19-9 cho

ung thƣ dạ dày - ruột và CA-125 cho ung thƣ buồng trứng [34].

1.3.3. Chỉ thị ung thƣ liên quan đến đáp ứng miễn dịch

Hiện nay, các nghiên cứu xác định chỉ thị sinh học ung thƣ đang đƣợc tiến

hành theo hai hƣớng: hƣớng thứ nhất là xác định tự kháng thể trong huyết thanh của

bệnh nhân ung thƣ bắt nguồn từ những kháng nguyên ung thƣ. Hƣớng thứ hai là xác

định sớm ung thƣ dựa vào việc phát hiện ra các kháng nguyên liên quan đến khối u.

Khi tế bào bình thƣờng chuyển dạng ác tính thành tế bào ung thƣ, trong khối

u xuất hiện các protein biểu hiện bất thƣờng, bị đột biến hoặc biến đổi sau dịch mã,

đây chính là các kháng nguyên liên quan đến ung thƣ. Nhiều nghiên cứu đã chứng

minh các TAA gây ra đáp ứng miễn dịch sinh ra các kháng thể kháng TAA trong


15

huyết tƣơng và một số TAA đã đƣợc xác định trong cơ thể bệnh nhân ung thƣ [27].

Hơn nữa, tế bào ung thƣ cũng giải phóng nhiều protein vào máu. Do đó, hƣớng

nghiên cứu chẩn đoán sớm ung thƣ dựa vào xét nghiệm máu, huyết tƣơng của bệnh

nhân ung thƣ để xác định TAA đang rất đƣợc quan tâm.

Bên cạnh đó, trong quá trình đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ, trong huyết

thanh của bệnh nhân ung thƣ có xuất hiện các tự kháng thể đặc hiệu chống lại các

kháng nguyên của chính cơ thể. Các tự kháng thể này mang nhiều đặc điểm ƣu việt

khiến chúng trở thành những chỉ thị phân tử giúp phát hiện ung thƣ ở giai đoạn

sớm: (a) đƣợc xác định ở giai đoạn sớm của bệnh do phản ứng miễn dịch giữa các

tự kháng thể và các TAA xảy ra ở giai đoạn đầu của quá trình hình thành khối u,

chúng là kết quả của quá trình khuếch đại qua hệ miễn dịch của con ngƣời; (b) có

khả năng kháng lại quá trình phân giải protein và tránh đƣợc sự chuyển hóa phân tử.

Do đó, đời sống của chúng kéo dài khoảng 21 ngày; (c) các tự kháng thể có mặt

trong huyết thanh của bệnh nhân, nên có thể đƣợc xác định, phân tích bằng các kỹ

thuật đơn giản nhờ các xét nghiệm máu [28].

1.4. NGHIÊN CỨU PROTEOMICS MIỄN DỊCH UNG THƢ GAN

1.4.1. Khái quát về proteomics và ứng dụng của proteomics

Proteomics là một lĩnh vực khoa học nghiên cứu về proteome - sản phẩm của

genome hay chính là tập hợp các protein đƣợc biểu hiện trong tế bào, mô hoặc cơ thể

ở những điều kiện và tại thời điểm xác định [23].

Mục đích của nghiên cứu proteomics là nhận diện đƣợc tất cả các protein

đƣợc mã hóa trong hệ gene của sinh vật và xác định: (a) phạm vi và phƣơng thức

biểu hiện, hoạt động của hệ protein ở các kiểu tế bào và loại mô khác nhau; (b) sự

phân bố ở dƣới mức tế bào; (c) những cải biến sau dịch mã; (d) mối tƣơng tác với

những protein và thành phần khác; (e) mối quan hệ cấu trúc - chức năng... Ngoài ra,

nghiên cứu proteomics cũng cung cấp những hiểu biết tổng thể về sự biểu hiện của

các protein ở những trạng thái sinh lý, phát triển và bệnh lý khác nhau [2].


16

Do đó, proteomics bao gồm những nghiên cứu có tính hệ thống nhằm cung

cấp những kiến thức tổng quan về cấu trúc, chức năng của protein và vai trò của

chúng trong điều hòa hoạt động của các hệ sinh học. Các kết quả nghiên cứu

proteomics sẽ bổ trợ cho kết quả giải trình tự gene từ các nghiên cứu genomics và

nghiên cứu genomics chức năng. Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóng

vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu Sinh - Y học, là nền tảng cho sự phát triển

trong chẩn đoán và chữa bệnh trong tƣơng lai.

Sử dụng các công cụ proteomics trong nghiên cứu bệnh học, proteomics lâm

sàng đã thu đƣợc nhiều kết quả theo ba hƣớng nghiên cứu chính sau [4]:

- Nghiên cứu cơ chế phát sinh bệnh ở mức độ phân tử.

- Tìm ra các chỉ thị sinh học mới góp phần sàng lọc, chẩn đoán sớm và theo

dõi tiến triển của bệnh.

- Nghiên cứu các đích tác dụng của thuốc điều trị, qua đó tìm ra các thuốc có

tác dụng tối ƣu, phát triển hƣớng nghiên cứu y học cá nhân, tức là sử dụng

biện pháp điều trị thích hợp cho từng ngƣời.

Tới nay, proteomics lâm sàng đã đƣợc phát triển nhanh và hiệu quả nhất trong

nghiên cứu về ung thƣ. Các nghiên cứu proteomics đã phát hiện ra nhiều chỉ thị ung

thƣ mới, có giá trị hơn, các chỉ thị mới này hỗ trợ cho các chỉ thị đang đƣợc sử dụng

làm tăng độ đặc hiệu và chính xác lên rõ rệt trong chẩn đoán sớm ung thƣ [4].

1.4.2. Hệ protein gan ngƣời

Gan là cơ quan lớn nhất trong cơ thể ngƣời, chỉ đứng thứ hai sau não về mức

độ phức tạp. Gan có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa, trao đổi chất, thanh

lọc độc tố và cũng là nơi sản sinh ra nhiều loại protein nhất. Các protein đƣợc tạo ra

từ tế bào gan thực hiện hàng ngàn phản ứng sinh hóa phức tạp.

Tại hội thảo khoa học của Tổ chức Proteome ngƣời (Human Proteome

Organisation - HUPO) diễn ra ngày 28-29/04/2002 ở Bethesda (Hoa Kỳ), đã đánh

dấu cho sự ra đời của dự án Proteome gan ngƣời (Human Liver Proteome Project -


17

HLPP). Đây là dự án lớn thứ 3 của tổ chức HUPO có mục đích nghiên cứu là: xây

dựng bản đồ protein toàn diện của gan ngƣời, nhận dạng sự biểu hiện của protein,

những cải biến sau dịch mã, thiết lập bản đồ tƣơng tác protein - protein, tiếp cận

theo hƣớng proteomics để tìm hiểu về trạng thái sinh lý, bệnh lý trong gan từ đó

giúp phát triển các chỉ thị chẩn đoán và điều trị các bệnh về gan, thành lập ngân

hàng dữ liệu HLPP [47].

Dự án HLPP đƣợc triển khai với tiến độ nghiên cứu nhanh và đã thu đƣợc

nhiều kết quả đáng kể. Trong 5 năm qua, các nhà khoa học của dự án đã thiết lập

quy trình thao tác chuẩn, tối ƣu hóa kỹ thuật phân tích proteomics và khảo sát thành

công hệ protein mô gan phôi thai và mô gan ngƣời trƣởng thành. Dự án đã thực hiện

đƣợc mục tiêu ban đầu đề ra là xác định đƣợc 5000 protein gan, 5500 khung đọc mở

của các gene biểu hiện ở gan ngƣời đƣợc lƣu giữ trong ngân hàng khung đọc mở.

Bên cạnh đó, một hệ thống hơn 1000 tƣơng tác giữa protein - protein ở gan ngƣời

đƣợc tìm thấy và miêu tả. Những thay đổi về proteomics trong mô gan và huyết

tƣơng đã đƣợc nghiên cứu và so sánh trong quá trình tiến triển của các bệnh về gan,

từ mô gan bình thƣờng tới viêm gan, xơ gan, ung thƣ gan và ung thƣ gan di căn. Từ

những nghiên cứu đó, 10 chỉ thị sinh học tiềm năng cho các bệnh về gan đƣợc tìm

ra và đƣợc khẳng định tính hiệu quả của chúng trong chẩn đoán các bệnh về gan.

Đặc biệt, dự án đã xây dựng và công bố 3 cơ sở dữ liệu về gan: Liverbase, dbLEP,

LiverMap nhằm cung cấp thông tin về đặc điểm protein biểu hiện trong gan, định vị

protein, mô tả tƣơng tác của protein và quá trình hoạt động chức năng của protein

trong gan [47].

1.4.3. Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thƣ gan

Ung thƣ có thể coi là bệnh về hệ protein, bởi chính những đột biến di truyền

làm sai lệch quá trình truyền tín hiệu, làm tế bào sai hỏng không bị loại bỏ, đồng

thời khiến tế bào tăng sinh không kiểm soát đƣợc. Hiện nay, đa số các chỉ thị ung

thƣ đang đƣợc sử dụng là kết quả nghiên cứu về protein, vì protein là sản phẩm cuối

cùng của gene và tác động trực tiếp đến các quá trình sinh học. Hơn nữa, protein là


18

thành phần phong phú nhất của tế bào. Do đó, các nhà khoa học đang tập trung ứng

dụng kỹ thuật proteomics trong nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị ung thƣ là các

protein nhằm chẩn đoán sớm ung thƣ.

Proteomics ung thƣ là ứng dụng kỹ thuật proteomics để xác định sự thay đổi

định tính và định lƣợng của protein đƣợc tìm thấy trong mô hoặc các dịch cơ thể

của ngƣời bị ung thƣ, so sánh với ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh nhằm giúp cho

việc chẩn đoán ung thƣ, tiên lƣợng và điều trị có hiệu quả hơn [15].

Proteomics miễn dịch là một khái niệm tƣơng đối mới trong lĩnh vực nghiên

cứu proteomics. Proteomics miễn dịch nghiên cứu về tập hợp các protein tham gia

đáp ứng miễn dịch [35]. Trong quá trình đáp ứng miễn dịch chống ung thƣ, trong

huyết thanh của bệnh nhân ung thƣ có xuất hiện các tự kháng thể đặc hiệu chống lại

các kháng nguyên ung thƣ của chính cơ thể. Đây chính là đối tƣợng nghiên cứu của

proteomics miễn dịch ung thƣ.

Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics miễn dịch trên dòng tế bào ung thƣ,

mô hình động vật, phân tích trực tiếp trên huyết tƣơng và mô gan của bệnh nhân

ung thƣ gan đã và đang đƣợc tiến hành rộng khắp trên toàn thế giới và đã thu đƣợc

nhiều kết quả khả quan [15].

Để xác định các tự kháng thể có tiềm năng làm chỉ thị phân tử trong chẩn

đoán HCC, năm 2006, Takashima và cs đã tiến hành phân tích các tự kháng thể

trong huyết thanh cho thấy có phản ứng miễn dịch với các protein trong mô ung thƣ

lấy từ bệnh nhân HCC. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã tiến hành phân tách

protein của 15 cặp mẫu mô ung thƣ và mô thƣờng bằng kỹ thuật điện di hai chiều,

sau đó chuyển lên màng và thực hiện phản ứng miễn dịch với huyết thanh của chính

bệnh nhân đó. Bằng cách so sánh từng phần, họ đã xác định đƣợc 4 spot có phản

ứng miễn dịch có độ nhạy với thuốc nhuộm ở mô ung thƣ mạnh hơn so với mô bình

thƣờng. Những protein này đƣợc nhận dạng bằng sắc ký lỏng kết nối với khối phổ

(LC-MS/MS), đó là protein sốc nhiệt 70kDa (HSP70), glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase, peroxiredoxin và manganese superoxide dismutase (Mn-SOD).


19

Trong huyết thanh bệnh nhân HCC, tần suất của các tự kháng thể kháng lại các

protein lần lƣợt là 7/15 (46,7%); 5/15 (33,3%); 5/15 (33,3%) và 6/15 (40%), trong

khi đó, ở mô đối chứng là 2/20 (10%); 7/20 (35%); 0/20 (0%) và 2/20 (10%). Tiếp

tục phân tích miễn dịch sử dụng các protein thƣơng mại đã tinh sạch đƣợc tiến hành

để khẳng định tính đặc hiệu của các tự kháng thể. Phân tích thống kê các tự kháng

thể kháng lại các protein HSP70, peroxiredoxin và Mn-SOD cho thấy những phản

ứng miễn dịch có độ đặc hiệu cao trong huyết thanh HCC. Ba kháng thể đƣợc cho là

đặc hiệu đối với bệnh HCC và có thể là các chỉ thị sinh học chẩn đoán bệnh [33].

Trƣớc đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng trong quá trình chuyển

dạng từ xơ gan, viêm gan thành ung thƣ gan, trong cơ thể xuất hiện các TAA kích

thích sinh ra tự kháng thể. Các tự kháng thể này có thể xuất hiện trong huyết thanh

trƣớc khi phát hiện biểu hiện chuyển dạng ác tính. Để đánh giá sự biểu hiện của các

tự kháng thể trong các trạng thái bệnh lý về gan, năm 2007, Zhang và cs đã tiến

hành sang loc huyêt thanh cua 30 bệnh nhân xơ gan, 30 bệnh nhân viêm gan và 142

bênh nhân HCC băng viêc sƣ dung 8 TAA chon trƣơc là các protein có liên quan

đến điều hòa chu trình tế bào, yếu tố phiên mã đang đƣợc nghiên cứu rộng rãi, gồm:

protein Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, cyclin B1, survivin và p16. Sử dụng kỹ thuật

hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) để phát hiện các kháng thể kháng 8

TAA trong huyêt thanh của các đối tƣợng đƣợc nghiên cứu, kết quả dƣơng tính

đƣợc kiểm tra lại bằng Western blot và xét nghiệm kết tủa miễn dịch. Kết quả cho

thấy tỷ lệ xuất hiện phản ứng dƣơng tính của tự kháng thể trong huyết thanh với

từng TAA biến đổi trong khoảng từ 9,9 - 21,8%, nhƣng khi kết hợp thêm lần lƣợt

từng TAA cho tới khi đủ 8 TAA thì thấy tỷ lệ phản ứng dƣơng tính với kháng thể

tăng lên đến 59,8% ở bệnh nhân HCC. Tỷ lệ này cao hơn hẳn so với tỷ lệ phản ứng

dƣơng tính với 8 TAA ở bệnh nhân viêm gan, xơ gan và ngƣời bình thƣờng lần lƣợt

là: 20%, 30% và 12,2%. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng quá trình chuyển dạng

ác tính thành ung thƣ có liên quan đến việc tăng phản ứng của tự kháng thể với một

số protein nhất định của tế bào, việc sử dụng mini-array gồm 8 TAA tăng cƣờng

phát hiện tự kháng thể có thể dùng để chẩn đoán HCC [40].


