Responsable : Nathalie DELESALLE
DIRECTION DES LABORATOIRES ET DES CONTROLES
Unité Produits Sanguins et Thérapie Cellulaire
2/ CONTRÔLE QUALITÉ DES TISSUS A L’AFSSAPS
15 novembre 2010
1
Contrôle qualité des tissus
I. Cornées
Choix : 2ème tissu le plus greffé en France, problème de pénurie en partie lié à la qualité.
II. Os (Têtes fémorales, Os massifs)
III. Autres tissus à développer : Membranes amniotiques, Valves, Vaisseaux (Veines et artères), Peau, Parathyroïdes
2
I- CORNÉES
I.1 Généralités
I.2 Bilan de l’inventaireI.2.1 Contrôle endothélial
I.2.2 Contrôle microbiologique
I.2.3 Conclusion de l’inventaire
I.3 Travaux à l’AfssapsI.3.1 Validation du Bact/AlertI.3.2 Etudes collaboratives : Contrôles microbiologiques
I.3.3 Contrôle de qualité externe : Milieux cornéens
I.3.4 Recueil des contaminations sur les contaminations bactériennes et fongiques
I.3.5 Contrôles endothéliaux: Etude multicentrique
I.3.6 Autres travaux et perspectives
3
I- CORNÉESI.1 Généralités
Epithélium
Mb Bowman
Stroma (90%)
Mb de Descemet
Endothélium
4
• PrélèvementDonneurs décédés (prélèvement à la morgue en majorité)
• Indications: – Opacités cornéennes avec baisse d’acuité visuelle:
• Perforation cornéenne (accident domestique, de voiture …)• Brulures chimiques (bases)
• Dégénérescence cornéenne : kératocône
• Kératites infectieuses : kératite herpétique, abcès bactérien, amibes
• Dystrophie bulleuse de la personne âgée : perte de cellules endothéliales cornéennes, elle peut être secondaire à des interventions chirurgicales (glaucome, cataracte) ou à l'altération constitutionnelle des cellules endothéliales
I- CORNÉESI.1 Généralités
5
•• 11èèrere greffegreffe : Eduard Konrad Zirm (1887-1944) réussit le premier une kératoplastie transfixiante
• 2 principales techniques de greffe :
– Kératoplastie transfixiante : remplacement de toute l’épaisseur de la cornée.
– Kératoplastie lamellaire (greffe partielle) : la cornée est greffée seulement sur sa partie antérieure l’épithélium et le stroma conservant l’endothélium du receveur ou sa partie postérieure
• 20 banques françaises de cornées
I- CORNÉESI.1 Généralités
6
I - CORNÉESOrganoculture (procédé simplifié)
Prélèvement des cornées :Mise en milieu de transport (Corneaprep, Corneamax)
Mise en milieu de conservation (Corneamax) Contrôle microbiologiqueet contrôle endothélial
Qualification du donneur
Mise en milieu de déturgescence (Corneajet) Contrôle microbiologiqueet contrôle endothélial
Greffe Contrôle microbiologique du milieu de déturgescence post greffe
Transport à la banque
Transport au site greffeur
Si donneur qualifié etContrôles conformes
Si Contrôles conformes
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I- CORNÉESI.2 Bilan de l’inventaire (2002-2003)
• Envoi d’un questionnaire pour inventorier les pratiques existantes (Fin 2002 - 2003)
• Hétérogénéité au sein des banques :
– Température de conservation des cornées (+31 ou +4°C)
– Durée de conservation (7 à 60 jours)
– Techniques de contrôle qualité du produit : contrôle endothélial (I.2.1 pour info)
– Techniques bactériologiques (milieux, durée d’incubation etc…) (I.2.2 pour info)
• Réel besoin de standardisation
8
I.2 Bilan de l’inventaire (2002-2003)I.2.1 Contrôle endothélial
• Comment ?– technique manuelle (réticule dans l’oculaire)– 45% des banques photographient les cornées lors du
contrôle (5 banques possèdent un analyseur d’image type SAMBA et les autres un capteur d’images ou un appareil photo fixé au microscope)
– étude histologique sur la collerette scléro-cornéenne(réalisée par 2 banques)
Coloration alizarine
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• Combien ?
