实验九 免疫学检测技术临床应用综合训练 ---- 自身免疫性疾病的检测

一、实验目的要求1. 掌握自身免疫性疾病免疫检测的应用原则。2. 了解 SLE 疾病特点，掌握 SLE 免疫学特征及常用检测项目。3. 掌握 ANA 荧光抗体技术原理、方法和检测意义。4. 掌握 ENA 多肽抗体谱检测技术原理、方法和检测意义。5. 掌握抗 dsDNA 抗体免疫渗滤试验原理、方法和检测意义。6. 掌握 RF 胶乳凝集试验的原理、方法和检测意义。7. 掌握免疫标记技术试验原理、实验方法及结果判断。8. 掌握化学发光、流式细胞仪的测定原理，熟悉化学发光、流式细胞仪临床检测的意义。9. 掌握组织配型的原理、方法及应用。

二、 相关知识回顾1.Ag 机体 特异性免疫应答 无免疫应答 免疫应答过强自身 Ag ？正常情况下，免疫系统对宿主自身的组织和细胞不产生免疫应答，即自身免疫耐受。

2.在某些情况下，自身耐受遭到削弱或破坏，机体免疫系统针对自身抗原产生免疫应答，体内检出自身抗体或自身反应性 T 淋巴细胞，这种现象称为自身免疫。

• 微弱的自身免疫并不引起机体的病理性损伤，而促进体内衰老残疾细胞的清除，帮助吞噬细胞完成免疫自稳效应，以保持机体生命环境的稳定。

• 在许多正常人血清中可发现多处微量的自身抗体或致敏淋巴细胞，自身免疫现象随年龄递增而愈加明显，在 70％以上的正常老年人血清中可查出自身抗体。

3. 当某种原因使自身免疫应答过分强烈时，可导致相应的自身组织器官损伤或功能障碍，使机体处于疾病状态，即自身免疫性疾病。

按自身抗原分布范围分类：• 器官特异性：自身抗原为某一器官的特定成分，其病变常局限于该器官。 • 非器官特异性：自身抗原是非器官组织特异的，是多器官、组织的共有成分。

表 26-1 自身免疫病按抗原分布范围分类 类 别 病 名 自 身 抗 原

器官特异性 桥本甲状腺炎 甲状腺球蛋白和甲状腺微粒体 甲状腺功能亢进(Graves病) TSH受体 艾迪生病(Addi son病) 肾上腺细胞 溃疡性结肠炎 结肠粘膜细胞 重症肌无力 乙酰胆碱受体

晶状体过敏性眼炎 眼晶状体蛋白 胰岛素依赖性糖尿病 胰岛β 细胞 胰岛素抵抗性糖尿病 胰岛素受体 原发性胆汁性肝硬化 小胆管上皮细胞 自身免疫性溶血性贫血 红细胞 特发性血小板减少性紫癜 血小板 特发性白细胞减少症 白细胞 非器官特异性 系统性红斑狼疮 细胞核 类风湿性关节炎 变性 I gG 混合性结缔组织病 细胞核 多发性肌炎 细胞核

表 26-2 自身免疫病按发病部位的解剖系统分类 分类 疾病

结缔组织 系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干燥综合征、混合性结缔组织病

内分泌系统 桥本甲状腺炎、Graves病、Addi son病、胰岛素依赖性糖尿病

消化系统 萎缩性胃炎、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬化、

血液系统

恶性贫血、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、特发性白

细胞减少症

心血管系统 风湿性心肌炎

泌尿系统 肾小球肾炎

呼吸系统 特发性肺纤维化

神经系统 重症肌无力、多发性神经炎

皮肤 荨麻疹

4.AID的共同特征 多数病因不清，无诱因者称为“自发”或“特发” 女性居多，随年龄增加发病率上升 有遗传倾向 血清中有自身抗体或针对自身组织细胞的致敏淋巴细胞，

