Download pdf - СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАНА

БИОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

Вестник ВолГУ. Серия 11. 2011. № 2 (2) 1 7

Л

ябин

М.П

., С

емен

ов П

.С.,

2011

УДК 663/66ББК 36-9

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТОЗАНА

М.П. Лябин, П.С. Семенов

Рассмотрены основные области применения хитозана. Показана возможность получениябиополимера новым «мягким» способом.

Ключевые слова: хитин, хитозан, медици-на, биотехнология, биоинженерия, получение, де-ацетилирование.

Хитозан – вещество ХХI в., природныйполисахарид, находящий широкое примене-ние в различных областях народного хозяй-ства. Если в 1994 г. в мире производилосьтолько 1 000 т хитозана, из которых 800 т – вЯпонии, то сегодня мировой оборот его про-изводства составляет 150–200 тыс. т в год.Лидерами в производстве хитозана являют-ся такие страны, как Китай, Малайзия,Польша и США.

Исследованиями хитозана занимаютсяболее чем в 15 странах, и в настоящее времяизвестно более 70 направлений его практичес-кого применения, наиболее важными из кото-рых во всем мире признаны:

1. Пищевая промышленность – в каче-стве загустителя и структурообразователейдля продуктов диетического питания, способ-ствующих выведению радионуклидов из орга-низма; для создания простых и многокомпо-нентных эмульсий, соусов, паст, осветленияпива, соков, вин; в качестве, как консерванта,так и интенсифицикатора запаха и вкуса.

Бактерицидное [13] действие хитозанапозволяет использовать его в изготовлениипленок для хранения различных видов пище-вой продукции. Наиболее широко известнозащитное действие пленок из хитозана, нане-сенных на поверхность плодов и овощей – яб-лок, апельсинов, земляники, томатов, перца.Поскольку плоды и овощи остаются живым

организмом, будучи отделенными от материн-ского растения, они обладают определеннымиммунитетом и в них проходят обменные про-цессы. Однородные, гибкие, не дающие тре-щин хитозановые пленки обладают избира-тельной проницаемостью, поэтому на поверх-ности плодов и овощей играют роль микроб-ного фильтра и/или регулируют состав газов уповерхности и в толще тканей, влияя тем са-мым на активность и тип дыхания, что в це-лом способствует продлению сроков хранениярастительного сырья. Помимо этого покры-тие из хитозана вызывает некоторые морфо-логические изменения в возбудителях порчитоматов и перца. Считается, что пленка хи-тозана, способствующая продлению срокахранения мороженого тунца, играет роль ба-рьера, регулирующего проникновение кисло-рода воздуха и испарение воды.

Хитозан, присутствуя в составе пищевыхпродуктов, положительно влияет на их биоло-гическую ценность. Кроме того, хитозан от-носится к диетическим волокнам, которые неусваиваются организмом человека, а в кис-лой среде желудка образует раствор высокойвязкости. Как компонент пищи или как лечеб-но-профилактический препарат хитозан про-являет свойства энтеросорбента, иммуномо-дулятора, антисклеротического и антиартроз-ного фактора, регулятора кислотности желу-дочного сока, ингибитора пепсина и др. [6].

2. Медицина – для лечения ран, ожогов,язв, производства хирургических нитей, искус-ственной кожи, лекарственных форм антискле-ротического, антикоагулянтного и антиартроз-


1 8 М.П. Лябин, П.С. Семенов. Совершенствование технологии получения хитозана

ного действия, диагностики и лечения различ-ного вида опухолей, язвы желудка; хитозанулучшает всасывание и эффективность труд-норастворимых лекарственных форм, способ-ствующих их пролонгированному действию;эффективен хитозан при лечении парадонтозаи кариеса зубов; в качестве средства борьбыс ожирением, связывания и выведения из орга-низма холестерина, профилактики и лечениясердечно-сосудистых заболеваний.

