UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Jelena M. Veličković

Zavisnost produkcije biomase mikroalge izolovane iz

Vlasinskog jezera od izvora azota u podlozi

MASTER RAD

Niš, 2016.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

MASTER RAD

Zavisnost produkcije biomase mikroalge izolovane iz

Vlasinskog jezera od izvora azota u podlozi

Kandidat: Mentor:

Jelena Veličković 145 Dr Nataša Joković

Niš, 2016.

UNIVERSITY OF NIS

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

MASTER THESIS

The dependence of biomass production from the

microalga isolated from Vlasina lake on the source of

nitrogen in media

Candidate: Mentor:

Jelena Veličković PhD Nataša Joković

Niš, 2016.

Zahvalnica

Veliku zahvalnost dugujem svom mentoru, prof. dr Nataši Joković, za izdvojeno

vreme, strpljenje i uložen trud. Hvala na savetima, podršci i pomoći koju ste mi

pružili u toku izrade ovog master rada.

Zahvaljujem se i asistentu, Nikoli Stankoviću, za nesebičnu pomoć, dragocene

savete, strpljenje i vreme koje je uložio u toku izvođenja eksperimentalnog dela

rada.

Takođe, zahvaljujem se i dr Ivani Kostić na pomoći i vremenu koje je izdvojila u

toku eksperimentalnog dela rada.

Posebnu zahvalnost dugujem svojoj porodici bez čije podrške i pomoći ne bih

bila ovde. Beskrajno vam hvala na svemu…Volim vas…

Ne mogu ništa drugo reć' do hvala, i hvala i navijek hvala.

(William Shakespeare)

Biografija

Ime i prezime: Jelena Veličković

Datum rođenja: 16. 5. 1992.

Mesto rođenja: Surdulica

Osnovna škola: ,,Vuk Karadžić“ Surdulica (1999 –

2007)

Srednja škola: Gimnazija ,,Svetozar Marković“

Surdulica (2007 – 2011)

Fakultet: Prirodno-matematički fakultet u Nišu,

departman za biologiju i ekologiju

(2011 – 2016)

Osnovne akademske studije: smer biologija (2011 – 2014)

Master akademske studije: smer biologija (2014 – 2016)

Sažetak

Mikroalge predstavljaju značajnu sirovinu u biotehnologiji zbog visokog procenta

ugljenih hidrata, proteina, lipida i drugih metabolita koje sintetišu. Sojevi mikroalgi koji se

koriste u biotehnologiji, izoluju se iz različitih prirodnih sredina, a zatim se vrši njihova

karakterizacija u laboratorijskim uslovima. Kako bi se produkovala dovoljna biomasa

mikroalgi koja se može koristiti za dalja ispitivanja, potrebno je uraditi optimizaciju rasta

mikroalgi. Optimizacija rasta podrazumeva određivanje sastava podloge kao i uslova pod

kojima određeni soj mikroalge daje maksimalnu produkciju biomase.

U ovom radu, iz uzoraka vode sa Vlasinskog jezera, izolovan je jedan izolat

mikroalge koji je identifikovan kao predstavnik roda Closterium. Da bi se ispitalo kako izvori

azota utiču na rast mikroalge, mikroalga je gajena 16 dana na podlogama sa različitim

izvorima azota, amonijum fericitratom, natrijum nitratom i mešavinom ova dva jedinjenja.

Rast mikroalge praćen je spektrofotometrijski dok je usvajanje azota iz podloge određivano

hemijskim spektrofotometrijskim metodama. Nakon mesec dana gajenja mikroalge, određena

je produkovana biomasa gravimetrijskom metodom.

Mikroalga je pokazala dobar rast na podlozi sa amonijum fericitratom kao jedinim

izvorom azota, kao i na podlozi sa mešovitim izvorima azota, amonijum fericitratom i

natrijum nitratom. Rezultati hemijskih analiza uzoraka podloga na kojima je rasla mikroalga

pokazuli su da mikroalga ne usvaja nitrate iz podloga za rast već da koristi amonijumov jon

kao izvor azota. Prinos biomase nakon mesec dana gajenja mikroalge bio je najveći na

podlozi koja je sadržala amonijum fericitrat i natrijum nitrat.

Ključne reči: mikroalga, biomasa, izvori azota

Abstract

Microalgae represent a significant raw material in biotechnology due to their high

percentage of carbon hydrates, proteins, lipids and other metabolites they synthetize.

Microalgal strains which are used in biotechnology are isolated from different natural habitats

and then characterized in laboratory conditions. In order to produce a great enough biomass

of microalgae for use in further study, it is necessary to perform a growth optimization of

microalgae. Growth optimization implies determination of the media composition as well as

conditions under which a certain strain of microalgae gives the maximal production of

biomass.

In this study we have isolated an isolate of the microalga from water samples of

Vlasina lake, which has been identified as a representative of the Closterium genus. In order

to examine how nitrogen sources affect the growth of microalga, the microalga was grown

for 16 days on medias with different nitrogen sources, like ammonium fericitrate, sodium

nitrate and a mixture of these two compounds. The growth of microalga was

spectrophotometrically observed while the nitrogen absorption from the media was

determined by chemical spectrophotometric methods. After a month of microalgal growth,

the produced biomass was determined by a gravimetric method.

The microalga has shown a good growth on the medium with ammonium fericitrate as

the only nitrogen source, as well as on the medium with a mixture of nitrogen sources,

ammonium fericitrate and sodium nitrate. The results of chemical analysis of medium

samples on which the microalga grew have shown that the microalga doesn’t absorb nitrates

from medium for growth, but it instead uses ammonia ion as the source of nitrogen. The

biomass yield after a month of microalgal growth was the biggest on the medium which

contained ammonium fericitrate and sodium nitrate.

Key words: microalgae, biomass, nitrogen source

Sadržaj

1. Uvod ....................................................................................................................................... 1

1.1. Alge ................................................................................................................................. 2

1.2. Klasifikacija algi ............................................................................................................. 3

1.3. Alge u jezerima ............................................................................................................... 9

1.4. Uloga i značaj algi ......................................................................................................... 10

1.5. Upotreba algi u biotehnologiji....................................................................................... 11

1.6. Produkcija biomase algi ................................................................................................ 13

2. Ciljevi rada ........................................................................................................................... 15

3. Materijal i metode ................................................................................................................ 16

3.1. Materijal ........................................................................................................................ 16

3.1.1. Uzorkovanje............................................................................................................ 16

3.1.2. Podloge ................................................................................................................... 16

2.1.3. Reagensi.................................................................................................................. 16

3.2. Metode rada ................................................................................................................... 17

3.2.1. Izolacija algi ........................................................................................................... 17

3.2.2. Identifikacija algi .................................................................................................... 18

3.2.3. Zasejavanje podloga ............................................................................................... 18

3.2.4. Određivanje biomase algi ....................................................................................... 18

3.2.5. Određivanje koncentracije nitrata ........................................................................... 18

3.2.6. Određivanje koncentracije amonijumove soli ........................................................ 19

4. Rezultati i diskusija .............................................................................................................. 20

4.1. Izolacija algi iz Vlasinskog jezera ................................................................................. 20

4.2. Identifikacija mikroalge ................................................................................................ 20

4.3. Rast mikroalge u zavisnosti od izvora azota ................................................................. 21

4.4. Određivanje koncentracije nitrata i amonijum fericitrata u podlogama ........................ 23

4.5. Gravimetrijsko određivanje biomase mikroalge ........................................................... 25

5. Zaključci ........................................................................................................................... 27

6. Literatura .......................................................................................................................... 28

1

1. Uvod

Alge su fotosintetički jednoćelijski i višećelijski organizmi veličine od nekoliko

mikrometara do nekoliko desetina metara. Jednoćelijske mikroskopske alge nazivaju se

mikroalge i predstavljaju heterogenu grupu organizama koji naseljavaju različita staništa.

Mikroalge imaju značajnu ulogu u vodenim ekosistemima gde čine fitoplankton jer

predstavljaju producente organske materije, sintetišu kiseonik i smanjuju količinu ugljen-

dioksida u atmosferi.

Mikroalge se sve više upotrebljavaju u biotehnologiji kao novi izvori hrane za čoveka i

kao industrijska sirovina. S obzirom da veoma brzo rastu u laboratorijskim uslovima pri čemu

produkuju velike količine lipida, ugljenih hidrata i proteine, mogu se koristiti za različite

svrhe u biotehnologiji. Poslednjih godina, mikroalge predstavljaju atraktivnu sirovinu za

proizvodnju novih goriva, naročito biodizela jer neki sojevi produkuju velike količine ulja.

Sojevi mikroalgi koji se koriste u biotehnologiji, izolovani su iz različitih prirodnih

sredina. Danas postoji veliki broj projekata širom sveta koji se bave izolacijom,

identifikacijom i karakterizacijom sojeva mikroalgi sa ciljem upotrebe u biotehnologiji. S

obzirom da je rast mikroalgi u prirodnim uslovima i laboratorijskim uslovima različit,

potrebno je svaki izolovani soj mikroalgi ispitati u laboratoriji. Prvi korak je optimizacija

rasta mikroalgi kako bi se produkovala dovoljna biomasa koja se može koristiti za dalja

ispitivanja. Optimizacija rasta podrazumeva određivanje sastava podloge kao i uslova pod

kojima određeni soj mikroalge daje maksimalnu produkciju biomase.

2

1.1. Alge

Alge su široko rasprostranjena i značajna grupa organizama u prirodi. Naziv alga

potiče od latinske reči algae što znači morska trava. Neki predstavnici su višećelijski i imaju

vegetativno telo koje se naziva talus. Za razliku od biljaka, njihovo telo nikada nije

diferencirano na koren, stablo i list. Kod makroskopskih algi veličina talusa može biti i

nekoliko desetina metara, dok neke vrste morskih algi mogu da dostignu veličinu i do 200

metara. Posebnu grupu algi čine jednoćelijske alge ili mikroalge koje su mikroskopskih

veličina i mogu da formiraju kolonije kada rastu na odgovarajućim podlogama u

laboratorijskim uslovima.