自身抗体在不同的自身免疫疾病中有交叉重叠现象。 疾病的重叠现象，即同一病人可同时患一种以上 AID 病程慢性迁移，反复发作 病损局部有淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞浸润 免疫抑制剂治疗有一定疗效

5. AID 的发病机制自身组织成分

自身抗体 致敏淋巴细胞

自身免疫应答

自身组织细胞损伤

（一）由 II 型超敏反应引起的免疫损伤（二）由 III 型超敏反应引起的免疫损伤（三） T 细胞对自身抗原应答引起的免疫损伤

6. 常见的 AID（一）由 II 型超敏反应引起的 AID

抗血细胞表面抗原抗体引起的自身免疫病如：自身免疫性溶血性贫血 免疫性血小板减少性紫癜抗细胞表面受体抗体引起的自身免疫病如：重症肌无力 毒性弥漫性甲状腺肿细胞外抗原的自身抗体引起的自身免疫病如：肺出血肾炎综合症

（ 1 ）自身免疫性溶血性贫血（ autoimmune hemolytic anemia, AIHA ）

红细胞 + 药物 → 表面抗原性发生变化 → 产生抗红细胞表面抗原的自身抗体 + 表面抗原→激活补体→破坏红细胞

特点： ① 体内出现抗红细胞自身抗体， Coombs test

阳性；② 红细胞寿命缩短；

（ 2 ）免疫性血小板减少性紫癜（ immunologic thrombocytopenic purpura, ITP ）

主要表现：皮肤粘膜紫癜， plt↓,骨髓中巨核细胞可增多。女性多发，发病率 1/10000。患者有抗血小板抗体，其使 plt寿命缩短。

可分为特发性和继发性。

( 二 ) 由Ⅲ型超敏反应引起的自身免疫性疾病

• 系统性红斑狼疮（ SLE ）；• 类风湿性关节炎（ RA ） 。（三）由 T 细胞对自身抗原应答引起的自身

免疫性疾病 • I 型糖尿病（ DM1 ） • 多发性硬化症（ MS ）

（ 1） SLE ：一种病因未明的自身免疫介导的炎症性结缔组织病。体内有大量自身抗体和免疫复合物，造成组织损伤，临床上可出现各个系统和脏器损害的症状。

免疫学特征：1)存在多种抗核抗体；2) 存在多种其他自身抗体；3) 血清补体水平↓ ,Ig和补体沉积在肾和皮肤 - 表皮交界处；4) 遗传风险因子包括补体经典途径早期阶段成分的缺陷。

主要的自身抗体有： 抗核抗体——筛选指标 抗 Sm抗体——标志抗体 抗 dsDNA抗体——特异性抗体 抗 DNA抗体 抗 ssDNA－－非特异性抗体 抗磷脂抗体 10%～ 15%SLE患者，与梅毒假阳性有关。

抗血小板抗体（ 75%～ 80%） 抗血小板Ⅷ因子抗体——出血 抗血小板抗体——血小板减少 抗红细胞抗体（ 10%～ 60%） 直接 Coombs试验 RF（ 30%） 胶乳凝集试验 抗细胞质抗体 抗线粒体抗体、抗核糖体抗体、抗溶酶体抗体

（ 2） RA ：是一种累及周围关节为主的多系统性自身免疫病。病理改变以关节滑膜慢性炎症性增生、关节软骨和骨质进行性不可逆破坏为特征。 免疫学特征：1)血液和滑膜液中存在 RF；2)淋巴细胞和活化的巨噬细胞浸润到受累滑液；3)炎症滑液局部产生 TNFα等其他炎症前细胞因子。主要的自身抗体有：1 ） RF－－非特异性，过筛实验，和疾病预后相关2 ）抗核抗体（低滴度）3 ）抗胶原酶抗体等

• 筛查性试验与确诊性试验项目的合理组合• 选择相关的自身抗体检测项目• 切忌盲目的全面检测• 实验中应同步设置阳性和阴性对照 一般 ANA筛选；结合 IgG、 IgA、 IgM、补

