1
Mikroskopije
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Sestava aparature za slikanje
Interakcija med snovjo in valovanjem (delci)
OPAZOVANA SNOV / PRIPRAVA VZORCA
IZVORvalovanja (delcev)
„OPTIKA“
„OPTIKA“
DETEKTOR
2
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Primerjaj med metodami!!
• občutljivost
• razmerje signal/šum
• dinamični razpon
• prostorska ločljivost
• časovna ločljivost
• osnovni princip nastanka slike
• pogoji priprave opazovanega sistema
• komponente aparatur oz. opreme
Kontrast –zaznavanje robov/mej!!!
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Mikroskopija
• Pred očesom potrebujemo vmesnik, ki poveča sliko ! Slednja pomeni povečane razdalje med deli slike oz. povečanimi koti !
• Še vedno gledamo krajevno odvisno absorbcijo svetlobe !
• V vsaki točki slike zbiramo svetlobo – iz vseh optičnih ravnin in
– različnih valovnih dolžin !
• Kontrast pomeni razliko v inteziteti v dveh točkah slike !
3
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
okular kot povečevalno steklo
Povečava mikroskopa
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Primeri slik optične mikroskopije
majhni organizmi,organi(6x, ~ 100 m)
1 mm = 1000 m
posamezne celice(1000x, ~ 1 m)
tkiva(600x, ~ 10 m)
4
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Poljubno velika povečava nam ne da poljubno velike ločljivosti!!
GEOMETRIJSKA OPTIKA VALOVNA OPTIKA
Povečava vs. ločljivost
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
*
točkast izvorsvetlobe
....
Airyjev disk
Uklon na eni reži in interferenčni vzorec
5
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
dva točkasta izvora (S1, S2)
S1 max. S2 (1.) min.
y … lateralna ločljivost
Rayleighjev kriterij
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Meja ločljivosti pri optičnem mikroskopu
kot zajema (kotna apertura)
y ≈ 0.61 / sin
y bo manjši za nižje in večje
6
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
y = 0.61 / (n sin) == 0.61 / NA
NA ... numerična apertura
imerzijska mikroskopija /n
(n ... lomni količnik)
y ≈ 200 nm ≈ /2
= 450 nmn = 1.5 = 70°
Kako lahko povečamo ločljivost
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
z ≈ 2 y
3D Airyjev vzorec 2D Airyjev vzorec
Lateralna vs. aksialna ločljivost
7
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Različni načini izvedbe presevne optične mikroskopije
Metode za neobarvane vzorce!!
Svetlobna mikroskopija eritrocitov
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Mikroskopija s svetlim poljem
8
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Mikroskopija s temnim poljem
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Fluorescenčna mikroskopija
• Ne gledamo absorpcije vse svetlobe, temveč le tisto, ki se absorbira na fluorescenčnih označevalcih, ki svetlobo absorbirajo ter jo nato emitirajo pri višji valovni dolžini (nižji energiji) !
svetlo polje fluorescenca
9
Fluorescenčna mikroskopija celic; sestavljena slika iz slik citoskeleta, jedra in membran
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
10 µm
0 s 5 s 10 s 15 s
dinamika membranskih domen na orjaških lipidnih vesiklih
Časovna ločljivost
10
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Konfokalna mikroskopija
• Dodatna drobna zaslonka zbira svetlobo le iz izbrane optične ravnine !
• V vsaki točki slike zbiramo svetlobo
– iz ene same izbrane optične ravnine in
– različnih valovnih dolžin !
• Kontrast pomeni razliko v intezitetiv dveh točkah slike v eni optični ravnini !
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
fluorescenca konfokalna fluor.
z 6 m
11
Spektroskopija
• Ne zanima nas, od kje prihaja svetloba, temveč kakšna je !
• Gledamo spekter ! Iz celotne slike zbiramo svetlobo in jo analiziramo pri različnih valovnih dolžinah !
• Kontrast pomeni razliko spektralne gostote pri dveh podobnih valovnih dolžinah !
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Konfokalna mikrospektroskopija
• Na detektorju zmoremo ločiti svetlobo različnih valovnih dolžin !
• Gledamo krajevno odvisno absorbcijo spektra svetlobe ! Ne zanima nas le intenziteta spektra, temveč posamezni deli spektra oz. spektralna gostota, ki se s krajem spreminja !
• Kontrast pomeni katerikoli razliko v spektru v dveh točkah slike !
12
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
konfokalno mikrospektroskopija
500 550 600
Fluorescen
ce intensity (a.u.)
Wavelength (nm)
Membrane probe
Nanoparticles
IR in ramanska mikrospektroskopija
• Na detektorju zmoremo ločiti svetlobo različnih valovnih dolžin v IR področju!
• Gledamo krajevno odvisno absorbcijo IR ali Ramanskega spektra! Zanimajo nas posamezni deli spektra, npr. slika v izbranem vibracijskem načinu določene kemijske skupine !
• Kontrast pomeni katerikoli razliko v spektru v dveh točkah slike !
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
y = 0.61 / (n sin) == 0.61 / NA
NA ... numerična apertura
IR vs. Raman
13
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
KONCEPT vibracijske MIKROSPEKTROSKOPIJE!!!V vsaki točki slike zajamemo celoten vibracijski spekter.To pomeni, da lahko kontrastiramo sliko preko lokalizacije različnih molekulskih skupin (kemično mapiranje). Intenziteta barve lahko pomeni lokalno koncentracijo neke snovi.
Pri SPEKTROSKOPIJI posnamemo povprečen vibracijski spekter vzorca.NI KRAJEVNE INFORMACIJE o razporeditvi komponent v vzorcu!!!
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Sklopitev FTIR spektrometra in mikroskopa
14
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Shema FTIR mikroskopa
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
vrstični mikroskop(zajem slike točko po točko)
mikroskop s FPA detektorjem(zajem celotne slike hkrati)
Možnosti za zajem slike
15
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
monokromatski izvorSTABILNOST!!!prostor za vzorce
posebni optični filtri!!!notch – (anti)Stokesedge - Stokes
spektrometer zdetektorjem
Shema Ramanskega mikroskopa
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
odvisnost od disperzijskih lastnosti uklonske mrežice
odvisnost od goriščne razdalje zrcal v spektrometru
Spektralna ločljivost - Raman
16
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Stimulated Raman Scattering Microscopy –Mikroskopija s stimuliranim ramanskim sipanjem
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
17
Ko svetlobo zamenjajo hitri delci
Zelo hitri delci se namreč obnašajo kot svetloba !
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Presevna elektronska mikroskopija (TEM)
• Gledamo krajevno odvisno (ne)sipanje hitrih elektronov !
• V vsaki točki slike zbiramo elektrone, ki se niso sipali na vzorcu, ki mora biti v vakuumu in na prevodnem nosilcu (da se vzorec ne nabija) !
• Kontrast pomeni razliko v sipanju elektronov v dveh točkah slike, ki je odvisna od mase sipalcev (jeder) !
lečaelektromagnetna
leča (tuljava,
kondenzator)
fosforna plošča
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
18
TEM Golgijevega aparata rastlinskih celic
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
Vrstična elektronska mikroskopija (SEM)
• Gledamo krajevno odvisno emisijo sekundarno vzbujenih elektronov zaradi trkov z elektroni zelo ozkega snopa!
• Kontrast pomeni razliko v intenziteti sekundarnih elektronov v dveh točkah slike, ki je odvisna od mase sipalcev in njihove elektronske strukture!
elektromagnetna leča kot objektiv
elektromagnetna leča kot deflektor
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini
19
SEM izvornih celic
Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini