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5. MICROSCOPÍA. TINCIONES BACTERIANAS

5.1. INTRODUCCIÓN

La microbiología se ha podido desarrollar a partir de la aparición y progreso del microscopio,

gracias al cual se pueden visualizar las bacterias.

El ojo humano no es capaz de discriminar más allá de 0,1 mm. El microscopio óptico tiene

como límite de poder de resolución unos 0,20 microns. Están a su alcance estructuras

celulares como cromosomas, nucleolos, cloroplastos, mitocondrias. El microscopio

electrónico, que tiene un poder de resolución del orden de 4 Angstrom (C), es capaz de

visualizar la estructura de las membranas, ribosomas, etc.

5.2. EL MICROSCOPIO ÓPTICO

En microscopía nos podemos encontrar un microscopio simple, que no es más que una lente

biconvexa o un microscopio compuesto, que emplea dos sistemas de lentes separadas,

consiguiendo con ello mayores aumentos.

Todo microscopio compuesto constará de:

� Un sistema óptico que aumenta la imagen.

� Un sistema de visualización que amplifica adecuadamente dicha imagen.

5.2.1. Contraste. Absorción diferencial de la luz entre la muestra y el medio. El grado de

contraste se puede mejorar, aumentándolo mediante técnicas de tinción.

5.2.2. Amplificación. La amplificación de la imagen en un microscopio se obtiene mediante

dos sistemas de lentes:

� Un primer sistema de lentes situado más cerca de la muestra, el objetivo que aumenta

la imagen real.

� El segundo sistema de lentes, que se sitúa más alejado de la muestra y más próximo al

ojo humano, es la lente ocular, que se encargará de ampliar esa imagen real

originando una imagen virtual que es la que percibe el ojo humano.

Los microscopios en la mayoría de laboratorios de microbiología presentan los objetivos

siguientes:

� objetivos secos, de x4, x10, x40

� objetivos de inmersión, x100 aumentos.

La amplificación total de un microscopio óptico se obtiene multiplicando la ampliación del

objetivo, por la ampliación del ocular.


5.2.3 Poder de resolución. El poder de resolución de una lente es la capacidad que ésta

presenta para poder observar dos puntos adyacentes como distintos y separados.El poder de

resolución en un microscopio está en función de la longitud de onda (�) de la luz empleada y

de las características del sistema de lentes, llamado apertura numérica.

Fig. 5.1

El límite o poder de resolución de un microscopio (d) es la distancia mínima entre dos puntos

que permite distinguirlos uno de otro. Se expresa como:

d = 0,5 �/ N sen �

� = longitud de onda de la luz empleada Nsen � = apertura numérica (medida del tamaño del cono de luz refractada por la preparación

que admite el objetivo)

N, es el índice de refracción del medio (aire/aceite de inmersión) que hay entre la muestra y

la lente del objetivo

�, es la mitad del ángulo que forma el cono de la lente del objetivo.


Cuanto más pequeño sea el poder de resolución de un microscopio, más capacidad de

amplificación tendrá. Esto se consigue aumentando la apertura numérica (para microscopio

óptico, 1,25 es un valor normal de apertura numérica, 1,4 es un valor máximo). La apertura

numérica depende del índice de refracción del medio que hay entre la muestra y el objetivo.

Como que el índice de refracción del aire es menor que el del vidrio, los rayos luminosos se

refractan cuando pasan del portaobjetos al aire. La mayoría de los rayos luminosos que han

atravesado la muestra se desvían en un ángulo tan grande que se pierden.

El aceite de inmersión (N = 1,56) tiene, aproximadamente, el mismo índice de refracción que

el vidrio. Si ponemos una gota de aceite entre la preparación y el objetivo, la mayoría de los

rayos luminosos procedentes de la muestra pasan directamente al objetivo, aumentando la

resolución del microscopio y observándose una imagen más clara. (Naire = 1)

No se ha de utilizar nunca aceite de inmersión con objetivos secos. La distancia a la muestra

es mayor y los rayos refractados son recogidos por estas lentes.

La resolución podría aumentarse también, disminuyendo la longitud de onda de la luz,

empleando luz ultravioleta. En este caso al no ser nuestro ojo sensible a tales radiaciones, la

observación no puede ser vista y es necesario utilizar una placa fotográfica, además comporta

también utilizar lentes de cuarzo y modificar la parte óptica del microscopio.

Sin embargo el microscopio óptico debido a la misma naturaleza de la luz y de su longitud de

onda no puede superar un cierto poder de resolución. El límite de resolución con onda corta

(� = 426 nm) es de 200 nm = 0,2 �.

Al utilizar en el microscopio electrónico haces de electrones de longitud de onda corta se

consiguen mayores resoluciones con lo que se supera el problema resolutivo del microscopio

óptico pasando de 2.000 C a 5 C, además consigue un mayor poder amplificador.

5.2.4. Estructura de un microscopio

Un microscopio se divide en dos partes, el soporte y el sistema óptico.

I. Soporte. En los modelos modernos el soporte es una pieza fija en la que únicamente

la platina y el condensador tienen un cierto movimiento. Las partes principales son:

a) La base, que normalmente alberga la fuente de iluminación (lámpara incandescente

halógena). En determinados modelos la base incorpora además un sistema portafiltros con

varios filtros y un diafragma de campo luminoso.

b) El brazo soporta todo el sistema óptico, el cabezal portaoculares (mono o

binocular) y el revólver portaobjetivos. En el brazo se dispone también el mecanismo de

anclaje de la platina dotado del correspondiente sistema de enfocado de la preparación.

c) La platina es la pieza donde se coloca la preparación microscópica para su

observación. Presenta un orificio central por donde pasa la luz y está equipada con un sistema

de fijación de la preparación y de desplazamiento en cruz, lo que permite posicionar

cómodamente la zona de la preparación que hay que observar. En su parte inferior se dispone

el sistema de fijación del condensador.


d) El macrométrico y el micrométrico permiten enfocar la preparación. El primero

se emplea para un enfoque rápido cuando se trabaja con el objetivo de menor aumento (x10),

mientras que el micrométrico permite afinar el enfoque cuando se utilizan los objetivos de

mayor aumento (x40, x100).

Fig. 5.2

II. Sistema óptico. El Sistema óptico está formado por un cuerpo tubular donde se

instalan las lentes: los oculares en un extremo y los objetivos en el extremo opuesto. Como se

indica más adelante, tanto oculares como objetivos no son lentes simples, sino conjuntos que

funcionan como una única lente que aumenta considerablemente la calidad de la imagen. Un

microscopio convencional posee tres sistemas de lentes:

a) El condensador, colocado entre la fuente de luz y la preparación. Concentra los

rayos de luz en un punto o foco, que, para una observación óptima, debe hacerse coincidir

con el plano de la muestra. Incorpora también un diafragma tipo iris que permite ajustar la

cantidad de luz que llega a la preparación y actúa de un modo muy eficaz sobre el contrastado

de la preparación (mayores aumentos requieren más iluminación, es decir, mayor apertura del

diafragma).


b) Los objetivos proporcionan una imagen ampliada de proyección real e invertida

que se forma en el plano focal anterior del ocular. Los objetivos están montados sobre un

dispositivo portaobjetos giratorio de revólver. En bacteriología se hace uso frecuentemente

del objetivo de inmersión (normalmente de 100 aumentos), que acostumbra presentar grabada

una raya negra o la inscripción Inm. Este objetivo debe ser empleado incluyendo entre él y la

preparación aceite de inmersión para microscopía.

c) El ocular aumenta a modo de lupa la imagen real proyectada por el objetivo y

permite que sea percibida por el ojo. Lleva grabado el número de aumentos.

Para evitar los defectos ópticos de tipo aberración cromática1 y esférica

2 inherentes a las

lentes únicas, tanto el ocular como los objetivos están formados por sistemas o conjuntos de

lentes cuyo diseño reduce al máximo estos defectos.

La disposición correcta del condensador es de gran importancia a la hora de obtener

una imagen clara y contrastada. Cuando se emplean grandes aumentos, es fundamental

conseguir una iluminación óptima; en este caso es necesario realizar un centrado tanto de la

fuente de la luz como del condensador, además de un correcto diafragmado.

Información objetivos

Longitud del tubo: Distancia que media entre la superficie de conexión del objetivo en el

revolver y el extremo del tubo en el cual se introduce el ocular. Número de campo: Diámetro en nanómetros (nm) del campo de visión que puede ser

observado a través del ocular.

Distancia de trabajo: Es el espacio entre la lente frontal del objetivo y la superficie superior

del cubreobjetos, cuando está enfocada la imagen de una muestra. A mayor aumento de

objetivo, menor distancia de trabajo.

Los distintos aumentos que podemos encontrar en los objetivos están codificados por un

anillo de color de la siguiente forma:

Los objetivos de inmersión en aceite llevan una marca de identificación que es un anillo

negro.

1aberración cromática. Se producen irisaciones (anillos coloreados) en torno a los objetos

que están en el campo del microscopio.

2aberración esférica. No logran enfocar simultáneamente todo el campo del microscopio, lo

que produce imágenes borrosas.

1 x negro 20 x verde

2 x castaño 40 x, 50 x azul claro

4 x, 5 x rojo 60 x azul cobalto

10 x amarillo 100 x blanco


Fig. 5.3 Nomenclatura de los objetivos

5.2.5. Manejo y uso del microscopio

1. Compruebe que las lentes del ocular y los objetivos están limpias. De no ser así,

limpiarlas con papel de fumar. Si el objetivo estuviera muy sucio, se puede humedecer el

papel con un poco de alcohol. No tocar las lentes con los dedos.

2. Coloque la preparación sobre la pletina sujetándola con el dispositivo móvil. Compruebe

previamente que el objetivo de menor aumento está en posición de empleo.