体（ CH50或 C3）、 RF的检测结果； 结果异常，再检测 ENA、 dsDNA等

7. AID 的免疫检测原则

95% ～ 99%可排除 SLE

（－） SLE治疗缓解 病情特重（大量 IC沉积消耗抗体）（＋）低滴度 常见于 RA等其它自身免疫性疾病　　　高滴度　可作为诊断 SLE的依据

ENA抗体谱检测 （－）不能排除抗 dsDNA、 Sm、 rib抗体 （＋）可帮助诊断　

ANA初筛

免疫球蛋白及补体检测（ 1 ）免疫球蛋白检测意义自身抗体↑→ Ig↑→其中 IgG↑明显， IgM、 IgA亦↑Ig含量波动与疾病活动与稳定有相关性（ 2 ）补体检测意义 Ⅱ、Ⅲ型变态反应性机制所致的 AID补体消耗↑→故含量↓（疾病缓解补体可恢复正常，补体的变化可了解疾病的进展）自身反应性 T 淋巴细胞引起的 AID补体无明显变化

8. 抗核抗体：以真核细胞（如 HEp-2 细胞、肝细胞）的各种细胞核成分为靶抗原所检测的自身抗体的总称。

间接免疫荧光法（ indirect immunofluorescence, IIF ）

酶免疫斑点法 ELISA 免疫印迹法 （ Western-blot）

9. 抗核抗体检测方法

•

免疫组化技术（荧光抗体技术）

荧光免疫测定均相——荧光偏振免疫测定 （ FPIA）非均相——时间分辨荧光免 疫分析（ TR-FIA）

10. 10. 荧光免疫技术荧光免疫技术 将抗原抗体反应的特异性和荧光物质检测的直观性和敏感性结合起来的一种免疫分析技术。

11. 荧光和荧光物质1 ）荧光的产生： 物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 ------ 荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光 ------ 化学发光技术

紫外光激发荧光物质放射荧光示意图

2 ）常见荧光素的特性：

11. 免疫荧光显微镜技术• 原理 以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记特异性抗体或抗抗体，检测固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体，常用于定性和定位检查的一门技术。• 优点：可定位、定性检测，直观性强• 缺点：难以保存，非特异荧光干扰

方法：1 ） 直接法：

2 ）间接法

3 ） 补体法

4 ）双标记法• 用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本进行荧光染色。

应用• 细菌学方面：菌种鉴定和 Ag 结构的研究 • 病毒学方面：病毒鉴定和病毒在感染 cell 内的定位• 免疫学方面：• 1 ）研究• 2 ）用于自身免疫病的诊断• 3） T、 B 细胞亚群的分离及检测 • 寄生虫学方面：用于寄生虫的诊断 • 其它：激素或酶的组织定位

荧光显微镜

抗双链 DNA抗体 • 抗 dsDNA抗体与细胞核 DNA（外围区）脱氧核糖磷酸框架结合。

• 抗 dsDNA抗体是 SLE患者的特征性标志抗体。其抗体滴度与疾病的活动程度有相关性。

12. 抗双链 DNA抗体检测

方法：斑点金免疫渗滤试验• 在以硝酸纤维素膜为载体并包被了抗原或抗体的渗滤装置中，依次滴加标本、免疫金及洗涤液，因微孔滤膜贴置于吸水材料上故溶液流经渗滤装置时与膜上的抗原或抗体快速结合并起到浓缩作用，达到快速检测目的（一般在 5 分钟左右完成）。• 阳性反应在膜上呈现红色斑点。

• 试剂盒组成 ①渗滤装置，是斑点金免疫渗滤试验试剂盒中主要组成成分之一，由塑料小盒、吸水垫料和点加了抗原或抗体的硝酸纤维素膜片三部分组成；②胶体金标记物 ；③洗涤液 。• 操作要点 ①将渗滤装置（或称反应板）平放于实验台面上，于小孔内滴加待测标本 1~2 滴，待完全渗入；②于小孔内滴加免疫金试剂 1~2 滴，待完全渗入；③于小孔内滴加洗涤液 2~3 滴，待完全渗入；④在膜中央显示清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应，反之则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性程度。

