SEQENCIAMENTO DE DNA: MTODOS E PRINCPIOSCristiane Kioko
Shimabukuro DiasPs-doutorado - FAPESP E-mail:
[email protected]
Laboratrio de Biologia e Gentica de Peixes - Departamento de
Morfologia Instituto de Biocincias UNESP Botucatu (SP)
DEFINIO DEFINI Determinar a seqncia de nucleotdeos
Seqenciamento de DNA
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HISTRICO HIST 1953 - Watson e Crick
Modelo dupla hlice do DNASeqenciamento de DNA
HISTRICO HIST Dcada de 70
Seqenciamento de DNA
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MTODOS CLSSICOS CL 1977 Seqnciamento de DNA Maxam e Gilbert -
mtodo de degradao qumicaTratamento com substncias qumicas que
cortam a molcula de DNA em nucleotdeos especficos
Sanger et al. - mtodo enzimtico, dideoxi ou de trmino da
cadeiaSntese enzimtica de uma fita complementar, cujo crescimento
interrompido pela adio de um dideoxinucleotdeo
Seqenciamento de DNA
MTODO DE DEGRADAO QUMICA DEGRADA QU
enzima de restrio
X X
X
aquecimento e purificao
Seqenciamento de DNA
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MTODO DE DEGRADAO QUMICA DEGRADA QU
Especificidade de bases
Qumico usado para Qumico usado para Qumico usado para a alterao
de bases remoo de bases clivagem da fita
G A+G C+T C A>C
Dimetilsulfato cido Hidrazina Hidrazina + lcali lcali
Piperidina cido Piperidina Piperidina Piperidina
Piperidina Piperidina Piperidina Piperidina Piperidina
Seqenciamento de DNA
MTODO DE DEGRADAO QUMICA DEGRADA QUG A+G C+T C
Seqenciamento de DNA
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MTODO ENZIMTICO ENZIM
DNA fita simples
DNA polimerase primer
Animao
Seqenciamento de DNA
MTODO ENZIMTICO ENZIM X MTODO DE DEGRADAO QUMICA DEGRADA QU
Seqenciamento de DNA
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Mtodos de seqenciamento manual
Mtodo enzimtico mais utilizado, seqenciamento de genomas,
automao
Mtodo de degradao qumica substncias qumicas, caracterizao de
oligonucleotdeos ou no seqenciamento de estruturas ricas em GC
Seqenciamento de DNA
SEQENCIAMENTO MANUAL SEQ
Seqenciamento de DNA
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SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM
Seqenciamento de DNA
SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM Anos 80 seqenciador
semi-automtico Substituio das tcnicas de deteco por radioatividade
pelo uso de marcadores fluorescentesRadioistopos danosos sade,
dificuldade de automao Fluorfos sistema de deteco que permite a
leitura automtica das seqncias
Preparao do gel e aplicao das amostras Utilizao ddNTPs durante a
eletroforese fluorescentes lidos automaticamente
Corantes fluorescentes reaes no mesmo poo no gel
Seqenciamento de DNA
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SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOMSeqenciamento em ciclos ou por
amplificao linear
Seqenciamento de DNA
SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM
animao
Seqenciamento de DNA
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Seqenciamento de DNA
SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM
Anos 90 - Seqenciadores de capilares
Seqenciamento de DNA
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SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM Seqenciadores automticos avano
para a genmica,poucas centenas de pb
Seqenciadores de capilares completamente automatizados
duas vezes mais rpidos,
Associao de capilares preenchidos com gel a um sistema de deteco
atravs de fluorescncia confocal excitada por laser
Seqenciamento de DNA
SEQENCIAMENTO AUTOMTICO SEQ AUTOM
Seqenciamento de DNA
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Eliminao da montagem da placa e preparao do gel Aplicao das
amostras por eletroinjeo
Alta velocidade e resoluo na separao das amostras
Eliminao do retraqueamento
Seqenciamento de DNA
OUTRAS TCNICAS DE SEQENCIAMENTO T SEQ Piroseqenciamento
Seqenciamento por hibridao Colnias da polimerase Seqenciamento por
nanoporos Espectrometria de massa Massively Parallel Signature
Seuqencing
Determinao de SNP, reseqenciamento, anlise da expresso
gnicaSeqenciamento de DNA
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OUTRAS TCNICAS DE SEQENCIAMENTO T SEQPiroseqenciamento tempo
real, seqenciamento por sntese
Mtodo rpido, seqncias menores, genotipagem de SNP, tipagem
microbiana, reseqenciamento de genes para doenas e determinao da
seqncia de DNA com estruturas secundrias complexasSeqenciamento de
DNA
OUTRAS TCNICAS DE SEQENCIAMENTO T SEQSBH complementariedade de
pares de bases da molcula de DNA
(4n=5) = 1024Seqenciamento de DNA, reseqenciamento de DNA,
seqenciamento de novo e anlise da expresso gnicaSeqenciamento de
DNA
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OUTRAS TCNICAS DE SEQENCIAMENTO T SEQColnias da polimerase
colnias de DNA de 1 m de dimetro que crescem numa lmina para
microscopiaProduo das polnias Denaturao do DNA imobilizado Hibridao
de um primer universal Primeira reao de extenso Microscpio de
fluorescncia devarredura
Fluorescncia removida Ciclos sucessivos Seqncia de cada polnia
paralelo
Estgio inicial, reduo de custos; genotipagem e
haplotipagemSeqenciamento de DNA
APLICAES APLICA Anlise genmica
Haemophilus influenzae (1995)
Fago phiX174 (Sanger et al., 1977)
Homo sapiens (2003)
Seqenciamento de DNA
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APLICAES APLICAEstudo sistemtico dos genomas
Avano das tcnicas de seqnciamento
Automao
Equipamentos sofisticados e precisos
Grande quantidade de dadosSeqenciamento de DNA
APLICAES APLICA Genoma completo: 28 archebactrias, 357 bactrias
e 22 eucariotos
Seqenciamento de DNA
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APLICAES APLICA
Cincia forense
Anlise filogenticaSeqenciamento de DNA
APLICAES APLICAConservao de espcies
Epidemias virais
Seqenciamento de DNA
15
APLICAES APLICA
DNA barcoding
Genmica comparada
Descoberta de drogas
Screening gentico
Seqenciamento de DNA
OBRIGADA!Seqenciamento de DNA
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