95% des banques ⇒⇒⇒⇒ 2 contrôles endothéliaux
5% des banques ⇒⇒⇒⇒ un seul contrôle.1 contrôle peut être ajouté en cas de difficulté de l ecture lors du
premier contrôle ou si la durée de conservation néc essite un changement de milieu
• Quand ?– lors du passage en milieu de conservation
– lors du passage en milieu de déturgescence
I.2 Bilan de l’inventaire (2002-2003)I.2.1 Contrôle endothélial
10
Critères de qualité du greffon : Kératoplastie transfixante
• Densité cellulaire > 2000 cellules / mm2
≥ 1900 cellules par mm2 pour une banque
• Mortalité cellulaire <2% , <3% ou <10%
• Perte cellulaire après conservation < 20%
• Continuité cellulaire de la mosaïque
• Absence de polymorphisme (taille ou forme)
• Plis de Descemet peu nombreux
• Absence d’œdème
I.2 Bilan de l’inventaire (2002-2003)I.2.1 Contrôle endothélial
11
I.2 Bilan de l’inventaire (2002-2003)I.2.2 Contrôle microbiologique
• 1 à 5 contrôles selon les banques
– 1: Prélèvement ou Conservation
– 2: Prélèvement et Conservation
Prélèvement et Déturgescence
Conservation et Déturgescence
– 3: Prélèvement, 2 Conservation (J12, J20)
Prélèvement, Conservation, Déturgescence
Prélèvement, Déturgescence, Collerette
– 4: Prélèvement, Conservation, Déturgescence, Collerette
Prélèvement, 2 Conservation, Déturgescence
– 5: Prélèvement, 2 Conservation, Déturgescence, Collerette
Nombre de contrôles microbiologiques effectués
9,118,2
54,5
9,1 9,1
0%
20%
40%
60%
1 2 3 4 5Nombre de contrôles
Banq
ues
12
• Nature du prélèvement effectué :
– 100% des banques contrôlent les milieux de transport, de conservation ou de déturgescence
– En plus, 41% des banques ajoutent un contrôle microbiologique de collerette scléro-cornéenne récupérée lors de la greffe
I.2 Bilan de l’inventaire (2002-2003)I.2.2 Contrôle microbiologique
13
Géloses : chocolat polyvitex, Columbia, Schaedler, VL, TS
Bouillons : schaedler, cœur-cervelle, TGY thioglycolate, glucosé, tryptocaséine soja
Hémocultures : (Vital), Bactec, Bact/alert, BBL septi-chek
Type de milieux utilisés pour le contrôle bactériol ogique
40,9%
4,6%
54,5%
Milieux classiques solides etliquides
Hemoculture seule
Hemoculture associée à unmilieu liquide
45,5%
I.2 Bilan de l’inventaire (2002-2003)I.2.2 Contrôle microbiologique
14
Temps d'incubation des flacons d'hémoculture
20
10
50
20
0%10%20%30%40%50%60%
5 7 10 14Nombre de jours
Banq
ues
Bactec
Bactec et Bact/Alert
1Bactec, 2 Bact/Alert1VITAL, 1BBL
I.2 Bilan de l’inventaire (2002-2003)I.2.2 Contrôle microbiologique
15
• Ces milieux sont incubés : à température ambiante, +20/22°C, +30°C ou +35°C selon les banques
• 59% des laboratoires effectuent une recherche de levures et de
champignons sur milieux spécifiques (Sabouraud ou Bactec Mycosis)
Temps d'incubation des milieux spécifiques pour levures et champignons
8%
15%
8%
23%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
2 5 7 8 12 14 21 30
Nombre de jours
Ba
nque
s
2
5
Milieux Sabouraud
Bactec Mycosis
I.2 Bilan de l’inventaire (2002-2003)I.2.2 Contrôle microbiologique
16
I- CORNÉES
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPS
I.3.1 Validation du Bact/Alert
I.3.2 Etudes collaboratives
I.3.3 Contrôle de qualité externe
I.3.4 Recueil des contaminations
I.3.5 Etude multicentrique : contrôles endothéliaux
I.3.6 Autres travaux et perspectives
17
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPSI.3.1 Validation du Bact/Alert
• Validation de l’automate d’hémoculture BACT ALERT pour le contrôle microbiologique des milieux cornéens (2003-2004)
– 540 essais
– 31 souches bactériennes et fongiques
� Détection rapide de faibles contaminations
� Difficultés avec certaines moisissures : nécessité d’un milieu spécifique en complément
18
• Envoi de milieux cornéens contaminés pour évaluer les performances des méthodes utilisées pour le contrôle microbiologique des milieux de transport, de conservation ou de déturgescence dans le cadre de la greffe de cornée et optimiser les méthodes de contrôle
• 1ère étude en Juin 2004 = Etat des lieux des pratiques et observation de l’hétérogénéité des techniques utilisées.
• Depuis 11 autres études collaboratives avec les 20 banques de cornées (2/an) : 44 échantillons envoyés.
Sphingomonas paucimobilis, Acinetobacter baumanii, St reptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, S tenotrophomonas maltophilia, Ochrobactrum anthropi, Bacteroides fragilis, Brevundi monas vesicularis, Staphylococcushominis, Aerococcus viridans, Wautersia paucula, Rhiz obium radiobacter, Klebsiellapneumoniae, Enterococus faecium …
Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Rhodotoru la rubra, Candida albicans, Penicillium expansum, Fusarium solani, Scedosporium a piospermum, Absidiacorymbyfera, Cladosporium apiospermum, Aspergillus f umigatus, Aspergillus niger …
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPSI.3.2 Etudes collaboratives
19
Hémoculture : Méthode plus sensible et Délai de dét ection plus rapide pour la cession du greffon grâce à une « quarantaine microbiologique » réduite.
Importance de l’utilisation d’un milieu spécifique à la recherche des champignons et des levures àune température adaptée
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPS I.3.2 Etudes collaboratives
Graphique 1: Evolution des techniques
0
20
40
60
80
100
juin-04
avr-05
sept-05
avr-06
sept-06
avr-07
sept-07
avr-08
sept-08
mai-09
sept-09
avr-10
%
Hémoculture manuelle ou automatisée
Microbiologie conventionnelle (géloses ou milieux liquides)
Milieux spécifiques des champignons toutes méthodes confondues
36% pos
75% pos
20
• Pas de faux positifs sur les 6 échantillons négati fs adressés • 27/48 ont été détectés par l’ensemble des laboratoir es• 5/48 ont permis d’évaluer la sensibilité des techniq ues
d’hémoculture versus les techniques classiques (ino culum faible)• 10/48 montrent la variabilité des résultats : positi vité à l’Afssaps et
en techniques classiques mais pas pour certaines ba nques (inoculum ensemencé faible, pas d’ensemencement de m ilieu SN …).
• Importance de l’utilisation d’un milieu spécifique à la recherche des champignons et des levures à une température adaptée
• Importance de renforcer l’observation des milieux d ’organocultureaprès ensemencement des échantillons
• Délai de détection plus rapide pour la cession du g reffon grâce àune « quarantaine microbiologique » réduite.
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPSI.3.2 Etudes collaboratives
21
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPSI.3.3 Contrôle de qualité externe
• Etude pilote avec 4 banques de cornées de Janvier à Mai 2005 : Validation de la faisabilité du contrôle externe des milieux cornéens (transport, organisation et techniques): 231 échantillons.
• Octobre 2005 : 1er tour de contrôle externe de qualité à l’échelon national avec les 21 banques de cornées
• Depuis Janvier 2006 : 3 tours de contrôles par an (20 banques)
22
• Intérêt du contrôle– Observation de la réalisation du procédé de conservation des
cornées– En cas de discordance : interrogation et discussion sur les
problèmes rencontrés : contamination faible, résistance aux ATB, les techniques bactériologiques employées, les méthodes de décongélation …
– But : Standardiser les méthodes en vue d’élaborer des référentiels de contrôle.
• Depuis Janvier 2006 : 3 tours de contrôles par an (20 banques)
• 4% (34/932) contrôles bactériologiques ou fongiques positifs
5 cornées détruites avant greffe (négatif dans les banques)+ 6 déclarations de biovigilance avec suivi du receveur(contrôle positif après greffe)
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPS I.3.3 Contrôle de qualité externe
23
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPSI.3.3 Contrôle de qualité externe
• Bilan 2009
– 231 échantillons réceptionnés
– 53 colis : transport à +4°C.