20

Khi nghiên cứu về quá trình chuyển dạng ác tính của tế bào gan, các nhà khoa

học đã sử dụng tự kháng thể trong huyết thanh trong sàng lọc miễn dịch thƣ viện biểu

hiện cDNA của tế bào ung thƣ gan HepG2 để xác định kháng nguyên liên quan đến

quá trình này. Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Chen tại đại học Texas đã tiến hành

nghiên cứu xác định các kháng nguyên liên quan đến khối u nhƣ những chỉ thị cho

chẩn đoán miễn dịch ung thƣ gan. Trong nghiên cứu này, huyết thanh của bệnh nhân

HCC đƣợc sử dụng để sàng lọc miễn dịch từ thƣ viện biểu hiện cDNA của tế bào

HepG2. Kết quả sàng lọc thƣ viện biểu hiện cDNA HepG2 đã chỉ ra 27 gene bao gồm

21 gene đã biết và 6 gene chƣa biết. Trong 21 gene đã biết thì 11 gene liên quan đến

quá trình chết theo chƣơng trình, biệt hóa và tăng sinh của tế bào cũng nhƣ chế biến

kháng nguyên, 10 gene là liên quan đến các ung thƣ khác và 3 gene liên quan đến

HCC. Dựa vào ý nghĩa chức năng và mối liên hệ với ung thƣ gan, HCC-1 (Suil) và

HCC-13 (RalA) đƣợc xác định có thể liên quan đến di truyền ung thƣ HCC và đƣợc

lựa chọn cho những nghiến cứu tiếp theo: phân tích huyết thanh bằng ELISA và

Western blot ở các điều kiện khác nhau. Việc xác định biểu hiện protein của cả hai

kháng nguyên đƣợc đánh giá bằng hóa mô miễn dịch. Kết quả nghiên cứu này đã

chứng minh rằng hai TAA đƣợc xác định là Suil và RalA từ thƣ viện biểu hiện cDNA

HepG2 có phản ứng miễn dịch ở HCC cao hơn đáng kể so với viêm gan mạn tính, xơ

gan cũng nhƣ ở ngƣời bình thƣờng. Điều đó khẳng định rằng hai kháng nguyên này

có thể là những chỉ thị ung thƣ trong chẩn đoán HCC [10].

Năm 2008, Li và cs đã tiến hành xác định các kháng nguyên khối u và tự kháng

thể của bệnh nhân HCC sử dụng phƣơng pháp phân tích proteome huyết tƣơng kết hợp

với protein microarray. Họ tiến hành phân tách protein tổng số từ hai dòng tế bào ung

thƣ thực nghiệm HepG2 và HepG2.2.15 bằng điện di hai chiều. Sau đó, chuyển các

protein đã đƣợc phân tách lên màng Polyvinylidene Fluoride (PVDF). Đầu tiên, protein

từ dòng tế bào HepG2 đƣợc ủ với mẫu huyêt thanh thu đƣợc từ 8 bệnh nhân HCC liên

quan đến HBV. Huyết thanh bình thƣờng đƣợc sử dụng làm đối chứng. Protein của

dòng tế bào HepG2.2.15 đƣợc ủ với mẫu trộn từ mẫu huyết thanh của 10 bệnh nhân

HCC liên quan đến HBV và 10 bệnh nhân HCC âm tính với HBV. Các nhà nghiên cứu


21

đã phát hiện 6 spot protein kháng nguyên của dòng tế bào HepG2 có phản ứng với

huyết thanh của bệnh nhân HCC mà không phản ứng với huyết thanh của ngƣời bình

thƣờng. Trong trƣờng hợp HepG2.2.15, họ cũng đã phát hiện đƣợc 10 spot protein

kháng nguyên có phản ứng với huyết thanh ngƣời bệnh mà không phản ứng với huyết

thanh của ngƣời bình thƣờng. Kết quả trên đã phản ánh sự khác nhau giữa các tự kháng

thể của bệnh nhân HCC liên quan đến HBV và bệnh nhân HCC không liên quan đến

HBV. Các protein trên đƣợc nhận dạng bằng phƣơng pháp phân tích khối phổ MALDI-

TOF và phần mềm Mascot. Nhóm nghiên cứu đã xác định đƣợc 13 kháng nguyên liên

quan đến HCC. Tính kháng nguyên của các protein này đƣợc khẳng định thêm bằng

cách sử dụng kỹ thuật Western blotting và phân tích protein microarray. Kết quả chỉ ra

rằng, tần suất của các phản ứng dƣơng tính với DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp), yếu tố kéo

dài dịch mã 2 (eEF2), yếu tố cảm ứng apoptosis, heterogeneous nuclear A2 (hnRNP

A2), protein liên kết với prostatic (PBP), triosephosphate isomerase (TIM) ở mẫu ung

thƣ cao hơn đáng kể so với bình thƣờng và viêm gan man tinh . Phản ứng dƣơng tính

với DEAD, eEF2, AIF và PBP là thƣờng xuyên xảy ra ở HCC hơn bất kỳ bệnh ung thƣ

khác. Độ nhạy của tất cả kháng nguyên HCC từ 50% đến 85%. Vì vậy, các nhà nghiên

cứu kết luận rằng việc phát hiện các tự kháng thể kháng lại các kháng nguyên trên có

thể có giá trị trong việc chẩn đoán sớm ung thƣ gan [22].

Năm 2008, Looi và cs đã dùng phƣơng pháp proteomics để xác định các

TAA liên quan đến HCC. Nghiên cứu đƣợc tiến hành trên mẫu huyết thanh của 20

bệnh nhân HCC, 30 bệnh nhân viêm gan mạn tính, 30 bệnh nhân xơ gan và huyết

thanh của 10 ngƣời bình thƣờng khỏe mạnh và dòng tế bào ung thƣ gan HepG2.

Trong số 34 spot protein có phản ứng miễn dịch đƣợc cắt ra khỏi bản gel điện di hai

chiều, thủy phân protein bằng trypsin và phân tích LC-MS/MS, các tác giả đã nhận

dạng đƣợc 28 protein. 17/28 protein không chỉ phản ứng với kháng thể trong huyết

thanh của bệnh nhân HCC mà còn phản ứng với kháng thể trong huyết tƣơng của

bệnh nhân tiền ung thƣ. 11/28 protein chỉ phản ứng với kháng thể trong huyết tƣơng

của bệnh nhân HCC, nhóm protein này có tiềm năng lớn để trở thành chỉ thị sinh

học của ung thƣ gan. Ngoài ra, để tìm hiểu mối liên quan của các protein đã nhận


22

dạng với ung thƣ, tác giả đã tìm kiếm trên Pubmed về cơ sở dữ liệu protein. Theo

kết quả tra cứu, 18/28 protein đã đƣợc báo cáo có liên quan đến ung thƣ: 3 protein

liên quan ung thƣ vú; 4 protein liên quan HCC (GRP78, HSP70, serotransferrin,

Mn-SOD); 11 protein còn lại liên quan đến các loại ung thƣ khác [26].

Gần đây, việc nhận dạng và mô tả đặc điểm của các TAA và dùng làm “TAA

mini-array” để chẩn đoán miễn dịch ung thƣ là một hƣớng tiếp cận để phát hiện ung

thƣ đang đƣợc quan tâm. Theo hƣớng nghiên cứu này, năm 2010, Zhang và cs đã

tiến hành nghiên cứu “Sàng lọc miễn dịch ung thƣ tế bào biểu mô gan thông qua tự

kháng thể và kháng nguyên liên quan đến khối u kết hợp với biểu hiện tăng bất

thƣờng của AFP”. Nhóm tác giả đã dùng các tự kháng thể trong huyết thanh của

một bệnh nhân HCC làm mẫu dò để sàng lọc miễn dịch xác định các TAA có liên

quan đến quá trình chuyển dạng ác tính của tế bào gan trong thƣ viện biểu hiện

cDNA của dòng tế bào ung thƣ thực nghiệm HepG2. Theo cách này đã xác định

đƣợc 2 gene là SUI1 và RA1A. Protein tái tổ hợp của 2 gene này là Sui1 và Ra1A

đƣợc biểu hiện, tinh sạch và dùng làm kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để

xác định sự có mặt của tự kháng thể trong huyết thanh của 77 bệnh nhân HCC, 30

bệnh nhân viêm gan mạn tính, 30 bệnh nhân xơ gan và 82 ngƣời bình thƣờng. Tỷ lệ

xuất hiện kháng thể kháng Sui1 và Ra1A trong huyết thanh bệnh nhân HCC lần lƣợt

là 11,7% (9/77) và 19,5% (15/77), tỷ lệ này cao hơn đáng kể so với tỷ lệ xuất hiện

kháng thể kháng lại 2 protein này trong huyết thanh của bệnh nhân xơ gan (3,3% và

3,3%) và không xuất hiện kháng thể kháng 2 protein này ở huyết tƣơng bệnh nhân

viêm gan và ngƣời bình thƣờng. Khi bổ sung 2 protein này vào mini-array gồm 8

TAA (Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, cyclin B1, survivin và p16 [40]) đã đƣợc nghiên

cứu trƣớc đó thì thấy tỷ lệ xuất hiện tự kháng thể kháng 10 TAA đạt tới 66,2%.

Ngoài ra, khi kết hợp sử dụng 10 TAA trên để chẩn đoán ở những ngƣời có AFP

biểu hiện bất thƣờng độ nhạy tăng từ 66,2% lên 88,7% [11].

Hiện nay, nhiều nghiên cứu về proteomics miễn dịch ung thƣ đã xác định

đƣợc các kháng nguyên liên quan đến khối u. Khi một TAA đƣợc xác định, các nhà

nghiên cứu sẽ dùng nhiều phƣơng pháp khác nhau để mô tả một cách toàn diện về


23

TAA, mối liên hệ của TAA với quá trình chuyển dạng tế bào ác tính và xác nhận

tƣơng tác của TAA với kháng thể kháng TAA nhằm đánh giá tiềm năng trở thành

chỉ thị để chẩn đoán miễn dịch ung thƣ. Theo hƣớng này, năm 2011, Liu và cs đã

tập trung nghiên cứu về hai TAA mới đƣợc tìm ra là p62 và p90 để tìm hiểu vai trò

của chúng trong chẩn đoán miễn dịch [24].

Tại Việt Nam, những nghiên cứu proteomics mới chỉ đƣợc bắt đầu triển khai

tại các Phòng thí nghiệm Trọng điểm (PTNTĐ) về công nghệ Gene và Protein đƣợc

thiết lập trong giai đoạn 2001 - 2005 [2]. Ở nƣớc ta đã có một số nghiên cứu về ung thƣ

gan sử dụng kỹ thuật proteomics, tuy nhiên, các nghiên cứu mới chỉ bƣớc đầu phân tích

hệ protein mô gan của bệnh nhân ung thƣ, so sánh với mô gan của ngƣời bình thƣờng

nhằm tìm ra các protein biểu hiện khác biệt trên hai loại mô này. Năm 2010, nhóm

nghiên của chúng tôi thuộc Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc PTNTĐ

Công nghê Enzyme va Protein , Trƣơng Đại học Khoa học Tự nhiên đa ti ến hành

nghiên cứu phân tích proteomics mô gan bệnh nhân ung thƣ gan nguyên phát đã xác

định đƣợc 44 spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan bệnh nhân ung thƣ so với

mô gan ngƣời bình thƣờng, nhận dạng đƣợc 37/44 spot protein tƣơng ứng với 28

protein đã đƣợc định danh và 8 protein giả thuyết. Trong đó, một số protein biểu hiện

khác biệt đặc trƣng giữa mô ung thƣ so với mô thƣờng nhƣ: Annexin V, PCNA (biểu

hiện tăng ở mô ung thƣ), p53, SODC (biểu hiện giảm ở mô ung thƣ) có tiềm năng trở

thành chỉ thị của ung thƣ tế bào gan [20]. Năm 2011, chúng tôi đã tiến hành phân tích

các protein biểu hiện khác biệt của mô gan ung thƣ và mô gan lành trên cùng lá gan của

bệnh nhân ung thƣ gan [6], đồng thời cũng tiến hành phân tích biểu hiện khác biệt của

protein huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ gan sử dụng kỹ thuật điện di hai chiều [36].

Tiếp tục thực hiện hƣớng nghiên cứu proteomics ung thƣ gan tại Việt Nam,

trong đề tài này, chúng tôi đã kết hợp phân tích proteomics mô gan của bệnh nhân

ung thƣ gan và thực hiện phản ứng miễn dịch Western blot hai chiều nhằm tìm ra

các protein có biểu hiện khác biệt, đặc biệt là các protein kháng nguyên phản ứng

miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của bệnh nhân ung thƣ gan, đây là các

protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học giúp chẩn đoán sớm ung thƣ gan.


24

Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí có khối u của bệnh nhân ung thƣ tế bào

gan nguyên phát và huyết tƣơng của chính bệnh nhân đó. Mẫu đối chứng là mô gan

cách ít nhất 5cm trên cùng lá gan tại vị trí không có khối u. Danh sách bệnh nhân

ung thƣ gan đƣợc tiến hành nghiên cứu ghi tại Phụ lục 1.

Mô gan và huyết tƣơng sử dụng trong nghiên cứu này (15 mẫu) do Khoa Tế

bào - Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K2, Tam Hiệp cung cấp. Mẫu mô đựng trong ống

eppendorf đƣợc vận chuyển bằng bình chứa nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu

-80oC, mẫu huyết tƣơng đƣợc bảo quản ở tủ lạnh -20

oC.

2.1.2. Hóa chất

Bảng 3. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Tên hóa chất Nhà cung cấp

Ampholytes pH 4 - 7, pH 3 - 10 GE Health Care, Mỹ

ECL Advance Western Blotting Detection Kit Product

Booklet (RPN2135) GE Health Care, Mỹ

Peptide chuẩn (Insulin B; Angiotensin II)

Chất nền CHCA Sigma - Aldrich, Mỹ

Trypsin Sigma - Aldrich, Mỹ

CHAPS, DTT, IAA, Tris - base, Biorad, Mỹ

Agarose low melting, Glycine, Urea, Tween 20 Sigma, Mỹ

SDS, Acrylamide, Bis - Acrylamide Pharmacia, Thụy Điển

Acetonitrile, Methanol, Acetone Merck, Đức

Tất cả các hóa chất khác đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh sạch

phân tích.


