1

Inżynieria genetyczna Ćwiczenie 3

Metoda PCR została opracowana w

1987 r. przez grupę Naukowców z

Cetus Corporation w USA. Firma

Roche odkupiła od Cetus Corp. prawa

do PCR za 300 mln $

Autor K. Mullis otrzymał w 1993r.

nagrodę Nobla w dziedzinie chemii.

2

Początkowo stosowano fragment Klenowa polimerazy DNA I z E. coli, który

wykazuje aktywność 5’→3’ polimerazy oraz 3’ →5’ egzonukleazy, brakuje

natomiast aktywności 5’ →3’ egzonukleazy, dzięki czemu nie występuje

niebezpieczeństwo degradacji primerów podczas reakcji. Polimeraza ta

była niestabilna w wyższych temperaturach, dlatego konieczne było

dodawanie jej kolejnej porcji w każdym kolejnym cyklu.

Niekorzystne cechy tej polimerazy

zostały wyeliminowane przez użycie

polimerazy Taq z termofilnych bakterii

Thermus aquaticus – temperatura

denaturacji matrycy nie pozbawia

enzymu aktywności.

1. Matryca DNA (RNA) 2. Startery 3. dNTP 4. MgCl2

5. Polimeraza 6. Bufor

3

najlepiej dodać najpierw wodę, a następnie kolejno pozostałe

składniki

mieszaninę reakcyjną przetrzymujemy w lodzie podczas pracy

gdy matrycą jest powszechnie używane DNA w laboratorium

lub gdy są jej śladowe ilości, to praca powinna odbywać się w

laminarnym przepływie sterylnego powietrza, a tipsy i pipety

powinny być zabezpieczone korkami

podczas pracy z małymi objętościami komponentów (1-2 μl)

trzeba uważać, aby do wszystkich prób dodana została

jednakowa ilość (szczególnie ważne przy ilościowym PCR)

Niekorzystna zbyt duża/zbyt niska liczba matryc

- Ilość DNA 1ng-1μg

- Wyjściowa liczba matryc:

DNA człowieka 3*10-5

DNA drożdży 1μg

DNA E. Coli 1ng

Odpowiedni stopień czystości (UV, elektroforeza ) -

Zanieczyszczenia matrycy: SDS, EDTA, DMSO,

heparyna, fenol, sole

Metoda izolacji - usunięcie inhibitorów reakcji

4

Efekt zbyt dużej

liczby matryc

Degradacja

DNA

Polimeraza Taq:

•Wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus

•Aktywność polimerazy 5’-3’

•Aktywność egzonukleazy 5’-3’

•Brak aktywności egzonukleazy 3’-5’

•Aktywność polimerazy Taq – około 2000 nt/min (60 nt/s) w

optym. temperaturze 72-78°C

•Po reakcji na końcach 3' kilka nukleotydów adeninowych,

właściwość wykorzystywana jest przy klonowaniu produktów

PCR.

•Do swej aktywności wymaga jonów Mg2+

•Procesywność, wierność, szybkość

5

Cechy: - odpowiednia długość (18- 28 nt) - zawartość GC 50- 60 %

Tm [2n1(A+T)+4n2(G+C)]- 5 55-72˚C Ta 40- 55 ˚C

-wyznaczana doświadczalnie

-wpływ na specyficzność

Dobór stężenia roboczego 10 pmol/ μl

-zbyt duże stężenie- niespecyficzność produktów

Dimery starterów - komplementarność końców 3’

metoda oparta o %GC: Tm[oC] = 81,5 + 16,6 x log[Na] + 0,41 x (%GC) -

675/długość - 0,65 x (%formamidu) - (%niekomplementarnych)

metoda uproszczona: Tm = [2o x (A + T) + 4o x (G + C)]

metoda w oparciu o zasady sąsiadujące

6

startery - najczęściej to ich sekwencja i stężenie decyduje o powodzeniu reakcji:

nie powinny tworzyć wewnętrznych struktur 2-rzędowych

Powinny mieć wyrównaną zawartość zasad G/C i A/T

nie mogą komplementować między sobą na 3’ końcu

nie mogą zbyt silnie wiązać na 3’ końcu

do 5’ można dodawać: miejsca cięcia dla enzymów restrykcyjnych, tzw.

