Zum Abbau der l-Äpfelsäure durch Milchsäurebakterien

Archly fill" Mikrobiologie 51,401--413 (1965)

Aus dem Pharmazeutischen Institut der Johannes Gutenberg-Universit~t MMnz

Zum Abbau der L-~pfelsiiure dutch Milchsiiurebakterien I. Mitteilung

|Jber die Malat-abbauenden Enzyme des Bakterium , ,L" unter besonderer Beriieksichtigung der 0xalessigsiiure-Decarboxylase

Von laETER t~LESCH un4 BRIGITTE HOLBACIt *

Mig 6 Text~bbildungen

(Eingegangen am 20. Miirz 1965)

In vorangegangenen Arbeiten hatten sich JEI~CIIEL, FLESCH U. BAUER (1956), JERCHEL U. SC~MIDT (1958) sowie SCHMIDT, I-I~SK~NS u. JERCtIEL (1962) mit dem Reaktionsmechanismus des L-~pfelsaureabbaues dutch Bacterium gracile befagt. Es wurde unter anderem nachgewiesen, dag B. gracile fiber eine doppelte Fermentausstattung zur L-J~pfelsaure- Dissimilation verffigt, dem Malic-Enzym-System und dem Malat- Dchydrogenase-System. ])as Vorhandensein einer Oxalessigsaure-/~- Decarboxylase neben dem Malic-Enzym, das nach 0cHoir u. 5{itarb. (1948) ebenfalls 0xalessigsaure zu decarboxylieren vermag, ist aufgrund orientierender Versuche als wahrscheinlich anzusehen.

In der Literatur sind Oxalessigsaure-Decarboxylasen aus tierisehem und pflanzlichem Material mit unterschiedlichen Eigenschaften beschrieben. UTTER u. KURAtIASttI (1954) isolierten beispielsweise aus l:[fihnerleber ein ITP (ATP) 1-abhangiges Enzym, das 0xalessigsaure fiber Phosphoenol- brenztraubensaure decarboxyliert; l~V[n-Ionen katalysieren nut die 0ES- Bildung aus PEP. Von CA~NAT~ U. STO~'PA?r (1963) wurde eine wcitere ATP-abhangige 0xalessigsgure-Decarboxylase aus Bs isoliert. Die Autoren fanden, dab ADP um 40o/o wirksamer ist als ATP. 3/[n-Ionen werden auch bier nur zur Carboxylierung yon PEP ben6tigt. In M. lysodeikticus wies ~ANUS (1951) eine ?r OES-Decarboxy- lase nach, die nicht yon ATP beeinflugt wird. Er folgert daraus, dal3 ATP in anderen Fallen lediglich zur Synthese eines Cofaktors nStig sei. Eine auf ADP und Mg-Ionen angewiesene Deearboxylase aus Ps. citronellolis ist yon SEUBERT U. REMBE~G~R (1961) besehrieben worden. Diese

�9 Teil der Diplomarbeit B. HOLBAcH-SIMo~ ", Mainz 1964. 1 Folgende Abkiirzungen werden verwendet: ATP = Adenosintriphosphat,

ITP = Inosintriphosphat, GOT = Glutamat-Oxalaeetat-Transaminase, 0ES Oxalessigsiiure, PEP = Phosphoenol-breaztr~ubensaure, MDI-I = Malat-Dehydro- genase, LDH = Laetat-Dehydrogen~se, NAD = Nicotinamid-adenin-dinucleotid, NADP = Nieotinamid-adenin-dinucleotid-phosphaL p-C1MB = p-Chloro-mercuri- benzoat.

402 PETER I~LESC]:[ und BRIGITTE I~OLB&CII:

erffillt mehr die Aufgabe einer Carboxylase und wird aueh als Py ruva t -

Carboxylase bezeichnet . I m Gegensatz zu den E n z y m e n aus t I f ihner leber

und B/~ekerhefe ha t sie keine Thiolgruppen. SchlieBlieh wurde yon

V~N~C~SLAZCD U. Mitarb. (1949) eine nnr yon ~ n - I o n e n abh/~ngige

pflanzliehe Deearboxylase besehrieben. N A D P +, NAD+, A T P und Biot in

bleiben auf sie ohne EinfluB, L-J~pfelss hemmt .

Bei der vor l iegenden Arbei t sollte zuns un te r sueh t werden, ob

auch andere Ar ten yon Milehs~urebakter ien fiber die beim B. gracile 1 vorgefundene E n z y m a u s s t a t t u n g verfiigen. Wei te rh in war zu ermit te ln ,

naeh welchem Reakt ionsmeehanismus yon diesen Bakter ien Oxalessig-

ss deearboxyl ie r t wird.

Methodik Material. Der Bakterienslbamm ,,L" wurde yon V6SSlbrG (1964) aus einem

Apfelweing~rgelage isoliert. Aufgrund der physiologischen und morpho]ogischen Eigenschaften ist Bacterium ,,L" der Art L. plantarum zugeordnet worden; es ist grampositiv und homofermentativ. Die Zfiehtung erfolgte jeweils in 300 ml Birnensaft-Hefeautolysat-Caseinpepton-N~hrlSsung pH 5,2 mit 4,0 g/1 zugesetzter DL-ApfelsSmre. Kulturdauer 3--5 Tage, Temperatur 24 ~ C.