3. Косметика – использование в качествеувлажнителя, эмульгатора, антистатика исмягчающего средства для ухода за волоса-ми и кожей лица, при производстве шампуней,гелей, увлажняющих кремов [5], тональнойжидкой пудры, зубных паст, в роли стабили-затора аромата духов.

4. Сельское хозяйство – в качестве био-стимулятора, обеспечивающего повышениеурожайности овощей на 25–40 %, средстваборьбы с нематодами почв в закрытом грун-те, стеблевой и корневой гнилью, ржавчиной;специальных покрытий для фруктов, увели-чивающих их сроки хранения, кормовой до-бавки, повышающей резистентность живот-ных к инфекционным заболеваниям и обога-щающей корма.

5. Биотехнология и экология – очисткасточных вод от белковых, нефтяных, жировыхи других загрязнений, иммобилизация фермен-тов, сорбция тяжелых металлов и радионук-лидов, добавка при производстве стиральныхпорошков.

Помимо перечисленного, хитозан ис-пользуют при изготовлении ткани [2; 4] длянижнего белья и носков, а в фотографическихпроцессах, связанных с быстрым проявлени-ем изображения, применяют такие важные ха-рактеристики хитозана, как его пленкообра-зующие свойства, поведение в системах, со-держащих желатин и комплексы серебра,обеспечивающее отсутствие поперечной (в

слоях пленки) диффузии красителя, оптичес-кие характеристики полимера.

Весьма перспективно использование хи-тозана в бумажной промышленности: благо-даря большей прочности при водных обработ-ках ионных связей, образующихся при нане-сении хитозана на целлюлозное волокно приформировании бумаги, по сравнению с суще-ствующими в обычной бумаге водороднымисвязями, заметно возрастает прочность бу-мажного листа, особенно в мокром состоянии.При этом одновременно улучшаются и дру-гие важные свойства – сопротивление продав-ливанию, излому, стабильность изображения.

Такие неоспоримые достоинства хитоза-на, как биосовместимость с альгинатами, фос-фатами, в частности глицерофосфатом натрия,гиалоурановой кислотой, кальцием, физиоло-гическая активность при отсутствии токсич-ности, совершенная безопасность для чело-века и экологическая чистота (биодеструк-ция), низкая иммуногенность, способность кпленко-, волокно- и гелеобразованию, высокаясорбционная емкость, умеренная цитостати-ческая активность в отношении бактерий, гри-бов и атипичных клеток, позволяют широкоиспользовать его в биоинженерии для моде-лирования различный тканей, в том числе ихрящевой [9; 10; 14].

Как известно, основным источником припромышленном получении хитозана служитхитин, являющийся основой наружного скеле-та ракообразных, кутикулы насекомых, кле-точной стенки грибов и некоторых бактерий.

По химической структуре хитин являет-ся линейным аминополисахаридом, цепь ко-торого состоит из N-ацетил-2-амино-2-дезо-киси-D-гликопиранозных звеньев [3] (рис. 1).

Хитин как нерастворимый полимер неподдается выделению из панциря напрямую.Для его получения необходимо последователь-ное полное, комплексное удаление белковой и

OO

N HH O

C OC H 3

C H 2O H

O O

N HH O

C OC H 3

C H 2O H

Рис. 1. Структурная формула хитина



минеральной составляющих панциря. В насто-ящее время известно несколько способов, от-носящихся к химической группе извлеченияхитина из панцирьсодержащего сырья. В боль-шинстве этих способов операции депротеини-зации и деминерализации включают обработ-ку измельченных панцирей растворами соля-ной кислоты и едкого натра с последующейпромывкой водой. После этого проводитсяудаление с помощью отбеливающих реаген-тов красящих пигментов и промывка спиртоми эфиром липофильных веществ. К основнымнедостаткам большинства способов извлече-ния хитина относится необходимость исполь-зования специального, коррозионно-стойкогодорогостоящего (предпочтительно изготов-ленного из титана) оборудования, использова-ние больших объемов подготовленной водыдля отмывки сырья, применение в технологи-ческой схеме и последующая утилизация от-работанной едкой щелочи и органических ра-створителей. Помимо вышеперечисленного,традиционные методы очистки хитина уже наранних стадиях обработки сырья приводят кразрушению полимерных цепей, что ограни-чивает области его использования, особеннов качестве биоинженерного компонента.