lepkie końce

stężenie 0,1-0,5 M (za dużo - pomyłki, za mało - mniej produktu)

startery zdegenerowane,

modyfikacje: biotynowanie, zabezpieczanie przed 3’ degradacją - wiązania

fosfotiolowe, fosforylacja

Źle zaprojektowane startery

http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html

7

Wpływ temperatury wiązania starterów

- termocykler z gradientem temp.

- wyznaczanie optymalnej Tm

dNTP-trifosforany deoksyrybonukleotydów

niezrównoważony skład obniża dokładność polimerazy,

stężenie wyjściowe: 5-10 mM stężenie reakcji: 20-200 µM

jednakowe stężenie wszystkich dNTP

pH 7,

8

MgCl2 - 0,5-5,0 mM - wpływa na

aktywność enzymu, zwiększa Tm dsDNA,

tworzy kompleksy z dNTP dając substrat

dla polimerazy,

Stężenie jonów Mg > stężenie dNTP

Wrażliwość na degradację

Rozkład- przyczyna braku produktu

dATP:dGTP: dCTP: dTTP

Stosowanie jednakowych stężeń

dNTP

Stężenie optymalne 20- 200µM

Wzrost dokładności polimerazy

Stężenie MgCl2 nieco wyższe od steżenia dNTP

Dokładność reakcji

Proporcjonalna do stężenia wolnych MgCl2

MgCl2

Wiązanie przez: matrycę, startery, polimerazę Taq, dNTP

9

Należy zwrócić uwagę na:

- Stężenie 0,5- 5U na 100µl zbyt duże- niespecyficzne produkty zbyt małe- brak produktów - Przechowywanie -20˚C

- Okres półtrwania 92,5 ˚C 2h 95,0 ˚C 40 min 97,5 ˚C 5 min (!)

10

DMSO Żelatyna BSA Tween 20 PEG

Fenol SDS Proteinaza K Porfiryna EDTA Etanol

11

Zapewnia odpowiednie warunki dla działania polimerazy

pH 8,3-8,8

Tris-HCl w zakresie 10-50 mM

Czynniki ujemnie wpływające na PCR: 1. Jakość i zanieczyszczenia matrycy 2. Startery - powstawanie dimerów starterów - niska specyficzność starterów 3. Niewłaściwy dobór stężeń dNTP i MgCl2 4. Błędy polimerazy 5. Zanieczyszczenia odczynników 6. Ilość cykli

12

ETAP CZAS °C

początkowa denaturacja 2-5 min 94

denaturacja 1-60 s 94

przyłączanie starterów 30-60 s 54

wydłużanie starterów 30-90 s 72

ostatnie wydłużanie 5-10 min 72

schładzanie b/o 4

x 20-35

Aktywność polimerazy Taq – około 2000 nt/min (60 nt/s) w

optym. temperaturze 72-78°C

Denaturacja – nie powinna być dłuższa niż 60 s, ponieważ

wpływałoby to na aktywność enzymu

Początkowo czas wydłużania ustalamy 1kb -1 min, 2kb – 2

min itd…., przy kolejnych reakcjach można skracać

Przyłączanie starterów – temp. zależy od temp. topnienia obu

oligonukleotydów

Liczba cykli – 30 , więcej cykli nie wpływa znacząco na ilość

produktu

OPTYMALIZACJA – usunięcie niespecyficznych produktów

13

Specyficzność – eliminowanie niespecyficznych produktów

podwyższyć temperaturę annealingu (przyłączania starterów), obniżyć stężenie jonów Mg2+ zmienić skład nukleotydowy primera obniżyć ilość cykli zmienić polimerazę