25

2.1.3. Thiết bị

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sử dụng các dụng cụ, thiết bị trong Phòng

Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ

Enzyme và Protein, các thiết bị chính bao gồm:

- Máy ly tâm lạnh 5417R (Eppendorft, Đức), máy ly tâm K30 (Sigma, Đức).

- Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad, Mỹ), Ettan IPGphor3

(GE - Healthcare, Mỹ).

- Thanh IPG strip pH 3 - 10, 17cm; IPG strip pH 4 - 7, 7cm (Biorad, Mỹ).

- Buồng điện di: Protean II xi multi-cell cho phép chạy 6 bản gel 17cm cùng

một lúc, Protean II XL cell chạy 2 bản gel kích thƣớc 17cm và Mini-Protean

3 cell (Biorad, Mỹ) chạy các gel kích thƣớc 7cm.

- Nguồn điện di PowerPacTM

HC (Biorad, Mỹ).

- Hệ thống phân tích hình ảnh sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích bản

gel diện di hai chiều Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản).

- Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA - CRF PLUS (KRATOS ANALYTICAL, Anh).

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Xử lý mẫu mô gan

Mẫu mô gan lành và mô gan ung thƣ của cùng một bệnh nhân đƣợc cắt

nhuyễn trong cối sứ đặt trên đá lạnh, protein mô gan đƣợc chiết bằng đệm muối

phosphate (PBS) 0,05M, pH 7,4 và đệm phá tế bào (đệm Lysis) có chứa Urea 7M,

Tris 30mM, CHAPS 4% w/v, DTT 65mM, PMSF 10mM. Tiến hành ly tâm thu các

phân đoạn dịch chiết và kéo dài thời gian ly tâm lạnh với tốc độ cao để loại bỏ các

thành phần phi protein (lipid, ARN, DNA...). Quy trình chiết protein từ mô gan

đƣợc mô tả trong hình 3.

Dịch thu đƣợc từ các phân đoạn gồm dịch chiết PBS1, PBS2, Lysis1, Lysis2

và Lysis3 sẽ đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 10% có SDS để kiểm tra thành


26

phần và độ sạch. Các mẫu chƣa đạt độ sạch sẽ đƣợc tủa bằng dung dịch Acetone

100% theo tỷ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch tủa ở -20oC trong 2 giờ.

Protein lắng tủa đƣợc hòa lại bằng đệm Lysis. Các dịch chiết của cùng một mẫu

đƣợc trộn lại để chuẩn bị cho điện di hai chiều.

Hình 3. Quy trình chiết protein từ mô gan


27

2.2.2. Định lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford

Để đảm bảo tính đồng nhất về lƣợng protein giữa các mẫu nghiên cứu, trƣớc

khi chạy điện di hai chiều, chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng protein trong

mẫu bệnh và mẫu đối chứng bằng phƣơng pháp Bradford [9].

Phƣơng pháp này định lƣợng bằng cách so màu và dựa trên sự thay đổi bƣớc

sóng hấp thụ cực đại của phức protein với thuốc nhuộm coomassie brilliant blue.

Dung dịch Bradford có tính axít thì độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 465nm, nhƣng

khi kết hợp với protein thì độ hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 595nm. Trƣớc tiên,

chúng tôi xây dựng đƣờng chuẩn về độ hấp thụ của albumin huyết thanh bò đã biết

trƣớc nồng độ sau đó tiến hành đo mẫu. Từ số đọc của mẫu, dựa vào đƣờng chuẩn

để xác định hàm lƣợng protein trong dịch chiết.

2.2.3. Điện di hai chiều

Điện di hai chiều gồm: điện di phân vùng đẳng điện (IEF) để phân tách

protein theo điểm đẳng điện và điện di SDS-PAGE để phân tách protein theo khối

lƣợng và hình dạng phân tử. Quá trình này bắt đầu bằng việc làm trƣơng thanh strip

có gradient pH cố định (IPG strip) bằng đệm trƣơng gel có chứa protein, sau 2 giờ,

protein sẽ thấm hết vào thanh strip. Lƣợng protein tối đa mà sợi gel IPG strip dài

7cm và 17cm có thể thấm tƣơng ứng là 100µg và 400µg.

Điện di đẳng điện đƣợc thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell (Biorad,

Mỹ) hoặc Ettan IPGphor3 (GE - Healthcare, Mỹ) để tập trung các phân tử protein

vào vị trí tƣơng ứng với pI của phân tử đó trên thanh IPG strip. Quá trình chạy điện

di đẳng điện diễn ra theo 5 buớc đƣợc trình bày ở bảng 4.

Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh IPG strip đƣợc ngâm trong đệm cân

bằng I (Tris HCl 50mM pH 8,8; urea 6M, glycerol 30%, SDS 2%, DTT 0,1%) ở

nhiệt độ phòng và đệm cân bằng II (Tris HCl 50mM pH 8,8; urea 6M, glycerol

30%, SDS 2%, IAA 0,25%), thực hiện trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Mỗi bƣớc

cân bằng đƣợc thực hiện 3 lần, mỗi lần 10 phút.


28

Điện di chiều hai đƣợc tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS (SDS-

PAGE) để tiếp tục phân tách protein theo khối lƣợng phân tử.

Bảng 4. Các bƣớc chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm

Hiệu điện thế (V) Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng

V 7cm 17cm 7cm 17cm 7cm 17cm

Bƣớc 1 50 12 giờ 0 Trƣơng gel

Bƣớc 2 125 2 giờ ... ... Tuyến tính

Bƣớc 3 250 15 phút ... ... Nhanh

Bƣớc 4 4.000 10.000 1 giờ 2 giờ ... ... Chậm

Bƣớc 5 4.000 10.000 ... ... 10.000 40.000 Nhanh

Tổng ~ 18 giờ ~ 20 giờ ~ 14.000 ~ 60.000

Trong nghiên cứu này, mỗi cặp mẫu bệnh và đối chứng của từng bệnh nhân

đƣợc tiến hành điện di hai chiều thành hai cặp bản gel. Sau khi kết thúc điện di hai

chiều, một cặp bản gel đƣợc cố định protein bằng dung dịch chứa axit phosphoric

1,3%, methanol 20% trong một giờ, sau đó, nhuộm qua đêm bằng Coomassie G250

theo phƣơng pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988).

Phƣơng pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng

protein [37]. Hình ảnh các protein trên bản gel này đƣợc chụp lại, lƣu giữ, phân tích

đánh giá mức độ biểu hiện và so sánh với cơ sở dữ liệu sẵn có hoặc cắt, thủy phân

spot protein để phân tích khối phổ. Cặp bản gel còn lại sẽ đƣợc dùng để điện chuyển

sang màng PVDF để thực hiện phản ứng miễn dịch Western Blot.

2.2.4. Western Blot

Western Blot hay còn gọi là kỹ thuật thẩm tách miễn dịch, đây là kỹ thuật

đang đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện sự có mặt của các protein cụ thể trong mẫu

nghiên cứu dựa vào tƣơng tác đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể. Tiến hành kỹ

thuật Western Blot sử dụng kit ECL AdvanceTM

Western blotting detetion (GE

Healthcare, Mỹ) để xác định kháng nguyên cố định là protein trong dịch chiết mô

gan sử dụng kháng thể bậc một là huyết tƣơng của ngƣời bệnh và kháng kháng thể


29

(kháng thể bậc hai) liên kết với peroxidase cỏ ngựa (HRP), enzyme này xúc tác cho

phản ứng oxy hóa Luminol gây ra hiện tƣợng phát quang. Sự phát sáng tối đa xuất

hiện ở bƣớc sóng 425nm. Quá trình thực hiện gồm các bƣớc sau:

Tiến hành điện đi biến tính để phân tách protein trong mô gan trên bản gel

polyacrylamide 10% có SDS.

- Điện chuyển qua đêm ở 4oC để chuyển protein trong gel lên bề mặt màng

PVDF.

- Nhuộm màng bằng dung dịch Ponceau S để kiểm tra hiệu quả chuyển màng,

sau đó, tẩy trắng màng bằng H2O và ủ màng với dung dịch blocking trong 1 giờ.

- Ủ màng qua đêm với dung dịch kháng thể bậc 1 (huyết tƣơng của ngƣời

bệnh) đã pha loãng. Sau đó, rửa sạch màng để loại bỏ kháng thể thừa và các

liên kết không đặc hiệu.

- Ủ màng với dung dịch kháng thể bậc hai (kháng kháng thể gắn với HRP)

đƣợc pha loãng theo tỷ lệ 1:10.000 trong 1 giờ. Rửa bỏ kháng thể thừa.

- Ủ màng với dung dịch chứa Luminol và H2O2, để trong bóng tối 5 phút, ghi

lại hình ảnh phát quang trên màng PVDF.

2.2.5. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, kết quả Western Blot

Hình ảnh các bản gel điện di hai chiều và hình ảnh phát quang trên màng

PVDF sau khi thực hiện phản ứng kháng nguyên - kháng thể đƣợc số hóa bằng cách

quét vào máy tính có phần mềm chuyên dụng Phoretix (Shimazdu, Nhật Bản) để

phân tích hình ảnh. Trƣớc tiên, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên

mỗi bản gel và màng, mỗi spot đều đƣợc xác định số thứ tự, vị trí, thể tích (tính theo

độ lớn và độ đậm nhạt của spot) trên bản gel/màng. Phần mềm này còn cho phép xác

định các spot protein tƣơng ứng trên từng cặp bản gel. Dựa vào cƣờng độ khối trung

bình của từng spot (nomalized volume - đƣợc tính bằng thể tích của spot đó chia cho

tổng thể tích các spot trên toàn bản gel nhân với 100) có thể chỉ ra điểm khác biệt

giữa bản gel/màng mẫu bệnh so với bản gel/màng mẫu đối chứng (hình 4).


30

Sau khi phân tích hình ảnh, chúng tôi có thể chỉ ra các spot protein xuất hiện

trên bản gel/màng này mà không xuất hiện trên bản gel/màng khác; các spot protein

biểu hiện tăng, giảm ở các bản gel/màng khác nhau. Dựa vào kết quả này, chúng tôi

xác định các spot protein ở các mẫu nghiên cứu có thể cắt ra khỏi bản gel phục vụ

cho các phân tích tiếp theo. Đồng thời cũng xác định đƣợc các điểm protein tƣơng

ứng trên màng có tính kháng nguyên, đây chính là các protein kích thích sinh ra đáp

ứng miễn dịch chống ung thƣ.

Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix

2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều

Các spot protein quan tâm trên các bản gel điện di hai chiều đƣợc cắt ra khỏi

bản gel, lúc này, phân tử protein nằm trong gel polyacrylamide liên kết với phân tử

thuốc nhuộm Coomassie, do đó, để thu đƣợc tập hợp các mảnh peptide phục vụ cho

phân tích khối phổ, cần loại bỏ chất màu Coomassie và phá vỡ cấu trúc không gian

của phân tử protein giúp enzyme trypsin có thể hoạt động. Enzyme trypsin cắt phân

tử protein tại các gốc Lysine (K) và Arginine (R) ở đầu C, và không cắt tại các vị trí

này khi các gốc này đƣợc liên kết với Prolin (P). Khi đó, phân tử protein đƣợc cắt

thành các mảnh peptide (6 - 20 acid amin) thích hợp cho phân tích khối phổ.

Quá trình tẩy màu spot và thuỷ phân protein thành các peptide sẵn sàng cho

phân tích khối phổ, bao gồm các bƣớc cụ thể nhƣ sau:


31

- Cắt các spot ra khỏi bản gel.

- Rửa các spot bằng nƣớc MiniQ.

- Tẩy màu các spot đã nhuộm coomassie bằng dung dịch chứa ammonium

bicarbonate (ABC) 50mM, acetonitrile (AcCN) 50%.

- Làm khô các spot bằng AcCN 100%.

- Nhỏ dung dịch trypsin vào các spot và ủ ở 37oC trong 4 giờ, khi đó, phân tử

protein trong các spot sẽ bị thuỷ phân thành các peptide có thể đi ra khỏi gel

polyacrylamide.

Các peptide trong dịch thủy phân sẽ đƣợc hấp phụ bằng Ziptip C18. Quy trình

Ziptip đƣợc tiến hành theo các bƣớc sau:

- Làm ƣớt Ziptip bằng dung dịch có Trifluoroacetic acid (TFA) 0,1% trong

AcCN 70%.

- Cân bằng Ziptip bởi dung dịch TFA 0,1%.

- Hấp phụ peptide trong dịch thuỷ phân vào Ziptip.

- Loại muối bằng dung dịch TFA 0,1%.

- Phản hấp phụ peptide ra khỏi Ziptip lên đĩa MS bằng dung dịch TFA 0,1%

trong AcCN 70%.

- Cuối cùng, bổ sung lên đĩa MS dung dịch matrix (CHCA 10mg/ml trong

TFA 0,05%, AcCN 50%).

2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein

Tiến hành phân tích khối phổ (MALDI-TOF MS) để xác định khối lƣợng của

tập hợp các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân mỗi spot protein. Phƣơng pháp khối

phổ (MS) là phƣơng pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác

khối lƣợng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện tích

hay ion trong một điện trƣờng hoặc từ trƣờng nhất định. Nguồn MALDI đƣợc dùng

trong phân tích các hợp chất cao phân tử dựa trên nguyên lý làm ion hóa và thăng


32

hoa mẫu peptide từ phức hợp với chất nền (matrix) ở dạng tinh thể qua tác động của

các xung laser [1].

Mẫu peptide đƣợc phân tích song song với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai

peptide: angiotensin II (Mw 1046,5423Da) và insulin B (Mw 3494,6513Da). Hỗn

hợp peptide đƣợc trộn với chất nền CHCA, để khô và đƣa vào máy phân tích khối

phổ AXIMA - CRF PLUS (KRATOS ANALYTICAL, Anh). Các thông số hoạt động của

máy khối phổ gồm:

- Nguồn laser: 55

- Profile: 30 profile cho một lần bắn

- Khối lƣợng tối ƣu: 2000Da

- Phổ khối lƣợng: 500 - 5000Da

Protein đƣợc nhận dạng theo phƣơng pháp Peptide Mass Fingerprint (PMF).

Theo phƣơng pháp này, protein đƣợc xác định bằng việc so sánh khối lƣợng của các

peptide thu đƣợc sau khi thủy phân với cơ sở dữ liệu lý thuyết sẵn có sử dụng phần

mềm Mascot để tra cứu theo chế độ sau:

- Cơ sở dữ liệu: NCBInr

- Phân loại: Homo sapiens

- Enzyme: Trypsin

- Các cải biến không thay đổi: Cacbamidomethyl (C)

- Các cải biến thay đổi: Oxidation (M)

- Cho phép sai số: ± 1Da

- Giá trị khối: MH+


33

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN

Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi tiến hành tách chiết protein từ

mô gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng (mẫu đối chứng). Mẫu mô đƣợc cắt nhỏ,

ngâm trong dịch chiết PBS 0,05M pH7,4 và đệm phá tế bào (Lysis) rồi thực hiện

các bƣớc ly tâm để thu lấy các phân đoạn dịch chiết protein. Kết quả tách chiết đƣợc

kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE (hình 5).

