Yeast two- hybrid system 을 활용한 Mycobacterium smegmatis 의 일산화탄소 산화관련 유사 유전자와 상호작용하는 단백질 분석

이정은

연구 배경과 목적 Mycobacterium smegmatis

호기적 조건하에서 일산화탄소 (CO) 를 유일한 에너지 및 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있는 carboxydobacteria

CO 를 산화하는데 필수적인 효소인 CO dehydrogenase (CO-DH) 존재함

CO-DH 는 물을 산화제로 이용하여 CO 를 CO2 로 산화시키는 주 효소

CO + H2O ---------- CO2 + 2H + 2e

Carboxydobacteria 에서 CO-DH 유전자 주변에 기능이 알려지지 않은 orf 들이 conserve 되어 있다 .

CO-DH 유전자 주변에 이러한 orf 들이 conserve 되어 있음을 보고 판단할 때 이들 orf 들이 CO-DH 와 관련되어 있을것이라 추정되므로 이들 orf 가 CO-DH 와 interacting 하는지 또는 이들 orf 들 끼리 interaction 하는지 알아보고자 하였다 또한 이들 Orf 와 interating 하는 다른 protein 이 있는지 알아보기로 한다 .

CO-DH+ -

cutB orf5orf2cutC cutA orf3 orf4orf1 orf6

cutB orf5orf2cutC cutA orf3 orf4cutR

Copy 1

Copy 2

Mycobacterium sp. strainJC1

M. tuberculosis

M. smegmatis

M. bovis

M. marinum

M. leprae

17.5 kb

Oligotropha carboxidovorans

Hydrogenophaga pseudoflava

Pseudomonas thermocarboxydovorans

Arthrobacter sp. FB24

Yeast two-hybrid system 이미 알고 있는 두 단백질 간의 상호작용을 확인하고자 할 경우나 , 이미

알고 있는 단백질과 상호 작용하는 또 다른 단백질을 스크리닝 하고자 할 때 사용할 수 있다 .

Regulator 들은 특정 염기 서열로 이루어진 promtor 부위와 결합하는 DNA- binding domain 과 RNA polymerase II 복합체와 직접적으로

작용하여 transformation 에 관여하는 기능을 수행하는 activation domai 으로 구성되어 있다 . Recombinant DNA technology 로 분리된 DNA- binding domain 과 activation

domain 은 상호작용이 가능한 단백질을 각각의 domain 의 유 전자에 결합시켜 yeast 에 발현 시키면 두 단백질에의 상호작용에 의해 두 domain 이 transcription 과 관련된 기능을 하게 됨으로써 유전자 발현이 가능해짐 .

연구 방법 1.Yeast two-hybrid system 을 위한 plasmid 제작

1) bait vector 제작 2) prey vector 제작

2.Yeast transformation

Bait vector 제작 Orf5 or Orf6 가 만들어지도록 primer 제작

Orf5F: 5’ GAA TTC ATG AAG ATC GCG AAC GAG TTC ACT G 3’R: 5’ GGA TCC TCA TCT GCC GCG AAG GGC CT 3’ Orf 6 F: 5’ GAA TTC ATG ACC GCA CCG CTG CTG CT 3’R: 5’ GGA TCC CTA AGC CCC GAG CAC GTC GA 3’

Orf 5 / Orf 6 PCR 수행

Template(Msm genomic DNA) 1 ㎕ Prrimer(F, R) 1 ㎕씩 Ex taq 0.5 ㎕ dNTP 4 ㎕ 10 X Ex taq buffer 2 ㎕ D.W 11.5 ㎕

Orf6 PCR product (1194 bp)

Orf5 PCR product (700 bp)

1 2 1 2 3

Lane 1: 1kb ladderLane 2 :Orf5 의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis

Lane 1 : 1kb ladderLane 2,3 :Orf6 의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis

Bait vector 제작• Sequencing the cloned pGEM-T easy vector containing PCR product

• Ligate with cloned PCR product with pAS2-1 for bait vector

Bait vector 제작

Orf6BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cutVector size: 8392 bpInsert size(orf6 ):1194 bp

Orf5BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cutVector size: 8392 bpInsert size(orf5 ):700 bp

1 2 3 4 5

Lane1,2,3,4 : pAS2-1 with orf5 를 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Lane5 : 1kb ladder

Prey vector 제작 Orf5 or Orf6 가 만들어지도록 primer 제작

Orf 5F: 5’ GGA TCC GAT GAA GAT CGC GAA CGA CTT 3’R: 5’ GAA TTC CTA TCA TCT GCC GCG AAG GGC CT 3’ Orf 6F: 5’ GAA TTC CTA AGC CCC GAG CAC GTC GAA CAA 3’R: 5’ GGA TCC GAT GAC CGC ACC GCT GCT GCT3’

Orf 5 / Orf 6 PCR 수행

Template(Msm genomic DNA) 1 ㎕ Prrimer(F, R) 1 ㎕씩 Ex taq 0.5 ㎕ dNTP 4 ㎕ 10 X Ex taq buffer 2 ㎕ D.W 11.5 ㎕

Orf6PCR product (1194 bp)

Orf5 PCR product (700 bp)

1 2 3 4 1 2 3 4 5

Lane 1: 1kb ladderLane 2,3,4 :Orf5 의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis

Lane1,2,3,4 :Orf6 의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatisLane 5 : 1kb ladder

Prey vector 제작• Sequencing the cloned pGEM-T easy vector containing PCR product

• Ligate with cloned PCR product with pGAD GH for prey vector

Prey vector 제작

Orf5BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cutVector size: 8009 bpInsert size(orf5 ):700 bp

Orf6BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cutVector size: 8009 bpInsert size(orf6 ):1194 bp

1 2 3 4 5

1 2 3 4 5

Lane1 : 1kb ladderLane,2,3,4,5 : pGAD GH with orf5 를 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut

Lane1 : 1kb ladderLane,2,3,4,5 : pGAD GH with orf6 를 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut

Yeast transformation1. Inoculate yeast colony into 1 ml of YPD

2. 30℃,250 rpm 에서 2~3 일 정도 키운다 .

3. 키운 yeast (1 ml) 을 50 ml of YPD 에 옮긴다 .

4. 다시 30℃, 250 rpm 에서 16~18 시간 정도 키운다 .

5. 잘 키운 yeast (30 ml) 를 300 ml 의 YPD 에 옮긴다 .

6. 다시 30℃, 230~270 rpm 에서 3 시간 정도 키운다 .

7. 1000 x g, 25℃, 5 min centrifuge

8.40 ml 의 증류수 또는 TE 에 resuspend

Yeast transformation9. 1000 x g, 25℃, 5 min centrifuge

10. 1.5 ml 의 1x TE/1x LiAc 에 resuspend

11. 0.1 ㎍ of plasmid DNA (co- transformation 일 경우 , 각각 0.1 ㎍ ) 와 0.1 ㎎ of herring sperm DNA 를 새 1.5 ml tube 에 넣는다 .

12. 0.1 ml 의 yeast competent cell 을 넣고 잘 섞는다 .

13. 0.6 ml 의 PEG / LiAc 용액을 넣고 10 초간 vortex

14. 30℃, 200 rpm 에서 30 분간 배양한다 .

15. 70 ㎕의 DMSO 를 넣고 , 위 아래로 5 회 뒤집어 섞는다 .

Yeast transformation16. 42℃, 15 분간 heat shock.

17. 얼음에 1-2 분간 방치

18. 14,000 rpm 으로 5 초간 원심 분리 후 , 상층액을 버린다

19. 0.5 ml 의 TE 에 resuspend.

20. 100 ㎕ 씩 SD+ DO 배지에 spreading ( DO: -Trp, -Leu,-His,-Ade /- Trp, -Leu)

앞으로의 실험 계획 제작되어 있는 orf 들의 bait vector 와 prey vector 를 이용하여 이들 Orf 들 어떤

상호작용이 있는지 확인한다 .

알고 있는 protein 과 상호 작용하는 unknown protein 어떤 protein 인지 알아 보기 위해 Mycobacterium smegmatis 의 cDNA library 를 제작한다 .

이런 protein 이 발현 될 수 있는 express vector(prey vector) 를 만든다 .

Yeast two-hybrid 방법을 이용하여 CO-DH 유전자 주변에 conserve 되어 있는 orf들과 interaction 하는 unknown protein 을 스크리닝한다 .