抗 ENA 抗体谱 : 可提取核抗原抗体的总称

临床常检测的抗 ENA抗体谱主要包括： 抗 Sm 抗 U1-RNP 抗 SSA 抗 SSB 抗 Jo-1 抗 Scl-70

抗 rib-P蛋白

13. 抗 ENA 抗体谱的检测与应用

免疫印迹法

SDS-PAGE电泳 转移电泳 酶免疫检测

免疫印迹法

（ 1 ）抗 Sm 抗体：• 是 SLE 的特异性抗体。 Sm 抗原是 U 族小分子细胞核核糖核蛋白（ UsnRNP ），具有抗原性的蛋白的分子量是 29KD、 28KD、 13.5KD 。• 对早期、不典型的 SLE 或经治疗缓解后的回顾性诊断有一定意义。• Sm 抗体和 SnRNP 是同一分子复合物中的不同抗原位点，抗 Sm 抗体阳性均伴有抗 U1RNP 抗体，而抗 U1RNP 抗体可以单独存在。

（ 2 ）抗 SSA／ Ro 抗体：• SSA／ Ro 是小分子细胞浆核糖核蛋白（ scRNPs ），是蛋白和小分子核糖核酸形成的复合物。抗原是含有 Y－ YRNA 的蛋白质，它更多的存在于胞浆中，其分子量有 52KD及60KD。 52KD 的多肽条带与干燥综合征（ SS ）相关，而 60KD 的多肽条带则更多存在于SLE患者中。

• 抗 SSA 抗体主要见于原发性干燥综合征，阳性率高达 60％～ 75％。• SSA 抗体与广泛光过敏性皮炎症状相关。

（ 3 ）抗 SSB/La/Ha 抗体：• 是抗小分子细胞核核糖核蛋白（ snRNP ）。抗原是 RNA 多聚酶转录中的小 RNA磷酸蛋白质。其分子量为 48KD、 47KD、 45KD ，其中

48KD更具特异性。对干燥综合征的诊断具有特异性。• 抗 SSB 阳性几乎总伴有抗 SSA 抗体阳性，抗

SSB 抗体较抗 SSA 抗体诊断干燥综合征更特异，是干燥综合征血清特异性抗体。原发性干燥综合征阳性率达 40％左右。• 其他自身免疫性疾病中如有抗 SSB 抗体，常伴有继发性干燥综合征。唾液腺、唇腺活检可见大量淋巴细胞浸润。

（ 4 ）抗 Scl-70 抗体：• 是分子量为 100KD的 DNA拓朴异构酶 I 的降解产物，首先在皮肤弥漫型多发性系统性硬化症（ PSS ）患者血清中发现抗 Scl-70 抗体。因其主要见于硬皮病，且相应抗原分子量为

70KD ，故取名为抗 Scl-70 抗体。• PSS 病人阳性率达 30%～ 40% 。虽然阳性率不高，但对 PSS（ SSC ）有较高特异性（特异性达 100% ）。• 有抗 Scl-70 抗体阳性表示病性进展较迅速，皮肤病变往往弥散广泛，易发生肺间质纤维化和指骨末端吸收。

（ 5 ）抗 JO-1 抗体：• Jo-1 抗原是组氨酰 tRNA 合成酶在胞浆中以小分子核糖核蛋白（ scRNPs ）形式出现，分子量为 50KD ，它是氨酰 tRNA 合成酶之一。• 抗 Jo-1 抗体对多发性肌炎的诊断具有较强的特异性，是目前公认的多发性肌炎（ PM ）的血清标记抗体。在多发性肌炎（ PM ）中阳性率达 25％左右。在皮肌炎（ DM ）中阳性率为7.1% 。合并肺间质病变的 PM／ DM患者，阳性率高达 60％。 67％抗 Jo-1 抗体阳性的患者有 HLA－ DR3 抗原。其他结缔组织病为阴性。