Herstellung der Enzyml6sung. Die Bakterien wurden nach Feststellen der Keim- zahl vonder NghrlSsung abzentrifugiert, zweimal mit dest. Wasser gewaschen und dam1 feueht gewogen. Die feuchte Masse wurde in einen M5rser fiberffihrt, in den ein Pistill derart pagte, dab es den Innenraum praktisch ausffillte und unter Zusatz yon Aluminiumoxydpulver 30--40 min lung kriiftig verrieben. Dabei durfte die Masse nicht fest werden. War es der Fall, so wurden jeweils 1--2 Tropfen Phosphatpuffer pH 6,0 zugesetzt. Nach dem Verreiben schlemmte man die Bakterien in Phosphat- puffer auf (beispielsweise 100 mg in 0,5 ml) und lieg sie zur Extraktion fiber Nacht im Kiihlschrank bei +2~ stehen. Am folgenden Tag wurde die Aufschlemmung bei 23000 g abzentrifugiert und die erhaltene Enzyml5sung sofort oder nach Dialyse in die Messung eingesetzt.

Proteingehalt der EnzymlSsung. Der Proteingehalt wurde naeh WARBU~G U. C~RISTIA~ (1942) durch Messung der Lichtabsorption bei 260 und 280 nm ermittelt.

Aktivitiitsbestimmungen. Die Dehydrogenase-Aktivits wurden optisch nach WAR~VRGU. CEmSTIA~ (1935) mit dem Zeiss-Spektra]photometer M 4 Q bei 366 nm gemessen.

Cuvettenffillung zur Bestimmung der MDH-Aktivitiit gegenfiber L-~i_pfelsgure: 1,7 ml Glycinpuffer pH 10,0; 0,3 ml 0,002 m NAD+ (2,1 - 10 -am); 0,3 ml Enzym- 15sung; 0,5 ml 1 m L-Apfelsgure (1,7 �9 10 1 m), mit NaOH auf pH 10,0 eiugestellt.

Als Enzymeinheit /iir die MDH ist nach B/ i c~R u. Mitarb. (1953) diejenige Aktivitgt je Milliliter EnzymlSsung definiert, welche bei 20 ~ C die NADH-Extinktion um 0,01 w~hrend 30 see bei 366 nm und einer Sehichtdicke yon 1 cm iindert.

Die Bestimmung der Malic-Enzym-Aktivit~it und der Oxalessigs~iure-Decarb- oxylase-Aktivitiit erfolgte mit Hilfe der Warburg-Apparaimr. Das aus den Substraten entstehende CO 2 wurde ermittelt (BERT~O u. GRASS~ANN 1936; UM]3~EIT 1959). Als Enzymeinheit diente die C02-Entwicklung yon 1 mm 3 innerhalb yon 10 min -- 5 min nach Zugabe der Enzyml6sung.

1 Diese yon M~LLER-TtIuRGAU U. OSTEI~WALDEI~ (1913) eingeftihrte Bezeiehnung sei bier beibehalten. Nach CARR (1959) u. a. diirfte es sieh um eine Leuconostoc-Art hande]n.

Die Malat-abbauenden Enzyme des Bakterium ,,L" 403

Die Ffillung der Warburg-Gef~Be zur Messung der Malic-Enzym-Aktivitgt war normalerweise folgende: 0,5 ml 0,2 m L-Apfelsgure pH 5,0 (2,5 �9 10 -2 m); 0,2 ml 0,1 m MnS0~ �9 4 It20 (5 �9 10 -a m); 0,3 ml 0,001 m NAB+ (7,7 �9 10 -5 m); 0,5 ml EnzymlSsung; 2,5 ml 0,067 m Phosphatpuffer pH 5,0. Gesamtvo]umen 4,0 ml. Zur Messung der OxMessigs~ure-Decarboxyl~se: 0,2 ml 0,25 m 0xalessigsgure pI-I 4,5 (1,25 �9 10 -2 m); 0,2 ml 0,02 m MnSO~ �9 4 H~O (1 �9 10 -am); 0,5 ml EnzymlSsung; 3,1ml Acetat/Phosphatpuffer (1:1) pH 4,5. Gesamtvolumen 4,0 mh Gestartet wurden die l~eaktionen jeweils dureh Zugabe der EnzymlSsung.

E r g e b n i s s e

Nachweis von Malat-Dehydrogenase-Alctivitiit

L-Jxpfels~ure wird durch ~a la t -Dehydrogenase zu Oxalessigsi~ure abgebaut :

COOH--CH2--CHOH--COOH + NAD + .~ COOH--CH2--CO--COOH + NADI-I + I-I+. (1)

Da das Gleichgewieht der Reakt ion weir auf der Seite der L-J~pfels/~ure liegt, ist es zweckm~gig, den linksli~ufigen Vorgang zu messen.

Spektralphotometr isehe Aktivi t / t tsbest immungen mit Enzyml6sung aus Bakter ien des Stammes ,,L" ergaben, dal3 das Subs t ra top t imum bei 3,6 �9 10-am Oxalacetat und bei einem p t t - W e r t yon 7,4 liegt. Die optimale N A D t L K o n z e n t r a t i o n wurde zu 1 , 8 . 1 0 - 4 m ermittelt . I n Abb. 1 (Kurve 1 ) i s t die Akt iv i tg t f/it die Oxalessigs~ure-t tydrierung dar- gestellt. Naeh 30 see erreehnen sieh 37,5 E auf 47,2/~g Protein. Die Michaelis-Konstante wurde zu 8,5 �9 10 -~ 2r best immt.

