DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA TRISTEZALEVANTE AGRÍCOLA N.° 245 (1983) (11-17)

DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA TRISTEZA (CTV)MEDIANTE LA TÉCNICA ELISA: INTERÉSY APLICACIONESM. CAMBRA. Departamento de Protección Vegetal.INIA-CRIDA 07. Moneada (Valencia)

1. INTRODUCCIÓN

El virus de la tristeza de los cí-tricos (CTV) ha causado pérdidasmuy elevadas a nivel mundial. EnEspaña, en 1957, se manifestó deforma epidémica, y desde enton-ces se calcula que han muertomás de ocho millones de árbolesinjertados sobre patrón amargo(Moreno et al., 1982). Otros tantosárboles podrían estar hoy díaafectados, y en plazos variablesmorirán o dejarán de ser produc-tivos.

En la lucha contra la tristeza esfundamental disponer de un méto-do fiable, rápido y sensible quepermita realizar económicamentelos miles de análisis necesariosen programas de erradicación ocontención, selección y controlsanitario de la producción, cen-tros de cuarentena y en proyectosde investigación en epidemiología,mejora genética de patrones, pro-tección cruzada, estudios de razaso diagnósticos de rutina.

Los métodos convencionales,fundamentalmente la inoculaciónde limas mejicanas (Wallace yDrake, 1951) han sido de gran va-lor, a pesar de sus limitaciones, yhan permitido durante los últimostreinta años diagnosticar de unamanera fiable el virus de la triste-za. En 1977, Clark y Adams en In-glaterra pusieron a punto un mé-todo inmunoenzimático para eldiagnóstico de virus fitopatóge-nos, que resultó prometedor conrespecto a los métodos conven-cionales e hizo intentar su aplica-ción a otros virus, entre ellos alde la tristeza.

Este método había sido emplea-do anteriormente en patología hu-mana bajo la denominación de ELI-SA (Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay) (Engvall y Perlmann, 1971).La técnica fue ideada por Avra-meas y Uriel (1966) en el Instituto

Pasteur y por Nakane y Pierce(1966) desarrollándola posterior-mente Avrameas (1969), que logróla conjugación o marcado de antí-genos y anticuerpos con enzimasmediante el uso del glutaraldehí-do. En 1974, Voller et al. pusierona punto el método en microplacasde poliestireno, tal y como hoy seutiliza.

En 1979, Bar Joseph et al. yCambra, Moreno y Navarro publi-caron la aplicación de la técnicaELISA al diagnóstico del virus de latristeza, demostrando su utilidadpara un diagnóstico rápido (vein-ticuatro horas) de la enfermedad,suponiendo su puesta a punto unconsiderable avance en las posibi-lidades de estudio del virus en nu-merosos aspectos.

Hoy en día, cinco años despuésde su primera aplicación en pato-logía vegetal, la técnica ELISA hasido comparada en cuanto a susensibilidad, con otras técnicasde diagnóstico, y se ha utilizadocomo herramienta en numerosostrabajos sobre patogenia, epide-miología, selección sanitaria ymejora genética de varios culti-vos. Se puede afirmar que se haconvertido en una técnica funda-mental y básica en virología vege-tal, de manera que su uso se hageneralizado en laboratorios de in-vestigación y control de la produc-ción y en gran número de empre-sas, para el diagnóstico rutinariode algunos virus para los cualesya se han comercializado los reac-tivos necesarios. En otros muchoscasos, como el del virus de la tris-teza, los reactivos comerciales es-tán en preparación, basados inclu-so en la utilización de anticuerposmonoclonales, y se prevé que acorto plazo puedan existir antisue-ros del virus de la tristeza en elmercado.

2. EL MÉTODO ELISA-DAS

Entre las variantes posibles dela técnica inmunoenzimática ELI-SA: directa, indirecta, «sandwich»(DAS, HADAS y F(ab')2) y competi-ción, la única utilizable para la de-tección de agentes patógenos devegetales es la «sandwich», quehabitualmente se utiliza en su for-ma DAS (Double Antibody Sand-wich).

Las cuatro etapas de la técnicason realizadas en microplacas depoliestireno de 96 pocilios confondo plano. Todas las operacio-nes a continuación descritas pue-den ser automatizadas con lasventajas que ello implica de obje-tividad, repetibilidad y aumentodel número de muestras que dia-riamente se pueden realizar.