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

A. Dịch chiết mô gan bình thƣờng B. Dịch chiết mô gan ung thƣ

Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thƣờng và

mô gan ung thƣ trên gel polyacrylamide 10% có SDS

(Giếng 1: Dịch chiết PBS1; Giếng 2: Dịch chiết PBS2; Giếng 3: Dịch chiết Lysis1;

Giếng 4: Dịch chiết Lysis2; Giếng 5: Dịch chiết Lysis3)

Trong điên di SDS-PAGE, protein đƣợc phân tách theo khối lƣợng phân tử,

các protein co khôi lƣơng phân t ử khác nhau thì đƣơc hiên lên dƣơi dang tƣng băng

vạch khác nhau. Hiệu quả tách chiết protein đƣợc đánh giá thông qua thành phần và

hàm lƣợng protein thể hiện bằng số lƣợng các băng và độ đậm nhạt của các băng

protein. Khi nhuộm bản gel bằng thuôc nhuộm có chứa Coomassie, băng protein băt

màu thuốc nhuộm càng đậm chứng tỏ hàm lƣợ ng protein tại đo cang lơn . Sô lƣơng

băng trong môt giêng điên di cang nhiêu ch ứng tỏ thành phần protein của mẫu càng

đa dang phong phu.


34

Trong kết quả điện di kiểm tra dịch chiết protein từ mẫu mô gan (hình 5),

chúng tôi thấy trong các giếng đã xuất hiện nhiều băng protein trải đều từ trên

xuống dƣới, chứng tỏ mẫu dịch chiết protein từ mô gan có thành phần protein đa

dạng. Tuy nhiên, các phân đoạn dịch chiết protein mô gan có độ sạch khác nhau, ở

các giếng 1, 3 (hình 5A) và giếng 1 (hình 5B), sự biểu hiện của các băng protein là

chƣa rõ ràng, hơn nữa, ở các giếng vẫn có hiện tƣợng kéo vệt dọc.

Do đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu dịch chiết thô bằng dung dịch acetone

100% theo tỉ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch tủa ở -20oC nhằm tập trung

protein có trong mẫu, đồng thời loại mỡ và các chất phi protein. Các dịch chiết sau

khi tủa đƣợc hòa lại bằng đệm lysis và trộn lại với nhau tạo thành dịch chiết protein

đầy đủ của mô gan dùng để tiến hành bƣớc thí nghiệm tiếp theo.

3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU

3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều

Cho đến nay, kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) đã trở thành một trong những

công cụ phân tách protein đƣợc dùng rộng rãi trong các nghiên cứu về hệ protein.

Kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau 0,1 đơn vị pI (isoelectric

point) và 1kDa về khối lƣợng phân tử [37]. Protein trong dịch chiết mô gan bình

thƣờng và mô gan ung thƣ cùng đƣợc phân tách bằng điện di hai chiều. Trên bản gel

điện di, các protein trong mẫu đƣợc phân tách thành các spot protein riêng rẽ hoặc

các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến protein, có thể do

sự sắp xếp ARN hay biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lƣợng phân

tử tƣơng tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau.

Tuy hệ protein mô gan rất phức tạp, song hàm lƣợng của các protein trong

gan khá đồng đều, do đó, các protein đƣợc phân tách khá tốt trên bản gel 2-DE

(hình 6). Khi phân tách protein mô gan trên bản gel 2-DE sử dụng thanh strip dài

17cm trong khoảng pH 3 - 10 (hình 6A1, B1), kết quả điện di cho thấy các protein đã

đƣợc phân tách rõ ràng thành các spot riêng rẽ nằm trải khắp bản gel và ít có những

vùng tập trung các spot protein có hàm lƣợng cao bao trùm lên các spot protein


35

khác. Tuy nhiên, ở vùng giữa bản gel trong khoảng pH 4 - 7, mật độ các spot

protein cao, do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành điện di hai chiều sử dụng thanh strip

7cm, pH 4 - 7 để phân tách protein trong khoảng pH này rõ ràng hơn (hình 6A2, B2).

A - Mô gan bình thƣờng B - Mô gan ung thƣ

Hình 6. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều

Chiều 1: Điện di đẳng điện sử dụng thanh IPG strip dài 17cm, pH 3 - 10 (A1 và B1); IPG strip

dài 7cm, pH 4 - 7 (A2 và B2); Chiều 2: Điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 10%.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tách đƣợc hệ protein mô gan ung

thƣ và mô gan bình thƣờng của 6 bệnh nhân HCC trên cả bản gel 2-DE sử dụng

thanh strip dài 17cm, pH 3 - 10 và thanh strip dài 7cm, pH 4 - 7. Kết quả điện di

phân tách protein mô gan của bệnh nhân HCC trên bản gel 2-DE đƣợc thể hiện

trong hình 6 và phụ lục 2.


36

Bƣớc đầu sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích hình ảnh bản gel điện di

hai chiều - Phoretix, chúng tôi đã xác định đƣợc tổng số spot đƣợc phân tách trên

các bản gel 2-DE (bảng 5).

Bảng 5. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều

Mã bệnh

nhân

Bản gel 17cm Bản gel 7cm

Mô bình thường Mô ung thư Mô bình thường Mô ung thư

8261 272 spot 171 spot 75 spot 136 spot






3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều

Phần mềm chuyên dụng Phoretix cho phép so sánh sự biểu hiện của các

protein thuộc mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng thông qua sự biểu hiện

của các spot trên các bản gel 2-DE. Phần mềm giúp xác định các spot tƣơng ứng

trên các bản gel, đƣa ra giá trị cƣờng độ khối trung bình của các spot. Ngoài ra,

phần mềm còn đƣa ra hình ảnh ba chiều (3-D) của các spot, trong đó, độ lớn của

spot đƣợc thể hiện bằng bề rộng của đáy spot trên hình 3-D, độ đậm của spot đƣợc

thể hiện bằng chiều cao của spot tính từ đáy lên đỉnh và độ sắc nét của spot nhuộm

màu coomasie đƣợc thể hiện bằng độ nhọn của spot ấy trên hình ảnh 3-D (hình 7).

Đây là cơ sở để so sánh mức độ biểu hiện của từng spot trên bản gel.

Căn cứ vào các thông số thu đƣợc khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE,

chúng tôi có thể chỉ ra các spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thƣ (+);

các spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt trên bản gel mô bình thƣờng (-); các spot biểu hiện

tăng (↑) và các spot biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mô ung thƣ so với bản gel mô bình

thƣờng (hình 8).


37

Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều


Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thƣ so với bản gel

mô bình thƣờng

Khi phân tích độc lập từng cặp bản gel, chúng tôi đã xác định đƣợc các spot

protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng trên

từng cặp bản gel 2-DE phân tách protein trong khoảng pH 3 - 10, dài 17cm (bảng 6)

và phân tách protein trong khoảng pH 4 - 7, dài 7cm (bảng 7). Các spot biểu hiện

khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu protein mô gan ung thƣ so với mô gan bình

thƣờng đƣợc minh họa ở hình 9.


38

A - Mô gan bình thƣơng B - Mô gan ung thƣ

Ghi chú: A1, B1 - Bản gel 2-DE dài 17cm, pH 3 - 10

A2, B2 - Bản gel 2-DE dài 7cm, pH 4 - 7

Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thƣ so với

mô gan bình thƣờng của bệnh nhân HCC mã 8935

A1 B1

A2 B2


39


bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10

8261 8460 8935 8977 9242 10480

↑ 31 16 51 23 21 39

↓ 19 33 20 22 27 21

- 7 11 2 4 1 4

+ 2 4 7 3 2 5

Tổng 59 64 80 52 51 69


bình thƣờng của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7

8460 8935 8977 9242 10480

↑ 6 17 18 11 16

↓ 9 3 10 5 8

- 5 1 1 2 1

+ 1 2 3 2 2

Tổng 21 23 32 20 27

Ghi chú: Spot protein biểu hiện tăng (↑); spot protein biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mẫu

ung thƣ so với bản gel mô bình thƣờng; spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mẫu ung

thƣ (+); xuất hiện mờ nhạt hoặc không thấy trên bản gel mẫu mô ung thƣ (-).

Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thƣ

so với bản gel mô gan bình thƣờng của cả 6 bệnh nhân HCC, chúng tôi nhận thấy có

52 spot khác biệt rõ ràng, xuất hiện trên các bản gel mô gan ung thƣ so với mô gan

bình thƣờng, bao gồm:

- 6 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thƣ

- 5 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô đối chứng

- 23 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thƣ

- 18 spot biểu hiện giảm ở bản gel mô ung thƣ.


40

Khi so sánh hình ảnh các bản gel điện di thu đƣợc trong nghiên cứu này với

hình ảnh bản gel mô gan ngƣời trong cơ sở dữ liệu SWISS-2D-PAGE [43], chúng

tôi nhận dạng đƣợc 13 protein tƣơng ứng với 13 spot biểu hiện khác biệt giữa bản

gel mô gan ung thƣ so với bản gel mô gan bình thƣờng (bảng 8).

Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thƣ so

với mô gan bình thƣờng đƣợc xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL

STT Protein

Yếu tố

nhận dạng

protein

Cƣờng độ khối

trung bình Biểu

hiện ĐC HCC

1 Alpha-1-antitrypsin (Alpha-1-protease

inhibitor) (A1AT) P01009 0,0015 0,608 +

2 Protein disulfide-isomerase (PDIA1) P07237 0,738 0,078 ↓

3 Cellular tumor antigen p53 (p53) P04637 0,114 − −

4 Beta-actin, cytoplasmic 1 (ACTB) P60709 0,003 4,599 +

5 Haptoglobin (HPT) P00738 0,002 0,839 +

6 Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) P12004 0,0008 0,265 +

7 Glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase (GAPDH/G3P) P04406 0,248 − −

8 Cathepsin D (CATD) P07339 0,0007 0,124 +

9 Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial

(ECHM) P30084 0,0005 0,129 +

10 Superoxide dismutase [Mn],

mitochondrial (SODM) P04179 2,730 0,315 ↓

11 UMP-CMP kinase (KYC) P30085 0,306 0,014 ↓

12 Superoxide dismutase [Cu-Zn] (SODC) P00441 4,524 1,467 ↓

13 Glutamate dehydrogenase 1,

mitochondrial (GDH/ DHE3) P00367 0,686 − −

Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu

hiện ở mẫu bệnh; +, protein không biểu hiện ở mẫu mô bình thƣờng; ĐC, bản gel mô gan

bình thƣờng; HCC, bản gel mô gan ung thƣ.

http://world-2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/ac=P01009














41

3.3. NHẬN DẠNG PROTEIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP MALDI-TOF MS

Sau khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE, những spot protein biểu hiện khác

biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc cắt và thủy phân, thu

đƣợc hỗn hợp peptide sử dụng cho phân tích khối phổ. Mỗi protein cho kết quả là

một tập hợp dữ liệu về khối lƣợng của các peptide khác nhau sau khi bị phân cắt bởi

enzyme trypsin. Trypsin là một protease thuộc nhóm serine, đƣợc sử dụng phổ biến

nhất trong phân tích proteomics. Enzyme này phân cắt các protein tại đầu C của

lysine và arginine. Thông thƣờng, một protein 50kDa sẽ bị trypsin phân cắt thành

30 đoạn peptide có khối lƣợng phù hợp để phân tích khối phổ. Một đặc điểm thuận

lợi của trypsin đối với phân tích proteomics là enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh

cả trong dung dịch lẫn khi thuỷ phân trong gel. Bằng kỹ thuật MALDI-TOF MS,

chúng tôi đã xác định đƣợc các peptide trong mẫu thủy phân protein và biểu thị

bằng các đỉnh trên đồ thị (hình 10). Với mỗi đỉnh trên đồ thị, trục hoành biểu diễn

khối lƣợng/điện tích của peptide (M/Z) và trục tung biểu thị độ lớn của tín hiệu

tƣơng ứng peptide đó khi phân tích khối phổ (đơn vị mV).

Hình 10. Phân tích khối phổ các peptide thu đƣợc sau khi thủy phân spot protein

C-256-B bằng trypsin


42

Protein đƣợc nhận dạng theo phƣơng pháp PMF (Peptide mass fingerprint),

khối lƣợng của peptide đƣợc tạo ra sau khi thủy phân đƣợc so sánh với cơ sở dữ liệu

NCBInr, sử dụng phần mềm Mascot thông qua webside www.matrixscience.com

[52]. Kết quả nhận dạng là một danh sách các protein và một số thông tin cơ bản nhƣ:

tên, ký hiệu, khối lƣợng phân tử, trình tự peptide phù hợp, sai số,… Tuy nhiên,

protein tra đƣợc phải có score lớn hơn 64 mới có ý nghĩa (độ tin cậy lớn hơn

99,95%). Thông tin chi tiết về protein tra đƣợc gồm: tổng giá trị khối đã tra, số giá trị

khối phù hợp với giá trị trong trình tự chuẩn và phần trăm phù hợp trong cơ sở dữ

liệu. Ngoài ra, phần mềm còn đƣa ra trình tự amino acid của protein tra đƣợc, phần

màu đỏ là trình tự của đoạn peptide phù hợp khi tra với cơ sở dữ liệu. Cuối cùng là sự

sai khác về khối lƣợng của các peptide đã tra cứu với khối lƣợng đã tính toán biểu thị

bằng bảng và đồ thị. Kết quả nhận dạng của spot N97B trên bản gel mẫu mô gan ung

thƣ là ví dụ về nhận dạng protein theo phƣơng pháp PMF (phụ lục 3). Danh sách các

protein đã xác định theo phƣơng pháp này đƣợc trình bày ở bảng 9.