Versuehe, die Oxa]essigsgure- hydr ierung mit p-Chloro-mereuri benzoat und Ag-Ionen zu hemmen, verliefen positiv, dagegen zeigte sich keine }Iemmung mit Jodaeeta t . Diese t t emmversuehe geben nur Auskunf t fiber das Vorhandensein yon Thiol- gruppen am Fermentmolekfil [NEI- LA~DS (1954); PFLEID~E~ U. Mit- arb. (1959)]. Wenn Jodaee ta t keine I{emmung ergibt, handel t es sieh naeh

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I I E o 30 5o 90 12o ~5o sec Abb. 1. ]-Iemmung der ~D~-Aktivit~t mit p-C1MB (1,07. 10 -~ m). Kurve 1: ohne p-CII~IB; Kurve 2: mit p-CL~IB. Cuvetten- ffillung: 1,0 ml 0,067 m S0rensen Phosphat- puffer ptI 7,4; 0,5ml 0,001 m NADH (1,8" 10 4 m); 0,5 ml Wasser bzw. p-Cl~'[B; 0~3 ml EnzymlSsung; 0,5 ml 0,02 m Oxal-

aeetat (3,6 �9 1O -~ m)

PFLEIDEI~EI~ U. Mitarb. um maskierte Thiolgruppen. Die t I e m m u n g liegt, wie in Abb. 1 (Kurve 2) gezeigt ist, mi t 1,07 �9 10 - s m p-C1MB bei 66,5o/0 .

Bei der 3~essung der J~-Xpfels8ure-Dehydrierung muB man mit grogem SubstratfiberschuB arbeiten, um eine Verschiebung des Gleichgewiehtes

Arch. l~[ikrobiol., Bd. 51 27

404 I~ETEI% FLESCII und BRIGITTE HOLBACH:

zu erreichen [WOLFE u. •EILANDS (1956)]. Die besten ~eBergebnisse wurden mit 1 m L-~pfelsaure und bei einem pt t -Wert yon 10 des Systems erzielt. Es ergaben sich nach 15 sec 6,2 E auf 37,4/~g Protein.

Da Oxa]essigsaure in wagriger L6sung unbests ist und nach langerem Stehen zum Tell zu Brenztraubensaure decarboxyliert, besteht die M6glichkeit, dab bei Einsatz yon OES auch Lactat-Dehydrogenase- Aktivits mitgemessen wird. Um einen solchen Fehler auszusehalten, wurde der kombinierte Glutamat-Oxalacetat-Transaminase Test (Test- gemiseh der Fa. Boehringer, Mannheim) durchgefiihrt. Die Oxalessig- saure wird in diesem Test, der znr ~essung tierischer MDtLAktivi ts zusammengestellt ist, aus ~-Ketoglutarat und Asparaginat in tier Cuvette durch das Enzym Glutamat-Oxalaeetat-Transaminase (GOT) kurz vor der Aktivits der MDI4 erzeugt. Es lieBen sich nach dieser Methode 3,7 E auf 37,4 #g Protein bezogen auf 60 sec, 1 rain naeh Zugabe der Enzyml6sung, ermitte]n. In quantitativer I~Iinsicht kann diese ~[essung nicht mit der vorangegangenen vergliehen werden, da die Substratkonzentration im Testgemiseh ffir die bakterielle MDIt nieht optimal ist. Es muB auch dahingeste]lt bleiben, ob die Gesehwindigkeit der ttilfsreaktion einen ausreiehenden Wert hat.

Nachweis von Malic-Enzym-Aktivitgt

Das Malie-Enzym kata]ysiert folgende Umsetzung:

COOH--CHOH--Ctt~--COOI-I + NAD+ ~n++\ CH3--CO--COOH + COs ~- NADII + I-I+ (2)

Nach MEHL~ u. Mitarb. (1948) sowie VEmA SALLES U. 0C~OA (1950a) handelt es sieh dabei um ein Enzym, das die dehyclrierende und die deearboxylierende Wirkung in sieh vereinigt, aber nieht aus Malat- Dehydrogenase und Oxalessigss besteht, was die versehiedenen pI-LOptima, f/it die MDt{-,,R/iekreaktion" 10,0 und fiir das Malie-Enzym 5,5 sowie die lV[n++-Abh~ngigkeit des Malie-Enzyms beweisen. Versuehe yon V]~IGA SALLV, S u. Mitarb. (1950b) mit C1~0~., Oxalessigss Mn ++ nnd reinem Malie-Enzym zeigten, dab CO 2 in Oxalessigsgure nieht eingebaut wird. Aus diesem Befund ziehen sie den SehluB, dab freie Oxalessigs/~ure kein Zwisehenprodukt yon Reaktion (2) ist. V~IGA SAU.v,S u. OcI~oA (1950a) geben fiir die Umsetzung yon L-~pfelsgure dutch das ~al ie-Enzym aus Taubenleber folgenden Reak- tionsmeehanism~s an:

O OH O OH C--CH2--C--COOI-I + NADP + ~-- C--CH~--C--COOI-I + NADH + H+ ~_ OH H ' O- i

Oxalessigsaurehydratlacton COs + CH2=C(OH)--COOH (3) Enolbrenztraubenss


Im Gegensatz zu dieser Annahme steht die Feststellung, dag Malie- Enzym aueh die Decarboxylierung yon Oxalessigss mit NADP + katalysiert [0cKoA u. Mitarb. (1948)].

Das p tL0p t imum ffir die Malie-Enzym-Aktivits (Substrat L-Apfel- s/~ure) lag, wie mit EnzymlSsung aus Bakterien des Stammes ,,L" ermittelt wurde, bei 5,5, das Substratoptimum bei 1,25 �9 10 -1 Mol/l und die Miehaelis-Konstante bei 9,34 �9 10 -s ~ol/1.

