ห น า | 1
บทท 1
บทน า ขนตอนในการคดสรรยาโดยทวไปเรมจากการศกษาเบองตนในหลอดทดลอง (in vitro) ทงน
เนองจากสามารถทดสอบไดในจ านวนมากในเวลาเดยวกน และสารทมฤทธดในหลอดทดลองจะถกน ามา
ศกษาตอในสตวทดลอง (in vivo) ซงปญหาทพบคอสารทแสดงฤทธดในหลอดทดลองจ านวนมากไมมฤทธ
เมอน ามาศกษาในสตวทดลอง แสดงใหเหนวาผลการศกษาในหลอดทดลองบางครงไมสอดคลองกบการ
ทดลองในสตวทดลอง (รปท 1) แตอยางไรกตามเราไมสามารถน าสารทงหมดมาทดสอบกบสตวทดลองได
โดยไมตองมผลการศกษาเบองตนจากหลอดทดลอง ทงน เนองจากตองใชสตวทดลองเปนจ านวนมากและม
คาใชจายสง รวมถงมปญหาทางดานจรรยาบรรณสตวทดลอง เพอลดปญหาทกลาวขางตนจงเรมมผสนใจน า
สตวไมมกระดกสนหลงมาท าการศกษาเบองตนกอนทจะน ามาทดสอบกบสตวทดลอง หรอคาดหวงวาจะ
น ามาศกษาแทนการทดลองในหลอดทดลอง โดยสตวไมมกระดกสนหลงทมรายงานการน ามาศกษาแลว
เชน แมลงหว (Drosophila melanogaste) หรอนมาโทด (Caenorhabditis elegans) เปนตน (Tan และคณะ,
1999) ซงในปจจบน มการศกษาและน ามาใชเปนตนแบบในการทดลองเพมมากขน
รปท 1 ภาพแสดงการคดสรรยาโดยทวไป โดยเรมจากสารปรมาณมากน ามาทดสอบฤทธในหลอดทดลองและจง
น าไปทดสอบประสทธผลของสารในสตวทดลอง
ห น า | 2
การน าสตวไมมกระดกสนหลงมาเปนตนแบบในการศกษาฤทธ พบวาสวนใหญเปน การศกษาฤทธ
ตานการตดเชอจลชพ แตพบวาการน าแมลงหว Drosophila melanogaster และนมาโทด Caenorhabditis
elegans มาทดสอบฤทธตานเชอจลชพยงมขอจ ากดเนองจากสตวทง 2 ชนดมขนาดทเลกมาก จ าเปนตองท า
ภายใตกลองจลทรรศน รวมถงปรมาณยาทใหในการทดสอบไมแนนอน เนองจากไมสามารถฉดเขาไปท
สตวไดโดยตรง นกวจยจงเรมหนมาศกษาสตวไมมกระดกสนหลงชนดอนๆ ทมขนาดใหญขน คอ หนอน
ไหม ซงมขอไดเปรยบในเรองของขนาดทใหญกวา และสามารถฉดยาปรมาณทแมนย าเขาสตวหนอนไหม
ได รวมถงสามารถใหได 2 ทางคอ ฉดใหทางเลอดเปด ( Intrahemolymph) และล าไสตอนกลาง
(Intramidgut)
ห น า | 3
บทท 2
ทบทวนวรรณกรรม
หนอนไหม หรอ Bombyx mori เปนตวออนของผเสอชนดหนงซงอยในล าดบ Lepidoptera ในวงศ
Bombycidae มวงจรชวตคอนขางส นเพยง 45-50 วน โดยวงจรชวตเรมจากเมอผเสอไหมผสมพนธและ
วางไข โดยผเสอหนงตวสามารถวางไขไดราว 400-600 ฟอง ไขจะใชเวลาฟกประมาณ 10 วนซงไขจะมส
เขมขนจนเปนสด า และฟกออกเปนตวหนอนไหม ซงมทงหมด 5 ระยะ ในชวงทเปนหนอนไหม จะกนใบ
หมอนเปนปรมาณมากและตลอดเวลา แตเมอเขาสตวเตมวยในระยะท 5 เปนประมาณ 7 วนจงจะเรมหยดกน
อาหาร มการพนใย และเปลยนเปนดกแด โดยฟกตวอยประมาณ 10 วนจงเปลยนเปนผเสอไหม และท าการ
ผสมพนธวางไขตอไป ดงแสดงในรปท 2A
ลกษณะโดยทวไปของหนอนไหมประกอบดวยสวนหว (head) อก (thorax) และทอง (abdomen)
ล าไสของหนอนไหมประกอบไปดวยล าไสตอนตน ตอนกลาง และตอนปลาย (รปท 2B) ล าไสตอนกลาง
(Midgut) เปนสวนทหนาทในการดดซมสารอาหาร สวนล าไสตอนปลาย (hind-gut) เปนสวนทใชในการดด
น าจากกากอาหาร ท าใหกากอาหารแหง ส าหรบการขบถายหนอนไหมม Malpighian tube เปนอวยวะท า
หนาทเกยวกบการขบถายของเหลว
หนอนไหมเปนสตวเลอดเปดดงนนหากฉดสารเขาใหทางเลอด hemolymph จะท าใหเกดการซม
ผานโดยตรงเขาสเซลลและอวยวะตางๆไดโดยไมตองอาศยการล าเลยงผานทางเสนเลอดฝอยเหมอนใน
มนษย ดงนนเมอฉดสารทตองการทดสอบเขาล าไส และเกดการดดซมจะเกดการกระจายสารอยางรวดเรว
ไปทวตวหนอนไหม
ห น า | 4
A.
B.
รปท 2 วงจรชวตของหนอนไหม(A) และสรระวทยาของหนอนไหม (B) (ดดแปลงจาก http://www.suekayton.com/Silkworms/images/Manyee/ Silkworm%20cycle%2034%20silkworm%20cycle.gif/ เมอวนท 10 มกราคม 2554)
ห น า | 5
การน าหนอนไหมมาทดสอบฤทธทางชวภาพ
1. โมเดลทดสอบฤทธตานการตดเชอจลชพ
1. โมเดลในการทดสอบฤทธตานเชอแบคทเรย (Bacterial infection model)
การน าสตวหรอสงมชวตอนๆทไมใชสตวเลยงลกดวยนมมาใชในการทดลอง สามารถหลกเลยง
หรอลดปญหาเกยวกบจรรยาบรรณสตวทดลองได มการศกษากอนหนาถงความสามารถในการตดเชอ
แบคทเรยของนมาโทด Caenorhabditis elegans, พช Arabidopsis thaliana และ ผเสอกนไขผง Galleria
mellonella ตอเชอ Pseudomonas aeruginosa และ อะมบา Dictyostelium discoideum สามารถท าใหตดเชอ
Legionella pneumophila , นมาโทด Caenorhabditis elegans และยสต สามารถตดเชอ Salmonella
typhimurium ได
จากการศกษาของ Kaito และคณะ (2002) พบวาเชอแบคทเรยทสามารถกอโรคในมนษย เชน
S. aureus, P. aeruginosa สามารถท าใหหนอนไหมระยะท 5 (สายพนธ Hu.Yo-Tukuba.Ne) ตดเชอและตาย
ไดภายใน 2 วนหลงการไดรบการฉดเชอเขาทเลอด (Intrahemolymph) (รปท 3) ในขณะทกลมทไดรบ E.