Długość produktu – amplifikacja długich fragmentów

wydłużyć czas syntezy dobrać odpowiednie stężenie jonów Mg2+ zmienić polimerazę skrócić czas denaturacji podwyższyć stężenie matrycy zmienić pH buforu do PCR

Wierność – redukcja błędów syntezy

obniżyć liczbę cykli podwyższyć stężenie matrycy obniżyć stężenie dNTP zmienić polimerazę

Ilość produktu – zwiększenie ilości amplifikowanych

fragmentów zwiększyć liczbę cykli podwyższyć stężenie matrycy zmienić polimerazę obniżyć temperaturę annilingu wydłużyć czas syntezy

14

Hot start - unikanie niespecyficznej amplifikacji podczas

pierwszego cyklu (RT 94oC):

wkładać probówki do gorącego bloku

dodawać polimerazę lub startery do gorącej mieszaniny

odseparować startery od reszty reakcji parafiną

korzystać z polimerazy zabezpieczonej przeciwciałem

inne zabezpieczenia dysocjujące w wyższej temperaturze

Touch-down PCR – pierwsze kilka cykli wykonane przy dużo

wyższej temp. przył. startera – zwiększa specyficzność

Kłopoty z subklonowaniem produktu PCR

po Taq polimerazie zostaje ok. 70% końców tępych, a reszta ma 1

zasadę wystającą na końcu 3’ (zwykle A) - można ligować na lepko (!)

większość starterów zdefosforylowanych na końcu 5’ (PNK).

15

Cechy PCR

PCR w zastosowaniu analitycznym (diagnostycznym)

PCR jako metoda syntezy (zastosowanie laboratoryjne)

Wykrywanie sekwencji o

niewielu kopiach

Analizy genetyczne

Sądownic-two

Synteza sond

Synteza matryc do sekwencjono-wania

Synteza insertów przeznaczonych do klonowania

Czułość +++ + +++ - - -

Specyficz-ność

+++ +++ +++ ++ ++ +++

Wierność - - - - - +++

Ilość produktu

- (+) - +++ +++ _

+++, niezwykle istotna; ++, bardzo istotna; +, istotna; (+), może być istotna; -, nieistotna.

Jedna zasada, wiele modyfikacji

16

nested - „zagnieżdżony” PCR,

multiplex PCR - jednoczesna

amplifikacja kilku fragmentów

(dłuższe startery),

long (expanded, extended)

PCR - dla fragmentów > 5kb -

mieszanki polimeraz, octany,

dwie temp. (np.99/68),

inverted PCR,

mutageneza kierowana -

wprowadzanie zmian,

asymetryczny PCR (zmiana

proporcji starterów po 15-25

cyklach),

LCR - ligase chain reaction,

RT-PCR,

in situ PCR (genomowy i RT) –

w tkance,

Real time PCR

AMV-RT - avian myeloblastosis virus reverse transcriptase, zachowuje aktywność do 55°C, eliminuje problemy związane strukturą II-rzędową

MMLV-RT - moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase, ma mniejszą aktywność RNAzy H niż AMV-RT i jest lepsza do syntezy pełnej długości cząsteczek cDNA

synteza cDNA:

hybrydyzacja ze specyficznym starterem

hybrydyzacja z oligo (dT)

hybrydyzacja z heksamerami

AAAA

AAAA

TTTT

AAAA

17

dwie lub więcej docelowych sekwencji jest namnażanych w jednej probówce

jedna z tych sekwencji to najczęściej wewnętrzna kontrola poprawności warunków reakcji a druga jest sekwencją docelową

zastosowanie diagnostyczne – polimorfizmy analizy mikrobiologiczne

wykorzystywany w celu

wykrywania punktowych

mutacji w genomowym DNA

w war.natywnych DNA

przyjmuje określoną

konformację zależną od

sekwencji nukleotydowych

szybkość zależna od

wielkości i konformacji

>95% wykrywalność dla DNA

o wielkości 100-300 pz

Do detekcji reakcja

srebrzenia, radioizotopy,

rzadziej bromek etydyny

SSCP- polimorfizm konformacji jednoniciowych fragmentów DNA (ang. single strand conformation polymorphism)