Um die 3~n ++-und NAD+-Abhs der l~eaktion (2) feststellen zu k6nnen, wurde die Enzyml6sung 12 Std lang bei @4~ gegen dest. Wasser dialysiert und dana die Aktivit/~t der dialysierten und der nieht dialysierten LSsung miteinander vergliehen. ])as Ergebnis zeigt Abb. 2.

x lO I

12o - - i 11 Vol COz l ~'----------i

t o o - " 2

8O / ~ ' / "

0~ 20 6"0 ~90 rain 180 Abb, 2

x J Vol C02 i

8O

2O

o~ 20 6o rain 90

Abb. 3

Abb. 2. Abh~ngigkeit der )Ialic-Enzym-Aktiviti i t yon Mn ++ und NAD + (Keimzahl 11,35.1010 Bak- terien/Manometer). It:urve 1: komplettes System ohne Dialyse; Kurve 2: kmnplettes System mit Dialyse; Kurve 3: System ohne Dialyse und ohne NAD+-Zusatz; Kurve 4: System mit Dialyse und ohne NAD+-Zusatz; Kurve 5: System ohne Dialyse und ohne Mn++-Zusatz; Kurve 6: System

mit Dialyse und ohne Mn++-Zusatz

Abb. 3. Hemmung des Ma]ic-Enzyms mit p-CISIB und Jodacetat (Keimzah] 16,6. 101~ Bakterien/ )ianometer). Kurve 1: komplettes System; Kurve 2: S y s t e m + 0,625 �9 10 -a m p-C]5[B; Kurve 3:

System -t- 1,25 �9 10 a m p-C12/iB; Kurve 4: System + 0,6"25.10 -3 m Jodacetat

~ a n erkennt die nahezu 100~ ign++-Abhgngigkeit aueh der nicht dialysierten L6sung (Kurve 5). Dialysiert man die L6sung nicht und gibt kein NAB + hinzu, so finder man eine CQ-Eintwicklung, die linear yon der Zeit abh/ingt (Kurve 3). ?r mug die Reaktion nur lange genug ablaufen lassen, um den schlieBlichen Umsatz mit NAD+-Zusatz zu crreichen. Kurven 4 und 6 geben die C02-Entwicklung der dialysierten LSsung ohne NAB+ bzw. ohne ~ n ++ wieder, wghrend Kurven 1 und 2 die Aktivit~t des kompletten Systems einmal mit dialysierter Enzyml6sung (2) und mit nicht dialysierter EnzymlSsung (1) zeigen.

Aus diesen Versuchen geht hervor, dab die ~alic-Enzym-Aktivitgt in hohem Mage ~n++-spezifisch ist and deshalb nicht mit Malat-Dehydro-

27*

406 PETER FLESe~ und ]~RIGITTE HOLBACtt:

genase identisch sein kann. Auch das ermittelte p t I -Opt imum yon 5,5 ist ein Beweis fiir Malic-Enzym, denn schon bei p i t 6,2 betrggt die Aktivi tgt nur noch einen Bruchteil der optimalen, ws die MDII-Aktivi t~t nach der spektra]photometrischen Bestimmung (Xpfels~ure-Dehydrierung) ihr p t I - 0 p t i m u m bei 10 hat.

t temmreakt ionen wurden mit Malons/~ure, p-CllV[B und Jodace ta t durchgefiihrt. ~ i t 2 , 5 . 1 0 - 2 m Malons~ure t r i t t nur anf~ng]ich eine starke t Iemmung auf (nach 10 rain 68~ die dann nachlal3t. Wie aus Abb.3 ersichtlieh, ist die t I emmung mit Jodaceta t gering. Die starke (96~ t Iemmung mit p-C1MB kann als ein Beweis dafiir angesehen werden, dab aueh das Malic-Enzym Thiolgruppen hat und in dieser Beziehung mit den Dehydrogenasen iibereinstimmt.

Charakterisierung der Oxalessigsiiure-Decarboxylase

Da die Frage gekl~rt werden sollte, nach welchem Reaktionsmechanis- mus yon den ~pfels~ure-Milehs/~urebakterien 0xalessigss abgebaut wird, wurden die Nucleotid- und Kationen-Abhgngigkeit der OES- Deearboxylase sowie t Iemmreakt ionen getestet. Dabei mul3te es sieh herausstellen, ob es sieh um eine selbst/~ndige Deearboxylase handelt, oder ob die OES-decarboxylierende Wirkung dem 1V[alie-Enzym zuzuordnen ist.

Die Oxalessigs/~ure-Deearboxylase katalysiert folgende Reaktion:

COOH__CH2__CO__COOH ~Vln++,, CHs_CO_CO0 H -~ C02 (4)

])as pI-l-0ptimum der 0ES-I)eearboxylierung wurde bei 4,5 gefunden. Die Aktivit~t sinkt yore pI-I 4,5 zum Neutralen hin rasch ab und hat bei 7,2 nur noeh einen Bruehteil der Aktivit/~t yon 4,5. Aus diesem Grunde kann die Restaktivit/~t nieht der eigentliehen 0ES-Deearboxylase und die Hauptaktivits dem lVialie-Enzym zugesehrieben werden, das naeh OCHOA u. Mitarb. (1948) aueh Oxalessigsgure zu deearboxylieren vermag und zwar im Taubenleberenzym unter Zusatz yon NADP+ und in L. arabinosus nur unter Zusatz yon Nn ++ [KonK~s u. Mitarb. (1950)]; es miigten clann zwei Optima zu finden sein.

Das Substrat-Optimum der 0ES-Decarboxylase aus Bacterium ,,L" wurde mit 1,25 �9 10 -1 3/[ol/1 und die Miehaelis-Konstante mit 2,51 �9 10 -~ Mol/1 ermittelt. Die OES-Deearboxylase zeigte sich im weiteren Versueh nu t abh/~ngig yon ~n++-Ionen. Wie aus Abb.4 ersiehtlieh, liegt das Opt imum bei 0,001 m 3/[nSO~.

