Компоненты ИФАКомпоненты ИФА

• АналитАналит – определяемое вещество – определяемое вещество

• ЛигандЛиганд – вещество избирательно – вещество избирательно связывающееся с аналитомсвязывающееся с аналитом

• МеткаМетка – легкоопределяемое – легкоопределяемое соединение, добавляемое в соединение, добавляемое в анлитическую систему для анлитическую систему для измерения количества аналитаизмерения количества аналита

• Авидность – прочность комплекса Авидность – прочность комплекса АГ-АтАГ-Ат

• Афинность – сродство активного Афинность – сродство активного центра центра IgIg с АГД с АГД

Иммуноферментный Иммуноферментный анализанализ

• ГомогенныйГомогенный - все 3 стадии ИФА - все 3 стадии ИФА проходят в растворе и между проходят в растворе и между основными стадиями нет основными стадиями нет дополнительных этапов дополнительных этапов разделения образовавшихся ИК от разделения образовавшихся ИК от непрорегировавших компонентов. непрорегировавших компонентов. Для определения Для определения низкомолекулярных субстанций.низкомолекулярных субстанций.

Иммуноферментный Иммуноферментный анализанализ• ГетерогенныйГетерогенный – анализ проводится в – анализ проводится в

двухфазной системе с участием твердой двухфазной системе с участием твердой фазы (носителя) и обязательной стадией фазы (носителя) и обязательной стадией разделения ИК от непрореагировавших разделения ИК от непрореагировавших компонентов (отмывка).компонентов (отмывка).

• Гетерогенные методы, в которых Гетерогенные методы, в которых формирование ИК на 1 стадии протекает формирование ИК на 1 стадии протекает на твердой фазе ,называют на твердой фазе ,называют твердофазнымитвердофазными..

Гетерогенный твердофазный Гетерогенный твердофазный ИФАИФА

По типу реагентов По типу реагентов присутствующих первой стадии:присутствующих первой стадии:

1.Конкурентный1.Конкурентный На первой стадии в системе присутствуют На первой стадии в системе присутствуют

одновременно анализируемое соединение одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментом и и его аналог, меченный ферментом и конкурирующий за центры конкурирующий за центры специфического связывания с ним.специфического связывания с ним.

2. 2. НеконкурентныйНеконкурентный – характерно – характерно присутствие в системе на 1 стадии только присутствие в системе на 1 стадии только анализируемого соединения и анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.специфичных к нему центров связывания.

Этапы ИФАЭтапы ИФА

• Взаимодействие аналита с Взаимодействие аналита с лигандомлигандом

• Формирование меченного Формирование меченного комплексакомплекса

• Измерение сигналаИзмерение сигнала

Конкурентный ИФА для Конкурентный ИФА для определения антигеновопределения антигенов

Искомый антиген(1) и меченыйферментом Искомый антиген(1) и меченыйферментом антиген(2) конкурируют друг с другом за антиген(2) конкурируют друг с другом за

антитела (3), сорбированные на твердой фазе.антитела (3), сорбированные на твердой фазе.

. . Определение АТ в сыворотке больногоОпределение АТ в сыворотке больного (в (в

лунках планшеток с сорбированным АГлунках планшеток с сорбированным АГ (прямой(прямой ИФА)ИФА)

Определение АГ в сыворотке больногоОпределение АГ в сыворотке больного (в (в лунках лунках планшеток с сорбированным АТ)прямой ИФАпланшеток с сорбированным АТ)прямой ИФА

Твердая фаза Твердая фаза

Полистирол,поливинилхлорид,полипропиленПолистирол,поливинилхлорид,полипропиленустойчивость к растворам, используемым в устойчивость к растворам, используемым в реакцияхреакциях

наличие высокой специфической емкости, т.е. наличие высокой специфической емкости, т.е. способности сорбировать на своей поверхности АГ способности сорбировать на своей поверхности АГ или АТ в количествах, необходимых для или АТ в количествах, необходимых для проведения реакциипроведения реакции

низкая неспецифическая сорбция белков из низкая неспецифическая сорбция белков из исследуемых образцов и конъюгатовисследуемых образцов и конъюгатов

Пути решения этой проблемы:Пути решения этой проблемы: добавить белок, заполняющий свободные добавить белок, заполняющий свободные центры связывания на поверхности пластика центры связывания на поверхности пластика «забивка»«забивка»

развести сыворотку в 10-100 раз развести сыворотку в 10-100 раз

Иногда забивку совмещают с разведениемИногда забивку совмещают с разведением

КонъюгатКонъюгат

• Конъюгат – продукт химической Конъюгат – продукт химической сшивки АТ ( АГ) с ферментным сшивки АТ ( АГ) с ферментным маркером (вторые АТ).маркером (вторые АТ).