Alge u svojim ćelijama sadrže hlorofil tako da mogu da vrše fotosintezu. Fotosinteza

je najvažniji biohemijski proces u kome se iz ugljen dioksida i vode sintetišu organska

jedninjenja, pri čemu se oslobađa kiseonik. Da bi se fotosinteza odvijala, neophodni su

određeni pigmenti koji su smešteni u organelama koje se zovu plastidi. Osnovni pigmenti su

iz grupe hlorofila, čiji se plastidi nazivaju hloroplasti. Osim njih, za fotosintezu su značajni i

pigmenti iz grupe karotena, ksantofila i fikobilina. Ukoliko oni dominiraju u plastidima, onda

se ti plastidi nazivaju hromoplasti. Plastidi mogu da budu različitog oblika (pločasti,

peharasti, zvezdasti, trakasti i slično). Postoje četiri vrste hlorofila: a, b, c i d. Hlorofil a,

karoteni i ksantofili se nalaze kod svih algi, dok se ostali pigmenti mogu naći kod pojedinih

predstavnika. Karoteni, ksantofili i fikobilini predstavljaju pomoćne pigmente, jer

apsorbovanu svetlost prenose do hlorofila a. Njihov značaj se ogleda u tome što mogu da

apsorbuju svetlost talasne dužine koju hlorofili ne mogu. Takođe, boja algi zavisi od

pigmenata, njihovog sastava i količine, kao i od svetlosnih uslova u kojima se razvijaju. Iako

su alge većinom fotoautotrofni organizmi, postoje i vrste koje se hrane heterotrofno

(Blaženčić, 2000).

Prvobitna sredina u kojoj su alge nastale je voda, ali su se mnoge tokom evolucije

prilagodile životu na kopnu. Možemo ih naći u zemljištu, na kori drveća i svim osvetljenim i

vlažnim mestima na kopnu. Žive samostalno ili u zajednici sa biljnim i životinjskim

organizmima (Blaženčić, 2000). Mogu da naseljavaju površinu biljaka i životinja, ostvaruju

simbiotske odnose kao što su alge i gljive u lišajima i alge i neke životinje primitivne

organizacije – zoohlorele. Takođe, među algama su otkriveni i paraziti (Mihailov-Krstev,

2008).

3

1.2. Klasifikacija algi

Alge su heterogena grupa organizama koja obuhvata prokariotske i eukariotske vrste.

U prokariote spadaju modrozelene alge (Cyanobacteriophyta) dok sve ostale spadaju u

eukariote (Duong et al., 2012). Pretpostavlja se da postoji 200 000 – 800 000 vrsta algi, od

kojih je do sada opisano oko 35 000 (Cardozo et al., 2007).

Klasifikacija algi se vrši na osnovu više kriterijuma. Osnovni kriterijumi su: prisustvo

ili odsustvo i građa pravog jedra, vrste pigmenata, rezervne materije, hemijski sastav

ćelijskog zida, prisustvo, broj i izgled flagela, način razmnožavanja (Mihailov-Krstev, 2008).

Međutim, neka od osnovnih pitanja filogenije nisu u potpunosti razjašnjena i to onemogućava

stvaranje jedinstvenog filogenetskog sistema za klasifikaciju algi. Zbog toga postoji veći broj

klasifikacionih shema gde su ovi organizmi svrstani u 8, 9, 10 ili više razdela (Blaženčić,

2000).

Alge su, na osnovu prethodno pomenutih kriterijuma, podeljene u 10 razdela:

Cyanobacteriophyta, Euglenophyta, Pyrrophyta, Bacillariophyta, Rhodophyta, Xanthophyta,

Chrysophyta, Phaeophyta, Chlorophyta i Charophyta (Mihailov-Krstev, 2008).

Razdeo Cyanobacteriophyta su modrozelene alge i jedini predstavnici sa

prokariotskim tipom ćelije. Tu spadaju najstariji jednoćelijski fotoautotrofni organizmi.

Sadrže hlorofil a, karotene, ksantofile i fikobilizome (granule sa c-fikocijaninom i c-

fikoeritrinom). Prilikom razmnožavanja deobom ćelija mogu da formiraju kolonije.

Naseljavaju sve tipove ekosistema i otporne su na temperaturne promene i sunčevu radijaciju.

Neki od najpoznatijih predstavnika pripadaju rodovima: Microcystis, Oscillatoria, Spirulina,

Lyngbya, Anabaena, Nostoc i drugi (Slika 1).

4

a) b) c)

d) e) f)

Slika 1. Predstavnici modrozelenih algi: a) Rod Microcystis, b) Rod Oscillatoria, c) Rod Spirulina, d)

Rod Lyngbya, e) Rod Anabaena, f) Rod Nostoc

Razdeo Euglenophyta su jednoćelijske monadoidne alge koje se odlikuju prisustvom

bičeva pomoću kojih se aktivno kreću. Njihove ćelije se odlikuju odsustvom ćelijskog zida, a

od pigmenata imaju hlorofile a i b, karotene i ksantofile. Razmnožavaju se uzdužnom

deobom ćelije. Naseljavaju male, slatke, stajaće vode i važni su kao bioindikatori zagađenosti

vode. Najpoznatiji rodovi su: Euglena, Phacus i Trachelomonas (Slika 2).

a) b) c)

Slika 2. Predstavnici razdela Euglenophyta: a) Rod Euglena, b) RodPhacus, c) Rod Trachelomonas

Razdeo Pyrrophyta ili vatrene alge obuhvata jednoćelijske pokretne predstavnike.

Sadrže hlorofile a i c, karotene i ksantofile. Zbog veće koncentracije karotena i ksantofila,

boja tela može da bude mrka, žuta ili crvena. Razmnožavaju se vegetativno (deobom ćelija),

bespolno (sporama) ili polno.Naseljavaju mora i slatke vode, ali im najviše pogoduju mora

tropskih predela. Značajni su kao bioindikatori stepena zagađenosti vode (Blaženčić, 2000).

Najznačajniji rodovi su: Peridinium, Cryptomonas, Gymnodinium i drugi (Slika 3).

5

a) b) c)

Slika 3. Predstavnici razdela Pyrrophyta: a) Rod Peridinium, b) Rod Cryptomonas, c) Rod

Gymnodinium

Razdelu Bacillariophyta pripadaju jednoćelijske i kolonijalne silikatne alge. Ove alge

se odllikuju prisustvom čvrstog omotača koji se naziva silikatni pancir ili teka. Imaju

hlorofile a i c, karotene i ksantofile. Razmnožavaju se vegetativno (deobom ćelija) i polno.

Naseljavaju slane i slatke vode, tresave, vlažno kamenje, zemljište, sneg i led. Dele se na 2

klase: Centrophyceace (centrične silikatne alge) sa najpoznatijim predstavnicima iz roda

Melosira i Pennatophyceace (penatne silikatne alge) sa poznatim predstavnicima iz rodova

Cocconeis, Navicula, Cymbella i drugi (Slika 4) (Mihailov-Krstev, 2008). Ove alge su

osetljive na koncentraciju hlorida u vodi, što ih čini značajnim bioindikatorima. Takođe se

koriste i u procesima biološkog čišćenja zagađenih voda. Osim što su primarni producenti

organske materije, ove alge su bogate vitaminima, belančevinama i mastima, pa su kvalitetna

hrana, a pritom produkuju i veliku količinu biomase. Ove alge poznate su i po tome što se od

njihovih ljuštura nakon uginuća stvara dijatomejski mulj. Naslage ovog mulja se nazivaju

dijatomit i koriste se u građevinarstvu, prehrambenoj i hemijskoj industriji (Blaženčić,2000).

a) b)

c) d)

Slika 4. Predstavnici razdela Bacillariophyta: a) Rod Melosira, b) Rod Cocconeis, c) Rod Navicula,

d) Rod Cymbella

6

Razdeo Rhodophyta ili crvene alge obuhvata jednoćelijske, kolonijalne alge.

Odlikuju se prisustvom dvoslojnog ćelijskog zida čiji spoljašnji sloj bubri u vodi i sluzav je.

Imaju hlorofile a i d, narandžaste karotene i ksantofile i plave i crvene fikobiline.

Razmnožavaju se vegetativno (deobom, raskidanjem kolonije), bespolno (sporama) ili polno.

Široko su rasprostranjene, naseljavaju bentos u priobalnoj zoni toplih mora, ali i u većim

dubinama, mogu se naći i u planktonu. Predstavnici pripadaju rodovima: Bangia, Porphyra,

Batrachospermum i drugi (Slika 5).

a) b) c)

Slika 5. Predstavnici razdela Rhodophyta:a) Rod Bangia, b) Rod Porphyra, c) Rod Batrachospermum

Razdeo Xanthophyta ili žutozelene alge su jednoćelijski, kolonijalni i višećelijski

organizmi. Imaju hlorofile a i c ili a i e, karotene i ksantofile koji daju boju talusu.

Razmnožavaju se vegetativno, bespolno ili polno. Široko su rasprostranjene i uglavnom

naseljavaju slatke čiste vode, ređe se mogu naći u morima, brakičnim vodama i zemljištu.

Najpoznatiji rodovi su: Tribonema, Vacheria i drugi (Slika 6).

a) b)

Slika 6. Predstavnici razdela Xanthophyta: a) Rod Tribonema, b) Rod Vaucheria

Razdeo Chrysophyta ili zlatne alge obuhvata jednoćelijske, kolonijalne i višećelijske

alge. Imaju hlorofile a i c, karotene i ksantofile. Razmnožavaju se vegetativno, bespolno ili

polno. Žive u slatkim, brakičnim i slanim vodama, uglavnom u planktonu. Predstavljaju

važnu kariku u lancima ishrane, kao i značajne primarne producente organske materije. Neke

vrste mogu da izazovu tzv. cvetanje vode, što je pokazatelj lošeg kvaliteta vode. Najznačajniji

rodovi su: Dinobryon, Chrysamoeba, Hydrurus i drugi (slika 7).