91% conformes à réception
– Echantillons analysés entre 0 et 26 jours après les banques (Médiane = 2)
185
2917
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Nom
bres
d'é
chan
tillo
ns0 à 5 > 5 à 10 > 10 à 26
Durée de stockage des échantillons a +4°C ( en jour s)
Durée de stockage des échantillons entre les contrô les bactériologiques réalisés à l'AFSSAPS et dans les b anques
Nombre de milieux cornéens reçus
(134/231), 58%
(3/231), 1%
(94/231), 41%
Milieux de prélèvementMilieux de conservationMilieux de déturgescence
24
• Bilan 2009
– 6% (6/94) des milieux de transport reçus étaient positifs
– Milieux analysés à l’Afssaps entre 2 et 10 jours aprèsles banques
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPSI.3.3 Contrôle de qualité externe
Résultats des contrôles bactériologiques et fongiques obtenus en 2009
Négatifs (225/231) 97%
Positifs (6/231) 3,0%
25
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPSI.3.3 Contrôle de qualité externe
• Bilan 2009
Sur les 6 échantillons contaminés :
- 17% (1/6) ont été retrouvés positifs àl’Afssaps et négatifs dans la banque.
- 83% (5/6) étaient concordants.
Un échantillon négatif à l’Afssaps et positif àla banque
Sur l’ensemble des échantillons reçus :
1% de résultats discordants (2/231)
Aliquote2Positif
(Candida albicans)Positif
(Candida albicans)
CorneamaxMilieu de transport
6
Aliquote4Positif
(Brevundimonasvesicularis)
Positif(Brevundimonas
diminuta/vesiculariset Sphingomonas
paucimobilis)
Corneaprepmilieu de transport
5
Aliquote2Négatif
Positif(Sphingomonas
paucimobiliset Streptococcus
mitis/oralis)
Corneaprepmilieu de transport
4
Aliquote2Positif
(Brevibacterium spp)
Positif(Sphingomonas
paucimobiliset Streptococcus
mitis/oralis)
Corneaprepmilieu de transport
3
flacon d’origine5Positif
(Pseudomonasaeruginosa)
Positif(Pseudomonas
aeruginosa)
Corneaprepmilieu de transport
2
flacon d’origine10Positif
(Agrobacter radiobacter)Positif
(Penicillium)
Corneaprepmilieu de transport
1
Aliquote ou flacon d’origine
Nombre de jours entre Analyse
Afssaps et banque
Résultats des contrôles bactériologiques en
Banque
Résultats des contrôles bactériologiques à l’Afssaps
Milieux analysés
N°°°°
26
• Bilan 2009
– Pour le positif à l’Afssaps et négatif dans la banque : Résistance connue aux antibiotiques des milieux, contamination faible au départ non détectable par les techniques utilisées par les banques. Et pour le négatif à l’Afssaps et positif à la banque (sensibilité du germe connue à la pénicilline)
• 1 cornée détruite avant greffe.
Importance de réaliser les contrôles en aveugle et impératif d’adresser les milieux à l’Afssaps dans un délai maximum de 5 jours après analyse à la banque
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPSI.3.3 Contrôle de qualité externe
27
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPSI.3.4 Recueil des contaminations
• Depuis 2005 : Recueil d’information sur les microorganismes identifiés lors du contrôle des cornées
*Fermeture d’une banque en 2006 et regroupement de son activité dans une autre banque.** Une banque ne nous a pas adressée ses données (Bordeaux).*** Quatre banques ne nous ont pas adressée leurs données (Bordeaux, Clermont, Tours, La Réunion).
*Fermeture d’une banque en 2006 et regroupement de son activité dans une autre banque.** Une banque ne nous a pas adressée ses données. 8,3
7493
621
19**
2008
8,9
7776
691
20
2007
7,4
9147
676
17***
2009
10,310,6% de cornées détruites
87498607Cornées analys ées
898910Contaminations observ ées
20*21Nombre de
banques participantes
20062005
28
Nature des produits contaminés en 2009
0 100 200 300 400 500
Effectifs
Collerrettes
Conservation
Deturgescence
Prelevement
I.3 TRAVAUX A L’AFSSAPSI.3.4 Recueil des contaminations
• Nature des produits contaminés de 2005 à 2009
1,4% (9/621)
0,3% (2/621)
35,7% (22/621)**
56,5% (351/621)**
2008
0,1% (1/676)
1,2% (8/676)
28,1% (190/676)**
70,6% (477/676)
2009
4,1% (28/691)
1,3% (9/691)
31,4% (217/691)*
60,2% (416/691)*
2007
2% (17/898)0,2% (2/910)Collerettes
2% (15/898)0,4% (4/910)Milieux de
déturgescence
33% (297/898)
20,4% (186/910)
Milieux de conservation
63% (569/898)79%
(718/910)Milieux de prélèvement
20062005
*Il y a 3% en plus de milieux contaminés qui étaient soit des milieux de prélèvement soit des milieux de conservation (non précisé par la banque).
**Il y a 6% en plus de milieux contaminés qui étaient soit des milieux de prélèvement soit des milieux de conservation (non précisé par les banques).
29
I.3.4 Recueil des contaminations
• Taux de contamination par banque :– 2005 : de 1,4% à 16,2%
– 2006 : de 4,1% à 24,1%
– 2007 : de 1,0% à 23,7%– 2008 : de 3,0% à 21,9%
– 2009 : de 1,5% à 17,1%
33%
70%65%
74% 76%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
2005 2006 2007 2008 2009
Banques avec un taux de contamination inférieur ou égal à 10%
30
• INCIDENCE DU NOMBRE DE CONTRÔLES REALISES SUR LES TAUX DE CONTAMINATION PAR BANQUE
I.3.4 Recueil des contaminations
Taux de contamination 2009 en fonction du Nombre de contrôles réalisés
Tau
x de
con
tam
inat
ion
2009
0 1 2 3 4 5Nombre de contrôles réalisés
0
3
6
9
12
15
18
Aucune relation statistiquement significative n’a é té mise en évidence entre le taux de contaminations 2009 et le nombre de contrôles réalisés.
31
• INCIDENCE DE L’ACTIVITE DES BANQUES SUR LES TAUX DE CONTAMINATION
I.3.4 Recueil des contaminations
Taux de contamination 2009 en fonction de l'activité des banques
Tau
x de
con
tam
inat
ion
2009
Nombre de cornées analysées en 2009
0 500 1000 1500 2000 25000
3
6
9
12
15
18
Aucune relation statistiquement significative entre le taux de contaminations 2009 et l’activité de la banque en 2009.
32
• INCIDENCE DU NOMBRE DE SITE DE PRELEVEMENT SUR LES TAUX DE CONTAMINATION
I.3.4 Recueil des contaminations
Taux de contamination 2009 en fonction du nombre de sites de prélèvement
0 5 10 15 20 25 30Sites de prélèvement 2009
0
3
6
9
12
15
18
% d
e co
ntam
inat
ions
200
9
Aucune relation statistiquement significative entr e le taux de contaminations 2009 et le nombre de si tes de prélèvement 2009.
33
I.3.4 Recueil des contaminations
*Une banque a effectué en 2007 une recherche d’Herpès et l’a indiquée dans la liste des contaminations (0,1% des contaminations).
17,9%
2,1%
Classification des germes retrouvés en 2009
ClassificationBactériesLevuresMelangesMoisissuresNon identifiés
73,5%
4,3%2,2%
0,022215Non identifiés
0,020714Moisissures
0,042929Mélanges
0,1790121Levures
0,7352497Bactéries
FréquenceEffectifValeur
34
Staphylocoque
Pseudomonas
E coli
I.3.4 Recueil des contaminations
0 30 60 90 120 150
Effectifs
Classification des bactéries retrouvées en 2009 par genre
AchromobacterAcinetobacter
AgrobacteriumBacillus
BacteroidesBrevibacterium
BrevundimonasBurkholderia
ChryseobacteriumChryseomonas
CitrobacterCorynebacterium
DelftiaEnterobacter
EnterococcusEscherichiaFlavomonas
HafniaKlebsiella
MethylobacteriumMorganella
Non identifiéesOchrobactrum
PropionibacteriumProteus
ProvidenciaPseudomonas
RalstoniaRoseomonas
RothiaSerratia
ShewanellaSphingobacterium
SphingomonasStaphylococcus
StenotrophomonasStreptococcus
Weeksella1,21%6Proteus
<1%/Autres
1,41%7Corynebacterium
1,41%7Achromobacter
1,61%8Enterococcus
1,61%8Chryseomonas
2,01%10Klebsiella
2,01%10Acinetobacter
4,23%21Non identifiées
4,63%23Stenotrophomonas
6,24%31Escherichia
6,24%31Brevundimonas
11,87%59Sphingomonas
16,30%81Pseudomonas
29,38%146Staphylococcus
% par rapport aux 497 conta.