Используют АТ к Используют АТ к IgIg того класса, того класса, который мы желаем выявитькоторый мы желаем выявить..

Конъюгат должен обладать Конъюгат должен обладать следующими свойствамиследующими свойствами• Высоким антительным титром и Высоким антительным титром и

высокой афинностью к АГ.высокой афинностью к АГ.

• Достаточной специфичностью в Достаточной специфичностью в рабочем разведениирабочем разведении

• Преобладанием мономерных форм над Преобладанием мономерных форм над полимернымиполимерными

• Оптимальным молярным соотношением Оптимальным молярным соотношением между ферментом и АТ (1:1)между ферментом и АТ (1:1)

• Достаточной ферментативной Достаточной ферментативной активностьюактивностью

СубстратСубстрат

• Бесцветное вещество –хромогенБесцветное вещество –хромоген

• ОртофенилендиаминОртофенилендиамин

• ТетрамитилбензидинТетрамитилбензидин

Основные требования к Основные требования к субстратусубстрату

• Обеспечение высокой Обеспечение высокой чувствительностичувствительности

• Образование хорошо учитываемых Образование хорошо учитываемых продуктов реакции фермент-субстратпродуктов реакции фермент-субстрат

• Должен быть безопасным, дешевым, Должен быть безопасным, дешевым, доступным,удобным в применении.доступным,удобным в применении.

• Чаще используют хромогенные Чаще используют хромогенные субстраты, которые разрушаясь субстраты, которые разрушаясь образуют окрашенное веществообразуют окрашенное вещество

Ферменты и субстраты, наиболее широко используемые в Ферменты и субстраты, наиболее широко используемые в ИФАИФА

Фермент Источник получения

Молек.масса(к

Да)

Субстрат (рекоменд.длина Конъюгирующий реагент

волны при фотометр.,нм)

Пероксидаза хрена Хрен 40 O-фенилендиаминдигидрохлорид

1.Глутаральдегид

(Armoracia (ОФД,492 нм), 2.Мета-периодат натрия

Rusticana) 5-аминосалициловая кислота(450 нм), диаминобензидин, о-дианизидин

3.N-сукцинимидил -3 пропионат

β -галактозидаза Escherichia 540 О-нитрофенил-β-D-галактозид Мета-малеимидобензол-N-гидроксисукцинимидный эфир

Coli (420 нм)

Щелочная форфатаза

E.coli,слизистая кишечника теленка

84-150 Р-нитрофенилфосфат(405нм) Глутаралдегид

5-бромо-4-хлоро-3-индолил

фосфат

Этапы проведения ИФАЭтапы проведения ИФА

Положительный Положительный результатрезультат

• Отрицательный Отрицательный результатрезультат

Добавление аналитаДобавление аналита

Добавление конъюгатаДобавление конъюгата

• Положительный Положительный результатрезультат

• Отрицательный Отрицательный результатрезультат

Схема взаимодействия Схема взаимодействия активного центра АТ и активного центра АТ и антигенной детерминантыантигенной детерминанты

Определение АТОпределение АТ• Сероконверсия Сероконверсия

• первая сыворотка отрицательнаяпервая сыворотка отрицательная

• Вторая -положительнаяВторая -положительная

Метод «парных Метод «парных сывороток»сывороток»

• Сравнение двух последовательных Сравнение двух последовательных анализов, причем повторный анализов, причем повторный анализ рекомендуется делать анализ рекомендуется делать через 10-14 днейчерез 10-14 дней

Иммуноглобулин Иммуноглобулин GG

• СтроениеСтроение

ИммуноглобулиныИммуноглобулины

• IgMIgM определение АТ этого класса определение АТ этого класса необходимо для диагностики острого необходимо для диагностики острого периода заболеванияпериода заболевания

• IgGIgG появляются в период появляются в период реконвалесценции и у переболевших реконвалесценции и у переболевших сохраняются 10 лет и сохраняются 10 лет и более.Используется для оценки более.Используется для оценки напряженности поствакцинального напряженности поствакцинального иммунитета и определение инфекции иммунитета и определение инфекции в анамнезе.в анамнезе.