I. Tapizado o sensibilización

A) Añadir a cada pocilio unasolución, en tampón fijador, deanticuerpos o inmunoglobulinaspurificadas específicas del virusde la tristeza.

B) Tapar la placa e incubar 4-5horas a 32-35° C. Durante este pe-ríodo las inmunoglobulinas queda-rán fijadas en la superficie de lospocilios de poliestireno, tapizán-dolos.

C) Lavar abundantemente, pa-ra eliminar las inmunoglobulinasque no se hayan fijado o lo hicie-ran deficientemente.

D) Las placas así tratadas,una vez secas, pueden almacenar-se a —20° C durante meses, has-ta su utilización, si no es inme-diata.

II. Adición de las muestras

A) Añadir a cada pocilio unhomogeneizado del material vege-tal a analizar, en un tampón de

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DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA TRISTEZA

extracción apropiado, para asegu-rar la estabilidad del virus.

B) Tapar la placa e incubar a4° C durante una noche. En esteperíodo, la cápsula o capsida pro-teica del virus o sus subunidadesse fija específicamente sobre lasinmunoglobulinas que tapizan orecubren la superficie del pocilio.

C) Lavar abundantemente paraeliminar los restos vegetales ytodo aquello que no haya reaccio-nado.

D) Al final del proceso única-mente el virus de la tristeza quedafijado en el pocilio por medio delas inmunoglobulinas específicasque tapizan los pocilios de laplaca.

En la aplicación del método esmuy Importante utilizar antisuerosde alta especificidad, es decir,con bajo contenido en inmunoglo-bulinas de proteína normal delhuésped. Así no existirán reaccio-nes con árboles sanos no conta-minados con el virus de la tris-teza.

El análisis rutinario de mues-tras consta de dos fases: recogidasistematizada de muestras encampo y realización de la técnicaELISA en laboratorio.

1. La recogida de muestras decampo puede realizarse en cual-quier época del año. Habitualmen-te se toman dos varetas por árbol,de unos siete centímetros de lon-gitud, de los brotes más jóvenesque haya. Se eliminan las hojas yambas varetas se rodean con cin-ta autoadhesiva, en la que se ano-ta la correspondiente nomenclatu-ra o clave de identificación (fotonúmero 1).

Se pueden recolectar juntoshasta cinco árboles para ser anali-zados simultáneamente en unaúnica muestra. Para prevenir laeventual necesidad de identificarposteriormente el árbol o árbolesinfectados, el material de cada ár-bol se insertará separadamentedel de los demás en la misma cin-ta autoadhesiva, de manera quelos cinco árboles constituyan unúnico paquete de varetas, peroque éstas queden individualizadasen la cinta, tal y como muestra lafoto número 1.

Los paquetes, ya sean indivi-duales o colectivos (de hasta cin-co árboles), se introducen en bol-sas de plástico, que se conservan

a 4-6° C hasta su traslado o envíoal laboratorio.

2. La preparación rutinaria dehomogeneizados (foto número 2)se realiza cortando en finas roda-jas las varetas de cada paquetesimultáneamente (0'2 g. son sufi-cientes). Las rodajas son introdu-cidas directamente en un tubo deplástico (8 cm. de largo por 2 cm.de diámetro), que se mantiene enuna gradilla con hielo picado paraasegurar una baja temperatura. Seañade un lampón de extracción a4° C (2 mi. por tubo) y se tritura lamuestra introduciendo el tubo enun homogeneizador de vastagoapropiado (foto número 3). Entremuestra y muestra, el vastago delaparato se lava durante unos se-gundos con agua fría.

Las muestras así homogeneiza-das se dispensan, mediante unapipeta automática, habitualmentea razón de muestra por pocilio dela placa. Igualmente se preparancontroles infectados por CTV y sa-nos, que se colocan en la placacomo testigos.

III. Adición del conjugadoinmunoglobulina-enzima

A) Añadir a cada pocilio unasolución de inmunoglobulinas delvirus de la tristeza marcadas conuna enzima (generalmente fosfata-sa alcalina). La dosis depende dela calidad del conjugado y de laespecificidad de las inmunoglobu-linas. La solución se realiza entampón de extracción.

B) Tapar la placa e incubar 3-4horas a 35° C. Durante este perío-do las inmunoglobulinas marca-das con la enzima reaccionan conel virus de la tristeza ya fijado alfinal de la etapa II, caso de estarpresente.

C) Lavar abundantemente paraeliminar las inmunoglobulinasconjugadas con enzima que nohayan reaccionado.