18

1. Do produktów PCR powyżej 400 pz

2. Układ heterozygotyczny( 2 allele zmutowany i prawidłowy)

3. Amplifikacjainkubacja w celu utworzenia heterodupleksów

4. Heterodupleks- hybrydyzacja nie w pełni komplementarna

5. Substytucja-obustronne wybrzuszenie

6. Insercja lub delecja- jednostronne wybrzuszenie lub ugięcie nici

PCR-HD

Wykrywanie mutacji metodą heterodupleksów

Polimorfizmy RFLP to dziedziczne warianty sekwencji DNA, które objawiają się utworzeniem bądź zanikiem miejsca rozpoznawalnego przez endonukleazy restrykcyjne lub zmianą liczby nukleotydów między takimi miejscami . Amplifikacja fragmentu DNA, w obrębie którego występuje marker RFLP a potem jego hydroliza enzymem restrykcyjnym.

19

pozwala na amplifikację długich fragmentów DNA,

można w ten sposób uzyskiwać fragmenty nawet do 27 kb, rutynowo służy do otrzymywania fragmentów 10 – 20 kb

długie fragmenty uzyskuje się stosując mieszaninę termostabilnych polimeraz DNA, zwykle:

polimerazę Taq – zapewnia wysoką procesywność (aktywność 5’-3’ polimerazy)

polimerazę Pwo – zapewnia poprawność (aktywność 3’-5’ egzonukleazy)

dwa zestawy primerów: zewnetrzne i wewnętrzne, ale dwie rundy amplifikacji.

cel: zwiększenie czułości (pg) i specyficzności PCR

Nested PCR

20

pozwala zamplifikować

obszary wokół transgenu

transgen

enz enz

trawienie restrykcyjne a następnie ligacja

enz., który nie trawi transgenu (to nie jest plazmid !)

przecinamy w obszarze transgenu

projektujemy primery

amplifikacja,

klonowanie i

sekwencjonowanie

Koliste fragmenty DNA stają się matrycą

produkty są w mieszaninach, w których formy

koliste zawierają oba miejsca przyłączania starterów

21

niskie tło – znakowanie po specyficznej hybrydyzacji, startery nie są znakowane szybkość – hybrydyzacja i elongacja w 30 min., cała procedura 2h wydłużanie nie jest limitowane długością startera

22

• Ocena ilościowa produktu

• Wysoka czułość i powtarzalność

• Szeroki zakres oznaczanych stężeń

Budowa:

- źródło światła wzbudzającego cząsteczkę reporterową - układ detekcji fluorescencji - termocyler

23

24

SYBR Green I – interkaluje do dsDNA podczas reakcji, związane z DNA

ma silną fluorescencję (1000x silniej niż nie związane – stąd (+) niskie tło)

technika FRET - (fluorescence resonanse energy transfer) – do detekcji

specyficznych sekwencji. Przygotowuje się 2 sondy hybrydyzujące blisko

na matrycy. Górna sonda jest wyznakowana fluoresceiną na końcu 3’,

która działa jako FRET. Koniec 5’ dolnej sondy jest wyznakowany

akceptorem. Jeżeli dojdzie do hybrydyzacji obu - jest fluorescencja

technika Molecular Beacons – podwójnie znakowany starter, gdy jest nie

związany jest wygaszanie1 (struktura spinki do włosów), gdy się przyłączy

jest fluorescencja

TaqMan – wykorzystanie aktywności egzonukleolitycznej 5’-3’. Starter jest

podwójnie wyznakowany: fluoresceiną i wygaszaczem. Następuje

wycięcie barwnika, co odblokowuje fluorescencję.

SYBR Green I (metoda niespecyficznej detekcji fluorescencji)

25

TaqMan (metoda specyficznej detekcji fluorescencji)

26

27

Geny:

miR482d

miR6023

U6

Matryce:

3dpi K

3dpi Inf

28

Geny:

β tubulina

Lsd1

Matryce:

Col0

Lsd1(Col0)

29

Gene Expression Std. Error 95% C.I. P(H1) Result

ACT2 1

APX1 1,584 0,909 0,663 - 2,870

0,065

CAT2 0,687 0,586 0,560 - 0,885

0,008 DOWN

EIN2 1,795 1,065 0,903 - 4,560

0,045 UP

ERF1 195,904 131,464 103,877 - 338,734

0 UP

GA3 0,474 0,4 0,357 - 0,629

0,007 DOWN

LOX2 3,35 2,099 0,993 - 9,826

0,014 UP

ORA47 1,01 0,477 0,423 - 2,022

0,963

OXI1 1,209 0,702 0,601 - 2,150

0,363

PDF1.2 400,04 198,096 48,870 -

2 351,125 0,001 UP

PR1 8,044 2,83 2,589 - 42,579

0,002 UP

RRTF 6,84 5,689 5,203 - 10,045

0,001 UP

SAG2 2,486 1,398 0,453 - 8,868

0,058

UBQ 1,261 0,54 0,212 - 6,047

0,661

WRKY33 4,335 2,269 1,760 - 10,719

0 UP

0,1

1

10

100

1000

Ge

ne

ex

pre

ssio

n le

vel

ROOT

30

Elektorforeza i metody elucji

31

rodzaj agarozy

przezroczystość

rozdział krótkich prążków

cena

czas (dla prążków krótszych niż 600pz)

lepiej krócej tzn. 3-4 h dla żelu 15-20 cm,

przy dłuższym czasie 14-16h (niskie napięcie)

prążki nie są ostre, rozdział gorszy

rozdział wielu prążków (polimorficzne loci):

lepsze żele poliakrylamidowe, jeżeli prążki różnią się kilkoma pz (np.

markery mikrosatelitalne) 6-10%

niedenaturujące – dobry dla pojedynczych loci

denaturujące 6%/7M mocznik - żele do sekwencjonowania

multiplex PCR – 2 - 3% żel agarozowy

Agaroza Wielkość rozdzielanych fragmentów DNA

0,3% 5-60 kpz

0,5% 1-30 kpz

0,7% 0,8-12 kpz

1,0% 0,5-10 kpz

1,2% 0,4-7 kpz

1,5% 0,2-3 kpz

2,0% 0,05-2 kpz

Elektroelucja konieczne przeprowadzenie kolejne elektroforezy, w specjalnie przygotowanym aparacie, pracochłonna

Szkło kwarcowe – sole chaotropowe odpowiednia do oczyszczania dużych i małych fragmentów DNA, pracochłonna, zanieczyszczenia NaI, trudności przy agarozie opartej na TBE

Modyfikowana celuloza DEAE nadaje się do oczyszczania długich odcinków DNA, skomplikowana i pracochłonna, konieczność wykonania kolejnej elektroforezy, możliwość nieodwracalnego związania się DNA z celulozą po wyschnięciu

Zamrażanie, wyciskanie, wirowanie tania, styczność z BrEt podczas wyciskania

Trawienie -agarazą odpowiednia do oczyszczania dużych i małych fragmentów DNA, tylko do agarozy o niskiej temperaturze topnienia, trudności przy wykorzystaniu bufora TBE, konieczne utrzymywanie odpowiedniej temp. (42-45C) oraz pH 5-8

Metody z wykorzystaniem kolumienek wygodna, w kontrolowanych warunkach, powtarzalna, kosztowne, większe cząsteczki DNA mogą zahaczać się w kolumienkach

32

Dziękuję za uwagę !