Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica
Ação do antioxidante tempol na hipertensão em
ratos com resistência à insulina induzida por frutose
e alimentados com dieta rica em sal
Waleska Claudia Dornas Amaral
Ouro Preto 2013
Waleska Claudia Dornas Amaral
Ação do antioxidante tempol na hipertensão em
ratos com resistência à insulina induzida por frutose
e alimentados com dieta rica em sal
Ouro Preto NUPEB-UFOP
2013
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do titulo de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica. Orientador Dr. Marcelo Eustáquio Silva Laboratório de Nutrição Experimental
Catalogação: [email protected]
A485a Amaral, Waleska Claudia Dornas. Ação do antioxidante tempol na hipertensão em ratos com resistência à
insulina induzida por frutose e alimentados com dieta rica em sal [manuscrito] / Waleska Claudia Dornas Amaral. - 2014.
118f.: il. color.; tabs.; quadro. Orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
1. Frutose - Teses. 2. Resistência à insulina - Teses. 3. Reação de oxidação-reação - Teses. 4. Hipertensão - Teses. I. Silva, Marcelo Eustáquio. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.
CDU: 612.349.8
iv
v
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Nutrição Experimental da Escola de Nutrição da
Universidade Federal de Ouro Preto, com o auxílio financeiro da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
vi
Dedicatória
A todas as pessoas que ajudaram e que se dedicaram para a realização deste trabalho.
vii
Agradecimentos
Ao meu orientador, Prof. Marcelo Eustáquio Silva, pela oportunidade e confiança.
Ao colaborador na pesquisa, Prof. Wanderson Geraldo de Lima.
Ao Prof. Rinaldo Cardoso dos Santos, pela ajuda constante.
Aos colegas do laboratório que foram imprescindíveis em vários momentos da pesquisa.
Ao Laboratório de Bioquímica Metabólica.
Ao Laboratório Piloto de Análises Clínicas da Escola de Farmácia.
À Profa. Andreia Carvalho Alzamora e Prof. Deoclécio Alves Chianca Júnior por gentilmente disponibilizarem aparelho para medida de pressão arterial durante o estudo.
Ao técnico do Laboratório de Nutrição Experimental, Jair Pastor Mota.
viii
Resumo Dornas WC. Ação do antioxidante tempol na hipertensão em ratos com resistência à insulina induzida por frutose e alimentados com dieta rica em sal. [tese]. Ouro Preto: Universidade Federal de Ouro Preto, 2013. A frutose é um açúcar altamente lipogênico que tem efeitos metabólicos drásticos no fígado e está associado a muitos componentes da síndrome metabólica. No entanto, não se sabe se a hiperinsulinemia desencadeada por frutose dietética, que sensibiliza a pressão sanguínea para a ingestão de sal, causa ou não hipertensão sustentada e se o estresse oxidativo contribui para a regulação da pressão arterial em tais condições. Assim, nesse estudo foi inicialmente avaliado o efeito da dieta com elevado teor de sal em ratos alimentados com suplementação de frutose na água e, em sequência, foi testado se radical superóxido contribui para a elevação da pressão sanguínea nesse modelo. Glicemia e trigliceridemia de jejum foram maiores em ratos alimentados com frutose do que em ratos controle, enquanto que o fígado também diferiu nesses animais, produzindo esteatose. Ratos alimentados com frutose sob dieta rica em sal, reduziram sensibilidade à insulina desenvolvendo hiperinsulinemia, o que levou a aumento dos níveis de sódio sérico. Somado a isso, observou-se peroxidação lipídica com diminuição do nível de defesas antioxidantes verificado pela menor atividade das enzimas superóxido dismutase, catalase e diminuição da razão glutationa reduzida/oxidada no fígado. Especificamente, tratamento com frutose não causou uma direta ação hipertensiva, enquanto sobrecarga de sal elevou significativamente pressão arterial sistólica. A magnitude da hipertensão foi associada ao consumo de sal. Porém, ratos tratados associadamente com alto teor de frutose e de sal, mesmo consumindo menos sal que o grupo tratado apenas com sal, apresentaram níveis pressóricos semelhantes de aumento de pressão, podendo-se atribuir um papel contributivo para a frutose na elevação da pressão arterial. Por outro lado, administração do antioxidante tempol, um mimético da superóxido dismutase que é a maior enzima envolvida na remoção do radical superóxido, preveniu o progressivo aumento da resposta pressórica encontrada para ratos alimentados com alto teor de frutose e sal relacionado à melhora de desordem metabólica. Dessa forma, pode-se considerar que o estresse oxidativo contribuiu para as alterações na pressão arterial sistêmica, indicando a participação do radical livre de oxigênio, superóxido, na manutenção da pressão sanguínea no modelo desenvolvido. Palavras-chave: Frutose, resistência à insulina, estresse oxidativo, hipertensão, tempol.
ix
Abstract Dornas WC. Antioxidant action of tempol on hypertension in rats with insulin resistance induced by fructose and fed high-salt diet. [thesis]. Ouro Preto: Universidade Federal de Ouro Preto, 2013. Fructose is a highly lipogenic sugar that has profound metabolic effects in the liver and is associated with many of the components of metabolic syndrome. However, it is not known whether hyperinsulinemia triggered by dietary fructose, which sensitizes the blood pressure to salt intake, causes sustained hypertension and if oxidative stress contributes to the regulation of arterial pressure in such conditions. So, the current study initially evaluated the effect of a high-salt and fructose-enriched diet in rats, and in sequence whether superoxide radicals contribute to increased blood pressure in this model. Fasting glycemia and triglyceridemia were higher in fructose-fed rats than in control rats, whereas the liver also differed in these animals, generating steatosis. Fructose-fed rats with high-salt diet had reduced insulin sensitivity triggering hyperinsulinemia, which led to increased levels of serum sodium. In addition, lipid peroxidation and decreased antioxidant defenses as verified by the lower activity of superoxide dismutase, catalase, and a lower ratio of reduced/oxidized glutathione in the liver. Specifically, the fructose treatment did not cause a direct hypertensive action, while salt overload significantly elevated systolic blood pressure. The magnitude of hypertension was associated with salt intake. Despite consuming less salt, rats treated with fructose and salt showed a pattern of blood pressure rise similar to those consuming a high-salt diet, which indicates that fructose contributes to the rise in blood pressure. Moreover, administration of the antioxidant tempol, a mimetic of superoxide dismutase, the most commonly involved enzyme in the removal of superoxide radicals, prevented a progressive increase in the hypertensive response in high-fructose and salt-fed rats, associated with the improvement of metabolic disorder. Thus, it is possible that oxidative stress contributed to changes in systemic blood pressure, indicating the involvement of the oxygen free radical, superoxide, in the maintenance of blood pressure in the model developed.
Key words: Fructose, insulin resistance, oxidative stress, hypertension, tempol.
x
Sumário Introdução ......................................................................................................................................... 1
1- REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................................... 3
1.1 DOENÇAS CARDIOVASCULARES ........................................................................................ 3
1.1.1 Hipertensão ............................................................................................................... 5
1.1.2 Síndrome Metabólica ................................................................................................ 5
1.2 FRUTOSE ............................................................................................................................. 6
1.2.1 Frutose na alimentação ............................................................................................. 6
1.2.2 Metabolismo da frutose ............................................................................................ 8
1.2.3 Frutose, lipogênese e resistência à insulina ........................................................... 11
1.2.4 Frutose e hiperuricemia .......................................................................................... 15
1.2.5 Frutose e hipertensão .............................................................................................. 18
1.2.6 Frutose e estresse oxidativo.................................................................................... 21
1.3 SÓDIO ............................................................................................................................... 24
1.3.1 Sódio na alimentação .............................................................................................. 24
1.3.2 Fisiologia do sódio ................................................................................................... 26
1.3.3 Sódio e homeostase hídrica .................................................................................... 27
1.3.4 Sódio e hipertensão ................................................................................................. 29
1.3.5 Sódio e estresse oxidativo ....................................................................................... 31
2- OBJETIVOS ................................................................................................................................ 34
2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................................. 34
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................. 34
3- MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................................... 35
3.1 ANIMAIS E TRATAMENTOS ............................................................................................. 35
3.1.1 Protocolo A: Avaliação e padronização do modelo experimental......................... 35
3.1.2 Protocolo B: Efeito do antioxidante tempol em animais alimentados com dieta
rica em frutose e sal ................................................................................................................ 36
3.1.3 Dieta ......................................................................................................................... 37
3.1.4 Registro da pressão arterial e da frequência cardíaca por pletismografia ............ 37
3.1.5 Teste oral de tolerância à glicose ............................................................................ 38
3.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS .................................................................................................. 38
3.2.1 Determinação do hematócrito ................................................................................ 38
3.2.2 Contagem diferencial de leucócitos ........................................................................ 39
xi
3.2.3 Atividade da paraoxonase-1 ................................................................................... 39
3.2.4 Concentração da insulina e leptina ......................................................................... 39
3.2.5 Determinação de sódio ........................................................................................... 40
3.2.6 Extração da gordura hepática ................................................................................. 40
3.2.7 Oxidação de lipídeos (peroxidação lipídica) pela dosagem das substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico .............................................................................................. 40
3.2.8 Atividade da superóxido dismutase........................................................................ 41
3.2.9 Atividade da catalase .............................................................................................. 42
3.2.10 Concentração de glutationa .................................................................................... 42
3.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA ..................................................................................... 44
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...................................................................................................... 44
4- RESULTADOS ............................................................................................................................ 45
4.1 CARACTERIZAÇÃO DO MODELO EXPERIMENTAL ........................................................... 45
4.1.1 Peso corporal, da gordura abdominal e dos órgãos, ingestão alimentar,
indicadores de função hepática e parâmetros metabólicos .................................................. 45
4.1.2 Sódio sérico .............................................................................................................. 47
4.1.3 Células sanguíneas ................................................................................................... 48
4.1.4 Peroxidação lipídica e componentes dos sistemas antioxidantes ......................... 49
4.1.5 Histopatologia hepática .......................................................................................... 52
4.1.6 Pressão arterial sistólica e correlação com consumo de sal .................................. 54
4.2 AÇÃO DO ANTIOXIDANTE TEMPOL ................................................................................. 55
4.2.1 Ganho de peso, de gordura abdominal e ingestão alimentar ............................... 55
4.2.2 Hematócrito, proteínas e glicose plasmática ......................................................... 55
4.2.3 Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da paraoxonase-1 .......................... 56
4.2.4 Peso relativo do fígado e parâmetros de função hepática .................................... 57
4.2.5 Peso relativo dos rins e produtos de degradação metabólica ............................... 57
4.2.6 Resposta pressórica e relação com peroxidação lipídica ....................................... 58
4.2.7 Correlação entre pressão arterial média e parâmetros sanguíneos...................... 60
5- DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 61
6- CONCLUSÕES ............................................................................................................................ 77
Referências Bibliográficas ............................................................................................................... 78
Anexos ............................................................................................................................................ 102
xii
Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos
A ADH hormônio antidiurético AGL ácido graxo livre ALT alanina aminotransferase ALP fosfatase alcalina AMP monofosfato de adenosina ANG I angiotensina I ANG II angiotensina II ANP peptídeo natriurético atrial ATP trifosfato de adenosina APO-B apolipoproteína B AST aspartato aminotransferase AVE acidente vascular encefálico
B BH2 diidrobiopterina
BH4 tetrahidrobiopterina
C C controle CT controle + tempol CAT catalase CIS cisteína COX cicl ooxigenase
D DAHL-SS rato Dahl sensível ao sal
DAHL-SR rato Dahl resistente ao sal DAP doença arterial periférica DCV doença cardiovascular DCC doença cardíaca coronária DIC doença isquêmica do coração
EF ECA enzima conversora da angiotensina
ERO espécie reativa de oxigênio F frutose
FS10 frutose e sal 10 semanas FS20 frutose e sal 20 semanas FS20T frutose e sal 20 semanas + tempol
G GFR taxa de filtração glomerular
GLUT5 transportador de frutose GPx glutationa peroxidase GSH glutationa reduzida GSSG glutationa oxidada
H HAS hipertensão arterial sistêmica
HbA1c hemoglobina glicosilada HDL lipoproteína de alta densidade HFCS xarope de milho rico em frutose H2O2 peróxido de hidrogênio
xiii
HOMA modelo de avaliação da homeostase
IJK L LDL lipoproteína de baixa densidade
LDN lipogênese de novo
MN MDA malonildialdeído mRNA RNA mensageiro NaCl cloreto de sódio NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato NAFLD doença hepática gordurosa não alcoólica Na+K+-ATPase bomba de sódio potássio NCEP/ATP III National Cholesterol Education Progran – NCEP Adult Treatment Panel III NO óxido nítrico NOS óxido nítrico sintase eNOS óxido nítrico sintase endotelial nNOS óxido nítrico sintase neuronal
O (O2•−) ânion superóxido
(OH•) radical hidroxil OMS Organização Mundial de Saúde (ONOO−) peroxinitrito oxLDL lipoproteína de baixa densidade oxidada
P PA pressão arterial
PAD pressão arterial diastólica PAM pressão arterial média PAS pressão arterial sistólica PAT-1 transportador de cloro PON1 paraoxonase-1
Q R RI resistência à insulina
S S sal
SHR ratos espontaneamente hipertensos SM síndrome metabólica SNC sistema nervoso central SNS sistema nervoso simpático SOD superóxido dismutase SRA sistema renina-angiotensina SRAA sistema renina-angiotensina aldosterona
T TBA ácido tiobarbitúrico
TBARS substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TEMPOL 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil piperidina-1-oxil TG triacilglicerol TOTG teste oral de tolerância à glicose
UV VLDL lipoproteína de muito baixa intensidade
XWYZ WKY Wistar-Kyoto
xiv
Lista de Ilustrações
Figura 1: Taxas de mortalidade por doenças cardiovasculares e suas diferentes causas no Brasil,
em 2007.............................................................................................................................................. 4
Figura 2: Formas isoméricas da frutose ............................................................................................. 8
Figura 3: Frutose e metabolismo da glicose nas células do fígado .................................................... 9
Figura 4: Efeitos do consumo crônico de frutose. ........................................................................... 11
Figura 5: Mecanismo proposto pelo qual frutose na dieta resulta em hipertensão ....................... 19
Figura 6: Formação de EROs a partir da redução de O2 ................................................................... 21
Figura 7: Função renal na homeostase de água e sal. ..................................................................... 28
Figura 8: Protocolo A ........................................................................................................................ 36
Figura 9: Protocolo B ........................................................................................................................ 36
Figura 10: Teste oral de tolerância à glicose nos grupos experimentais ......................................... 47
Figura 11: Valores séricos de sódio para os grupos experimentais ................................................. 48
Figura 12: Concentrações das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no coração, no
fígado e no rim dos diferentes grupos experimentais ..................................................................... 49
Figura 13: Atividade da enzima superóxido dismutase no coração, no fígado e no rim dos
diferentes grupos experimentais. .................................................................................................... 50
Figura 14: Atividade da enzima catalase no coração, no fígado e no rim dos diferentes grupos
experimentais. .................................................................................................................................. 51
Figura 15: Concentração de glutationa total, reduzida, oxidada e relação de glutationa reduzida
para oxidada no fígado dos diferentes grupos experimentais......................................................... 52
Figura 16: Fotomicrografia representativa da coloração hematoxilina e eosina (H&E) de seções
hepáticas de ratos nos diferentes grupos experimentais ................................................................ 53
Figura 17: Correlação de Pearson entre valores de PAS final (mmHg) e consumo de sal (g/dia). .. 54
Figura 18: Comparação das mudanças ao longo dos tratamentos para pressão arterial sistólica
(PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e frequência cardíaca (FC) dos diferentes grupos
experimentais ................................................................................................................................... 59
Figura 19: Correlação de Pearson entre valores de PAS (mmHg), PAD (mmHg) final e substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (nmoles/mL). ................................................................... 59
Figura 20: Esquema dos efeitos gerais induzidos pelo modelo dietético utilizado e pelo tratamento
com tempol em ratos Fischer ........................................................................................................... 76
xv
Quadros
Quadro 1: Grupos de causas de óbito na população brasileira em 2007 .......................................... 4
Quadro 2: Critérios da NCEP/ATPIII ................................................................................................... 6
Quadro 3: Efeitos de diferentes rotas de administração de frutose em diferentes espécies por
variados períodos ............................................................................................................................. 14
Quadro 4: Quantidades equivalentes entre sódio e sal .................................................................. 25
Tabelas
Tabela 1: Composição das dietas dos grupos experimentais .......................................................... 37
Tabela 2: Características dos grupos experimentais ....................................................................... 46
Tabela 3: Contagem de leucócitos nos grupos experimentais ........................................................ 48
Tabela 4: Registro pressórico dos grupos experimentais ao longo do experimento ...................... 54
Tabela 5: Peso corporal, da gordura abdominal e ingestão alimentar nos grupos experimentais . 55
Tabela 6: Hematócrito, proteínas e glicose plasmática em animais experimentais ....................... 56
Tabela 7: Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da PON1 nos grupos experimentais ........ 56
Tabela 8: Peso relativo do fígado, atividade sérica de transaminases e fosfatase alcalina nos
grupos experimentais ....................................................................................................................... 57
Tabela 9: Peso relativo dos rins e produtos de degradação nos grupos experimentais ................. 58
Tabela 10: Correlação entre PAM final (mm/Hg) e parâmetros sanguíneos nos grupos
experimentais ................................................................................................................................... 60
Introdução
1
Introdução
A ocorrência generalizada de doenças crônicas como obesidade, diabetes,
hipertensão e dislipidemia, juntas conhecidas como síndrome metabólica (SM),
crescentemente causam morbidade e mortalidade em humanos (LAKKA et al., 2002;
GANG et al., 2004; GIRMAN et al., 2004). Entretanto, frente à complexa interação entre
susceptibilidade genética e fatores ambientais, o papel de cada um dos elementos
envolvidos nessa enfermidade é, muitas vezes, pouco compreendido devido a aspectos
éticos ou inerentes à própria doença e ao modo de investigação limitarem o estudo em
seres humanos. Esse fato levou os pesquisadores a utilizarem modelos animais tornando-
os extremamente úteis e vantajosos por fornecerem subsídios para a melhor
compreensão das causas e da progressão da doença, além de testarem potenciais
intervenções terapêuticas. Nesse sentido, uma grande variedade de modelos
experimentais geram dados que são ferramentas importantes para a investigação das
doenças cardiovasculares (DCVs).