Хорошо известно, что основным мас-штабным источником панцирьсодержащегосырья являются камчатские крабы. Прини-мая во внимание ценность, уникальность иширокую сферу практического использова-ния этого продукта, представляется акту-альным изыскание иных доступных сырье-вых ресурсов.

Учитывая вышесказанное, предложеноизвлекать хитозан из доступного сырья пан-цирей ракообразных рода Pandalus с исполь-зованием модифицированной нами схемы, при-меняемой ранее для плесневых грибов родаAspergillum.

Мягкие щадящие условия предложенно-го метода позволяют использовать реакторыдля неагрессивных и слабоагрессивных сред,а также исключают необходимость дополни-тельной очистки сточных вод. Вывод из цик-ла органических растворителей способству-ет повышению пожарной безопасности и сни-жению токсичности процесса.

Для лучшего сохранения нативной струк-туры биополимера строго соблюдалось под-держание оптимального температурного ре-жима на стадии депротеинирования не более70 °C, на стадии деминерализации не более20 °C. Как показал опыт, наиболее предпоч-тительно – 4 °C, но это ведет к значительно-му увеличению продолжительности процесса.

Так как практически нерастворимый хи-тин не нашел широкого применения в какой-либо отрасли промышленности, наибольшийпрактический интерес представляет его про-изводное – хитозан, хорошо растворимый в раз-бавленных органических кислотах, в частно-сти в водном растворе уксусной кислоты.

Хитозан (II) является -(1–4)-2-амино-2дезокси-D-гликополисахаридом, содержа-щим, как правило, 5–15 % ацетамидных групп,а также до 1 % групп, соединенных с амино-кислотами и пептидами [12]. Из хитина (I)данный биополимер получается в результатеудаления ацетильной группы из положения С2действием раствором щелочи путем полиме-раналогичных превращений (рис. 2).

Протекание процесса затруднительно,потому что трансрасположение в элементар-ном звене макромолекулы хитина заместите-лей (ацетамидной и гидроксильной групп) у С2и С3 обусловливает значительную гидролити-ческую устойчивость ацетамидных групп, втом числе и в условиях щелочного гидролиза.

Поэтому отщепление ацетамидных группудается, как правило, осуществить лишь в

HO

O

NH

CO

CH3

OCH2OH O

NH

HO

+NaOH

O

CH2OH

CO

CH3

-CH3COONa O

HO

CH2OHO

NH2

OCH2OH O

NH2

HO

(I) (II)Рис. 2. Схема реакции получения хитозана из хитина


2 0 М.П. Лябин, П.С. Семенов. Совершенствование технологии получения хитозана

сравнительно жестких условиях – при обра-ботке 40–49%-м водным раствором NaOHпри температуре 110–140 °C в течение 4–6 ча-сов [9; 11].

Реакция деацетилирования сопровожда-ется одновременным разрывом гликозидныхсвязей полимера, то есть уменьшением мо-лекулярной массы, изменением надмолекуляр-ной структуры, степенью кристалличности,снижением его вязкости и т. д. [1; 8; 12].

Для сохранения молекулярной массыполимера предпочтительно снижать темпера-туру обработки хитина [7].