7

a) b) c)

Slika 7. Predstavnici razdela Chrysophyta: a) Rod Dinobryon, b) Rod Chrysamoeba, c) Rod Hydrurus

Razdeo Chlorophyta ili zelene alge obuhvata jednoćelijske, kolonijalne i višećelijske

predstavnike, aktivno pokretne i nepokretne. Zelena boja potiče od hlorofila a i hlorofila b, a

sadrže i karotene i ksantofile. Razmnožavaju se vegetativno, bespolno ili polno. Kosmopoliti

su, a najčešće se mogu naći u planktonu i bentosu slatkovodnih ekosistema. Najpoznatiji su

predstavnici rodova: Chlamidomonas, Scenedesmus, Volvox, Ulotrix, Spirogyra, Chlorella,

Cosmarium, Pediastrum i drugi (Slika 8).

a) b) c)

d) e) f)

g) h)

Slika 8. Predstavnici razdela Chlorophyta: a) Rod Chlamidomonas, b) Rod Scenedesmus, c) Rod

Volvox, d) Rod Ulotrix, e) Rod Spirogyra, f) Rod Chlorella, g) Rod Cosmarium, h) Rod Pediastrum

8

Razdeo Charophyta ili pršljenčice su višećelijske krupne alge koje podsećaju na

rastaviće (Equisetum) i jasno se razlikuju od drugih algi po svom talusu. Sadrže hlorofile a i

b, karotene i ksantofile. Razmnožavaju se vegetativno i polno. Naseljavaju uglavnom slatke

vode i bentosne su. Razdeo sadrži jednu klasu Characeae sa najpoznatijim predstavnicima iz

rodova Chara i Nitella (Slika 9).

a) b)

Slika 9. Predstavnici razdela Charophyta: a) Rod Chara, b) Rod Nitella

Razdeo Phaeophyta ili mrke alge su višećelijske, sesilne alge. Imaju krupan talus,

dvoslojni ćelijski zid koji bubri u vodi. Sadrže hlorofile a i c, narandžaste karotene i

ksantofile i fukoksantin koji je im daje mrku boju. Razmnožavaju se vegetativno, bespolno i

polno (Mihailov-Krstev, 2008). Samo 3 roda žive u slatkim vodama (Pleurocladia, Bodanella

i Lithoderma) (Blaženčić, 2000). Najznačajniji predstavnici pripadaju rodovima: Fucus,

Laminaria, Macrocystis, Ectocarpus i drugim (Slika 10).

a) b)

c) d)

Slika 10. Predstavnici razdela Phaeophyta: a) Rod Fucus, b) Rod Laminaria, c) Rod Macrocystis, d)

Rod Ectocarpus

9

1.3. Alge u jezerima

Alge koje naseljavaju vodenu sredinu dele se na bentosne i planktonske alge. Podela

je izvršena na osnovu dela vodenog basena u kome se razvijaju.

Životni ciklus bentosnih algi vezan je za dno vodenog basena, gde one mogu da budu

pričvršćene za podlogu (sesilne) ili nepričvršćene odnosno slobodne. Najveći broj bentosnih

algi koje mogu da se nađu u slatkim vodama pripadaju razdelu Chlorophyta i većina

predstavnika je sesilna. Osim njih, brojne su i alge iz razdela Bacillariophyta,

Cyanobacteriophyta i Chlorophyta, čiji su predstavnici uglavnom slobodni. Rasprostranjenje

algi zavisi od svetlosnog režima, pa se u čistim i prozračnim jezerima one mogu naći i na

dubinama od 50 m, dok se u manje providnim jezerima ne rasprostiru na većim dubinama od

10 m.

Planktonske alge čine jednoćelijski i kolonijalni organizmi koji slobodno lebde u

vodenoj masi i sa drugim biljnim organizmima čine fitoplankton. Ove alge su razvile brojne

morfološke i fiziološke adaptacije u cilju smanjenja svoje specifične težine kako bi se održale

slobodne u vodi. Neke od tih adaptacija su: gasne vakuole, ulje kao rezervna supstanca, razni

izraštaji, loptasto telo i druge. Rasprostranjenje ovih algi zavisi od svetlosnog režima,

temperature vode, saliniteta, mineralnih soli, ugljen-dioksida i kiseonika. Vegetacioni ciklus

fitoplanktona u jezerima koja se nalaze u umereno-kontinentalnoj klimi počinje u proleće, u

periodu mart-april. Prvi predstavnici jednoćelijskih algi koji se javljaju pripadaju razdelima

Pyrrophyta, Chrysophyta i Bacillariophyta i one su aktivno pokretne. Sa porastom

temperature (10 – 12 ºC) raste broj silikatnih algi, kojima se početkom leta pridružuje sve

veći broj zelenih, modrozelenih i zlatnih algi. Zelene i modrozelene alge su najbrojnije kada

temperatura vode dostigne 15 ºC i više i tada preovladavaju predstavnici rodova: Anabaena,

Microcystis, Oscillatoria, Pediastrum i druge. U jesen, sa opadanjem temperature, raste broj

silikatnih algi, a prisutne su i modrozelene alge. Na razviće fitoplanktona, osim temperature,

utiče i koncentracija nitrata i fosfata. S obzirom da je najveća koncentracija ovih jedinjenja u

proleće i jesen, tada se fitoplakton najviše i razvija. U toku leta dominiraju vrste kojima nije

potreba visoka koncentracija ovih jedinjenja i azot usvajaju iz minimalnih količina

(Blaženčić, 2000).

10

1.4. Uloga i značaj algi

Alge su osnovni producenti organske materije u ekosistemu, a primarna produkcija

predstavlja materijalnu i energetsku osnovu svih produkcionih odnosa u ekosistemu. Njihov

značaj se ogleda u tome što najveći broj ovih organizama pripada fotoautotrofima, odnosno

ima sposobnost fotosinteze. Brojna istraživanja primarne organske produkcije algi pokazala

su da se zahvaljujući njima stvara ogromna količina organskih materija na planeti (Blaženčić,

2000). S obzirom da se u procesu fotosinteze koristi ugljen-dioksid iz atmosfere, alge imaju

važnu ulogu u smanjenju efekta staklene bašte i globalnog zagrevanja (Wang et al., 2008;

Sheehan et al., 1998). Produkcija 100 tona biomase algi uklanja oko 183 tona ugljen-dioksida

iz atmosfere (Chisti, 2007). Osim toga, alge predstavljaju neiscrpan izvor kiseonika. Prema

procenama, mikroalge proizvode polovinu ukupnog atmosferskog kiseonika (Cardozo et al.,

2007).

Alge iz razdela Cyanobacteriophyta (modrozelene alge) imaju sposobnost vezivanja

molekularnog azota. Azot se nalazi u velikim količinama u atmosferi, ali je u tom obliku

nedostupan većini biljaka. Zbog toga je neophodno da se takav azot prevede u stanje u kome

biljke mogu da ga koriste. Ovu sposobnost, pored nekih mikroorganizama i bakterija, imaju i

modrozelene alge. Kako je kruženje azota jedan od najznačajnih bioloških ciklusa u procesu

kruženja materije, to je i značaj ovih algi veći (Blaženčić, 2000).

Alge su značajni indikatori stepena zagađenosti voda, jer su osetljive na kvalitativne i

kvantitativne promene osobina vode. Neke alge su miksotrofi što znači da koriste organske

supstance iz okolne sredine za rast i razvoj. Zahvaljujući ovoj sposobnosti, alge imaju značaj

u procesima biološkog prečišćavanja zagađenih voda. Njihova uloga se ogleda u tome što

koriste ugljen-dioksid koji se oslobađa u procesu truljenja, a za uzvrat oslobađaju i obogaćuju

vodu kiseonikom. Ovo njihovo svojstvo je našlo primenu i pri prečišćavanju otpadnih voda

(Blaženčić, 2000). Pokazalo se da su alge sposobne da uklanjaju policiklične aromatične

ugljovodonike, fenole, organske rastvarače, teške metale i patogene (Muñoz, 2006).

Alge su značajne za ishranu ljudi i životinja. Bogate su ugljenim hidratima,

belančevinama, mastima, vitaminima i mineralnim solima. Sadrže i znatne količine joda,

broma i drugih supstanci koje im daju dodatnu hranljivu vrednost. U ove svrhe više se koriste

morske od slatkovodnih algi (Blaženčić, 2000).

11

Alge su pogodne i za đubrenje zemljišta. Pored kalijumovih, azotnih i fosfornih soli,

preko njih u podlogu dospevaju i jod, arsen, bor i drugi elementi. Uglavnom se za dobijanje

đubriva koriste najkrupnije alge (Tešić i Marinović, 1966).

Alginati, soli alginske kiseline, koje se nalaze kod mrkih algi, koriste se u tekstilnoj,

prehrambenoj, građevinskoj i kozmetičkoj industriji (Tešić i Marinović, 1966). U tekstilnoj

industriji se koriste za slepljivanje vlakana, u građevinarstvu se dodaju cementu i asfaltu, kao

i drugim materijalima kako bi povećale njihove hidroizolacione sposobnosti (Blaženčić,

2000).

Agar-agar je jedna od značajnijih materija koja se dobija iz algi, uglavnom iz crvenih.

Koristi se za pravljenje čvrstih podloga u medicini i biologiji, zatim u tekstilnoj,

prehrambenoj i farmaceutskoj industriji, jer daje čvrstinu proizvodima (Blaženčić, 2000).

1.5. Upotreba algi u biotehnologiji

Glavni pritisak za korišćenje algi u biotehnologiji pojavio se sedamdesetih godina

prošlog veka kako bi se prevazišao manjak hrane i energije (Chen et al., 2009). Veliki

varijetet dostupnih mikroalgi može da se koristi u različite svrhe, kao što su proizvodi koji se

koriste u farmaceutske svrhe, usevi hrane za ljudsku potrošnju i izvori energije (Yin et al.,

2011). Poslednjih godina se mikroalge sve češće upotrebljavaju, jer mogu da obezbede

sirovine za različite tipove goriva kao što su biodizel, etanol, vodonik i metan koji su brzo

biorazgradivi i mogu da budu efikasniji od fosilnih goriva. U Americi je 2011. godine

proizvedeno bilion galona biodizela, naredne godine 1.1 bilion galona, dok je u 2013.

proizvodnja dostigla, čak, 1.8 biliona galona (Anonimus).

Zbog sve veće potražnje biogoriva postoji potreba za otkrićem produktivijih

nehranljivih izvora biomase koja može da se konvertuje u biodizel ili druga goriva (Lee et al.,

2014). Biodizel je netoksično i biorazgradivo alternativno gorivo koje se dobija hemijskom

reakcijom triacilglicerola (biljnih ulja ili životinjske masti) sa alkoholom pri čemu se

formiraju alkil estri masnih kiselina. Neke vrste algi, takođe, mogu da sintetišu

triacilglicerole koji se koriste kao osnovna sirovina za proizvodnju biodizela. Alge su bolja

sirovina za dobijanje biodizela u odnosu na biljke (suncokret, uljana repica i drugo) jer:

12

1. imaju veću produktivnost biomase u odnosu na biljke tako da neke vrste mogu da

udvostruče svoju biomasu za nekoliko sati,

2. neke vrste algi mogu da akumuliraju veliku količinu triacilglicerola u obliku ulja i

3. nije potrebno zemljište za gajenje algi kao što je slučaj sa biljkama (Scott et al., 2010).