D) Se habrá formado el «sand-wich» de anticuerpos o inmuno-globulinas, de manera que única-mente habrá presencia de enzimaen el pocilio si el virus de la tris-teza estaba en la muestra ana-lizada.

IV. Revelado de la reaccióny lectura

A) Añadir a cada pocilio elsustrato específico sobre el cual

sea capaz de actuar la enzimamarcadora.

B) Incubar a temperatura am-biente hasta la aparición de unacoloración en los controles (mues-tras conocidas infectadas por tris-teza). El tiempo habitual de incu-bación suele ser de treinta a se-senta minutos. En este tiempo laenzima habrá sido capaz de ac-tuar sobre el sustrato y produciruna coloración.

C) Paralizar, si se desea, lareacción enzimática desnaturali-zando la enzima. Esta operaciónno es necesaria si posteriormentese realiza lectura automatizada yse ha empleado fosfatasa alcalinacomo enzima marcadora.

D) Realizar lectura visual o co-lorimétrica (a 405 nm.). Exclusiva-mente los pocilios de la placa querecibieron una muestra contami-nada por el virus de la tristezapresentarán coloración (foto nú-mero 4). La Intensidad de la colo-ración será proporcional a la can-tidad de antígenos fijados en elpocilio.

3. COMPARACIÓN CON OTRASTÉCNICAS DE DIAGNOSTICODEL VIRUS DE LA TRISTEZA

El virus de la tristeza no puedeser diagnosticado por simple sin-tomatología en campo, ya que eldecaimiento, más o menos rápido,que produce en árboles injertadossobre el patrón naranjo amargo noes específico. Además, son fre-cuentes casos de infección sinmanifestar síntomas externos y,por supuesto, cualquier árbol in-fectado injertado sobre patrón to-lerante a tristeza escaparía aldiagnóstico visual.

La presencia de punteaduras enla corteza del patrón amargo (in-verse stem pitting), justo debajode la línea de injerto, indica ennuestras condiciones la presenciadel virus, pero su ausencia no per-mite concluir la ausencia delmismo.

El diagnóstico de la tristeza pormétodos de invernadero o de labo-ratorio es imprescindible. El méto-do clásico de diagnóstico es lainoculación, por injerto, del ma-terial sospechoso en limas meji-canas cultivadas en maceta eninvernaderos climatizados a 18-25° C. Tras un período de dos a

DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA TRISTEZA

ocho meses las limas mejicanasinoculadas con material contami-nado mostrarán los síntomas típi-cos de la enfermedad (aclaramien-to de nerviaduras y stem pitting).

La prueba de la lima mejicanaes muy sensible, a pesar de detec-tar con dificultad razas débiles so-bre la propia lima, pero posee al-gunos otros inconvenientes impor-tantes, como la excesiva lentituden el diagnóstico, la dificultad desu aplicación a gran escala, suelevado coste y la dificultad deaplicación a tejidos vegetales cul-tivados «¡n vitro».

La rapidez del diagnóstico esmuy importante en programas deerradicación de la enfermedad. Lalentitud de la prueba en limas me-jicanas posibilita que árboles decampo diagnosticados como sa-nos hayan contraído la enferme-dad durante el período de dura-ción de la prueba debido a la di-fusión natural de la enfermedadmediante pulgones. Se hicieron in-tentos de combinar la microsco-pía electrónica con inoculacionesmúltiples en lima mejicana, demanera que diez muestras eran in-jertadas en la misma lima, y casode ser positiva la prueba, el árbolo árboles contaminados eran bus-cados por microscopía electrónica(Bar Joseph, Loebenstein y Oren,1974). El método, a pesar de sermás rápido, poseía una sensibili-dad mediana al basarse finalmen-te en la microscopía electrónica, yresultaba demasiado laborioso.

El elevado coste de cada prue-ba sobre lima mejicana vieneimpuesto por la realización delpropio injerto en invernaderos cli-matizados de elevada inversióneconómica y por la lentitud deldiagnóstico, que obliga a la per-manencia de las plantas en inver-nadero durante meses, con losconsiguientes gastos de cultivo ymantenimiento de instalaciones.En las condiciones españolas seha evaluado el coste de una prue-ba sobre lima mejicana en 5.000pesetas (Ballester, comunicaciónpersonal, 1983).

