FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUÍMICA

Alumno: _______________________________________ Código: _________

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Práctica3: IDENTIFICACIÓN Y DETERMINACIÓIN DE PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE LAS PROTEÍNAS.

OBJETIVOS:

• Identificar la Presencia de proteínas en algunos alimentos.

• Identificar algunas propiedades fisicoquímicas de las proteínas

• Observar y determinar experimentalmente el efecto del pH sobre las proteínas de la leche.

• Verificar el proceso de desnaturalización de las proteínas

INTRODUCCIÓN Y FUNDAMENTO TEORICO:

Las proteínas son compuestos químicos muy complejos que se encuentran en todas las células vivas: en la sangre, en la leche, en los huevos y en toda clase de semillas y pólenes. Hay ciertos elementos químicos que todas ellas poseen, pero los diversos tipos de proteínas los contienen en diferentes cantidades. En todas se encuentran un alto porcentaje de nitrógeno, así como de oxígeno, hidrógeno y carbono. En la mayor parte de ellas existe azufre, y en algunas fósforo y hierro. Las proteínas son sustancias complejas, formadas por la unión de sustancias más simples llamadas aminoácidos.

La organización estructural de una proteína viene definida por cuatro niveles denominados:

ESTRUCTURA PRIMARIA, es la secuencia de amino ácidos de la proteína. Nos indica qué amino ácidos componen la cadena polipeptídica y el orden en que se encuentran. La función de una proteína depende de su secuencia y de la forma que ésta adopte.

ESTRUCTURA SECUNDARIA, es la disposición de la secuencia de amino ácidos en el espacio. Los aas., a medida que van siendo enlazados durante la síntesis de proteínas y gracias a la capacidad de giro de sus enlaces, adquieren una disposición espacial estable, la estructura secundaria. Existen dos tipos de estructura secundaria: la α(alfa)-hélice que se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la estructura primaria. Se debe a la formación de

enlaces de hidrógeno entre el -C=O de un aminoácido y el -NH- del cuarto amino ácido que le sigue. En las hebras beta, los aas. no forman una hélice sino una cadena en forma de zigzag, denominada disposición en lámina plegada. Presentan esta estructura secundaria la queratina de la seda o fibroína.

ESTRUCTURA TERCIARIA, informa sobre la disposición de la estructura secundaria de un polipéptido al plegarse sobre sí misma originando una conformación globular. Esta conformación globular facilita la solubilidad en agua y así realizar funciones de transporte, enzimáticas, hormonales, etc. Esta conformación globular se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces covalentes como los puentes disulfuro y las interacciones débiles entre los radicales R de los aminoácidos

ESTRUCTURA CUATERNARIA, informa de la unión, mediante enlaces débiles (no covalentes) de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria, para formar un complejo proteico. Cada una de estas cadenas polipeptídicas recibe el nombre de protómero.

El número de protómeros varía desde dos como en la hexoquinasa, cuatro como en la hemoglobina, o muchos como la cápsida del virus de la poliomielitis, que consta de 60 unidades proteicas.

Figura 1. Organización estructural de la proteína

3. METODOLOGIA

3.1. Materiales

Item Cantidad Gradilla 1 Tubos de ensayo grande con tapa 4 Tubos de ensayo pequeños 12 Vasos de precipitado de 250mL 2 Vaso de precipitados de 150mL 2 Erlenmeyer de 150mL 1 Probeta graduada de 20mL 1 Pipeta graduada de 2mL 1 Pipeta graduada de 5mL 1 Pipeta graduada de 10mL 2 Propipeta 1 Termómetro 1 Pipeta pasteur 2 Varilla de vidrio 2 Embudo de Filtración 1 Espátula 1 Frasco lavador 1 Soporte universal 1 Pinza con nuez 1 Soporte para termómetro 1 Plancha de calentamiento 9 para todo el curso Erlenmeyer de 250mL con tapa 6 para todo el curso Frasco ámbar con tapa 1 para todo el curso

3.2. REACTIVOS Y SUSTANCIAS:

Item Cantidad Huevo, Leche en polvo, caldo de pollo en polvo (o cubo), pescado, carne molida, jamón y salchicha, jugo de papa, jugo de alguna fruta.

Traído por los estudiantes

Biuret 5 mL Alcohol etílico comercial 3 mL Solución de ácido acético al 10% 5 mL Solución saturada de NaCI 2 mL Solución de acetato de calcio al 10% 2 mL Solución de ácido acético 0.1 N 20 mL Solución de acetato de sodio 0.1 N 20 mL Solución de Hidróxido de sodio al 10% 4 mL Hielo Papel indicador universal de pH 5 cm Agua 50 mL

4. TÉCNICA:

• Realice un orificio pequeño a un huevo y deposite la clara en un vaso de precipitado.

• Prepare 30 mL de una solución de clara de huevo y agua destilada en relación 1:3.

• Filtre la solución anterior usando un embudo y un pedazo de gasa doble. El filtrado que se denominará solución "A" se usará para los experimentos siguientes.

4.1. SOLUBILIDAD

• Enumerar 3 tubos de ensayo pequeños y en cada uno mida y marque el volumen correspondiente a 1 mL. Adicione en cada uno aproximadamente 1mL de solución A.

• Añada: al primero, 4 mL de agua fría, al segundo 4 mL de agua caliente y al tercero, 4 mL de solución de hidróxido de sodio al 10%. Tápelos, agítelos y anote sus observaciones sobre la solubilidad de la albúmina de huevo.

4.2. PRUEBAS COLORIMÉTRICAS.

• REACCIÓN DE BIURET. En un tubo de ensayo coloque 1mL de solución "A" y añada unas cuantas gotas de solución de reactivo de Biuret hasta observar algún cambio en su coloración.