Определение специфическихОпределение специфических IgEIgE

IgE

специфический

АГ

на бумажном диске

Определение специфическихОпределение специфических IgEIgE

HPR

развитие цветной реакции

СА-242 СА-242 («сэндвич» вариант («сэндвич» вариант ИФА)ИФА)

Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-АТАТ

Твердая фазаТвердая фаза –МАТ против р24 ВИЧ 1 –МАТ против р24 ВИЧ 1Конъюгаты Конъюгаты -1. Биотил.анти-р24 2.Авидин--1. Биотил.анти-р24 2.Авидин-

пероксидазныйпероксидазный

Сыворотка/плазма

Твердая фаза

Коньюгат

Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-Дженскрин Плюс ВИЧ АГ-АТАТ

Твердая фаза-Твердая фаза-gp160,gp160, gp36gp36, композ.пептид, композ.пептидКонъюгатКонъюгат – – gp41,gp36 gp41,gp36 и пероксидаз. конъюгатыи пероксидаз. конъюгаты

Сыворотка/плазмаТвердая фаза

Коньюгат

IgG, IgA, IgM

Тест полоскиТест полоски - Иммунодот - ИммунодотКомбинация АГ на полоскахКомбинация АГ на полосках

1 3 42 5 6

Название Название наборанабора

11 22 33 44 55 66

MONO IgGMONO IgG ((инфекционнинфекционный ый МононуклеозМононуклеоз))

++ EBVEBVVCAVCA GG

EBNA EBNA 1G1G

CMVCMVGG

Toxo Toxo GG

OO

Преимущества ИФАПреимущества ИФА• Высокой чувствительностью, позволяющей Высокой чувствительностью, позволяющей

определять концентрации до 0,05 нг/млопределять концентрации до 0,05 нг/мл

• Минимальные объемы исследуемого Минимальные объемы исследуемого материаламатериала

• Стабильностью при хранении всех Стабильностью при хранении всех ингредиентовингредиентов

• Простотой проведения реакцииПростотой проведения реакции

• Наличием как инструментального, так и Наличием как инструментального, так и визуального учетавизуального учета

• Возможностью автоматизации всех этапов Возможностью автоматизации всех этапов реакцииреакции

• Относительно низкой стоимостью Относительно низкой стоимостью диагностических наборовдиагностических наборов

Полезные советыПолезные советы• Выбор фирмы поставщикаВыбор фирмы поставщика

o Цена не должна быть приоритетомЦена не должна быть приоритетом

o Желательно комплектация 1-3 уровнями Желательно комплектация 1-3 уровнями контр.кач.контр.кач.

o Совместимость с международ. Совместимость с международ. контр.материаламиконтр.материалами

o Стабильность реагентов после открытия Стабильность реагентов после открытия наборанабора

o Срок годности тест-системыСрок годности тест-системы

Неправильная форма Неправильная форма калибровочной кривойкалибровочной кривой

• Не правильно приготовлен раствор стандартаНе правильно приготовлен раствор стандарта

• Стандарт не был разбавлен разбавителем Стандарт не был разбавлен разбавителем стандарта или рабочим буферомстандарта или рабочим буфером

• Неправильная промывкаНеправильная промывка

• Ошибка при внесении стандарта или Ошибка при внесении стандарта или последующих шагахпоследующих шагах

• Использование реагентов из других наборов Использование реагентов из других наборов или наборов другого лотаили наборов другого лота

Полезные советыПолезные советы• Точность пипетирования ( от ячейки к ячейки не Точность пипетирования ( от ячейки к ячейки не >>

2%)2%)

• Не хранить реагенты в саморазмораживающимся Не хранить реагенты в саморазмораживающимся холодильникехолодильнике