Nombre de conta.
Genre
Répartition des Bactéries par genre en 2009
35
Candida albicans
Cryptococcus
neoformans
I.3.4 Recueil des contaminations
0 20 40 60 80 100
Effectifs
Classification des genres de levures retrouvées 2009
Candida
Non identifiées
Rhodotorula
Saccharomyces
Trischosporon
0,83%1Saccharomyces
0,83%1Rhodotorula
2,48%3Trischosporon
23,97%29Non identifiées
71,90%87Candida
% par rapport aux 121 conta.
LevuresGenre
Répartition des Levures par genre en 2009
36
Aspergillus
Penicillium
I.3.4 Recueil des contaminations
0 2 4 6 8
Effectifs
Classification des genres de moisissures retrouvées en 2009
Acremonium
Alternaria
Aspergillus
Non identifiées
Phoma
Scopulariopsis
Scytalidium
7,14%1Scytalidium
7,14%1Scopulariopsis
7,14%1Phoma
7,14%1Alternaria
7,14%1Acremonium
14,29%2Aspergillus
50,00%7Non identifiées
Total en ligneMoisissuresGenre
Répartition des Moisissures par genre en 2009
37
I.3.4 Recueil des contaminations
Techniques microbiologiques utilisées en 2009 pour la détection des germes
71,6%
1,3%
Techniques 2009Contrôle visuelHémocultureMéthodes conventionnellesSabouraud
0,9%
26,2%
1,3%9Sabouraud
0,9%6Contrôle visuel
26,2%177Méthodes conventionnelles
71,6%484Hémoculture
38
I.3.4 Recueil des contaminations
• Conclusion :– Taux de contamination national s’est amélioré en 2009 :
7,4% (676/9147) versus 8,3% (621/7493) en 2008. (2 banques importantes ne nous ont pas transmis leurs données.)
– Milieux de prélèvement les plus contaminés– 3 contrôles en majorité– Contaminations les plus fréquentes : bactéries (Staph
coag négative, Pseudomonas et Sphingomonas).– Sensibilisation des équipes de prélèvement– Identification des germes importante : origine des
contaminations
• Souchothèque : Conservation des germes détectés dans les produits tissulaires et cellulaires reçus
39
• 5 lames comptées par tous les techniciens des 18 banques françaises et de l’Afssaps (DCE 825 à 2952 EC/mm2) : 72 techniciens, 450 comptages, 70 en manuel et 20 avec analyseur par lame
• Objectif : – Mieux connaître les méthodes de préparation des cornées pour contrôle
endothélial– Comparer les techniques de comptage (analyseur versus manuel)
• Résultats :– 2 banques surestiment entre 30 et 80% les comptages (problème matériel)– Technique analyseur plus proche de la valeur cible et plus reproductible
que la technique manuelle
– Amélioration des comptages entre 2003 et 2009
I.3.5 Etude multicentrique : contrôles endothéliaux
40
I.3.5 Contrôles endothéliauxEtude nationale multicentrique
• 5 lames comptées par tous les techniciens des 18 banques françaises et de l’Afssaps (DCE 825 à 2952 EC/mm2) : 72 techniciens, 450 comptages, 70 en manuel et 20 avec analyseur par lame
• Objectif :– Mieux connaître les méthodes de préparation des
cornées pour contrôle endothélial– Comparer les techniques de comptage (analyseur
versus manuel)
41
Coloration alizarine
I.3.5 Contrôles endothéliauxEtude multicentrique
Densité endothéliale par lame technique manuelle
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Den
sité
end
othé
liale
cel
lule
s /m
m2
Lame 5825 EC/mm2
Lame 41185 EC/mm2
Lame 1 2047 EC/mm2
Lame 32262 EC/mm2
Lame 2 2952 EC/mm2
Densité endothéliale technique analyseur
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
Den
sité
end
othé
liale
cel
lule
s/m
m2
Lame 5825 EC/mm2
Lame 41185 EC/mm2
Lame 1 2047 EC/mm2
Lame 32262 EC/mm2