3. Para bacteriología, ilumine la preparación bajando casi totalmente el condensador, con el

diafragma abierto totalmente.

4. Coloque el objetivo de 10 aumentos (x10) y enfoque:

a. Acerque al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando para ello el

macrométrico. No haga esta operación mirando por el ocular, pues correría el

riesgo de "clavar" el objetivo en la preparación con el consiguiente destrozo de

ambos.

b. Suba el tubo lentamente con el macrométrico observando por el ocular hasta que

obtenga un enfoque nítido.

5. Pase al objetivo de 40 aumentos (x40). suba ligeramente el condensador. La imagen debe

de estar casi enfocada; afine el enfoque con el micrométrico. Si la imagen no está ni

medianamente enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo x10.

6. Empleo del objetivo de inmersión

a. Gire el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre

éste y el objetivo de x40.

b. Coloque una gota mínima de aceite de inmersión sobre el punto de luz.

c. Termine de girar suavemente el revólver hasta la posición del objeto de inmersión,

asegurándose de que éste no toca la preparación, pero sí la gota de aceite.

d. Enfoque cuidadosamente con el micrométrico. La preparación debería estar

prácticamente enfocada si se ha realizado un enfoque cuidadoso con el objetivo de

x40. De no ser así, es preferible volver a enfocar de nuevo un campo distinto

partiendo del objetivo de x10. Recuerde que la distancia de trabajo desde la lente

frontal del objetivo de inmersión a la preparación es mínima, por lo que el riesgo

de accidente es ahora máximo. e. Una vez que haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no puede

volver a colocar el objetivo de x40 sobre ese campo, pues correría el riesgo de

mancharlo de aceite.


f. Finalizada la observación de una preparación y antes de retirarla de la platina, se

coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver en el sentido hacia la

lupa. Nunca retirar la preparación con el objetivo de inmersión en posición de observación.

g. Retire la preparación y limpie el objetivo de inmersión cuidadosamente

empleando papel de fumar. Compruebe también que el objetivo de x40 está

perfectamente limpio.

h. Limpiar los portas con solución jabonosa. Aclararlos abundantemente y dejarlos

guardados en un recipiente cerrado con disolución eter-alcohol 1:1.

i. Limpiar con rapidez cualquier suciedad que caiga en el microscopio.

j. Guardar el microscopio con el revolver en posición "sin objetivo" o con el

objetivo de menor aumento. Recoger los cables eléctricos y colocar en el armario

según las normas indicadas.

k. Para desplazar el microscopio, sujetar la columna con una mano y el pie con la

otra.

l. No forzar los engranajes que mueven la pletina.

5.3. TIPOS DE MICROSCOPÍA ÓPTICA En general, para el trabajo diario, el instrumento de uso más común es el microscopio de

campo luminoso (microscopio óptico). Los otros tipos son utilizados con fines especiales o

trabajos de investigación.

A. Microscopía de campo luminoso (microscopio óptico). Esta basada en los principios

expuestos en los apartados anteriores. B. Microscopía de campo oscuro. Es un microscopio óptico donde aparecerá un efecto

producido por la técnica del campo oscuro, que consiste en un fondo negro sobre el

cual se ven los objetos intensamente iluminados. Esto se obtiene al equipar al

microscopio con un condensador especial que dirige la luz desde la fuente luminosa

por una trayectoria tal que sólo los haces de luz que tropiezan con los objetos de la

muestra se dirigen al objetivo. C. Microscopía de luz ultravioleta. El microscopio de luz ultravioleta permite un poder

de resolución mejor, ya que la luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 180 a 400

nm frente a la de 400 a 700 nm del espectro visible. las imágenes del microscopio

ultravioleta pueden ser visualizadas por el ojo humano gracias a un tubo convertidor

de imagen que se registrará sobre un plano fotográfico o televisión sensible a la luz

ultravioleta. D. Microscopía de fluorescencia. Existen sustancias en la naturaleza que son capaces de

absorber la energía de las ondas ultravioletas y emitirla como ondas visibles de mayor

longitud de onda. De ahí que existan materiales que a la luz ordinaria presentan un

color y a la luz ultravioleta otro distinto y más intenso. Este tipo de materiales se

denominan fluorescentes. Basándose en esta propiedad, la microscopía de

fluorescencia consistirá en teñir previamente el microorganismo con un colorante

fluorescente y observarlo al microscopio con luz ultravioleta. E. Microscopía de contraste de fases. Es uno de los mejores métodos para la

visualización de microorganismos vivos. Las preparaciones de la muestra se iluminan

de manera controlada mediante objetivos especiales de contraste de fase de la luz, con

lo que se puede distinguir índices de refracción similares. Establecer un contraste de

fase hace diferenciar estructuras que tienen índice de refracción muy próximo, las

cuales no se apreciarían con el microscopio convencional. Se recurre a un dispositivo


de iluminación según el cual una porción del haz luminoso es tratada de un modo

distinto al resto; posteriormente se recombinan ambos en tales condiciones que

producen por interferencia grandes aumentos en el contraste de las células o

estructuras intracelulares, que difieren ligeramente en su índice de refracción respecto

al de su entorno.

5.4. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Poder de resolución

Rayos � Rayos X UV Visible IR Micro ondas

TV FM AM

Longitud de onda (�) 0,01 nm 1 nm <400 nm 400-700nm >700 nm 0.1-7 cm 1 m 10 m 1 Km

El uso de ondas de radio para visualizar objetos pequeños, sería un desastre (como una regla

de 1 Km para medir el diámetro de una canica). El "criterio Rayleigh" establece el límite de

resolución, esto es, la distancia más corta que se puede observar con una onda viene limitada

por el valor el valor medio de �2 . Para la luz visible unos 300 nm que es efectivamente el

límite de resolución con los microscopios ópticos.

Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

El microscopio electrónico utiliza un haz de electrones. El poder de resolución es por ello

1.000 veces mayor al del microscopio óptico (� electrones = 0,0036 C).

La fuente emisora de electrones es un filamento de Tungsteno sometido a un potencial de 30-

150 Kv.

El flujo de electrones se dirigen hacia la muestra. El haz emergente se somete a la acción de

campos electromagnéticos que amplifican la imagen igual que las lentes en un microscopio

óptico. Una lente proyectora lleva la imagen a una pantalla fluorescente (tipo TV) que brilla

al recibir los impactos de los electrones.

El TEM viene limitado por:

a) Sólo permite trabajar en muestras de espesores muy delgados y exentos de materiales

que dispersen o absorban electrones (en especial átomos pesados de Fe o Pb).

b) Trabaja en vacío (no permite estudiar procesos fisiológicos).

Microscopía electrónica de barrido (MEB) 1. Los electrones no se transmiten desde abajo como en el TEM, si no que inciden desde

arriba sobre la muestra, por lo que no hay limitación en el grosor de esta.

2. Proceso de secado de la muestra (eliminación de agua)

3. Recubrimiento de la muestra con una capa de metal (Au o Pt)

4. Se irradia la superficie de la muestra con un haz muy estrecho de electrones. La

muestra desprende electrones secundarios (de baja energía) que se recogen sobre una

placa cargada positivamente que produce una señal eléctrica proporcional al número

de electrones. Estas intensidades eléctricas dependen de la forma y composición

química del objeto irradiado. Las señales se registran en un monitor de TV.

5. Tiene menor resolución que el TEM pero da bastante impresión de

tridimensionalidad.


Microscopía por efecto túnel

Desde los años 80 se viene desarrollando una técnica (premio Nobel) consistente en

establecer una corriente o flujo de electrones entre una punta extremadamente fina de unos

pocos nanómetros de diámetro, que se puede aproximar hasta casi 1 nm del objeto.

Se puede explorar así los más pequeños detalles de la superficie de un objeto y estudiar

átomo por átomo su estructura. Especial aplicación en microelectrónica y el estudio de

moléculas de ADN.

5.5. OBSERVACIONES AL MICROSCOPIO 5.5.1. OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS EN VIVO

1. Examen en fresco: cultivo de protozoos

a. Método entre portaobjetos y cubreobjetos. � Se prepara un portaobjetos (porta) y un cubreobjetos (cubre) perfectamente

limpios y desengrasados.

� En el porta se depositara una gota de agua destilada .

� Con el asa de siembra se tomará un poco de muestra de el microorganismo y

se realizará una resuspensión de ésta en la gota.

� Se intentará extender la muestra con el fin de homogeneizar la mezcla,

colocando con cuidado sobre la suspensión un cubre formando inicialmente un

ángulo de 45º evitando que se formen burbujas de aire al caer el cubre sobre la

suspensión.

� Observar al microscopio inicialmente con objetivo de 40 aumentos.

b. Método de gota pendiente en porta excavado

� Se utilizará en este caso un cubre adecuadamente limpio y desengrasado en el que se

colocará en el centro una gota de la suspensión microbiana con una asa

de siembra.

� Se colocará vaselina en los bordes del microtubo del porta excavado.

� El cubre se invertirá sobre el porta excavado perfectamente limpio, colocándolo

encima del área cóncava del porta.

� La vaselina adherirá el cubre al porta formando una cámara que evitará su

evaporación, así como corrientes de aire.

� Se invertirá la preparación.

� Se observará al microscopio con objetivo inicialmente de 40 aumentos.


Fig. 5.4

Resultados

Estos métodos son utilizados para identificar a los microorganismos como móviles o

inmóviles, así como para observar su morfología y, a veces, su distribución. Es importante

no confundirlos con los movimientos brownianos que se producen cuando se desplaza el

medio líquido y hace que todas las bacterias sigan la corriente en dicha dirección. El sellado

con vaselina evita precisamente ese problema.

2. Tinción vital

Fundamento:

Técnica intermedia entre examen en fresco y las técnicas de tinción con fijación previa,

consistente en el empleo de colorantes a diluciones muy altas para que no resulten tóxicos

para las bacterias, evitando así la muerte de los gérmenes.

� Rojo neutro en solución acuosa al 1: 1000

� Azul de metileno en solución acuosa al 1:1.000 ó 1:500

Procedimiento :

� Se colocará sobre el porta limpio y desengrasado una gota de la suspensión del

microorganismo problema junto con otra del colorante utilizado.

� Mezclar bien ambas gotas con el asa de siembra y colocar el cubre con cuidado para

evitar que se formen burbujas de aire.

� Observar al microscopio con objetivo de inmersión.


5.6. TINCIONES BACTERIANAS 5.6.1. Preparación de un frotis (o extensión) bacteriano

1. Extensión. Colocar una pequeña gota de agua destilada en el porta. Con el asa de

Kolle transferir una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido a la gota.

Remover la mezcla con el asa hasta formar una suspensión homogénea y extenderla,

bien con la propia asa, o bien, con la ayuda del borde de otro porta produciendo la

extensión del inóculo. ( Si el material de partida es un cultivo en medio líquido, no es

necesario realizar los pasos 1 y 2, basta con realizar directamente la extensión) 2. Fijación. Es imprescindible para que las bacterias queden inactivadas y adheridas al

vidrio, permitir la evaporación espontánea del porta, ayudándose con la llama del

mechero de manera muy leve (en ningún caso el porta debe quemar al tacto). Si el

porta alcanza una temperatura excesiva a la llama, las células pueden deformarse o

romperse. a. Por calor. (Bacterias procedentes de medio sólido) Pasar 2-3 veces el porta

por la llama durante un segundo. Dejar enfriar el porta entre los pases. . b. Con metanol ( bacterias procedentes de medio líquido). Añadir unas gotas

de metanol sobre la extensión completamente seca. Retirar de inmediato el

exceso de metanol del porta, golpeándolo con suavidad por su canto contra un

papel de filtro en la mesa de trabajo. Esperar a que el metanol se evapore

completamente. (La fijación por calor de bacterias que se hallan en su propio

medio de cultivo, no da buen resultado, pues la capa de materia orgánica que

contiene las bacterias, una vez realizada la extensión, tiende a despegarse con

facilidad en los lavados posteriores. Mecanismo de acción de los colorantes:

Química: Se fundamenta en las reacciones ácido-base. Los colorantes son sales orgánicas

cuya estructura fundamental es un anillo bencénico con distintos radicales.

El radical coloreado o cromatóforo suele se de tipo: nitroso (-NO2), azo (-N=N-), alqueno (-

C=C-), ciano (-C=N-). Cuanto mayor sea el número de radicales cromóforos, mayor será el

poder colorante de la solución.

El radical no coloreado o auxocromo es de tipo hidroxilo (-OH), amino (-NH2), metilo (-

CH3) y no tiene capacidad tintorial (dan estabilidad al colorante y pueden facilitar la acción

del radical cromóforo).

Dependiendo de la carga del radical cromóforo los colorantes se clasifican en básicos, ácidos o neutros. En bacteriología es especialmente frecuente la utilización de colorantes básicos (radicales cromóforos positivos) como la fucsina básica, cristal violeta o azul de metileno;

ello es debido a la gran basofilia de los componentes nucleares ricos en ADN y componentes

citoplasmáticos ricos en ARN.


5.6.2. TINCIÓN SIMPLE

Objetivo

� Observar la morfología de la bacteria

� Observar la agregación o tipo de distribución bacteriana

Fundamento

Se basa en la afinidad de los colorantes a los distintos componentes celulares, ya que las

células bacterianas en medios a pH neutros suelen presentar una débil carga negativa. Así

pues, la bacteria cargada negativamente se combinará con los iones positivos de los

colorantes básicos, como por ejemplo, el azul de metileno, cristal violeta, fucsina fenicada, de

tal forma que la bacteria quedará coloreada. Esto explica porqué en las tinciones simples los

colorantes utilizados suelen ser de tipo básico. Como colorantes ácidos se utilizan la eosina y

la nigrosina; pero los iones negativos de estos colorantes no podrán teñir la célula y se

depositarán alrededor de esta: son las tinciones negativas. Con este tipo de tinción se

consigue una imagen más real del tamaño y la forma celular.

Fig. 5.5

Procedimiento:

1. Preparar un frotis de:

a. Mucosa bucal (eucariota)

b. Muestra laboratorio (E. coli, Staphylococcus epidermidis, ...)

2. Cubrir el frotis con abundante colorante azul de metileno. Dejar actuar 2 min.

3. Lavar las preparaciones con agua corriente para eliminar el exceso de colorante Para

ello, inclinar el porta y aplicar el chorro de agua corriente en su parte superior

permitiendo que resbale sobre el frotis. No dirigir el agua directamente sobre el frotis,

pues podría arrastrar parte de él consigo.

4. Esperar hasta que el líquido se evapore. Este proceso se puede acelerar procediendo al

secado del porta por simple presión entre dos papeles de filtro (en ningún caso frotar

el porta).