Измельчение хитина облегчает доступдеацетилирующего агента внутрь структуры,благодаря чему достигается равномерноепротекание процесса деацетилирования и со-провождающей его деструкции [9]. При ис-пользовании слишком крупных частиц хитинаданный процесс проходит не в полной мере,поверхностные слои таких частиц деацетили-рованы в большей степени, чем внутренние.При последующем растворении в уксуснойкислоте эти поверхностные слои образуют ра-створ, а внутренние слои частиц, не полнос-тью деацетилированные, только набухают. Та-кой неоднородный хитозан может иметь ог-раниченное применение. В случае достаточ-но тонкого измельчения хитина все слои час-тиц деацетилируются в одинаковой степени,что приводит к получению более однородно-го продукта.

Также хорошо известно, что наличие кис-лорода в среде, в которой проводится реак-ция деацетилирования, увеличивает степеньдеструкции хитина, поэтому кислород из зоныреакции необходимо удалять.

При сушке готового продукта в услови-ях высоких температур (более 50 °C), а так-же в результате длительного хранения хито-зана возможно его уплотнение, потемнение иснижение растворимости, что отрицательносказывается на потребительских свойствах.

Результаты органолептических и физи-ко-химических испытаний (см. таблицу) сви-

детельствуют о соответствии качества по-лученного хитозана по определенным пара-метрам, нормам технических условий на хи-тозан пищевой, что показывает возможностьполучения продукта по предложенному намиспособу, перспективность его дальнейшейразработки.

Как мы полагаем, для получения хитоза-на со структурой, наиболее близкой к природ-ной, следует подобрать еще более мягкие ус-ловия проведения процесса получения хитина,возможно, в условиях ферментативного ката-лиза и обеспечивать перемешивание реакци-онной массы на стадии его деацетилирования.

Экспериментальная часть

Процесс депротеинирования проводилсяна предварительно отсортированном и промы-том сырье. В качестве депротеинирующегореагента применялся 10 %-й раствор натриябикарбоната в присутствии катионных и ани-онных ПАВ, обладающих депигментирующими обезжиривающим свойствами, что исклю-чает применение агрессивных и токсическихреагентов: раствора концентрированной щело-чи, перекисных соединений и органических ра-створителей. Максимально щадящее воздей-ствие на полимер предотвращает его дегра-дацию и исключает развитие вторичной пиг-ментации готового продукта.

Стадия деминерализации проводилась0,1 M раствором НСl. По окончании процессаполимер подвергался тщательной многократ-ной промывке дистиллированной водой на во-ронке Бюхнера, отжиму и сушке.

Процесс деацетилирования предваритель-но измельченного до размеров 1–2 2–3 мм хи-тина проводили в двугорлом реакторе, снабжен-ном термометром и подключенном к водоструй-ному насосу, в 40%-м растворе NaOH (при со-отношении к хитозану 1 : 20) при 100 °C в тече-ние 1–2 ч.

Готовый продукт многократно промыва-ли дистиллированной водой на воронке Бюхне-

Физико-химические свойства хитозанаНаименование показателя Ед. изм. Норма по ТУ Результаты испытаний

Массовая доля влаги % Не более 10,0 9,40 рН 1%-го раствора хитозана в 2%-й уксусной кислоте

Ед. рН Не более 7,5 3,85



ровский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7,№ 1. – С. 51–56.

4. Гальбрайх, Л. С. Модифицированные во-локнистые и пленочные материалы / Л. С. Гальбрайх// Химические волокна. – 2005. – № 5. – С. 21–27.

5. Исследование композиций целлюлоза-хи-тозан. Твердофазная модификация, реология, плен-ки / Г. А. Вихорева [и др.] // Химические волокна. –2000. – № 6. – С. 14–18.

6. Кильдеева, Н. Р. Получение материаловмедицинского назначения из растворов биосовме-стимых полимеров / Н. Р. Кильдеева, Л. С. Гальб-райх, Г. А. Вихорева // Химические волокна. –2005. – № 6. – С. 21–24.

7. Общая химическая технология / под ред.И. П. Мухленова. – М. : Высш. шк., 1984. – 255 с.

