20.05.2015
1
LEUKEMIER
Klassifiseringog
Diagnostisk immunfenotyping
1
Leukemi
• Klonal sykdom av hematologiske stamceller.
• Deling av den leukemiske stamcellen fører tilopphopning av umodne blodceller og hemming av de friske stamcellene.
• Kan fører til benmargsvikt med bl.a:
lave trombocytter-blødning
lav Hb
Infeksjonstendens
• Generell sykdomsfølelse, fatigue
2
20.05.2015
2
Hvor begynner vi?WHO- klassifikasjon
3
EiKKr
KreftregisteretNye tilfeller
2007 2012 2013
515 886 997
4
20.05.2015
3
Klassifisering av leukemier
• FAB - Fransk-Amerikansk-Britisk gruppe(1976) basert på morforlogi og immunhistokjemi.
• EGIL - European Group for Immunolgisk klassifisering av leukemier, 1995?- basert på immunfenotype.
• WHO 2008 – Stor internasjonal arbeidsgruppe. Basert på morfologi, cytogenetikk, molekylærgenetikk og flowcytometri.
(REAL -klassifisering av lymfoid neoplasi 2004)
5
Leukemi inndeling• Akutte leukemier
-AML Akutt Myelogen Leukemi (barn og voksne)
-ALL Akutt Lymfoblastisk Leukemi (barn og voksne) Lymfoblastlymfom (voksne)
• Kroniske Leukemier-MNP Myeloproliferative Neoplasier
KML Kronisk Myelogen Leukemi (voksne)
-Lymfoproliferative sykdommerKLL Kronisk Lymfatisk Leukemi (eldre voksne)
• MDS Myelodysplastisk syndrom
6
20.05.2015
4
FAB-klassifisering
AML• Mo- udifferensiert
• M1- uten modningstegn
• M2- med modningstegn
• M3- hypergranulærpromyelocytt
• M4- myelomonocytt
• M5- monoblast
• M6- erytroleukemi
• M7- megakaryoblast
• Andre sjeldne (eosinofili, NK-celle)
ALL
• L1- cytoplasmafattige, små blaster
• L2- mer heterogent med henblikk på cytoplasmarikdom og størrelse
• L3- blaster med basofiltvakuolisert cytoplasma
7
EGIL/FAB klassifikasjon av AML8
Best Practive & ResearchClin Haemat, 2003, 561
20.05.2015
5
EGIL-klassifikasjon av B-ALL9
Best Practive & ResearchClin Haemat, 2003, 561
EGIL-klassifikasjon av T-ALL 10
Best Practive & ResearchClin Haemat, 2003, 561
20.05.2015
6
WHO klassifisering av AML
• AML med genetiske abnormaliteter9 undergrupper
• AML med myelodysplasi relasjon
• AML behandlingsrelatert
• AML NOS (not otherwise specified)11 undergrupper
• Myeloid sarcoma• Myeloid proliferasjon relatert til Downs syndrom
2 undergrupper
11
WHO klassifisering av ALLPrecursor lymfoid neoplasi
• B lymfoblastisk leukemi/lymfom NOS
• B lymfoblastisk leukemi/lymfom med genetiske abnormaliteter.7 undergrupper
• T lymfoblastisk leukemi/lymfom
12
20.05.2015
7
Acute leukemias of ambiguous lineage
• AUL, akutt udifferensiert leukemi
• MPAL, Mixed Phenotype Akutt leukemi (bifenotypisk)5 undergrupper
13
MorfologiAuerstaver
Monocytt - esteraseMyeloperoxidase
MGG
14
20.05.2015
8
Eksempel på ulike teknikker
A: MGG farging B/M utstryk
B: Flowcytometri
C: Cytokjemi
D: Cytogenetikk
E: Molekylærgenetikk: FISH
15
Blood, 2008 111;3941-3967
Hva er flowcytometri?
• Måling av celler i væskestrømCellestørrelse
Celleform
Kompleksitet
Fluorescens
Karakterisere proteiner som er uttrykt på overflaten,i cytoplasma eller i kjernen på celler.
16
20.05.2015
9
Hva kan måles med flowcyometri?17
ALL
Perifert blodBeinmarg
18
20.05.2015
10
Hvordan
• Antistoff / antigenbinding
• Lysspredning
• Fluorescens
19
Antistoff / antigenbinding
Membran receptor
Nucleære antigen
Cytoplasmatiske antigen
Cellulære antigen
AntistofferMonoklonale antistoff konjugert med fluorokrom (f.eks FITC, PE osv.)
CD-markører
20
20.05.2015
11
Lysspredning FCS/SSC
Malign populasjon?