Uma mudança no padrão dietético de ratos foi utilizada no presente estudo,
tentando mimetizar a dieta ocidental, uma vez que está bem estabelecido que o alto
consumo de produtos alimentícios industrializados, ricos em açúcar e em sal e que
promovem distúrbios à homeostase, potencializam a incidência de DCV. O aumento no
consumo alimentar de frutose coincide com a crescente prevalência de obesidade e SM
nas duas últimas décadas (JOHNSON et al., 2007) e dados observacionais e experimentais
indicam uma associação entre maior consumo de sal nos dias atuais e elevação da
pressão arterial (PA) (ELLIOTT & BROWN, 2006). Todavia, os mecanismos pelos quais
decorrem todas essas alterações promovidas por diferentes fatores, permanecem
parcialmente desconhecidos, o que evidencia a importância de maiores investigações.
Pesquisa em roedores demonstra que o aumento da ingestão dietética de frutose
estimula a absorção de sal no intestino delgado e nos túbulos renais, resultando em
estado de sobrecarga de sal, ajustando-se, assim, em movimento a uma cascata de
eventos que levam à hipertensão (SOLEIMANI & ALBORZI, 2011). Além disso, o excesso de
ingestão de sódio e alterações na manipulação do mineral, conduzindo à sua retenção,
Introdução
2
são conceitos fisiopatológicos básicos da hipertensão arterial. A insulina apresenta um
efeito antinatriurético, estimulando a reabsorção renal de sódio. Esse efeito é claramente
mantido, e, talvez aumentado, em indivíduos com resistência à insulina (RI),
representando também um papel importante no desenvolvimento da hipertensão arterial
(HORITA et al., 2011).
Por outro lado, há evidências de que o tratamento com antioxidantes, como a
vitamina E, melhora a RI em ratos alimentados com frutose (FAURE et al., 1997) e previne
hipertensão (VASDEV et al., 2002). Acredita-se que dano oxidativo causado pela dieta é
devido a defeito no mecanismo de defesa antioxidante e ao aumento da produção de
radicais livres que desempenham um papel fundamental nas alterações cardiovasculares
associadas à RI (DELBOSC et al., 2005). Alto conteúdo de sal na dieta de ratos obesos, por
sua vez, foi associado a estresse oxidativo e à mudanças renais (DOBRIAN et al., 2003)
com possibilidade de que a elevada produção de radical superóxido (O2•−) vascular
origina-se, principalmente, a partir de uma maior atividade de nicotinamida adenina
dinucleotídeo fosfato (NADPH)-oxidase.
Desse modo, o interesse no papel do estresse oxidativo em uma variedade de
doenças chama a atenção para substâncias que impedem a geração de espécies reativas
de oxigênio (EROs). Tempol (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil), um membro da
família nitróxido, tem sido estudado extensivamente em modelos animais de estresse
oxidativo aumentado e os seus efeitos, sobre a função endotelial e hipertensão, costuma
mostrar resultados diversos em função dos diferentes modelos usados (BANDAY et al.,
2005; PRETI et al., 2005; DeRICHELIEU et al., 2005; PIRES et al., 2010). A química do
tempol e seus efeitos sobre a regulação da PA foi revisada recentemente (WILCOX &
PEARLMAN, 2008) e, assim, de acordo com todos esses dados, o estudo propõe que, com
a retirada dos O2•−, através do uso de tempol, se avalie a hipótese de que estresse
oxidativo é mediador da resposta hipertensiva em ratos com RI, alimentados com frutose
e sal.
Revisão de Literatura
3
1- REVISÃO DE LITERATURA
1.1 DOENÇAS CARDIOVASCULARES
O termo DCV é de natureza genérica e descreve um conjunto de enfermidades,
muitas vezes, relacionadas entre si. Essas podem incluir a doença cardíaca coronária
(DCC), afetando vasos sanguíneos que irrigam os músculos do coração, doença
cerebrovascular, que afeta os vasos sanguíneos que irrigam o cérebro e doença arterial
periférica (DAP), afetando vasos sanguíneos que irrigam os membros. Outras patologias
também incluem doença cardíaca congênita, malformação da estrutura do coração,
doença reumática do coração com danos ao músculo cardíaco e em válvulas por febre
reumática, além de hipertensão por elevação crônica da PA maior do que 140 mmHg para
pressão sistólica e 90 mmHg para pressão diastólica.
A mortalidade por DCV aumenta progressivamente com a elevação da PA de
forma linear, contínua e independente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde
(OMS), dentre as mortes cujas causas foram registradas em 2008, as DCVs foram
responsáveis por aproximadamente 17,3 milhões de mortes (48%), sendo que desses 7,3
milhões foram por doença isquêmica do coração (DIC) e 6,2 milhões por acidente vascular
encefálico (AVE), seguida por doenças como câncer e outras doenças não transmissíveis
(21%), doenças respiratórias (12%) e diabetes mellitus (3%) (WILLIAMS, 2010), ocorrendo
na maioria em países de baixo e médio desenvolvimento econômico e mais da metade
em indivíduos entre 45 e 69 anos.
Para análise das tendências de mortalidade no Brasil, dados do Ministério da
Saúde revelam que no Brasil, em 2007, as DCVs também foram responsáveis pelo maior
número de casos de morte, o qual correspondeu a 29% do total de óbitos ocorridos e
registrados (Figura e Quadro 1). Foram utilizadas, para cálculo das taxas, as informações
de população do IBGE e as projeções disponibilizadas pelo Datasus. A elevação dessa
incidência, principalmente nos países em desenvolvimento, se deve a fatores como o
aumento da expectativa de vida, à diminuição ou controle de doenças infecto-parasitárias
e ao aumento do poder socioeconômico, propiciando mudança no estilo de vida para pior
Revisão de Literatura
4
em relação aos fatores patogênicos da doença (GUS et al., 2002). Aproximadamente 75%
dos casos novos de DCV ocorridos nos países desenvolvidos, nas últimas décadas, poderiam
ser explicados por dieta e atividade física inadequada, níveis lipídicos desfavoráveis,
obesidade, elevação da PA e fumo, ressaltando, assim, a importância do reconhecimento de
tais fatores para uma conduta individual mais adequada (KANNEL & WILSON, 1997).
Figura 1: Taxas de mortalidade por doenças cardiovasculares e suas diferentes causas no Brasil, em 2007. Adaptado de MALTA et al. (2009). AVE (acidente vascular encefálico); DIC (doença isquêmica do coração);
HAS (hipertensão arterial sistêmica).
Quadro 1: Grupos de causas de óbito na população brasileira em 2007
Causas de mortalidade Masc % Fem % Total %
Doenças do aparelho circulatório 158435 26,7 144220 33,0 302682 29,4
Neoplasias (tumores) 83719 14,1 71998 16,5 155734 15,1
Causas externas de morbidade e mortalidade 107146 18,1 20996 4,8 128255 12,4
Doenças do aparelho respiratório 55490 9,4 47331 10,8 102834 10,0
Sintomas, sinais e achados anormais clínicos e laboratoriais 48596 8,2 36802 8,4 85469 8,3
Doenças endócrinas, nutricionais e metabólicas 26315 4,4 32543 7,4 58867 5,7
Doenças do aparelho digestivo 33250 5,6 18654 4,3 51910 5,0
Doenças infecciosas e parasitárias 27428 4,6 19051 4,4 46487 4,5
Algumas afecções originadas no período perinatal 16059 2,7 12167 2,8 28328 2,7
Doenças do sistema nervoso 9653 1,6 9503 2,2 19157 1,9
Doenças do aparelho geniturinário 9136 1,5 8282 1,9 17419 1,7
Malformação congênita e deformidades 5387 0,9 4906 1,1 10398 1,0
Transtornos mentais e comportamentais 7728 1,3 2518 0,6 10249 1,0
Doenças do sangue dos órgãos hematopoiéticos 2758 0,5 2734 0,6 5492 0,5
Doenças do sistema osteomuscular e tecido conjuntivo 1200 0,2 2394 0,5 3595 0,3
Doenças da pele e do tecido subcutâneo 1066 0,2 1397 0,3 2464 0,2
Gravidez, parto e puerpério 0 0,0 1637 0,4 1637 0,2
Doenças do ouvido e da apófise mastóide 79 0,0 65 0,0 144 0,1
Doenças do olho e anexos 13 0,0 15 0,0 28 0,0
Total 593458 100 437213 100 1031149 100 Fonte: SIM/DASIS/SVS/Ministério da Saúde
29
71 Doenças cardiovasculares
Outras causas AVE DIC HAS Outras causas
31,10% 31,00%
12,80%
25,10%
Revisão de Literatura
5
1.1.1 Hipertensão
Embora hipertensão seja reconhecida como o maior fator de risco para DCV (VASAN,
et al. 2001), os mecanismos pelos quais a HAS contribui para o desenvolvimento da doença
vascular são complexos e ainda pouco entendidos. Um aspecto fundamental da patogênese é
que, habitualmente, existem cofatores aterogênicos interagindo, com efeito multiplicativo ao
da eventual hipertensão arterial como a dislipidemia, a intolerância à glicose e a obesidade.
Contudo, parece claro que a HAS desempenha papel central nesse processo, uma vez que a
aterosclerose significativa, raramente, ocorre em segmentos do sistema circulatório com
baixo regime pressórico, tais como artérias pulmonares ou veias, a despeito da sua exposição
aos mesmos fatores circulantes aterogênicos. Portanto, o mecanismo pelo qual se desenvolve
o processo hipertensivo é de ordem multifatorial e diretamente ligado a alterações
metabólicas crônicas (GRUNDY et al., 2004). Entre hipertensos com SM, observa-se uma alta
prevalência de lesões em órgãos-alvo com impacto prognóstico adverso. Estudos recentes
indicam, dentre as lesões identificadas, elevada prevalência de hipertrofia de ventrículo
esquerdo, disfunção diastólica, aterosclerose de carótida, alterações na distensibilidade
aórtica, retinopatia hipertensiva e microalbuminúria, quando comparados portadores de
hipertensão arterial associada à SM com hipertensos sem outras manisfestações
características da síndrome (MULÈ et al., 2005).
1.1.2 Síndrome Metabólica
Inicialmente descrita por Reaven (1988), a SM foi caracterizada por uma constelação
de fatores de risco cardiovascular, incluindo dislipidemia aterogênica, intolerância à glicose,
hipertensão e obesidade visceral, condições que estão intimamente associadas a RI. Aliás, há
um consenso geral de que a RI/hiperinsulinemia são as características mais importantes da
SM e, na verdade, por vezes a SM é referida como um estado de RI. Isso pode ser devido à
associação da RI com outras manifestações da SM, especialmente com a hipertensão.
Entretanto, embora existam muitas definições para a SM como a National Cholesterol
Education Progran – NCEP Adult Treatment Panel III (NCEP/ATP III); International Diabetes
Federation (IDF), Organização Mundial de Saúde (OMS) e outras, a definição da NCEP/ATP III
é a mais amplamente usada, tanto na prática clínica como em estudos epidemiológicos.
Trata-se de um guia com foco no risco cardiovascular, que não usa como critério obrigatório a
evidência de anormalidades na insulina ou na glicemia. Apesar desse guia considerar a DCV
Revisão de Literatura
6
como desfecho primário da SM, muitos dos portadores dessa síndrome apresentam RI, o que
lhes confere um risco aumentado para o desenvolvimento da diabetes do tipo 2. Os critérios
da NCEP/ATP III encontram-se no quadro 2.
Quadro 2: Critérios da NCEP/ATPIII
Parâmetro Número de alterações > 3 de: Glicose > 100 mg/dL ou em tratamento para hiperglicemia Colesterol-HDL Homens: < 40 mg/dL ou em tratamento para HDL baixo
Mulheres: < 50 mg/dL ou em tratamento para HDL baixo Triacilglicerol TG > 150 mg/dL Obesidade Cintura > 102 cm para homens ou > 88 cm para mulheres Hipertensão PA >130 x 85 mmHg ou em tratamento medicamentoso para hipertensão Lipoproteína de alta densidade (HDL); Triacilglicerol (TG); Pressão Arterial (PA); National Cholesterol Education
Progran – NCEP Adult Treatment Panel III (NCEP/ATPIII/2001).
Vários estudos em animais e humanos sugerem que o consumo excessivo de frutose
pode contribuir para o aumento da prevalência da SM e seus componentes, incluindo a
hipertrigliceridemia, baixa concentração de lipoproteína de alta densidade (HDL), obesidade,
hipertensão arterial, hiperglicemia e hiperuricemia (HWANG et al., 1987; BEZERRA et al.,
2001; NAKAGAWA et al. 2006). Ao lado de modelos genéticos desenvolvidos para a pesquisa,
como rato Zucker obeso (CARLSON et al., 2000), a SM é induzida por vários protocolos
experimentais que incluem administração de sacarose e frutose na dieta. Ratos Wistar e
Sprague-Dawley alimentados com alto teor de frutose por várias semanas apresentam
aspectos característicos da SM, embora os resultados não sejam totalmente conclusivos.
