Flux o transmissió de la informació genètica “Expressió gènica”
Trancripció Traducció
Replicació
Trancripció Traducció
Replicació
Tipus d’RNA Inici de la transcripció (I)
<4% mides molt variables
80% Estructural
U-RNA spliceosomes
Modificació rRNA tRNA metilació pseudouridinilació
Micro RNA i RNA d’interferència, interfereixen l’espressió de gens concrets.
Recordem: les diferències de la molècula de RNA amb la de DNA
2’-OH
L’uracil interacciona per ponts d’H amb l’adenina en la molècula de RNA.
Recordem que l’RNA pot adquirir diferents estructures secundàries
L’ RNA és de cadena senzilla i llavors adopta moltes estructures diferents d’aquest tipus. La mateixa molècula de RNA pot adoptar més d’una estructura tridimensional (amb funcions específiques). Adaptat de l’Alberts i col. “Biologia Molecular de la Célula” i
del Lehninger “Principles of Biochemistry”
Transcripció:
• És la síntesi de la molècula de RNA
catalitzada per la RNA polimerasa,
utilitzant una cadena de DNA com a
motlle, per donar lloc a un “producte
gènic”:
-RNA funcional: estructural o catalític
-RNA missatger que donarà lloc a una proteïna.
Proteïna
tRNA
DNA
Adaptat de l’Alberts i col. “Biologia Molecular de la Célula”
Reacció de la RNA polimerasa (1960)
Característiques de les RNA polimerases:
Necessiten un motlle de DNA. Els 4 ribonucleòtids i Mg2+
Polimeritza RNA en direcció 5’ a 3’, mitjançant la formació d’enllaços fosfodiéster. Llegeix la cadena motlle del DNA en direcció 3’ a 5’ (antiparal·lela i complementària a la nova cadena d’RNA).
No tenen activitat correctora
Alta processivitat
Caràcter asimètric
No necessiten encebador, s’uneixen a seqüències promotores.
Inici de la transcripció (I)
La transcripció produeix una sola cadena de RNA. Cadena Motlle i codificant
5’ AAACGCUAUAGCG 3’
Figura 6-13 Biología molecular de la célula, quinta edición (© Garland Science 2008 y Ediciones Omega 2010)
Es transcriu tot el genoma al mateix temps? Les dues cadenes poden codificar proteïnes o RNAs?
Organització de la informació codificant en un fragment del genoma d’adenovirus transcrit en les dues direccions.
Diferents gens, uns codificats en la “cadena de dalt” i altres per la cadena de baix . Les dues cadenes codifiquen missatges diferents.
5’
5’ 3’
3’
Cadena codificant 5’-3’
Cadena motlle 3’-5’
molècula de RNA 5’-3’del gen de dalt
molècula de RNA 5’-3’del gen de baix
5’ AAACGCUAUAGCG 3’
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”
Adaptat de Luque, J., y Herráez, Á. Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética. Ed. Harcourt
Estructura d’un gen. La transcripció d’un gen s’inicia en un punt concret. Promotor lloc d’unió de la RNA polimerasa.
La seqüència de DNA correponent a un gen també ens diu en quin moment s’ha de fabricar el producte gènic, en quines cèl·lules i en quina quantitat.
Transcripció a procariotes
Estudis amb E.coli
Transcripció a procariotes: Estructura de la RNA polimerasa de E.coli
* transcriu tots els RNAs * holoenzim: Estructura de 500 kD amb sis subunitats de 5 tipus: (α2ββ’ω) σ.
a s’uneix a seqüències UP reguladores. b forma enllaços fosfodiester. b ‘ s’uneix al DNA. (ββ’ és el centre catalític) s responsable de l’inici de la transcripció.
“Core” o nucli de l’holoenzim (α2ββ’ω)
Subunitat σ (hi ha diferents subunitats σ)
La síntesi de RNA comença en els promotors: seqüències de reconeixement per a l’iniciació de la transcripció.