coli สายพนธทไมกอโรคในมนษยและกลมควบคมทไดรบเพยงน าเกลอ หนอนไหมสามารถเจรญเตบโตตอ
กลายเปนดกแดไดดงแสดงในรปท 4
นอกจากนทางกลมนกวจยไดท าการศกษาถงการตดเชอและการเจรญเตบโตของเชอ S. aureus ใน
หนอนไหม โดยการน าเนอเยอสวนนอกของล าไสตอนกลาง (Outer midgut) มาท าการยอมตดสเรองแสง
ดวยวธ Immunostaining assay หลงจากไดรบเชอ S. aureus ปรมาณ 3x108 cells/larvae ไปแลว 40 ชวโมง
ผลการยอมสแสดงใหเหนวาในกลมหนอนไหมทไดรบการตดเชอจะสามารถยอมตดสของเชอ S. aureus ท
เนอเยอได ในขณะทกลมควบคม(ไดรบน าเกลอ) จะไมพบการเรองแสง (รปท 5) และเมอศกษานบปรมาณ
เชอในสวนเลอดหรอสวนเนอเยอของหนอนไหมทเวลา 10, 20, 30 และ 40 ชวโมงหลงการฉดเชอ S. aureus
พบวาปรมาณของเชอแบคทเรยมปรมาณเพมขนทงในสวนของเลอดและเนอเยอ พบมปรมาณเชอมากกวา
1x108 cells/larvae ( ปรมาณเชอในหนอนไหมหลงจากฉดเชอมประมาณ 5x105 cells/larvae ) (รปท 6)
จากผลการทดลองดงกลาว ทางนกวจยยงไดทดลองฉดเชอ S. aureus ทผานการฆาดวย autoclave
แลวพบวาหนอนไหมไมเกดการตดเชอ และสามารถมชวตเจรญเตบโตตอไปได รวมถงไดทดลองให E. coli
สายพนธทกอเชอในมนษยได (O-157) พบวากสามารถท าใหหนอนไหมตายได แสดงใหเหนวาหนอนไหม
ห น า | 6
สามารถตดเชอแบคทเรยไดเชนเดยวกบในมนษย และไมใชทกสายพนธทสามารถฆาหนอนไหมได จากรป
ท 6 จะสงเกตเหนไดวาสายพนธทตางกน กใหผลการตายของหนอนไหมทตางกน โดยสายพนธ Smith ของ
S. aureus จะเหนถงผลทแตกตางจากสายพนธอนอยางเดนชด ซงเชอวาเนองจากมการแสดงออกของการ
สรางและปลอยสารพษออกมาทตางกน รวมถงปรมาณเชอทใหตางกนกมผลตอ % การรอดชวตของหนอน
ไหมเชนกน โดยถาใหเชอมากหนอนไหมกตายมากกวาเชอปรมาณทนอยกวา
รปท 3 ภาพหนอนไหมในกลมควบคม, ไดรบเชอ และเมอไดรบทงเชอและยารกษา
รปท 4 กราฟแสดง % การรอดชวตของหนอนไหมวย 5 (N=10) ภายในระยะเวลา 5 วน หลงจาก
ไดรบเชอ ปรมาณ 3x108 cells/larvae S. aureus (RN4220, Smith, MSSA, MRSA)
, P. aeruginosa (S24), E. coli (K12-3,W3110,NIHJ)
ห น า | 7
รปท 5 ภาพแสดงการตดส Immunostaining ของเนอเยอสวนนอกของล าไสตอนกลางของหนอน
ไหมวย 5 ทไดรบน าเกลอ (A) และไดรบเชอ S. aureus (B)
รปท 6 กราฟแสดงปรมาณเชอ S. aureus ในเลอด hemolymph (A.) และเนอเยอ (B.) ของหนอน
ไหมวย 5 ทเวลาตางๆ หลงจากไดรบเชอ S. aureus (MSSA) 3x107 cells/larvae
ห น า | 8
รปท 7 แสดงกราฟ %การรอดชวตของหนอนไหมภายใน 4 วนหลง
การไดรบเชอ MSSA (A) และ MRSA (B)
Kaito ไดศกษาทดลองใหยาตานเชอแบคทเรยในมนษย เชน Ampicillin, Oxacillin, Vancomycin
พบวาสามารถใหฤทธการรกษา และท าใหหนอนไหมรอดชวตไดเชนเดยวกน โดยยาทง 3 ชนดสามารถออก
ฤทธรกษาท าใหหนอนไหมทตดเชอ MSSA มชวตรอดได 90% ภายใน 4 วน ดวยยาขนาด 200 ไมโครกรม
ในขณะทกลมหนอนไหมทตดเชอ MRSA มเฉพาะยา Vancomycin ทสามารถใหผลการรกษาท าใหหนอน
ไหมรอดชวตได 80% ของทงหมด (รปท 6)
นอกจากน Kaito และคณะยงไดท าการทดลองใหน ายาฆาเชอ Disinfection กบหนอนไหม ผลการ
ทดลองพบวาไมสามารถหาคา IC50 ไดเนองจากคา LD50 ของสารต ากวาคา MIC จากการทดสอบดวยวธ
Agar diffusion จงท าใหหนอนไหมตาย ซงผลดงกลาวแสดงถงขอแตกตางของการทดสอบดวยหนอนไหม
และในหลอดทดลอง เนองจากน ายาฆาเชอ Disinfection ไมสามารถใหฤทธการรกษาเชอ S. aureus ทตดใน
หนอนไหมได ดงแสดงในตารางท1
Hamamoto และคณะ (2004) ไดท าการศกษาการตดเชอแบคทเรย S. aureus และ S. maltophilia
ของหนอนไหม และทดสอบในยารกษาทหลากหลายมากขน ผลการทดสอบเปนไปในทางเดยวกน (ตาราง
ท 2) ยาสามารถใหฤทธการรกษาในหนอนไหมทตดเชอไดเชนกน (รปท 8)
ห น า | 9
Hamamoto และคณะไดใหขอสงเกตวาคา ED50 จากการทดลองในหนอนไหมและ คา MIC จาก
หลอดทดลอง เมอน ามาเปนสดสวนกนคอ ED50/MIC พบวาในผลการทดลองยาทกตวทน ามาทดสอบให
คาทนอยกวา 10 และในยาบางชนดเมอน าไปเปรยบเทยบกบคา ED50/MIC ในหนทดลอง พบวามคาท
คอนขางใกลเคยงกน แสดงใหเหนถงความสอดคลองของผลทไดจากหนอนไหม และหนทดลอง (ตารางท
2)
การทดลองของ Barman และคณะ (2008) ในการทดสอบฤทธยากลม Oxazolidinones รวมถงสาร
ใหมทน ามาทดสอบฤทธ (RBx) ถงการออกฤทธตานเชอ S. aureus (MRSA 562) โดยทดสอบในหนอนไหม
สายพนธ CSR-2 x CSR-4 ผลการทดลองพบวาในการทดลองดวยหนอนไหมและหนทดลอง ใหฤทธการ
รกษาทมความคลายคลงกนเชนกน แตอยางไรกตามเมอค านวณคา ED50/MIC จากผลการทดลองนนไมได
ใหคาทนอยกวา 10 เสมอไปเหมอนในการทดลองของ Hamamoto และคณะ ซงทาง Barman ไดให
ความเหนวานาจะเกดจากการเลยงด สภาพแวดลอมและสายพนธของหนอนไหมทแตกตางกน ( ตารางท 3 )
รปท 8 กราฟความสมพนธระหวาง %การรอดชวตและความเขมขนของยาตานเชอแบคทเรยท
ใหกบหนอนไหมวย 5 ทตดเชอ S. aureus (A) และ S. maltophilia (B)
ห น า | 10
ตารางท 1 ตารางแสดงผลคา LD50, MIC และ IC50 ของยาปฏชวนะและน ายาฆาเชอ จากการทดสอบฤทธ
ตานเชอ MSSA, MRSA ในหลอดทดลอง และในหนอนไหม
ตารางท 2 คา ED50 ของยาชนดตางๆทใหกบหนอนไหมทตดเชอ S. aureus และ S. maltophilia
ตารางท 3 แสดงคา ED50 ในหนอนไหมและหนทดลอง, คา MIC จากการทดลองดวยวธ Agar diffusion
ห น า | 11
2. โมเดลในการทดสอบฤทธตานเชอรา
Hamamoto และคณะ (2004) นอกจากท าการศกษาในแบคทเรยแลว กไดลองน าเชอรา C. albican
และ C. tropicalis ซงสามารถกอโรคในมนษยมาฉดและศกษาในหนอนไหมเชนกน ผลการทดลองพบวา
เชอรา C. albican และ C. tropicalis ขนาด 1x106 และ 4x106 cells ใน Sabouraud medium 0.05ml ตามล าดบ
สามารถท าใหหนอนตดเชอและตายภายใน 2 วน แตเมอไดรบยา Amphotericin B, Fluconazole พบวา
