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Xenotrasplante de islotes Xenotrasplante de islotes porcinos y células de Sertoli en porcinos y células de Sertoli en
pacientes diabéticos tipo 1. pacientes diabéticos tipo 1.
Dr. Rafael Valdés González-Salas
Laboratorio de Xenotrasplantes,Hospital Infantil de México Federico Gómez,
México, D.F. MEXICO.
AntecedentesAntecedentes
AntecedentesAntecedentes
• Diabetes en México.• Evolución del tratamiento
convencional.• Evolución del esquema intensivo• Trasplante de islotes (alogénico).• Trasplante de islotes (xenogénico).
JustificaciónJustificación
• Aún con el esquema intensivo las complicaciones aparecerán.
• En transplantes alogénicos:– Escasez de donadores cadavéricos.– Mayor riesgo de transmisión de
enfermedades. – Complicaciones quirúrgicas – Daño hepático– Alto costo del tratamiento inmunosupresor– Alto riesgo de complicaciones secundarias– Tiempo de sobrevida corto
XenotrasplanteXenotrasplante
• Riesgo de infección por Retrovirus Endógeno Porcino (PERV)
• Otras zoonosis
Retos del XenotrasplanteRetos del Xenotrasplante
• Supervivencia de las células implantadas: – Rechazo inmunológico– Factores no inmunológicos
• Compatibilidad funcional de las células implantadas– De la insulina porcina y otras hormonas– De los sistemas reguladores humanos
Diseño ExperimentalDiseño Experimental
a) Creación de un sitio inmunológicamente privilegiado:
• Dispositivo • Formación de colágena autóloga• Inmunomodulación por células de
Sertoli
b) Trasplante Islotes + Sertoli
DispositivoDispositivo
Usamos un dispositivo diseñado en Usamos un dispositivo diseñado en nuestro laboratorio, que consiste en un nuestro laboratorio, que consiste en un cilindro de malla metálica de 6 cm de largo, cilindro de malla metálica de 6 cm de largo, con dos tapones de polipropileno, uno de con dos tapones de polipropileno, uno de ellos con un émbolo que llena el cilindro. ellos con un émbolo que llena el cilindro.
Implante del dispositivoImplante del dispositivoDos meses antes del xenotrasplante, Dos meses antes del xenotrasplante, dos a cuatro dispositivos fueron dos a cuatro dispositivos fueron implantados subcutáneamente en la implantados subcutáneamente en la pared abdominal anterior. pared abdominal anterior.
Procesamiento de Islotes y Procesamiento de Islotes y SertolisSertolis
El páncreas y los testículos son El páncreas y los testículos son macerados y digeridos con una macerados y digeridos con una
solución de Liberasa HI. solución de Liberasa HI.
Se utilizan Se utilizan cerdos de 7 cerdos de 7 días de vidadías de vida
El páncreas es El páncreas es removido removido
inmediatamentinmediatamente después de e después de eutanasia por eutanasia por
exanguinación. exanguinación.
Los islotes y las Sertolis Los islotes y las Sertolis son cultivados son cultivados
separadamente a 37°Cseparadamente a 37°C
Control de calidadControl de calidadLa pureza de los islotes La pureza de los islotes
es de 88%es de 88%Con tinción de Ditizona.Con tinción de Ditizona.
Pureza de Sertoli 93.6%:Pureza de Sertoli 93.6%:por MIS y sox9.por MIS y sox9.