（ 6 ）抗 rRNP（ ribosome ）抗体：• 抗 rRNP 抗体的靶抗原是核糖体大亚基上磷酸蛋白。为胞浆抗原（抗原是主要存在于胞浆中的一种磷酸蛋白）。• 免疫印迹法测得抗 rRNP 主要有 38KD 、

16KD、 15KD 三条蛋白多肽。抗 rRNP 抗体主要见于 SLE ，常在 SLE活动期中存在，阳性率在10%～ 20%左右，是诊断 SLE 的特异性抗体。

• 如仅有抗 rRNP 抗体阳性的 SLE患者， ANA 常为阴性。抗 rRNP 抗体阳性患者中枢神经系统病变发生率高。抗 rRNP 抗体与抗 dsDNA 抗体的消长相平行，但与抗 dsDNA 抗体不同的是不会随病情好转立即消失，可持续 1～ 2年后才转阴。

（ 7 ）抗 RNP 抗体：• 抗 nRNP（ nuclear RNP ）：临床上应用较多的是 U1RNP 抗体， U1snRNP由

U1RNP和 9 种不同的蛋白质组成。• 具有抗原性的分子量有 70KD、 32KD和 22KD 。因为是以抗核内的核糖核蛋白得名 ，所作用的抗原是 U1 小分子细胞核核糖核蛋白（ U1snRNP ），所以又称抗 U1RNP 抗体。

意义：• 1 ）混合性结缔组织病 (MCTD) ：几乎均为阳性，且滴度很高，对确立MCTD 的诊断很有帮助。高滴度的抗 RNP ，尤其在没有其他自身抗体存在的情况下，一般认为是混合性结缔组织病（ MCTD ）的诊断标志。• 2 ）系统性红斑狼疮（ SLE ）：抗 RNP 抗体在 SLE 中的阳性率为 40%左右，仅产生抗 RNP 抗体的 SLE 病人，常常抗 DNA 抗体阴性，肾脏受累较少，一般来说皮质激素类药物有很好的治疗效果，预后理想，定期监测抗 RNP 对疗效观察及预后判断有实际意义。抗 RNP 抗体如和抗 ds-DNA抗体、抗 Sm 抗体同时存在，则发生狼疮肾炎的可能性较大。

• 3 ）其他结缔组织病：抗 RNP 抗体在其他结缔组织病阳性率较低且滴度低。

类风湿因子（ rheumatoid factor, RF ）为抗变性 IgG Fc 的自身抗体，主要是 IgM 型 致病机理： RF 与体内变性 IgG 结合形成免疫复合物，激活补体或被吞噬细胞吞噬，产生炎性介质导致组织炎性损伤，使患者发生骨关节炎及血管炎。

14. RF 的检测与应用

1 ）胶乳颗粒凝集实验 定性、半定量，敏感性和特异性不高，测定 IgM-RF 2 ）速率散射比浊法（ ARRAY、 IMAGE） 定量、准确、快速，测定 IgM-RF 3 ） ELISA 定量、准确，可测定不同类型的 RF

检测方法

（ 1 ） RF在 RA 、 SLE 、 PSS等多种自身免疫性疾病患者中均可被检出。

疾病 阳性率（ % ）RA 79SLE 30SS 95

Sclerosis 80PM 80MCTD 25

临床应用

（ 2 ） RF滴度与 RA患者临床表现呈正相关， IgM-RF效价 >80IU/ml并伴有严重关节功能障碍时 通常提示患者预后不良。 （ 3 ） IgG-RF与 RA患者的滑膜炎、血管炎和关节 症状密切相关，常伴随 IgM-RF同时出现，在 正常人及非 RA患者中很难检出。 （ 4 ） IgA-RF与 RA患者关节症状的严重程度及骨质 破坏有显著相关性。