8. Пат. 2116314 Российская Федерация, МПК6 С08 В37/08. Способ получения хитозана / Г. И. Ка-сьянов, О. И. Квасенков, А. И. Николаев, Е. Е. Касья-нова. – №97104789/04 ; заяв. 26.03.97 ; опубл. 27.07.98// Изобретения. – 1998. – № 21. – 220 с.

9. Хитин и хитозан. Получение, свойства иприменение / под ред. К. Г. Скрябина, Г. А. Вихоре-вой, В. П. Варламова. – М. : Наука, 2002. – 368 с.

10. Chitosan as antimicrobial agent: applicationsand mode of action / E. Rabea, M. Badawy, C. Stevens,G. Smagghe [et al.] // Biomacromol. – 2003. – Vol. 4,№ l. – P. 14–57.

11. Chitosan Preparation from Persian Gulf ShrimpShells and Investigating the Effect of Time on the Degreeof Deacetylation / M. Shahabi Viarsaghl, M. Janmaleki,H. Reza Falahatpisheh1, J. Masoumi // Journal ofParamedical Sciences (JPS). – 2009. – Vol. 1. – P. 2–7.

12. Hoemann, C. Tissue engineering of cartilageusing an injectable and adhesive chitosan-based cell-delivery vehicle / C. Hoemann, J. Sun, A. Le’gare// Osteoarthritis Cartil. – 2005. – Vol. 13. – P. 318–329.

13. Kyung, W. K. Antimicrobial activity of nativechitosan, degraded chitosan-carboxymethylatedchitosan / W. K. Kyung, R. I. Thomas, L. Chan // Journalof Food Protection. – 2003. – № 66. – P. 1495–1498.

14. Ultrastructure of hybrid chitosan-glycerolphosphate blood clots by environmental scanning electronmicroscopy / M. Iliescu, C. D. Hoemann, M. S. Shive,A. Chenite // Microsc. Res. Technique. – 2008. – Vol. 71,№ 3. – P. 236–247.

ра до нейтрального значения рН. Промытыйхитозан представляет собой сильно гидрати-рованный, набухший продукт с содержаниемводы более 70 %. Для предотвращения орого-вения хитозан сушился в термошкафу при 50–55 °С до постоянного значения массы.

Состав полученного хитозана из панци-ря ракообразных рода Pandalus определялиметодом элементного анализа. В результатепроведения анализа содержание азота соста-вило 8,6 %, водорода – 6,46 %, углерода –43,8 %, кислорода – 40,9 %.

Для оценки уровня качества полученно-го хитозана были использованы показатели,заложенные в технические условия на пище-вой хитозан (ТУ 9289-067-00472124-03). Ор-ганолептические показатели:

Внешний вид: чешуйки размером 1–3 мм.Цвет: белый с кремовым оттенком.Вкус: свойственный данному продукту,

без постороннего привкуса.Запах: свойственный данному продукту,

без постороннего запаха.Измерение среды раствора продукта в

уксусной кислоте проводили на pH-метре мар-ки pH-150 МИ.

Массовую долю влаги определяли путемсушки продукта в вакууме при температуре100–105 °С до постоянной массы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Быкова, В. М. Сырьевые источники и спо-собы получения хитина и хитозана: Хитин, его стро-ение и свойства / В. М. Быкова, С. В. Немцев // Хи-тин и хитозан. Получение, свойства и применение. –М. : Наука, 2002. – C. 7–23.

2. Волокнистые, пленочные и пористые мате-риалы на основе хитозана / Е.Л. Илларионова [и др.]// Химические волокна. – 1995. – № 6. – С. 18–22.

3. Гальбрайх, Л. С. Хитин и хитозан: строе-ние, свойства, применение / Л. С. Гальбрайх // Со-

IMPROVED TECHNOLOGY OBTAINING CHITOSAN

M.P. Lyabin, P.S. Semenov

The main applications of chitosan. The possibility of obtaining biopolymer new “soft” way.

Key words: chitin, chitosan, medicine, biotechnology, bioengineering, production,deacetylation.