La viabilidad es determinada por La viabilidad es determinada por tinción de ioduro de propidio tinción de ioduro de propidio (Islotes:94%, Sertoli 95%) (Islotes:94%, Sertoli 95%)
Apoptosis (Islotes: 4.8%, Apoptosis (Islotes: 4.8%, Sertoli 10.5%)Sertoli 10.5%)
Cytometría de flujo contra Cytometría de flujo contra Annexina Annexina
Funcionalidad:Funcionalidad:
Índices de Índices de estimulación de estimulación de
Islotes =11.5Islotes =11.5
Sertoli:Sertoli:detección de detección de ClosterinasClosterinas
Diseño ExperimentalDiseño Experimental
– Reclutamiento Reclutamiento totalmente voluntariototalmente voluntario
– Pronóstico con Pronóstico con tratamientos actualestratamientos actuales
– Procedimiento Procedimiento ExperimentalExperimental
– ObjetivosObjetivos
– MetasMetas– RiesgosRiesgos– Costo económicoCosto económico– Obligaciones del Obligaciones del
voluntariovoluntario– Obligaciones del Obligaciones del
HospitalHospital
•12 adolescentes con Diabetes Tipo 1 12 adolescentes con Diabetes Tipo 1 •Consentimiento Informado:Consentimiento Informado:
BioéticaBioética
• Instituciones revisoras:– Comisión Nacional de Bioética– Facultad de Medicina, UNAM– Hospital Infantil de México Federico
Gómez
BioéticaBioética• Cumplimiento de la declaración de Helsinki
– “Art. 32. Cuando los métodos preventivos, diagnósticos o terapéuticos disponibles han resultado ineficaces en la atención de un enfermo, el médico, con el consentimiento informado del paciente, puede permitirse usar procedimientos preventivos, diagnósticos y terapéuticos nuevos o no probados, si, a su juicio, ello da alguna esperanza de salvar la vida, restituir la salud o aliviar el sufrimiento. Siempre que sea posible, tales medidas deben ser investigadas a fin de evaluar su seguridad y eficacia. En todos los casos, esa información nueva debe ser registrada y, cuando sea oportuno, publicada. Se deben seguir todas las otras normas pertinentes de esta Declaración..”
Diseño ExperimentalDiseño Experimental• Monitoreo:
– Requerimientos de insulina exógena– Hemoglobina glicosilada– Insulina porcina circulante – Antígenos Anti -Gal y hemolíticos de cerdo– PERV (incluyendo familiares cohabitantes)
• 1 dispositivo removido 3-5 años después, para permitir el retrasplante y tratar de obtener independencia de la insulina.– Detección inmunohistoquímica de:
• Células positivas a Glucagon• Células positivas a Insulina• Células positivas a CD3, CD4 y CD8• Células positivas a MIS y sox9 (Sertoli)
SeguridadSeguridad
• Medidas de seguridad de los animales en la granja:– Granja cerrada y aislada (5km).– Red contra aves.– Barreras contra roedores.– Programa extensivo de vacunación– Cuarentena estricta (Baño de entrada – Baño
de salida).– Monitoreo de salud aleatorio.– Registro e identificación detallada de cada
animal.
SeguridadSeguridad• Medidad de seguridad de los animales
donadores.• Tamiz microbiológico para:
– Aujeszky (elisa)– Erisipela (elisa)– Salmonella sp.(elisa)– Salmonella sp.(cultivo de hígado y válvula ileocecal)– Brucella a. (aglutinación).– Influenza Porcina (inhibición de aglutinación)– Leptospira (microaglutinación 16 especies).– Mycoplasma hyopneumoniae (elisa)– Coronavirus (elisa)– Toxoplasmosis (elisa)
ContingenciasContingenciasObserv. Clínica o Observ. Clínica o
de Lab de Lab sospechosasospechosa
Reunión Reunión de de
PersonaPersonall
DiagnósticoDiagnóstico
Tratamiento Tratamiento específicoespecífico
SeguimientoSeguimiento TratamientoTratamiento
HospitalHospitalOMSOMS
Granja Granja ProductoraProductora
Manual de Manual de bioseguridad de bioseguridad de
la granjala granja
Instituciones Instituciones ExternaExterna
ContactarContactarfamilias yfamilias yPersonas Personas cercanascercanas
Secretaría Secretaría de Saludde Salud
CuarentenaCuarentena
Retrovirus Endógeno PorcinoRetrovirus Endógeno Porcino
20361636
1018
506396
1 2 3 4
PERV 814 bp
Carriles:
1. Marcadores de tamaño
2. Control Negativo
3. DNA porcino
4. DNA de Pacientes
ResultadosResultados• Anticuerpos Anti -Gal
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
PreTx Día 7 Día 14 1mes 3mes 6mes Día 7 1mes
títu
los
1año
Tiempo Post trasplante
2nd Tx2° Tx
1212
1212
1212
88
1111
99
8855
1212
Anticuerpos en el ensayo Anticuerpos en el ensayo Mexicano (2000-2001) vs. El Sueco Mexicano (2000-2001) vs. El Sueco
(1990-1993)(1990-1993)Títulos de hemaglutininas IgM contra eritrocitos porcinos replicando Títulos de hemaglutininas IgM contra eritrocitos porcinos replicando exactamente el método de Lindeborg E. Xenotransplantation 2001: exactamente el método de Lindeborg E. Xenotransplantation 2001: 8; 273-283.8; 273-283.
22
44
88
1616
3232
6464
128128
256256
Valdes et al.Valdes et al. Groth et al.Groth et al.
**p<0.0001, Mann-Whitney U testp<0.0001, Mann-Whitney U test
Tit
er (
mea
n ±
sem
)T
iter
(m
ean
±se
m)
Requerimientos de InsulinaRequerimientos de Insulina
ResultadosResultados
0102030405060708090
ML (97%)
JO (68%)
PA (51%)
GS(100%)
AA (34%)
DO (86%)
Insu
lina E
xógena
Uni
dades/
día
Pre Tx Post Tx
•El primer grupo de 12 pacientes trasplantados al primer año del trasplante,
•6 no tuvieron reducciones, 6 mostraron reducciones variadas.
Paciente (% Reducción)
13
13 99
9.9
9.9
6.6
6.6
7.9
7.9 77 12
12
6.7
6.7
10
.81
0.8
7.4
7.4
8.9
8.9
7.1
7.1
HemoglobinaHemoglobinaGlicosiladaGlicosilada
ResultadosResultados
• Detección de insulina porcina en suero por HPLC
ResultadosResultados
• Un dispositivo fue removido de cada uno de los pacientes, para poder ser retrasplantados y posiblemente llegar a la independencia de insulina.
• Los dispositivos removidos fueron analizados por inmunohistoquímica para insulina, glucagon, MIS (un marcador de células de Sertoli), y CD3, CD4 y CD8.
InsulinaInsulina
11 11
22 22
33 334444
HEHE
GlucagonGlucagon
Sustancia Inhibidora Sustancia Inhibidora Mulleriana (MIS)Mulleriana (MIS)
ResultadosResultados
11
11
22
22
33
3344
44
55
55
66
66
CD3 HumanoCD3 Humano
InsulinaInsulina
Q-03-164-5Q-03-164-5
ResultadosResultados
ConclusionesConclusiones
• No ha habido señales de zoonosis• No hay complicaciones metabólicas• No hay intolerancia al dispositivo o al
procedimiento. • El sistema inmune de los pacientes
se mantiene intacto, medido por reacciones intradérmicas.
ConclusionesConclusiones
• Respuesta Inmune– Persistencia de insulina (100% de los
dispositivos removidos) y células positivas a glucagon (90%) en cantidades variables después de 5 años, y de manera sorprendente, coexistiendo con linfocitos T
– No hay correlación entre los niveles de anticuerpo y supervivencia de las células.
– No hay una respuesta típica después del retrasplante
ConclusionesConclusiones
• Modificaciones en los requerimientos de insulina exógena– En 50% de los casos hubo reducciones, en
algunos casos cerca de 100% por varios meses.
– El otro 50% pudiera no haber tenido suficientes células supervivientes, o una menor sensibilidad a la insulina.
• La presencia de insulina porcina se ha podido detectar en la circulación por medio de HPLC
Pasos InmediatosPasos Inmediatos
• Identificar los sistemas antigénicos en el cerdo que sean importantes para el xenotrasplante a humano– Respuesta humoral
• Anticuerpos Anti -Gal• Grupos sanguíneos tipo ABO• Fenómeno de Acomodamiento en los dispositivos• Pruebas de reactividad cruzada para antígenos
proteicos en islotes y Sertolis contra anticuerpos humanos preformados.
– Respuesta celular• Caracterización de los linfocitos T en los
dispositivos.
Pasos InmediatosPasos Inmediatos
• Cuantificación de la composición celular dentro de los dispositivos.
Hospital Infantil de México Hospital Infantil de México “Federico Gómez”“Federico Gómez”
Colaboración con otras Colaboración con otras Instituciones.Instituciones.
Dr Camillo Ricordi, Dr Luca InverardiDiabetes Research Institute,
University of Miami
Dr David White,Robarts Research Institute,University of Western Ontario
Dr Gordon Weir,Joslin Diabetes Center.Boston, MA
Dr Robert Elliott,Diatranz Ltd, New Zealand