สามารถใหฤทธการรกษาในหนอนไหมไดเชนกน โดย %การรอดชวตของหนอนไหมเพมขนตามความ
เขมขนของยาทมากขน (dose-dependent) ดงแสดงในรปท 9
รปท 9 กราฟความสมพนธระหวาง % การรอดชวตของหนอนไหมกบความเขมขนของยา
Amphotericin B และ Fluconazole ตอเชอ C. tropicalis (A) และ C.albican (B)
ห น า | 12
3. โมเดลในการทดสอบฤทธตานเชอไวรส
Orihara และคณะ (2008) ไดท าการศกษาฤทธของยาตานเชอไวรสในมนษย ไดแก Ganciclovir,
foscarnet, vidarabine และ ribavirin พบวาสามารถใหฤทธรกษาไดในหนอนไหมทไดรบการตดเชอไวรส
Baculovirus (รปท 10,11) ซงยาฆาไวรสทน ามาทดสอบสามารถยบย งการเจรญเตมโตของเชอไวรสใน
หนอนไหมเมอทดสอบใน cell cultures (รปท 12 ) ซงคา ED50 จากการทดสอบในหนอนไหม และคา IC50
จากการทดสอบดวย cell culture พบวาเมอน ามาเทยบอตราสวน (ED50/IC50) จะไดคาทต ากวา 5 ในทกยาท
น ามาทดสอบ Orihara และคณะจงเชอวา ยาหรอสารทน ามาทดสอบในหนอนไหม หากใหคา ED50/IC50ท
นอยกวา 5 จะเปนสารทเหมาะสมและสามารถน าไปศกษาตอในสตวทดลองจ าพวกเลยงลกดวยนมตอไปได
ดงนนทาง Orihara จงชใหเหนวา Silkworm-baculovirus infection model นาจะเปนโมเดลทเปน
ประโยชนใชในการประเมนฤทธตานเชอไวรสกลม DNA virus อยางไรกตามการประเมนฤทธตาน RNA
virus ซงเกยวของกบการกออาการตางๆในมนษย เชน ไขหวดใหญ เปนตน ยงคงตองท าการศกษาเพมเตม
โดยคาดวาจะน า cytoplasmmic polyhedron virus ซงอยในวงศ Reoviridae และม RNA dependent RNA
polymerase มาใชเปน virus ในการศกษา
รปท 10 ภาพแสดงหนอนไหมเมอไดรบการฉดดวยน าเกลอ(กลมควบคม)[ซาย], เมอไดรบ
เชอไวรส[กลาง] และเมอไดรบไวรบรวมกบยาฆาเชอไวรส Ganciclovir [ขวา]
ห น า | 13
รปท 11 แสดงกราฟความสมพนธระหวาง %การรอดชวตของหนอนไหม
และปรมาณความเขมขนของยาฆาเชอไวรสชนดตางๆ
รปท 12 กราฟความสมพนธระหวางปรมาณเชอไวรส
ในเลอด hemolymph ในกลมควบคมและยาแตละชนด
ตารางท 4 แสดงคา ED50 , IC50 และ ED50/IC50 ratio ของยาตานไวรสใชในการทดสอบฤทธตาน
ไวรสในหนอนไหมและ cell culture
ห น า | 14
2. โมเดลทางเภสชจลนศาสตร
1. การดดซมของยาตานจลชพ
การทดลองในหลอดทดลองหาฤทธตานเชอจลชพนนบางครงเมอน ามาทดสอบตอในสตวทดลอง
พบวาไมใหฤทธในการรกษา ซงปญหาสวนหนงมาจากเหตผลเนองจากมเภสชจลนศาสตรทไมเหมาะสม
เชน สารดงกลาวอาจดดซมไดไมด, มการขบออกทไวมาก หรอเกดการเปลยนแปลงโดยเอนไซมในตบ เปน
ตน Hamamoto และคณะ(2004) ไดทดลองศกษาดการดดซมของยาตานเชอแบคทเรย Tetracycline,
Chloramphenicol, Kanamycin และ Vancomycinในหนอนไหม โดยฉดเขาหนอนไหมเขาสเลอด
hemolymph (Intrahemolymph) หรอฉดเขาทล าไสตอนกลาง (Intramidgut) เพอเปรยบเสมอนการใหโดย
การรบประทาน รวมถงใหทางปาก (per oral) โดยการผสมกบอาหารและใหหนอนไหมกนตลอดทงหนงคน
ซงวธการฉดเขาเลอดหรอล าไสนนไดรบการทดสอบโดยฉดสเขาทเลอด hemolymph หรอเขาทางล าไส
ตอนกลางของหนอนไหม จะพบวาหนอนไหมทถกฉดสเขาเลอดจะเหนการกระจายของสทผวของหนอน
ไหม ในขณะทหนอนไหมทไดรบการฉดสเขาล าไสจะไมเหนสทบรเวณผวหนงของหนอนไหม ดงแสดงใน
รปท 12
รปท 13 แสดงการฉดสเขาเลอดและล าไสของหนอนไหม
ห น า | 15
ผลการทดสอบฤทธการรกษาหนอนไหมทไดรบเชอ S. aureus และใหยาปฏชวนะโดยบรหารยาใน
รปแบบทแตกตางกน 3 รปแบบ (Intrahemolymph, intramidgut, per oral) พบวาการใหยาแบบฉดเขาเลอด
ยาทกชนดสามารถออกฤทธและใหผลการรกษาในหนอนไหมได ในขณะทการใหโดยการฉดเขาล าไส
ตอนกลางหรอผสมใหกบอาหารเลยงหนอนไหมและปอนใหกน ม เฉพาะ Tetracycline และ
Chloramphenicol เทานนทสามารถออกฤทธการรกษาได แต Kanamycin และ Vancomycin ไมสามารถให
ฤทธการรกษาได (รปท 14) จากการศกษาทง in-vivo และ in-vitro โดยการแยกเอาล าไสหนอนมาบรรจยา
และดการซมผานออกมาภายนอกล าไส (รปท 15) ท าใหพบวาเปนผลเนองมาจากการทยา Kanamycin และ
Vancomycin ไมสามารถดดซมผานผนงล าไสของหนอนไหมเขาสเลอด hemolymph ได (รปท 16) ซง
ชใหเหนถงความคลายคลงกนของความสามารถในการดดซมจากล าไสเขาสเลอดของหนอนไหมกบมนษย
เนองจากในมนษยเอง Kanamycin และ vancomycin กไมสามารถใหฤทธการรกษาเมอใหโดยวธ
รบประทานซงเปนผลเนองมาจากขนาดโมเลกลทใหญและมความเปนขวมาก
ในขณะทยา Cefcapene pivoxil ซงเปนยากลม 3rd gen Cephem ทโครงสรางมการน า
Pivaloyloxymethyl ester moiety มาเตมในโครงสรางท าใหสามารถใหโดยการรบประทานได เทยบกบ
Cefcapene sodium ซงมปญหาดานการดดซมในมนษย ผลการทดสอบกบหนอนไหมกเปนไปในทาง
เดยวกนคอ ยา Cefcapene pivoxil สามารถออกฤทธรกษาไดดทงการใหแบบฉดเขาเลอด hemolymph และ
เขาทางล าไส (Intramidgut) จะสงเกตไดวา Cefcapene sodium ใหคา ED50 ทใกลเคยงกบ Cefcapene pivoxil
ในการบรหารแบบ Intrahemolymph แตมคา ED50 ทสงมากเมอใหทางการฉดเขาล าไสตอนกลาง
(Intramidgut) ดงแสดงในตารางท 5
ในป 2005 Hamamoto และคณะ (2005) ไดทดสอบผลของขนาด( Molecular mass) และความชอบ
ไขมน (Hydrophobicity) ของสารตอการซมผานล าไสของหนอนไหม ผลการทดสอบพบวาขนาดโมเลกลท
มากกวา 400 Da จะผานล าไสไดนอย รวมถงสารทมความชอบไขมน (Hydrophobicity) มากขนกจะสามารถ
ผานล าไสไดลดลงเชนกน (รปท 18) อยางไรกตามบางสารถงแมจะมโมเลกลทมากกวา 400 Da กสามารถ
ผานและดดซมได หรอสารทมขนาดนอยกวา 400 Da บางสารกไมสามารถผานได ซงกตองพจารณาถง
ปจจยอนๆอกเชนกน เชน เรองของรปทรง หรอแรงทกระท าตอกนระหวางสาร หรอตวน าสง เชน P-
glycoprotein เปนตน ซงกเปนเรองทตองท าการศกษาเพมเตมตอไป
ห น า | 16
รปท 14 กราฟแสดงความสมพนธระหวาง % การรอดชวตกบความเขมขน
ของยาชนดตางๆ เมอฉดเขาล าไสโดยตรง (i.m.) และใหทางปาก (p.o.)