Debido a las desventajas deldiagnóstico sobre lima mejicana,la búsqueda de nuevas posibilida-des de diagnóstico del virus de latristeza se ha dirigido últimamen-te hacia métodos de laboratorio,como la observación de paracris-

tales o inclusiones del virus enplantas enfermas (Garnsey ef al.,1980), y sobre todo hacia la sero-logía, ya que la observación deparacristales, aun siendo muy rá-pida, no es una prueba sensible nipuede ser efectuada a gran escala.

Entre los métodos serológicospuestos a punto figuran, ademásdel inmunoenzimático ELISA, la in-monofluorescencia indirecta (Tsu-chizaki, Sasaki y Saito, 1978), lainmunodifusión doble con SDS(Garnsey, Gonsalves y Purcifull,1979) y la inmunoelectromicrosco-pía (Garnsey er al., 1980).

Los métodos serológicos ofre-cen las ventajas de ser muy rápi-dos y económicos, aunque su sen-sibilidad varíe, según las técnicas,de mediana a muy alta. El incon-veniente principal que poseen esla necesidad de obtención de anti-sueros de alta especificidad. Losantisueros se obtienen inmunizan-do animales con soluciones de vi-rus purificados.

Las reacciones serológicas sebasan en la combinación específi-ca del antígeno (virus) con los an-ticuerpos que contiene el antisue-ro. La reacción se realiza «in vi-tro», y cuando se produce se debea la presencia del virus, (antigeno)en la muestra analizada.

La inmunodifusión doble conSDS lleva a cabo la reacción sero-lógica en un soporte de agar quecontiene dodecil sulfato sódico(detergente) para degradar las par-tículas del virus de la tristeza que,debido a su tamaño (2.000 mm.),serían incapaces de migrar porlos poros del agar. La reacción espositiva cuando aparece un arco olínea de precipitado frente a unextracto de la muestra.

La sensibilidad de esta técnicaes mediana, pero permite realizarde una manera muy sencilla aproxi-madamente setecientas pruebascon un mililitro de antisuero bruto.

La inmunofluorescencia tienelos mismos fundamentos que latécnica ELISA, pero en este casose utilizan anticuerpos marcadoscon una sustancia excitable a losrayos ultravioleta. La reacción espositiva cuando, al observar lapreparación de la muestra al mi-croscopio con luz incidente ultra-violeta, presenta emisión de fluo-rescencia en alguna zona.

Se trata de una técnica de sen-sibilidad alta, pero no puede seraplicada a gran número de mues-tras diariamente, y por su delica-da interpretación, su utilizaciónqueda restringida a laboratoriosde investigación para usos con-cretos.

La inmunoelectromicroscopíacombina el poder de resolución dela microscopía electrónica con laespecificidad que ofrece la serolo-gía. Las partículas de virus, capta-das en rejillas tapizadas de anti-cuerpos, pueden ser visualizadasal microscopio electrónico detransmisión.

Es una técnica muy sensible,pero, por ser laboriosa y precisarequipos costosos, su utilizaciónse restringe a laboratorios espe-cializados.

La comparación de estas técni-cas serológicas con pruebas deinfectividad (inoculación de limasmejicanas) y la técnica ELISA, semuestra de forma resumida en elgráfico número 2 para distintoscriterios.

Las ventajas que ofrece la técni-ca ELISA sobre los demás métodosde diagnóstico del virus de la tris-teza se refieren fundamentalmentea su alta sensibilidad y a la posi-bilidad de ser utilizada de una for-ma simple y económica, pudiendoautomatizarse gran parte de surealización, para lo que no sonprecisos ni equipos costosos, niinstalaciones complicadas, ni con-sumo elevado de antisuero (conun mililitro de antisuero brutopueden realizarse diez mil prue-bas). Por todo ello, la técnica hasido adoptada, a partir de 1979,en los programas de erradiaciónde Israel (Raccah ef al., 1976), Ca-lifornia (Roistacher, 1976) y Anda-lucía Occidental, siendo utilizadaen los países citrícolas más avan-zados para el diagnóstico de ruti-na de la tristeza con otras mu-chas finalidades.

4. POSIBILIDADES Y UTILIDADDE LA TÉCNICA ELISAPARA EL DIAGNOSTICODE LA TRISTEZA

Desde su puesta a punto, latécnica ELISA ha hecho posible larealización de numerosos estudiossobre la enfermedad de la tristeza

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DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA TRISTEZA

que anteriormente hubieran resul-tado imposibles de efectuar o difí-ciles de abordar.