三、实验内容根据给出的病例，初步诊断，讨论

• 病例：张某，女， 16岁。• 主诉：乏力，发热 3月余，伴颧部红斑 1月余。• 现病史：患者 3月前无明显诱因出现乏力，发热，体温

37～ 38℃， 1月前出现颧部红斑，日光照射后出现皮疹。自患病以来，患者精神差，饮食不佳，体重下降5kg 。

• 体检： T:37.8℃， P： 100次 / 分， R： 20次 /分， BP： 120/90mmHg 。面部蝶型红斑，口腔溃疡，余无殊。• 已有检查项目： 血液： IgG： 28.3g/l， IgA： 3.40g/l， IgM： 3.02g/l，

C3： 0.43g/l， C4： 0.06g/l 尿： MA:14mg/L， TRF:1.5mg/L， IgG:9.5mg/L， α1

M:10mg/L

• SLE 免疫学特征？• 除了上述已有的免疫学检查项目，与

SLE 相关的主要检测项目还有哪些？• SLE 检测原则？

SLE 免疫学特征？– 存在多种细胞核抗原的抗体，如抗 dsDNA 抗体、抗 Sm 抗体。– 同时存在多种其他抗体，如抗核糖体抗体。– 疾病活动期血清补体水平降低。– 免疫球蛋白和补体沉积在肾和皮肤－表皮交界处。– 遗传风险因子包括补体金典途径早期阶段成分的缺陷。除了上述已有的免疫学检查项目，与 SLE 相关的主要检测项目还有哪些？

RF、 ANA 、抗 dsDNA 抗体、 ENA 、抗血小板抗体、抗红细胞抗体、抗细胞质抗体、抗磷脂抗体、血沉、 CRP、 CIC等。SLE 检测原则？ 先选择检测 ANA， RF ，免疫球蛋白 IgG、M、 A含量，补体量，如结果异常再检测抗 dsDNA 抗体、 ENA 以助确诊。

四、根据实验室可供选择检查项目合理安排相关实验检测• ANA、 RF• ENA 、抗 dsDNA 抗体实验原理、方法和步骤（见实验书和说明书）

五、结果及讨论

1. 结果报告2. 结果分析：写出你的诊断，并说明理由。

六、思考题： 如不用 ANA间接免疫荧光检测做初筛试验，而用酶免疫分析法、免疫电泳等其他的方法来检测自身抗体，可以吗？

ANA 荧光抗体技术实验步骤：1. 肝印片制备：取 4~8周龄小鼠，断颈处死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用 NS 洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上形成薄层肝细胞。冷风吹干，丙酮固定 20min 。2. 用红蜡笔在玻片上画两个直径 1cm 的圆圈。3. 将待测血清和对照血清用 PBS作 1:10稀释，取 50ul 加于抗原片记号圈内，放湿盒， 37℃温育 30min 。4. 取出抗原片，用 ddH2O冲去未结合的血清，置

PBS（ 1、 2、 3 平皿）中浸洗，每缸 5min ，吹干。5. 滴加稀释的 FITC- 抗人 IgG 抗体 10ul （勿涂开），置湿盒内，

37℃孵育 30min 。6. 同步骤 4浸洗，吹干。7. 滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜检查。

第二部分 化学发光、组织配型、流式细胞仪一、目的要求

1. 掌握化学发光、流式细胞仪的测定原理。2. 熟悉化学发光、流式细胞仪临床检测的意义。3. 掌握组织配型的原理、方法及应用。二、 化学发光、流式细胞仪、组织配型（录像示教）

1. 化学发光 2. 荧光抗体技术 3.MLR 4.HLA 分型技术 5.FCS 技术

思考题 在发光免疫分析中，最常见的的三大类型是什么？ 检测 HLA 抗原的方法常见的有哪两类？ 补体依赖的细胞毒（ CDC ）试验原理是什么？ 前向散射光（ FS ）、侧向散射光（ SS ）分别反映

细胞的什么性状？