Najbolje alge za proizvodnju biodizela su mikroalge, jer produkuju više ulja od

makroalgi i imaju brži rast (Altin et al., 2001), tako da predstavljaju obećavajući izvor ulja za

proizvodnju biodizela (Danilović et al., 2013). Jednoćelijske mikroalge rastu veoma brzo i

mogu da prođu ceo životni ciklus za nekoliko dana ako postoje adekvatni uslovi za njihov

razvoj (svetlost, voda, ugljen-dioksid, nutritijenti) (Li et al., 2008; Liu et al., 2008). Neke

vodene vrste algi imaju visok sadržaj ulja (i do 60% suve težine) i potencijal da postanu

značajno produktivniji izvor za proizvodnju biodizela kada se uporede sa terestričnim

usevima kao što je soja (Chisti, 2007; Hossain et al., 2008; Sakai et al., 1995; Kurano et al.,

1996). Naime, njihova mogućnost proizvodnje je do 100 puta više biodizela po jedinici

površine gajenja u odnosu na suncokret i uljanu repicu (Mata et al., 2010). Takođe, troškovi

transporta i izdvajanja mikroalgi su niži u odnosu na troškove drugih sirovina. Ne zahtevaju

mnogo prostora za gajenje i što je od velikog značaja nemaju negativan uticaj na svetske

zalihe hrane i vode (Hundt i Reddy, 2011). Njihovo gajenje može biti sprovedeno na mestima

koja nisu pogodna za razviće drugih biljaka. Osim toga, mogu se gajiti i na farmama i u

bioreaktorima (Danilović et al., 2013). Alge mogu da produkuju 1000 – 4000 galona ulja po

hektaru godišnje više od soje i drugih useva, mogu da žive u širokim klimatskim i vodenim

uslovima, nisu tradicionalna hrana, pa nisu u kompeticiji sa poljoprivredom (Chen et al.,

2009).

U poređenju sa drugim izvorima (životinjska mast, zrna žitarica i palmino ulje),

postoje izuzetne prednosti kada je u pitanju proizvodnja biodizela iz ulja mikroalgi (Duong et

al., 2012). Biodizel iz ulja algi ne sadrži sumpor, smanjuje emisiju čestica, ugljen-monoksida

i ugljovodonika. Proizvodnja ovakvog biodizela je možda jedini način da se proizvede

dovoljno motornog goriva da bi se zamenila sadašnja potrošnja benzina (Yin et al., 2011).

Veliki problem sa drugim alternativnim gorivima je taj što nisu kompatibilna sa

postojećim vozilima. Biodizel iz algi ima veliku prednost nad ostalim gorivima zato što je

hemijski kompatibilan sa postojećim dizel gorivom (Neltner, 2008).

Osim za proizvodnju biodizela, alge se mogu koristiti i u drugim granama

biotehnologije. Zahvaljujući velikoj sposobnosti adaptacije, mikroalge su postala dominantna

13

grupa organizama na zemlji, bogate su skrobom, uljima, proteinima i mogu da akumuliraju

važne sekundarne metabolite. Neke vrste, kao što je Spirulina sadrže mnogo proteina i gaje se

u različitim zemljama na industrijskom nivou (Chen et al., 2009). Potencijalna industrijska

primena algi se ogleda u tome što je preko 15 000 komponenti (antioksidansi, enzimi, masne

kiseline, peptidi, steroli i toksini) dobijeno iz algi (Danilović et al., 2013). Produkti

ekstrahovani iz algi mogu da se koriste kao izvor za organsko đubrivo ili produkte visoke

vrednosti kao što su omega-3 masne kiseline, steroli, karotenoidi i drugi pigmenti i

antioksidansi (Wang et al., 2008). Istraživanja su pokazala da mikroalge imaju potencijal da

se koriste kao vakcine za ljude i ribe (Rosenberg et al., 2008).

1.6. Produkcija biomase algi

Rast ćelija je jedna od fundamentalnih odlika koja određuje maksimalni potencijal

produkcije biomase algi. Ćelijski rast se sastoji iz dve faze – ranije, ćelijske proliferacije i

kasnije, povećanje obima ćelija. Obe direktno doprinose akumulaciji biomase. Očekuje se da

su brza deoba i rast ćelija najvažniji za produkciju biomase. Za neke manje i okrugle

mikroalge, čiji je dijametar nekoliko mikrometara, produkcija biomase je determinisana

stopom proliferacije (Chen et al., 2009).

Kao što je rečeno, alge su organizmi koji u procesu fotosinteze sintetišu

makromolekule. Konvertuju neorganski ugljenik u organske materije i snabdevaju sve

organizme na planeti energijom i supstancama neophodnim za život i rast. Neke vrste, pak,

koriste gotove organske molekule iz okruženja i ugrađuju ih. Takva metabolička aktivnost je

poznata pod nazivom heterotrofija. Za razliku od autotrofnih algi, heterotrofne rastu veoma

dobro i pri velikoj gustini ćelija, pa je njihova produkcija biomase obično veća. Postoje i

vrste algi koje mogu da koriste i ugljen dioksid i organske molekule, pa je njihova produkcija

biomase, verovatno, negde između prethodna dva načina ishrane (Chen et al., 2009).

Zahvaljujući jednostavnoj jednoćelijskoj strukturi, fotosinteza se odvija veoma brzo,

ugljenik se efikasno vezuje i produkcija biomase je brza (Danilović et al., 2013). Faktori koji

ograničavaju rast mikroalgi su: abiotički (svetlost, temperatura, koncentracija nutritijenata,

kiseonik, ugljen dioksid, pH, salinitet, toksični elementi), biotički (prisustvo patogena i

14

kompeticija sa drugim vrstama algi) i procesni (mešanje, stepen razblaženja i drugi) (Mata et

al., 2010).

Proizvodnja biomase fotoautotrofnih kultura je ograničena, jer se sa povećanjem broja

ćelija smanjuje dostupnost svetlosti. Povećan intenzitet svetlosti i malo iznad intenziteta koji

obezbeđuje maksimalnu brzinu rasta, dovodi do fotoinhibicije, odnosno do smanjenja brzine

rasta algi (Chisti, 2007). Što se tiče uticaja temperature na rast, pokazalo se da su mikroalge

otpornije na niže temperature (mogu preživeti i do 18 ºC niže temperature od optimalnih), a

povećanje temperature za svega 2-4 ºC je letalno (Mata et al., 2010). Mešanje je veoma važan

faktor, dovodi do ravnomerne distribucije ćelija, toplote i metabolita i ubrzava prenos mase

gasova. Rast može da inhibira smanjenje pH vrednosti usled povećanog sadržaja CO2 (Chiu

et al., 2009; De Morais i Costa, 2007).

Metabolizam mikroalgi je sličan metabolizmu viših biljaka. Naravno, nije moguće

predvideti unapred koje podloge alge mogu da koriste (Neilson i Lewin, 1974). Ključni faktor

kod heterotrofne kultivacije mikroalgi je kiseonik. Ograničenje kiseonika u kulturi može da

smanji stopu rasta i produkciju biomase. Takav je slučaj kod Chlorella-espp. (Wu i Shi,

2007).

Manipulacijom metaboličkih puteva može se preusmeriti ćelijska funkcija prema

sintezi željenih proizvoda i na taj način se mogu povećati sposobnosti mikroalgi.

Specijalizovanom kultivacijom mogu da se podstaknu promene u metabolizmu i tako se

dobije biomasa sa ciljanim metabolitom (Rosenberg et al., 2008).

15

2. Ciljevi rada

Imajući u vidu da mikoalge imaju veliki potencijal za primenu u različitim

biotehnološkim procesima, ciljevi ovog rada su:

izolacija mikroalgi iz uzorka vode sa Vlasinkog jezera,

identifikacija dobijenih izolata mikroskopkim metodama i

ispitivanje produkcije biomase mikroalgi u odnosu na različite izvore azota u

podlozi.

16

3. Materijal i metode

3.1. Materijal

3.1.1. Uzorkovanje

U ovom radu za izolaciju mikroalgi korišćeni su uzorci vode iz Vlasinskog jezera.

Uzorci su uzeti sa više lokaliteta i čuvani su u staklenim flašama. Flaše su bile izložene

svetlosti, a zatvarači nisu bili zatvoreni do kraja, dok nisu transportovane u laboratoriju.

3.1.2. Podloge

Za izolaciju, gajenje algi i pripremu inokuluma korišćena je BG11 (Blue-Green)

podloga (Tabela 1).

Tabela 1. Sastav BG11 podloge

Stok 1 (po litru) Stok 2 (po 500 ml) Stok 3 (po litru)

NaNO3 15.0 g K2HPO4 2.0 g H3BO3 2.86 g

MgSO4.7H2O 3.75 g MnCl2.4H2O 1.81 g

CaCl2.2H2O 1.80 g ZnSO4.7H2O 0.22 g

Limunska kiselina 0.30 g Na2MoO4.2H2O 0.39 g

Amonijum fericitrat 0.30 g CuSO4.5H2O 0.08g

EDTANa2 0.05 g Co(NO3)2.6H2O 0.05 g

Na2CO3 1.00 g

Podloga se pravi mešanjem 100 ml stoka 1, 10 ml stoka 2 i 1 ml stoka 3 i dodavanjem

dejonizovane vode do 1 litra. pH podloge je podešavan na 7.1 sa 1M NaOH ili HCl. Za

pravljenje čvrste podloge dodaje se bakteriološki agar 15 g po litru. Pripremljena podloga je

sterilizovana u autoklavu, 15 min 121 ºC.

Za ispitivanje uticaja azota na rast algi pored BG11 podloge korišćene su i

modifikovane BG11 podloge. U modifikovane podloge kao izvori azota dodavani su natrijum

nitrat (15 g/L) ili amonijum fericitrat (0.3 g/L). U podlozi koja je imala natrijum nitrat kao

izvor azota, dodat je feri hlorid (0.3 g/L) kao izvor gvožđa za rast algi.

2.1.3. Reagensi

Za određivanje nitrata u podlozi UV-spektrofotometrijski korišćeni su sledeći

reagensi:

1. demineralizovana voda,

17

2. osnovni rastvor nitrata, dobijen rastvaranjem 7211,9 mg osušenog kalijum-nitrata

(KNO3) i razblaživanjem do 1 litra vodom. Dobijen je rastvor koncentracije 1 ml

= 0,l mg N = 100 μg N,

3. standardni rastvor nitrata, dobijen razblaživanjem 100,0 ml osnovnog rastvora

nitrata do 1 litra vodom; dobijen rastvor koncentracije 1,00 ml = 10,0 μg N = 44,3

μg NO3,

4. hlorovodonična kiselina (HCl) 1 M,

5. suspenzija aluminijum-hidroksida; dobijena odmeravanjem 125 g

AlK(SO4)2·12H2O ili A1NH4(SO4)2. 12H2O i rastvaranjem u litru vode. Zatim je

zagrejana do 60ºC i postepeno je dodato 55 ml koncentrovanog rastvora

amonijaka, uz mešanje. Smeša je ostavljena da stoji jedan sat, zatim prebačena u

široku bocu, a talog ispran sukcesivnim dodavanjem i dekantovanjem vode (bez

sadržaja amonijaka, hlorida, nitrata i nitrite). Nakon taloženja, odekantovano je što

je moguće više bistre tečnosti i ostavljena je samo koncentrovana suspenzija.