Iniciació de la transcripció: existeixen seqüències específiques de reconeixement al DNA: promotors
Seqüències conservades en el promotor procariota reconegut per la subunitat σ 70
T T G A C A
Les mutacions en els promotors poden variar l’eficiència de la transcripció Les mutacions a la regió -35 afecten la unió de la RNA polimerasa Les mutacions a la regió -10 afecten la separació de les cadenes
Genetistes, operó lactosa, 1964.
DNA motlle
Regió -35 Seqüència Inici RNA Pribnow
TTGACA TATAAT
+1 -10 -35
Seqüències consens del promotor bàsic procariota.
Aquestes dues caixes són elements clau perquè s’hi uneixi la polimerasa. Però hi ha altres elements reguladors. Promotors forts i Promotors febles segons les seqüències. És tant important la conservació de la seqüència com la de la posició relativa dels diferents elements.
La interacció de l’RNA polimerasa amb el DNA: tècnica de footprinting “empremta genètica”
La interacció de l’RNA polimerasa amb el DNA es pot visualitzar mitjançant la tècnica de footprinting. En la que es pot veure que la regió protegida es de uns 60-80 bp i inclou ambdues regions de -10 i -35.
Adaptat del Stryer “Bioquímica” i del Lehninger “Principles of Biochemistry”
Indiqueu si les següents afirmacions són vertaderes o falses: • Les RNA polimerases poden començar la còpia d’àcids nucleics sense necessitat
d’un encebador. • La RNA polimerasa en fase d’elongació presenta una síntesi tan processiva que,
una vegada iniciada la síntesi no es desenganxa fins a trobar els senyals d’acabament.
• S’entén per transcripció únicament la síntesi d’un únic tipus de RNA, la síntesi de RNAm.
• A procariotes l’inici de la transcripció implica la unió prèvia de varies proteïnes a seqüències consens dels promotors perquè pugui unir-se la RNA polimerasa.
• Quins són els dos motius presents en els promotors típics bacterians que els defineixen i que són necessaris pel reconeixement de l’holoenzim RNA polimerasa σ70?
• La subunitat de la RNA polimerasa d’ E. coli que reconeix als llocs promotors s’anomena: β, α, β‘, γ, s70.
QÜESTIONS Indiqueu si les següents afirmacions són vertaderes (V) o falses (F): - El nucli (core) de la RNA polimerasa bacteriana no es capaç de
distingir entre els promotors i altres seqüències del DNA. - El factor s confereix a l’holoenzim bacterià especificitat pel
promotor. - El reconeixement del promotor bacterià no depèn de seqüències
consens. - En bacteris es dóna amb molta freqüència l’splicing alternatiu.
La tècnica de “footprinting” permet determinar: a. L’homologia entre varies seqüències de DNA. b. Com unes proteïnes interaccionen amb les altres quan s’uneixen al
DNA. c. A on s’uneixen les proteïnes al DNA.
Etapes de la transcripció
• inici: requereix seqüències promotores.
• elongació: Allargament de la cadena de RNA per la RNA polimerasa.
• terminació: requereix de senyals de parada o de factors proteics.
Tant a procariotes com a eucariotes la transcripció es dóna en tres etapes:
Inici de la transcripció (I)
Etapes en la
transcripció de l’RNA
polimerasa
Etapa de l’inici de la transcipció (unió)
Formació del complex tancat: unió de l’RNA polimerasa
de σ i unió reconeixement
El DNA està encara com a doble hèlix
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”
Etapa d’inici de la transcripció
Complex Obert: el DNA té un petit segment desenrotllat de 17 pb.
La caixa Pribnow rica en A i T és més fàcil de fondre (obrir).
Complex ternari: DNA pol DNA-RNA 8pb.
Les subunitats β i σ intervenen en la formació del complex obert.
