Transcript
Page 1: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

1

Mikroskopije

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Sestava aparature za slikanje

Interakcija med snovjo in valovanjem (delci)

OPAZOVANA SNOV / PRIPRAVA VZORCA

IZVORvalovanja (delcev)

„OPTIKA“

„OPTIKA“

DETEKTOR

Page 2: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

2

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Primerjaj med metodami!!

• občutljivost

• razmerje signal/šum

• dinamični razpon

• prostorska ločljivost

• časovna ločljivost

• osnovni princip nastanka slike

• pogoji priprave opazovanega sistema

• komponente aparatur oz. opreme

Kontrast –zaznavanje robov/mej!!!

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Mikroskopija

• Pred očesom potrebujemo vmesnik, ki poveča sliko ! Slednja pomeni povečane razdalje med deli slike oz. povečanimi koti !

• Še vedno gledamo krajevno odvisno absorbcijo svetlobe !

• V vsaki točki slike zbiramo svetlobo – iz vseh optičnih ravnin in

– različnih valovnih dolžin !

• Kontrast pomeni razliko v inteziteti v dveh točkah slike !

Page 3: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

3

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

okular kot povečevalno steklo

Povečava mikroskopa

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Primeri slik optične mikroskopije

majhni organizmi,organi(6x, ~ 100 m)

1 mm = 1000 m

posamezne celice(1000x, ~ 1 m)

tkiva(600x, ~ 10 m)

Page 4: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

4

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Poljubno velika povečava nam ne da poljubno velike ločljivosti!!

GEOMETRIJSKA OPTIKA VALOVNA OPTIKA

Povečava vs. ločljivost

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

*

točkast izvorsvetlobe

....

Airyjev disk

Uklon na eni reži in interferenčni vzorec

Page 5: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

5

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

dva točkasta izvora (S1, S2)

S1 max. S2 (1.) min.

y … lateralna ločljivost

Rayleighjev kriterij

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Meja ločljivosti pri optičnem mikroskopu

kot zajema (kotna apertura)

y ≈ 0.61 / sin

y bo manjši za nižje in večje

Page 6: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

6

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

y = 0.61 / (n sin) == 0.61 / NA

NA ... numerična apertura

imerzijska mikroskopija /n

(n ... lomni količnik)

y ≈ 200 nm ≈ /2

= 450 nmn = 1.5 = 70°

Kako lahko povečamo ločljivost

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

z ≈ 2 y

3D Airyjev vzorec 2D Airyjev vzorec

Lateralna vs. aksialna ločljivost

Page 7: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

7

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Različni načini izvedbe presevne optične mikroskopije

Metode za neobarvane vzorce!!

Svetlobna mikroskopija eritrocitov

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Mikroskopija s svetlim poljem

Page 8: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

8

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Mikroskopija s temnim poljem

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Fluorescenčna mikroskopija

• Ne gledamo absorpcije vse svetlobe, temveč le tisto, ki se absorbira na fluorescenčnih označevalcih, ki svetlobo absorbirajo ter jo nato emitirajo pri višji valovni dolžini (nižji energiji) !

svetlo polje fluorescenca

Page 9: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

9

Fluorescenčna mikroskopija celic; sestavljena slika iz slik citoskeleta, jedra in membran

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

10 µm

0 s 5 s 10 s 15 s

dinamika membranskih domen na orjaških lipidnih vesiklih

Časovna ločljivost

Page 10: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

10

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Konfokalna mikroskopija

• Dodatna drobna zaslonka zbira svetlobo le iz izbrane optične ravnine !

• V vsaki točki slike zbiramo svetlobo

– iz ene same izbrane optične ravnine in

– različnih valovnih dolžin !

• Kontrast pomeni razliko v intezitetiv dveh točkah slike v eni optični ravnini !

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

fluorescenca konfokalna fluor.

z 6 m

Page 11: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

11

Spektroskopija

• Ne zanima nas, od kje prihaja svetloba, temveč kakšna je !

• Gledamo spekter ! Iz celotne slike zbiramo svetlobo in jo analiziramo pri različnih valovnih dolžinah !