Za određivanje koncentracije amonijumovog jona u podlozi sprektrofotometrijski

korišćeni su sledeći reagensi:

1. rastvor amonijum-hlorida dobijen je rastvaranjem 0,0314 g NH4Cl u 100 ml

destilovane vode (0,1 mg NH3/cm3)

2. neslerov reagens

3. rastvor sumporne kiseline, 0,05M dobijen rastvaranjem 2,7 cm3 H2SO4 u 1000 ml

destilovane vode.

3.2. Metode rada

3.2.1. Izolacija algi

Za izolaciju algi korišćene su sledeće metode:

- metoda iscrpljivanja eze (metoda poteza) – Ezom je zahvaćena mala količina početnog

uzorka (10μl) koja je prenešena na jedan deo podloge. Zatim je nanešena kap ezom

prevlačena i na druge delove podloge, tzv. striklovanje.

- metoda razlivanja kapi – Određena količina uzorka (500 μl) je prenešena na podlogu i

razlivena po površini podloge štapićem po Drigalskom.

18

Nakon zasejavanja podloga, Petri ploče su stavljene na inkubaciju u dobro osvetljenoj

prostoriji na sobnoj temperaturi 14 dana. Pojedinačne kolonije algi sa Petri ploča su dalje

prečišćavane prebacivanjem na nove Petri ploče do dobijanja uniformnih kolonija.

3.2.2. Identifikacija algi

Identifikacija algi rađena je na osnovu morfoloških karakteristika. Od kolonija sa Petri

ploča napravljeni su nativni preparati koji su posmatrani svetlosnnim mikroskopom na

uvećanju od 40 x (Leica DM 1000).

3.2.3. Zasejavanje podloga

Priprema inokuluma rađena je zasejavanjem BG11 tečne podloge kolonijama uzetim

sa Petri ploča. Zasejana podloga inkubirana je na sobnoj temperaturi (oko 28 ºC) 15 dana, uz

konstantno prisustvo svetlosti i mešanja na 210 obrtaja u minuti (PSU-20i, Multi-functional

Orbital Shaker).

Određivanje uticaja izvora azota na rast algi rađeno je u 3 podloge:

modifikovana BG11 podloga bez natrijum nitrata, ali sa amonijum fericitratom kao

izvorom azota (1),

modifikovana BG11 podloga bez amonijum fericitrata, ali sa natrijum nitratom kao

izvorom azota (2) i

BG11 podloga koja jej sadržala natrijum nitrat i amonijum fericitrat kako izvore azota

(3).

Podloge su zasejavane 2% inokulumom algi, inkubirane su na sobnoj temperaturi

(oko 28 ºC), uz konstantno prisustvo svetlosti i mešanjem na 210 obrtaja u minuti.

3.2.4. Određivanje biomase algi

Rast algi je praćen u periodu od 16 dana, uzimanjem uzoraka za određivanje biomase

na svakih 2 dana. Nagrađena biomasa algi je određivana spektrofotometrijski merenjem

apsorbance uzoraka na 620 nm.

Na kraju završenog perioda gajenja algi (30 dana), rađeno je gravimetrijsko

određivanje biomase. 10 ml podloge filtrirano je pod vakuumom i sušeno na filter papiru do

konstantne mase. Biomasa algi odrađena je kao razlika mase filter papira sa algama i filter

papira bez algi i izražena je kao masa mikroalgi/L/danu.

3.2.5. Određivanje koncentracije nitrata

Određivanje koncentracije nitrata u uzorcima podloga rađeno je UV-

spektrofotometrijski merenjem apsorbance uzoraka na 220 nm.

19

Najpre su pripremljeni kalibracioni standardi rastvora nitrata u opsegu od 0 do 8 mg

nitrata po litru i to razblaženjem do 50 ml sledećih zapremina standardnog rastvora nitrata: 0;

1,00; 2,00; 4,00; 6,00 i 8,00 ml. Pošto su ispitivani uzorci prilikom određivanja nitrata

razblaživani 1000 puta, obojenje uzorka je tako izbegnuto, a samim tim i postupak uklanjanja

obojenja koji se sastoji u dodavanju suspenzije Al(OH)3 i ceđenju kroz membran-filtar od

0,45 μm, kao i naknadno zakišeljavanje sa HCl.Očitana je apsorbanca svih standardnih

rastvora i uzoraka u odnosu na slepu probu (demineralizovana voda) na 220 i 275 nm.

3.2.6. Određivanje koncentracije amonijumove soli

Određivanje koncentracije amonijumove soli rađeno je Neslerovim reagensom tako

što se uzorak zakiseli pomoću H2SO4. Stvoreni amonijum-sulfat se određuje spektrofoto-

metrijski, jer uzorci koji sadrže amonijumov jon sa Neslerovim reagensom razvijaju žuto

obojenje, čiji intenzitet boje zavisi od količine amonijaka ili amonijumove soli u uzorku.

Najpre je napravljen radni rastvor NH4Cl odmeravanjem 10 ml primarnog rastvora i

rastvaranjem u normalnom sudu od 100 ml, pri čemu je dobijen rastvor koncentracije 0,01

mg NH3/ml. Od tog rastvora napravljena je standardna serija rastvora u normalnim sudovima

od 50 ml odmeravanjem 1, 2, 4, 6, 8 i 10 ml. Dobijeni rastvori su u opsegu koncentracija: 0,2;

0,4; 0,8; 1,2; 1,6 i 2 mg/L. Standardnim rastvorima je zatim dodato 10 ml 0,05 M H2SO4 i 2

ml Neslerovog reagensa, i nakon 15 minuta izmerena je apsorbanca rastvora na 425 nm.

Priprema slepe probe je izvršena tako što je u normalni sud od 50 ml odmereno 10 ml 0,05 M

H2SO4 i dodato 2 ml Neslerovog reagensa, a zatim je normalni sud dopunnjen do crte

destilovanom vodom. Uzorci su najpre razblaženi 100 puta, a onda je kao i kod pripreme

standardnih rastvora dodato 10 ml 0,05 M H2SO4 i 2 ml Neslerovog reagensa, i nakon 15

minuta izmerena je apsorbanca rastvora na 425 nm. Na osnovu konstruisanog kalibracionog

grafika, nanošenjem vrednosti apsorbance na ordinatu i koncentracije amonijumove soli na

apscisu, očitane su vrednosti koncentracije amonijumovog jona u ispitivanim uzorcima.

20

4. Rezultati i diskusija

4.1. Izolacija algi iz Vlasinskog jezera

Alge su veoma heterogena grupa organizama sa različitim morfološkim i fiziološkim

karakteristikama. Posledica ovako velikog diverziteta je heterogenost različitih vrsta algi u

odnosu na uslove njihovog rasta. Zato je lokacija sa koje se alge izoluju ključni faktor za

selekciju sojeva mikroalgi koje se mogu koristiti za produkciju biomase (Lee at al., 2014). U

ovom radu, mikroalge su izolovane iz uzoraka vode uzetih sa površine Vlasinskog jezera.

Vlasinsko jezero izabrano je kao lokalitet za izolaciju algi jer se nalazi na nadmorskoj visini

odod 1 204 m i predstavlja sredinu sa minimalnim uticajem čoveka. Korišćenim metodama

izolacije koje su opisane u delu Metode, dobijen je jedan izolat mikroalgi koji je formirao

kolonije zelene boje (Slika 11). S obzirom da je uzorak vode sa Vlasinskog jezera uzet

početkom aprila, kada su temperature bile niske tako da je tek krenuo vegetacioni ciklus

fitoplanktona, uočena je samo jedna vrsta kolonija pilikom prvog prebacivanja uzorka vode

na Petri ploče. Ovo ukazuje na mali broj mikroalgi u uzorku vode sa Vlasinskog jezera u

ovom periodu godine.

Slika 11. Kolonije mikroalge na Petri ploči

4.2. Identifikacija mikroalge

Slika nativnog preparata izolovane mikroalge dobijena svetlosnim mikroskopom pod

uvećanjem od 40 x prikazana je na Slici 12. Na osnovu morfoloških karakteristika, izolat

mikroalge identifikovan je kao predstavnik roda Closterium. Rod Closterium pripada razdelu

Chlorophyta. Vrste ovog roda su jednoćelijske alge koje imaju kokoidni tip morfološke

21

organizacije. Ćelije su izdužene, polumesečasto savijene i zašiljene na oba kraja. Izgrađene

su od dve simetrične polovine (polućelije) između kojih se nalazi suženje poznato kao istmus.

Dominantna grupa pigmenata su hlorofili a i b koji su smešteni u pločastim hloroplastima sa

pirenoidima.

Slika 12. Nativni preparat izolata mikroalge

Mikroalge iz roda Closterium su slatkovodne i najviše se razvijaju u oligotrofnim

vodama kao što su bare ali su izolovane iz različitih jezera (Descy et al., 1994).

4.3. Rast mikroalge u zavisnosti od izvora azota

Esencijalni elementi za rast algi su N, P, K, Ca, Mg, S, Fe, Cu, Zn i Mn koji se dodaju

u podloge u obliku soli. Koncentracija ovih elemenata varira od podloge do podloge

(Ilavarasi et al., 2011). Azot čini 1-10% suve mase mikroalgi i utiče na sastav ćelija i

metabolizam algi što ga čini jednim od najvažnijih elemenata (Perez-Garcia et al., 2010). Kao

izvor azota se najčešće koriste nitrati, amonijumove soli ili urea (Danilović et al., 2013).

U ovom radu je ispitivan rast mikroalge izolovane iz Vlasinskog jezera u tri podloge

sa različitim izvorima azota. Korišćena je BG11 podloga sa natrijum nitratom i amonijum

fericitratom kao izvorima azota, kao i modifikovane BG11 podloge koje sadrže samo

natrijum nitrat ili amonijum fericitrat. Rast mikroalge u korišćenim podlogama praćen je

spektrofotometrijski u periodu od 16 dana (Slika 13).

