Upload
dinhnhi
View
214
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Czy jest coś, czego się nie da zrobid z bakteriofagiem?
Przegląd moich tematów badawczych
Marcin Łoś
Katedra Biologii Molekularnej
Uniwersytet Gdaoski
Najliczniejsze organizmy żywe na ziemi to bakterie…
… ale wirusy są około 10x bardziej liczne
Zdecydowana ich większośd jest dla nas nieszkodliwa. Są za to zabójcze dla bakterii
Szacowana ilośd cząstek wirusowych wynosi na całej Ziemi 1031
Gdyby je ułożyd w jednym rzędzie utworzyłyby linię 1013 razy dłuższą niż średnia odległośd Ziemi od Słooca
Głodzone komórki bakteryjne
• Znacznie obniżona wydolnośd aparatu biosyntezy białek
• Mniejszą objętośd komórek
• Większa odpornośd na uszkodzenia przez np. antybiotyki, chloroform
• Namnażanie się faga ograniczone lub całkiem zastopowane
Czemu takie badania są istotne?
• Wzrost bakterii używanych w wielu procesach przemysłowych jest spowolniony – wynika to głownie ze względów technologicznych
• Bakteriofagi są jednym z głównych zagrożeo procesów biotechnologicznych opartych na bakteriach
Hodowle ciągłe
bakterii w
chemostatach:
• Stała objętość
hodowli.
• Czas generacji jest
uzależniony tylko od
tempa wymiany
pożywki w
chemostacie, a nie od
stężenia substancji
odżywczej
Rozwój bakteriofagów w
procesie biofermentacji
.
Funkcje kontrolowane
automatycznie:
• Pomiar DOT, pH, temperatury,
• Utrzymywanie stałego pH,
temperatury i dozowanie pożywki
• Sterowanie szybkością mieszania
przestawione na manualne w celu
zwiększenia kontroli nad przebiegiem
fermentacji
Funkcje kontrolowane manualnie:
• Pomiar OD
• Dostosowywanie prędkości
mieszania
• Dostosowywanie szybkości
przepływu powietrza
• Dozowanie substancji przeciwdziałającej
pienieniu się hodowli
Bakteriofag T4 w głodzonych kulturach bakteryjnych
• Miano fagów i bakterii w głodzonych kulturach E. coli MG1655 zakażonych fagami T4D (romby) T4rI (trójkąty) i T4rIII (kwadraty)
1,0E+02
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
0 10 20 30 40 50
Ph
age
tit
er
Time (days)
1,0E+02
1,0E+03
1,0E+04
1,0E+05
1,0E+06
0 10 20 30 40 50
Tite
r o
f in
fect
ed
bac
teri
a
Time (days)
Jakie są powody różnic w poziomie fagów w infekowanych hodowlach?
• Brak rozwoju mutantów T4rI i T4rIII w głodzonych komórkach przy jednoczesnym rozwoju T4D umożliwiającym podtrzymanie populacji?
• Zróżnicowana adsorpcja mutantów i szczepu dzikiego?
• Kombinacja obu?
• …?
Adsorpcja fagów na komórkach gospodarza
• Adsorpcja fagów ze
zwykłego lizatu (romby) i lizatu pasażowanego przez hodowle głodzone (kwadraty) na komórkach głodzonych (panel górny) i rosnących (dolny) w 30°C
0,01
0,1
1
0 5 10 15 20 25 30 35
No
rmal
ize
d f
ree
ph
age
Time (min)
0,01
0,1
1
0 5 10 15 20 25 30 35
No
rmal
ize
d f
ree
ph
age
Time (min)
Znaczenie biofilmu
• Szkody w procesach przemysłowych
• Duże znaczenie w patogenezie (mukopolisacharydoza, rany, zapalenie wsierdzia)
• Łatwa kolonizacja powierzchni (implanty i endoprotezy, cewniki)
Cele projektu
• Optymalizacja metod hodowli biofilmów bakteryjnych
• Dostarczenie dużych ilości materiału bogatego w EPS
• Określenie struktury EPS produkowanych przez różne gatunki bakterii
Metagenomiczne poszukiwanie aktywności przeciwbakteryjnych i
przeciwbiofilmowych w populacjach fagowych
Aktywności przeciwbakteryjne
• Ze względu na charakterystykę cyklu życiowego fagów geny o działaniu przeciwbakteryjnym (lizyny, lizozymy, holiny, inhibitiory biosyntezy ściany komórkowej) stanowią duży procent ich genomów
Aktywności przeciwbiofilmowe
• Naturalne populacje bakteryjne występują często w postaci biofilmu, który jest fizyczna barierą uniemożliwiającą penetrację m.in. przez wirusy
• Niektóre fagi wytworzyły w odpowiedzi enzymy degradujące EPS (egzopolisacharyd). Enzymy takie mogą byd zasocjowane z kapsydem, lub wydzielane przez lizujące komórki bakteryjne
Czemu takie aktywności są cenne?