5. Observar la preparación en el microscopio con el objetivo de inmersión.

6. Seleccionar un buen campo de observación y dibujarlo ilustrando la morfología y

agrupación de las células.


5.6.3. TINCIÓN NEGATIVA

Fundamento Las cápsulas son estructuras (capas mucosas) situadas alrededor de la pared

celular de algunas bacterias que confieren a éstas una cierta resistencia (son consideradas

como un factor de virulencia). Su espesor es variable y su composición de polisacáridos o

polipéptidos. Por su elevado contenido en agua se tiñe débilmente con los colorantes básicos,

sin embargo, se pueden observar directamente mediante tinción negativa con tinta china.

Este colorante está compuesto por partículas finas de carbón suspendidas en agua formando

un auténtico coloide. Las partículas son demasiado grandes para penetrar a través de la matriz

de la cápsula, por lo que sólo se teñirá el medio circundante. También se utilizan colorantes

ácidos (cargados negativamente). Los microorganismos, cargados negativamente, no van a

captar el colorante, quedando claros y brillantes sobre un fondo tenido oscuro.

Este método es menos utilizado en bacteriología que otras técnicas de tinción, pero

proporciona una visión muy exacta de las células bacterianas y se consigue una imagen más

real de su forma y tamaño, ademas de permitirnos observar si presentan o no cápsulas.

PROCEDIMIENTO: (la técnica no requiere fijación)

1. Colocar una gota de agua en un porta limpio y desengrasado.

2. Tomar con el asa de siembra una pequeña cantidad de muestra cryptococcus sp. y

mezclarla con la gota de agua.

3. Añadir una gota de solución de tinta china.

4. Mezclar cuidadosamente con el asa de siembra.

5. Colocar suavemente un cubreobjetos, evitando formar burbujas de aire.

6. Colocar "porta" y "cubre" en un papel absorbente doblado por la mitad, presionar con

los dedos sobre el cubre, de forma que el papel absorba el exceso de suspensión.

7. Observar con objetivo (x 40) y de inmersión

Fig. 5.6 Tinción negativa


5.6.4 TINCIONES DIFERENCIALES A. TINCIÓN GRAM

Objetivo � Diferenciar dos grandes grupos de eubacterias (Gram+, Gram-) en función de la

distinta composición de su pared bacteriana.

� Visualizar su morfología y disposición.

Fundamento Esta tinción fue desarrollada por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la

tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realizan para cualquier

identificación bacteriana. El distinto comportamiento en la tinción Gram es debido a la

distinta composición de la pared de las células bacterianas.

� Gram (+) se tiñen de violeta. Mono estratificada. Esta formada por una gruesa capa,

amorfa y densa de mucopolisacáridos (mureína, etc.). Esta densa capa evita la

extracción del complejo cristal-violeta-yodo por el disolvente (alcohol o acetona)

� Gram (-) pared multiestratificada de mayor complejidad. Se tiñen de rosa con el

colorante de contraste (safranina). Esta formada por una capa de mureína más delgada

(tan sólo un 10 % de la estructura) y encima de ella una capa de lípidos y

glucolípidos. La decoloración con alcohol incrementa la porosidad por arrastre de

lípidos, aumentando la tinción diferencial.


Fig. 5.7 Tinción Gram

La tinción de Gram requiere el uso de cuatro soluciones:

1. Primer colorante. El más utilizado es el cristal violeta. Es un colorante básico que

en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas tiñéndolas a

todas de azul. 2. Solución mordiente. Algunos colorantes sólo se depositan sobre determinadas

estructuras cuando éstas han sido sometidas a la acción de un mordiente, formándose

lo que se conoce con el nombre de "laca". El mordiente por si mismo no tiene color.

Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el primer colorante y las células. Suele

emplearse una disolución de yodo (Lugol). 3. Agente decolorante, Es un disolvente orgánico, por ejemplo, alcohol (alcohol-

acetona 1:1) que decolorará solamente un tipo de bacterias (las Gram -)que serán

teñidas con el colorante de contraste o segundo colorante.


4. (Gram - ) La eliminación por extracción de grasas de las paredes celulares, aumenta la

porosidad. El complejo CV-I (cristal violeta-Yodo) se separa de la célula.

5. (Gram +) Se deshidratan las paredes celulares, se contraen los poros y disminuye la

permeabilidad. El complejo CV-I se fija.

6. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el primer

colorante, como por ejemplo, la safranina. Este distinto comportamiento frente a la

decoloración es dependiente de la composición de la pared bacteriana , hecho que

servirá para clasificarlas como Gram+, aquellas que no han sido decoloradas y que

por lo tanto quedan teñidas con el cristal violeta de color azul violáceo (cuando un

colorante se une a una estructura , ésta ya no puede ser teñida por otro), o como

Gram- (aquellas bacterias que han sido decoloradas y son teñidas con el colorante de

contraste, la safranina; por lo tanto, su color es rosa-rojo). Es recomendable trabajar

con cultivos en fase exponencial 18-24 h. Las bacterias Gram positivas en fase

estacionaria pueden aparecer como Gram negativas. Agua altamente clorada puede debilitar la coloración de contraste.