รปท 15 แสดงภาพการน าล าไสของหนอนไหมมาใชในการศกษา in-vitro transport assay
ห น า | 17
รปท16 กราฟความสมพนธระหวางความเขมขนของยา Chloramphenicol และ
Vancomycin ทผานล าไสออกมาไดกบความเขมขนของยาขนาดตางๆทใชในการทดลองดการผาน
ของสารกบล าไสของหนอนใน in-vitro transport assay
รปท 17 กราฟความสมพนธระหวางอตราการผานของยา Cefcapene pivoxil(CFPN-PI), Cefcapene
sodium(CFPN-Na) ตอเวลา(a) และ ความเขมขนของยา ตอเวลา (b)
ห น า | 18
รปท 18 แสดงกราฟความสมพนธระหวางอตราการผานของสาร
กบขนาดของสาร(a) และ logPOW/M.W. ของสาร (b)
ตารางท 5 แสดงคา ED50, IC50 จากการทดลองยา Cefcapene pivoxyl และ Cefcapene sodium ในหนอนไหม
ทตดเชอ S. aureus และคา MIC จากการทดลองใน agar plate
ห น า | 19
2. การศกษาถงกระบวนการเมตาบอลซมของหนอนไหมตอสารแปลกปลอม
เอนไซมไซโตโครม P450 เปนเอนไซมทเกยวของกบกระบวนการเปลยนแปลงสารในรางกายของ
มนษย ส าหรบในหนอนไหมนนเอนไซมดงกลาวจะท าหนาทเกยวของกบการสรางสารหรอฮอรโมนภายใน
รางกายของหนอนไหม (Niwa และคณะ, 2004) Hamamoto และคณะ (2009) จงไดทดลองศกษาเปนครง
แรกวา หากมการใหสารแปลกปลอมเขาไปในหนอนไหม หนอนไหมจะมกระบวนการจดการสง
แปลกปลอมดงกลาวเชนไร โดยผวจยไดทดลองใหสาร 4-methyl umbelliferone ฉดเขาไปในรางกายของ
หนอนไหม และดดเลอด hemolymph มาวดทเวลาตางๆเพอวดปรมาณและหาคาครงชวต และพสจน
เอกลกษณของสารเกดขนจากการเปลยนแปลงในรางกายหนอนไหม
4-Methyl umbelliferone (7-hydroxycoumarin) เปนสารทเรองแสง ในรางกายมนษยจะถก
เปลยนแปลงโดย Glucuronide conjugation ไดเปนสารทไมเรองแสง จากการทดลองในหนอนไหมพบวาท
เวลามากขน มปรมาณของสาร 4-Methyl umbelliferone (7-hydroxycoumarin )ลดลง โดยมคาครงชวต
ประมาณ 7 นาท (รปท18) เมอเทยบกบการทดสอบในหนทดลอง ซงด าเนนการทดลองมาพรอมกน พบวา
ในหนมคาครงชวตประมาณ 9 นาท คาดงกลาวแสดงใหเหนถงความคลายคลงกนตออตราการเปลยนแปลง
ของสารดงกลาวในหนอนไหมและในหนทดลอง
จากการพสจนเอกลกษณสารทเกดจากการเปลยนแปลงของ4-Methyl umbelliferone ในหนอนไหม
หลงฉดสารดงกลาวเขาไป 20 นาท เมอวดดวย HPLC พบพคของ metabolite ขนท retention time เทากบ 13
นาท ซงเปนสารทถก conjugate ดวย Glucose ไมใช Glucuronide เหมอนในมนษย ( รปท 20 )และเมอให β
-glucosidase แลวพบการกลบมาเรองแสงเหมอนสารตงตน ในขณะทเมอให β-glucuronidase จะไมเกดการ
กลบมาเรองแสงอก จงเปนตวชวยยนยนวาสาร 4-Methyl umbelliferone ในหนอนไหมจะถกเปลยนแปลง
เปน Glucose-conjugate form ซงจากการทดลองแยกสวนอวยวะตางๆของหนอนไหม ไดแก fatbody, silk
gland, gut และสวนอนๆ มาท าการศกษาแยกสวนวากระบวนการ Conjugation ดงกลาวเกดมากทสวนใด ผล
การทดลองพบวาสวนใหญกระบวนการดงกลาวเกดขนทสวนไขมน (Fat body) ของหนอนไหม (รปท 21)
และเกดในสวนของ Microsomal fraction (ตารางท 6) ซงมความคลายคลงกบในมนษยทกระบวนการเมตา
บอลซมเกดท ไมโครโซมในตบ ดงนนเราอาจเปรยบไดวาสวนไขมน(Fat body) ในหนอนไหมมความ
คลายคลงเปรยบเทยบไดกบตบของมนษย
นอกจากนยงไดมการทดลองน าสาร 7-ethoxycoumarin ซงเปน General substrate ของเอนไซมไซ
โตโครม P450 (CYP450) ในมนษย มาทดสอบในหนอนไหมพบวาสารดงกลาวสามารถเปลยนแปลงถก O-
ห น า | 20
deethylation ไปเปน 7-hydroxycoumarin และ Umbelliferyl-β-D-glucopyranoside ซงเชอวาการ
เปลยนแปลงดงกลาวเกด 2 ขนตอนคอ กระบวนการ deethylation โดยเอนไซม CYP450 และกระบวนการ
คอนจเกชนโดย กลโคส ซงจะเหนไดวากลไกการเปลยนแปลงสารแปลกปลอมทเขาสรางกายของหนอน
ไหมนนมความคลายคลงกบในมนษย จงเชอวาหากมการศกษาเพมเตมกบสารทมากขน และไดขอมลท
นาเชอถอมากพอ จะสามารถน าหนอนไหมมาใชศกษาเกยวกบกระบวนการเปลยนแปลงยาภายในรางกายได
คราวๆ เบองตนกอนทจะไปศกษาในสตวทดลองเลยงลกดวยนมตอไป
รปท 19 แสดงกราฟความสมพนธระหวาง %สาร 4-Methyl umbelliferone
ทเปลยนแปลงไป ณ เวลาตางๆ
รปท 20 แสดง HPLC Chromatogram ของสาร 4-Methyl umbelliferone หลงจากฉดเขาหนอนไหม
และน ามาวดทนท (A) และเมอวดในเลอด hemolymph หลงจากฉดสาร 20 นาท (B)
ห น า | 21
รปท 21 กราฟแสดงความสมพนธระหวางปรมาณสาร Glucose conjugated – 4-
Methylumbelliferone ทเวลาตางๆ ในสวนตางๆของหนอนไหม
รปท 22 แบบเสนทางจ าลองการเปลยนแปลงสาร 7-ethoxycoumarin ในหนอนไหม
ตารางท 6 กระบวนการเกด glucose-conjugation ในสวนของ microsomal fraction และ soluble fraction
ห น า | 22
โดยทวไปหนอนไหมจะมกระบวนการขบถายโดย Malphigian tube อยางไรกตามกระบวนการ
ขบถายสารแปลกปลอมในหนอนไหมนนยงไมมขอมลการศกษา จ าเปนจะตองท าการศกษาเพมเตม ซงจาก
การศกษาโดยน าอจจาระของหนอนไหมมาสกด และหาปรมาณของสาร Umbelliferone รวมถง Glucose-
conjugated umbelliferone พบวาโดยสวนใหญ ขบออกในรป Glucose-conjugated และขบออกเกอบหมด
ภายใน 3 ชม. แรก (รปท 23)
รปท 23 กราฟความสมพนธระหวาง %การขบออกของสาร glucose-conjugated
umbelliferone และ สารในรปทไมเปลยนแปลง กบเวลาตางๆ
ตารางท 7 ปรมาณสาร Umbelliferone, Glucose-conjugated umbelliferone ทพบในอจจาระของหนอนไหม
หลงไดรบ Umbelliferone, 7-ethoxycoumarin
ห น า | 23
3. โมเดลทดสอบความเปนพษของสาร
Hamamoto และคณะ (2009) ไดท าการศกษาถงความเปนพษของสารตางๆ ตอหนอนไหม และหา
คา LD50 จากสารทเปนพษตอเซลล (Cytotoxic substances) โดยการฉดสารดงกลาวเขาไปในตวของหนอน
ไหม และดขนาดของสารทท าใหหนอนไหมตายครงหนงภายในหนงวน(LD50) ผลการทดลอง Hamamoto
ชใหเหนวาคา LD50 ของสารสวนใหญทน ามาทดสอบทไดจากการทดลองในหนอนไหมคอนขางเปนไป
ในทางเดยวกนกบการทดสอบในสตวเลยงลกดวยนม โดยเปรยบเทยบการฉดเขาในเลอดหนอนไหมเหมอน
การฉดเขาเสนเลอดด า(intravenous, i.v.) หรอฉดใตผวหนงของมนษย(subcutaneous, s.c.), และการฉดเขา
ล าไสหนอนไหม(intramidgut, i.m., m.)เปรยบเหมอนการใหโดยการรบประทาน(per oral, p.o.)
ผลของ potassium cyanide และ sodium azide ซงเปน aerobic ATP synthesis inhibitor มคา LD50
ในหนอนไหมทสงกวาในสตวเลยงลกดวยนม สวนในสารทมความเปนพษตอระบบประสาท (Neurotoxic
substances) ในสตวเลยงลกดวยนม เชน morphine, strychnine, D-tubocurarine และ botulinum toxin B จะม
LD50 มากกวา 10 เทาในหนอนไหมเมอเทยบกบในสตวเลยงลกดวยนม อยางไรกตามการน าหนอนไหมมา
ใชทดสอบความเปนพษของสารยงคงเปนเรองทใหม และยงตองค านงถงอกหลายๆดาน เชน เรองของระบบ
หายใจในมนษยเรานนใชปอด แตหนอนไหมใช spiracle ซงมลกษณะทแตกตางกน ดงนนพษในเรองของ
การกดการหายใจจงทดสอบไมไดในหนอนไหมเนองจากปอดถกควบคมโดยระบบกลามเนอและระบบ
ประสาทมาเกยวของ ดงนน morphine และ D-tubocurarine sulfate ซงมผลตอระบบหายใจ เมอทดสอบใน
หนอนไหมจะไมเหนผลดงกลาว หรอในเรองของความเปนพษตอตบและไตทอาจไดผลคลาดเคลอนกบการ