Investigações envolvendo intervenções de longo prazo e nas quais sejam empregadas
quantidades de açúcares normalmente ingeridos são necessárias e podem preencher a lacuna
de informações sobre o tema.
1.2 FRUTOSE
1.2.1 Frutose na alimentação
Nos últimos anos, principalmente em países desenvolvidos, podemos considerar que
a ingestão de sacarose e frutose vem aumentando, acentuadamente, em decorrência do
maior consumo de produtos industrializados (BRAY et al., 2004). Enquanto por muito tempo o
consumo humano de frutose era entre 16 a 20 gramas/dia, em grande parte pelo consumo de
frutas frescas, a ocidentalização da alimentação resultou em aumento significativo na frutose
Revisão de Literatura
7
adicionada à dieta que pode atingir 60 a 100 gramas/dia e até 150 gramas/dia, se somada a
frutose proveniente da sacarose (PARK & YETLEY, 1993; BASCIANO et al., 2005).
Com avanços nas tecnologias de isomerização, de separação e de cristalização na
década de 1960, tornou-se possível a produção de frutose cristalina e de xarope de milho rico
em frutose (HFCS) (HANOVER & WHITE, 1993). Em particular, a introdução de HFCS, na
década de 1970, resultou em um consumo acelerado de adoçantes nos EUA, em parte devido
ao HFCS ser mais facilmente solubilizado em alimentos processados (BRAY et al., 2004).
Assim, a frutose foi incorporada em fórmulas envolvidas no preparo de frutas enlatadas,
geleias, doces em pasta, bolos, pudins, tabletes, pó para bebidas, refrigerantes etc., uma vez
que é 1,5 vezes mais doce do que a sacarose bem como seu custo vem sendo gradualmente
reduzido ao longo dos anos como resultado da melhoria nos processos envolvidos na
obtenção.
No Brasil, embora a ingestão de frutose não esteja bem estabelecida, estima-se um
consumo médio de aproximadamente 4 gramas/dia de frutose livre, originária de frutas,
doces, hortaliças e outros vegetais. Já a quantidade de frutose advinda da sacarose é de
aproximadamente 27,5 gramas/dia. Essa estimativa foi baseada em dados estatísticos de
consumo de produtos alimentares fornecidos pelo Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística, utilizando-se como fonte as pesquisas sobre orçamentos familiares. Estudos
mostraram que a dieta do brasileiro vem sendo modificada com uma tendência para redução
do consumo de leguminosas, hortaliças, frutas e aumento do consumo de açúcares simples e,
consequentemente, de frutose, principalmente proveniente da sacarose (MONTEIRO et al.,
2000).
Analisando os dados da Pesquisa de Orçamentos Familiares 2008-2009, podemos
notar aumento considerável no consumo de refrigerantes (400%), se comparado ao consumo
na década de 70 (IBGE, 2010). A disponibilidade relativa dos macronutrientes evidencia
excesso do teor de açúcar para as famílias das cinco regiões geográficas (variando de 13,9%
das calorias totais na Região Norte a 17,4% na Região Sudeste). O limite máximo de 10% para
a proporção de calorias provenientes de açúcares é amplamente ultrapassado em todas as
regiões e classes de rendimentos. Cabe ressaltar que esse é um aspecto que comprova as
tendências na alteração dos hábitos alimentares, observados atualmente no Brasil e no
mundo, traduzidos pela frequente troca de alimentos naturais, mais saudáveis, por alimentos
industrializados.
Revisão de Literatura
8
1.2.2 Metabolismo da frutose
A frutose é um monossacarídeo (C6H12O6) composto por seis átomos de carbono
unidos em ligações covalentes simples, apresentando grupamentos hidroxila, formados por
hidrogênio e oxigênio e um grupamento carbonila, formado por ligação dupla entre o
carbono e o oxigênio. A posição desse grupamento é que determinará, após a hidrólise do
monossacarídeo, se ele dará origem à cetona ou ao aldeído. A frutose, contendo o
grupamento carbonila no final da cadeia, quando hidrolisada, fornecerá cetona, e será
denominada cetohexose. Em equilíbrio, a frutose pode ser encontrada na forma
frutopiranose (70%) e frutofuranose (30%)(Figura 2).
Figura 2: Formas isoméricas da frutose. PONTIS & FISCHER, 1963.
Absorvida no jejuno e transportada para o interior do enterócito através do
transportador específico GLUT5 (transportador de frutose), a ação da frutose não depende da
estimulação pela insulina. Após a absorção, a frutose atinge a veia porta até o fígado,
transportada pela GLUT2 (MAYES, 1993). No hepatócito, a frutose é rapidamente fosforilada
no carbono 1, em uma reação mediada pela frutoquinase, ou no carbono 6, pela
hexoquinase. A maior parte da frutose é fosforilada no carbono 1, pois a hexoquinase tem
maior afinidade com a glicose (HALLFRISCH, 1990). A frutose-1 fosfato, a qual se acumula
rapidamente no fígado é quebrada em duas trioses, diidroxiacetona e gliceraldeído-fosfato,
Revisão de Literatura
9
em uma reação mediada pela aldolase B. Essas duas trioses poderão seguir três caminhos
distintos, com finalidades diferentes: 1) participar da via glicolítica fornecendo piruvato, o
qual é convertido para ácido láctico sob condições anaeróbicas ou entrar no ciclo do ácido
cítrico como acetil coenzima A sob condições aeróbicas liberando energia; 2) a diidroxicetona
fosfato pode ser reduzida para glicerol-3-fosfato, necessário para a síntese de triacilglicerol
(TG), fosfolipídio e outros lipídios e, finalmente, 3) a diidroxicetona fosfato pode ser
condensadas até formar a frutose-1,6-bifosfato pela aldolase e formar glicose ou glicogênio.
Dessa forma, dará origem ao piruvato, ao lipídio e ao glicogênio (HALLFRISCH, 1990). Na
figura 3, estão apresentadas as vias metabólicas da frutose e da glicose.
O controle do metabolismo da glicose está relacionado a um derivado fosforilado da
frutose. Trata-se da frutose-2,6-bifosfato que está presente em todos os tecidos dos
mamíferos, exceto nos eritrócitos maduros, sendo o mais potente efetor da
fosfofrutoquinase (VAN SCHAFTINGEN, 1988). A frutose-2,6-bifosfato desempenha papel
Figura 3: Frutose e metabolismo da glicose nas células do fígado. Adaptado de HAVEL, 2005.
Gliceraldeido
sfato
Dihidroxicetona fosfato Gliceraldeido-3-fosfato
Frutoquinase G-6-fosfatase
Glicoquinase
Frutose Glicose
Glicose-6-fosfato
Frutose-1-fosfato
Frutose-6-fosfato Frutose e
metabolismo da glicose nas
células do fígado. Adaptado de
HAVEL, 2005.-fosfato
Frutose-1-6-bifosfato
Glicose
Fosfofrutoquinase ATP
-
-
Citrato
Citrato
Glicerol 3-P Piruvato Lactato
Acil-CoA Acetil-CoA Acil-glicerol
VLDL CO2 + ATP
Revisão de Literatura
10
importante na regulação da glicólise e, também, controla a gliconeogênese. O nível de
frutose-2,6-bifosfato parece afetar a atividade de duas importantes enzimas regulatórias
controlando o catabolismo e o anabolismo do carboidrato no fígado (fosfofrutoquinase e
frutose-1,6-bifosfatase). Altos níveis de trifosfato de adenosina (ATP) e de citrato exercem
inibição da fosfofrutoquinase, o que permite a regulação da reação de acordo com o estado
energético da célula (TORNHEIM & LOWENSTEIN, 1976); portanto, monofosfato de adenosina
(AMP) estimula a frutose-2,6-bifosfatase, a qual, então, forma frutose-6-fosfato, diminuindo o
nível de frutose-2,6-disfosfato. Esse nível diminuído de frutose-2,6-bisfosfato estimula a
frutose-1,6-bifosfatase, o qual favorece a conversão de frutose-1,6-bifosfato para frutose-6-
fosfato, um intermediário da gliconeogênese. Em contraste, aumento na frutose-2,6-bifosfato
estimula a 6-fosfofrutoquinase, a qual converte frutose-6-fosfato para frutose-1,6-bifosfato,
favorecendo a glicólise. Como o metabolismo da frutose não é afetado pelo passo regulador
da glicólise, fosforilações da frutose podem levar à depleção de ATP e ao aumento na síntese
de TG.
A ingestão de frutose resulta em menores excursões da glicemia pós-prandial em
comparação à glicose (GLINSMANN & BOWMAN, 1993). No entanto, quando quantidades
maiores de frutose são consumidas (por exemplo, em sacarose e HFCS), frutose continua a
entrar na via glicolítica e a produção de TG hepático é facilitada. A frutose pode fornecer
átomos de carbono, tanto para o glicerol quanto para as porções acil de moléculas de
acilglicerol (HALLFRISCH, 1990) e, assim, ao contrário do metabolismo da glicose, no qual a
absorção da glicose é negativamente regulada pela enzima fosfofrutoquinase, concentrações
elevadas de frutose podem servir como uma fonte relativamente desequilibrada de acetil-
CoA. De fato, os estudos em seres humanos mostraram que a ingestão de frutose resulta em
maiores taxas de lipogênese de novo (LDN) (LÊ et al., 2009). Dessa forma, frutose é mais
lipogênica do que a glicose, um efeito que pode ser exacerbado em doentes com
hiperlipidemia existente (JEPPESEN et al., 1995), ou com RI ou diabetes do tipo 2 (ABRAHA et
al., 1998). Além disso, a frutose não estimula a produção de insulina e leptina, que estão
envolvidas na regulação da homeostase energética. Portanto, a diminuição nas respostas de
insulina e a produção de leptina associadas ao consumo crônico de dietas ricas em frutose
podem ter efeitos nocivos a longo prazo sobre a regulação da ingestão de energia.
Revisão de Literatura
11
1.2.3 Frutose, lipogênese e resistência à insulina
Inicialmente, a frutose atraiu grande interesse como adoçante para pacientes com
diabetes mellitus, devido ao seu baixo índice glicêmico (UUSITUPA, 1994). Todavia, resultados
de vários estudos propõem que o consumo de frutose pode promover especificamente a
deposição de lipídios no tecido adiposo (BRAY et al., 2004; VASANKARI & VASANKARI, 2006;
STANHOPE & HAVEL, 2009), embora não aumente de forma aguda os níveis de glicose ou de
insulina no sangue, em contraste com a glicose. Curiosamente, o perfil de TG plasmáticos são
aumentados após o consumo de frutose com maior taxa de conversão da frutose em lipídios
no fígado e na taxa de secreção e de remoção de TG (BAR-ON & STEIN, 1968). Isso sugere que
a lipogênese pode ser o núcleo das alterações bioquímicas induzidas por frutose, apesar de
evidências emergentes demonstrarem que a estimulação simultânea de vias fisiológicas
alternativas também podem contribuir para os efeitos deletérios da frutose (Figura 4).
Figura 4: Efeitos do consumo crônico de frutose. Distúrbios ocorrem em vários tecidos, incluindo o fígado, o tecido
adiposo, o sistema gastrointestinal e o sistema nervoso central (SNC). GLP-1 (Peptídeo tipo I tipo glucagon); GLUT5 (Transportador de Frutose, tipo 5).
Revisão de Literatura
12
O aumento na taxa de frutose induzindo LDN gera ácidos graxos, que podem, então,
ser incorporados em TG ou em outras espécies lipídicas, e são associados ao aumento na
síntese de lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL). Esse aumento das VLDL-TG
desempenha importante papel na doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD)
(OUYANG et al., 2008). A administração a longo prazo de frutose para ratos resulta em
macro-e microvesicular esteatose hepática, com aumento de aproximadamente 200% em
TGs hepáticos e 90% na concentração de colesterol hepático (ACKERMAN et al., 2005).
Entretanto, enquanto roedores tratados com frutose pode ser um modelo sustentável para
estudar vários aspectos da NAFLD humana (ANSTEE & GOLDIN, 2006; KAWASAKI et al., 2009;
CASTRO et al., 2011), a acumulação de gordura intra-hepática como consequência da
ingestão de frutose também tem sido menos documentada em humanos.
Assy et al. (2008) verificaram que pacientes que apresentam NAFLD sem fatores de
riscos clássicos consomem mais refrigerantes e sucos adoçados que controles. Os dados
demonstram correlação entre a gravidade da esteatose hepática e a quantidade de consumo
de refrigerantes e, como esperado, os níveis de RI foram maiores em pacientes com NAFLD
(ABDELMALEK et al., 2010). A retenção de lipídios nos hepatócitos é um pré-requisito para o
desenvolvimento da NAFLD. No tecido adiposo a RI acentua a lipólise de TG e inibe a
esterificação de ácidos graxos livres (AGLs), resultando em aumento dos níveis circulantes de
AGL que são captados pelo fígado. Adicionalmente nos hepatócitos, a hiperinsulinemia
aumenta a síntese de novo de ácidos graxos e inibe a sua β-oxidação. A consequência dessas
ações ocasionadas pela insulina é o acúmulo de AGL dentro dos hepatócitos. Além disso, a
síntese hepática de TG é guiada pelo aumento do conteúdo de AGL nos hepatócitos e
favorecida pela suprarregulação, mediada pela insulina. A RI hepática facilita a liberação de
EROs, bloqueia a secreção de TG dos hepatócitos pelo aumento da degradação intracelular de
VLDL e apolipoproteina B-100 (Apo-B100) e bloqueia a exocitose de vesículas contendo VLDL
(ANGULO, 2002; GRATTAGLIANO et al., 2008; PREISS & SATTAR, 2008). Dessa maneira é
possível observar que a entrada e síntese de novo de AGL no fígado ultrapassam sua oxidação
e secreção de TG, resultando em um efeito em cascata de acúmulo hepático de gordura,
podendo explicar o papel chave da RI no desenvolvimento da esteatose hepática.
Embora a frutose não aumente agudamente os níveis de insulina, a sua exposição
crônica parece causar indiretamente hiperinsulinemia. Em ratos alimentados com 66% de
frutose por 3 semanas, o mRNA do receptor de insulina e o números de receptores de
Revisão de Literatura
13
insulina no músculo esquelético foram significativamente diminuídos em comparação aos
ratos alimentados com uma dieta de ração padrão (CATENA et al., 2003). Em outro estudo,
descobriu-se que, após 28 dias de alimentação com frutose, não houve alterações na
concentração do receptor de insulina, mas a autofosforilação, um mecanismo necessário para
a sua ação, foi reduzida para 72% no fígado (UENO et al., 2000). Existem numerosos trabalhos
com roedores em que a frutose na dieta induz hiperlipidemia e é uma forma comum de
reproduzir características da SM (RUTLEDGE & ADELI, 2007). Dessa forma, animal alimentado
com frutose é um modelo experimental útil de RI e uma ferramenta para o estudo de vários
aspectos da SM (Quadro 1) devido mimetizarem diversas respostas fisiológicas humanas.
Ratos alimentados com dieta rica em frutose pode desenvolver hiperinsulinemia,
hipertrigliceridemia, RI e hipertensão. Thorburn et al. (1989) usaram ratos alimentados com
uma dieta contendo 35% de energia como frutose por 4 semanas e encontraram redução da
sensibilidade à insulina associada à prejudicada ação da insulina hepática e disponibilidade de
glicose. Blakely et al. (1981) mostraram aumentos nas concentrações de insulina e glicose de
jejum em ratos que consumiram 15% da energia como frutose por 15 meses, apesar de não
haver diferenças no peso corporal ou na ingestão de comida. Ao contrário de dietas ricas em
gordura, dietas ricas em sacarose causam RI na ausência de aumento da gordura visceral, mas
aumentam o conteúdo de TG no fígado e nos músculos, levando a um aumento de RI em
ratos machos (PAGLIASSOTTI et al., 1996). Em contrapartida, estudos demonstram que
fêmeas não desenvolvem hiperinsulinemia ou hipertensão com alimentação rica em sacarose
e frutose exceto após ovariectomia, sugerindo que os hormônios sexuais femininos podem
conferir uma proteção (HORTON et al., 1997; GALIPEAU et al., 2002). Porém, a ausência do
efeito de hormônios sexuais isoladamente (animais ovariectomizados) não causa mudança
significativa na PA, além de ovariectomia por si só também não afetar parâmetros
metabólicos (GALIPEAU et al., 2002). Apesar de nos animais não existir dúvida de que a
ingestão elevada de frutose causa RI, em humanos a evidência é menos clara. Um ensaio
clínico conduzido em 12 mulheres demonstrou que uma dieta isocalórica com elevados
teores de frutose resultou em redução na glicemia, insulinemia de jejum e leptina associado
ao aumento na concentração sérica de TG quando comparada a uma dieta com teor elevado
de glicose. O balanço controlado pelo sistema nervoso central (SNC) foi influenciado pela
insulina e leptina e, assim, dieta rica em frutose representa um fator de risco potencial para o
ganho de peso corporal (TEFF et al., 2004).
Revisão de Literatura
14
Quadro 3: Efeitos de diferentes rotas de administração de frutose em diferentes espécies por variados períodos
Método de administração
Espécie Qde Tempo de estudo Efeito Referência
Bebida Camundongo 10% 3 semanas Hipertensão, Hiperinsulinemia DAN et al., 2006
2 meses Hiperglicemia, Hiperinsulinemia, Hipertensão, Intolerância à glicose Hipertrigliceridemia
DeANGELIS et al., 2012
30% 8 semanas Esteatose KANURI et al., 2011 Ratos 4% 14 semanas Hipertensão VASDEV et al., 2002 10% 8 semanas Hiperglicemia, Hipertrigliceridemia, Intolerância à glicose JALAL et al., 2007 5 semanas Hipertensão, Resistência à insulina XU et al., 210 10 semanas Hipertrigliceridemia, Resistência à insulina, Hipertensão SUZUKI et al., 1997 2 e 5 semanas Resistência à insulina, Hipertrigliceridemia, Hipertensão ZHAO et al., 2009 20% 20 semanas Hipertrigliceridemia DORNAS et al., 2012 20% 30 dias Hipertrigliceridemia MOTOYAMA et al., 2010 Cobaia 10% 6-19 dias Hipertrigliceridemia BAR-ON & STEIN, 1968 10% 18 semanas Hiperglicemia FÉLÉTOU et al., 2003 Comida Camundongo 60% 8 semanas Intolerância à glicose, Dislipidemia, Hipertensão FARAH et al., 2006 Rato 56,8% 6 semanas Hipertrigliceridemia, Resistência à insulina FAURE et al., 1997 60% 10 semanas Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia, Hiperuricemia NAKAGAWA et al., 2006 60% 30 dias Hiperglicemia, Resistência à insulina, Hipertrigliceridemia NANDHINI et al., 2005 60% 6 semanas Hiperglicemia, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia LIU et al., 2011 60% 35 dias Intolerância à glicose, Dislipidemia, Resistência à insulina EL MESALLAMY et al., 2010 65% 2 semanas Hiperglicemia, Dislipidemia, Hipertensão KIN et al., 2010 65% 4 semanas Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia BUSSEROLLES et al., 2003b 66% 4 semanas Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia, Hipertensão HWANG et al., 1987 66% 8 semanas Hiperglicemia, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia D’ANGELO et al., 2005 Hamster 60% 2 semanas Hipertensão, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia TAGHIBIGLOU et al., 2000 Cachorro 60% 20 a 28 dias Hipertensão, Resistência à insulina, Hiperinsulinemia, Hipertrigliceridemia MARTINEZ et al., 1994 Humanos 15% 5 semanas Hiperinsulinemia, Hiperglicemia HALLFRISCH et al., 1983 20% 5 semanas Hipertrigliceridemia, Hiperuricemia REISER et al., 1989
Revisão de Literatura
15
Paralelamente, Shapiro et al. (2008) relataram aumento de leptina em ratos
alimentados com frutose, o que implica que, apesar do aumento nos níveis de leptina há uma
diminuição na capacidade de resposta à leptina ocasionando diminuição da saciedade. Essa
observação mostra o potencial para aumento da ingestão de alimentos com a frutose. Além
disso, a administração central da frutose pode causar aumento de apetite, bem como
alterações significativas na função neuronal. Doses suprafisiológicas de frutose administradas
diretamente no cérebro induzem aumento do consumo alimentar, enquanto que a glicose
provoca diminuição na ingestão de alimentos (MILLER et al., 2002). Isso verificou-se estar
associado com a indução diferencial de malonil-CoA entre os dois açúcares (CHA et al., 2008).
Indivíduos obesos (SCHOLZ et al., 1996) e camundongos obesos induzidos por dieta
(FREDERICH et al., 1995) demonstram resistência à leptina o que contribui para a deposição
de lipídios no fígado (LEE et al., 2002) e no músculo esquelético (STEINBERG et al., 2002).
Como o metabolismo de glicose mediado pela insulina tem demonstrado regular a liberação
de leptina (MUELLER et al., 1998), esse fenômeno pode provavelmente ser atribuído a uma
falta de resposta da insulina com o consumo de frutose. Notavelmente, 4 semanas de frutose
na dieta induz hiperleptinemia em humanos associado a diminuição da sensibilidade à
insulina, esteatose hepática e aumento na circulação de TG (LÊ et al., 2006). Ratos
alimentados com frutose também exibem hiperleptinemia (MOORADIAN et al., 2000;
ROGLANS et al., 2007; SHAPIRO et. al., 2008).
1.2.4 Frutose e hiperuricemia
Estudos prévios intervencionais realizados (FOX & KELLEY, 1972; EMMERSON, 1974;
MACDONALD et al., 1978; REISER et al., 1989) demonstraram que frutose experimentalmente
tem a propriedade de induzir hiperuricemia. Essa relação foi repetidamente revisada e
discutida por vários estudos, entre eles Gao et al. (2007), Choi et al., (2008) e Nguyen et al.,
(2009), que encontraram associação entre maior consumo de bebidas ricas em açúcar e
aumento de ácido úrico sérico. Porém, Turner et al., (1979), Crapo & Kolterman, (1984), Osei
& Bossetti, (1989), Sun et al. (2010) e Wang et al. (2012) não observaram que frutose tem
influencia sobre concentrações séricas de ácido úrico.
Em seres humanos e outros primatas, o ácido úrico é o produto final do metabolismo
das purinas e é excretado como tal, mas outros mamíferos possuem a enzima uricase, que
permite, ainda, oxidação do ácido úrico para a alantoina (substância muito mais solúvel). A
consequência da ausência da enzima uricase em seres humanos é a ocorrência de gota, a qual
está associada à hiperuricemia.
Revisão de Literatura
16
Muitas investigações tanto in vivo quanto in vitro foram realizadas e, embora a
designação precoce do ácido úrico como um antioxidante (AMES et al., 1981) estime que esse
possa ser responsável por aproximadamente 60% da capacidade antioxidante do plasma
(NIETO et al., 2000), o ácido úrico também é reconhecido por apresentar propriedades
prooxidativas (SAUTIN et al., 2007) e pode ter numerosas funções biológicas deletérias. Por
exemplo, o ácido úrico estimula a proliferação das células do músculo liso vascular e a
liberação de substâncias quimiotáticas inflamatórias (RAO et al., 1991), induz quimiotaxia de
monócitos (ZARE et al., 2006), inibe a proliferação e a migração de células endoteliais (KANG
et al., 2005; KHOSLA et al., 2005) e causa estresse oxidativo nos adipócitos, indiretamente,
através da ativação da NADPH-oxidase, diminuindo a concentração de óxido nítrico (NO) total
(SAUTIN et al., 2007). Esse último estudo mostrou que EROs produzida pela NADPH-oxidase
aumenta a peroxidação lipídica evidenciando a associação entre ácido úrico, estresse
oxidativo e inflamação levando à SM. Isso apoia à ideia de que a hiperuricemia pode ser
considerada um fator causal na progressão da SM, como mostrado por Choi & Ford (2007) e
níveis elevados de ácido úrico são observados em uma variedade de estados de doença
metabólicas (MASUO et al., 2003; NAKANISHI et al., 2003; MELLEN et al., 2006).
Em ratos, frutose induz hiperuricemia ocasionando, também, vários aspectos da SM, o
que inclui hipertrigliceridemia, hiperglicemia e hipertensão (NAKAGAWA et al., 2006;
SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2007). Além disso, ratos alimentados com frutose, tratados com o
agente alopurinol (inibidor da xantina oxidase) exibem melhora na SM, já que se observa que
o tratamento com drogas redutoras de ácido úrico reduz os níveis plasmáticos de insulina,
melhora sensibilidade à insulina e diminui pressão sanguínea (NAKAGAWA et al., 2006;
SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2008).
Adicionalmente, observou-se participação do ácido úrico como um biomarcador de
fígado com gordura (MARCHESINI & BABINI, 2006; SARTORIO et al., 2007). Um estudo
recente da população da China (LI et al., 2009) relatou que a taxa de prevalência da NAFLD foi
significativamente maior em indivíduos com hiperuricemia do que naqueles sem
hiperuricemia (24,75 vs 9,54%, P <0,001) e a prevalência elevou-se progressivamente com
aumento nos níveis séricos de ácido úrico. Além disso, a análise de regressão múltipla
mostrou que a hiperuricemia foi associada a um risco aumentado de NAFLD (LI et al., 2009).
Existe também evidência experimental de que a hiperuricemia crônica pode ser capaz de
causar hipertrigliceridemia e esteatose em ratos. Nesses estudos, a hiperuricemia foi induzida
pela inibição da uricase (WEXLER, 1982) ou ácido oxônico (WEXLER & GREENBERG, 1977) e,
após 4 semanas, os animais desenvolveram concentrações elevadas de TG no soro e
Revisão de Literatura
17
esteatose. Entretanto, o mecanismo através do qual o ácido úrico pode ser capaz de induzir
esteatose ainda é desconhecido.
Considerando que doenças humanas, tais como obesidade, diabetes e DCVs são
complexas e apresentam origens multifatoriais, estudos sugerem que o ácido úrico é um fator
independente de risco para doença renal em humanos (HEINIG & JOHNSON, 2006). A fim de
verificar a hipótese de que a frutose dietética provoca diretamente disfunção renal, ratos
foram alimentados com 60% de frutose e desenvolveram hipertensão, hiperuricemia e
hipertrigliceridemia além de problemas renais, incluindo hipertrofia, hipertensão glomerular
e redução do fluxo glomerular (SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2007). Um outro estudo (GERSCH et
al., 2007) mostrou que uma dieta com 60% de frutose acelerou a doença renal em ratos com
insuficiência renal crônica induzida cirurgicamente. Esse efeito pode ser mediado pela
hiperuricemia ou por outros componentes da SM, incluindo inflamação ou hiperinsulinemia.
Concentrações de ácido úrico são elevadas na grande maioria (89%) de adolescentes com
hipertensão (FEIG & JOHNSON, 2003) e um estudo prospectivo relatou que a redução de
concentrações de ácido úrico em pacientes com hiperuricemia e doença renal resulta em
progressão renal significativamente mais lenta e uma redução significativa da pressão arterial
sistólica (PAS) (SIU et al., 2006).
Assim, mais estudos clínicos são necessários e descobertas sugerem que o ácido úrico
pode contribuir para a epidemia da doença cardiorenal. Aproximadamente 25% a 50% dos
indivíduos hipertensos são relatados apresentarem níveis elevados de ácido úrico (CANNON
et al., 1966) e em animais, o efeito da concentração de ácido úrico é ainda mais pronunciado.
Ratos que desenvolvem hiperuricemia desenvolvem hipertensão devido à inibição da síntese
de óxido nítrico sintase (NOS) na mácula densa (MAZZALI et al., 2002). Ocorrem estímulo do
sistema renina intra-renal e inibição da função endotelial ao diminuir biodisponibilidade do
NO, o qual induz vasodilatação que é necessária para a insulina estimular a captação de
glicose nos tecidos. Quando a secreção de NO é prejudicada, a captação de glicose é reduzida
e mais insulina é segregada para compensar (HEINIG & JOHNSON, 2006). Perturbações na
dilatação dependente do NO costumam acompanhar a hiperuricemia e a extensão está
relacionada à magnitude da elevação do ácido úrico. Portanto, disfunção endotelial induzida
por ácido úrico com diminuição da produção de NO pode participar no desenvolvimento da RI
em ratos alimentados com frutose, e, a diminuição das concentrações de ácido úrico melhora
função do endotélio (BUTLER et al., 2000; DOEHNER et al., 2002; FARQUHARSON et al., 2002).
Assim, frutose e ácido úrico são susceptíveis de serem da maior importância no
desenvolvimento do fenótipo da SM.
Revisão de Literatura
18
1.2.5 Frutose e hipertensão
Semelhantemente a RI e à hiperlipidemia, muitos estudos demonstram que dieta com
teor alto de frutose pode induzir hipertensão. Entretanto, embora inúmeras investigações
com ratos alimentados com frutose são relacionadas a hipertensão (HWANG et al 1987;
VASDEV et al., 2002; 2007; ZHAO et al., 2009; KIM et al., 2010), há também outros relatos em
que não é observado aumento de PA nesse modelo (BRANDS et al., 1994; KOTCHEN et al.,
1997; BEZERRA et al., 2001; D’ANGELO et al., 2005). Esse conflito tem sido atribuido a
componentes dietéticos (ex: lipídios ou sódio) (SANTURÉ et al., 2002; NISHIMOTO et al., 2002;
SHAPIRO et al., 2008), diferentes linhagens e idade dos animais (KOTCHEN et al., 1997) ou a
diferentes técnicas usadas para medir PA (BRANDS et al., 1994; D’ANGELO et al., 2005).
Há, portanto, incertezas considerando o mecanismo pelo qual o consumo de frutose
pode produzir elevação da PA, mas numerosas possibilidades são propostas (Figura 5),
incluindo, principalmente, atenuação do baroreflexo e aumento da atividade do SNS
(DeANGELIS, 2012), elevação de catecolaminas circulantes (TRAN et al., 2009), elevação da
atividade do sistema renina-angiotensina (SRA) (KOBAYASHI et al., 1993), reabsorção de sódio
aumentada (BAUM, 1987), maior produção de ácido úrico (NAKAGAWA et al., 2006) e
disfunção endotelial (TAKAGAWA et al., 2002). Somado a isso, existe evidência de que
hiperinsulinemia, isoladamente, pode causar hipertensão, uma vez que administração de
insulina causa aumento da pressão sanguínea em ratos (BRANDS et al., 1991; 1992).
Tem-se observado que há associação entre RI e hipertensão em roedores bem como
em humanos (REAVEN & CHANG, 1991; BRANDS et al., 1991; DeFRONZO, 1992; ABE et al.,
1998) e intervenções que previnam RI também normalizam PA (REAVEN, 1991; VERMA et al.,
1994; LEE et al., 1994; SUZUKI et al., 1997). Comparados a indivíduos com PA normal, pessoas
com hipertensão são relativamente intolerantes à glicose (DeFRONZO, 1992), mas redução da
PA em indivíduos hipertensos não significa necessariamente reduzir o grau de intolerância à
glicose e hiperinsulinemia. Inibidor adrenérgico reduz PA mas não RI, como demonstrado por
Hwang et al. (1987), em ratos alimentados com frutose. Portanto, se frutose induz elevação
na atividade do SNS, então, essa mudança não é a causa da RI, da hiperinsulinemia e da
hipertrigliceridemia. Suzuki et al. (1997) demonstraram que tratamento com pioglitazona em
ratos com RI e hipertensos resultou em redução na glicemia, em normalização dos níveis de
insulina e da concentração de TG e também em redução da PAS, indicando que RI é
responsável pelo desenvolvimento de hipertensão em ratos com dieta rica em frutose.
Cronicamente, insulina ativa o SNS e provoca aumento no tônus vascular periférico
conduzindo a aumento na PA. A consequência é que essa ativação pode contribuir para a RI
Revisão de Literatura
19
fazendo com que vasoconstrição provoque diminuição do fluxo sanguíneo e, portanto, reduza
fornecimento de glicose aos tecidos (RATTIGAN et al., 1999). Sugere-se que, assim, há uma
relação causal entre a RI/hiperinsulinemia e hipertensão no modelo de dieta rica em frutose,
com o SNS potencialmente desempenhando um papel importante tanto no desenvolvimento
da hipertensão como também na RI.
A hipertensão arterial nesse modelo tem sido também associada intimamente à
retenção de sódio. Os primeiros estudos que apresentaram diminuição da excreção urinária
de cloreto de sódio (NaCl), durante infusão aguda de insulina (DeFRONZO et al., 1975; BAUM,
1987), levaram à hipótese de que a hiperinsulinemia poderia contribuir para a hipertensão
arterial na SM. Durante a RI, o efeito vasodilatador da insulina pode estar inibido e, portanto,
torna-se incapaz de compensar a diminuição da reabsorção de sódio no túbulo proximal, com
predisposição à retenção de sódio (STENVINKEL et al., 1995). Administração aguda de insulina
resulta em diminuição da excreção de sódio em animais (BAUM, 1987) e em humanos (ter
MAATEN et al., 1999), com taxa de filtração glomerular (GFR) e fluxo sanguíneo renal
Figura 5: Mecanismo proposto pelo qual frutose na dieta resulta em hipertensão. Sistema Nervoso
Simpático (SNS); Sistema Renina Angiotensina (SRA). ABDULLA et al., 2011.
↑ Vasoconstrição
↑ Retenção de Na+
Resistência à insulina
Hiperinsulinemia
↑ SRA
Frutose
↓ Baroreflexo Dislipidemia Estresse oxidativo
REsis
↑ Ácido úrico
↑ SNS
Disfunção endotelial
Hipertensão
Revisão de Literatura
20
inalterados. De acordo com o conceito de feedback de fluido renal, uma redução primária da
capacidade de excreção renal ocasiona aumento compensatório na pressão sanguínea que
serve para manter o equilíbrio de fluidos. As reduções na capacidade de excreção renal
podem ocorrer devido a várias alterações funcionais ou patológicas intrínsecas ao rim ou a
fatores neuro-humorais que influenciam a excreção renal. Assim, excreção de sódio pode ser
mantida e alteração na GFR ou na reabsorção tubular podem ser mascaradas pela PA elevada.
Entretanto, na hipertensão prolongada, com duração de meses ou anos, são observadas
alterações patológicas nos capilares glomerulares resultando em reduções na taxa de GFR
que necessitam de mais elevações da PA e inibição da reabsorção tubular para manter o
equilíbrio de sódio (HALL et al., 1990).
Catena e colaboradores (2003), por outro lado, demonstraram que o efeito
antinatriurético da hiperinsulinemia pode ser determinado por um mecanismo que depende
do número de receptores de insulina nos tecidos, e essa densidade é inversamente
relacionada com a ingestão de sal na dieta. Assim, o efeito antinatriurético da insulina é
significativamente diminuído pela dieta com elevado teor de sal, mas não em ratos
alimentados com frutose, sugerindo que o mecanismo de feedback que normalmente limita
reabsorção de sódio induzida pela insulina está ausente nesse modelo experimental.
Portanto, a longo prazo, o elevado consumo de sal, juntamente com a alimentação
rica em frutose, resultará em mecanismo prejudicado de controle para o equilíbrio de sódio,
contribuindo para a hipertensão. Singh e colaboradores (2008) demonstraram que frutose
aumenta a absorção de sódio no trato gastrointestinal e no rim, através do aumento da
atividade de GLUT5 (Slc2a5), transportador de frutose, e PAT-1 (Slc26a6), um transportador
de cloro. Ambos são expressos nas membranas apicais do intestino delgado e no túbulo
proximal renal, estabelecendo uma ligação direta entre o aumento no consumo de frutose e
maior absorção de sal no intestino e, assim, diminuindo a sua excreção pelos rins (SINGH et
al., 2008; BARONE et al., 2009). Esse aumento pode contribuir para o desenvolvimento de
hipertensão em ratos alimentados com frutose.
Apesar de muito trabalho estar centrado em frutose induzir RI e doença cardiorrenal,
nem todas as fontes de frutose podem causar o mesmo efeito. Frutas naturais também são
ricas em antioxidantes que podem ter efeitos benéficos (VASDEV et al., 2002). Com efeito,
Forman et al. (2009) relataram que a ingestão de frutose não se correlaciona com pressão
sanguínea elevada na população em que muita ingestão da frutose foi a partir de fruta,
contendo compostos como vitamina C, quercetina, resveratrol, que podem alterar os seus
efeitos metabólicos. Por outro lado, quando o teor de frutose, a partir de frutas naturais, foi
Revisão de Literatura
21
excluída Jalal e colaboradores (2010) encontraram uma forte associação da ingestão de
frutose, advinda de sacarose ou de frutose adicionada a produtos industrializados, com
aumento da PA.
Por fim, estresse oxidativo pode ser considerado um fator patogênico importante no
desenvolvimento da hipertensão (PARAVICINI & TOUYZ, 2006) com dano oxidativo em ratos
alimentados com frutose (BUSSEROLLES et al., 2002a). Estudos apoiam que o aumento da
inativação oxidativa de NO, por um excesso de O2•−, pode ser responsável pela diminuição da
disponibilidade de NO e disfunção endotelial, o que contribui para a elevação da PA.
Consequentemente, aumento da produção de O2•− em tecido vascular, mediado através de
NADPH-oxidase está sendo estudado. Unger & Patil (2009) demonstraram, em ratos
alimentados com frutose, que administração crônica de apocinina, um suposto inibidor da
NADPH-oxidase, previne o desenvolvimento da disfunção endotelial e hipertensão pela
inibição da produção exagerada de O2•−, aumentando a biodisponibilidade de NO.
1.2.6 Frutose e estresse oxidativo
Os radicais livres são definidos como qualquer espécie química capaz de existência
independente de conter um ou mais elétrons desemparelhados, sendo assim altamente
reativos e capazes de atacar qualquer biomolécula (DEL MAESTRO, 1980). Condições que
envolvem o aumento dos níveis de radicais livres podem ser referidas como estresse
oxidativo, o qual ocorre durante os processos de oxidação biológica através da ação de
enzimas da respiração celular acoplada à fosforilação oxidativa para a formação de ATP na
mitocôndria.
Há ainda outras fontes de radicais no organismo que podem ser enzimáticas ou não.
Os principais sistemas enzimáticos que catalisam a redução univalente de O2 (Figura 6) são as
ciclooxigenase (COX), lipoxigenase, xantina oxidase, aldeído oxigenase, flavina desidrogenase
e peroxidase. Já as reações não enzimáticas incluem reações de autoxidação como as que
ocorrem com catecolaminas, flavinas e ferridoxinas, além de reações catalisadas por ferro,
cobre e radiação ionizante (YU, 1994).
e- e- e- e-
O2 O2•- H2O2 OH• •H2O + O2
Figura 6: Formação de EROs a partir da redução de O2. Oxigênio (O2) é reduzido a água (H2O) recebendo quatro
elétrons de uma só vez pela citocromo oxidase gerando compostos intermediários altamente reativos.
Revisão de Literatura
22
Na SM, estresse oxidativo está relacionado à hiperglicemia, à hiperinsulinemia, à
hipertrigliceridemia e às defesas antioxidantes inadequadas. Como o estresse oxidativo,
através de EROs é considerado a causa subjacente no desenvolvimento de RI e intolerância à
glicose na diabetes tipo 2 (WRIGHT et al., 2006), não é surpreendente que alimentação rica
em frutose aumente o estresse oxidativo (BUSSEROLLES et al., 2002a) e está associada à SM
em roedores (MILLER & ADELI, 2008). Os efeitos prejudiciais da frutose são aumentados
quando as defesas antioxidantes são diminuídas ou quando há maior produção de radicais
livres (BUSSEROLLES et al., 2003a), enquanto que a suplementação de vitamina E melhora a
sensibilidade à insulina em ratos alimentados com dieta rica em frutose (FAURE et al., 1997).
O2•− é uma EROs relativamente abundante e é dismutada enzimaticamente pela
superóxido dismutase (SOD) para peróxido de hidrogênio (H2O2), o qual pode ser
metabolizado em água e oxigênio pela catalase (CAT) ou pela glutationa peroxidase (GPx)
(FRIDOVICH, 1995). Das suas 3 isoformas, a SOD extracelular é a de maior importância em
nível vascular. A sua produção e secreção ocorre na célula muscular lisa, ligando-se
posteriormente aos glicosaminoglicanos da matriz extracelular, na superfície da célula
endotelial, desempenhando, dessa forma, um papel essencial na regulação do estado redox
no interstício vascular (FRIDOVICH, 1995). Nas células vasculares, a glutationa reduzida
desempenha um papel na regulação do estado redox intracelular, provendo equivalentes
redutores a várias vias bioquímicas (TOUYZ, 2003). Entre essas reações, é de se destacar
aquela em que a GPx reduz o H2O2 e os peróxidos lipídicos a água e álcoois lipídicos,
oxidando, para isso, a glutationa reduzida a dissulfido de glutationa (glutationa oxidada). A
CAT é, igualmente, uma enzima intracelular antioxidante, que se encontra
predominantemente nos peroxissomas, mas também, em alguma porcentagem, no
citoplasma das células. Caracteristicamente, é muito ativa quando existem níveis elevados de
estresse oxidativo dentro das células e, quando tal acontece, catalisa o H2O2 em água e
oxigênio molecular, protegendo assim, os elementos intracelulares dos efeitos nocivos do
H2O2 (CAI, 2005). Faure et al. (1999) demonstraram que ratos alimentados com alto conteúdo
de frutose conduz à RI e em estresse oxidativo. Além disso, evidenciaram que tratamento
com metformina, um sensibilizador da insulina, tem um efeito benéfico sobre alguns
componentes do sistema de defesa antioxidante. Assim, vários estudos demonstram que
dieta rica em frutose afeta negativamente equilíbrio entre a produção de radicais livres e de
defesa antioxidante em ratos, o que conduz a aumento da susceptibilidade à peroxidação
lipídica (BUSSEROLLES et al., 2002a, 2002b; 2003b). Com base nessas descobertas, foi
sugerido que a taurina, um aminoácido que contém enxofre, é capaz de diminuir o estresse
Revisão de Literatura
23
oxidativo e melhorar a sensibilidade à insulina em ratos alimentados com frutose (NANDHINI
et al., 2005; EL MESALLAMY et al., 2010). Esse aminoácido é um derivado da cisteína (Cis),
que é um precursor da glutationa reduzida (GSH) e está disponível em tecidos e células. Nos
seres humanos, a deficiência de Cis pode levar ao estresse oxidativo plasmático (JONES et al.,
2011), e, em roedores, insuficiência de aminoácidos de enxofre provoca estresse oxidativo no
plasma e tecido (NKABYO et al., 2006). Desse modo, suplementação de bebidas adoçadas
com frutose pode reduzir a ingestão dietética de aminoácidos de enxofre, sendo possível que
a diminuição desse consumo contribua para o estresse oxidativo observado em ratos
alimentados com frutose.
Degeneração neuronal na RI induzida por produção excessiva de EROs, peroxidação
lipídica, oxidação de proteína bem como diminuição da capacidade antioxidante no cérebro
de ratos alimentados com frutose na água, sugeriu acumulação de H2O2, induzindo
citotoxicidade no cérebro (YIN et al., 2013). O aumento na produção de EROs em ratos
alimentados com dieta rica em frutose pode reduzir biodisponibilidade de NO, o que explica
relaxamento vascular alterado. O excesso de O2•−, produzido na vasculatura de ratos com RI
pode degradar NO e aumentar a geração de outras EROs que são responsáveis pela
peroxidação de lipídios, ocasionando dano vascular dependente do endotélio (SHINOZAKI et
al., 1999; 2003). Então, a consequência mais importante do aumento do estresse oxidativo
sobre a função endotelial vascular é a diminuição da biodisponibilidade resultante da
inativação de NO por O2•− (PACHER et al., 2007). Fisiologicamente, a NOS converte a L-
arginina em NO ocasionando relaxamento da musculatura lisa do vaso. Essa reação ocorre na
presença de tetrahidrobiopterina (BH4) que se converte à diidrobiopterina (BH2) por meio da
redução de O2 a H2O. Em condições patológicas, como na deficiência de substrato (L-arginina)
ou de cofatores BH4, o O2 não é reduzido completamente a H2O. Tal redução incompleta gera
O2•− e, na RI, pode ser um fator patogênico para a disfunção endotelial através da ação
prejudicada da eNOS e aumento da degradação oxidativa de NO (SHINOZAKI et al., 2003). O
exagero da produção de O2•− estimula o desacoplamento da enzima eNOS o que leva a
contração do vaso. Tem sido também descrito que a geração exagerada de O2•− pode
aumentar devido à atividade da NADPH-oxidase, o que resulta em oxidação do BH4,
comprometendo sua função como cofator. NADPH-oxidase está associada à maioria da
geração de O2•− favorecendo a produção de EROs (ZALBA et al., 2001). Entretanto, a
produção excessiva de EROs pode também estar ligada a processos patológicos associados à
disfunção endotelial e remodelamento vascular, que são características da hipertensão.
Revisão de Literatura
24
Dietas ricas em frutose, por sua vez, podem alterar o metabolismo celular com
ativação do SRA (SHINOZAKI et al., 2004; ISHIBASHI, 2007). Angiotensina II (Ang II), além do
seu papel fundamental no desenvolvimento da hipertensão, na medida em que provoca a
retenção de sódio (via aldosterona), tem ainda capacidade de promover a inflamação e
estresse oxidativo renal e vascular. Na verdade, evidência crescente sugere que a formação
de EROs e a ativação das cascatas de oxidação-redução, mediadas pela NADPH-oxidase, estão
envolvidas de forma crítica na hipertensão induzida pela Ang II (CERIELLO, 2008).
Ang II atua através do receptor AT1, estimula a NADPH-oxidase, levando,
consequentemente, à acumulação dos radicais livres O2•−, H2O2 e peroxinitrito
(ONOO−)(TOUYZ et al., 2004). O tratamento de ratos alimentados com frutose com
bloqueador de AT1 (losartan) normaliza a atividade da NADPH-oxidase, melhorando função
endotelial e efetivamente prevenindo que Ang II resulte em resposta pressórica contrátil em
ratos com RI (CANNIZZO et al., 2012). Descobriu-se então que a dieta rica em frutose
aumenta estresse oxidativo caracterizado pela superprodução de EROs dependente da
ativação de NADPH-oxidase, porém, esse aumento é diminuído por tempol e losartan,
corroborando o papel da geração de O2•− em RI induzida pela frutose, o que sugere o
envolvimento do SRA no estresse oxidativo.
1.3 SÓDIO
1.3.1 Sódio na alimentação
Os termos sal e sódio são frequentemente utilizados como sinônimos, embora, numa
base de concentração, o sal compreende 40% de sódio e 60% de cloro; 1 g de sódio é
equivalente a 2,55 g de sal; 1 mmol de sódio é equivalente a 23 mg de sódio e 1 g de sal é
equivalente a 17 mmol de sódio. O quadro 4 apresenta uma visão geral das diferentes
unidades. A maior fonte de sódio na dieta é o sal (NaCl) e o seu alto consumo, atualmente, é
utilizado como preditor de DCV. Embora a American Heart Association recomende um
consumo de sódio de <2300 mg por dia (AHA, 2010), pesquisas mostram que a população
mundial consome muito mais do que isso, ingerindo até 13 g de sal por dia, com um consumo
diário médio de 8,7 g (CDC, 2011). Em países ocidentais seu consumo é ainda mais elevado
não só pelo seu uso na preparação como na conservação de alimentos, sendo extremamente
excessivo para as necessidades fisiológicas humanas. O processamento de alimentos, muitas
vezes, envolve a adição de sódio por uma grande variedade de razões relacionadas ao sabor
ou ao processamento. Por exemplo, grão de bico, milho e ervilha que têm, naturalmente,
Revisão de Literatura
25
muito baixo teor de sódio, apresentam 10 a 100 vezes mais sódio pós-processamento (WHO,
2007).
Apesar de existirem poucas pesquisas sobre a mudança de padrões alimentares no
Brasil, o estudo de Barreto & Cyrillo em 2001 mostrou uma diminuição de 35% nos gastos
domésticos com hortaliças e frutas no orçamento familiar. Situação inversa foi encontrada
nos gastos com alimentos industrializados. Essa modificação não parece estar somente
relacionada aos preços do mercado, mas também ao marketing e à própria dinâmica de vida,
os quais exercem importante papel nas decisões de consumo. Uma alimentação mais pobre
em frutas e hortaliças é baseada em alimentos industrializados, mais rica em sal, o que parece
ser preditor de agravos à saúde. Assim, é nesse contexto que a relação sódio/potássio vem
sendo utilizada como marcador da qualidade na alimentação, visto que uma dieta mais
adequada em relação ao sódio e ao potássio pode estar relacionada ao maior consumo de
frutas e hortaliças e ao menor consumo de alimentos industrializados, como os embutidos e
enlatados. Kotchen & Kotchen em 1997 demonstram que essa relação é mais importante do
que a medida de sódio e potássio isoladamente. Outro estudo realizado por Kaufman et al.
(1996), na África, mostrou que essa relação estava associada à PAS e à pressão arterial
diastólica (PAD) e que o aumento da prevalência da hipertensão estava relacionado tanto às
mudanças econômicas quanto às dietéticas.
As iniciativas voltadas à redução no consumo de sódio se destacam entre as ações de
prevenção e de controle das doenças crônicas diretamente associadas à alimentação por uma
relação positiva entre custo e efetividade. Entre as principais estratégias encontram-se a
redução voluntária do conteúdo de sódio de alimentos processados e a realização de
campanhas de mídia para a promoção de hábitos alimentares saudáveis, que, segundo
estimativas da OMS, poderiam evitar 2,5 milhões de mortes e poupar bilhões de dólares aos
sistemas de saúde no mundo (WHO, 2010).
Quadro 4: Quantidades equivalentes entre sódio e sal
Sódio (mg) Sódio (mmol) Sal (g)
1200 51 3,0 2000 87 5,0 2400 104 6,0 4000 174 10,0
MOHAN & CAMPBELL, 2009
Revisão de Literatura
26
1.3.2 Fisiologia do sódio
No corpo de um homem pesando 70 kg há aproximadamente 3,5 mol de sódio.
Metade do sódio está dentro dos fluidos corporais (90% extracelular e 10% intracelular) e o
restante está presente no osso. O sódio é um elemento inorgânico e é um dos principais
eletrólitos, responsável pela osmolaridade e volume do fluido extracelular além de fazer
parte de diversas secreções do organismo, como a bile e os sucos pancreáticos. Seu equilíbrio
no corpo está intimamente ligado ao equilíbrio da água. Juntamente com potássio e cloro, o
sódio desempenha um papel na condução dos impulsos nervosos, excitação elétrica de
células musculares (incluindo o músculo cardíaco) e em combinação com o bicarbonato,
regula o pH corpóreo. Excesso ou deficiência pode ser a base de alterações no equilíbrio
ácido-base (ÉVORA et al., 1999).
Sódio e cloro são também vinculados ao transporte de muitas moléculas através das
membranas celulares. Bomba de sódio (também designada bomba de sódio-potássio), Na+K+-
ATPase, desempenha um papel fundamental no equilíbrio da água, na condução nervosa e no
transporte ativo. Para manter o potencial elétrico da célula, essa enzima precisa de uma baixa
concentração de íons de sódio e de uma elevada concentração de íons de potássio dentro da
célula. Fora das células existe uma alta concentração de sódio e uma baixa de potássio, pois
existe difusão desses componentes através de canais iônicos existentes na membrana celular
(KAPLAN, 2002). Para manter as concentrações ideais dos dois íons, a bomba de sódio libera
sódio para fora da célula e potássio para dentro. Nota-se que esse transporte é realizado
contra os gradientes de concentração desses dois íons, o que ocorre graças à energia liberada
com a clivagem de ATP. Os impulsos dos nervos ao longo de células, o transporte ativo de
nutrientes para os enterócitos e células musculares são todos dependentes da bomba Na+/K+-
ATPase (KAPLAN, 2002).
Em bom estado de saúde, a absorção de sódio no intestino é > 97%, transportado
para o rim, onde é filtrado e reabsorvido para a corrente sanguínea de forma a manter os
níveis normais no sangue. A quantidade de sódio absorvida é proporcional à quantidade de
sódio ingerida, e, por esse motivo, a excreção urinária (mais de 24 horas) é geralmente aceita
como a estimativa mais confiável de ingestão de sódio (ELLIOTT & BROWN, 2006), já que sua
excreção é realizada essencialmente através da urina (90 a 95%). O restante é eliminado pelas
fezes e pelo suor, sendo a sua excreção não mais que 2% pelas fezes e cerca de 2% pela pele,
durante a transpiração. Comunidades que vivem em climas tropicais mostram excreção mais
diluída para evitar a perda de excesso de sódio (GLEIBERMAN, 2009).
Revisão de Literatura
27
1.3.3 Sódio e homeostase hídrica
Dependendo da disponibilidade de água, o rim adulto saudável é capaz de excretar
muito ou pouco de sódio e de fluido (GUYTON, 1991). O plasma pode ser influenciado por
diversos mecanismos. Forças físicas, tais como pressão de perfusão e pressão coloidosmótica,
mecanismos neurais e comportamentais, como a sede e a fome de sal, a taxa de filtração
renal, bem como mecanismos endócrinos e hormonais, podem afetar a homeostase de Na+.
Assim, hormônios circulantes como a Ang II, a aldosterona, o fator natriurético atrial (ANF), a
atividade do nervo simpático renal têm uma influência importante sobre a relação pressão-
natriurese (CAMPESE & KARUBIAN, 1991; McMANUS et al., 1995; CHIOLERO et al., 2001;
ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004; DIETZ, 2005; KOPKAN & CERVENKA, 2009).
Embora haja indícios fortes de que o rim é a via final comum no padrão a longo prazo
de alteração da pressão, a anormalidade inicial deste não pode ser intrínseca ao
desenvolvimento da hipertensão. Aumento da pressão sanguínea na aurícula direita do
coração provoca a secreção do ANF, que aumenta a excreção do sódio e, consequentemente,
a perda de água na forma de urina. Isso resulta em redução da pressão sanguínea com o
volume de sangue diminuindo devido à eliminação da água. O mecanismo funciona em
sentido inverso, com uma diminuição no ANF diminuindo a perda de água e aumentando
pressão sanguínea quando diminuição da PA é detectada dentro do átrio direito do coração
(De BOLD, 1985).
Outro mecanismo é o sistema renina angiotensina aldosterona (SRAA) que é um dos
principais componentes de regulação homeostática. O sistema SRAA atua principalmente
através da regulação de reabsorção renal de sódio e responde à diminuição da PA dentro das
arteríolas aferentes do rim. A renina é uma enzima proteolítica liberada a partir de células
especializadas do aparelho justaglomerular, em resposta à diminuição da PA, à atividade do
SNS e as diminuições de NaCl no túbulo distal. Assim, a renina ativa o SRA por clivagem do
angiotensinogênio, produzido pelo fígado, para produzir a angiotensina I (Ang I), que é ainda
convertida em Ang II pela enzima conversora de angiotensina (ECA), principalmente dentro
dos capilares dos pulmões. Em seguida, Ang II contrai os vasos sanguíneos, aumenta a
secreção de hormônio antidiurético (ADH) e aldosterona, além de estimular o hipotálamo,
ativando o reflexo da sede (ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004; COOPER et al., 2007; BADER &
GANTEN, 2008).
Reduções significativas na PA também provocam um aumento da secreção do ADH
com aumento da permeabilidade à água nas células dos ductos coletores renais, o que
permite que mais água seja reabsorvida a partir da urina para o sangue. Assim, a liberação de
Revisão de Literatura
28
ADH aumentando a reabsorção de água no interior do rim resultará em pequeno volume de
urina concentrada a ser produzido. Adicionalmente, elevação da PA será causada por
aumento no volume de sangue e diminuição da pressão osmótica do sangue (um efeito de
diluição), com resultante aumento do volume de sangue agindo de forma a restabelecer a PA.
ADH é considerado o regulador mais importante da osmolaridade do sangue
(McMANUS et al., 1995; ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004). Um aumento da osmolaridade
do sangue, como maior concentração de sódio, provoca secreção de ADH a partir da pituitária
posterior mediada por osmorreceptores. Isso resulta em ativação da reabsorção de água nos
rins, diluindo, assim, o sangue e restaurando a osmolaridade normal (Figura 7).
Angiotensina I
Angiotensinogênio
↑ excreção de sal 3
↑ ANF
↑Volume plasmático ↓Volume plasmático
Excesso de sal Déficit de sal Angiotensina II
↓ excreção de sal 4
1
↓ Volume de urina
Antidiurese 2
↑ Volume de urina
Diurese
↑ ANF Sede
VP
Déficit de água
Osmorreceptores
↑Osmolaridade
plasmática
↓Pressão
atrial
Excesso de água
Barorreceptores
↑Pressão
atrial
↓Osmolaridade
plasmática
Figura 7: Função renal na homeostase de água e sal. (1) Rim e resposta hipotalâmica para déficit de água; (2)
Rim e resposta hipotalâmica para excesso de água; (3) Rim e resposta adrenal para excesso de sal e (4) Rim e resposta adrenal para déficit de sal. Adaptado de Despopoulos & Silbergafl, 1986. Fator natriurético atrial (ANF).
Revisão de Literatura
29
A osmolaridade no sangue é, dessa forma, mantida através do controle exato da
concentração de íons extracelulares e, concomitantemente, pelo equilíbrio de fluidos
(McMANUS et al., 1995; ANTUNES-RODRIGUES et al., 2004). Sugere-se também que a
excreção urinária de sódio e a pressão hidrostática intersticial renal estão sob a influência do
NO (KONE & BAYLIS, 1997; MAJID et al., 2001), e qualquer defeito desse sistema pode
resultar na geração de hipertensão (COWLEY et al., 1995; BARTON et al., 2000). Ocorre
diminuição significativa de nitratos no plasma em pacientes hipertensos, embora metabólicos
de NO, medidos no plasma ou urina, são apenas indicadores indiretos da produção de NO e
suas alterações não refletem necessariamente a disfunção endotelial (BRAGULAT et al.,
2001).
1.3.4 Sódio e hipertensão
Existe hoje uma infinidade de estudos sobre comunidades subdesenvolvidas que,
historicamente, têm um consumo muito baixo de sal (<1 g) e, predominantemente,
apresentam PA baixa sem hipertensão relacionada à idade, como visto nos países ocidentais.
Porém, a primeira implicação de que o sal pode ser um fator de aumento da PA foi relatada
com Ambar & Beaujard (1904) evidenciando uma relação positiva entre alto teor de sal na
alimentação e PA elevada. Já Kempner (1948) com o objetivo inicial de demonstrar a
eficiência no controle da hipertensão arterial e das complicações cardiovasculares utilizando
dieta com baixo teor proteico, em 500 pacientes acompanhados durante 4 anos, mudou os
rumos da pesquisa quando os resultados iniciais demonstraram que a simples restrição de sal
na dieta, por si só, era capaz de reduzir a PA.
Estudos clínicos e experimentais demonstram uma correlação positiva entre o sal
ingerido na dieta e valores de PA. Essa afirmativa tem como fundamento vários estudos que
avaliaram indivíduos normotensos, hipertensos, animais de laboratório, bem como pequenas
amostras e grandes populações (MASCIOLI et al., 1991; LAW et al., 1991; ELLIOTT et al., 1996;
VASDEV et al., 2003; KATORI & MAHIMA, 2006; STRAZZULLO et al., 2009). Ensaios clínicos e
em animais, por sua vez, mostram que reduzir a ingestão de sal diminui os níveis de PA em
grupos normotensos e hipertensos e podem prevenir a hipertensão. Uma pesquisa
envolvendo 3.000 indivíduos pré-hipertensos com idade entre 30-54, informou que a
diminuição da ingestão de sal reduz o risco de DCV em até 35% (COOK et al., 2007). Os
resultados confirmaram que os grupos restritos de sódio tinham menos probabilidade de
sofrer DCV e uma redução de risco de morte por qualquer outra causa. Outro estudo de
intervenção de longo prazo, avaliou PA e excreção urinária de sódio de 24 horas após redução
Revisão de Literatura
30
da ingestão de sal (> 50%) em uma população rural em Portugal. Uma diminuição progressiva
da pressão sanguínea foi observada quando comparada com o controle, além de correlações
significativas entre queda da PA e diminuição da relação sódio urinário e creatinina (FORTE et
al., 1989).
Uma das maiores pesquisas sobre consumo de sal (Intersalt) envolveu um estudo
controlado de 52 comunidades em 32 países ao redor do mundo, incluindo dados de mais de
10 mil adultos no total, todos com variáves nos níveis de ingestão de sal (0,5 g > 25 g/dia). A
investigação mostrou uma relação positiva entre a ingestão de sal e PA e uma inversa relação
para consumo de potássio e aumento da PA. Foi também estimado que um aumento de 6 g
por dia de sal, durante 30 anos levaria a uma elevação em 9 mmHg na PA (STAMLER et al.,
1996). Além desse estudo, uma meta-análise das bases Medline, Embase, Cochrane
Hypertension Group Specialised Register, Cochrane Central Register of Controlled Trials e
artigos relevantes envolvendo redução de consumo de sal e sua relação entre queda da PA
em indivíduos normotensos e hipertensos foi realizada por He & Mac Gregor (2000). A análise
constatou que sódio urinário estava significativamente associado à redução da PA. A
diminuição do consumo de sal ocasionou redução de -75 mmol/24h de sódio urinário e essa
queda resultou em mudança na PA (-4,18 mmHg para PAS e -2,06 mmHg para PAD) em 4
semanas. Essa intervenção para consumo menor de sal foi também relacionada a mudanças
na atividade de renina no plasma, concentração de aldosterona e noradrenalina e nenhuma
alteração nos níveis de lipídios. Levando em conta que a maioria dos estudos analisados
envolveu uma média de 2 g/dia de redução da ingestão de sal e as recomendações atuais são
para reduzi-lo por 5-7 g/dia, os autores argumentam que uma intervenção mais controlada e
maior do que 2 g/dia provavelmente ocasionaria maior redução na pressão sanguínea, à
semelhança das respostas dependentes da dose observada em estudos com animais.
Portanto, vários estudos têm sido realizados e, quase todos apoiam o conceito de que
o consumo de sal é um importante fator no aumento da PA da população. Entretanto, a
resposta da PA diante de modificações no consumo de sódio não costuma ser homogênea na
população. Existem indivíduos que apresentam “tendência” maior ou menor para queda ou
elevação da PA frente a reduções ou suplementações de sal, fenômeno explicado como
sensibilidade ao sal. Pacientes classificados como sensíveis ao sal mostram diminuição
significativa da excreção urinária de nitratos no final do período de elevado teor de sal em
contraste a hipertensos resistentes ao sal.
Modelos animais de hipertensão humana, incluindo ratos Dahl sensíveis ao sal (Dahl-
SS), Wistar-Kyoto (WKY) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR) respondem à dieta com
Revisão de Literatura
31
baixo e alto teor de sal com alterações da PA semelhante aos humanos sensíveis ao sal
(OGIHARA et al., 2002). Porém, os mecanismos pelos quais os indivíduos normotensos ou
hipertensos variam sua PA em diferentes graus, em resposta à restrição ou sobrecarga salina,
ainda não são completamente conhecidos.
Gordon & Mark (1984) encontraram função anormal dos barorreceptores em ratos
Dahl-SS, mesmo antes dos animais se tornarem hipertensos. Esses autores preconizaram um
mecanismo neurogênico alterado, que seria responsável pela hipertensão arterial nessa cepa
de ratos. Mecanismos renais associados ao desenvolvimento de hipertensão arterial nos
modelos Dahl-SS também foram identificados. Ratos Dahl-SS apresentam defeito na resposta
vasodilatadora renal que normalmente acompanha a sobrecarga salina com diferença na
vasculatura renal em relação à observada nos ratos Dahl resistente ao sal (Dahl-SR) (FINK et
al., 1980). Rins de ratos Dahl-SS não têm capacidade de vasodilatar integralmente
apresentando defeito na resposta vasodilatadora renal, que normalmente acompanha a
sobrecarga salina, e não aumentando com dieta rica em sal. Dahl & Heine (1975) observaram
que o transplante de um rim de rato Dahl-SR para um rato Dahl-SS previne o aparecimento de
hipertensão arterial nesse último, quando submetido à sobrecarga salina, o que de fato
sugere que o rim possa ser o órgão responsável pela sensibilidade ao sal. Em adição, cepas de
ratos Dahl-SS e Dahl-SR têm sido intensamente estudadas por meio de técnicas de biologia
molecular. Rapp et al. (1989) identificaram aumento na expressão do gene da renina nas
cepas de ratos Dahl-SS, sugerindo que essa maior expressividade do gene poderia estar
relacionada ao aumento da PA nesses animais quando expostos a sobrecarga salina.
1.3.5 Sódio e estresse oxidativo
A literatura sugere que estresse oxidativo participa da patogênese da hipertensão
com estudos relacionando modelos de hipertensão sensível ao sal e aumento do estresse
oxidativo (MANNING et al., 2003; TIAN et al., 2007; BANDAY et al., 2007). Dieta rica em sal
leva à geração de EROs e esse aumento do estresse oxidativo sistêmico pode contribuir para
prejudicar função endotelial, diminuindo dilatação endotélio-dependente em ratos
normotensos (LENDA et al., 2000). O2•− pode, então, inativar rapidamente NO, e essa reação
ocorre numa taxa mais rápida do que a interação de O2•− com a SOD, sugerindo uma
interação preferencial entre O2•− e NO na parede vascular (HARRISON, 1997). Um mecanismo
sugerido, assim, é que dieta rica em sal aumenta produção de O2•− interagindo com NO,
formando ONOO−, o que reduz biodisponibilidade de NO (BRAGULAT et al., 2001) levando ao
Revisão de Literatura
32
comprometimento funcional do órgão. Outra possibilidade para a disfunção endotelial é a
diminuição na atividade da NOS (SATOH et al., 2005).
Assim sendo, em hipertensos com sobrecarga de sal foi observado diminuição nos
níveis plasmáticos e urinários de metabólitos de NO (FUJIWARA et al., 2000) com acumulação
significativa de O2•− no rim alterando regulação normal da função renal, e contribuindo para
o desenvolvimento da sensibilidade ao sal e hipertensão (CHEN et al., 1998). O estresse
oxidativo na hipertensão foi demonstrado pelo aumento da produção de marcadores, como
por exemplo, sobre a peroxidação lipídica com o produto isoprostano e malonildialdeído
(MDA) (SCHNACKENBERG & WILCOX, 1999; BELTOWSKI et al., 2005), e por efeitos de
diminuição da PA pelo uso de formas de células-permeáveis de SOD (LAURSEN et al., 1997) ou
de seus miméticos (SCHNACKENBERG & WILCOX, 1999). O2•− age como um vasoconstritor e
aumenta a reabsorção tubular de sódio (MAKINO et al., 2002) e NO exibe efeitos opostos ao
O2•−, de forma que também está envolvido na regulação da função renal. Além disso, os
efeitos do O2•− podem reduzir a expressão do sistema de defesa antioxidante (CHABRASHVILI
et al., 2003; WELCH et al., 2005) com o aumento da produção de EROs e sua degradação
reduzida podendo levar ao estresse oxidativo com ampla consequências fisiológicas e
fisiopatológicas.
O2•− é produzido em fagócitos ativados pela enzima NADPH-oxidase (BABIOR, 1999)
que também tem sido implicada na sinalização de O2•− na vasculatura (RAJAGOPALAN et al.,
1996), no córtex (CHABRASHVILI et al., 2002) e medula (ZOU et al., 2001) do rim. Ativação de
NADPH-oxidase leva à geração de O2•− induzida por Ang II (RAJAGOPALAN et al., 1996) e está
implicada na patogênese de vários modelos de hipertensão (GRIENDLING et al., 2000;
CHABRASHVILI et al., 2002). Normalmente, durante uma dieta rica em sal, o SRA está
suprimido. Como consequência dos baixos níveis circulantes de Ang II ocorre, nos vasos da
circulação renal, aumento na expressão dos receptores para Ang II (up regulation) e maior
reatividade local à Ang II (OIGMAN, 2000). Ou seja, quantidades pequenas de Ang II são
capazes de promover expressiva vasoconstricção. Na verdade, quando medido diretamente
em ratos com hipertensão sensível ao sal, o angiotensinogênio intrarenal se eleva,
acompanhado por um aumento da expressão do receptor AT1 da Ang II. Kitiyakara et al.
(2003) sugerem que o elevado teor de sal e Ang II regulam a expressão da NADPH-oxidase
uma vez que a essa enzima foi atribuído um papel importante na geração de EROs nos tecidos
vascular e cardíaco. Consequentemente, NADPH-oxidase pode desempenhar um papel crítico
na produção de EROs no rim com disfunção endotelial em animais hipertensos sensíveis ao
sal. Ocorre, dessa maneira, uma regulação positiva da NADPH-oxidase e aumento da
Revisão de Literatura
33
produção de EROs, o que leva a uma disparidade entre os mecanismos oxidativos e
antioxidantes nos tecidos, que estão envolvidos em muitos processos fisiopatológicos no
organismo.
Logo, nesse estudo considerou-se que ratos normotensos tratados com dieta rica em
sal podem ter a produção basal de O2•− aumentada e essa alteração poderia contribuir para o
desenvolvimento do estresse oxidativo, relacionado ao aumento da resistência vascular no
modelo estudado e possível regulação da perfusão tecidual. O consumo de sal, portanto,
induz mudanças na regulação da homeostase do sódio e do volume extracelular
principalmente pelos rins (GUYTON et al., 1972) com o SRA desempenhando um papel-chave
na regulação da função renal, no volume do fluido extracelular e na PA, além de induzir
estresse oxidativo (particularmente formação de O2•−). O desequilíbrio dessas interações está
ligado à fisiopatologia da hipertensão uma vez que a hemodinâmica renal na manutenção de
sódio e no volume de fluido extracelular são reguladas por esses sistemas. À medida que a
ativação de SRA, em particular o aumento de Ang II, pode induzir a geração de O2•−, sugere-
se, diante dessas questões, que as interações fisiológicas de SRA e O2•− podem proporcionar
uma regulação coordenada da função renal (KOPKAN & CERVENKA, 2009).
Objetivos
34
2- OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente estudo teve como objetivo avaliar se dieta rica em sal pode induzir
hipertensão em ratos com hiperinsulinemia, desencadeada por frutose dietética, com o
estresse oxidativo contribuindo para a regulação da PA.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Padronizar o modelo de estudo com a dieta empregada para:
avaliar mudanças corpóreas e anatomopatológicas de órgãos-alvo;
averiguar padrão de consumo alimentar;
investigar a existência de aspectos característicos da SM;
examinar a presença de estresse oxidativo identificando dano celular e/ou alteração
de defesas antioxidantes;
verificar perfil de células sanguíneas e aspectos histológicos e funcionais hepáticos;
verificar se a administração de frutose pode estimular aumento na reabsorção de
sódio com a sobrecarga de sal;
avaliar uma provável interação entre sal e frutose, potencialmente, interferindo na
resposta pressórica.
Examinar a ação do antioxidante tempol no modelo estudado para:
avaliar desenvolvimento corpóreo;
averiguar padrão de consumo alimentar;
identificar dados relativos ao estado nutricional e à função hepática;
investigar perfil lipídico, índice aterogênico e resposta enzimática da PON;
determinar se ocorreu variação de produtos finais de degradação metabólica;
avaliar se O2•− pode estar envolvido na resposta pressórica encontrada;
observar uma possível relação entre PA, peroxidação lipídica e parâmetros sanguíneos
avaliados.
Materiais e Métodos
35
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 ANIMAIS E TRATAMENTOS
Para realizar esse estudo foram utilizados ratos machos Fischer, em idade adulta,
obtidos do Laboratório de Nutrição Experimental da Escola de Nutrição da Universidade
Federal de Ouro Preto. Todos os procedimentos foram cuidadosamente realizados e
aprovados pelo comitê de ética no uso de animais de laboratório da Universidade Federal de
Ouro Preto (068/2011). Mantidos numa sala com temperatura e umidade controladas, num
ciclo claro-escuro 12:12, os animais foram acondicionados individualmente em gaiolas do tipo
galvanizadas de fundo aramado, com livre acesso à comida e à água. Para o início do
experimento, grupos de 11 a 12 animais foram selecionados de modo que a média de peso
corporal fosse semelhante e, a cada duas semanas, ganho de peso foi regularmente avaliado.
Para calcular o consumo alimentar de cada animal foi medida a quantidade de dieta
oferecida, não consumida e desperdiçada. Já a ingestão hídrica foi verificada através do
volume de água presente no recipiente de fornecimento hídrico, subtraindo desse volume a
quantidade restante vinte e quatro horas depois. Esses dados foram avaliados próximo ao
término do experimento, sendo os valores apresentados referentes à média da mensuração
de 10 dias. Após 20 semanas de tratamento, com jejum por 10 a 12 horas, animais foram
anestesiados com isoflurano e eutanasiados por enxanguinação, através de um corte sobre o
plexo braquial. Para análise coletaram-se sangue, órgãos (fígado, coração e rins) e gordura
abdominal. Gordura e órgãos foram pesados logo após remoção e fígado, coração e rins
foram estocados a -80oC para subsequentes análises.
3.1.1 Protocolo A: Avaliação e padronização do modelo experimental
Os animais foram divididos inicialmente em três grupos: 1) grupo controle (C), que
recebeu dieta padrão e água; 2) grupo com dieta rica em sal (S), que recebeu dieta padrão
modificada com acréscimo de sal (8% NaCl) e água e 3) grupo com dieta rica em frutose (F),
que recebeu dieta padrão e solução de frutose (20%) em vez de água. Após 10 semanas de
tratamento, animais do grupo F foram subdivididos em 2 grupos: um que continuou a receber
suplementação de frutose e outro que associou alto teor de frutose e de sal por mais 10
semanas (FS10), com a mesma concentração de frutose e de sal na dieta já descrita para os
grupos F e S, respectivamente. Estenderam, assim, todos os grupos para 20 semanas de
tratamento (Figura 8).
Materiais e Métodos
36
Figura 8: Protocolo A. Ratos foram divididos em grupo controle (C), recebendo dieta padrão e água por 20
semanas; grupo com dieta rica em sal (S), recebendo dieta padrão modificada com 8% de NaCl e água por 20 semanas; grupo com dieta rica em frutose (F) , recebendo dieta padrão e solução de 20% de frutose como água por 20 semanas e grupo com dieta rica em frutose e sal (FS10), recebendo dieta padrão modificada com 8% de NaCl e solução de 20% de frutose como água por 10 semanas após tratamento prévio de dieta padrão e solução de 20% de frutose como água por 10 semanas.
3.1.2 Protocolo B: Efeito do antioxidante tempol em animais alimentados com dieta rica
em frutose e sal
Os animais foram divididos em dois grupos experimentais, um que recebeu dieta
padrão (C) e outro que recebeu dieta padrão modificada com acréscimo de sal (8% NaCl) e
solução de 20% de frutose em vez de água para beber (FS20). Da 13ª até a 20ª semana do
estudo, metade dos animais de cada um desses grupos foi tratado, uma vez ao dia com
veículo (água filtrada), ou com 10 mg/kg/dia de tempol (Sigma) em 2 mL/kg de peso por
gavagem, compondo os grupos (CT) e (FS20T) (Figura 9).
Figura 9: Protocolo B. Ratos foram divididos em grupo controle (C), recebendo dieta padrão e água por 20 semanas
e da 13ª a 20ª semana foram tratados com gavagem, uma vez ao dia, com água; grupo controle e tempol (CT) recebendo dieta padrão e água por 20 semanas e da 13ª a 20ª semana foram tratados com gavagem, uma vez ao dia, com tempol (10 mg/kg de peso); grupo com dieta rica em frutose e sal (FS20), recebendo dieta padrão modificada com 8% de NaCl e solução de 20% de frutose como água por 20 semanas e da 13ª a 20ª semana foram tratados com gavagem, uma vez ao dia, com água; grupo com dieta rica em frutose sal e tempol (FS20T), recebendo dieta padrão modificada com 8% de NaCl e solução de 20% de frutose como água por 20 semanas e da 13ª a 20ª semana foram tratados com gavagem, uma vez ao dia, com tempol (10 mg/kg de peso).
Grupo controle (C )
Grupo com dieta rica em sal (S)
Grupo com dieta rica em frutose (F)
Grupo com dieta rica em frutose e sal (FS10)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (semanas)
Dieta
Pro
toco
lo A
P
roto
colo
B
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 (semanas)
Grupo controle (C )
Dieta
Grupo controle + tempol (C T)
Grupo com dieta rica em frutose e sal (FS20)
Grupo com dieta rica em frutose e sal + tempol (FS20T)
Administração de Tempol
Administração de Tempol
Materiais e Métodos
37
3.1.3 Dieta
No Laboratório de Nutrição Experimental (LABNEX) da Escola de Nutrição da Ufop,
foram elaboradas duas rações, sendo a padrão confeccionada segundo a recomendação de
Reeves e colaboradores (1993), modelo AIN-93M, e a modificada com acréscimo de 8% de
NaCl. A composição das dietas semipurificadas referidas nos protocolos A e B está
apresentada na tabela 1.