• Не используйте инкубаторы с конвективным Не используйте инкубаторы с конвективным нагревомнагревом

• Оптимальное промываниеОптимальное промывание

• Регулярно проверять точность работы обрудованияРегулярно проверять точность работы обрудования

• Рекомендуется, чтобы все сыворотки анализ. в Рекомендуется, чтобы все сыворотки анализ. в дубляхдублях

• (разброс для 1 образца не (разброс для 1 образца не >> 5%) 5%)

Проблемы ИФАПроблемы ИФА•Повышенный фонПовышенный фонo Недостаточная промывкаНедостаточная промывкаo Контаминация субстрата ионами металлов или Контаминация субстрата ионами металлов или

окисляющими реагентамиокисляющими реагентамиo Загрязнение дозатора или субстрата Загрязнение дозатора или субстрата

конъюгатом стрептовидина с ПХконъюгатом стрептовидина с ПХo Неправильное разведение конъюгата Неправильное разведение конъюгата

Стреп.сПХСтреп.сПХo Хромоген. субстрат находился на светуХромоген. субстрат находился на светуo Неправиьное время/ или ТНеправиьное время/ или Т00 инкубации инкубацииo Испарение содержимого во время инкубацииИспарение содержимого во время инкубацииo Неправильное количество ФК или ХСНеправильное количество ФК или ХС

Повышенные оптические Повышенные оптические плотности плотности образцов/стандартовобразцов/стандартов• Не правильно разбавлены стандарты, Не правильно разбавлены стандарты,

конъюгатыконъюгаты

• Микропланшет накрыт пленкой во время Микропланшет накрыт пленкой во время инкубации с субстратоминкубации с субстратом

• Превышение времени инкубацииПревышение времени инкубации

• Нарушение ТНарушение Т0 0 режимарежима

• Контаминация наконечника, субстрата Контаминация наконечника, субстрата Ф.К.Ф.К.

• Субстрат находился на свету перед Субстрат находился на свету перед использованиемиспользованием

Отсутствие или слабое Отсутствие или слабое развитие окраскиразвитие окраски

• Реагенты не достигли комнатной ТРеагенты не достигли комнатной Т00 (25±20) (25±20)• Не правильное хранение набораНе правильное хранение набора• Инкубация с Ф.К. при 37Инкубация с Ф.К. при 3700 вместо комнатной Т вместо комнатной Т00

• Пропущена одна из инкубацийПропущена одна из инкубаций• Высыхание ячеек в ходе проведения анализаВысыхание ячеек в ходе проведения анализа• Использование неподходящего субстрата или стоп-Использование неподходящего субстрата или стоп-

реагент.реагент.• Низкая ТНизкая Т00 в помещении в помещении <<222200 • Истечение срока годности реагентовИстечение срока годности реагентов• Не соответствующая длина волны считыванияНе соответствующая длина волны считывания• Не правильное разбавление Ф.К.Не правильное разбавление Ф.К.•

СоветыСоветы

• Спектрофотометр перед измерением Спектрофотометр перед измерением прогретьпрогреть

• 1 включение = 40 минут работы 1 включение = 40 минут работы лампылампы

• Увеличение сигнала при Увеличение сигнала при использовании марли обработанной использовании марли обработанной хлораминомхлорамином

• Дистиллированная вода комн.Т. Не Дистиллированная вода комн.Т. Не хранить воду более 2-3 дней.хранить воду более 2-3 дней.

• Планшет для предварит. Разведения Планшет для предварит. Разведения использовать однократно.использовать однократно.

СоветыСоветы

• Не сокращать время инкубации с ОФДНе сокращать время инкубации с ОФД• Не допускать подсыхания лунокНе допускать подсыхания лунок• При промывке лунки заполняются до При промывке лунки заполняются до

самого верхасамого верха• Особенно тщательно промывать Особенно тщательно промывать

после инкубации с конъюгатомпосле инкубации с конъюгатом• При отказе спектрофотометра – При отказе спектрофотометра –

добавить стоп-реагент и быстро добавить стоп-реагент и быстро заморозитьзаморозить