22

Slika 13. Rast mikroalge u podlogama sa različitim izvorima azota

(1 – podloga sa amonijum fericitratom, 2 – podloga sa natrijum nitratom, 3 – podloga sa amonijum

fericitratom i natrijum nitratom)

U svim podlogama sa različitim izvorom azota zapažen je rast mikroalge. U

podlogama sa amonijum fericitratom i mešavinom amonijum fericitrata i natrijum nitrata,

mikroalga ulazi u eksponencijalnu fazu rasta nakon osam dana inkubacije. Na kraju praćenog

perioda produkcije biomase (16 dana), veći rast mikroalge je zabeležen u podlozi sa

amonijum fericitratom (A620 0,25) u odnosu na podlogu sa dva izvora azota (A620 0,14). U

podlozi u kojoj je natrijum nitrat bio jedini izvor azota, rast mikroalge je bio najsporiji.

Početak eksponencijalne faze je tek nakon 14 dana od početka inkubacije, dok je nakon 16

dana vrednost apsorbance jako niska (A620 0,036).

Pretraživanjem literature nisu pronađeni podaci koji bi se odnosili na rast mikroalgi iz

roda Closterium u zavisnosti od izvora azota u podlozi. Rezultati dobijeni za druge zelene

mikroalge su u suprotnosti sa prikazanim rezultatima u ovom radu. Tako je pokazano da

mikroalga Scenedesmus bijugatus najbolju produkciju biomase ima kada su izvori azota

kalijum nitrat i natrijum nitrat u odnosu na ureu, kalcijum nitrat, amonijum nitrat i amonijum

hlorid (Arumugam et al., 2013). Takođe, urea i nitrati su se pokazali kao bolji izvori azota u

odnosu na amonijumove soli za rast mikroalgi iz rodova Chlorella i Neochloris (Converti et

al., 2009; Li et al., 2008). Sa druge strane morska alga iz roda Ellipsoidion je imala bolji rast

na podlozi sa amonijumovim solima u odnosu na podloge sa dodatkom nitrata i uree (Xu et

al., 2001).

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

2. 4. 6. 8. 10. 12. 14. 16.

Ap

so

rba

nca

Vreme (dani)

1

2

3

23

4.4. Određivanje koncentracije nitrata i amonijum fericitrata u podlogama

Tokom perioda praćenja rasta mikroalge u podlogama sa različitim izvorima azota,

rađena je hemijska analiza podloga koja je obuhvatala određivanje koncentracija nitrata i

amonijum fericitrata. Koncentracije su određivane spektrofotometrijskim metodama i

očitavane su na osnovu dobijenih kalibracionih grafika (Slika 14).

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ap

sorb

an

ca

Koncentracija nitrata (mg/L)

Slika 14. Kalibracioni grafici za nitrate i amonijumove soli

U Tabeli 2 prikazani su rezultati koncentracija amonijum fericitrata i nitrata u

različitim podlogama. Koncentracija nitrata je relativno konstantna tokom celog perioda

inkubacije u obe korišćene podloge sa dodatkom nitrata. Određena minimalna povećanja

koncentracije nitrata koja su izmerena tokom eksperimenta (Tabela 2) verovatno su posledica

ekperimentalne greške. Ovakvi rezultati ukazuju da ispitivana mikroalga ne koriti nitrate kao

24

samostalne izvore azota ni u kombinaciji sa amonijumovom soli. Jedan od mogućih razloga

zbog koga mikroalga korišćena u ovom radu ne može da koristi nitrate kao izvore azota za

rast je koncentracija natrijum nitrata u podlozi koja je visoka. Arumugam i saradnici (2013)

pokazali su da koncentracije nitrata u podlozi veće od 10 mM dovode do slabe produkcije

biomase mikroalgi, verovatno zbog štetnog delovanja azota na njihove ćelije što dovodi do

prestanka rasta ćelija.

Tabela 2. Koncentracije amonijum fericitrata i nitrata u različitim podlogama (1 – podloga sa

amonijum fericitratom, 2 – podloga sa natrijum nitratom, 3 – podloga sa amonijum fericitratom i

natrijum nitratom)

Dan Amonijum fericitrat (mg/L) Nitrati (mg/L)

1 3 2 3

2. 4,643 5,159 106,3 116,2

4. 4,006 4,876 115,1 113,3

6. 3,560 3,658 112,1 111,5

8. 3,268 3,071 109,2 121,0

10. 1,944 2,742 119,6 122,1

12. 0 2,136 129,2 135,7

14. 0 2,388 120,5 126,9

16. 0 0 119,0 122,1

Koncentracija amonijum fericitrata u praćenom periodu inkubacije opada kada se

samo amonijumov jon koristi kao izvor azota, kao i kada je u kombinaciji sa nitratima. Na

osnovu ovoga se može zaključiti da mikroalga koristi amonijumov jon kao izvor azota. U

podlozi gde je NH4+ jedini izvor azota, njegova koncentracija opada jako brzo tako da već

nakon 10 dana inkubacije u podlozi nema više amonijum fericitrata. Prisustvo nitrata

smanjuje unos NH4+ pa je brzina smanjenja njegove koncentracije u podlozi sa nitratima i

amonijum fericitratom manja u odnosu na podlogu gde je prisutan samo amonijum fericitrat

(Slika 15). Ukoliko se u podlozi nalaze mešoviti izvori azota, amonijumove soli se obično

prvo koriste za rast mikroalgi, a tek u kasnijim fazama gajenja nitrati ili urea (Eustanace et

al., 2013). Osim toga, u ovom radu je korišćen amonijum fericitrat kao izvor NH4+ koji je u

isto vreme i izvor gvožđa neophodnog za sintezu hlorofila, a samim tim i procesa fotosinteze.

25

Slika 15. Koncentracija amonijum fericitrata tokom gajenja mikroalge (1 – podloga sa amonijum

fericitratom, 3 – podloga sa amonijum fericitratom i natrijum nitratom)

Dobijeni rezultati za koncentraciju amonijum fericitrata i nitrata u podlogama se

poklapaju sa rezultatima produkcije biomase. Na ovaj način je potvrđeno da je rast mikroalge

u korelaciji sa unosom i korišćenjem NH4+ a da mikroalga praktično ne usvaja nitrate u

praćenom periodu gajenja.

4.5. Gravimetrijsko određivanje biomase mikroalge

Nakon mesec dana gajenja mikroalge na rotacionoj mućkalici, dobijen je različit rast u

korišćenim podlogama (Slika 16).

Slika 16. Erlenmajeri u kojima je gajena mikroalga na različitim podlogama

Produkovana biomasa je određivana gravimetrijski i rezultati su prikazani u Tabeli 3.

Najviše biomase produkovano je prilikom rasta mikroalge u podlozi sa mešavinom izvora

azota (natrijum nitrat i amonijum fericitrat). Nakon mesec dana gajenja u ovoj podlozi

proizvedeno je 0,123 g/L/d biomase. U ostalim podlogama produkovna biomasa je bila

značajno manja (Tabela 3). Iako je ispitivana mikroalga imala bolji rast u prvih 16 dana na

0

1

2

3

4

5

6

2. 4. 6. 8. 10. 12. 14. 16.Ko

nce

ntr

acija

(mg

/L)

Vreme (dani)

1

3

26

podlozi sa amonijum fericitratom u odnosu na podlogu sa mešavinom izvora azota, nakon

mesec dana gajenja, prinos biomase je na ovoj podlozi manji. Jedan od problema prilikom

korišćenja NH4+ kao izvora azota jeste smanjenje pH vrednosti podloge što može dovesti do

prestanka rasta ćelija (Eustance et al., 2013). Smanjenje pH vrednosti podloge dešava se zbog

unosa NH4+ katjona u ćeliju tako da ćelija izbacuje protone u spoljašnju sredinu da bi se

održala neutralnost unutar ćelija.

Tabela 3. Produktivnost biomase mikroalge u različitim podlogama (1– podloga sa amonijum

fericitratom, 2– podloga sa natrijum nitratom, 3– podloga sa amonijum fericitratom i natrijum

nitratom)

Produktivnost

biomase (g/L/d)

1 0.011

2 0,020

3 0.123

Da bi se određeni produkti ekstrahovali iz mikroalgi, potrebno je dobiti veliku

količinu biomase mikroalgi što je veoma često problem pri njihovom korišćenju u

biotehnologiji. Prinos biomase mikroalgi je različit i pre svega zavisi od korišćenog soja

mikroalge, kao i od optimizacije samog procesa produkcije odnosno sastava podloge i uslova

gajenja. U literaturi nisu pronađeni podaci koji bi se odnosili na produktivnost biomase vrsta

iz roda Closterium, dok je produktivnost kod ostalih mikroalgi od 0,04 do 4,1 g/L/d

(Danilović et al., 2014).

27

5. Zaključci

Na osnovu prikazanih rezultata mogu se doneti sledeći zaključci:

1. Iz uzoraka vode sa Vlasinskog jezera izolovan je jedan izolat mikroalge koji je

identifikovan kao predstavnik roda Closterium;

2. Mikroalga je pokazala dobar rast na podlozi sa amonijum fericitratom kao jedinim

izvorom azota, kao i na podlozi sa mešovitim izvorima azota, amonijum fericitratom i

natrijum nitratom;

3. Hemijske analize uzoraka podloga na kojima je rasla mikroalga pokazuju da

mikroalga ne usvaja nitrate iz podloga za rast već da koristi amonijumov jon kao izvor

azota;

4. Prinos biomase nakon mesec dana gajenja mikroalge bio je najveći na podlozi koja je

sadržala amonijum fericitrat i natrijum nitrat.

28

6. Literatura

Altin, R., Cetinkaya, S., Yucesu, H. S., 2001: The potential of using vegetable oil fiels

as fuel for diesel engines. – Energy Conversion and Menagement 42, 529-538.

Anonimus: http://biodiesel.org/production/production-statistics

Arumugam, M.,Agarwal, A., Arya M. C., Ahmed, Z., 2013:Influence of nitrogen

sources on biomass productivity of microalgae Scenedesmus bijugatus. -Bioresource

Technology 131, 246–249.

Blaženčić, J., 2000: Sistematika algi. – NNK Internacional, Beograd.

Cardozo, K. H., Guaratini, T., Barros, M. P., Falcao, V. R., Tonon, A. P., Lopes, N.

P., 2007: Metabolites from algae with economical impact. – Com. Biochem. Physiol.,

C 146, 60-78.

Chen, P. et al., 2009: Review of the biological and engineering aspects of algae to

fuels approach. - Int J Agric & Biol Eng 2, 4.