Bảng 9. Danh sách các protein đƣợc xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô

gan ung thƣ so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC

Spot Tên protein

Yếu tố

nhận

dạng

protein

KLPT

(Dalton) pI

%

phù

hợp

Score Biểu

hiện

C43C

Suppressor of

tumorigenicity 7 protein-

like (ST7L)

Q8TDW4 37.024 8,42 12 73 ↑

C56B Protein disulfide-isomerase

A3 (Erp57/ PDIA3) P30101 28.483 5,49 20 71 ↑

C52C Human Mitochondrial

Aldehyde Dehydrogenase P05091 54.394 5,7

19 88 ↓

N80A 15 71 ↓

C256B REST corepressor 1

(Protein CoREST) Q9UKL0 47.762 8,23 12 74 ↑

P130B Glutamine synthetase (GS) P15104 42.745 6,43 14 69 ↑

P193B Transcription Factor Ca150 O14776 9.408 9,69 54 85 ↑

P221B Heat shock protein beta-1

(HSPB1/HSP27) P04792 22.826 5,98 24 66 ↓

O50C Heat shock protein 27 34 89 ↓

http://www.matrixscience.com/

http://www.uniprot.org/uniprot/Q8TDW4

http://www.uniprot.org/uniprot/P30101


http://www.uniprot.org/uniprot/Q9UKL0


http://www.uniprot.org/uniprot/O14776



43

P71B Apolipoprotein L2 Q9BQE5 45.887 8,79 14 74 ↑

P57D MHC class I antigen Q95460 9600 11,26 30 73 ↓

O167B BAT2 protein (Protein

PRRC2A) P48634 17.081 9,94 25 88 ↑

O244B

Bromodomain and PHD

finger containing 1 (Protein

Peregrin)

P55201 59.536 8,66 13 71 ↑

O67B Immunoglobulin G heavy

chain variable region AEX28843 13.503 8,62 59 69 ↑

O301B

Mitochondrial 3-oxoacyl-

CoA thiolase (3-ketoacyl-

CoA thiolase)

P42765 42.469 8,51 23 69 ↑

O113

A Zinc finger protein AAC50263 28.889 9,6 20 67 −

O137B AP-2 complex subunit

alpha-1 O95782 106.378 7,75 9 89 ↑

O286B Metastasis related protein AAG27483 10.414 5,43 56 84 ↑

O46D Heterogeneous nuclear

ribonucleoprotein L-like Q8WVV9 49.517 9,01 14 66 −

O285B Peroxiredoxin 2 A6NIW5 15.243 5,82 33 68 ↑

O8D Heat shock protein 60 P10809 61.346 5,7 15 81 ↑

O241B T cell receptor alpha chain AAK37512 13.640 7,88 40 66 ↑

N24B Interleukin-32 P24001 15.127 4,8 23 70 ↑

N97B

Chain A, Crystal Structure

Of Human Enolase 1

(Alpha-enolase)

P06733 47.481 7,01 18 69 ↑

N296

A

Neuropolypeptide h3

(Phosphatidylethanolamine-

binding protein 1)

P30086 21.027 7,42 41 78 ↓

N35B TFEC protein

(Transcription factor EC) O14948 22.696 9,67 17 71 ↑

N139C Microfibrillar-associated

protein 3 (MFAP3) O75121 34.362 4,9 15 68 ↓

P46D LOC643854 protein AAI01323 61.880 5,45 9 74 ↑

P228A TPA protein Q6LBF5 13.392 7,85 24 72 ↓

P229A Unnamed protein product BAC04847 32.496 8,51 14 70 ↓

P10C Protein FAM180A Q6UWF9 19.834 8,59 16 68 ↓

P15C hCG1989686 EAX08132 11.676 9,55 32 68 ↓

P14A Uncharacterized protein

C12orf45 Q8N5I9 20.168 5,1 20 69 ↓

P48A COMM domain containing 3 Q5T8Z0 18.286 6,14 20 83 ↓

http://www.uniprot.org/uniprot/Q9BQE5

http://www.uniprot.org/uniprot/Q95460





http://www.uniprot.org/uniprot/Q8WVV9

http://www.uniprot.org/uniprot/A6NIW5







http://www.uniprot.org/uniprot/Q6LBF5

http://www.uniprot.org/uniprot/Q6UWF9

http://www.uniprot.org/uniprot/Q8N5I9

http://www.uniprot.org/uniprot/Q5T8Z0


44

C55D GDDM protein Q86XP7 4.086 10,54 80 71 ↑

C151A Interphase cyctoplasmic

foci protein 45 variant G6DPS4 35.150 8,11 15 68 ↑

O218B IFT172 protein A5PKZ0 60.583 5,66 11 68 ↑

O243B KIAA1179 protein Q9UG01 142.340 5,51 9 67 ↑

N244

A hCG2041492 EAW97522 15.331 5,31 36 66 ↓

Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu

hiện ở mẫu bệnh; +, protein không biểu hiện ở mẫu mô bình thƣờng.

Sử dụng kỹ thuật MALDI-TOF MS, chúng tôi đã nhận dạng đƣợc 39 spot

protein, trong đó có 27 spot tƣơng ứng với 25 protein đã đƣợc định danh và 12

protein giả thuyết.

Tóm lại, kết hợp kỹ thuật MALDI-TOF MS và tra cứu cơ ở dữ liệu, chúng

tôi đã nhận dạng đƣợc 38 protein trên tổng số 52 spot protein biểu hiện khác biêt

trên các bản gel mô gan của bệnh nhân HCC.

3.4. THẨM TÁCH MIỄN DỊCH - WESTERN BLOT HAI CHIỀU

3.4.1. Xác định tỷ lệ pha loãng kháng thể bậc một thích hợp

Kit ECL Advance Western Blotting Detection là kit có độ nhạy cao do tín

hiệu phát quang của phản ứng oxy hóa Luminol nhạy và mạnh. Do đó, để giảm liên

kết không đặc hiệu và tín hiệu nhiễu trên màng cần tối ƣu nồng độ kháng thể bậc

một và bậc hai khi ủ màng với dung dịch kháng thể.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm để lựa chọn tỷ lệ

pha loãng kháng thể thích hợp. Dịch chiết protein mô gan ung thƣ đƣợc tra vào 20

giếng trên bản gel điện di SDS-PAGE, 2 giếng đƣợc dùng để nhuộm Coomassie

G250 để kiểm tra kết quả phân tách mẫu trên gel polyacrylamide (hình 11A), các

giếng còn lại đƣợc điện chuyển qua đêm để đƣa protein lên màng, sau đó, nhuộm

màng bằng thuốc nhuộm Ponceau S để kiểm tra hiệu quả chuyển màng (hình 11B).

Trên bản gel nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie G250 xuất hiện nhiều băng

protein bắt màu thuốc nhuộm rõ nét và trải đều dọc theo giếng điện đi, hình ảnh này

http://www.uniprot.org/uniprot/Q86XP7

http://www.uniprot.org/uniprot/G6DPS4

http://www.uniprot.org/uniprot/A5PKZ0

http://www.uniprot.org/uniprot/Q9UG01


45

khẳng định protein đã đƣợc phân tách tốt trên bản gel polyacrylamide. Khi so sánh

thành phần protein trên bản gel điện di và màng PVDF, ta thấy các băng protein trên

các giếng tƣơng tự nhau chứng tỏ quá trình điện chuyển đạt hiệu suất cao, protein

trên gel đƣợc chuyển hoàn toàn lên màng.

A B

Hình 11. Phân tách protein chiết từ mô gan bệnh nhân HCC trên gel polyacrylamide

và màng PVDF chuẩn bị cho phản ứng Western Blot

(A - Bản gel polyacrylamide nhuộm Coomassie G250; B - Màng PVDF nhuộm Ponceau S)

Cắt màng thành 9 phần và ủ qua đêm với 8 dung dịch kháng thể bậc một

(huyết tƣơng của ngƣời bệnh) đƣợc pha loãng theo các tỷ lệ khác nhau 1:100;

1:200; 1:300; 1:400; 1:500; 1:600; 1:800; 1:1000. Dung dịch kháng thể bậc hai

đƣợc pha loãng theo tỷ lệ do nhà sản xuất khuyến cáo là 1:10000. Kết thúc phản

ứng Western Blot, hiện tƣợng phát quang đƣợc chụp ảnh (hình 12).

1:100 1:200 1:300 1:400 1:500 1:600 1:800 1:1000

Hình 12. Kết quả phản ứng Western Blot khi ủ màng với dung dịch kháng thể bậc 1

có độ pha loãng khác nhau


46

Quan sát hình 12 ta thấy những vạch sáng xuất hiện ở các giếng là vị trí băng

protein có tƣơng tác đặc hiệu với kháng thể bậc 1, do đó sẽ liên kết với kháng thể

bậc 2 gắn enzyme xúc tác phản ứng phát quang. Các băng sáng xuất hiện trên nền

đen càng sắc nét càng đặc hiệu. Tại các giếng đƣợc ủ với dung dịch kháng thể bậc 1

có độ pha loãng là 1:100; 1:200; 1:300; 1:400; 1:500, tuy có xuất hiện băng sáng

nhƣng băng chƣa sắc nét và nền giếng có hiện tƣợng sáng lóa, điều này có thể do

lƣợng kháng thể bậc 1 dƣ thừa nên liên kết không đặc hiệu với các protein trên gel.

Còn ở các giếng đƣợc ủ với dung dịch kháng thể đƣợc pha loãng theo tỷ lệ 1:600;

1:800; 1:1000, đặc biệt là giếng đƣợc ủ với dung dịch kháng thể pha loãng theo tỷ lệ

1:800, các băng sáng sắc nét, xuất hiện cả băng có khối lƣợng nhỏ ở phía gần đáy

giếng và nền giếng không bị nhiễu sáng.

Từ kết quả thí nghiệm trên, chúng tôi đã lựa chọn tỷ lệ pha loãng dung dịch

kháng thể bậc một là 1:800 khi tiến hành các thí nghiệm thực hiện kỹ thuật Western

blot tiếp theo.

3.4.2. Kết quả Western Blot hai chiều

Sau khi xác định đƣợc tỷ lệ pha loãng kháng thể bậc một thích hợp, chúng tôi

tiến hành thực hiện phản ứng Western blot hai chiều. Các phân tử protein sau khi

đƣợc phân tách trên bản gel điện di hai chiều 7cm trong khoảng pH 4 - 7 đƣợc điện

chuyển lên màng. Khi ủ màng với huyết tƣơng của bệnh nhân HCC đã pha loãng 800

lần, các kháng thể trong huyết tƣơng gắn với protein đặc hiệu trên màng, sau đó, tiếp

tục ủ màng với kháng thê bậc 2 gắn enzyme xúc tác cho phản ứng hiện màu để phát

hiện các spot protein có phản ứng miễn dịch.

Chúng tôi đã thực hiện thành công phản ứng Western blot hai chiều trên bản

gel 2-DE mẫu mô gan của 4 bệnh nhân HCC. Kết quả cho thấy trên màng đã xuất

hiện các điểm sáng sắc nét (hình 13 và phụ lục 4), đây chính là vị trí của các spot

protein có tính kháng nguyên. Cƣờng độ sáng của từng điểm là tiêu chí đánh giá mức

độ biểu hiện và đáp ứng miễn dịch của protein trên màng. Hình ảnh Western blot


47

đƣơc so sanh vơi bản gel 2-DE 7cm đƣợc nhuộm Coomassie G250 nhằm xác định

các protein có tính kháng nguyên.


Hình 13. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977

Dựa vào vị trí tƣơng ứng của các spot phát sáng trên màng PVDF với các

spot trên bản gel 2-DE dài 7cm và kết quả định danh protein, chúng tôi đã xác định

đƣợc 4 protein trong mô gan của bệnh nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể

trong huyết tƣơng của chính bệnh nhân đó là: protein ST7L biểu hiện tăng và

protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung

thƣ so với mô gan bình thƣờng.

3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT

Những điểm protein khác biệt, kể cả những protein biểu hiện tăng/giảm trong

mô gan bệnh nhân ung thƣ gan đều là những đặc trƣng về bệnh và có thể là những

protein chỉ thị ung thƣ. Kết hợp xác định protein bằng MALDI-TOF MS và tra cứu

cơ sở dữ liệu, chúng tôi đã nhận dạng đƣợc 38 protein biểu hiện khác biệt giữa mô

gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng. Để tìm hiểu mối liên quan của các protein

này với ung thƣ, chúng tôi đã tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu về protein [51], từ đó xác

định đƣợc chức năng chính của protein và mô tả sơ lƣợc, phân nhóm các protein

nhƣ trong bảng 10 và hình 14.


48

Bảng 10. Tóm tắt chức năng chính của các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan

ung thƣ so với mô gan đối chứng đã đƣơc nhận dạng

Ptotein Chức năng chính

Protein liên quan đến chu trình tế bào, tăng sinh tế bào và apoptosis: 5 protein

Protein ST7L Ức chế phát triển khối u

Metastasis related protein Protein liên quan đến quá trình di căn

Protein Neuropolypeptide h3 Ức chế hoạt động của protein Raf

Protein p53 Protein ức chế khối u, điều hòa sự tăng sinh tế bào, kiểm

soát chu trình tế bào và apoptosis

Proliferating cell nuclear antigen

(PCNA)

Tăng sinh tế bào, điều khiển sao chép DNA, sửa chữa

DNA

Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể: 11 protein

Protein sốc nhiệt beta-1

(HSPB1/HSP27)

Đáp ứng lại stress, nhiễm virus, kích thích sản xuất

interleukin-1

HSP60 Tƣơng tác vật chủ - virus, hoạt hóa tế bào T, kích thích

tế bào B sản xuất cytokine, than gia cuộn gấp protein.

Kháng nguyên MHC lớp I Trình diện kháng nguyên nội sinh

Interleukin-32 Tham gia đáp ứng miễn dịch, kích thích sinh ra IL-8,

yếu tố hoại tử mô (TNFA)

Immunoglobulin G heavy chain

variable region

Cấu tạo phân tử Ig

T cell receptor alpha chain Tham gia nhận dạng kháng nguyên

Peroxiredoxin 2 Chống lại các stress oxy hóa

Alpha-1-antitrypsin Ức chế protease nhóm serine, tham gia quá trình đông

máu

Haptoglobin Liên kết với Hemoglobin

Superoxide dismutase [Cu-Zn] Phá hủy gốc tự do bảo vệ cơ thể

Superoxide dismutase [Mn] Phá hủy gốc tự do bảo vệ cơ thể

Protein tham gia cấu trúc tế bào: 2 protein

Beta-actin (ACTB) Cấu trúc tế bào


49

Microfibrillar-associated protein

3 (MFAP3)

Liên quan đến microfibri, tham gia cấu tạo tế bào

Protein tham gia các quá trình trao đổi chất: 10 protein

Aldehyde Dehydrogenase Chuyển hóa rƣợu, phân giải ethanol

Enoyl-CoA hydratase Trao đổi lipid

Glutamine synthetase (GS) Chuyển hóa glutamate, dẫn truyền thần kinh (có liên

quan đến quá trình tăng sinh tế bào)

Glutamate dehydrogenase Truyền xung thần kinh

Apolipoprotein L2 Chuyển hóa và vận chuyển lipid

3-ketoacyl-CoA thiolase Chuyển hóa lipid và acid béo

UMP-CMP kinase (KYC) Chuyển gốc phosphate từ ATP sang UMP và CMP, tổng

hợp Pyrimidin

Glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase (G3P)

Tham gia quá trình đƣờng phân, vận chuyển các chất qua

màng tế bào.

