174

Физика живого, Т. 17, No2, 2009. С.174-178. © Вишневский В.Г., Костюк А.С., Темурьянц Н.А.

УДК612.884.002.56:594.38

УСТАНОВКА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ БОЛЕВОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ НАЗЕМНЫХ МОЛЛЮСКОВ

Вишневский В.Г., Костюк А.С., Темурьянц Н.А.

Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского

Поступила в редакцию 17.06.2009

Сконструирована установка, позволяющая определить ряд параметров болевой чувствительности моллюсков. Отличительной особенностью установки является горячая пластинка, изготовленная из стекла с напылением нитрида титана. Такая конструкция позволяет медленно изменять температуру пластинки и определять порог болевой реакции.

Ключевые слова: моллюски, болевая чувствительность, экспериментальная установка.

ВВЕДЕНИЕ

Одной из актуальных проблем экологической биофизики является изучение механизмов действия электромагнитных полей (ЭМП) различных параметров [1]. Показано, что в ответную реакцию организмов различной степени сложности на действие электромагнитных раздражителей вовлечена опиоидная система [2], активность которой адекватно характеризует состояние болевой чувствительности. Поэтому в последние годы реакция на действие ЭМП у различных животных оценивается по изменению латентного периода болевой реакции [3].

При изучении эффектов действия любого фактора всегда остро стоит вопрос о выборе объекта исследования. При этом следует иметь в виду, что эксперименты на млекопитающих не приветствуются научной общественностью по этическим причинам. Кроме того, такие эксперименты трудоемки, экономически труднодоступны. Поэтому предпочтение отдается экспериментам с использованием тест-систем, а также беспозвоночных животных, в частности, как морских моллюсков, так и наземных.

Болевая чувствительность у этих животных исследуется по реакции избегания – поднятие передней части ноги – в ответ на предъявление ноцицептивного (термического) стимула. В настоящее время изучена болевая чувствительность Cepaea nemoralis [2], Helix aspersa [4], слизняков Arion alter [5], морских моллюсков Aplysia californica [6] и т.д.

Используя эти модели, удалось получить подтверждения теории параметрического резонанса В.В. Леднева [7], значительно расширить

возможности изучения эффектов слабых воздействий. В этих экспериментах измерялся латентный период реакции. Однако более полная характеристика болевой чувствительности может быть дана при изучении ее болевого порога. Поэтому целью настоящего исследования явилась разработка метода регистрации болевого порога у моллюсков, используя наземных брюхоногих моллюсков Helix albescens, широко распространенных на территории Украины и используемых в биологических экспериментах.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДЫ

Сбор улиток производился в поле, вдали от предприятий, линий электропередач. Моллюсков содержали в аквариуме при температуре 22±2ºС, высокой влажности и избытке пищи (капуста, морковь). В эксперименте использовались половозрелые особи, одинаковые по массе и размерам. До измерения болевой чувствительности улитки не менее одной недели находились в активном состоянии.

Для обоснования метода регистрации параметров болевой чувствительности улиток было изучено их поведение при подаче термического стимула. В начале предъявления стимула (t = 22ºС) (рис. 1, А) для улиток характерно распластанное положение на поверхности пластинки, разведывательное поведение, пальпация щупальцами субстрата, изучение окружающей среды.

При постепенном увеличении температуры горячей пластинки и достижении ее определенного (минимального) значения, у моллюска развивается реакция избегания (порог болевой реакции) (рис. 1,

РЕАКТИВНІСТЬ ВІДНОСНОЇ ПОТУЖНОСТІ ЕЕГ ПІД ЧАС ДИВЕРЕГЕНТНОГО МИСЛЕННЯ У ПОЛЕЗЕЛЕЖНИХ І ПОЛЕНЕЗЕАЛЕЖНИХ ДОСЛІДЖУВАНИХ

175

Б) и заканчивающаяся подъемом всей подошвы при определенной температуре (температура избегания)

(рис. 1, В), сопровождающаяся интенсивным выделением желтоватой слизи.

Рис. 1. Поведенческая реакция брюхоногого моллюска Helix albescens при действии теплового стимула. По горизонтальной оси – значения времени в секундах, по вертикальной – температура пластинки в градусах Цельсия. Фото с экрана персонального компьютера (Print Screen SysRq). А – Распластывание улитки на стеклянной пластинке при t = 22ºС; Б – поднятие ноги над поверхностью стеклянной пластинки при минимальных значениях температуры (болевой порог); В – реакция полного избегания (подъем всей подошвы).

Рис. 2. Блок-схема установки для регистрации болевого порога виноградной улитки. 1 – стеклянная пластина; 2 – контактные площадки; 3 – источник питания; 4 – набор компактных ламп

накаливания; 5 – источник напряжения; 6 – бескорпусная (чиповая) камера; 7 – цифровой датчик; 8–микроконтроллер; 9 – жидкокристаллический экран.

При постепенном увеличении температуры горячей пластинки и достижении ее определенного (минимального) значения, у моллюска развивается реакция избегания (порог болевой реакции) (рис. 1, Б) и заканчивающаяся подъемом всей подошвы при определенной температуре (температура избегания) (рис. 1, В), сопровождающаяся интенсивным выделением желтоватой слизи.

Использование в эксперименте металлических горячих пластинок, нагреваемых горячей водой [8,9] и обладающих высокой теплопроводностью, не позволяет медленно изменять их температуру и, следовательно, фиксировать ее минимальное значение (порог), при котором начинается реакция избегания.

Учитывая биологию (поведенческие реакции) улитки, для изготовления пластинки нами был

выбран материал с высоким омическим сопротивлением, обеспечивающий медленный подъем температуры. Таким материалом явилось стекло марки К8 (1), имеющее ряд преимуществ перед металлом: 1) стекло полупрозрачное; поэтому при условии наблюдения за реагирующим животным снизу, могут быть количественно оценены изменения зоны соприкосновения его подошвы с поверхностью пластинки; 2) поверхность стекла, на котором располагается подопытное животное, является диэлектриком, поскольку полупрозрачный токо-проводящий слой (выделяющий омическое тепло) наносится на нижнюю сторону пластинки; 3) подбором толщины токопроводящего слоя можно варьировать его резистивные свойства. Все это делает возможным оптимальное управление скоростью нарастания

Вишневский В.Г., Костюк А.С., Темурьянц Н.А. 176

температуры, величиной напряжения на контактных площадках пластинки, благодаря чему можно точно регистрировать минимальную температуру, при которой начинается реакция избегания (болевой порог), и латентный период.

С нижней стороны стеклянной пластинки методом распыления в вакууме нанесено полупрозрачное напыление нитрид титана (TiN) с толщиной слоя 0,17 мкм. Важным свойством примененного покрытия является его устойчивость к механическому износу и условиям повышенной влажности.

Блок-схема экспериментальной установки представлена на рис. 2.

Напыленные участки контактируют со специ-альными площадками из нержавеющей стали (2), на которые подается напряжение от источника питания (3). Было установлено, что стеклянная пластинка может быть нагрета до необходимой температуры со скоростью 0,2 0/сек-0,4 0/сек при изменениях тока на контактах в пределах 0,35 – 0,55 А.

Изменение температуры пластинки фиксируется цифровым термометром DS18B20 (8-Pin μSOP) (7), закрепленным на внешней стороне стекла при помощи термопасты. Диапазон измеряемых им температур от -10ºС до +85ºС с точностью до ±0,5ºС. Термометр подключен к микроконтроллеру (8), который посредством цифровой связи обеспечивает индикацию значений температуры в градусах Цельсия на 16-ти сегментном жидкокристаллическом экране (9). Затем это значение температуры внутри видеокадра проецируется на монитор персонального компьютера.

Регистрирующим устройством движения улитки является бескорпускная (чиповая) камера (6) черно-белого изображения с разрешением 520 линий по вертикали, подключенная к линейному видеовходу ТV-тюнера персонального компьютера. Камера расположена в корпусе короба, изготовленного из стеклотекстолита, снизу от горячей пластинки. Благодаря такому располо-жению камеры поднятая над поверхностью пластины часть ноги улитки выглядит более светлой, чем часть, распластанная на стекле. Сбоку объект освещается двумя наборами ламп накаливания (6 В, 50 мА) (4), которые включены последовательно и помещены в корпус. Для повышения точности фиксации поведенческих актов (поднятия ноги) улитки подсветка регулируется источником напряжения (5) и осуществлена по принципу «темного поля». Вместе с видеозаписью движения улитки фиксируется изменения температуры во времени, благодаря чему возникает возможность определить порог болевой реакции, температуру и продолжи-тельность реакции полного избегания. Латентный

период и время избегания определяется при помощи покадрового разложения полученного с камеры видеоряда с использованием программного обеспечения VirtualDub 1.8.6 Rus.

Для определения параметров болевой чувствительности интактных моллюсков делили их на две равноценные группы по 20 особей в каждой. Животные первой группы находились в стандартных лабораторных условиях, продолжи-тельность светового дня составила 15:9 ч, с восходом солнца в 4:11 по местному времени. Животные второй группы были помещены в затемненные условия (цикл свет-темнота 1:23 ч). Регистрацию параметра болевой чувствительности проводили ежедневно в течение часа (в одно и то же время) на протяжении 30 дней у каждого животного.

Статистическую обработку и анализ материала проводили с помощью параметрических методов, применение которых позволила оценка полученных данных на закон нормального распределения. Вычисляли среднее значение исследуемых величин, ошибку средней. Для оценки достоверности наблюдаемых изменений использовали t-критерий Стьюдента.За достоверную принимали разность средних при р<0,05. Расчеты и графическое оформление полученных в работе данных проводились с использованием программы Microsoft Excel [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В проведенных экспериментах с

использованием сконструированной установки определены параметры болевой чувствительности улиток Helix albescens: болевой порог в среднем составил 30,5±1ºС, латентный период болевой реакции – 10,5±1 сек, температура полного избегания горячей поверхности – 56±4ºС, а продолжи-тельность реакции избегания – 10±3 сек.

В литературе существуют сведения о величине латентного периода на ноцицептивное раздражение у улиток других видов. Согласно Frank S. Pratо [8], у моллюсков Cepaea nemoralis латентный период реакции избегания при температуре 40,0 ± 0,2ºС составляет 4,8-6,5 сек, что несколько меньше значений, зарегистрированных нами. Это может быть связано как с различной конструкцией пластинки, так и с видовыми различиями используемых в эксперименте улиток, а также с тем, что в исследованиях F. Prato латентный период измеряется при t = 40ºС, тогда как в наших опытах латентный период измерялся при минимальном значении температуры, при которой развивается реакция избегания.

Нами также были получены данные об изменении параметров болевой чувствительности у интактных моллюсков в течение 30 суток. Было обнаружено, что при обитании моллюсков в

УСТАНОВКА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ БОЛЕВОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ НАЗЕМНЫХ МОЛЛЮСКОВ

177

условиях освещения различной продолжи-тельности, динамика показателей болевой чувствительности неодинакова. При преобладании световой фазы (15:9 ч) имеет место большая

амплитуда изменений этих показателей: болевой порог колебался в пределах от 29,71ºС до 31,38ºС, латентный период – от 8,67 сек до 11,2 сек (рис. 3).

контроль

8

9

10

11

12

13

фон 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

сутки эксперимента

латентны

й пери

од (сек

)

L:D 15:9 чL:D 1:23 ч

Рис. 3. Динамика латентного периода у интактных животных в условиях освещенности различной продолжительности.

При преобладании темновой фазы (цикл свет-

темнота 1:23 ч) заметных изменений показателей болевой чувствительности в течение 30 дней не выявлено: болевой порог колебался от 30,5ºС до 31,58ºС, латентный период - от 9,87 сек до 11,51 сек. В отдельные сроки эксперимента эти показатели у животных двух групп имеют статистически достоверные различия (16-20 сутки).

Таким образом, сконструированная установка позволяет определить параметры болевой чувствительности у моллюсков. Абсолютные значения и динамика показателей в течение месяца зависит от такого условия обитания улиток, как продолжительность световой фазы.

ВЫВОДЫ

1. Сконструирована установка, позволяющая определить параметры болевой чувствительности моллюсков: болевой порог, латентный период болевой реакции, температура и продолжительность реакции полного избегания ноцицептивного стимула.

2. Динамика показателей болевой чувствительности моллюсков Helix albescens зависят от продолжительности цикла свет-темнота.

Литература 1. Бинги В.Н., Савин А.В. Физические проблемы действия

слабых магнитных полей на биологические системы // УФН. - 2003. - Т.173, N 3. - С.265-300.

2. Kavaliers M, Ossenkopp K-P. Opioid systems and magnetic field effects in the land snail, Cepaea nemoralis // Biol Bull. – 1991. – Vol. 180. – Р. 301-309.

3. Prato F.S., Carson J.J.L., Ossenkopp K.-P. & Kavaliers M.

Possible mechanisms by which extremely low frequency magnetic fields affect opioid function // FASEB J. – 1995. – Vol. 9. – Р. 807-814.

4. Leung M.K. and Stefano G.B. Comparative neurobiology of opioids in invertebrates with special attention to senescent alterations // Prog. Neurobiol. – 1987. – Vol. 28. – Р. 131-159.

5. Dalton L.M. and Widdowson P.S. The involvement of opioid peptides in stress-induced analgesia in the slug Arion ater // Peptides. – 1989. – Vol. 10. – Р. 9-13.

6. Walters E.Т. and Erickson M.T. Directional control and the functional organization of defensive responses in Aplysia // J. Соmр. Physiol. A. – 1986. – Vol. 159. – Р. 339-351.

7. Prato F.S, Kavaliers M., Thomas A.W. Extremely low frequency magnetic fields can either increase or decrease analgesia in the land snail depending on field and light conditions // Bioelectromagnetics. – 2000. – Vol. 21. – Р. 287–301.

8. Prato F. S., Kavaliers М., Carson J.J.L. Behavioural evidence that magnetic field effects in the land snail, Cepaea nemoralis, might not depend on magnetite or induced electric currents // Bioelectromagnetics. – 1996a. – Vol. 17 – P.123-130.

9. Achaval М., Penha M.A.P., Swarowsky А., Rigon Р., Xavier L.L., Viola G.G., Zancan D.M. The terrestrial Gastropoda Megalobulimus abbreviatus as a useful model for nociceptive experiments. Effects of morphine and naloxone on thermal avoidance behavior // Brazilian Journal Medical and Biological Research. – January 2005. – Vol. 38, N 1. – P.73-80.

10. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Exсel. – К.: Модмон, 2000. – 319 с.

Сутки

Вишневский В.Г., Костюк А.С., Темурьянц Н.А. 178

УСТАНОВКА ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ БОЛЬОВОЇ ЧУТЛИВОСТІ НАЗЕМНИХ МОЛЮСКІВ

Вишневський В.Г., Костюк О.С., Темурьянц Н.А.

Сконструйована установка, що дозволяє визначити ряд параметрів больової чутливості молюсків. Відмітною особливістю установки є гаряча пластинка, виготовлена зі скла з напиленням нітрид титану. Така конструкція дозволяє повільно змінювати температуру пластинки та визначати поріг больової реакції.

Ключові слова: моллюски, больова чутливість, експериментальна установка.

FACILITY FOR STUDY PAIN SENSITIVITY OF LAND SNAILS

Vishnevskiy V.G., Kostyuk A.S., Temuryants N.A.

A devise has been constructed that allows for testing of several parameters of pain sensitivity in molluscs. A special feature of this devise is a hot plate made of glass covered with a thin layer of titanium nitride. This feature allows for slow changes in the plate temperature and determines the threshold of pain reaction.

Key words: snails, pain sensitivity, experimental devise.