Eine Abhangigkeit der Aktivits yon Nucleotiden [UTTER U. lV[itarb. ,(1954); CAntATA n. Mitarb. (1963)] konnte nieht festgestellt werden. Weder AMP, ADP und ATP noch Biotin braehten eine Aktivit/~ts- ~steigerung, aueh bei p t t 7,2 konnte mit ATP keine h6here Aktivit~t beobaehtet werden. Ebenfalls mit NAD + und NADP + ergab sich kein ~anderer Befund.


Ferner wurde die Abh/~ngigkeit der OES-Decarboxylase yon Mg- Ionen und Nucleotiden gepriift. Die CQ-Entwieklung ist mit Mg-Ionen viel geringer als mit Mn-Ionen; das Optimum erhalt man bei Zugabe yon ADP. Die Kurven der lVIessungen durchlaufen Maxima, gleiehgfiltig, ob man dem System Mn ++ oder Mg++ zugibt; aueh die Nueleotide haben kefllen Einflug auf die Lage des Maximums. Da sieh beim Maximum das Gleiehgewicht zwisehen dem Substrat Oxalessigs~ure und den Reaktions- sol

Vol CO 2 produkten Brenztraubens/~ure undC02 (rare3)

einstellt, ist es mSglich, dab unter 20 der Wirkung des Malic-Enzyms die weitere Reaktion zu Gunsten einer Carboxylierung versehoben ist, sic naeh augen hin scheinbar rfiekw~rts / verl/~uft. Die Rolle des Biotins mfiBte . / / / noch geklgrt werden, eirt Zusatz bringt auf jeden Fall keine hShere Aktiv~tat. /o

Die bisherigen N[eBergebnisse an der OES-Deearboxylase des Bac- terium ,,L" stimmen gut mit Angaben fiber die OES-Deearboxylase aus M. lysodeilcticus und den aus Pflanzen fiberein. 0ffensiehtlieh haben die pflanzliehe und die bakterielle De- earboxylase andere Eigenschaften Ms die tierische, was schon MAgus (1951) festgestellt hat. Aueh das hier

l . J /

,

I

I ~0 30 GO 90 rain /20

Abb.4 , Abh~,ngigkeit der OES-Decar- boxylase yon der ~in++-Ionen-Konzen - t r a t ion (Ke imzah l 13,15- 101~ Bak te r i en / l~fanometer). K u r v e 1 : Sys t em ohne Mn ++; K u r v e 9: S y s t e m m i t 0,001 m l~In++; K u r v e 3: Sys t em m i t 0,0025 m l~[n ++; K u r v e 4: Sys t em m i t 0,005 m Mn ++

ermittelte pl-I-Optimum liegt nahe dem der beiden erstgenannten De- carboxylasen (Deearboxylase aus Pflanzen 5, 2, aus M. lysodeikticus 5,0 und aus Bacterium,,L" 4,5, dagegert aus tIfihnerleber 6,2 and aus Tauben- leber 7,0). Ein weiterer Unterschied zwisehen tierischer and pflanzlieher OES-Deearboxylase ist, dab die Reaktiort der tierisehen Deearboxylase die ~etallionen nut zur Carboxylierung der Phosphoenol-brertztrauben- saute braueht und dal] ~angart sogar eine 90~ tIemmung der OES- Deearboxylase verursaeht [CAntATA U. Mitarb. (1963) ; U T T ~ u. Mitarb. (1954b)]. Da die Reaktiort beim Enzym aus dem Xpfelsgm'e-Milehsgure- bakterium aueh mit der dialysierten LSsung urtd reinem Aeetatpuffer verlguft, seheint P E P als Zwisehenstufe ausgesehlossen zu sein.

Vergleieht mart die am Substratoptimum entwiekelte CQ-Menge yon lVIalie-Enzym und OES-Deearboxylase, so ergeben sieh fiir das Malie- Enzym innerhalb 10 min auf 54,1 #g Protein 228,1 mm a C02 und fiir die OES-Deearboxylase 140,4 mm. a. Das Verhgltnis yon Decarboxylase- Aktivitgt nnd Malie-Enzym-Aktivitgt ist 0,616. Dagegen fanden VEmA

408 P]~ER Fr,]~SCE und BRIGITTE HOLBACtt :

SALVES u. 0CHOA (1950), dab die Aktivitgten der beiden Enzyme in L. arabinosus 17--5 bei optimalen Bedingungen fast identiseh sind. Sie ermittelten fiir das Malie-Enzym 3,36 �9 10 -6 Mole CO 2 und fiir die OES- Deearboxylase 3 ,75 .10 -6 Mole. Diesen Befund f/ihren die Autoren als einen Beweis daffir an, dab beide Aktivit/~ten in demselben Enzym vereinigt sind. Weiterhin fanden sie, dab beim Erhitzen der Enzym- �9 IJ prgparation die Aktivitgt desMalie-Enzyms 3c und der OES-Decarboxylase parallel ver-

2 lorengeht, was eigene Trennversuehe, die sp/iter zu besehreiben sein werden, nieht

/ a best/~tigen konnten. Itierbei erwies sieh

26 die Deearboxylase als hitzebestgndiger. tIemmreaktionen wurden mit Malon-

s~ure und n-Xpfelsgure durehgeffihrt. Mit s0 2,5.10 -2 ?r Malonsgure ergab sieh eine

lCiemmung von 290/0 naeh 10 min und mit 3,8.10-2Mol/1 L-]4pfelsgure eine solehe von 350/0 [die Deearboxylase aus Pflanzen

00 l0 2.0 30 rain ~/o zeigt aueh eine I-Iemmung mit L-]4pfel- Abb. 5. I-Iemmung d~r O~S-De- s/~ure; V]~ESLA~D u. Mitarb. (19r carboxylase-Aktivit~t mi~ p-CIMB Interessant sind aueh die I-Iemm- und 5odaeetat (Keimzahl 7,45. 10 I~ B~kterien/Manometer). Kurve ~: versuehe mit p-C1MB und Jodaeetat zur kom!olet~es System; Kurve 2: System weiteren Unterseheidung der beiden En- + 0,625 �9 10 ~ m p-ClUB; Kurve 8: System + 0,625' 10 - a m ffodacetat z y m e . nine I{emmung konnte weder ohne

noeh mit Inkubationszeit naehgewiesen werden. Abb.5 gibt einen Versueh dieser Art wieder. Die Anfangs- gesehwindigkeiten der Reaktionsablgnfe sind praktiseh gleieh, die ge- ringen Abweiehungen als Mel3fehler zu werten.