AP-2 complex subunit alpha-1 Vận chuyển protein

Cathepsin D (CATD) Proteinase nội bào

Protein tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã, cải biến: 10 protein

Protein PDIA3 Tái sắp xếp liên kết S-S

Protien PDIA1 Phá vỡ và tái tạo liên kết S-S

Yếu tố phiên mã Ca150 Điều hòa phiên mã

Yếu tố phiên mã EC Điều hòa phiên mã

BAT2 protein (Protein PRRC2A) Tham gia ghép nối tiền mARN

Protein Peregrin Điều hòa phiên mã gene RUNX1, RUNX2, tham gia

acetyl hóa Histone H3

Zinc finger protein Gắn với DNA tại vị trí liên kết với yếu tố phiên mã

Heterogeneous nuclear

ribonucleoprotein L-like

Chế biến mARN (cắt nối luân phiên)

REST corepressor 1

(Protein CoREST)

Tham gia phiên mã và điều hòa phiên mã, tƣơng tác

virus - vật chủ.

Alpha-enolase Glycosyl hóa, hoạt hóa plasminogen, điều hòa phiên mã.


50

Căn cứ vào chức năng chính của protein, các protein có biểu hiện khác biệt

giữa mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng đƣợc nhóm thành 5 nhóm khác

nhau dựa vào quá trình sinh học mà protein tham gia. Tỷ lệ protein thuộc 5 nhóm

này không đồng đều (hình 14), trong đó, các protein tham gia vào quá trình quá

trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể chiếm tỷ lệ cao nhất (~ 29%) và các protein tham

gia cấu trúc tế bào chiếm tỷ lệ thấp nhất (~5%).

Hình 14. Tỷ lệ các nhóm protein tham gia vào các quá trình sinh học khác nhau

Dựa vào kết quả nhận dạng protein, chúng tôi thấy có nhiều loại protein biểu

hiện khác nhau giữa mô gan ở trạng thái bình thƣờng và bệnh lý. Sự thay đổi mức

độ biểu hiện của các protein có thể là nguyên nhân dẫn đến rối loạn hoạt động tế

bào đƣa đến tình trạng ung thƣ, hoặc cũng có thể là hậu do quá trình tăng sinh tế

bào mang lại. Do đó, các protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ và mô

gan bình thƣờng, đặc biệt là các protein có phản ứng miễn dịch với huyết tƣơng của

chính bệnh nhân HCC đều có thể trở thành protein chỉ thị cho ung thƣ gan. Dƣới

đây là sự mô tả chức năng của một số protein có liện hệ mật thiết với tình trạng ung

thƣ tế bào.

3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis

Theo kết quả nhận dạng protein, chúng tôi đã xác định đƣợc 5 protein tham

gia vào chu trình tế bào, tăng sinh tế bào và sự chết theo chƣơng trình (apoptosis),

chúng có vai trò quan trọng trong việc duy trì sự tồn tại của tế bào ung thƣ trong cơ

thể. Trong số đó, chúng tôi đặc biệt quan tâm tới 3 protein: proliferating cell nuclear


51

antigen, cellular tumor antigen p53 và suppressor of tumorigenicity 7 protein-like

(ST7L).

Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) là một protein bổ trợ cho DNA

polymerase delta và tham gia quá trình điều khiển sao chép DNA ở tế bào nhân

chuẩn thông qua việc tăng cƣờng khả năng duy trì của polymerase trong quá trình

kéo dài sợi khuôn [51]. Sự biểu hiện tăng của PCNA nhƣ một chỉ thị của tình trạng

tăng sinh tế bào, đã đƣợc xác định ở nhiều tổn thƣơng. PCNA tăng trong trƣờng hợp

ung thƣ vú [30]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy protein PCNA biểu

hiện tăng trong mô gan ung thƣ, tƣơng tự nhƣ kết qủa của Li và cs (2005). Sự biểu

hiện tăng của PCNA có thể đƣợc sử dụng nhƣ một chỉ thị đáng tin cậy để đánh giá

sự tiến triển của khối u và dự đoán cho những bệnh nhân mang khối u có nguy cơ

tiến triển thành ác tính [21].

Cellular tumor antigen p53 (p53) là protein ức chế khối u, điều hòa sự tăng

sinh tế bào, tham gia vào điểm kiểm tra trong chu trình tế bào, quá trình apoptosis

và tƣơng tác virus - vật chủ [30]. P53 liên quan đến quá trình điều hòa âm tính sự

phân bào thông qua việc điều khiển một nhóm gene cần thiết cho quá trình này. Đột

biến gene TP53 có tần số cao và dạng p53 bị bất hoạt xuất hiện trong khoảng 60%

các dạng ung thƣ. P53 bị khiếm khuyết đƣợc tìm thấy trong các tế bào ung thƣ thực

quản, ung thƣ phổi. Bốn dạng ung thƣ nhƣ: ung thƣ vú, u não, u xƣơng và ung thƣ

thận có tới 80% trƣờng hợp mắc ung thƣ liên quan đến đột biến gene TP53 ở tế bào

mầm. Tóm lại, đây là một chỉ thị cho rất nhiều bệnh và đặc thù cho ung thƣ khi

protein này biểu hiện giảm ở các bệnh nhân [51]. Trong in vitro, DNA của HBV

chèn vào hệ gene vật chủ gây đột biến TP53, tƣơng tác giữa p53 với các protein

virus trong đó có protein lõi HCV làm suy giảm p53 hoặc làm mất chức năng của

p53, khiến cho sự điều hòa sinh trƣởng tế bào bị rối loạn [38]. Kết quả nghiên cứu

của chúng tôi cho thấy ở mô gan ung thƣ thiếu sự biểu hiện của p53, kết quả này

phù hợp với các công bố trên thế giới. Do đó, thiếu sự biểu hiện của p53 trong tế

bào mô gan có thể là một dấu hiệu để nhận biết HCC.


52

3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận dạng đƣợc 11 protein tham gia vào

quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể. Đây là nhóm protein chiếm tỷ lệ cao nhất

(~29%) trên tổng số protein có biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ so với mô

gan bình thƣờng đã đƣợc nhận dạng, bao gồm các thành phần của hệ thống miễn

dịch nhƣ interleukin-32, vùng biến đổi của chuỗi nặng của phân tử Ig, chuỗi alpha

của thụ thể tế bào T, phân tử MHC lớp I. Điều này phản ánh quá trình đáp ứng miễn

dịch mạnh mẽ của cơ thể chống lại tế bào ung thƣ. Bên cạnh đó, một số protein

tham gia vào quá trình bảo vệ cơ thể chống lại các gốc tự do, stress nhƣ:

peroxiredoxin 2, haptoglobin, superoxide dismutase, protein sốc nhiệt beta-1

(HSPB1/HSP27) và HSP60 đã đƣợc xác định là có sự biểu hiện khác biệt ở mô gan

ung thƣ so với mô gan bình thƣờng. Điều đáng lƣu ý là kết quả nghiên cứu của

chúng tôi có sự tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác trên thế

giới đã đƣợc tổng kết trong danh sách các chất chỉ thị ung thƣ của Polanski và

Anderson (2006). Theo tổng kết của nhóm tác giả này, alpha-1-antitrypsin (α1AT) là

một glycoprotein có nồng độ trung bình trong máu ngƣời bình thƣờng là

1,4x109pg/ml, là một chất ức chế protease nhóm serine và là chỉ thị của những mô

bào ác tính [30]. Gene α1AT biểu hiện chủ yếu ở gan, protein α1AT đƣợc tiết vào hệ

tuần hoàn 2g mỗi ngày. α1AT khuếch tán vào hầu hết các cơ quan trong cơ thể để

bảo vệ các cấu trúc ngoại bào khỏi sự tấn công của enzyme elastase đƣợc giải

phóng do sự hoạt hóa hoặc phân hủy bạch cầu trung tính. Giống nhƣ một chất ức

chế hoạt hóa caspase và quá trình apoptosis, α1AT có thể ức chế đƣợc nhiều loại

enzyme đƣợc tiết ra từ các tế bào chết, vì vậy, nó bảo vệ mô bình thƣờng tránh khỏi

hàng loạt các stress cũng nhƣ bị sƣng viêm. α1AT tăng trong các trƣờng hợp pha

cấp và viêm gan, có thể là đáp ứng tự bảo vệ của gan. Mặt khác, sự thiếu hụt α1AT

đƣợc xem là có liên quan mật thiết tới bệnh về gan [16]. Protein α1AT tăng khi cơ

thể đáp ứng với sự nhiễm khuẩn, chấn thƣơng mô, có mang, bị xuất huyết hay khi

có khối u. α1AT đƣợc coi là chỉ thị của các khối u ác tính. Trong nghiên cứu của

chúng tôi, α1AT biểu hiện rõ rệt ở bản gel HCC.


53

Haptoglobin (HPT) là protein có cấu trúc tetramer gồm hai chuỗi alpha và

hai chuỗi beta, đƣợc sản sinh ở gan và đƣợc tiết vào máu [51], nồng độ trung bình

trong huyết tƣơng ngƣời bình thƣờng là 1,3x109pg/ml. Vai trò chính của HPT là giữ

lại sắt bằng việc gắn nó với bất cứ hemoglobin nào giải phóng ra khỏi hồng cầu.

HPT đƣợc biết đến nhƣ là một chất phản ứng pha cấp. Hàm lƣợng của nó tăng lên

trong các điều kiện cấp tính nhƣ: nhiễm trùng, tổn thƣơng, phá hủy mô, một số bệnh

ung thƣ, bỏng, phẫu thuật hay chấn thƣơng. Mục đích của nó là loại bỏ các tế bào,

các mảnh vỡ tế bào tổn thƣơng và các chất hỗ trợ quan trọng nhƣ sắt. Nồng độ HPT

khác nhau có thể đƣợc sử dụng để kiểm soát sự tiến triển của những bệnh này. HPT

tăng trong trƣờng hợp tổn thƣơng kéo dài, hoại tử, tăng ở bệnh nhân leukemia và ở

một số tế bào ung thƣ phổi, làm giảm tỷ lệ sống sót của các bệnh nhân này [30]. Khi

so sánh sự biểu hiện của protein này ở mô gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng,

chúng tôi nhận thấy HPT tăng cao trong trƣờng hợp bị ung thƣ.

Thông thƣờng các gốc tự do đƣợc sản sinh trong tế bào khi cơ thể bị tổn

thƣơng, bệnh lý, lão hóa và thoái hóa, chúng gây hại cho các hệ thống sinh học của

cơ thể. superoxide dismutase [Mn] (SODM) và superoxide dismutase [Cu-Zn]

(SODC), gọi chung là SOD, là các chất điều hòa phản ứng giải độc gốc oxy tự do

bằng cách phá hủy các gốc tự do này [51]. Có nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng SODC

giảm trong trƣờng hợp ung thƣ gan, trong đó, kết quả của Wong và cs đã chỉ rõ

SODC thay đổi ít trong trƣờng hợp HCC do HCV và HCC không liên quan đến

HBV, HCV nhƣng lại giảm rõ rệt trong trƣờng hợp bệnh nhân HCC có tiền sử viêm

gan B [38]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy nồng độ SOD giảm ở mô

gan bệnh nhân ung thƣ gan.

3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào

Đối với nhóm tham gia cấu trúc tế bào, có 2 protein biểu hiện khác biệt giữa

mô gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng đã đƣợc nhận dạng gồm microfibrillar-

associated protein 3 (MFAP3) biểu hiện giảm và Beta-actin biểu hiện tăng ở mô gan

ung thƣ so với mô gan bình thƣờng. MFAP3 là protein thành phần của microfibril


54

liên kết với elastin tham gia cấu tạo màng tế bào [51]. Beta-actin (ACTB) là những

protein có tính bảo tồn cao, nó liên quan đến các dạng vận động tế bào khác nhau và

biểu hiện ở tất cả các tế bào nhân chuẩn. Thiếu hụt ACTB gây rối loạn vận động

liên quan đến thần kinh từ đó dẫn đến rối loạn trƣơng cơ thể hiện ở sự kéo dài quá

trình co cơ trơn gây ra tƣ thế và vận động bất thƣờng [51]. Trong nghiên cứu của

chúng tôi, ACTB biểu hiện tăng rõ rệt trên bản gel mô ung thƣ, đây có thể là kết quả

của việc tế bào gan ung thƣ tăng sinh nhanh chóng kéo theo các thành phần tham

gia cấu tạo tế bào cũng tăng.

3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất

Nhƣ chúng ta đã biết, gan có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa, trao

đổi chất, và là nơi sản sinh ra nhiều loại protein nhất. Khi tế bào gan bị tổn thƣơng,

đặc biệt là chuyển sang trạng thái ung thƣ, sẽ dẫn đến sự thay đổi mức độ biểu hiện

của các protein tham gia vào các quá trình trao đổi chất. Trong nghiên cứu này,

chúng tôi đã nhận dạng đƣợc 10 protein thuộc nhóm các protein tham gia vào hoạt

động trao đổi chất có sự biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thƣ và mô gan đối

chứng. Trong số đó có protein cathepsin D và Enoyl-CoA hydratase, aldehyde

dehydrogenase, glutamine synthetase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

là các protein đã đƣợc chứng minh là có sự thay đổi mức độ biểu hiện trong nhiều

nghiên cứu về ung thƣ.

Cathepsin D (CTSD) là một proteinase thuộc lysosome, có hoạt tính tƣơng tự

pepsin A. Cathepsin D hoạt hóa protease acid trong quá trình phá vỡ protein nội

bào, có liên quan đến một vài bệnh nhƣ ung thƣ vú và có thể là bệnh alzheimer. Sự

suy giảm CTSD là nguyên nhân tạo ra neuronal ceroid lipofuscinosis 10, đây là một

nhóm chất gây thoái hóa thần kinh ở trẻ em và ngƣời lớn, biểu hiện ở sự suy giảm

thị lực, động kinh và thay đổi hành vi [51]. Hàm lƣợng CTSD tăng cao trong trƣờng

hợp ung thƣ kết trực tràng [30]. Enoyl-CoA hydratase là một protein khác biểu hiện

tăng ở mô gan HCC trong nghiên cứu của chúng tôi, đây là enzyme tham gia vào

con đƣờng trao đổi lipid và beta oxy hóa acid béo [51]. Enoyl-CoA hydratase đã


55

đƣợc chứng minh là biểu hiện giảm trong trƣờng hợp ung thƣ gan có liên quan đến

HBV [38, 19] và biểu hiện tăng trong trƣờng hợp bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử

viêm gan C [19].