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”
Transcripció per l’RNA polimerasa (elongació)
Bombolla de transcripció.
Híbrid DNA-RNA de 8 nt.
Síntesi RNA 5’ a 3’.
Velocitat 40-50 nt/s.
RNA pol no es desenganxa (processiu).
Adaptat de l’Alberts i col. “Biologia Molecular de la Célula”
Superenrotllament del DNA provocat per la transcripció
L’elongació produeix una tensió en el DNA i provoca:
-superenrotllament positiu pel davant de la bombolla de transcripció.
-superenrotllament negatiu pel darrera la bombolla.
Més
enrotllat
Menys
enrotllat
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”
Terminació de la transcripció independent de rho
“Hairpin” (ganxo) de terminació Depèn només de la seqüència
Es forma aquesta estructura secundària “hairpin” molt a prop de la bombolla, molt estable pel contingut de CG.
2 seqüències palindròmiques riques en CG, i a continuació es troben vàries T.
Figura de Garret & Grisham: Biochemistry, 2a Fig 31.7
Model de Terminació de la transcripció independent del factor Rho
Crea tensió i impediment estèric
Aparellament A=U feble
•Disminueix la velocitat de la polimerasa i la transcripció al trobar les CG.
•Amb l’estructura secundària del RNA i a més les unions febles al motlle U=A, tot plegat fa que la polimerasa es pari i el RNA es desenganxi sortint del complex.
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”
Terminació de la transcripció dependent del factor Rho: Depèn de la seqüència del DNA i de la proteïna Rho.
• És una helicasa que té 6 subunitats
• s’enganxa a l’RNA.
• es desplaça per l’RNA de 5’a 3’.
• trenca la hibridació RNA-DNA.
• i desfà el complex.
Regió seqüència rica en GC
Disminueix velocitat polimerasa
Figura 28-12 Stryer 5a Ed
Rho-Dependent Transcription Termination (depends on a protein AND a DNA sequence)
G/C -rich site
RNAP slows down
Rho helicase
catches up
Elongating complex is disrupted
Indiqueu si les següents afirmacions són vertaderes o falses: • A procariotes l’holoenzim de la RNA polimerasa conservarà totes
les subunitats al llarg de la transcripció.
• Els exons constitueixen les seqüències codificants del genoma del bacteri.
• En el cas de la síntesi dels mRNAs el promotor del gen no es transcrit.
• Els gens tenen seqüències que indiquen el seu inici, el seu acabament i altres que regulen la seva expressió.
• La RNA polimerasa bacteriana acaba la transcripció quan troba una seqüència rica en CG seguida d’una altra de vàries T.
QÜESTIONS Les funcions de la RNA polimerasa inclouen: a. Buscar els llocs del promotor. b. Desenrotllar fragments curts del DNA. c. Detectar els senyals de terminació. d. a i c. e. a, b, i c. L’estructura del DNA ha d’estar ________________ perquè tingui lloc la
transcripció. a. Complex en el promotor tancat. b. Complex en el promotor obert.
Quines de les següents afirmacions caracteritzen millor la terminació de la
transcripció? a. Les seqüències senyal de terminació de la transcripció es troben a dins
del transcrit. b. Les seqüències senyal es troben en el DNA aproximadament a 30 pb
més avall del lloc de terminació. c. La transcripció acaba quan la polimerasa arriba a un codó d’stop. d. La transcripció acaba quan la polimerasa arriba al promotor del gen
adjacent. e. La transcripció acaba quan la polimerasa arriba al codó d’inici del gen
següent.
On té lloc la regulació de l’expressió gènica en procariotes? Punts de control.
Expessió gènica constitutiva. És la que es dona en tots aquells gens que es necessiten contínuament. Factor Sigma.