Chisti, Y., 2007: Biodiesel from microalgae. – Biotechnol. Adv. 25, 294-306.

Chiu, S. Y., Kao, C. Y., Tsai M. T., Ong, S. C., Chen, C. H., Lin, C. S., 2009: Lipid

accumulation and CO2 utilization of Nannochloropsis oculata in response to CO2

aeration. - Bioresource Technol. 100, 833–838.

Converti, A., Casazza, A. A., Ortiz, E. Y., Perego, P., Del Borghi, M., 2009: Effect of

temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of

Nannochloropsis oculata and Chlorellavulgaris for biodiesel production. - Chem.

Eng. Proc. 48, 1146–1151.

Danilović, B. R., Avramović, J. M., Ćirić, J. T., Savić, D. S., Veljković, V. B., 2013:

Proizvodnja biodizela iz ulja mikroalgi. – Savez hemijskih inženjera Srbije 68, 213-

232.

De Morais, M. G., Costa J. A. V., 2007: Carbon dioxide fixation by Chlorella

kessleri, C. vulgaris, Scenedesmus obliquus and Spirulina sp. cultivated in flasks and

vertical tubular photobioreactors. - Biotechnol. Lett. 29, 1349–1352.

Descy, J. P., Reynolds, C. S., Padisák, J., 1994: Phytoplankton in Turbid

Environments: Rivers and Shallow Lakes. - Springer Science & Business Media 100,

2013.

Duong, V. T., Li, Y., Nowak, E., Schenk, P. M., 2012: Microalgae Isolation and

Selection for Prospective Biodiesel Production. – Energies 5, 1835-1849.

Eustance, E., Gardner, R. D., Moll, K. M., Menicucci, J., Gerlach, R., Peyton, B. M.,

2013: Growth, nitrogen utilization and biodiesel potential for two chlorophytes grown

on ammonium, nitrate or urea. - Journal of Applied Phycology 25, 1663–1677.

Hossain, A.B., Salleh, A., Boyce, A. N., Chowdhury, P., Naqiuddin, M., 2008:

Biodiesel Fuel Production from algae as renewable energy. – Am J Biochem.

Biotechnol 4, 250-254.

Hundt, K., Reddy, B. V., 2011: Algal biodiesel production from power plant axhaust

and its potencial to replace petrodiesel and reduce greenhouse gas emissions. – Int. J.

Low-Carbon Technol. 6, 294-298.

29

Kurano, N., Ikemoto, H., Miyashita, H., Hasegawa, T., Hata, H., Miyachi, S., 1996:

Fixation and utilization of carbon dioxide by microalgal photosynthesis. - Energy

Conver Manage 36, 689-92.

Lee, K., Eisterhold, M. L., Rindi, F., Palanisami, S., Nam, P. K., 2014: Isolation and

screening of microalgae from natural habitats in the Midwestern United States of

America for biomass and biodiesel sources. – Journal of Natural Science, Biology and

Medicine 5, 332-339.

Li, Y, Horsman, M., Wang, B., Wu, N., Lan, C. Q., 2008: Effects of nitrogen sources

on cell growth and lipid accumulation of green alga Neochloris oleoabundans. – Appl.

Microbiol. Biotechnol. 81, 629-36.

Liu, Z. Y., Wang, G. C., Zhou, B. C., 2008: Effect of iron on growth and lipid

accumulation in Chlorella vulgaris. - Bioresour. Technol. 99, 4717-4722.

Mata, T., Martins, A., Caetaano, N., 2010: Microalgae for bidiesel production and

other applications. – A review, Renew. Sustain. Energ. Rev. 14, 217-232.

Mihailov-Krstev, T., 2008: Praktikum iz algologije i mikologije. – Prirodno-

matematički fakultet, Niš.

Muñoz, R. B. G., 2006: Water Research 40, 2799-2815.

Neilson, A.H., Lewin, R.A., 1974: The uptake and utilization of organic carbon by

algae: an essay in comparative biochemistry. - Phycologia 13, 227-264.

Neltner, B., 2008: Algae Based Biodiesel. – Algae 2, 5.

Perez-Garcia, O., Escalante, F. M. E., De-Bashan, L.E., Bashan, Y., 2010:

Heterotrophic cultures of microalgae: Metabolism and potencial products. – Elsevier

45, 11-36.

Rosenberg, J. N., Oyler, G. A., Wilkinson, L., Betenbaugh, M. J., 2008: A green light

for engineered algae: redirecting metabolism to fuel a biotechnology revolution. –

Current Opinion in Biotechnology 19, 430-436.

Sakai, N., Sakamoto, Y., Kishimoto, N., Chihara, M., Karube, I., 1995: Chlorella

strains from hot springs tolerant to high temperature and high CO2. – Energy Conver

Manage 36, 693-6.

Scott, S. A. et al., 2010: Biodiesel from algae: challenges and prospects. – Current

Opinion in Biotechnology 21, 277-286.

Sheehan, J., Dunahay, T., Benemann, J., Roessler, P., 1998: A Look Back at the U.S.

Deparment of Energy´s Aquatic Species Program: Biodiesel from microalgae. –

National Renewable Energy Laboratory: Golden, Colorado, USA.

Tešić, Ž., Marinović, R., 1966: Sistematika nižih biljaka, I deo. – Zavod za izdavanje

udžbenika SR Srbije, Beograd.

Wang, B., Li, Y., Wu, N., Lan, C. Q., 2008: CO2 bio-mitigation using microalgae. –

Appl. Microbiol. Biotechnol. 79, 707-718.

Wu, Z., Shi, X., 2007: Optimization for high-density cultivation of heterotrophic

Chlorella based on a hybrid neural network model. - Lett. Appl. Microbiol. 44, 13-18.

Xu, N., Zhang, X., Fan, X., Han, L., Zeng, C., 2001: Effects of nitrogen source and

concentration on growth rate and fatty acid composition of Ellipsoidion sp.

(Eustigmatophyta). - J. Appl. Phycol. 13, 463–469.

30

Yin, N. C., Yaakob, Z., Ali, E., Min, A., Wa, N. S., 2011: Characterization of Various

Microalgae for Biodiesel Fuel Production. – Journal of Materials Science and

Engeineering A 1, 80-86.

Slike algi su preuzete sa sledećih linkova:

http://cyanobacteria.myspecies.info/taxonomy/term/262

https://www.google.rs/search?q=microcystis&espv=2&biw=1366&bih=662&source=lnms&t

bm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwisyNvcwefPAhVkLsAKHV0iBTgQ_AUIBigB&dpr=1#tbm

=isch&q=oscillatoria&imgrc=4dapg8x0QYjEqM%3A

http://algae-lab.com/product/spirulina-maxima-live-algae-2/

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/Images/Prokaryotes/Oscillatoriaceae/Lyngbya/sp_01.jpg

https://www.google.rs/search?q=microcystis&espv=2&biw=1366&bih=662&source=lnms&t

bm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwisyNvcwefPAhVkLsAKHV0iBTgQ_AUIBigB&dpr=1#tbm

=isch&q=anabaena&imgrc=Qye_8yU-KxXz_M%3A

https://www.google.rs/search?q=nostoc&espv=2&biw=1366&bih=662&site=webhp&source

=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjDjsvow-

fPAhXMJ8AKHUeVClsQ_AUIBigB#imgrc=7HD2eGkxzj28BM%3A

https://www.google.rs/search?q=nostoc&espv=2&biw=1366&bih=662&site=webhp&source

=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwjDjsvow-

fPAhXMJ8AKHUeVClsQ_AUIBigB#tbm=isch&q=euglenophyte&imgrc=7jZJ827cnJ1UhM

%3A

https://www.google.rs/search?q=phacus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiP

_JHKxOfPAhUBuhQKHZd2Da8Q_AUICCgB&biw=1366&bih=662#imgdii=awujxP4Nj9K

4EM%3A%3BawujxP4Nj9K4EM%3A%3BK9yfyc8vAJR6rM%3A&imgrc=awujxP4Nj9K4

EM%3A

https://www.google.rs/search?q=phacus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiP

_JHKxOfPAhUBuhQKHZd2Da8Q_AUICCgB&biw=1366&bih=662#tbm=isch&q=trachelo

monas&imgrc=D4_0IESY2_FlxM%3A

https://www.google.rs/search?q=phacus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiP

_JHKxOfPAhUBuhQKHZd2Da8Q_AUICCgB&biw=1366&bih=662#tbm=isch&q=peridini

um&imgrc=YyTZktjd0iixQM%3A

https://www.google.rs/search?q=phacus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiP

_JHKxOfPAhUBuhQKHZd2Da8Q_AUICCgB&biw=1366&bih=662#tbm=isch&q=cryptom

onas&imgdii=giyD-jpo2JHiLM%3A%3BgiyD-

jpo2JHiLM%3A%3B5Wve2UqS_0OPYM%3A&imgrc=giyD-jpo2JHiLM%3A

31

https://www.google.rs/search?q=phacus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiP

_JHKxOfPAhUBuhQKHZd2Da8Q_AUICCgB&biw=1366&bih=662#tbm=isch&q=gymnodi

nium&imgrc=BQtvdZzKXUCq9M%3A

https://www.google.rs/search?q=phacus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiP

_JHKxOfPAhUBuhQKHZd2Da8Q_AUICCgB&biw=1366&bih=662#tbm=isch&q=melosira

&imgrc=IenIudzYNogCAM%3A

https://www.google.rs/search?q=phacus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiP

_JHKxOfPAhUBuhQKHZd2Da8Q_AUICCgB&biw=1366&bih=662#tbm=isch&q=cocconei

s&imgrc=1qSmqNRJ-6Je5M%3A

https://www.google.rs/search?q=phacus&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiP

_JHKxOfPAhUBuhQKHZd2Da8Q_AUICCgB&biw=1366&bih=662#tbm=isch&q=navicula

+&imgrc=4g3zs4JLbrH8RM%3A

https://www.google.rs/search?q=cymbella&biw=1366&bih=662&tbm=isch&tbo=u&source=

univ&sa=X&ved=0ahUKEwjThI7Py-

fPAhUDLcAKHbbaAIgQsAQIHA#imgrc=LozSRM61c51A4M%3A

https://www.google.rs/search?q=bangia&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=isch&sa=