Сомнительный результатСомнительный результат

• Ошибка дозирования 5%Ошибка дозирования 5%

• Ошибка измерения Ошибка измерения спектрофотометра 10%спектрофотометра 10%

• Серая зонаСерая зона

Сыворотки, оптическая плотность Сыворотки, оптическая плотность которых отличается не более 15% которых отличается не более 15% от ОПот ОПкриткрит следует признать следует признать сомнительнымисомнительными

ССut offut off

• Пороговое значение, превышение Пороговое значение, превышение которого является положительным которого является положительным результатомрезультатом

ОФД, ТМБОФД, ТМБ

• Отдельная посуда и наконеникиОтдельная посуда и наконеники

• Обработка 50% спиртомОбработка 50% спиртом

• Промыть дистиллированной водойПромыть дистиллированной водой

• Измерять оптическую плотность Измерять оптическую плотность не позже 30 минне позже 30 мин

Автоматические пипеткиАвтоматические пипетки

• Погрешность пипеток не должна Погрешность пипеток не должна превышать 5%превышать 5%

• 1мкл Н1мкл Н220 =1мг0 =1мг

• Дозирование объема менее 10 мклДозирование объема менее 10 мкл

Сбор, подготовка и транспортировка Сбор, подготовка и транспортировка образцов для исследования на наличие образцов для исследования на наличие антител к вирусу краснухи класса антител к вирусу краснухи класса IgM IgM ии IgG IgG• Материал для исследования - сыворотка крови.Материал для исследования - сыворотка крови.• Тестированию подлежит сыворотка, не содержащая примеси эритроцитов, Тестированию подлежит сыворотка, не содержащая примеси эритроцитов,

бактериальной контаминации, хилеза, гемолиза.При наличии любого из указанных бактериальной контаминации, хилеза, гемолиза.При наличии любого из указанных признаков сыворотка уничтожается и назначается повторный забор крови.признаков сыворотка уничтожается и назначается повторный забор крови.

• Приготовление сыворотки.Приготовление сыворотки.• Венозная кровь берется без антикоагулянта. Отстаивается при комнатной Венозная кровь берется без антикоагулянта. Отстаивается при комнатной

температуре (15-20град) в течении 30 минут до полного образования сгустка. По температуре (15-20град) в течении 30 минут до полного образования сгустка. По окончании образования сгустка пробирки открывают и осторожно проводят тонкой окончании образования сгустка пробирки открывают и осторожно проводят тонкой стеклянной палочкой по внутренним стенкам пробирки для стделения сгустка от стеклянной палочкой по внутренним стенкам пробирки для стделения сгустка от стенок пробирки.Сыворотку сливают в другую центрифужную пробирку, стенок пробирки.Сыворотку сливают в другую центрифужную пробирку, придерживая сгусток стеклянной палочкой, и центрифугируют, либо придерживая сгусток стеклянной палочкой, и центрифугируют, либо центрифугируют в тех же, первичных, пробирках. центрифугируют в тех же, первичных, пробирках.

• После центрифугирования отделяют сыворотку от сгустка и клеток крови и После центрифугирования отделяют сыворотку от сгустка и клеток крови и помещают в холодильник при +2-+8 град. При необходимости более длительного помещают в холодильник при +2-+8 град. При необходимости более длительного хранения ее необходимо хранить при - 20 град. Допускается замораживать хранения ее необходимо хранить при - 20 град. Допускается замораживать сыворотку только 1 раз.сыворотку только 1 раз.

• Условия транспортировкиУсловия транспортировки..• Правильно собранная сыворотка должна быть своевременно доставлена в Правильно собранная сыворотка должна быть своевременно доставлена в

лабораторию. Сыворотка крови стабильна при +2-+8 град в течении 12 часов.лабораторию. Сыворотка крови стабильна при +2-+8 град в течении 12 часов.• Во время транспортировки пробирки с сывороткой должны быть соответствующим Во время транспортировки пробирки с сывороткой должны быть соответствующим

образом защищены от вредного воздействия окружающей среды и погодных образом защищены от вредного воздействия окружающей среды и погодных условий. Пробирки должны быть промаркированы, упакованы и плотно закрыты.условий. Пробирки должны быть промаркированы, упакованы и плотно закрыты.