Expressió gènica regulada, que depèn de la influencia de proteïnes reguladores: inducció i repressió
GENDNA
TranscripcióNucleòtids
Trànscrit primari
RNAm madur
Traducció
Modificaciópostraducció
Direccionament de laproteïna i transport
Degradacióproteica
AminoàcidsProteïna(inactiva)
Proteïnamodificada(activa)
GENDNA
TranscripcióNucleòtids
Trànscrit primari
RNAm madur
Traducció
Modificaciópostraducció
Direccionament de laproteïna i transport
Degradacióproteica
AminoàcidsProteïna(inactiva)
Proteïnamodificada(activa)
Regulació de l’inici de la transcripció a bacteris
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”
Diferents subunitats sigma, que reconeixen seqüències diferents, són essencials per l’iniciació de la transcripció
σ 70 reconeix el promotor estàndard “housekeeping” per les funcions bàsiques de la cèl·lula.
Altres subunitats sigma alternatives controlen operons específics que s’activen en determinades condicions d’estrès o de creixement:
σ 32 reconeix el promotor de xoc tèrmic.
σ 54 reconeix el promotor de proteïnes que usen fonts alternatives de nitrogen.
Variacions de les seqüències promotores respecte de la consens i la utilització de diferents subunitats σ ja és una forma de regulació gènica específica.
- Regulació a través de proteïnes reguladores
model regulació positiu
model regulació negatiu
- Concepte d’Operó
- Operons lac i triptofen : models de regulació
Expressió gènica regulada en E. coli
Patrons de regulació de l’inici de transcripció a procariotes. Regulació positiva.
Una molècula senyal (efector) causa dissociació de la proteïna activadora de l’DNA, inhibint la transcripció.
L’activador facilita la transcripció unint-se a la seqüència reguladora.
L’activador s’uneix a l’DNA si esta associat a una molècula senyal (efector) i llavors activa la transcripció.
molècula senyal
Quan disminueix la conc. De la molècula senyal causa dissociació de la proteïna activadora de l’DNA. Ex. Proteïna CAP operó lactosa.
Adaptat de l’Alberts i col. “Biologia Molecular de la Célula”
Patrons de regulació de l’inici de transcripció a
procariotes. Regulació negativa per proteïnes repressores
El repressor s’uneix al DNA només si esta associat a una molècula senyal (efector) i llavors inhibeix la transcripció.
El repressor per si sol s’uneix al DNA (seqüència de l’ “operador”) i inhibeix la transcripció.
Una molècula senyal (efector) causa la dissociació de la proteïna repressora del DNA i permet la transcripció. Ex. Proteïna repressora operó Lactosa.
molècula senyal
Quan disminueix la conc. De la molècula senyal causa dissociació de la proteïna repressora de l’DNA. Ex. Proteïna repressora operó triptofan.
Adaptat de l’Alberts i col. “Biologia Molecular de la Célula”
Lloc d’unió del repressor
(operador)
Lloc d’unió de l’activador
Seqüències reguladores Gens transcrits com una unitat
Operó procariota: centre operador, gens reguladors i gens estructurals
• La majoria de gens procariotes estan agrupats i es regulen en “operons”. • Un operó està constituït per un grup de gens estructutrals, un promotor i seqüències addicionals que funcionen conjuntament en la regulació. • Generalment el transcrit d’un operó és un RNAm policistrònic.
RNAm policistrònic.
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”
1960 François Jacob Jaques Monot
L’operó Lac conté: - 3 gens estructurals: Galactosidasa Permeasa Transacetilasa -un promotor per aquests gens. -sequències reguladores (operador i CAP site) -una seqüència que codifica per un repressor “i” i el seu promotor que controla la seva l’expressió.
Gens estructurals de l’operó lac
La activació de l’Operó lac permet la utilització de la lactosa com a única font de carboni
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”
esquerre i......
Exemple de regulació en procariotes Operó lac
El objectiu de la regulació és modificar la transcripció de l’operó lac, amb dues molècules senyal que són clau: alol·lactosa i AMPc.