• Repita el mismo procedimiento para los otros alimentos. Para ello se coloca un pequeño pedazo del alimento en un tubo de ensayo y se tritura con una varilla de vidrio y un poco de agua y se añaden unas gotas del reactivo de Biuret. Pida indicaciones a su instructor sobre cómo realizar esta parte.

• Responda:

1. ¿En qué se fundamenta el reactivo de Biuret?

2. ¿Cómo reacciona el reactivo de Biuret con las proteínas?

3. ¿Cuáles de los alimentos analizados poseen proteínas?

4. ¿Cómo usaría el reactivo de Biuret para cuantificar la cantidad de proteína contenida en una muestra?

4.3. PRUEBAS CON SALES MINERALES (DE METALES).

• Tome 4 tubos y enumere. A cada uno de ellos agregue 2mL de solución "A".

• A los tubos 1 y 3 añádeles 2 gotas de ácido acético al 10% y agite. Continúe con el proceso monitoreando con el papel indicador, hasta que el medio sea ligeramente ácido.

• A los tubos 2 y 4 no añada nada extra. Mida aproximadamente el pH con el papel indicador. Es la solución acida o básica?

• A los tubos 1 y 2 añade 1mL de solución saturada de cloruro de sodio y a los tubos 3 y 4, 2 gotas de solución de acetato de calcio al 10%. Anote sus observaciones.

• Discute las diferencias observadas en los 4 tubos.

4.4. EFECTO DEL CALOR

• En un tubo de ensayo adiciona 3mL de solución "A".

• Coloca un termómetro en el baño de agua y caliente ligeramente el vaso.

• Observe y registre a qué temperatura empezó a coagularse (precipitación) la proteína.

4.5. EFECTO DEL ALCOHOL ETÍLICO

• A un tubo de ensayo que contenga 1 mL de solución "A" agregue 2 mL de alcohol etílico comercial, anote sus observaciones.

• Responda:

1. ¿Qué es la desnaturalización de proteínas? Y ¿Por qué ocurre?

2. Qué relación tiene la desnaturalización de proteínas con la práctica culinaria común de preparar huevos hervidos?

3. Investigue en qué se basa la electroforesis de proteínas SDS-PAGE.

4.6. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO.

4.6.1. Preparación de una serie de tubos con solución amortiguadora de acetatos.

• Coloca en una gradilla 6 tubos de ensayo rotulados con números consecutivos.

• Adiciona a cada tubo las soluciones ácido acético y acetato de sodio que indica la siguiente tabla:

TUBO Solución ácido acético 0.1 M Solución acetato de sodio 0.1 M

1 5mL

2 4mL 1mL

3 3mL 2mL

4 2mL 3mL

5 1mL 4mL

6 5mL

El volumen final de cada tubo deberá ser de 5mL.

4.6.2 PREPARACIÓN DE LA LECHE

• En un vaso de precipitados de 100mL disuelve 6g de leche en polvo descremada, con 50mL de agua destilada. (preparar una sola mezcla para todo el laboratorio) NOTA: añade el agua poco a poco para evitar que se formen grumos que podrían dificultar la obtención de una solución homogénea. No debes calentar la leche para disolverla.

• En un tubo de ensayo de 16 x 150mm adicione 2mL de la leche rehidratada preparada como se indicó anteriormente (evitando adicionar grumos) y añada 8mL de agua destilada, agita cuidadosamente por inversión. Esta muestra de leche diluida se utilizará para llevar a cabo la determinación del punto isoeléctrico de las proteínas descrito en el siguiente párrafo:

4.6.3. PUNTO ISOELÉCTRICO.

• Añade 1mL de la leche diluida a cada tubo de solución amortiguadora que preparaste en el punto 4.6.1.

• Mezcla cuidadosamente por inversión todos los tubos y deja reposar por espacio de 10 minutos. Observa el aspecto de las mezclas preparadas. Observa en que tubo se precipitan las proteínas de la leche.

• Responda:

1. Haciendo uso de la ecuación de Heenderson-Haselbach calcula el pH del tubo donde observaste la mayor precipitación de proteínas de la leche.

2. Investiga lo que es el punto isoeléctrico de una proteína y porque en este punto se puede observar precipitación de las mismas.

3. Cuál es la proteína principal componente de la leche. Investiga su punto isoeléctrico y discute si está de acuerdo con lo que encontraste en esta práctica.

4. ¿Qué aplicación tiene el conocer el punto isoeléctrico de una proteína?

5. ¿Qué es la electroforesis de proteínas en dos dimensiones o iso electroenfoque? ¿Qué ventajas ofrece sobre la electroforesis en una sola dimensión?

6. Investigue en qué se basan los métodos de cromatográficos de separación de proteínas.

7. Investigue en qué se basa la identificación de proteínas mediante espectrometría de masas.

5. BIBLIOGRAFIA. • BOATELLA RIERA, Josep. Química y Bioquímica de los alimentos II. Barcelona: Edicions Univers. Barcelona, 2004.

ISBN: 978-84-475-2836-7. • ALBERTS, B. y col. Biología Molecular de la célula. España: Edit. Omega, 2004. • BAYNES, John W.; DOMINICZAK, Marek H. Bioquímica Médica. España: Edit. Elsevier, 2007. ISBN: 978-848-086-730-6. • BERG, Jeremy Mark; STRYER, Lubert; TYMOCZKO, John; MARACULLA, José M. Bioquímica. Edit. Reverte, 2008.

ISBN: 978-84-291-7602-5