Nhƣ chúng ta biết glutamine là acid amin tự do có nhiều nhất trong cơ thể,

chiếm đến 60% các acid amin tự do trong tế bào cơ bắp. Trong những trƣờng hợp

stress, glutamine đƣợc giải phóng ra từ cơ đóng vai trò vận chuyển nitrogen đến các

vùng nội tạng và hệ miễn dịch. Với chức năng cung cấp nitrogen, glutamine là chất

tiền thân cho tổng hợp purines, pyrimidines, đƣờng amin và glutathione kháng oxid-

hoá, do đó, nó rất cần cho sự tăng sinh tế bào [25]. Ngày càng có nhiều bằng chứng

cho thấy glutamine là một cơ chất thiết yếu, nguồn năng lƣợng cho các hoạt động

chuyển hoá và chức năng của nhiều hệ thống cơ quan và nâng cao hoạt tính của hệ

miễn dịch. Đối với bệnh nhân bị ung thƣ, quá trình tăng sinh tế bào diễn ra hết sức

mạnh. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng glutamine rất cần thiết cho sự phát triển khối u

và sự thay đổi rõ rệt trong sự chuyển hóa glutamine là đặc điểm của bệnh nhân ung

thƣ. Trong nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy, protein glutamine synthetase (GS)

biểu hiện tăng lên ở mô ung thƣ so với mô thƣờng, đây là enzyme xúc tác tổng hợp

glutamine. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Long

và cs công bố năm 2010. Kết quả của họ cho thấy GS biểu hiện cao quá mức trong

mô gan ung thƣ, sử dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch họ cũng chỉ ra rằng GS biểu

hiện tăng mạnh ở 70% bệnh nhân HCC. Do đó, GS có thể là một chỉ thị để chẩn

đoán sớm HCC đặc biệt với những bệnh nhân có mức AFP thấp [25].

3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến

Đối với các protein thuộc nhóm tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã,

và cải biến sau phiên mã, dịch mã, chúng tôi xác định đƣợc 10 protein biểu hiện

khác biệt giữa mô HCC và mô gan bình thƣờng. Trong đó, protein disulfide-

isomerase (PDI) là enzyme có khả năng tổng hợp, bẻ gẫy cũng nhƣ sắp xếp lại các

liên kết disulfide (-S-S-). Ở nồng độ cao, các protein này có chức năng nhƣ một

chaperone, ức chế sự tập hợp các protein cuộn lỗi. Ở nồng độ thấp sự tập hợp này sẽ


56

đƣợc thực hiện dễ dàng [51]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định đƣợc 2

protein thuộc họ PDI là PDIA1 - protein disulfide-isomerase và PDIA3 - protein

disulfide-isomerase A3. Protein PDIA1 biểu hiện giảm còn PDIA3 lại biểu hiện

tăng ở mô gan HCC. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Kim và cs: enzyme

dạng PDIA1 biểu hiện giảm ở cả bệnh nhân HCC không liên quan đến viêm gan và

bệnh nhân HCC do HBV; dạng PDIA3 biểu hiện tăng ở mô gan bệnh nhân HCC

không có tiền sử viêm gan [19].

Zinc finger protein có biểu hiện tăng trong mô gan ung thƣ, protein này

tham gia điều hòa phiên mã. Zinc finger protein gắn với DNA tại vị trí liên kết với

các yếu tố phiên mã, các protein điều hòa, do đó protein này biểu hiện tăng sẽ ngăn

cản hoạt động phiên mã trong tế bào ung thƣ [51]. Ngoài ra, kết quả của chúng tôi

còn chỉ ra một số protein khác thuộc nhóm protein điều hòa phiên mã, dịch mã nhƣ:

REST corepressor 1, alpha-enolase, heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-

like, protein peregrin, BAT2 protein, yếu tố phiên mã EC, yếu tố phiên mã Ca150.

Sự thay đổi mức độ biểu hiện của các protein này có thể liên quan đến hoạt động

phiên mã, dịch mã trong các tế bào ung thƣ.

3.5.6. Protein có phản ứng miễn dịch với huyết tƣơng

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận dạng đƣợc 4 protein trong mô gan của

bệnh nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của chính bệnh

nhân đó là: protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde

dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng. Các

protein này đƣợc tiếp tục tìm hiểu sâu hơn về chức năng và mối liên hệ của chúng

với tình trạng ung thƣ.

Protein đầu tiên là ST7L, đây là protein đƣợc mã hóa bởi gene ST7L, gene

này tƣơng đồng với gene ức chế khối u thuộc vùng 7q31 của nhiễm sắc thể. Gene

này đƣợc sắp xếp trên cùng một nhiễm sắc thể với gene WNT2B, vùng gene này có

thể bị mất hoặc có hiện tƣợng tái sắp xếp trong một số loại ung thƣ [48]. Protein

ST7L đƣợc xác định là có vai trò ức chế sự phát triển của tế bào khối u. Quan trọng


57

hơn nữa, protein này có phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tƣơng của

bệnh nhân HCC khi thực hiện phản ứng Western blot và biểu hiện tăng ở mẫu mô

gan ung thƣ so với mô bình thƣờng. Chúng tôi đƣa ra hai giả thuyết để lý giải hiện

tƣơng này là: do protein ST7L tăng nhƣng bị biến đổi về cấu trúc nên không thực

hiện đƣợc chức năng và bị cơ thể nhận là “lạ” và sinh đáp ứng miễn dịch, hoặc

trong giai đoạn này, ngƣời bệnh ở giai đoạn phục hồi, nên cơ thể có phản ứng để

kìm hãm sự phát triển của khối u. Đây là protein lần đầu tiên đƣợc phát hiện trong

nghiên cứu của chúng tôi, hơn nữa, chƣa có tài liệu nào về HCC đề cập tới protein

này. Điều này giúp gợi mở hƣớng nghiên cứu mới để tìm hiểu về cơ chế hoạt động

của ST7L trong ung thƣ nói chung và HCC nói riêng, đồng thời khẳng định tiềm

năng trở thành chỉ thị để chẩn đoán HCC của protein này.

Trong quá trình miễn dịch chống ung thƣ, dƣờng nhƣ vai trò của sự đáp ứng

miễn dịch qua trung gian tế bào thƣờng chiếm ƣu thế. Quá trình này có sự tham gia

của phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu (MHC), ở ngƣời là HLA. Trong nghiên

cứu này, chúng tôi nhận dạng đƣợc protein MHC lớp I (MHC I) biểu hiện giảm ở

mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng. Protein MHC đƣợc tích lũy trong lƣới

nội chất và làm nhiệm vụ trung chuyển phân tử. Trong tế bào mang virus hay tế bào

ung thƣ, các kháng nguyên nội sinh (kháng nguyên virus, kháng nguyên ung thƣ)

nằm trong tế bào chất, sẽ đƣợc các vi thể proteasome chế biến thành các peptide

kháng nguyên. Các peptide này đƣợc TAP vận chuyển vào khoang lƣới nội chất để

liên kết với rãnh của MHC I. Sau đó, phức hệ MHC I - peptide kháng nguyên đƣợc

đóng gói bằng cách bọc màng và đƣợc vận chuyển lên bề mặt tế bào để trình diện

cho tế bào TCD8+, kích thích tế bào T sản sinh ra Lymphokin để tiêu diệt tế bào

mang kháng nguyên nội sinh (hình 15). Khi tế bào bị nhiễm virus nội sinh, lƣợng

MHC I luôn đƣợc tổng hợp dƣ thừa, sẵn sàng làm nhiệm vụ trình diện kháng

nguyên nội sinh [3, 7]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, protein MHC I biểu hiện

giảm, điều này gợi ý rằng, quá trình tiến triển thành ung thƣ ở tế bào gan đã làm ảnh

hƣởng tới sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, tế bào ung thƣ không bị tiêu

diệt do thiếu sự nhận diện kháng nguyên nội sinh. Hơn nữa, khi thực hiện phản ứng


58

Western blot hai chiều, tại vị trí spot MHC I có xảy ra phản ứng miễn dịch và phát

quang, điều này có thể do kháng thể trong huyết tƣơng đã nhận diện MHC I nhƣ là

kháng nguyên ung thƣ gan.

Hình 15. Sơ đồ nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC lớp I [44]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy các protein sốc nhiệt: HSP27,

HSP60 đều biểu hiện giảm ơ mô gan ung thƣ so v ới mô gan bình thƣờng. Protein

HSP27 là phân tử đa chức năng, biểu hiện khác nhau trong các giai đoạn biệt hóa và

sinh trƣởng tế bào. HSP còn đƣợc gọi là các stress protein, là một nhóm các protein

có mặt ở tất cả các tế bào sống, đƣợc đặt tên theo khối lƣợng phân tử của chúng.

Chúng xuất hiện hiện khi một tế bào phải trải qua những dạng stress của môi trƣờng

nhƣ nóng, lạnh hay thiếu oxy. Ở điều kiện bình thƣờng, các HSP27 cũng xuất hiện

trong tế bào và hoạt động nhƣ các chaperone đảm bảo cho các protein của tế bào

hoàn thiện về cấu trúc phù hợp với chức năng tại một vị trí vào một thời điểm thích

hợp, đồng thời vận chuyển các protein già đến “thùng rác” trong tế bào, protein này

còn liên kết với actin tránh phá hủy actin, giúp ổn định cấu trúc tế bào. Các protein

này cũng có vai trò trong trình diện kháng nguyên giúp hệ miễn dịch nhận ra các tế

bào bệnh thông qua việc kích thích vi thể proteasome chế biến kháng nguyên nội

sinh. HSP27 còn kích thích sản sinh interleukin-1 giúp hoạt hóa đại thực bào và


59

kích hoạt phản ứng viêm [51]. HSP27 ức chế hoạt hóa caspase 9 gây ức chế quá

trình apoptosis. HSP27 biểu hiện giảm có thể ảnh hƣởng tới nhiều hoạt động chức

năng của tế bào gan và giúp tế bào gan ung thƣ thoát khỏi apoptosis. Biểu hiện bất

thƣờng của HSP27 cũng đƣợc phát hiện ở ung thƣ ruột kết và ung thƣ tuyến tiền

liệt. Kết quả này của chúng tôi tƣơng đồng với kết quả nghiên cứu của Li và cs

(2005), Wong và cs (2006), Yao và cs (2007) [21, 38, 39].

Trong nghiên cứu này, chúng tôi còn nhận dạng đƣợc protein aldehyde

dehydrogenase có biểu hiện giảm ở mô gan ung thƣ so với mô gan bình thƣờng.

Đây là protein thuộc họ enzym tham gia phản ứng oxy hóa khử, tham gia quá trình

chuyển hóa ethanol trong gan và truyền điện tử [51]. Enzyme này giảm có thể là hệ

quả của quá trình tiến triển thành ung thƣ gây suy giảm chức năng gan, hoặc thiếu

hụt enzym này dẫn tới tình trạng gan nhiễm độc, từ đó bị biến đổi thành tế bào ung

thƣ. Hơn nữa, protein này có phản ứng miễn dịch với huyết tƣơng của bệnh nhân

ung thƣ gan, đây có thể là một loại kháng nguyên liên quan đến ung thƣ gan. Kết

quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Li và cs, nhóm nghiên

cứu này cũng chú ý nghiên cứu tìm hiểu tiềm năng của aldehyde dehydrogenase trở

thành chỉ thị phân tử phát hiện HCC [21].

Cùng với những biểu hiện khác biệt quan trọng ở trên, chúng tôi cũng nhận

thấy sự biểu hiện đa dạng của những protein khác biệt không chỉ là đặc trƣng của

riêng một bệnh. Những chỉ thị riêng cho bệnh có thể đƣợc hình thành trong một

chuỗi các tác động tổng hợp với các bệnh khác, điều này góp phần bổ sung cho ý

kiến chỉ thị ung thƣ có thể không đặc hiệu với riêng một loại ung thƣ nào mà phản

ánh mối liên quan chặt chẽ giữa sự tiến triển của bệnh ung thƣ với các quá trình

viêm và bệnh lý khác trong cơ thể [12].


60

KẾT LUẬN

Bƣớc đầu phân tích proteomics miễn dịch của bệnh nhân ung thƣ gan, chúng

tôi rút ra một số kết luận sau:

1. Bằng kỹ thuật điện di hai chiều đã phân tách đƣợc các protein trong mô

gan ung thƣ và mô gan bình thƣờng của 6 bệnh nhân ung thƣ gan thành các spot

riêng rẽ trên các bản gel điện di.

2. Đã xác định đƣợc các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung

thƣ và mô gan bình thƣờng của từng bệnh nhân ung thƣ gan. Trong đó có 52 spot

khác biệt chung ở các bệnh nhân gồm: 23 spot biểu hiện tăng, 18 spot biểu hiện

giảm, 6 spot chỉ xuất hiện ở bản gel mô ung thƣ, 5 spot không xuất hiện ở bản gel

mô ung thƣ.

3. Đã nhận dạng đƣợc 52 spot tƣơng ứng với 38 protein đã đƣợc định danh

và 12 protein giả thuyết. Các protein đƣợc chia thành 5 nhóm chức năng, bao gồm:

nhóm protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis; protein liên quan đến quá

trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể; protein tham gia cấu trúc tế bào; protein tham gia

các quá trình trao đổi chất và protein tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã và

cải biến sau phiên mã, dịch mã. Trong đó, protein tham gia vào quá trình miễn dịch

và bảo vệ cơ thể chiếm tỷ lệ cao nhất (~29%), thấp nhất là nhóm protein tham gia

vào cấu trúc tế bào (~5%).

4. Sử dụng kit ECL Advance Western Blotting Detection , đã xac đinh đƣơc

tỷ lệ pha loãng tôi ƣu kháng th ể bậc môt và th ẩm tách miễn dịch thành công trên 4

cặp bản gel điện di 2 chiều của 4 bệnh nhân ung thƣ gan.

5. Bằng kỹ thuật thẩm tách miễn dịch Western blot hai chiều đã xác định

đƣợc 4 protein có phản ứng miễn dịch la : protein ST7L biểu hiện tăng và protein

MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thƣ so

với mô gan bình thƣờng.


61

KIẾN NGHỊ

Trải qua nghiên cứu thực tế, chúng tôi đƣa ra một số kiến nghị sau:

1. Tiếp tục nhận dạng các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thƣ

so với mô gan thƣờng và kết hợp với kết quả phân tích thẩm tách miễn dịch

Western blot hai chiều trên số lƣợng bệnh nhân lớn hơn nhằm tìm ra các protein có

tính kháng nguyên đặc trƣng cho ung thƣ gan.