Lame 2 2952 EC/mm2
Comptage par analyseur plus reproductible et plus fiable que la technique manuelle (moins de variations intra et inter banques et plus proche de la valeur cible)
MANUEL ANALYSEUR
42
I.3.5 Contrôles endothéliauxEtude multicentrique
Dispersion des écarts interbanques des techniques d e comptage libérant les cornées
-30,0
-20,0
-10,0
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
Lame 5825 EC/mm2
Lame 41185 EC/mm2
Lame 12047 EC/mm2
Lame 32262 EC/mm2
Lame 22952 EC/mm2
Var
iatio
n in
tert
echn
icie
n pa
r ra
ppor
t à la
val
eur
cib
le e
n %
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
R
S
Ecart par banque des valeurs libérant les cornées t outes lames confondues
-30,0
-20,0
-10,0
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
Eca
rt de
s ba
nque
s %
CO
Détermination de la DCE acceptable dans 16/18 banques : 2 banques (C, O) doivent entreprendre des mesures correctives.
Afssaps
Exactitude des 18 banquesVariation inter banque par lame
CO
BA
43
I.3.5 Contrôles endothéliauxEtude multicentrique
(Thuret et al. Tranplantation 2004;78:1299)
Amélioration des comptages par rapport à 2003
44
I.3.5 Contrôles endothéliauxEtude multicentrique
• Conclusion de l’étude :
– Nécessité d’élaborer des recommandations pour améliorer la détermination de la qualité endothéliale
• Projets :
– Réalisation d’autres études nationales: suivi de la DCE et morphométrie
– Réalisation d’une étude européenne basée sur le même principe
45
I.3.6 Autres travaux et Perspectives
• En parallèle, surveillance du marché des PTA : contrôle par rapport au certificat d’analyses fabricant.• PTA Cornées : 2 campagnes de contrôles en 2007: 59 produits.
• PTA FIV: 1 campagne en 2009 et une en 2010.
• Etude pilote sur les contrôles endothéliaux avec 5 banques (2008-2010) :• Envoi de 20 cornées par banque à +22°C par transporteur : Cornées
déclassées pour contrôle endothélial limite ou Ac Anti Hbc + couplés à des Ac anti-Hbs
• Comptage au préalable à la banque et comptage manuel et avec analyseur d’image à l’Afssaps
� But : Mise en place en 2011 du contrôle de la DCE au niveau national
46
II- TÊTES FEMORALES
II.1 Généralités
II.2 Bilan de l’inventaire
II.3 Travaux à l’Afssaps
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• Donneur vivant : résidus opératoires lors d’interventions chirurgicales d’arthroplastie de la hanche sauf pour une banque étrangère
• Allogreffes osseuses : Utilisation pour une reconstruction osseuse et des comblements osseux en orthopédie, neurochirurgie, chirurgie maxillofaciale, stomatologie et implantologie orale
• Plusieurs types de procédés appliquées aux allogreffes osseuses– La cryoconservation (-80°C): 33 banques
– La viro-inactivation (solvants chimiques) : 3 BF, 4 BE
– La stérilisation par irradiation (rayon Gamma ou Béta)
II.1 GENERALITES
48
Prélèvement de la tête fémorale
Retrait de tous les tissus mous et du cartilageConditionnement en Cryokit (double emballage stérile)
Qualification du donneurcontrôle microbiologiqueet anatomopathologique
Greffe Contrôle microbiologique du liquide de rinçage ou os
Transport à la banque
Transport au site greffeur
Si donneur qualifié etContrôles conformes
Congélation à – 80°C
Décongélation au blocConservation du greffon en NaCl
II.1 GENERALITES Cryoconservation (Procédé simplifié)
49
II.2 BILAN DE L’INVENTAIREContrôle qualité du produit
Quels contrôles ?