ทดลองในสตวเลยงลกดวยนม ซงเรองดงกลาวเปนเรองทตองค านงถงมากและตองมการศกษาเกยวกบ
หนอนไหมตอการทดสอบทางพษของสารเพมเตมตอไป
ห น า | 24
ตารางท 8 คา LD50 ของสารทมความเปนพษตอเซลล(Cytotoxic substances) จากการทดลองในหนอนไหม
และหน, m=intramidgut, h=heamolymph, p.o.=peroral, i.v.=intravenous, s.c.=subcutaneous
ตารางท 9 คา LD50 ของสารทมความเปนพษตอระบบประสาท (Neurotoxic substances) ในหนอนไหมและ
หน
ห น า | 25
4. โมเดลทดสอบความสามารถในการกระตนภมคมกนของสาร
ในระบบภมตานทานทตอตานการตดเชอในมนษยสามารถแบงยอยไดเปน 2 ชนดคอ ภมตานทาน
แตก าเนด (Innate immune response) และทสรางขนภายหลง (Acquire immune response) ซงพบวาทงสอง
ชนดมการท างานทใกลเคยงกนคอกระตนการหลง cytokine โดยปกต cytokine มผลดชวยปองกนรางกาย
อยางไรกตามหากมการสรางทมากเกนไปกสามารถสงผลใหเกดอนตรายได เชน ท าใหเกดภาวะตดเชอใน
กระแสเลอดได แตเนองจากความซบซอนของกลไกทเกยวของกบ cytokine, กลไกทกอใหเกดอาการ
ดงกลาวจงยงไมทราบแนชด ส าหรบสตวไมมกระดกสนหลงกลไกการปองกนสงแปลกปลอมทเขามาเชน
แบคทเรย ไดมาจากภมคมกนแตก าเนดเทานน ( Ishii และคณะ, 2008)
ภมคมกนแตก าเนดในสตวไมมกระดกสนหลงประกอบดวยสวนของ humoral และ cellular ,
humoral ประกอบดวย antimicrobial peptides, lectins และ melanin สวน cellular ประกอบดวย hemocyte ท
จะท าการ phagocytosis สารแปลกปลอม ส าหรบกลไกการกระตนภมตานทางในหนอนไหมทางหนงคอ
เมอมสารแปลกปลอมเขามาในตวหนอนไหม เชน สวนของ peptidoglycan ของ bacteria จะไปจบกบตวรบ
PGRP ซงสงผลใหเกดกระบวนการ melanization และกระตนการหลง Serine protease และท าใหเกดการ
สงเคราะหเมลานนและ reactive quinine ซงมความเปนพษตอแบคทเรย
Ishii และคณะ (2008)ไดศกษาถงกระบวนการตอตานสงแปลกปลอมทเขาสหนอนไหม เนองจาก
สงเกตเหนวาเมอฉดเชอแบคทเรยหรอราเขาทตวหนอนไหม หนอนไหมจะเกดภาวะอมพาตขน แมแตเชอท
ผานการฆาดวยความรอนกสามารถท าใหหนอนไหมเกดภาวะอมพาตไดทความเขมขนของเชอระดบหนง
ทาง Ishii เลยตองการศกษาถงกลไกทท าใหเกดภาวะดงกลาว โดยในชวงแรกเชอวาเกดจากการทสารอาจไป
จบท Kainic acid receptor จงท าใหเกดการหดตวของกลามเนอเหมอนทมรายงานกอนหนาน แตอยางไรก
ตามพบวามขอทแตกตางกนในสองจดคอ เรองของการเกดภาวะกลามเนอหดซงเกดชามาก ( ประมาณ 10
นาท) ในขณะท kainic acid สามารถกระตนไดในทนท และอกเรองหนงคอหากเปน kainic acid จะสามารถ
ถกยบย งภาวะหดตวของกลามเนอไดดวย L-glutamic acid แตพบวาการเกดกลามเนอหดตวจากการไดรบ
peptidoglycan หรอ glucan นนไมสามารถยบย งไดดวย L-glutamic acid จงเชอไดวากลไกการเกดกลามเนอ
หดตวนนเกดผานกลไกทตางจากกลไกผาน kainic acid
สาร Paralytic peptide (PP) เปนสารตวหนงทสงผลใหเกดการเปนอมพาตของหนอนไหม ทาง Ishii
สงเกตเหนวาหนอนไหมเกดภาวะอมพาตหลงไดรบเชอเขาไป จงสนนษฐานวา สาร PP นาจะมสวน
ห น า | 26
เกยวของกบกระบวนการตอตานในรางกายของหนอนไหม จงท าการศกษาโดยใหสาร anti-PP ฉดกอนแลว
จงตามดวยการให peptidoglycan หรอ glucan กบหนอนไหม พบวาผลภาวะอมพาตในตวหนอนไหมลดลง
(รปท 24) แสดงใหเหนวาสาร PP เปนสารสอตวหนงทเกยวของกบการเกดกลามเนอหดตวในหนอนไหมท
ไดรบ peptidoglycan หรอ glucan
Ishii ยงไดศกษาถงผลของ Reactive oxygen specie (ROS) ตอการตอตานสงแปลกปลอมของ
หนอนไหม โดยเชอวา ROS สามารถกระตนใหเกดการ activation PP และท าใหเกดการหดตวของกลามเนอ
ได จากการทดลองพบวา H2O2 สามารถกระตนใหเกดภาวะกลามเนอหดตวไดโดยแปรผนตรงกบความ
เขมขนของ H2O2 นอกจากนพบวาเมอให N-acetyl-L-cysteine หรอ edaravone ซงเปน free radical
scavengers สามารถลดการหดตวของกลามเนอทถกกระตนดวย peptidoglycan หรอ glucan ได แตไมมผล
ยบย งในกลมทถกกระตนดวย PP (รปท 25) จงท าใหเชอวา peptidoglycan หรอ glucan เปนตวสราง ROS ซง
จะสงผลตอใหเกดการ activated PP และเกดกลามเนอหดตวตอไป
จากการสงเกตวาในเซลลทไดรบเชอแบคทเรยสามารถหลงพวก ROS ออกมาได ทางผวจยจง
ตองการศกษาวา hemocyte ในหนอนไหมเปนแหลงสราง ROS จรงหรอไม โดยท าการศกษา NBT
reduction assay พบวา hemocyte ทไดรบ peptidoglycan ผลต ROS ออกมามากกวากลมทไมไดรบ (รปท
26) โดยพบ NBT formazan particle ซงเกดจากปฏกรยาระหวาง NBT และ ROS ขนใน hemocyte เมอมอง
ผานกลองจลทรรศน นอกจากนทางผวจยยงไดสนนษฐานวา Serine protease นาจะมสวนเกยวของกบการ
เกด activated PP ทถกกระตนโดย peptidoglycan โดยไดทดสอบให Serine protease inhibitor
(benzamidine, p-APMSF) พบวาสามารถลดการเกดกลามเนอหดตวจากการกระตนดวย peptidoglycan ได
อยางมนยส าคญทางสถต แต Serine protease inhibitor นไมมผลยบย งใน ภาวะกลามเนอหดตวทกระตนดวย
PP (รปท 27)ดงนนจงเชอวา Serine protease ท าการactivate PP เมอถกกระตนดวย peptidoglycan หรอ
glucan เพราะฉะนนสามารถสรปไดวาเมอหนอนไหมตดเชอแบคทเรยหรอจลชพอนๆ จะท าใหมการหลง
Cytokine-like factor ชอวา Paralytic peptide (PP) ซงเปนเปปไทดในกลม ENF peptide family ตามการแบง
ตามความเหมอนของล าดบกรดอะมโน โดย PP นนถกสงเคราะหออกมาในรป inactive และจะ active เมอม
สารแปลกปลอมเขามา
ดงนนทางนกวจยจงเชอวา กลไกการปองกนตวเองเกดโดยเมอแบคทเรยหรอราเขามาในรางกาย
ของหนอนไหม สวนของ peptidoglycan หรอ glucan จะไปจบกบตวรบและท าให hemocyte หลง ROS
ห น า | 27
ออกมาซงสงผลให Serene protease กระตนใหเกด activated PP และเกดกระบวนการตอตานสงแปลกปลอม
โดยการเกดการหดตวของกลามเนอดงแสดงในรปท 28 อยางไรกตามกยงคงมขอมลไมทราบแนชด
เกยวกบ ROS วาเกดจากการหลงของ hemocyte แนชดหรอไม หรออาจเกดจากภายนอกแลวซมผานเขาไป
ในเซลล และกลไกในการกระตน protease ทแนชดยงคงตองท าการศกษาเพมเตมตอไป
กลไกการปองกนรางกายของหนอนไหมโดยการหลง Cytokine-like PP และท าใหกลามเนอหดตว
นน ในรางกายมนษยเองกมกระบวนการดงกลาว เชน cytokine interleukin-4 ซงสามารถกระตนใหเกดการ
หดตวของกลามเนอเรยบทระบบยอยอาหาร ซงเปนกระบวนการปองกนตวเองจากการไดรบเชอพวกปรสต
จงเชอวากลไกการปองกนตวเองจากการตดเชอจลชพ และสาร cytokine-like PP นมความคลายคลงกน
ระหวางหนอนไหมและสตวเลยงลกดวยนม หรออาจเปน cytokine ทมอยและท าหนาทในสตวเชนกน
โดยคาดวาประโยชนทไดรบจากการศกษากลไกดงกลาวคอกลไกนนาจะเปนกญแจเพอน าไปหา
ค าตอบถงกลไกทท าใหเกดอาการตางๆจากการทมการสราง Cytokine ในรางกายทมากเกนไป นอกจากน
จากความรในเรองของกลไกการตอตานของหนอนไหมซงแสดงออกโดยกลามเนอหดตวของหนอนไหม
ท าใหมการน ามาศกษาใชเปนการทดสอบเบองตนในการหาสารทมความสามารถในการกระตนภมคมกน
เชน มการศกษาในอาหารทางการเกษตรหากอาหารดงกลาวสามารถกระตนภมคมกนไดกจะกอใหเกด
กลามเนอหดตวในหนอนไหม ดงแสดงในรปท 29, 30
ห น า | 28
รปท 24 แผนภมแทงแสดงคาการหดตวของกลามเนอหนอนไหมหลงจากถกกระตนดวย 1 mg/ml