• Alternatywa dla antybiotyków, szczególnie w leczeniu miejscowym
• Poznanie mechanizmów działania przeciwbakteryjnego
• Niszczenie biofilmów istotne w przemyśle, służbie zdrowia oraz leczenia niektórych chorób
Cele projektu
• Znalezienie w ekspresyjnych bibliotekach genowych jak największej ilości genów godujących interesujące nas aktywności
• Scharakteryzowanie wybranych genów
• Analiza bioinformatyczna sekwencji w celu ustalenia pokrewieostwa wybranych genów z sekwencjami zdeponowanymi w bazach danych
Bakteriofagi jako czynniki patogenności
• Poza bakteriobójczym działaniem bakteriofagi mogą również odpowiadad za zmianę fenotypu bakterii chorobotwórczych
• Ze względu na szerokie spektrum gospodarzy mogą zapewnid horyzontalny transfer genów między gatunkami bakterii
• Poznanie mechanizmów regulacji rozwoju fagów oraz regulacji aktywności genów stx może mied duże znaczenie dla zrozumienia patogenezy zakażeo.
Indukcja H2O2
Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty–27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox
Indukcja mitomycyną C
Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty– 27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox
Indukcja norfloksacyną
Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty–27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox
Indukcja szokiem solnym
Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty–27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox
Czy są jakieś zalety stosowania fagów zamiast przeciwciał?
• Fagi maja zwykle znacznie stabilniejsze domeny odpowiadające za oddziaływanie z bakterią
• Są tanie w produkcji i stosunkowo łatwe w izolacji
• Występują fagi zarówno o bardzo szerokich spektrach gospodarza, jak i bardzo waskich, co umożliwia dobranie specyficzności faga do danego testu.
Czy to działa?
Ilośd faga/test
• Ilośd bakterii/test-0,200
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
T4D λcIb2 P1vir O1
ilość faga na studzienkę
OD
405 n
m
1,00E+08
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
kontrola bez przeciwciał biotynylowanych
kontrola bez surowicy
kontrola bez bakterii
kontrola bez faga
-0,050
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
O1 T4D λcIb2 P1vir
ilość bakterii na studzienkę
OD
405 n
m
1,00E+08
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
kontrola bez przeciwciał biotynylowanych
kontrola bez surowicy
kontrola bez bakterii
kontrola bez faga
Fagi filamentarne
Rozmiary faga: grubość – 6-7 nm
Długość: 900 nm
hu.cnsi.ucsb.edu
www.ncbi.nlm.nih.gov
Phage display
• Bakteriofagi filamentarne i ogoniaste umożliwiają modyfikacje niektórych składników kapsydu
• Pozwala to na produkcje dużych ilości ściśle zdefiniowanych peptydów, które są eksponowane na zewnątrz wirusa
hu.cnsi.ucsb.edu
Po co?
• Zastosowao jest wiele – od produkcji sztucznych przeciwciał do nanostruktur
• Możliwe jest tworzenie fagów o mieszanym składzie wiążącym różne elementy
• Po opłaszczeniu faga np. koloidalnymi zawiesinami metali lub ich związków uzyskujemy wysoko zorganizowane nanostruktury
• Ze wstępnych badao wynika, że użycie fagów eksponujących sekwencje wiążące takie związki może katalizowad ich krystalizacje
• Dzięki możliwościom techniki phage display takie kryształy mogą byd precyzyjnie domieszkowane wybranymi związkami lub pierwiastkami
• Wystarczy wyselekcjonowad peptydy, które je wiążą