• Kontrast pomeni razliko spektralne gostote pri dveh podobnih valovnih dolžinah !

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Konfokalna mikrospektroskopija

• Na detektorju zmoremo ločiti svetlobo različnih valovnih dolžin !

• Gledamo krajevno odvisno absorbcijo spektra svetlobe ! Ne zanima nas le intenziteta spektra, temveč posamezni deli spektra oz. spektralna gostota, ki se s krajem spreminja !

• Kontrast pomeni katerikoli razliko v spektru v dveh točkah slike !

Page 12: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

12

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

konfokalno mikrospektroskopija

500 550 600

Fluorescen

ce intensity (a.u.)

Wavelength (nm)

Membrane probe

Nanoparticles

IR in ramanska mikrospektroskopija

• Na detektorju zmoremo ločiti svetlobo različnih valovnih dolžin v IR področju!

• Gledamo krajevno odvisno absorbcijo IR ali Ramanskega spektra! Zanimajo nas posamezni deli spektra, npr. slika v izbranem vibracijskem načinu določene kemijske skupine !

• Kontrast pomeni katerikoli razliko v spektru v dveh točkah slike !

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

y = 0.61 / (n sin) == 0.61 / NA

NA ... numerična apertura

IR vs. Raman

Page 13: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

13

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

KONCEPT vibracijske MIKROSPEKTROSKOPIJE!!!V vsaki točki slike zajamemo celoten vibracijski spekter.To pomeni, da lahko kontrastiramo sliko preko lokalizacije različnih molekulskih skupin (kemično mapiranje). Intenziteta barve lahko pomeni lokalno koncentracijo neke snovi.

Pri SPEKTROSKOPIJI posnamemo povprečen vibracijski spekter vzorca.NI KRAJEVNE INFORMACIJE o razporeditvi komponent v vzorcu!!!

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Sklopitev FTIR spektrometra in mikroskopa

Page 14: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

14

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Shema FTIR mikroskopa

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

vrstični mikroskop(zajem slike točko po točko)

mikroskop s FPA detektorjem(zajem celotne slike hkrati)

Možnosti za zajem slike

Page 15: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

15

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

monokromatski izvorSTABILNOST!!!prostor za vzorce

posebni optični filtri!!!notch – (anti)Stokesedge - Stokes

spektrometer zdetektorjem

Shema Ramanskega mikroskopa

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

odvisnost od disperzijskih lastnosti uklonske mrežice

odvisnost od goriščne razdalje zrcal v spektrometru

Spektralna ločljivost - Raman

Page 16: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

16

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Stimulated Raman Scattering Microscopy –Mikroskopija s stimuliranim ramanskim sipanjem

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Page 17: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

17

Ko svetlobo zamenjajo hitri delci

Zelo hitri delci se namreč obnašajo kot svetloba !

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Presevna elektronska mikroskopija (TEM)

• Gledamo krajevno odvisno (ne)sipanje hitrih elektronov !

• V vsaki točki slike zbiramo elektrone, ki se niso sipali na vzorcu, ki mora biti v vakuumu in na prevodnem nosilcu (da se vzorec ne nabija) !

• Kontrast pomeni razliko v sipanju elektronov v dveh točkah slike, ki je odvisna od mase sipalcev (jeder) !

lečaelektromagnetna

leča (tuljava,

kondenzator)

fosforna plošča

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Page 18: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

18

TEM Golgijevega aparata rastlinskih celic

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Vrstična elektronska mikroskopija (SEM)

• Gledamo krajevno odvisno emisijo sekundarno vzbujenih elektronov zaradi trkov z elektroni zelo ozkega snopa!

• Kontrast pomeni razliko v intenziteti sekundarnih elektronov v dveh točkah slike, ki je odvisna od mase sipalcev in njihove elektronske strukture!

elektromagnetna leča kot objektiv

elektromagnetna leča kot deflektor

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

Page 19: Mikroskopijelbf.ijs.si/Biofizika/SlikovneTehnike/mikroskopije_zoran.pdf · 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov

19

SEM izvornih celic

Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini