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INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO
Prof. Wendell Coltro
CROMATOGRAFIA
Tipos de Métodos de Separação
1) CLÁSSICOS: precipitação, destilação e extração
2) INSTRUMENTAIS: cromatografia e eletroforese
- Tiveram uso intenso até a metade do século XX;
- Técnicas úteis para amostras com poucos componentes
(em altas concentrações) e relativamente puras;
- Porém são pouco seletivas e apresentam baixa sensibilidade.
- Técnicas “imbatíveis” na separação de amostras multicomponentes;
- Apresentam alta seletividade e sensibilidade;
- Sistema “integrado” (análise é feita de modo completo).
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Introdução a Métodos Cromatográficos
CROMATOGRAFIA (Definição): técnica analítica (clássica ou
instrumental) que permite a separação de misturas por interação
diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA
(líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
A Cromatografia foi inventada (e assim denominada) no início do
século 20 (1903) pelo botânico russo Mikhail Tswett. Ele empregou a
técnica para separar vários pigmentos de plantas (como a clorofila e a
xantofila) passando soluções desses componentes através de uma
coluna de vidro empacotada com carbonato de cálcio (CaCO3).
As espécies separadas apareciam como bandas coloridas na coluna,
daí originando o nome da técnica:
CROMATOGRAFIA: do grego CHROMA (COR) + GRAPHEIN (ESCREVER)
EXPERIMENTO DE TSWETT
PRINCÍPIO BÁSICO DE UMA
SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
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CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EM COLUNA
Classificação Geral Método Específico F.E. Tipo Equil.
Cromatografia Líquida (CL)
(F.M.: líquido)
Líquido-líquido ou
partição
Líquido ads. sólido Partição
Fase líquido-ligado Esp. org. ligadas sólido Partição
Líquido-sólido ou
adsorção
sólido Adsorção
Troca iônica Resina de troca iônica Troca iônica
Exclusão por tamanho Líquido interstícios sólido
Cromatografia Gasosa (CG)
(F.M.: gás)
Gás-líquido Líquido ads. sólido Partição
Fase gás-ligado Esp. org. ligadas sólido Partição
Gás-sólido sólido Adsorção
Cromatografia c/ fluido
supercrítico (CFS)
(F.M.: fluido supercrítico)
Esp. org. ligadas sólido Partição
CARACTERÍSTICAS DE UM PICO GAUSSIANO
- A eficiência de uma coluna (medida do alargamento da banda de
um pico) pode ser medida quantitativamente através de duas
grandezas:
Quanto maior tR e menor s (ou wb ou wh ), maior será N.
N é adimensional. F
(1) NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N)
- N mede a relação entre o tempo de retenção de um pico e a sua
variância (σ)
Nt
Nt
wN
t
w
R R
b
R
h
s
2
2
2
2
2
2
16 5 54, [7]
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PRATO TEÓRICO: equivalente a uma etapa
de equilíbrio entre as duas fases
PRATO TEÓRICO: equivalente a uma etapa
de equilíbrio entre as duas fases
IMPORTÂNCIA DO NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS
N1 > N2 > N3
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N=2500 N=1500
IMPORTÂNCIA DE N NA SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
EXEMPLO DE CÁLCULO DE N
- Assumindo que tR= 5 minutos e wb= 0,5 min (atenção: tR e wb devem
estar na mesma unidade; N é adimensional!!!)
- Substituindo-se esses valores na equação de N = ?????
(2) ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H): compara
eficiência de colunas de diferentes comprimentos
L= comprimento da coluna
N= número de pratos teóricos da coluna
- H nos dá o comprimento da coluna que corresponde ao valor de
um prato.
HL
N [8]
- No exemplo anterior de cálculo de N, se considerarmos que a
análise foi realizada em uma coluna de 30 cm, e sabendo-se que
N=1600, substituindo-se na equação [8], temos:
H = 30 cm / 1600
H = 0,01875 cm
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INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO
CROMATOGRAFIA GASOSA
CROMATOGRAFIA À GÁS (ou GASOSA): CG (“GC”)
Fase móvel: gás
Fase estacionária: sólido ou líquido
X
CROMATOGRAFIA À GÁS (CG)
1) Cromatografia gás-sólido: F.M. é um gás; F.E. é um sólido.
- Retenção dos analitos ocorre por adsorção física;
- Não tem ampla aplicação (retenção irreversível de analitos);
- Aplicada a analitos de baixo P.M. e pouco polares (isômeros).
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CROMATOGRAFIA À GÁS (CG)
1) Cromatografia gás-sólido: F.M. é um gás; F.E. é um sólido.
2) Cromatografia gás-líquido: F.M. é um gás; F.E. é um líquido
adsorvido ou quimicamente ligado a um suporte sólido.
- Retenção dos analitos ocorre por adsorção física;
- Não tem ampla aplicação (retenção irreversível de analitos);
- Aplicada a analitos de baixo P.M. e pouco polares (isômeros).
- Técnica denominada simplesmente de cromatografia gasosa;
- Separação dos analitos baseada no fenômeno de partição;
- Ampla aplicação em todas as áreas da ciência.
CROMATOGRAFIA GÁS-LÍQUIDO (CGL) ou apenas (CG)
- F.M. é um gás (não interage com analito);
- F.E. é um líquido de alto ponto de ebulição adsorvido física ou
quimicamente a um suporte sólido.
suporte
fase líquida
Gás
- O fenômeno físico-químico responsável pela interação do analito
+ F.E. líquida é a ABSORÇÃO. O equilíbrio envolvido no processo
de eluição do analito da coluna é a PARTIÇÃO do analito entre a
F.M. (gás) e a F.E. (líquido).
- A absorção ocorre no INTERIOR da F.E. líquida (fenômeno
INTRAfacial).
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1 2 3
4
5 6
7
1. Pressurização da fase móvel 2. Controle de fluxo
3. Introdução da amostra 4. Forno
5. Coluna 6. Detector
7. Aquisição e tratamento dos dados
COMPONENTES DE UM SISTEMA DE CG
Estação de gases
Integrador
Forno e
Coluna
Painel de
controle
Injetor
FOTOGRAFIA DE UM SISTEMA DE CG
Gás de arraste
Injetor
Forno com coluna
Coluna capilar
Detector FID
Integrador
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Gás de
arraste Injetor Coluna
Detector
Registrador
Tratamento
de dados
Aquecido para vaporizar amostra Aquecida
para
controlar tR
Aquecido para manter limpo
COMPONENTES AQUECIDOS EM UM
SISTEMA DE CG
AMOSTRAS TÍPICAS ANALISADAS POR CG
⇒ Gases, líquidos ou sólidos (introduzidos na vapor de vapor);
⇒ A amostra necessita ser VOLÁTIL;
⇒ Massa molecular entre 2 e 1000 daltons;
⇒ Compostos orgânicos ou inorgânicos.
CROMATOGRAMA TÍPICO
tempo de retenção
resp
osta
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SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA: MICROSERINGAS
Gás arraste
P/ coluna P/ coluna
Posição de injeção
da amostra
Posição de envio da
amostra para coluna amostra
“loop”
injeção
SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA:
VÁLVULAS DE INJEÇÃO
INTRODUÇÃO DE AMOSTRA EM CG: DEVE-SE EVITAR
INTRODUZIR AMOSTRAS NA FORMA DE “BANDAS LARGAS”!!!
t = 0
t = x
Banda Estreita Banda Larga
t=0
t=x
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Seringa
Coluna
Gás de arraste
Septo Bloco aquecido
Lã de vidro
INJETOR TÍPICO DE UM SISTEMA DE CG
MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: “SPLIT” (divisão da amostra)
p/ coluna
1 mL/min
descarte: 100 mL/min
descarte: 1 mL/min
Fluxo total: 102 mL/min
MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: “SPLITLESS” (sem divisão da amostra)
p/ coluna
1 mL/min
descarte: 0 mL/min
descarte: 1 mL/min
Fluxo total: 2 mL/min
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MODOS DE INJEÇÃO DA AMOSTRA: “ON COLUMN” (inj. direta na coluna)
p/ coluna
1 mL/min
descarte: 0 mL/min
descarte: 0 mL/min
Fluxo total: 1 mL/min
MANIPULAÇÃO CORRETA DA SERINGA DE INJEÇÃO
SISTEMA DE INTRODUÇÃO DE AMOSTRA:
MICRO EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (SPME)
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SPME: INTRODUÇÃO DA FIBRA NO SISTEMA DE CG
SISTEMAS DE DETECÇÃO PARA CG
- CARACTERÍSTICAS DO DETECTOR IDEAL PARA CG:
1. Sensibilidade adequada;
2. Boa estabilidade e reprodutibilidade;
3. Resposta linear por várias ordens de grandeza;
4. Suportar altas temperaturas;
5. Resposta rápida;
6. Seletivo;
7. Não destrutivo.
Nenhum detector apresenta todas as características citadas,
sendo que sua escolha deve basear-se na finalidade
analítica, bem como no tipo de amostra a ser analisada.
Análise Qualitativa usando CG
- A CG é um excelente método para a confirmar a presença ou
ausência de um determinado analito em uma amostra (após a
adição do padrão do composto de interesse, nenhum novo pico
deve aparecer no cromatograma).
- Existem basicamente três meios de ser realizar uma análise
qualitativa utilizando a técnica de CG:
1. Tempo de Retenção
2. Métodos Gráficos (Índices)
3. Métodos Analíticos Auxiliares
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Tempo de Retenção
Tempo de Retenção
Vantagens da CG
Elevada resolução
Alta velocidade de análise
Alta sensibilidade
Ótima exatidão
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OTIMIZAÇÃO DE UMA SEPARAÇÃO POR CG
- Comprimento da coluna;
- Diâmetro interno da coluna;
- Tubulação da coluna;
- Fase líquida presente na F.E.;
- Tamanho da amostra (quantidade injetada).
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
INSTRUMENTAIS DE ANÁLISE
MÉTODOS DE SEPARAÇÃO
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (ou a LÍQUIDO)
(CLAE OU “HPLC”)
Fase móvel: líquido
Fase estacionária: sólido ou líquido
X
CLAE: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
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EFICIÊNCIA DE UMA COLUNA DE CLAE
Efeito do diâmetro da partícula
3 µm
5 µm
10 µm
Tamanho da partícula
Dp (µm)
tR
(min)
No pratos
(N)
Pressão
(bar)
5,0 30 25000 19
3,0 18 42000 87
1,5 9 83000 700
1,0 6 125000 2300
Eficiência como função do Dp
Cromatograma mostrando o efeito da eficiência
como função do Dp
- CLAE não pode ser realizada em colunas capilares abertas : problema da
baixa difusão do soluto na fase móvel líquida.
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Em quais casos deve-ser usar a CLAE?
MODOS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
1) CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO (LÍQUIDO-LÍQUIDO)
2) CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (LÍQUIDO-SÓLIDO)
3) CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA
4) CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO (OU
CROMATOGRAFIA EM GEL)
APLICAÇÕES DA TÉCNICA DE CLAE
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Componentes de um sistema de CLAE
Fotografia de uma sistema de CLAE (1)
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Fotografia de uma sistema de CLAE (2)
Componentes de um sistema de CLAE
Reservatórios de F.M.
a) Eluição com gradiente
b) Eluição isocrática
F.M.: 50:50 (v/v) de
metanol/H2O durante
toda a análise.
F.M.: início 40:60 (v/v) de
metanol/H2O ; aumento do
metanol numa razão de
8%/min.
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Sistemas de Bombeamento
- Requisitos para um eficiente sistema de bombeamento:
1. Geração de pressões de até 6000 psi;
2. Saída com ausência de pulsos;
3. Velocidades de fluxo (vazão) variando de 0,1 a 10 mL/min;
4. Controle e reprodutibilidade relativa de fluxo de 0,5%;
5. Componentes resistentes a corrosão (aço inox ou teflon).
Existem 3 tipos de bombas para CLAE: 1) bombas
recíprocas, 2) bombas do tipo seringa e
3) bombas pneumáticas
Sistemas de Injeção de Amostras
- O método mais utilizado para introdução de amostras em
CLAE está baseado em alças (em inglês, loop) de
amostragem que podem ser trocadas de acordo com a
necessidade analítica (volumes de 5 a 500 µL).
- Alças de amostragem permitem a introdução de amostras a
pressões de até 7000 psi com excelente precisão.
Sistema de alça de amostragem para CLAE
Posição de Carregamento
da Amostra (load) Posição de Injeção
(Inject)
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Colunas para CLAE
- As colunas para CLAE geralmente são construídas em tubos
de aço inox. Os custos variam em torno de 200 a 1000
doláres (ou mais), dependendo do tipo de F.E.
Coluna típica para CLAE
Colunas analíticas usadas em CLAE
Detectores utilizados em CLAE
- Diferente do que ocorre em CG, em CLAE não existe um
detector universalmente aplicável, como o FID.
- O detector ideal em CLAE deve ter as mesmas propriedades
listadas para os detectores de CG, com exceção do
fornecimento de resposta em grande intervalo de temperatura.
- Os detectores usados em CLAE são de dois tipos básicos:
1) Detectores de propriedades universais: respondem a
propriedades da F.M. como um todo (ex: índice de refração)
2) Detectores de propriedades do soluto: respondem a certas
propriedades do soluto, como absorbância no UV ou
fluorescência.
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Principais detectores utilizados em CLAE
Detectores de Absorbância
> Volume cela pequeno: 1 a 10 µL
> L da cela: 2 a 10 mm
> Cela em “Z”: aumento do
caminho óptico
Detectores de Absorbância UV
1) UV com Filtros
- São fotômetros, com uma lâmpada de mercúrio como fonte. A linha em
254 nm (mais intensa) é isolada por filtros.
- Outras linhas podem ser isoladas: 250, 313, 334 e 365 nm.
- Esse tipo de detector é restrito a compostos que absorvem radiação
em tais comprimentos de onda.
- Fontes de filamento de deutério e de tungstênio com filtros
apropriados também podem ser úteis para algumas aplicações.
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1) UV com Monocromadores
- A maioria dos equipamentos de CLAE vem equipados com um
espectrofotômetro de varredura com redes ópticas, incluindo a
radiação UV e Visível.
- Com esses equipamentos pode-se utilizar-se de diferentes
comprimentos de ondas (aquele apropriado para cada pico sendo
eluído da coluna) se os compostos são suficientemente separados
um do outro.
- Os detectores espectrofotométricos UV mais poderosos são aqueles
equipados com arranjo de diodos, que permitem a coleta de dados de
um espectro inteiro em cerca de 1 segundo.
Detector de UV com arranjo de diodos para CLAE
Detectores de Fluorescência
- O esquema desse tipo de detector é similar aos fluorímetros e
espectrofluorímetros, com a fluorescencia sendo observada
perpendicularmente ao eixo de excitação.
- Os detectores mais simples usam uma fonte de mercúrio com um ou
mais filtros para isolar a bande de emissão de radiação.
- A grande vantagem dos detectores de fluorescência está na sua alta
sensibilidade.
- Detectores de fluorescência são utilizados em CLAE na análise de
compostos farmacêuticos, produtos naturais e produtos do petróleo.
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Detectores de Índice de Refração
- Esse tipo de detector tem a vantagem de responder a quase todos os
analitos. As desvantagens incluem sua alta sensibilidade a mudanças
de temperatura e a sua baixa sensibilidade de detecção.
Esquema de um detector de índice de refração diferencial
Detectores Eletroquímicos
- São baseados nos fenômenos de amperometria, polarografia,
coulometria e condutometria. Sendo que o mais utilizado baseia-se
na amperometria (simplicidade).
Grupos funcionais detectáveis por amperometria
Cela de um detector amperométrico para CLAE
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MODOS DE OPERAÇÃO EM CLAE
MODOS DE OPERAÇÃO EM CLAE
Cromatografia de Partição
- Pode ser subdividida em: cromatografia líquido-líquido e cromatografia
de fase ligada.
- Cromatografia líquido-líquido: a F.E. líquida é adsorvida fisicamente
sobre a superfície de um suporte sólido.
- Cromatografia fase ligada: a F.E. é quimicamente ligada sobre a
superfície de um suporte.
Colunas para Cromatografia de Fase Ligada
- A grande maioria dos suportes para F.E. utilizados em CLAE são
preparados à base de sílica.
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- Os recobrimentos mais utilizados como fase ligada são siloxanos
formados por reação da superfície hidrolisada da sílica com um
organoclorossilano:
- A cobertura por silanização está limitada a 4 µmol/m2 devido a efeitos
estéricos. Para desativar os grupos SiOH restantes faz-se umareação
com trimetilcloro-silano (processo chamado endcapping).
Cromatografia de Fase Ligada: Fase Normal e Fase Reversa
- A subdivisão da cromatografia de fase ligada em fase normal e fase
reversa está baseada na polaridade relativa das fases móvel e
estacionária.
CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL
- Nesse modo de cromatografia, a F.E. é polar e a F.M. é não-polar.
- Em cromatografia de fase normal, a F.E. tem caráter polar
(sintetizada a partir da sílica com grupos funcionais polares):
Fase estacionária polar (sílica, NH2, CN)
Fase móvel apolar
(Hexano, diclorometano)
Analito mais apolar Analito mais polar
amostra
- Em cromatografia de fase normal, os analitos polares tem maior
afinidade pela F.E. (polar) e, portanto, ficam mais retidos na coluna e
são os últimos a serem eluídos da coluna:
- A F.M. não contém água. Os solventes mais comumente utilizados
são: hexano e diclorometano. Um solvente e característica polar
(como metanol) pode ser usado em pequenas proporções para dar
seletividade a F.M. na eluição de analitos mais polares.
- A cromatografia de fase normal é mais utilizada na análise de
compostos lipofílicos: óleos, gorduras, lípidios.
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CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
- Nesse modo de cromatografia, a F.E. é não-polar e a F.M. é polar.
- Em cromatografia de fase reversa, a F.E. tem caráter apolar
(sintetizada a partir da sílica com grupos funcionais apolares):
Octadecil (C18)
Octil (C8)
- Em cromatografia de fase reversa, os analitos apolares tem maior
afinidade pela F.E. (apolar) e, portanto, ficam mais retidos na coluna
e são os últimos a serem eluídos:
Área intersticial (F.M.) Suporte da partícula Fase ligada
(A) – analito mais polar
(B) – analito menos polar
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Fase estacionária apolar (C8, C18)
Fase móvel polar
(metanol, acetonitrila, água)
amostra
Analito mais apolar Analito mais polar
- A F.M. contém água. Os solventes mais comumente utilizados são:
metanol e acetonitrila. A força de eluição para os analitos é dada pela
proporção do solvente orgânico. A proporção de água na F.M. é utilizada
para controlar o processo de retenção dos analitos.
- Fase Reversa é o modo de CLAE mais utilizado (em cerca de 75% dos
métodos). Pode ser utilizado na separaç ão de compostos não iônicos,
polares, até a compostos de polaridade intermediária.
separação rápida
separação lenta
separação muito
lenta
Efeito do Solvente em Fase Reversa
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Efeito do Tamanho do Cadeia sobre a Eficiência
de Separação
Fase Normal x Fase Reversa: tempos de eluição
para uma mistura de compostos
Desenvolvimento de Métodos em Cromatografia de
Partição (Fase Normal e Fase Reversa)
Seleção da Coluna
- A polaridade da F.E. da coluna deve ser combinada de maneira próxima
com a polaridade dos analitos a serem separados. A F.M. (de polaridade
diferente) é usada para eluição.
- Polaridade dos analitos: hidrocarbonetos < éteres < ésteres < cetonas <
aldeídos < amidas < aminas < alcoóis < água.
- Uma vez feita a escolha da F.M. e da F.E., o analista deve realizar uma
série de experimentos (tentativa e erro) até conseguir a separação dos
analitos de interesse. Caso a separação não seja ideal, deve-se escolher
outro sistema F.M./F.E.
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Seleção da Fase Móvel
- A F.M. em cromatografia de partição deve ser escolhida de modo a se
obter uma resolução adequada para todos os compostos em estudo.
- Em CLAE a maneira mais fácil de se obter uma boa resolução é através
da manipulação do fator de retenção (k), que é muito dependente da F.M.
utilizada.
- Caso os ajustes dos valores de k não dêem os resultados esperados na
resolução, a variação nos fatores de retenção (α) devem ser realizados.
> Isso pode ser feito variando-se a proporção dos solventes
utilizados na F.M.
> Isso pode ser feito mudando-se a composição dos solventes
usados na F.M.
APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO
- A cromatografia de partição, mais especificamente a cromatografia em
fase reversa, aproxima-se de um sistema universal ideal para a
cromatografia líquida devido à sua ampla aplicabilidade e facilidade de
manipulação dos fatores k e α quando se utiliza uma fase móvel aquosa.