Diese Versuche zeigen, dab die Oxalessigsgure-Decarboxylase des Bacterium ,,L" keine Thiolgruppen aufweist, die an der Reaktion beteiligt sind. Deshalb kann die Deearboxylierungsaktivit/it wohl nieht dem Malie-Enzym zugeschrieben werden, denn dieses Enzym besitzt Thiolgruppen und wird mit derselben Menge p-C1MB zu 89o/0 gehemmt. Zur weiteren Unterscheidung der beiden Enzyme wurde die Biotin- beteiligung untersueht.

Funktion des Biotins Sehon ira Jahre 1947 stellten LICHSTEIN U. UI~BREIT lest, dab Biotin

die Oxalessigsgure-Deearboxylase in Coli-Bakterien katalysiert. OcI~OA (1947) land einen erniedrigten Malie-Enzymgehalt in der Leber biotinfrei ern/~hrter Truth/~hne. Da jedoeh hoeh gereinigte Pr/~parate dieses Enzyms kein Biotin enthielten, vermutete OOHOA, dab das Vitamin zwar bei der Biosynthese des Enzyms eingreift, jedoeh nieht als Coenzym der Carboxy- lierung wirkt. Tats/~ehlieh bewiesen AISLES, RAVEn U. SI~IVE (1961), dag


Biotin nur eine indirekte golle in der Synthese des Malie-Enzyms in L. arabinosus spielt. Es wird benStigt zur Biogenese einer 4-Kohlenstoff- einheit nnd kann dnreh Peptide yon Asparagin z.B. Glyeylasparagin, ersetzt werden. Aneh Avidin hemmt nieht die CQ-Fixierung dutch Malie- Enzym [KASIgO u. Mitarb. (1960)].

LYNEN U. Mitarb. (1959, 1961) kl~rten die bioehemische Funktion des Biotins auf. Sie fanden, dab Biotin im Stoffweehsel als Coenzym der Transearboxylierung eingreift nnd die Fahigkeit der Kohlens~ure- iibertragung auf der Bildnng von l 'N-Carboxy-Biotin beruht. Biotin kann im Iiefewaehstumstest naehgewiesen werden (LIcHsTEr~ 1955). Die Identit/it des Biotins mit der Wirkungsgruppe der Carboxylase gibt sieh in der spezifischen Enzymhemmnng dareh Avidin zu erkennen (W~ss- 3{ANN u. WEl~K~AN 1950). 1 MO1 Avidin binder 2 Mole Biotin oder 1 E Avidin bindet 1 #g Biotin.

S~r~EzT u. R~M~EGE~ (196i) konnten erstmals bei Ps. citronellolis die spezifische ]Kemmung der Pyruvat-Carboxylase dareh Avidin naeh- weisen (diese hat aueh keine Thiolgrnppen nnd ist nieht Aeetyl-CoA- abMngig) und Lynens Meehanismus best~tigen. Die Autoren nehmen an, dab der Carboxylierungsmeehanismns in tierisehen und in bakteriellen Systemen untersehiedlieh ist. KE~c~ n. UT~E~ (1963) stellten dagegen fest, dab an CQ-geakt ionen, die dareh Avidin gehemmt werden, Aeetyl- CoA beteiligt ist. Aeetyl-CoA wird zur Carboxylierung des Biotin-Enzyms gebraueht [ScguTToN, ](EECH n. U~TE~ (1965)]. AnBerdem ist zur Carboxylierung des Biotin-Enzyms ATP-Energie notwendig [LY~E_N u. Mitarb. (1959, 1961); SC~UTTON, KEECH U. UTTEg (1965)].

Es war nun die Frage zn klaren, ob die Oxalessigs~ure-Deearboxylase aus 2ipfels~ure-Milehs~arebakterien auch ein Biotinproteid ist. I-Iemm- versuehe mit Avidin konnten hieriiber Klarheit bringen. Bei den I-Iemm- versuehen ist zu nnterseheiden zwisehen dem Eingeben yon Avidin vor oder w~thrend der Messnng in die Enzyml6sung und der Zugabe in die Nghrl6sung, nm sehon eine Synthese der Enzyme, die biotinabhangig sind, in den Bakterien zn nnterbinden.

1Kalie-Enzym warde zunaehst nntersneht und die tIemmreaktion wahrend der Aktivitatsmessung ausgefiihrt. Es warden 300 #g Avidin in die Enzyml6sung gegeben (Avidin ist sehwer 16slieh, bei Zugabe gibt es eine Triibung). Aus dem Karvenverlauf der Messung war zu erkennen; dab nar anfangs eine geringe ~emmung auftritt, sie betr~gt naeh 20 rain 8~ . Weitere Versuehe braehten gar keine tIemmung oder nar eine 6~ Demnaeh seheint, wie aueh KAsn~o u. Mitarb. (1960) feststellten, Biotin bei der CO~-l~bertragnng dureh das ~{alie-Enzym keine oder nur eine untergeordnete Rolle zu sloielen.