En proyectos de investigaciónla técnica es muy empleada paracomprobaciones rutinarias de lainfección de plantas tolerantesinoculadas artificialmente con laenfermedad. Estas plantas, quemultiplican al virus sin mostrarsíntomas, son muy utilizadas entrabajos de transmisión con vecto-res, estudios de razas o aislados,experiencias de traslocación delvirus, etc. Asimismo, se ha utiliza-do para comprobar la resistenciaa la enfermedad de diversas espe-

grandes zonas para actuar en con-secuencia.

En zonas con poca afección, in-ferior a un 1-2% de árboles conta-minados, la técnica ELISA posibili-taría la realización de programasde erradicación o de contenciónde la enfermedad mediante arran-que de los árboles enfermos y vi-gilancia periódica del resto paraevitar difusión.

La utilización de la técnica esde máxima importancia en paísesque no posean la enfermedad ybasen su citricultura en el patrónamargo. El uso de la técnica haríaposible la realización de controles

diante la técnica ELISA con gransensibilidad en material de inver-nadero, y se puede aplicar encampo en zonas suficientementecálidas. La técnica fue puesta apunto por Saillard eí al. (1978),Clark eí al. (1978) y Cambra y Mo-reno (1979). Se ha aplicado conéxito para la detección del mico-plasma en cicadélidos (Saillardeí al., 1979).

La bacteria Xanthomonas cam-pestris pathovar citri, causante dela cancrosis, gravísima enferme-dad de los cítricos en numerosospaíses de Asia, Sudamérica y Áfri-ca, puede ser diagnosticada me-

GRÁFICO NUM. 2

COMPARACIÓN DE TÉCNICAS DE DIAGNOSTICO DE CTV

Resumen comparativo Patogenicidad(lima mejicana)

Observaciónparacristales

SDS-IDD IF (i) IEM ELISA

Sensibilidad + + + + +Rapidez + + + + + + + +Sencillez + + + + + + + + +Economía + + + + + + + +Posibilidad uso en prospec-

ciones a gran escala + + + + + +

El número de cruces indica la mayor o menor idoneidad respecto al criterio señalado.SDS-IDD = lnmunodifusión doble con SDS.IF (I) = Inmunofluorescencia Indirecta.IEM = Inmunoelectromicroscopia.ELISA = Enzyme-Linked Immunosorben Assay.

cies y sus híbridos en programasde mejora genética (Garnsey,1981).

La técnica ELISA ha sido aplica-da con éxito para la detección delvirus de la tristeza (semipersisten-te) en pulgones portadores (Cam-bra eí al., 1981) y en material ve-getal cultivado «in vitro» (Navarroy Cambra, datos no publicados).

Desde un punto de vista prácti-co, la técnica es utilizada actual-mente en gran parte de los paísescitrícolas, constituyendo una prue-ba oficial aceptada internacional-mente.

La aplicación de la técnica ELI-SA es de gran interés en centrosde cuarentena, incluso en fronte-ra, donde se precisan resultadosrápidos y fiables, y permitiría rea-lizar intercambios de material ve-getal sin riesgos de contamina-ción por el virus de la tristeza.

En los países con la enferme-dad, la técnica ELISA puede serusada para la realización de ma-pas de afección que permitan, deuna forma estadística, conocer laincidencia de la enfermedad en

y prospecciones que permitierandetectar los primeros focos de laenfermedad a tiempo para erradi-carla. La técnica, al igual queotras serológicas, ofrece la venta-ja de detectar árboles enfermos,aunque no manifiesten síntomas.Esta situación ha sido comproba-da, incluso en árboles injertadossobre amargo, en Israel (Bar Jo-seph, eí al., 1980), en AndalucíaOccidental (Moreno ef al., 1980) yen Levante.

5. OTRAS APLICACIONESDE LA TÉCNICA ELISAEN CITRICULTURA

Las posibilidades de utilizaciónde la técnica ELISA para el estudioy diagnóstico del virus de la triste-za pueden ser aplicadas en granmedida a otros patógenos, paracuya detección se ha puesto apunto la técnica inmunoenzimática.

El micoplasma Spiroplasma ci-tri, causante de la enfermedad delStubborn, puede ser detectado me-

diante la técnica ELISA (Civerolo,1981).

El hongo Phoma tracheiphyla,causante del «mal secco», puedeser detectado por la técnica ELISAaplicada a su diagnóstico (Nach-mias eí al., 1979).

Finalmente, la técnica inmu-noenzimática ha sido puesta apunto para su aplicación al virusInfectious variegation-crinkly leaf(Garnsey, comunicación personal,1982) y a los virus citrus mosaic ySatsuma dwarf, que causan gra-ves daños en Japón (Kuhara eí al.,1981).

Las ventajas de la técnica ELISAimplicarán que, a medida que seobtengan antisueros de nuevosagentes patógenos de los cítricos,se intente la puesta a punto de latécnica, que igualmente tiene mu-chas posibilidades de ser utiliza-da, incluso en su forma indirecta,en caracterización varietal, detec-ción de proteínas y polisacáridosde alto peso molecular de loscítricos, estudios comparativosde patógenos y titulación de anti-sueros.

DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA TRISTEZA

Toma de muestras. Paquete de varetas co"las muestras individualizadas mediante cin-ta autoadhesiva, tal y como se toman de

campo.

Preparación de muestras. Corte del paquetede varetas en finas rodajas que por mediode un embudo caen directamente al tubo enel que se preparará el extracto. Los tubosse mantienen en hielo picado. Únicamenteson necesarios unos 0'2 gramos de material

vegetal para la realización del ensayo

Preparación de extractos. El material vege-tal a analizar es triturado dentro del tubo,en presencia de un tampón apropiado, me-diante un homogeneizador de vastago. La

operación dura unos segundos.

Resultado final de la técnica ELISA. Micro-p/aca con pocilios coloreados de amarilloque corresponden a árboles infectados porel virus de la tristeza. Los pocilios sin colo-ración corresponden a árboles sanos. La in-tensidad de la coloración es proporcional a

la concentración de virus en la muestra.

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DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA TRISTEZA

GRÁFICO NUM. 1

ETAPAS DEL MÉTODO ELISA-DAS. DIAGNOSTICO DE CTV

A A

A >

y \ u

B

I. TAPIZADO O SENSIBILIZACIÓN. —A: Añadir 0'2 mi. por pocilio de inmunoglo-t ulinas purificadas especificas del virus deI a tristeza (Ig-CTV), (2 (ig/ml. en lampón fija-dor. TF"); B: Incubar 4-5 h. a 35° C; C: Lavar• >n lampón lavador (TL*); D: Conservar se-

as las placas tapizadas a 20° C.

II?.* y.':v Vv*

B

II. ADICIÓN DE LA MUESTRA. —A: Aña-dir 0'2 mi. por pocilio de un homogeneizadodel material vegetal en (ampón de extrac-ción (TE") (10 ó 20 volúmenes de TE' por 1peso de material vegetal); B: Incubar 16 h. a4° C; C: Lavar; D: Los virus de la muestraquedarán fijados a las Ig-CTV del tapizado.

III ){•>

B

*•>>

w >

III. ADICIÓN DEL CONJUGADO. —A: Añadir 0'2 mi. por pocilio de una diluciónen TE" de Ig-CTV marcadas con la enzima'osfatasa alcalina; B: Incubar 3-4 h. a 35° C;C: Lavar; D: Se producirá la formación del«sandwich» de anticuerpos o inmunoglobuli-ñas. Únicamente habrá presencia de enzimasi había virus fijado.

IV

B D

IV. REVELADO DE LA REACCIÓN YLECTURA.—A: Añadir 0'25 mi. por pociliodel substrato específico de la enzima mar-cadora (TS*); B: Incubar a temperatura am-biente hasta aparición de una coloraciónamarilla intensa (30-60 minutos); C: Paralizarla reacción, si se desea, añadiendo 50 ¡i\esosa 10 M; D: Realizar lectura visual o colo-rimétrica (405 nm) anotando los pociliosamarillos. La intensidad de la coloraciónserá proporcional al contenido en virus dela muestra.

TF = 0'159% carbonato sódico+ 0'293% bicarbonato sódico + 0'02 azida sódica, en agua destilada, pH 9'6.TL = 0'85% cloruro sódico + 0'05% Tween 20+0'02% azida sódica, en agua destilada.

TE = 0'8% cloruro sódico + 0'04% fosfato monosódico + 0'27% fosfato di sódico+ 0'02% azida sódica, en agua destilada, pH 7'2 — 7'4 + 1% polivinil pirrolidona.TS = 0'6-1 mg/ml. p-nitrofenilfosfato en 10% dietanolamina en agua destilada, pH 9'8.

DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA TRISTEZA

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