• Минимальное количество сыворотки, необходимое на 1 исследование - 200 мкл.Минимальное количество сыворотки, необходимое на 1 исследование - 200 мкл.• Для определения динамики антителообразования сыворотку исследуют дважды.Для определения динамики антителообразования сыворотку исследуют дважды.• Интервал между исследованиями 1-2 недели. ( метод "парных" сывороток)Интервал между исследованиями 1-2 недели. ( метод "парных" сывороток)•

СпектрофотометрыСпектрофотометры

СпектрофотометрыСпектрофотометры• СпектрофотометрыСпектрофотометры• Обычно требуют длительного времени прогрева Обычно требуют длительного времени прогрева

(указано в инструкции). Поэтому если ожидается (указано в инструкции). Поэтому если ожидается измерение оптической плотностичерез 30 мин после измерение оптической плотностичерез 30 мин после очередного измерения, прибор лучше оставить очередного измерения, прибор лучше оставить включенным ( 1 включение равносильно 40 мин работы включенным ( 1 включение равносильно 40 мин работы лампы).лампы).

• Спектрофотометры имеют допустимую погрешность Спектрофотометры имеют допустимую погрешность измерения до 10%.Проверить это можно, промеряя измерения до 10%.Проверить это можно, промеряя дважды один и тотже планшет и вычисляя различие в дважды один и тотже планшет и вычисляя различие в величине оптической плотности в одинаковых лунках. величине оптической плотности в одинаковых лунках. При этом планшет разворачивают так, чтобы лунка А1 При этом планшет разворачивают так, чтобы лунка А1 заняла место Н12. заняла место Н12.

• При оптической плотности выше 1,5 о.е. погрешность При оптической плотности выше 1,5 о.е. погрешность спектрофотометра может возрастать.спектрофотометра может возрастать.

Марля или Марля или фильтровальная бумагафильтровальная бумага

• При многократном использовании При многократном использовании марли, обработанной хлорамином, марли, обработанной хлорамином, возможно повышение сигнала (при возможно повышение сигнала (при попадании хлорамина в лунки) попадании хлорамина в лунки)

Дистиллированная водаДистиллированная вода

• Не хранить более 2-3 дней. Не Не хранить более 2-3 дней. Не добавлять азид натрия в качестве добавлять азид натрия в качестве консерванта.. Он является консерванта.. Он является ингибитором пероксидазы. Если ингибитором пероксидазы. Если вода хранилась в холодильнике, вода хранилась в холодильнике, необходимо прогреть до необходимо прогреть до комнатной t°.комнатной t°.

Планшет для Планшет для предварительного предварительного разведения сыворотокразведения сывороток

• Использовать однократно.Использовать однократно.

Инструкции по Инструкции по применениюприменению

– При получении новой серии наборов даже хорошо знакомой тест-системы – необходимо При получении новой серии наборов даже хорошо знакомой тест-системы – необходимо прочитать инструкцию.прочитать инструкцию.

– Сознательные нарушения инструкции – сокращение времени инкубации с р-ром Сознательные нарушения инструкции – сокращение времени инкубации с р-ром субстрата.Такие изменения протокола ИФАмогут существенно снизить выявляемость субстрата.Такие изменения протокола ИФАмогут существенно снизить выявляемость слабоположительных образцов, т.е. привести к ложноотрицательным результатам.слабоположительных образцов, т.е. привести к ложноотрицательным результатам.

– Перед вскрытием пакета с планшетом его следует выдержать при комнатной Т° для Перед вскрытием пакета с планшетом его следует выдержать при комнатной Т° для предотвращения конденсации влаги на планшете если планшет разборный и предотвращения конденсации влаги на планшете если планшет разборный и используются не все стрипы сразу,то после вскрытия оставшиеся стрипы следует используются не все стрипы сразу,то после вскрытия оставшиеся стрипы следует поместить в пакет, край покета завернуть и зажать скрепками.Не следует удалить поместить в пакет, край покета завернуть и зажать скрепками.Не следует удалить покетик с влагопоглотителем.покетик с влагопоглотителем.