peptidoglycan, 1mg/ml glucan, 4 µg/ml PP () และเมอมการให anti-PP serum รวม ()
รปท 25 แผนภมแทงคาการหดตวของกลามเนอหนอนไหมเมอถกกระตนดวย peptidoglycan,
glucan และ PP ในกลมทดลองทใหSaline, N-acetyl-cysteine; NAS, Edaravone
รปท 26 แผนภมแทงแสดงคา Intensity ของ ROS ในหนอนไหมทถกกระตนดวย peptidoglycan
(10mg/ml) หรอ phorbol myristate acetate (PMA; 10µg/ml) และ Phosphate buffer saline (PBS)
ห น า | 29
รปท 27 แผนภมแทงคาการหดตวของกลามเนอหนอนไหมเมอถกกระตนดวย peptidoglycan,
glucan และ PP ในกลมทดลองทใหSaline, Benzamidine และ p-APMSF
รปท 28 แผนภาพแบบจ าลองเสนทางการเกดภาวะปองกนตวเองจากการถกกระตนดวย Peptidoglycan
ห น า | 30
รปท 29 รปการทดลองการหดตวของกลามเนอเมอ
ถกกระตนดวยสารกระตน(i), และน าเกลอ (ii)
รปท 30 กราฟแสดงความสมพนธระหวางความยาวของหนอนไหมกบ
เวลาของตวอยางทไดรบน าเกลอ()และอาหารทางการเกษตร()
ห น า | 31
5. โมเดลศกษาหา Bacterial virulence genes S. aureus กอใหเกดโรคฉวยโอกาส (Opportunistic disease) ในคนไขทมความบกพรองของภม
ตานทาน ความเขาใจเกยวกบกลไกระดบโมเลกลของการแสดงออกทางพยาธสภาพของ S. aureus ใน
รางกายสตวจะชวยใหเขาใจและสามารถหาวธมารกษาเชอดงกลาวได ซงหากดจากล าดบยนของแบคทเรย
ชนดนพบวาม 589 ยนทเกยวของกบการเกดโรคแตหนาททชดเจนยงคงไมทราบแนชด (Kaito และคณะ,
2007)
จากการศกษาของ Kaito และคณะ (2005) ไดทดลองกลายพนธของล าดบยนของเชอแบคทเรยเปน
สายพนธทแตกตางกน 100 สายพนธและฉดเขาเลอดหนอนไหม และพบวาม 3 สายพนธทใหผลการกอโรค
ลดลง โดยสายพนธอนๆสามารถท าใหหนอนไหมตายไดครงหนงภายใน 36 ชวโมงแตในสามสายพนธ
ดงกลาวตองใชเวลามากกวา 80 ชวโมง(ตารางท 10) โดย Kaito ใหชอยนดงกลาววา cvfA, cvfB, cvfC
(Conserve virulence factor A,B,C) ซงเมอน ามาทดสอบกบหนทดลอง ผลการทดสอบพบวาสายพนธทม
การลบล าดบยน cvfA, cvfB, cvfC ออกจะใหผลกอโรคนอยลง จงชใหเหนวายนสามตวนเกยวของกบการกอ
โรคในสตวเลยงลกดวยนม
จากการทดสอบการหลง exotoxin ของสายพนธ wild-type, cvfA, cvfB, cvfC พบวาสามสายพนธท
มการกลายพนธสราง exotoxin นอยกวา wild type strain โดยใน agar plate assay ทม เลอด erythrocyte ของ
แกะ (ซบเสตรทของ beta-toxin) จะเหนวาในสามสายพนธทกลายพนธม lysis zone นอยกวา wild type
strain และ cvfA mutant มปรมาณของ protease และ nuclease หลงจากเซลลนอยกวา wild-type strain ซง
จากผลดงกลาวนกวจยจงเชอวายน cvfA, cvfB, cvfC นาจะมสวนเกยวของกบ exotoxin genes
Agr locus เปนสวนทเกยวของกบการแสดงออกของ exotoxin ใน S. aureus ทาง Kaito จง
ท าการศกษาวาหากน ายน cvfA ออกจะสงผลตอการแสดงออกของ agr locus หรอไม ซงผลการทดลองโดย
วธ Northern blot analysis แสดงใหเหนวาระดบการแสดงออกของ RNAII ซงเปนผลจาก agr locus และ
RNAIII ทเกดจากการกระตนของ RNAII มระดบทลดลงในสายพนธทกลายพนธ cvfA จากผลดงกลาวจง
ชวยสนบสนนหลกฐานวายน cvfA ควบคมการแสดงออกของ agr locus ซงเกยวของกบการแสดงออกของ
ยน exotoxin ทเกยวกบ hemolysins, protease และ nuclease
ห น า | 32
ตารางท 10 Killing ability ของสายพนธตางๆตอหนอนไหม
รปท 31 ภาพแสดงการสราง exotoxin ของสายพนธ wild-type, cvfA, cvfB, cvfC
6. การน าหนอนไหมมาใชเปนโฮสตในการสรางโปรตน
มการทดลองมากมายทน าหนอนไหมมาใชในการเปนโฮสตส าหรบสรางโปรตน ซงโดยปกตโฮสต
ทมการน ามาใชคอ E. coli เพราะสามารถท าไดงาย อยางไรกตามมนยงคงมขอจ ากดบางอยาง เชน ไม
สามารถดดแปลงในชวง cotranslation หรอ posttranslation ได เมอไมนานมานนกวจยบางกลมเรมนยมและ
สนใจหนมาใชแมลง เชน หนอนไหม ในการสรางโปรตนเพราะมกลไกทคลายกนและมความสามารถใน
การดดแปลงชวง cotranslation และ posttranslation ได เชนการ glycosylation, phosphorylation และ protein
processing เปนตน (Kato และคณะ, 2010)
AcNPV (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) Bacmid เปน bacmic ทมการใชกน
กวางขวาง อยางไรกตาม AcNPV ไมมความสามารถในการ infect เขาหนอนไหมทางการศกษาของ
Motohashi และคณะ (2005) จงพฒนา Bombyx mori nuclear polyhedrosis virud bacmic system และทดลอง
ห น า | 33
ใหหนอนไหมสรางโปรตนทเรองแสงสเขยว ซงกประสบความส าเรจไมวาจะท งใหการตดเชอโดย
recombinant virus หรอการฉด bacmid DNA เขาโดยตรงทตวหนอนไหม ซงจากการศกษาดงกลาวแสดงให
เหนถงความสามารถในการสรางโปรตนอยางรวดเรวในหนอนไหม และมความปลอดภย จงเชอวาจะ
สามารถน ามาใชเปนเครองมอในการสราง recombinant eukaryotic protein ทด
ห น า | 34
บทท 3
การประยกตน าโมเดลหนอนไหมมาใชในการทดสอบสารใหมหรอสารจากธรรมชาต
1. การประเมนฤทธทางเภสชวทยาของยา Oseltamivir ในระบบประสาท
การทดลองอนๆทมการน าหนอนไหมมาใชเปนโมเดลในการทดลองนอกเหนอจากการทดสอบการตาน
เชอจลชพและการทดสอบดการดดซมของยา เชน การน าหนอนไหมมาทดสอบดเรองของผลตอการกระตน
ท Glutamate receptor ของยา Oseltamivir เนองจากการศกษาของ Sekimizu และคณะ (2005) พบวา D-
glutamic acid และ Kainic acid สามารถกระตน glutamate receptor ชนด Kainic acid ทกลามเนอลายของ
หนอนไหมได สงผลใหเกดกลามเนอหดตว แตหากไดรบ L-glutamic acid จะใหฤทธในทางตรงกนขามคอ
สามารถตานการหดตวของกลามเนอได
Ishii และคณะ (2008) จงสนใจศกษาและไดทดลองน า Oseltamivir ซงมโครงสรางคลายกบ L-
glutamic acid ซงเปนสารสอประสาททหากมปรมาณมากเกนไปสามารถกอใหเกดภาวะตางๆทางสมองได
เชน ภาวะลมชก เปนตน จงเชอวาหาก Oseltamivir สามารถจบท glutamic receptor ไดกอาจมฤทธเหมอน
L-glutamic acid และเปนสาเหตหนงของภาวะชกได ดงนนทางนกวจยจงไดท าการทดลองกบหนอนไหม
โดยศกษาดการหดตวของหนอนไหมโดยการฉด Oseltamivir (2.5 mg) เขาทเลอด hemolymph ของหนอน
ไหม ผลการทดลองพบวาหนอนไหมเกดการคลายตวของกลามเนอ จงเชอวายา Oseltamivir นาจะมกลไก
การออกฤทธคลายกบ L-glutamic acid ซงมผลตอระบบประสาทได ทางIshii และคณะกไดท าการทดสอบ
ในโมเดลอนๆ คอ ท าการทดสอบฉดยาเขาท intracerebellar ของหน mice และสงเกตดพฤตกรรมท
เปลยนแปลงไป และดคา Electrophysiology ของ hippocampal slice ในหน rat ซงผลจากการทดลองทง 3
การทดลองใหผลเหมอนกบการกระตนโดย L-glutamic acid ดงนน Ishii และคณะจงชแนะถงการดดแปลง
โครงสรางของ Oseltamivir เพอพฒนาลดอาการขางเคยงใหไมมผลตอ glutamic receptor
ห น า | 35
รปท 32 โครงสรางของ Oseltamivir (ซาย) และ L-glutamic acid (ขวา)
รปท 33 ภาพหนอนไหมในกลมควบคม (ซาย) และ ทไดรบ Oseltamivir (ขวา)
2. การใชหนอนไหมในการศกษาสารจากธรรมชาตทมความเหมาะสมในเรองเภสชจนศาสตร จากการศกษาถงการน าหนอนไหมมาใชในการทดลองทหลากหลาย ผลการทดลองพบวาหนอน