Eine stgrkere l-lemmung braehte Avidin bei Pr/ifung der 0ES-I)eearboxylase-Aktivit/it. In einem Versueh mit 300 #g trat eine 21~

410 PETER FLESCH und BI~IGITTE ]-IOLBACtt:

xfO: zlO

30

/0

tIemmung auf. Da es sich um die gleiche Enzyml6sung wie bei der Bestimmung der Malic-Enzym-Aktivits handelte, kann nicht eine unterschiedliche L6slichkeit des Avidins den gr6geren tIemmeffek~ ver-

ursacht haben. In dem Versuch, dar- Vol C02 (tn,~ 3)

/ / . /

/

0 3O ~0

Abb.6. Hemmung der OES-Decarboxy- lase mit 1 mg Avidin (Keimzahl 11,7 �9 10 ~~ Bakterien/~anometer). Kttrve 1:

ohne Avidin; KurYe 2: mit Avidin

90 rain 120

gestellt in Abb. 6, ergab sieh mit 1 mg Avidin naeh 30 rain eine I{emmung yon 37,70/0 .

Zur weiteren Kls der Frage, ob die OES-Decarboxylase ein Biotin- proteid ist, wurden andere St~mme von Milehs~urebakterien dahingehend untersucht. Mit jeweils 300 #g Avidin in der EnzymlSsung erhie]b man die in der Tab. 1 zusammengestellten Er- gebnisse.

Naeh den angeffihrten Versuchen liegt die Avidin-Kemmung je nach I-IShe der Decarboxylasen-Aktivits im Bereich yon 14--100~ . Daraus kann man sehlieBen, dab es sieh bei der OES-Deearboxylase aus Xpfel-

Tabelle 1. Der Ein]lu[3 von Avidin au/ die OES-Decarboxylase-A#tivitgt verschiedener A p / els~i ur e- M ilchsgur ebakterien

C02-Entwicklung nach l0 min.

Stamm ohne Avidin mit Avidin I temmung Protein (ram ~) (ram 3) ( ~ (pg/Manometer)

,,La Louvi~re" ,,PIe-l-" ,,QTI_~"

45,3 64,0

342,0 512,1

0 36,7

282,0 409,1

100 39,0 19,3 14,4

227 324 380 216

s~ure-Mflehs~urebakterien um ein Biotin-Enzym handelt. Bei den Stgm- men, die fiber eine hohe Aktivit~t verffigen, war die eingesetzte Avidin- menge offensichtlich nicht ausreichend, um das in gr6Berer 1Vfenge vor- handene Biothl zu binden. Man erkennt auch, dab die Hemmung viel starker ist als beim Malic-Enzym, welches offensichtlich kein Biotin- Enzym darstellt.

Weiterhin wurden 3,2 mg Avidin mit den Impfbakterien in die 300 ml Ns gegeben. Tab. 2 gibt die Aktivitgtsbestimmung auf Malic- Enzym (pit 5,5) und 0ES-])eearboxylase (pit 4,5) in der Enzyml6sung yon Zellen wieder, die in Avidin enthaltender Ni~hrl6sung gezfichtet w & r e n .

Die Malat-abbauenden Enzyme des B~kterium ,,L': 411

Aus den Ergebnissen der lVfessungen geht hervor, da6 beide Enzyme :zu etwa 80O/o gehemmt werden, wenn sich Avidin in der N/~hrl6sung der Bakterien befunden hat. Das kann einmal bedeuten, dab ohne Biotin die :Enzyme nieht syntheti- siert werden kSnnen nnd zum anderen, dag die C02-~bertragung ohne iBiotin nicht stattfinden kann.BeimMalie-Enzym diirfte es sich vornehm- lich um eine Blockierung der Synthese handeln.

Zum Vergleieh wurde noch die I-Iemmung der ilVfalat -Dehydr ogenase

Tabelle 2. Hemmung der Malic-Enzym- und OES- Decarboxylase.Aktivit~it bei ,,L "-Ba]cterien ( A vidin in

der 2Vghrldsung)

Malic-Enzym OES-Decarboxy-

lase Pro~eingehalt

CO..-Entwieklung naeh 15 Minuten

olme Avidin mi t Avidin (ram ~) (ram ~)

264,5 59,3

124,5 38,0 70,6~g 91,1#g

~Iemmung (%)

82,7

76,3

und der Laetat-Dehydrogenase geprfift, wenn Avidin der Nghrl6sung zugesetzt war. Die Avidin-~emmung bei den Dehydrogenasen zeigte :sich geringer (~DI-I 53,60/0; LDtI 62,70/0). Dies sprieht, soweit es die 3/falat-Dehydrogenase angeht, fiir das gleichzeitige Vorhandensein yon 3/[alie-Enzym und yon 1Vfalat-Dehydrogenase in Xpfels/~ure-Milchs~urebakterien. Da bei den yon den Dehydrogenasen katalysierten Reaktions- abl/~ufen keine C02-Ubertragung stattfindet und letztere deshalb aueh nieht gehemmt werden kann, ist es nur mSglieh, dab dutch Avidin die Synthese der Dehydrogenasen eingesehrgnkt ist, vielleieht als Folge der J:Iemmung der Malie-Enzym-Synthese und der Oxalessigs/ture-Deearb- oxylase nnd des dadureh bedingten Fehlens an Snbstrat.

Diskussion Die Frage, ob im Bacterium ,,L" neben dem Malic-Enzym eine 3/[alat-

Dehydrogenase vorhanden ist, kann aufgrund der vorliegenden Versuche bejaht werden. Die Verfolgung der entspreehenden Reaktionsverlgufe -- sowohl der Hydrierung der Oxalessigsgure bei pI-I 7,4 als aueh der Dehy- drierung der L-Xpfelss bei pig 10,0 -- lassen diesen Sehlug zu. Aueh konnte mit tIilfe des GOT-Testes eine MDH-Aktivitgt naehgewiesen werden.