2. Tiếp tục thu thập mẫu và phân tích proteomics miễn dịch mô gan của bệnh

nhân ung thƣ gan ở các giai đoạn ung thƣ khác nhau nhằm phân tích sự biến đổi

thành phần các protein liên quan đến bệnh.

3. Thu thập mẫu huyết tƣơng của bệnh nhân viêm gan B và C đang tiến triển

thành ung thƣ gan và bệnh nhân ung thƣ gan có tiền sử nhiễm HBV và HCV nhằm

tìm hiểu mối liên hệ giữa viêm gan B , C và ung thƣ gan trên cac đôi tƣơng bênh

nhân ung thƣ gan ơ Viêt Nam.


62

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Phan Văn Chi (2006), PROTEOMICS Khoa học về hệ protein, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.

2. Phan Văn Chi (2009), “Thực trạng nghiên cứu về Proteomics”, Hội thảo

VNProteomics lần 1, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ.

3. Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học cơ sở, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia

Hà Nội.

4. Hoàng Văn Sơn (2009), “Proteomics lâm sàng”, Hội thảo VNProteomics lần

1, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ.

5. Hoàng Văn Sơn (2011), “Các chỉ tố ung thƣ gan”, Tạp chí y học Việt Nam,

348, 5-11.

6. Bùi Phƣơng Thảo, Lê Lan Phƣơng, Trịnh Hồng Thái (2011), “Phân tích các

protein biểu hiện khác biệt của mô gan ở bệnh nhân ung thƣ gan”, Tạp chí y

học Việt Nam, 348, 67-71.

7. Trƣờng Đại học Y Hà Nội (2006), Miễn dịch học, Nhà xuất bản Y học, Hà

Nội.

Tiếng Anh

8. American Cancer Society (2012), Cancer Facts & Figures, National Health

Council.

9. Bradford M. M. (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”,

Analytical Biochemistry, 72, 248-254.

10. Chen Y. (2007), “Identification of tumor-associated antigens as markers for

immunodiagnosis of human cancers”, ETD Collection for University of Texas,

El Paso, Paper AAI3262904.


63

11. Chen Y., Zhou Y., Qiu S., Wang K., Liu S., Peng X.X., Li J., Tan E.M., Zhang

J.Y. (2010), “Autoantibodies to tumor-associated antigens combined with

abnormal alpha-fetoprotein enhance immunodiagnosis of hepatocellular

carcinoma”, Cancer Letters, 289(1), 32-39.

12. Diamandis E.P. (2004), “Identification of serum amyloid A protein as a

potentially useful biomarker for nasopharyngeal carcinoma”, Clinical Cancer

Research, 10, 5293-5294.

13. Farazi P.A., Depinho R.A. (2006), “Hepatocellular carcinoma pathogenses:

from genes to evironment”, Nature Reviews Cancer, 6, 674-687.

14. Farombi E.O. (2006), “Aflatoxin contamination of foods in developing

countries: Implications for hepatocellular carcinoma and chemopreventive

strategies”, African Journal of Biotechnology, 5(1), 001-014.

15. Govekar R. and Zingde S.M. (2007), “Cancer Proteomics: How far are we

from the Clinics? ”, International Journal of Human Genetics, 7(1), 91-97.

16. He Q.Y., Lau G.K.K., Zhou Y., Yuen S.T., Lin M.C., Kung H.F. and Chiu J.F.

(2003), “Serum biomarkers of hepatitis B virus infected liver inflammation: A

proteomic study”, Proteomics, 3(5), 666-674.

17. Jain K.K. (2002), “Role of proteomics in diagnosis of cancer”,

Technology in Cancer Research and Treatment, 1(4), 281-286.

18. Jemal A., Bray F., Center M. M., Ferlay J., Ward E., Forman D., (2011),

“Global Cancer Statistics, CA Cancer J Clin, 61, 69-90.

19. Kim W., Lim S.O., Kim J.S., Ryu Y.H., Byeon J.Y., Kim H.J., Kim Y.L., Heo

J.S., Park Y.M., and Jung G. (2003), “Comparison of Proteome between

Hepatitis B virus-and Hepatitis C virus-Associated Hepatocellular

Carcinoma”, Clinical Cancer Research, 9, 5493-5500.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chen%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19683863

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zhou%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19683863

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Qiu%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19683863

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wang%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19683863

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Liu%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19683863

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Peng%20XX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19683863

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Li%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19683863

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tan%20EM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19683863

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zhang%20JY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19683863



http://www.krepublishers.com/02-Journals/IJHG/IJHG-00-0-000-000-2001-Web/IJHG-00-0-000-000-2001-1-Cover.htm

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jain%20KK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12625787

http://journalseek.net/cgi-bin/journalseek/journalsearch.cgi?field=issn&query=1533-0346


64

20. Le L.P., Pham A.T., Trinh H.T. (2010), “Proteomics analysis of human

hepatocellular carcinoma”, Vietnam National University Journal of Science,

Natural Science and Technology, 26(1), 85-90.

21. Li C., Tan Y.X., Zhou H., Ding S.J., Li S.J., Ma D.J., Man X.B., Hong

Y., Zhang L., Li L., Xia Q.C., Wu J.R., Wang H.Y., Zeng R. (2005),

“Proteomic analysis of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma:

Identification of potential tumor markers”, Proteomics, 5(4), 1125-1139.

22. Li L., Chen S.H., Yu C.H., Li Y.M. and Wang S.Q. (2008), “Identification of

Hepatocellular-Carcinoma-Associated Antigens and Autoantibodies by

Serological Proteome Analysis Combined with Protein Microarray”, Journal

of Proteome Research, 7(2), 611-620.

23. Liebler D.C. (2002), Introduction to proteomics, Human Press, Totowa, New

Jersey.

24. Liu W., Peng B., Lu Y., Xu W., Qian W., Zhang J.Y. (2011), “Autoantibodies

to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis”,

Autoimmunity Reviews, 10(6), 331-335.

25. Long J., Lang Z.W., Wang H.G., Wang T.L., Wang B.E. (2010), “Glutamine

synthetase as an early marker for hepatocellular carcinoma based on proteomic

analysis of resected small hepatocellular carcinomas”, Hepatobiliary Pacreat

Diseases International, 9(3), 296-305.

26. Looi K.S., Nakayasu E.S., Diaz R.A., Tan E.M., Almeida I.C., Zhang J.Y.

(2008), “Using Proteomic Approach to Identify Tumor-Associated Antigens

as Markers in Hepatocellular Carcinoma”, Journal of Proteome Research,

7(9), 4004-4012.

27. Lu H., Goodell V., Disis M.L. (2008), “Humoral immunity directed against

tumor-associated antigens as potential biomarkers for the early diagnosis of

cancer”, Journal of Proteome Research, 7(4), 1388-1394.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Li%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tan%20YX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zhou%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ding%20SJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Li%20SJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ma%20DJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Man%20XB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hong%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zhang%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Li%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Xia%20QC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wu%20JR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wang%20HY%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zeng%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15759316

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Liu%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21167321

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Peng%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21167321

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lu%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21167321

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Xu%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21167321

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Qian%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21167321


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Looi%20KS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18672925

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nakayasu%20ES%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18672925

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Diaz%20RA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18672925


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Almeida%20IC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18672925


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lu%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18311901

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Goodell%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18311901

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Disis%20ML%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18311901


65

28. Martin K., Ricciardelli C., Hoffmann P., K.Oehker M., (2011), “Exploring the

Immunoproteome for Ovarian Cancer Biomarker Discovery”, International

Journal of Molecular Sciences, 12, 410-28.

29. Mendy M., Walton R. (2009), “Molecular pathogenesis and early detection of

Hepatocellular perspectives from West Africa”, Cancer Letters; 286(1), 44-51.

30. Polanski M., Anderson N.L. (2006), “A list of candidate cancer biomarkers for

targeted proteomics”, Biomark Insights, 1, 1-48.

31. Qin L.X., Tang Z.Y. (2002), “The prognostic molecular markers in

hepatocellular carcinoma”, World Journal of Gastroenterology, 8(3), 385-392.

32. Rubin P., Hansen J.T. (2008), TNM Staging Atlas, Lippincott Williams &

Wilkins, a Wolters Kluwer Business, Bogota, Colombia.

33. Takashima M., Kuramitsu Y., Yokoyama Y., Iizuka N., Harada T., Fujimoto

M., Sakaida I., Okita K., Oka M., (2006), “Proteomic analysis of autonantibides

in patients with hepatocellular carcinoma”, Proteomics, 6(13), 3894-3900.

34. Tan H., Low J., Lim S.G., Chung M.C. (2009), “Serum autoantibodies as

biomarkers for early cancer detection”, FEBS journal, 276(23), 6880-6904.

35. Tjalsma H., Schaeps R.M., Swinkels D.W. (2008), “Immunoproteomics: From

biomarker discovery to diagnostic applications”, Proteomics Clinical

Appllications, 2(2), 167-180.

36. Tran T.T., Le L.P, Trinh H.T (2011), “Analysis of differentially expressed

proteins of plasma in hepatocellular carcinoma”, Vietnam National University

Journal of Science, Natural Science and Technology, 27(2), 279-284.

37. Westermeier R., Naven T. (2002), Proteomics in Practice, Wiley-VCH

Verlag-GmbH, Freiburg.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Polanski%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19690635

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Anderson%20NL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19690635

http://www.wjgnet.com/1007-9327/index.jsp

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Tjalsma%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21136823

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schaeps%20RM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21136823

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Swinkels%20DW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21136823


66

38. Wong C.H., Chan S.K.P., Chan H.L.Y., Tsui S.K.W. (2006), “The Molecular

Diagnosis of Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”,

Clinical Laboratory Sciences, 43(1), 69-101.

39. Yao D.F., Dong Z.Z., Yao M. (2007), “Specific molecular markers in

hepatocellular carcinoma”, Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 6(3), 241-247.

40. Zhang J.Y., Megliorino R., Peng X.X., Tan E.M., Chen Y., Chan E.K. (2007),

“Antibody detection using tumor-associated antigen mini-array in

immunodiagnosing human hepatocellular carcinoma”, Journal of Hepatology,

46(1), 107-114.

Công cụ World Wide Web

41. http://benhvienk.com/index.php/vi/pcut/tin-tuc-phong-chong-ung-thu/677-

dau-hieu-cua-benh-ung-thu-gan (5/6/2012)

42. http://cancerhelp.cancerresearchuk.org/type/liver-cancer/about/types-of-

primary-liver-cancer (14/02/2012)

43. http://expasy.org/swiss-2dpage/viewer (5/6/2012)

44. http://igrid-ext.cryst.bbk.ac.uk/WWW/PhD_thesis.htm (10/06/2012)

45. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/adult-primary-

liver/HealthProfessional/page3 (14/02/2012)

46. http://www.cancer.gov/dictionary?cdrid=45618 (15/03/2012)

47. http://www.hupo.org/research/hlpp/ (25/04/2012)

48. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54879 (10/06/2012)

49. http://www.mayoclinic.com/health/medical/IM04073 (30/03/2012)

50. http://www.medicinenet.com/liver_biopsy/article.htm (15/03/2012)

51. http://www.uniprot.org/ (05/06/2012)

52. www.matrixscience.com (05/06/2012)


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Megliorino%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067715

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Peng%20XX%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067715


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chen%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067715

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chan%20EK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17067715

http://www.jhep-elsevier.com/

http://benhvienk.com/index.php/vi/pcut/tin-tuc-phong-chong-ung-thu/677-dau-hieu-cua-benh-ung-thu-gan

http://benhvienk.com/index.php/vi/pcut/tin-tuc-phong-chong-ung-thu/677-dau-hieu-cua-benh-ung-thu-gan

http://cancerhelp.cancerresearchuk.org/type/liver-cancer/about/types-of-primary-liver-cancer

http://cancerhelp.cancerresearchuk.org/type/liver-cancer/about/types-of-primary-liver-cancer

http://expasy.org/swiss-2dpage/viewer

http://igrid-ext.cryst.bbk.ac.uk/WWW/PhD_thesis.htm

http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/adult-primary-liver/HealthProfessional/page3

http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/adult-primary-liver/HealthProfessional/page3

http://www.cancer.gov/dictionary?cdrid=45618

http://www.hupo.org/research/hlpp/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54879

http://www.mayoclinic.com/health/medical/IM04073

http://www.medicinenet.com/liver_biopsy/article.htm

http://www.uniprot.org/

http://www.matrixscience.com/

i

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Danh sách bệnh nhân ung thƣ tế bào gan

STT Họ và tên Giới tính Tuổi Mã Giai đoạn Ngày lấy mẫu

1 Bùi Xuân Đ. Nam 61 8261 T2N0M0 05/11/2010

2 Nguyễn Thị M. Nữ 69 8327 T2N0M0

10/11/2010

3 Phạm Văn T. Nam 62 8344 T1N0M0

4 Phạm Đăng N. Nam 54 8460 T2N0M0 18/11/2010

5 Nguyễn Văn B. Nam 49 8754 T2N0M0 10/12/2010

6 Trần Văn S. Nam 49 8786 T1N0M0 12/12/2010

7 Nguyễn Trọng P. Nam 56 8977 T2N0M0

24/12/2010 8 Phạm Văn Ơ. Nam 64 8935 T2N0M0

9 Lục Thị T. Nữ 63 8996 T3N1M0

10 Nguyễn Văn C. Nam 59 9242 T2N0M0 21/01/2011

11 Vũ Văn M. Nam 65 9543 T2N0M0

24/02/2011

12 Nguyễn Thị T. Nữ 63 9567 T1N0M0

13 Trần Hải A. Nam 46 10480 T2N0M0 04/05/2011

14 Nguyễn Ngọc T. Nam 51 13282 T2N0M0 15/11/2011

15 Triệu Văn L. Nam 41 13994 T1N0M0 06/01/2012

ii

Phụ lục 2. Phân tách protein mô gan của 5 bệnh nhân HCC trên bản gel

điện di hai chiều

Chiều 1: Điện di đẳng điện sử dụng thanh IPG strip dài 17cm, pH 3 - 10 (A1 và B1); IPG strip

dài 7cm, pH 4 - 7 (A2 và B2); Chiều 2: Điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 10%.

A - Mô gan bình thƣờng; B - Mô gan ung thƣ

1 - spot protein ST7L; 2 - spot protein aldehyde dehydrogenase; 3 - spot protein HSP27; 4 -

spot protein MHC lớp I.

Hình 2.1. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8261 trên bản gel 2-DE

iii



iv



v


vi

Phụ lục 3. Kết quả nhận dạng protein bằng cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng phần

mềm Mascot

vii

viii

Phụ lục 4. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của 3 bệnh nhân HCC


Hình 4.1. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 9242





Documents

xác định kháng nguyên phản ứng miễn dịch của bệnh nhân ung thƣ