X&ved=0ahUKEwiApKSCzOfPAhUFC8AKHTe0ArQQ_AUIBygC#imgrc=7lq8oOK7en_L

PM%3A

https://www.google.rs/search?q=porphyra&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=isch&s

a=X&ved=0ahUKEwjb5rTQzOfPAhUsIcAKHRTRAxEQ_AUIBigB#imgrc=ot47rb3HdM5

ReM%3A

https://www.google.rs/search?q=batrachospermum&biw=1366&bih=662&tbm=isch&tbo=u

&source=univ&sa=X&ved=0ahUKEwio4seAzefPAhWLI8AKHSbjB5EQsAQIGQ#imgrc=C

YEVBkY9ibHSCM%3A

https://www.google.rs/search?q=tribonema&biw=1366&bih=662&tbm=isch&tbo=u&source

=univ&sa=X&ved=0ahUKEwis16aszefPAhXGBsAKHU5rBigQsAQIGQ#imgrc=WyuhTtU

M7aDDyM%3A

https://www.google.rs/search?q=vaucheria&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=isch&

sa=X&ved=0ahUKEwi6r9PGzefPAhVBCsAKHaLpBZ0Q_AUIBigB#imgrc=_WCbudsA44

1fVM%3A

http://protist.i.hosei.ac.jp/PDB/images/Heterokontophyta/Dinobryon/sertularia/sp_20.jpg

https://www.google.rs/search?q=chrysamoeba&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=isc

h&sa=X&ved=0ahUKEwi9x-K8zufPAhVBJcAKHaXSB8YQ_AUIBigB#imgrc=8fbysVR-

wTyXBM%3A

https://www.google.rs/search?q=hydrurus&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=isch&s

a=X&ved=0ahUKEwi8w_vQz-

fPAhVpIMAKHfVYBMwQ_AUIBigB#imgrc=Uw429BlZUpYvNM%3A

32

https://www.google.rs/search?q=chlamydomonas&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=

isch&sa=X&ved=0ahUKEwjXntzyz-

fPAhXnLsAKHeWJDo4Q_AUIBigB#imgrc=iEbNZWsIvBOTOM%3A

https://www.google.rs/search?q=chlamydomonas&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=

isch&sa=X&ved=0ahUKEwjXntzyz-

fPAhXnLsAKHeWJDo4Q_AUIBigB#tbm=isch&q=scenedesmus&imgrc=yYOg4m6-

RgxA0M%3A

https://www.google.rs/search?q=chlamydomonas&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=

isch&sa=X&ved=0ahUKEwjXntzyz-

fPAhXnLsAKHeWJDo4Q_AUIBigB#tbm=isch&q=volvox&imgrc=TVsiPJj5NVbDyM%3A

https://www.google.rs/search?q=chlamydomonas&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=

isch&sa=X&ved=0ahUKEwjXntzyz-

fPAhXnLsAKHeWJDo4Q_AUIBigB#tbm=isch&q=ulothrix&imgrc=QzAMjysSoRjEtM%3

A

https://www.google.rs/search?q=chlamydomonas&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=

isch&sa=X&ved=0ahUKEwjXntzyz-

fPAhXnLsAKHeWJDo4Q_AUIBigB#tbm=isch&q=spirogyra&imgrc=-

PXQB35z7Ty6vM%3A

https://www.google.rs/search?q=chlamydomonas&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=

isch&sa=X&ved=0ahUKEwjXntzyz-

fPAhXnLsAKHeWJDo4Q_AUIBigB#tbm=isch&q=chlorella&imgrc=z6-

SmqRa45Ab_M%3A

https://www.google.rs/search?q=chlamydomonas&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=

isch&sa=X&ved=0ahUKEwjXntzyz-

fPAhXnLsAKHeWJDo4Q_AUIBigB#tbm=isch&q=cosmarium&imgrc=TxPb-

Uky50w7lM%3A

https://www.google.rs/search?q=chlamydomonas&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=

isch&sa=X&ved=0ahUKEwjXntzyz-

fPAhXnLsAKHeWJDo4Q_AUIBigB#tbm=isch&q=pediastrum&imgrc=b47jff34En1idM%3

A

https://www.google.rs/search?q=chara&espv=2&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=is

ch&sa=X&ved=0ahUKEwjl-O_e0efPAhUHAsAKHdHZD-

IQ_AUIBigB#tbm=isch&q=chara+algae&imgrc=O5YCgAY8RT17FM%3A

https://www.google.rs/search?q=chara&espv=2&biw=1366&bih=662&source=lnms&tbm=is

ch&sa=X&ved=0ahUKEwjl-O_e0efPAhUHAsAKHdHZD-

IQ_AUIBigB#q=nitella&tbm=isch&tbs=rimg%3ACarEFfjCOubxIjj1EDURz9aELVSsegbo

KP3jAbMcccT4YTObUjeTg6RZWGG5px-

HNWl8s89yBD4RIM1NwhveMCfoASoSCfUQNRHP1oQtESxVIZpiiYjMKhIJVKx6Bugo_

1eMRi7jaUPmuO9wqEgkBsxxxxPhhMxE1hZrViWRhqyoSCZtSN5ODpFlYEb6qEXV-

IQZVKhIJYbmnH4c1aXwRf7PMOo7RW34qEgmzz3IEPhEgzREZ-

oT9oFFPwyoSCU3CG94wJ-gBEesZA8-i9Bm_1&imgrc=Tl-KL3JNRrHxjM%3A

33

https://www.google.rs/search?q=fucus&espv=2&biw=1366&bih=662&tbm=isch&tbo=u&so

urce=univ&sa=X&ved=0ahUKEwioitj10ufPAhXFLMAKHRgiC28QsAQIJw#imgrc=GsGIO

XfhqtROzM%3A

https://www.google.rs/search?q=laminaria&espv=2&biw=1366&bih=662&source=lnms&tb

m=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiIoJTI0-

fPAhVILcAKHdenDBUQ_AUIBigB#imgrc=ul2ayzEdm9CLWM%3A

https://www.google.rs/search?q=macrocystis&espv=2&biw=1366&bih=662&tbm=isch&tbo

=u&source=univ&sa=X&ved=0ahUKEwiZheDz0-

fPAhWhAsAKHQKwCWwQsAQIJw#imgrc=kY7SaDUSP5pIbM%3A

https://www.google.rs/search?q=ectocarpus&espv=2&biw=1366&bih=662&tbm=isch&tbo=

u&source=univ&sa=X&ved=0ahUKEwje1JWQ1OfPAhWrKsAKHaTeCk4QsAQIGQ#imgr

c=5dJRWLpYF20YvM%3A

34

Прилог 4/1

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: Монографска

Тип записа, ТЗ: Текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Јелена Величковић

Ментор, МН: Наташа Јоковић

Наслов рада, НР: ЗАВИСНОСТ ПРОДУКЦИЈЕ БИОМАСЕ МИКРОАЛГЕ ИЗОЛОВАНЕ ИЗ ВЛАСИНСКОГ ЈЕЗЕРА ОД ИЗВОРА АЗОТА У ПОДЛОЗИ

Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2016.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО:

(поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

6 поглавља, 43 стране, 16 слика, 3 табеле

Научна област, НО: Биологија

Научна дисциплина, НД: Алгологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО:

УДК 662.6/.9 : 582.26 + (497.11) : 556.55 + 661.938

Чува се, ЧУ: Библиотека

Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Микроалге представљају значајну сировину у биотехнологији због високог процента

угљених хидрата, протеина, липида и других метаболита које синтетишу. Сојеви

микроалги који се користе у биотехнологији, изолују се из различитих природних

средина, а затим се врши њихова карактеризација у лабораторијским условима.

Како би се продуковала довољна биомаса микроалги која се може користити за

даља испитивања, потребно је урадити оптимизацију раста микроалги.

Оптимизација раста подразумева одређиванје састава подлоге као и услова под

којима одређени сој микроалге даје максималну продукцију биомасе.

У овом раду, из узорака воде са Власинског језера, изолован је један изолат

микроалге који је идентификован као представник рода Closterium. Да би се

испитало како извори азота утичу на раст микроалге, микроалга је гајена 16 дана на

подлогама са различитим изворима азота, амонијум ферицитратом, натријум

нитратом и мешавином ова два једињења. Раст микроалге праћен је

спектрофотометријски док је усвајање азота из подлоге одређивано хемијским

спектрофотометријским методама. Након месец дана гајења микроалге, одређена је

продукована биомаса гравиметријском методом.

Микроалга је показала добар раст на подлози са амонијум ферицитратом као

јединим извором азота, као и на подлози са мешовитим изворима азота, амонијум

ферицитратом и натријум нитратом. Резултати хемијских анализа узорака подлога

на којима је расла микроалга показали су да микроалга не усваја нитрате из подлога

за раст, већ да користи амонијумов јон као извор азота. Принос биомасе након

месец дана гајења микроалге био је највећи на подлози која је садржала амонијум

ферицитрат и натријум нитрат.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

Члан, ментор:

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

35

Прилог 4/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Jelena Veličković

Mentor, MN: Nataša Joković

Title, TI: The dependence of biomass production from microalgae isolated from Vlasina

lake on the source of nitrogen in media

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2016

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD:

(chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/a

ppendixes)

6 chapters, 43 pages, 16 pictures, 3 tables

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: algology

Subject/Key words, S/KW:

UC 662.6/.9 : 582.26 + (497.11) : 556.55 + 661.938

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: Microalgae represent a significant raw material in biotechnology due to their high percentage of carbon hydrates, proteins, lipids and other metabolites they synthetize. Microalgae breeds which are used in biotechnology are isolated from different natural habitats and then characterized in laboratory conditions. In order to produce a great enough biomass of microalgae for use in further study, it is necessary to perform a growth optimization of microalgae. Growth optimization implies determination of the media composition as well as conditions under which a certain breed of microalgae gives the maximal production of biomass. In this study we have isolated an isolate of a microalgae from water samples of Vlasina lake, which has been identified as a representative of the Closterium genus. In order to examine how nitrogen sources affect the growth of microalgae, the microalgae was grown for 16 days on medias with different nitrogen sources, like ammonium fericitrate, sodium nitrate and a mixture of these two compounds. The growth of microalgae was spectrophotometrically observed while the nitrogen absorption from the media was determined by chemical spectrophotometric methods. After a month of microalgae growth, the produced biomass was determined by a gravimetric method.The microalgae has shown a good growth on the media with ammonium fericitrate as the only nitrogen source, as well as on the media with a mixture of nitrogen sources, ammonium fericitrate and sodium nitrate. The results of chemical analysis of media samples on which the microalgae grew have shown that the microalgae doesn’t absorb nitrates from medias for growth, but it instead uses ammonia ion as the source of nitrogen. The biomass yield after a month of microalgae growth was the biggest on the media which contained ammonium fericitrate and sodium nitrate.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

Образац Q4.09.13 - Издање 1