Der Unterscheidung zwisehen OES-Deearboxylase-Aktivitgt und Nalie-Enzym-Aktivit/~t ist grSgere Bedeutung beigemessen. Im Jahre 1957 wurde ngmlieh yon SAZ u. Mitarb. (1957) aus Ascaris lumbricoides ein Malic-Enzym isoliert, das keine Oxalessigsgure-Decarboxylierung zeigte, wie yon OcRoa u. Mitarb. (1948) sowie VEmA SALLES u. Mitarb. (1950 b) angegeben wird. Au6erdem konnten UTTEn U. KUnA~ASHI (1954) eine Enzymaktivi tgt aus I-Iiihnerleber isolieren, die sich vollst~ndig in 1Vfalie-Enzym nnd eine ATP-abhangige OES-Decarboxylase mit pH-

412 I:)ETEI~ I~LESCII und BICIGITTE HOLBACH:

Optimum 6,2 trennen lielB. Darfiber hinaus stellten sie vie vordem OCHOA lest, dal~ dieses Malie-Enzym in Gegenwart yon NADP + ebenfalls bei pK 4,50xalessigs/iure decarboxyliert, obschon nicht einzusehen ist, welehe Rolle hierbei das NADP+ spielen soll.

Wenn aber die im Bacterium ,,L" nachgewiesene OES-decarboxylierende Aktivitiit dem ?r zuzusehreiben w~re, so enthielte das Bakterium keine selbst/~ndige OES-Deearboxylase, die wegen der nachgewiesenen MDH-Aktivitgt zu fordern w/~re, denn es ist nur eine Aktivitgt mit Optimum bei pit 4,5 zu finden. Zudem lielB sieh bei ver- /~nderter AufschluBmethode, dem Einfrieren der Zellen in fliissiger Luft [JEBcgEL U. Mitarb. (1956)], keine decarboxylierende Wirkung der EnzymlSsung bei ptI 7,2 gegenfiber Oxalessigsgure feststellen.

Wie die Versuche dieser Arbeit welter ergeben haben, konnte das Malic-Enzym yon Bacterium ,,L" durch p-C1MB nahezu 100~ gehemmt werden, wi~hrend die OES-Decarboxylase nieht gehemmt wurde. Somit sind ffir die oxydative Decarboxylierung der L-Jlpfels~ure Thio]gruppen wesentlich, nieht aber fiir die OES-Deearboxylierung. Weiterhin wurde in l~bereinstimmung mit KASmO u. Mitarb. (1960) gefunden, dab der n-)kpfelsgure-Abbau dutch das Malic-Enzym nicht yon Avidin gehemmt wird. Im Gegensatz hierzu steht aber der Befund mit OES als Substrat. Die Oxalessigsi~ure-Deearboxylase wurde dutch Avidin in starkem Make gehemmt, nieht nur beim Bacterium,,L", sondern auch bei anderen Stgm- men der J~pfels~ture-Milchsi~urebakterien. Es handelt sieh deshalb bei der OES-Deearboxylase dieser Mikroorganismen mit grol3er Wahrseheinlieh- keit um ein Biotinproteid. Eine tIemmung der Malie-Enzym-Synthese dureh der N~hrlSsung zugesetztes Avidin konnte dagegen beobachtet werden, ebenfa]ls eine tIemmung der ~DI~- und LDg-Synthese. l~ber den EinfluB yon Avidin auf die Synthese der OES-Deearboxylase ist naeh den vorliegenden Versuchen keine Aussage mSglich.

Zusammenfassung Es werden qualitative und quantitative Bestimmungen von

Enzym-Aktivit/~ten beim ~pfelss Stature ,,L" beschrieben.

An Malat abbauenden Fermenten enth/~lt Bacterium ,,L" neben einer 1V[alat-Dehydrogenase auch Ma]ie-Enzym. Die festgestellte Oxalessig- s~ure decarboxylierende Wirkung dfirfte nicht dem Malic-Enzym, sondern einer selbst/~ndigen Oxalessigs/~ure-Decarboxylase zuzuordnen sein. Ffir den L-Apfelsaureabbau durch Malic-Enzym sind n/~mlieh freie Thiol- gruppen erforderlich, nicht aber ffir die Oxalessigsi~ure-Decarboxy- lierung. Auch unterscheiden sich die Michaelis-Konstanten der Enzym- Substrat-Komplexe wesentlich.


l~erner ist die F u n k t i o n des Biotins getestet. Wghrend die C Q - Freise tzung aus ~-~pfelsgure durch Mal ic-Enzym yon Avid in prakt isch

nicht gehemmt wird, ist die } Iemmung bei der 0xalessigs&ure-Decarb- oxyl ierung s tark ausgeprs Daraus l~Bt sich sehlieBen, dab die Oxal- essigs/~ure-Decarboxylase aus Bacterium ,,L" ein Biot inprote id darstell t .

Wit danken dem Ministerium fiir Landwirtsehaft, Weinbau und Forsten des Landes Rheinland-Pfalz fiir die F6rderung der M'beit durch Gew~hrung eines For- schungsauftrages und dem Institut fiir Weinforschung der Johannes Gutenberg- Universitgt in Mainz fiir sachliche Unterstiitzung.

L i t e r a t u r

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Dr. P. ]~LESCH, Pharmazeutisehes Institu~ der Universitgt, 65 Mainz

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Zum Abbau der l-Äpfelsäure durch Milchsäurebakterien