Control negatiu L’element de regulació és una proteïna repressora unida al DNA que quant s’uneix a la alol.lactosa, perd afinitat per l’DNA i permet la transcripció. Control positiu L’element de regulació és un activador, CRP o proteïna receptora d’AMPc (CAP, catabolit gene activator) que quant s’uneix a l’AMPc activa la transcripció.
McKee 2003, 1ª ed.
L’operó lac és regulat negativament
mRNA policistrònic
b-Galactosidasa
Permeasa
Transacetilasa
El repressor unit a l’operador no hi ha transcripció
La regulació de l’Operó lac té lloc a nivell de l’operador.
Promotor (unió de la RNA polimerasa) Inici de transcripció
Operador (unió del repressor lac)
Seqüència del promotor Lac
DNA
Seqüència simètrica Repressor 2 dímers
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”
Inici de la transcripció (I)
Dos dímers del repressor lac s’uneixen a l’operador
principal i a un dels dos llocs secundaris, formant un llaç
Creixement de bacteris en presència de glucosa i lactosa
Activitat β-
galactosidasa
Fenomen de repressió catabòlica
Això és deu a que hi un segon control a través de la proteïna reguladora CAP (catabolite activator protein o proteïna receptora d’AMPc).
Jaques Monod
1941
Regulació positiva de l’operó lac a través de la proteïna CRP o CAP (cAMP receptor protein)
el lloc CRP-AMPc
és palindròmic
Unió a l’RNA polimerasa Domini d’activació
cAMP
DNA unit a l’homodímer CRP (cAMP receptor protein)
Glucosa Baixa AMPc alt CRP unit AMPc Unió a DNA Activació transcripció
Motiu hèlix-turn-hèlix
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”, de l’Alberts “Biologia Molecular de la Célula” i del Stryer i col.“Bioquímica”
Acció combinada de glucosa i lactosa en l’operó lac
Glucosa AMPc
Glucosa AMPc
Raonament: Hi ha transcripció quan hi ha poca glucosa Primer s’aprofita la glucosa i després la lactosa
Paper del cAMP
El repressor sempre esta lligat. Perquè hi hagi activació és necessari que hi hagi lactosa i a més la unió de CRP
Adaptat de Lehninger i col. “Principles of Biochemistry”
Model “dual” de regulació:
L’operó es transcriu perquè CAP està unida i no hi ha repressor.
L’operó no es transcriu perquè CAP no està unida, encara que el repressor no està unit.
L’operó no es transcriu perquè el repressor està unit i CAP no està unida.
L’operó no es transcriu perquè està unit el repressor, a pesar de que CAP està també unida.
Adaptat de l’Alberts i col. “Biologia Molecular de la Célula”
Exemple de control negatiu:
operó del triptòfan
Nivell baix triptòfan Nivell alt triptòfan
Enzims per la biosíntesi de triptòfan.
Adaptat de l’Alberts i col. “Biologia Molecular de la Célula”
La unió del triptòfan augmenta la distància entre les dues hèlix de reconeixement, canvi de conformació i unió a l’DNA.
Indiqueu si les següents afirmacions són vertaderes o falses: • Els gens procariotes poden estar organizats en forma d’operons, no tenen
introns ni es poliadenilen i solen ser policistrònics. • Un operó és un conjunt de senyals reguladores que controlen la
transcripció d’un conjunt de gens estructurals adjacents, tots sota el control d’un únic promotor.
• La proteïna CAP (catabolite activator protein) activa l’expressió de l’operó Lac quan s’uneix a l’AMPc.
• Els promotors són seqüències que regulen el lloc en el que s’inicia la transcripció d’un gen i la freqüència de la seva expressió bassal.
• Quan hi ha nivells elevats de triptòfan, el repressor del triptòfan està unit a l’operador i bloqueja l’accés de la RNA polimerasa al promotor. És tracta d’un exemple de regulació negativa.