– Для предотвращения загрязнения не следует трогать верхнюю часть стрипов пальцами.Для предотвращения загрязнения не следует трогать верхнюю часть стрипов пальцами.– Перед использованием убедитесь, что растворы и реагенты гомогенны.Перед использованием убедитесь, что растворы и реагенты гомогенны.– В случае необходимостидлительного перерыва следует положить планшет вверх В случае необходимостидлительного перерыва следует положить планшет вверх

донышками на смоченную водой марлю или фильтровальную бумагу.донышками на смоченную водой марлю или фильтровальную бумагу.– Реакция связывания АТ с АГ начинается сразу после внесения сыворотки в лунку, Реакция связывания АТ с АГ начинается сразу после внесения сыворотки в лунку,

поэтому желательно уменьшить период между внесением первой и последней поэтому желательно уменьшить период между внесением первой и последней сыворотки в планшет.сыворотки в планшет.

– Рабочий раствор конъюгата желательно готовить непосредственно перед применением.Рабочий раствор конъюгата желательно готовить непосредственно перед применением.– Особенно тщательно следует промывать планшет после инкубации конъюгата.Особенно тщательно следует промывать планшет после инкубации конъюгата.

Отказ Отказ спектрофотометраспектрофотометра

• Быстро заморозить планшет после Быстро заморозить планшет после добавления серной кислоты с добавления серной кислоты с последующим быстрым оттаиванием последующим быстрым оттаиванием перед измерением оптической перед измерением оптической плотности.Следует учмтывать, что о.п. плотности.Следует учмтывать, что о.п. все-таки возрастает, а относительный все-таки возрастает, а относительный прирост сигнала более высок для прирост сигнала более высок для небольших значений о.п.небольших значений о.п.

Отказ термостатаОтказ термостата

• Универсальных рецептов нетУниверсальных рецептов нет

Ошибки при постановки Ошибки при постановки ИФАИФА

• Инкубация при комнатной t° (18-25°)Инкубация при комнатной t° (18-25°)• На практике t° в помещениях лабораторий На практике t° в помещениях лабораторий

варьирует от 12-30°. Общих формул оценки варьирует от 12-30°. Общих формул оценки влияния соотношения t° и времени инкубации на влияния соотношения t° и времени инкубации на оптическую плотность не оптическую плотность не существует.Единственный способ избежать существует.Единственный способ избежать ошибки – установка планшета в термостат, ошибки – установка планшета в термостат, настроенный на комнатную t°.настроенный на комнатную t°.

• Перед постановкой тест-системы концентраты р-Перед постановкой тест-системы концентраты р-ров необходимо развести дистиллированной ров необходимо развести дистиллированной водой. Вода должна иметь комнатную t°. Особенно водой. Вода должна иметь комнатную t°. Особенно это важно для разведения конъюгата и сывороток. это важно для разведения конъюгата и сывороток. Вероятность получения неправильного результата Вероятность получения неправильного результата выше, если продолжительность инкубации мала выше, если продолжительность инкубации мала (30мин)(30мин)

Относительная влажность Относительная влажность воздухавоздуха

• Относительная влажность воздухаОтносительная влажность воздуха

• Длительная инкубация при комнатной Длительная инкубация при комнатной t°, при сухом воздухе(зимой) может t°, при сухом воздухе(зимой) может вызвать подсыхание р-ра с вызвать подсыхание р-ра с образованием «ободка» на боковой образованием «ободка» на боковой поверхности лунки, который при поверхности лунки, который при промывки может сохраниться. Лучше промывки может сохраниться. Лучше использовать влажную камеру.использовать влажную камеру.

Промыватели Промыватели планшетовпланшетов

• Засорение каналов Засорение каналов промывателей.недостаточная промывка промывателей.недостаточная промывка приводит к завышению сигнала.Обнаружить приводит к завышению сигнала.Обнаружить это просто – при использовании рядного это просто – при использовании рядного промывателяповышенный сигнал имеет один промывателяповышенный сигнал имеет один из рядов, при использовании 96-канального – из рядов, при использовании 96-канального – одна и таже лунка разных планшетоводна и таже лунка разных планшетов

• Менее частовстречается засорение Менее частовстречается засорение пространства между иглами промывателя пространства между иглами промывателя кусочками марли или ваты.Это приводит к кусочками марли или ваты.Это приводит к заносу растворов из одной лунки в другие.заносу растворов из одной лунки в другие.