Contrôle de qualité de la tête fémorale
47,0%
17,6%
41,0%
11,8%5,9%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
Contrôles réalisés
Ban
ques
Contrôle anatomopathologique
Aspect macroscopique
Dimensions
Poids
Radiographie
Contrôles physicochimiques
50
II.2 BILAN DE L’INVENTAIRE Contrôle microbiologique
• 78,6% des banques réalisent un seul contrôle au moment du prélèvement (en général).
• 21,4% des banques réalisent 2 contrôles (au moment du prélèvement et à la décongélation pour les os cryoconservés)
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II.2 BILAN DE L’INVENTAIRE Contrôle microbiologique
Types de prélèvements effectués pour le contrôle mi crobiologique
14,3%10,7%
3,6%
10,7%
28,6%
60,7%
17,9%
3,6%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
Prélèvements effectués
Ban
ques
Ecouvillonnage de la surfaceosseuseLiquide de trempage
Cartilage
Ligaments
Capsule articulaire et synoviale
Os spongieux
Têtes entières (contrôlesdestructifs)Contrôle indirect
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II.2 BILAN DE L’INVENTAIRE Contrôle microbiologique
Type de milieux utilisés pour le contrôle bactériol ogique
3,6%10,7%
57,1%
10,7%
17,9%Milieu liquide puishémocultureHémoculture seule
Milieu solide et liquide
Milieu solide seul
Milieu liquide seul
• Bouillons : schaedler + vit K3, cœur-cervelle, thioglycolate, glucosé, TGY, tryptocaséine soja etc…
• Hémocultures: Bactec, Bact/alert, BBL septi-chek, Hemoline di phasique
• Géloses : chocolat polyvitex, Columbia + sang, TS + sang etc …
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II.2 BILAN DE L’INVENTAIRE Contrôle microbiologique
• 21,4% des laboratoires effectuent une recherche des mycobactéries sur des milieux spécifiques (Lowenstein-Jensen et Coletsos).
• 17,9% des laboratoires effectuent une recherche de levures sur milieux spécifiques
(Sabouraud, milieu spécifique Candida).
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• Validation du contrôle microbiologique des os – Préparation de l’échantillon : Broyage – Ensemencement de milieux : TS,TR et Sabouraud +
Bact/Alert PF, SN et MP– Repiquage systématique des TS, TR et Sabouraud sur Géloses
II.3 TRAVAUX A L’AFSSAPS
55
• 135 os analysés dans le cadre d’expertises à la demande de la DIE.
• Contrôle externe de qualité à mettre en œuvre.
II.3 TRAVAUX A L’AFSSAPS
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IV- AUTRES CONTRÔLES DE TISSUS A DEVELOPPER
• Membranes amniotiques
• Valves
• Vaisseaux : Veines et artères
• Peau
• Parathyroïdes
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CONCLUSION
• Travail de normalisation entrepris par la pharmacopée européenne à l’initiative de la France
• 2 projets de monographies :– Contrôle microbiologique des cornées et/ou tissus – Numération des cellules endothéliales dans les
cornées
• A ce jour, le contrôle des cornées et des os est en place, extension des contrôles aux autres tissus (membranes amniotiques etc…)
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CONCLUSION• Définition de modalités de contrôle adaptées à ces produits (rareté,
spécifications, stabilité, …)
• Suivi des écarts Producteurs-Afssaps, repères de qualité pour les produits cellulaires et tissulaires, et pour les procédés
• Contribution à la standardisation des méthodes
• Exploitation des données du contrôle contribuant à l’amélioration de la qualité des produits
• Forte adhésion des sites
• Publication de recommandations nationales et de référentiels européens pour les CSH, et projet de monographie sur les méthodes de contrôle sur les tissus.
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CONTACTSDirectrice scientifique des laboratoires de St-DenisLaurence Mouillot
Unité Produits Sanguins et Thérapie CellulaireResponsable de l’Unité: Laurent Fleury [email protected]
Responsables Contrôle Qualité:Cellules: Béatrice Panterne Tél: 01 55 87 42 10 [email protected]
Tissus: Nathalie Delesalle Tél: 01 55 87 42 07 [email protected]
Equipe technique:Julien Dubus, Vanessa Duval, Christine Sabatini
Responsable de l’Unité Microbiologie: Gérard Huyghe