ไหมมเอนไซมไซโตโครม P450 (CYP450) ในกระบวนการเมตาบอลซมทคลายในมนษย, มลกษณะการดด
ซมยาผานล าไสทคลายกบในมนษยเชนกน และผลการทดสอบฤทธตานเชอจลชพกใหผลไปในทางเดยวกบ
ในการทดสอบดวยวธมาตรฐาน Asami และคณะ (2010) จงไดศกษาทดสอบถงความคงตวของยาสมนไพร
Seihi และความสามารถในการดดซมของยาดงกลาว โดยฉดสาร Seihi เขาสล าไสของหนอนไหม และวดด
ความคงตวของสารทซมผานล าไสเขามาส hemolymph ทเวลาตางๆ ซงจากการศกษาสาร Seihi เมอดดซม
เขาสกระแสเลอด hemolymph จากการวเคราะหดวย HPLC พบสาร 3 ชนดในเลอดของหนอนไหมไดแก
Nobiletin, Heptamethoxyflavone, Tangeretin ซงมคาครงชวตทเวลา 18, 26, 34 ชวโมงตามล าดบ เมอ
เปรยบเทยบ Nobiletin กบคาครงชวตของสารดงกลาวในหนทดลอง (> 24hr) พบวามความใกลเคยงกน
แสดงใหเหนวาสารทงสามชนดมความคงตวทดเมอดดซมเขาสเลอดของหนอนไหม และเชอวาสารทมเภสช
จลนศาสตรทเหมาะสมในหนอนไหม กนาจะมเภสชจลนศาสตรทเหมาะสมในสตวเลยงลกดวยนมเชนกน
3. การศกษายาสมนไพรจนตอฤทธตานไวรส Orihara และคณะ (2008) ไดน ายาสมนไพรจน (Kampo medicine) 3 ชนดไดแก Maoto, Kakkon-to,
Shosaiko-to มาศกษาดผลตอการตานไวรส โดยฉดสารเขาไปในหนอนไหมทไดรบเชอไวรส baculovirus
(BmNPV ) ซงผลการทดสอบพบวา Maoto มฤทธตานไวรส baculovirus ทดทสด (รปท 34 ) ใน Maoto
ประกอบไปดวยสารจากธรรมชาตสชนด ไดแก ephedra herb, apricot kernel, licorice root และ cinnamon
bark ทาง Orihara และคณะจงน าสารดงกลาวมาสกดแยก และทดสอบพบวาสารทออกฤทธตานไวรสคอ
สาร Cinnzeylanine ใน Cinnamon bark ซงกถอเปนการศกษาแรกทพบวาสาร cinnzeylanine มฤทธตาน
ห น า | 36
ไวรสในโมเดลหนอนไหมได และเมอทดสอบ Plaque-forming assay ดความสามารถในการตานการ
เจรญเตบโตของจ านวนไวรส BmNPV พบวามความสามารถใกลเคยงกบ Ganciclovir และมฤทธลดการ
แบงตวของไวรส HSV-1 ใน vero-cell เชนกน
รปท 34 กราฟความสมพนธระหวาง %การรอดชวตของหนอนไหมกบเวลา ของ [] Control,
[] BmNPV+Saline, [] BmNPV+Maoto(100mg),
[] BmNPV+ Kakkon-to(200mg), []BmNPV +Shosaiko-to(200mg)
รปท 35 กราฟความสมพนธระหวาง % Plaque reduction และความเขมขนของสาร Cinnzeylanine
และ Ganciclovir
ห น า | 37
รปท 36 กราฟความสมพนธระหวาง %จ านวน Plaque กบ Cinnzeylanine ทความเขมขนตางๆ
4. Nokomycin, ยาตานเชอแบคทเรย Uchida และคณะ (2010) ไดน าโมเดลหนอนไหมมาใชศกษาหาสารทมฤทธตานเชอ methicillin-
resistant Staphylococcus aureus (MRSA) เบองตน โดยมขอก าหนดวาหากสารใดสามารถท าใหหนอนไหม
ทตดเชอ MRSA มชวตรอดตอไปไดอยางนอย 3 วนหลงไดรบเชอ จะถกพจารณาคดเลอดเพอน ามาศกษาตอ
ในวธมาตรฐาน liquid microdilution method ตอไป ซงจากการทดสอบเบองตนดงกลาว ท าใหพบสารตาน
เชอ MRSA ตวใหมคอ Nokomycin (A-D) (รปท 37) ซงขนาดประมาณ 50 µg/larvae สามารถท าใหหนอน
ไหมรอดชวตจากการตดเชอ MRSA ไดและมคา MIC 0.125 µg/ml จากการทดสอบดวย liquid
microdilution method (ตารางท 11) ในขณะท imipenem และ vancomycin มคา MIC เทากบ 16 และ 0.5
µg/ml ตามล าดบ แสดงใหเหนวาสาร Nokomycin มฤทธในการตานเชอ MRSA ทดเมอทดสอบในหนอน
ไหม ซงผลจากการทดลองในหลอดทดลองกแสดงใหเหนวาสารดงกลาวมฤทธทด จงอาจกลาวไดวาโมเดล
หนอนไหมมประโยชนและสามารถน ามาคดเลอกสารทมฤทธตานเชอ MRSA กอนในเบองตน เพอทจะ
ด าเนนการทดสอบขนตอไป
รปท 37 โครงสรางของ Nokomycin A-D
ตารางท 11 คา MIC ของ Nokomycin A-D , Imipenem และ vancomycin จากการทดสอบฤทธตานเชอ
MRSA ดวย liquid microdilution method
ห น า | 38
5. การน าหนอนไหมมาเปนโมเดลในการศกษาฤทธตานเชอ MRSA ของสารกลม
oxazolidinones
การทดลองของ Barman และคณะ (2008) ในการทดสอบฤทธยา vancomycin, linezolid และสาร
ใหมกลม oxazolidinones (RBx 7644, RBx 8700, RBx 2006171) ถงการออกฤทธตานเชอ S. aureus (MRSA
562) โดยทดสอบในหนอนไหมสายพนธ CSR-2 x CSR-4 จากผลการทดลองพบวา vancomycin, linezolid,
RBx 7644, RBx 8700 มคา ED50 เทากบ 30.72, 13.38, 37.89, 24.96 ตามล าดบในขณะท RBx 2006171
(6.25-200 mg/kg body weight)ไมสามารถหาคา ED50 ไดในการทดลองดวยหนอนไหมรวมถงในหนดวย
เชนกน ซงแสดงใหเหนถงความแตกตางของผลจากการทดสอบดวยหนอนไหม,หน และAgar plate
เนองจากในการทดลองดวย Agar plate จะเหนไดวาไดคา ED50 ทคอนขางดมาก แตเมอมาท าการทดสอบใน
หนอนไหมหรอหนทดลองพบวาไมมฤทธการรกษา ซงทงสองการทดลองใหผลทสอดคลองเปนไปในทาง
เดยวกน (ตารางท 21) จงเชอวาหนอนไหมจะเปนโมเดลทดและเอามาใชในการทดสอบเบองตนได ทงยงม
ขอดในเรองของปรมาณสารทใชฉดกใชเพยงเลกนอย คอใชเพยงประมาณ 1 mg ในขณะทหน mice , rat ใช
10, 30mg ตามล าดบ
ตารางท 12 คา MIC และED50จากการทดลองในหนอนไหมและหน Mice
6. การศกษาฤทธตานเชอแบคทเรยในสารสยอม
Fujiyuki และคณะ (2010) ไดท าการศกษาฤทธตานเชอแบคทเรย S. aureus ในโมเดลหนอนไหม
ในสารสยอมและมฤทธตานเชอแบคทเรยจ านวน 13 สาร ผลการศกษาพบวามเพยง Rifampicin ทมฤทธ
รกษาในหนอนไหมและมคา ED50 และคาครงชวตทคลายในสตวเลยงลกดวยนม สวนอก 12 สาร พบวาไมม
ฤทธตานเชอแบคทเรยเมอทดสอบในหนอนไหม ดงนนทางFujiyuki และคณะจงท าการศกษาหาสาเหต
ดงกลาว และพบวาเกดจากปญหาของความเปนพษและเรองของเภสชจลนศาสตร เชน Amidol, Pyronin G
และ Safranin ยงไมแสดงฤทธในหนอนไหมเนองจากมความเปนพษตอหนอนไหม, Fuchsin basic และ
ห น า | 39
methyl green พบวาปรมาณสารในเลอดของหนอนไหมลดลงอยางรวดเรว ซงคาดวาเปนเพราะไมคงตวใน
เลอด hemolymph นอกจากนสาร CBB R250, CBB G250, cresyl blue และ nigrosin ไมมฤทธในหนอน
ไหม ถงแมเมอวดปรมาณสารในกระแสเลอดพบวามปรมาณสงกวาคา MIC กตาม ซงคาดวาเปนผล
เนองมาจากสารดงกลาวจบกบพลาสมาโปรตนในหนอนไหม และปรมาณของสารในรปอสระ (Free
compound) มปรมาณนอยมากเกนจะสามารถมฤทธตานเชอจลชพได ซงแสดงใหเหนถงผลของพลาสมา
โปรตนของหนอนไหมตอการกระจายของยาในหนอนไหมมผลลดประสทธผลของยาได ซงมลกษณะท
คลายคลงกบในสตวมกระดกสนหลงเชนกน
ดงนนสารทมฤทธตานเชอทด แตไมมฤทธหากมการจบกบพลาสมาโปรตน จงสามารถตรวจพบ
เจอไดในชวงตนของการคดสรรยา จงคาดวาหนอนไหมจะสามารถน ามาเปนโมเดลทดไดเนองจากสามารถ
ดเรองของเภสชจลนศาสตรไดตงแตชวงแรกของการคดสรรหายาใหม ซงนอกจากจะมคาใชจายทต าแลว ยง
ไมมปญหาเรองจรรยาบรรณสตวทดลองเชนกน
ตารางท 13 แสดงคาจากการทดสอบในสารทง 13 ชนดและ vancomycin
ตารางท 14 คา MIC และความเขมขนของสารยอมสในเลอดหนอนไหมหลงให 25% plasma
และ BSA 25 mg/ml
ห น า | 40
ตารางท 15 ความเขมขนของสารตางๆ (µg/larvae) ในเลอดหนอนไหมหลงการฉด Plasma, BSA
ขอมลแสดงคา MIC และ ความเขมขนของสารในเลอดหนอนไหม โดยวด
หลงจากฉดส( 250 µg/larvae fuchsin basic, 750 µg/larvae methyl green, 185
µg/larvae CCB R250, 250 µg/larvae CCB G250, 400 µg/larvae cresyl blue,
450 µg/larvae nigrosin )ไปแลวสองวน
ห น า | 41
บทท 4
บทสรป จากการศกษาเกยวกบหนอนไหมในการน ามาใชเปนโมเดลในการทดสอบเบองตน ซงมขอดคอ
สามารถลดตนทนคาใชจายได และไมมปญหาในเรองของจรรยาบรรณสตวทดลอง นอกจากนยงเปนสตว
ไมมกระดกสนหลงทมขนาดคอนขางใหญ จงสามารถจะฉดปรมาณสารทแมนย าเขาสตวหนอนไหมได
โดยตรง ซงเปนขอไดเปรยบกวาแมลงหวหรอนมาโทดซงมขนาดเลกมาก นอกจากนยงมขอดเนองจาก
สามารถใหไดทงทางเลอดและทางล าไส
โดยโมเดลทเรมมการน ามาศกษาน าหนอนไหมมาใช ยกตวอยางเชน การน ามาใชในการทดสอบ
ฤทธตานเชอจลชพ, การศกษาเรองของเภสชจลนศาสตรดานการดดซมของยา, การดความเปนพษของสาร,
การศกษากลไกการออกฤทธของยาตอ Glutamic receptor, ศกษา bacterial virulence genes, การศกษาถง
ความสามารถในการกระตนภมคมกน และการน าหนอนไหมมาใชเปนโฮสตในการสรางโปรตน เปนตน ซง
ผลทไดจากการทดลองสวนมากมความสอดคลอยและคลายคลงกบผลการทดลองในสตวเลยงลกดวยนม
ดงนนจงมความเชอวาหนอนไหมจะสามารถน ามาใชในการทดลองเบองตนกอนทจะลงลกไปศกษาใน
สตวทดลอง เพอเปนการจ ากดคาใชจาย คดแยกสารทไมมฤทธออกไปกอนทจะไปศกษาตอในขนตอน
ตอไป รวมถงลดปรมาณของสตวทดลองทตองน ามาใชศกษาทดลองในขนถดไป
อยางไรกตามขอมลผลการทดลองของหนอนไหมยงคงตองท าการศกษาเพมเตมอกมาก เนองจาก
ยงคงมการศกษานอย และยงตองการขอมลในการยนยนสนบสนนผลทไดจากการทดลองในหนอนไหมอก
มาก ซงหากเมอมการศกษาหาขอมลทมากพอวาผลการทดลองทไดมความคลายคลงกบในมนษย ในอนาคต
หนอนไหมกอาจจะสามารถน ามาใชเปนโมเดลทมประสทธภาพอกโมเดลหนงในการทดสอบเบองตน
กอนทจะกาวขามไปท าการศกษาในสตวเลยงลกดวยนมตอไป
ห น า | 42
เอกสารอางอง
Asami Y, Horie R, Hamamoto H and Kazuhisa S. Use of silkworms for identification of drug candidates having appropriate pharmacokinetics from plant sources. BMC Pharmacology. 2010;10(7):1-6.
Barman T.K, Arora P, Rao M, Bhadauriya T and Upadhyay D.J. Utilization of Bombyx mori larvae as a surrogate animal model for evaluation of the anti-infective potential of oxazolidinones. Japanese Society of Chemotherapy and The Japanese Association for Infectious Diseases. 2008;14:166–169.
Fujiyuki T, Imamura K, Hamamoto H and Sekimizu K. Evaluation of therapeutic effects and pharmacokinetics of antibacterial chromogenic agents in a silkworm model of Staphylococcus aureus infection. Drug Discoveries & Therapeutics. 2010; 4(5):349-354.
Hamamoto H, Kurokawa K, Kaito C, Kamura K, Razanajatovo I.M, Kusuhara H, et al. Quantitative Evaluation of the Therapeutic Effects of Antibiotics Using Silkworms Infected with Human Pathogenic Microorganisms. Antimicrobial agents and Chemotherapy. 2004; 774–779.
Hamamoto H, Kamura K, Razanajatovo IM, Murakami K, Santa T, Sekimizu K. Effects of molecular mass and hydrophobicity on transport rates through non-specific pathways of the silkworm larvae midgut. International Journal of Antimicrobial Agents. 2005; 26:38-42.
Hamaoto H, Narushia K, Horie R, Sekimizu K. Silkworm as a model animal to evaluate drug candidate toxicity and metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology. 2009; 149:334–339.
Ishii K, Hamamoto H, Sasaki T, Ikegaya Y, Yamatsugu K, Kanai M, et al. Pharmacologic action of Oseltamivir on the nervous system. Drug Discov Ther. 2008;2(1):24-34.
Ishii K, Hamamoto H, Kamimura M and Sekimizu K. Activation of the Silkworm Cytokine by Bacterial and Fungal Cell Wall Components via a Reactive Oxygen Species-triggered Mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 2008; 283(4):2185-2191.
Kaito C, Akimitsua N, Watanabe H and Sekimizua K. Silkworm larvae as an animal model of bacterial infection pathogenic to humans. Microbial Pathogenesis. 2002;32:183–190.
Kaito C, Kurokawa K, Matsumoto Y, Terao Yutaka, Kawabata S, Hamada S, et al. Silkworm pathogenic bacterial infection model for identification of novel virulence genes. Molecular Microbiology. 2005; 56(4):934-944.
ห น า | 43
Kaito C and Sekimizu K. A silkworm model of pathogenic bacterial infection. Drug Discov Ther. 2007;1(2):89-93.
Kato T, Kajikawa M, Maenaka K, Park EY. Silkworm expression system as a platform technology in life sciencs. Appl Microbiol Biotechnol. 2010; 85:459-470.
Motohashi T, Shimojima T, Fukagawa T, Maenaka K, Park EY. Efficient large-scale protein production of larvae and pupae virus bacmid system. Biochemical and Biophysical Research Communication. 2005;326:564-569.
Niwa R, Matsuda T, Yoshiyama T, Namiki T, Mita K, Fujimoto Y, et al. CYP306A1,a Cytochrome P450 Enzyme, Is Essential for Ecdysteroid Biosynthesis in the Prothoracic Glands of Bombyx and Drosophila. The Journal of Biological Chemistry. 2004; 279(34): 35942-35949.
Orihara Y, Hamamoto H, Kasuga H, Shimada T, Kawaguchi Y and Sekimizu K. A silkworm–baculovirus model for assessing the therapeutic effects of antiviral compounds: characterization and application to the isolation of antivirals from traditional medicines. Journal of General Virology. 2008;89:188–194.
Sekimizu K, Larranaga J, Hamamoto H, Sekine M, Furuchi T, Katane M, et al. D-Glutamic Acid-Induced Muscle Contraction in the Silkworm, Bombyx mori. J. Biochem. 2005; 137: 199-203.
Sekimizu N and Ogata Y. Intellectual property strategies for university spinoffs in the development of new drugs. Drug Discov Ther. 2009; 3(5):193-199.
Tan M, Miklos SM, Ausubel FM. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Microbiology. 1999;96:715-720.
Uchida R, Iwatsuki M, Kim YP, Ohte S, Omura S and Tomoda H. Nokomycin, new antibiotics discovered in an in vivo-mimic model using silkworm larvae. l:Fermentation, isolation and biological properties. The Journal of Antibiotics. 2010; 63: 151-155.
Uchida R, Iwatsuki M, Kim YP, Ohte S, Omura S and Tomoda H. Nokomycin, new antibiotics discovered in an in vivo-mimic model using silkworm larvae. ll: Structure elucidation. The Journal of Antibiotics. 2010; 63: 157-163.