Resultado Paso Técnica

Gram+ Gram- Primer colorante cristal violeta 2’ se tiñen violeta se tiñen violeta

Mordiente Lugol 2’ se fija coloración se fija coloración

Decoloración alcohol-acetona 10" permanecen violetas se decoloran

Segundo colorante safranina 2’ permanecen violetas se tiñen de rojo/rosa

Procedimiento

1. Preparar 3 portas con frotis bacteriano de cultivos en fase exponencial de:

a. Staphylococcus epidermidis b. Escherichia coli c. mezcla de ambos

2. Fijar las muestras y dejar enfriar antes de proceder a su tinción.

3. Teñir con cristal violeta (2 min). Lavar con agua corriente el exceso de colorante

4. Cubrir con Lugol (2 min). Lavar con agua corriente el exceso de Lugol

5. Decolorar con etanol hasta que la muestra deje de perder color (unos 10 seg). Lavar

con abundante agua corriente para eliminar el resto del disolvente

6. Teñir con safranina (2 min).

7. Lavar con agua corriente para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparación.

8. Examinar al microscopio con objetivo de inmersión.

9. Dibujar la morfología y el color que toman los distintos tipos bacterianos en estudio.


B. TINCIÓN ÁCIDO-RESISTENTE (Ziehl-Neelsen)

Fundamento. La mayoría de las eubacterias se encuentran englobadas en dos grandes

grupos según la tinción Gram; sin embargo, algunas bacterias de los grupos Micobacteria y

Actinomicetos no pueden ser clasificadas por aquella tinción. Para poder observar y

diferenciar con detalle estos grupos bacterianos, se utiliza la tinción ácido-alcohol resistente.

Esta tinción demuestra la capacidad que tienen algunas bacterias teñidas de resistir a la decoloración por ácidos y alcoholes. Esta propiedad se correlaciona con el alto contenido de

componentes lipoideos y céreos de su envoltura celular, que confiere un ambiente muy

hidrófobo, de tal forma que este tipo de bacterias presentarán grandes dificultades a la hora de

teñirse con los colorantes convencionales que no pueden penetrar en el interior de las

bacterias. De ahí que se necesiten, para este tipo de tinciones, colorantes altamente

concentrados así como la presencia de calor que facilite su penetración al interior de dichas

bacterias; de tal forma que, siguiendo tales instrucciones, una vez que dichas bacterias han

quedado teñidas, su decoloración posterior no es posible, resistiendo incluso a decoloraciones

ácido-alcohólicas.

Dicha tinción se emplea principalmente para el diagnóstico y estudio de enfermedades

producidas por bacterias ácido resistentes, como son la tuberculosis y la lepra.

La tinción Ziehl-Neelsen requiere tres colorantes:

1. Tinción con mezcla de fucsina-fenol: capaz de teñir de color rojo las células en

caliente. El fenol facilita la penetración de la fucsina en la envoltura celular.

2. Decolorante orgánico: mezcla de ácido y alcohol (HCl 0,36 N en etanol). 3. Colorante de contraste: azul de metileno

Las bacterias ácido-alcohol resistentes, tras la unión de la fucsina, resisten el tratamiento

orgánico y se verán teñidas de rosa. El resto de las bacterias se decolorarán y se contrastarán

con azul de metileno.

Procedimiento:

1. Preparar un frotis de cultivos en fase exponencial de Mycobacterium phlei y

Staphylococcus epidermidis.

2. Cubrir el frotis bacteriano con papel de filtro, de manera que el papel de filtro no

sobresalga del portaobjetos.

3. Teñir con fucsina fenicada cubriendo el porta durante 2 min.

4. Con unas pinzas de madera, colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta

que se desprendan vapores blancos. No ha de hervir, secarse ni quemarse. Retirar la

preparación del fuego. Añadir más colorante y repetir la operación 4 veces.

5. Retirar el papel de filtro y lavar con abundante agua corriente el exceso de colorante.

6. Decolorar con la solución ácido-alcohólica hasta color rosa claro (unos 30 seg).

7. lavar con agua corriente para detener la decoloración.

8. Teñir con azul de metileno(0,3 %) durante 1ó 2 min. sin necesidad de calentar.

9. Lavar con agua corriente el exceso de colorante. Secar la preparación

10. Examinar al microscopio con objetivo de inmersión.

11. Dibujar la morfología y el color que toman los distintos tipos bacterianos en estudio.


5.6.5. TINCIÓN ESTRUCTURALES

A - TINCIÓN DE ESPORAS

Fundamento. Sólo algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y

Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endósporas. Su enorme

importancia se debe a su resistencia al calor. Mientras que calentando a 80º durante 10 min

(pasteurización) mueren todas las bacterias y las propias formas vegetativas de las

formadoras de esporas, las endósporas termorresistentes soportan en algunos casos incluso

la cocción durante horas.