21
22
Fluorescens
Hvert fluorokrom har sitt spesifikke exitasjon- og emmisjonsspekter
20.05.2015
12
23
Fluorescens intensitet
Fluorokromer24
Laser
BD Horizon™ V450 (Em-Max 448 nm)
Pacific Blue™ (Em-Max 452 nm)AmCyan (Em-Max 491 nm) BD Horizon™ V500 (Em-Max 500 nm) Alexa Fluor® 488 (Em-Max 519 nm).FITC (Em-Max 520 nm)
R-PE (Em-Max 578 nm),.PE-Texas Red® (Em-Max 615 nm) Texas Red® (Em-Max 620 nm) APC (Em-Max 660 nm), PE-Cy™5 (Em-Max 667 nm) Alexa Fluor® 647 (Em-Max 668 nm).PerCP (Em-Max 678 nm) PerCP-Cy™5.5 (Em-Max 695 nm) Alexa Fluor® 700 (Em-Max 723 nm).APC-Cy™7 (Em-Max 785 nm) APC-H7 (Em-Max 785 nm) PE-Cy™7 (Em-Max 785 nm)
Flere lasere: Opplysning om inntil 10 parametere på hver celle
20.05.2015
13
25
Flowcytometrisk Immunfenotyping
Granulocytter
Monocytter
Lymfocytter
Granulocytter
Monocytter
LymfocytterErytroide forstadier
Erytroide forstadier
”Blastregionen”
Benmarg
SSC/CD45-gatingSSC/FSC-gatingEosinofile
Liv T.N. Osnes
Normal AML ALL ALL
Normal benmarg vs AML vs ALL
Grønn populasjon :Blaster
26
M H Fenstad
20.05.2015
14
Immunfenotype
• Avvik fra normalmønster
• Linjetilhørighet av patolologisk populasjonLymfoid –B eller T, Myeloid
• Akutt eller kroniskSubklassifisering - betydning for behandling/prognose
• Markørkombinasjonerviktig for oppfølging av MRD
27
Immunfenotyping av leukemi
• Konsensuspaneler
• NOPHO/NFCG (nordisk samarbeid)• Felles 6-farge-panel for B-ALL og T-ALL til diagnostikk og MRD
deteksjon
• Fra 2008 har FCM-MRD-funn behandlingsmessig konsekvens
• EMN02 Myelomatose MRD European Myeloma Network (2012)
• EuroFlowJuni-09: Forslag til 8-farge-FCM-paneler for de aller fleste diagnoser (www. EuroFlow.org)
28
20.05.2015
15
Etikett: Dato:
Materiale:Sign lege(r): Prøve tatt: kl:
Prøve analysert: kl:
WBC: x109/L
WBC/analyserør: x106/rør
Kommentar:
Filene exportert til X:\
Sign bioing:
Ekstra Rør FITC µl PE µl
PerCP-CY5.5 µl PE-Cy7 µl APC µl
APC-H7 APC-Cy7 µl
P B / HRZ V450 µl
HRZ V500 µl
Antall events
1CD8 og Lambda
2,5 5
CD56 og kappa
2,5 5
CD19 og TCRgd 2,5 CD3 2,5 CD38 2,5
CD20 og CD4 2,5 CD45 2,5 50000 (LST)
2 CD36 5 CD64 10 CD34 5 CD117 5 CD33 5 CD14 5 HLADR 2,5 CD45 2,5 50000(rør 2 AML
3 cy MPO 5 cy CD79a 5 CD34 5 CD19 2,5 CD7 5 CD3 2,5 cy CD3 2,5 CD45 2,5 50000 (ALOT)
ALOT rør: Før merking må prøven lyseres vha Ammoniumklorid ( NH4Cl). Vask to ganger før vanlig prosedyre for intracellulær merking følges.Benytt intracellulær metode til antistoffer med rød skrift
LST: Benytt 25 µl av mix, tilsett PerCP-Cy5:5, PE-Cy7 og APC-Cy7/H7 i tillegg Tilhører EQS-prosedy re 8482 "Immunfenoty ping v ed flow cy tometri"
Antistoff kombinasjon
8-farge Screening
Panel for screening29
Immunologiske linjemarkører
• Acute leukemia orientation tube (ALOT) (EuroFlow)
ALL, AML, akutt udifferensiert leukemi
B-cellerCD19/CD79a
T-cellerCD7/CD3/cyCD3
Myeloide celler:cyMPO/ (CD13/CD33)
30
Liv T.N. Osnes
20.05.2015
16
Mistanke om leukemi31
Erasmus MC,
32
Litt til nå….!
20.05.2015
17
33
• Leukemi-assosiert fenotype (LAPs)– Umodne celler
(eks CD34, CD117, TdT)
– Asynkron/abberant markør ekspresjon(eks: dobbelpositive CD13-CD7, CD13-CD19)
– Antigen overekspresjon
– Fravær av linjespesifikke markører(spes T-ALL CD7+/CD3-)
– Unormal lysspredning(FSC/SSC)
Minimal residual disease(MRD)
• Molekylært/cytogenetisk/immunfenotypiskbevis for rest-sykdom
• Rest-sykdom kan ikke påvises ved vanlig mikroskopering (morfologisk remisjon:<5% leukemiceller)
• Flow cytometri– Sensitivitet <0,01% (hvis nok celler)– Abberant fenotype (viktig redskap i MRD oppfølging)
34
20.05.2015
18
35
Flowcytometrisk immunfenotyping
• Identifisering av celletype– B- vs T-celle, myeloid– Moden vs umoden– Myeloid vs lymfoid
forstadium
• Kvantitering– Mengde/dominans av
maligne celler
• Karakterisering– Abberante fenotyper– Prognose– Monitorering
• Konklusjon
Normal? �+ leg �+arm �+ mouth�+ eyes
FC Analysis: Abnormal!
�The legs don’t go witharms, eye or mouth
�Decrease in eyes
36
20.05.2015
19
37
Takk for oppmerksomheten ! 38