La esporulación se inicia en el interior de la bacteria con una concentración de material

proteico (la espora contiene casi toda la materia seca de la célula materna, pero en 1/10 de su

volumen). Se forma una doble capa envolvente que representa el 50 % de peso y volumen en

la espora madura.

La esporulación se produce cuando las condiciones ambientales son desfavorables

(agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.),

formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis,

la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior.

Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa.

La capacidad de germinar perdura durante años.

En general las esporas, se tiñen muy dificilmente, requiriendo determinados colorantes muy

concentrados así como la presencia de calor que facilite su penetración; pero, ahora bien, una

vez teñidas es muy difícil perder el colorante, propiedad que es utilizada para poder

demostrar la presencia de éstas.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1. Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente. 2. Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endósporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua , y sí

lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

Procedimiento

Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las

esporas.

1. Preparar frotis bacteriano de Bacillus sp. 2. Cubrir el frotis bacteriano con papel de filtro, de manera que el papel de filtro no

sobresalga del portaobjetos.

3. Teñir con verde de malaquita cubriendo el porta durante 2 min

4. Con unas pinzas de madera, colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta

que se desprendan vapores blancos. No ha de hervir, secarse ni quemarse. Retirar la

preparación del fuego. Añadir más colorante y repetir la operación 4 veces.

5. Retirar el papel de filtro y lavar con abundante agua corriente el exceso de colorante.


6. Teñir con safranina 2-3 min y lavar con agua corriente. Secar la preparación.

7. Observar la preparación al microscopio con objetivo de inmersión.

8. Dibujar y anotar la disposición y la morfología de las endósporas.

9. Clasificar el tipo de endósporas según la fig.5.8

Fig. 5.8

Interpretación de los resultados

La posición y la morfología de la endóspora en el interior de la bacteria constituyen un

carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género.

Las tres bacterias de la fig. 5.8 difieren en la disposición y morfología de las endósporas.

B. sphaericus posee una endóspora esférica con localización terminal y deformante de la

célula vegetativa, por lo que suele ser denominada en palillo de tambor. B.thuringiensis

tiene localizada la endóspora elipsoidal en el centro de la célula vegetativa, lo que provoca un

abombamiento característico denominado huso. B.subtilis forma una espora cilíndrica

subterminal no deformante.


Fig. 5.9 Tipos de protozoos y su tamaño aproximado en micras (��)


5.7. CUESTIONARIO MICROSCOPÍA Cuestionario uso del microscopio 1. Nombrar los elementos que forman el sistema óptico del microscopio.

2. Nombrar los elementos que forman el sistema mecánico del microscopio

3. Porqué todo lo que se quiere observar en el microscopio tiene que ser transparente.

4. De que elementos depende la correcta iluminación de la preparación

5. Porqué utilizamos aceite de inmersión

6. Interpreta ayudándote en la fig. 5.3 los datos que figuran en los objetivos de tu

microscopio. (monocular y binocular).

Cuestionario Tinciones bacterianas

1. ¿Qué es un examen en fresco? ¿Qué función desempeña el uso de la silicona?

2. Señala las ventajas y desventajas de la tinción simple respecto al examen en fresco.

3. Explica qué significan en microscopía las siguientes expresiones:

a) Extensión b) Fijación

4. En que difiere la extensión según provenga la muestra de un cultivo sólido o líquido

5. ¿Cómo y porqué se debe realizar la fijación con metanol, en caso de cultivos provenientes

de medio líquido?

6. ¿Qué problemas acarrea el calentar el porta en exceso durante el proceso de la fijación?.

7. Con los resultados de una tinción simple ¿se puede saber si la muestra es un cultivo puro?

8. ¿Que diferencias existen entre la tinción simple y la tinción negativa en cuanto a:

a. Morfología que nos permiten observar

b. Tipo de colorantes, ácidos o básicos que se emplean.

9. ¿Qué diferencias estructurales hay entre Gram+ y Gram-?

10. Tinción ácido-resistente:

a. Para que tipo de bacterias está indicado este tipo de tinción.

b. ¿Actúa alguna sustancia como mordiente?


11. ¿Que es la esporogénesis. En qué circunstancias se produce?

12. Qué significa: "la célula vegetativa se lisa"

13. ¿Qué función desempeña el "colorante de contraste" en las tinciones bacterianas?.

14. Completar la siguiente tabla:

Resultado Tinción Primer

colorante Mordiente

Decoloració

n

Colorante de contraste

Positivo Negativo

T. Simple

T. Negativa

T. Gram

T. Ác. Resist

T. de Esporas

T. de Cápsulas

1. Las 4 imágenes corresponden a los campos que se observan en las cuatro etapas de una

tinción Gramm.

a. Ordenar la secuencia de campos tal como se producen.

b. Explicar a que etapa corresponde cada uno.

c. Que operación se realiza en cada etapa y como se manifiesta en cada tipo de

bacteria según la clase de pared celular que posea.