Animais de grupos alimentados com acréscimo de sal e de frutose foram tratados com
os respectivos constituintes, isoladamente e em combinação, de modo que distintos aportes
energéticos foram oferecidos para os diferentes grupos estabelecidos ao longo do estudo.
Tabela 1: Composição das dietas dos grupos experimentais
Ingredientes
Composição (g/Kg dieta)
C S F3 FS
3
Amido de milho 622.5 542.5 622.5 542.5
Caseina 140.0 140.0 140.0 140.0
Sacarose 100.0 100.0 100.0 100.0
Sal - 80.0 - 80.0
Celulose 50.0 50.0 50.0 50.0
Óleo de soja 40.0 40.0 40.0 40.0
1Minerais 35.0 35.0 35.0 35.0
2Vitaminas 10.0 10.0 10.0 10.0
Colina 2.5 2.5 2.5 2.5
Energia (Kcal/Kg) 3810 3490 3810 3490
(C) dieta controle; (S) dieta rica em sal; (F) dieta rica em frutose; (FS) dieta rica em frutose e sal. 1Mistura mineral para
AIN-93M; 2Mistura vitamínica para AIN-93M; 3D-Frutose (Synth®Labsynth, São Paulo, Brasil)
3.1.4 Registro da pressão arterial e da frequência cardíaca por pletismografia
Animais foram colocados em contenção em um tubo cilíndrico de acrílico, em que
somente a cauda foi mantida exteriorizada, próxima a uma lâmpada aquecida para promover
dilatação da artéria e facilitar a medida da PA. A aferição só foi registrada após um período de
adaptação dos animais ao sistema de medida, com valores pressóricos registrados no início,
na fase intermediária e no final do estudo. Um manguito de borracha foi adaptado à região
proximal da cauda e ligado a um esfingmomanômetro para insuflar e desinsuflar
automaticamente em intervalos fixos de tempo (segundos). Próximo ao manguito foi também
Materiais e Métodos
38
acoplado um transdutor de pulso (sensor) que captava sinais a serem enviados e registrados
em computador. No registro da pressão sanguínea por pletismografia de cauda, ocorrem a
perda e o retorno dos sinais de pulso e de FC durante o processo de insuflação e
desinsuflação do manguito, sendo considerado o valor da PA como o primeiro sinal de pulso
de retorno desse processo. Já para análise da FC foram selecionados intervalos de 10
segundos entre os ciclos de insuflar e de desinsuflar. O sinal era captado por um amplificador
de sinais e conectado a um conversor analógico digital.
3.1.5 Teste oral de tolerância à glicose
Antes do final do experimento, 8 animais de cada grupo foram utilizados para a
investigação da sensibilidade à insulina utilizando um teste oral de tolerância à glicose
(TOTG). Para realização do teste, os animais permaneceram 12 horas em jejum antes de
receberem uma solução de 2,5 g de glicose por kg de peso corporal, via gavagem, e a glicemia
foi determinada nos tempos zero (antes da sobrecarga), 30, 60 e 120 minutos após a
administração, utilizando-se glicosímetro automatizado e fitas para se medir glicemia.
3.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS
Amostras sanguíneas dos animais foram coletadas em tubos de polipropileno com ou
sem 15μL de anticoagulante para obtenção do plasma ou soro, respectivamente. Em seguida,
o sangue foi centrifugado a 10.000 g por 15 minutos e guardados sob refrigeração (-4oC).
Foram realizadas as seguintes dosagens bioquímicas utilizando-se kits comerciais: glicose, TG,
colesterol total, colesterol-HDL, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase
(AST), fosfatase alcalina (ALP), albumina, proteínas totais, ureia, creatinina e ácido úrico. Os
princípios dos métodos e seus respectivos protocolos estão descritos no anexo 2 desse
trabalho.
3.2.1 Determinação do hematócrito
A determinação do hematócrito foi realizada por meio da técnica de
microhematócrito, segundo Goldenfarb et al. (1971). Tubos capilares foram preenchidos,
vedados em uma das extremidades e levados à centrífuga. Na centrifugação, os eritrócitos
foram compactados na parte inferior do tubo e, para a leitura, foi utilizado como auxílio o
cartão padrão. O resultado foi apresentado em porcentagem de células.
Materiais e Métodos
39
3.2.2 Contagem diferencial de leucócitos
Para contagem diferencial de leucócitos, uma gota de sangue foi usada para preparar
o esfregaço sanguíneo. A lâmina foi corada pelo corante Panotic Fast, o qual usa
componentes da coloração de Romanowsky. Contagem de 100 leucócitos foi realizada e os
resultados foram expressos como subtipos identificados para células polimorfonucleares
(PMN), linfócitos ou monócitos.
3.2.3 Atividade da paraoxonase-1
A atividade enzimática da paraoxonase-1 (PON1) no soro foi determinada de acordo
com Beltowski e colaboradores (2002). A avaliação da atividade paraoxonásica, usando
paraoxon como substrato, teve como base a velocidade de hidrólise desse, com a liberação
do para-nitrofenol por minuto. Inicialmente preparou-se uma solução contendo 9 mL de
tampão glicina/NaOH 50 mM pH10,5, contendo CaCl2 0,9mM e 2 μL de paraoxon. Em um
tubo de polipropileno adicionou-se 780 μL dessa solução e 20 μL de soro. A solução foi
homogeneizada e a absorbância das amostras foi lida no espectrofotômetro em 412 nm,
exatamente a cada minuto, por 3 minutos. O branco (tubo com 780 μL da solução preparada
inicialmente e 20 μL de água) foi utilizado para zerar o aparelho.
Para cálculo da enzima, 1 U da enzima PON1 é equivalente à hidrólise de 1 nmol de
paroxon por minuto (usualmente a atividade dessa enzima é representada por 1 mL de soro).
A atividade paraoxonásica da enzima foi calculada segundo a lei Lamber Beer. A absorbância
utilizada nessa expressão é o delta (absorbância por minuto) obtido das absorbâncias lidas no
1º e 3º minutos, subtraindo a absorbância do terceiro minuto pela absorbância do primeiro
minuto e dividindo por 2, uma vez que são 2 minutos entre as duas absorbâncias.
3.2.4 Concentração da insulina e leptina
A concentração sérica dos hormônios insulina e leptina foi determinada pelo método
de ELISA utilizando-se kits específicos descritos no anexo 2. A leitura foi realizada com auxílio
de leitor de micro-placa. O índice de resistência à ação da insulina foi estimado através do
cálculo do Homeostasis Model Assessment {HOMA-IR= [insulina em jejum (mol/L) x glicose
plasmática em jejum (mmol/L)] / 22,5} de acordo com Matthews et al. (1985).
Materiais e Métodos
40
3.2.5 Determinação de sódio
Sódio sérico foi determinado em fotômetro de chama, devidamente calibrado com
solução padrão contendo 140 mEq/L de sódio, diluído em água destilada na proporção de
1:100. Cada amostra foi diluída igualmente a solução padrão, homogeneizada e aspirada no
fotômetro de chama para a leitura da concentração do sódio e expressa em mmol/L.
3.2.6 Extração da gordura hepática
A gordura hepática foi extraída usando uma mistura de clorofórmio e metanol (2:1,
v/v), conforme descrito por Folch et al. (1957). Inicialmente, 400 mg de fígado foram
homogeneizados com 8 mL da mistura clorofórmio-metanol (2:1v/v) e o homogenato vertido
em tubos de vidro pré-lavados com éter de petróleo. Os tubos foram centrifugados a 1000 g
por 10 minutos. O sobrenadante foi retirado e colocado em outro tubo de vidro previamente
pesado e identificado. Foram acrescentados 2 mL da solução de NaCl 0,73% e nova
centrifugação foi realizada e, em seguida, a fase superior foi desprezada. Posteriormente, a
parede interna do tubo de vidro foi lavada com 3 mL da solução de Folch -
clorofórmio/metanol/água (3:48:47). A fase superior foi desprezada e os tubos com os
extratos lipídicos foram secos em estufa semiaberta, a 40oC, para evaporação total do
solvente. Após a evaporação, os tubos foram resfriados no dessecador e pesados novamente.
A quantidade de gordura no fígado (mg) foi obtida, subtraindo-se o peso do tubo final (g) do
peso do tubo inicial (g) multiplicado por 1000.
3.2.7 Oxidação de lipídeos (peroxidação lipídica) pela dosagem das substâncias reativas
ao ácido tiobarbitúrico
Determinação da concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS) é fundamentada na capacidade do ácido tiobarbitúrico (TBA) se ligar a lipídios
oxidados, conforme descrito por Buege & Aust (1978).
Para a realização da dosagem, fragmentos de 100 mg do tecido foram
homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato, pH 7,4 e, em seguida, centrifugados por 10
minutos a 10000 g a 4oC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.
Em um tubo foram adicionados 500 µL de homogeneizado, 250 µL de ácido
tricloroacético (TCA) 28% p/v dissolvido em HCl 0,25N, 250 µL de TBA 1% dissolvido em ácido
acético 1:1 e 125 µL de BHT 5 mM dissolvidos em etanol. Em seguida, o tubo foi levado ao
Materiais e Métodos
41
vórtex e colocado em banho-maria a 95oC por 15 minutos. Após serem resfriados em banho
de gelo, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10000 g e o sobrenadante retirado foi
lido no espectrofotômetro a 535 nm, zerado com água destilada.
A concentração de TBARS foi determinada utilizando o coeficiente de extinção molar
(ε = 1,56 x 105L x mol-1 x cm-1), segundo a lei de Lambert Beer. Essa concentração foi
representada em nmoles/mL.
3.2.8 Atividade da superóxido dismutase
Atividade da SOD foi medida nos tecidos de acordo com o método de Marklund &
Marklund (1974) que se baseia na capacidade da SOD em inibir a autooxidação do pirogalol.
Os reagentes de trabalho utilizados foram: KH2PO4, Na2HPO4, Pirogalol, MTT {brometo de
(3-[4,5-dimetiltiazol-2H]-2,5-difeniltetrazolio) e DMSO (dimetilsulfóxido)}.
Para a realização da dosagem, fragmentos de 100 mg do tecido foram
homogeneizados com 1 mL de tampão fosfato (50 mM), pH 7,0, e em seguida, centrifugados
por 10 minutos a 12000 g a 4oC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.
A confecção das dosagens nas amostras usando placa de Elisa seguiu a sequência de adições
de reagentes, conforme o quadro a seguir.
Poço Amostra Tampão MTT (1,25 mM)
Pirogalol (100µM)
Branco - 144 µL 6 µL -
Padrão - 129 µL 6 µL 15 µL
Amostra 30 µL 99 µL 6 µL 15 µL
As amostras foram incubadas por 5 minutos em estufa à 37oC. Logo após, 150 μL de
DMSO foram adicionados às mesmas para parar a reação. As absorbâncias foram lidas no
leitor de Elisa em um comprimento de onda de 570 nm. Considerando que uma unidade de
SOD (U) é responsável pela oxidação de 50% do piragolol, e que a absorbância da amostra
obtida em unidades de SOD, converteu-se a absorbância da amostra obtida em unidades de
SOD. Para cálculo da atividade de SOD, subtrai-se o resultado obtido da amostra pelo valor
encontrado do branco e, a seguir, divide-se esse valor pelo encontrado da subtração do
padrão pelo branco.
Materiais e Métodos
42
3.2.9 Atividade da catalase
A determinação da atividade da enzima CAT é baseada na sua capacidade de
converter H2O2 em água e oxigênio molecular, conforme descrito por Aebi (1984).
Para a preparação da amostra biológica 100 mg do tecido foram homogeneizados
com 1 mL de tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2 e, em seguida, centrifugados por 10 minutos a
4oC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.
Em um tubo de polipropileno, adicionaram-se 50 µL de tampão fosfato pH 7,2; (0,1
mM) e 40 µL de água destilada. Em seguida, adicionaram-se 10 µL da amostra e 900 µL de
H2O2 (10 mM) e homogeneizou-se a solução. O espectrofotômetro foi zerado com H2O2 (5
mM) em 240 nm e determinaram-se as absorbâncias das amostras exatamente a cada
minuto, durante 2 minutos e 30 segundos.
1 U de CAT é equivalente à hidrólise de 1 µmol de H2O2 (ε = 39,4 L.mol-1.cm-1) por
minuto. Usualmente, a atividade dessa enzima é representada em Unidade por mL de
amostra. Calculou-se a atividade da CAT segundo a lei de Lambert Beer. A absorbância
utilizada nessa expressão é o delta obtido da primeira e da última absorbância lida
(absorbância final – absorbância inicial / 2).
3.2.10 Concentração de glutationa
Glutationa total foi determinada enzimaticamente de acordo com Akerboon & Sies
(1981). Esse ensaio utiliza um método cinético fundamentado na redução do 5,5’ ditio-bis-2-
ácido nitrobenzóico (DTNB). A glutation reduzida (GSH) presente na amostra reage com
DTNB, produzindo 5-tio-2-ácido nitrobenzóico (TNB) e glutationa oxidada (GSSG).
Para preparo dos reagentes de estoque foram usados: solução de ácido sulfosalicílico
(SSA) 5%; tampão fosfato 5x (500 mM), contendo 5 mM EDTA; solução padrão estoque de
glutationa (0,3 mg de glutationa reduzida em 0,1 mL de água destilada); solução de estoque
de DTNB (8 mg de DTNB foram diluídos em 5,33 mL de dimetil sulfosalicílico (DMSO)
resultando em uma solução com 1,5 mg/mL de concentração) e estoque de NADPH (solução
de 40 mg/mL).
A amostra biológica foi preparada com 100 mg do tecido homogeneizado em 1 mL de
ácido de sulfosalicílico 5% (SSA) e, em seguida, centrifugada a 10000 g, por 10 minutos a 4oC.
O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.
Materiais e Métodos
43
Os reagentes utilizados foram: solução de enzima diluída (diluir 15,2 μL de glutationa
redutase (100 unidades/mL) em 250 μL de tampão fosfato 1x); solução de NADPH de trabalho
(da solução de estoque de NADPH preparada são retirados 30 μL para 7,5 mL de tampão
fosfato 1x); mistura de trabalho (8 mL de tampão 1x, 228 μL da solução de enzimas diluída e
228 μL de DNPH solução de estoque); solução padrão de glutationa – preparar para a curva
padrão (diluir 10 μL de solução estoque de glutationa padrão com 2 mL de ácido SSA 5%).
Para a confecção da curva padrão e das dosagens nas amostras utilizou-se placa de Elisa
seguindo a sequência de adições de reagentes, conforme mostradas nos quadros a seguir.
CURVA PADRÃO:
Poço 1 2 3 4 5
[GSH] µM
50 25 12,5 6,25 3,125
Solução de GSH (µM)
50 25 (tubo 1) 25 (tubo 2) 25 (tubo 3) 25 (tubo 4)
SSA 5% (µL)
- 25 25 25 25
nmoles de GSH em 10 µL de amostra
0,5 0,25 0,125 0,062 0,0312
DOSAGEM:
Poço Volume da
amostra SSA 5%
Mistura de trabalho
NADPH (final)
Branco
- 10 µL 150 µL 50 µL
Curva padrão
10 µL - 150 µL 50 µL
Amostra
10 µL - 150 µL 50 µL
As amostras foram então incubadas, por 5 minutos à temperatura ambiente e, em
seguida, adicionou-se NADPH às mesmas com o cronômetro sendo disparado. As
absorbâncias foram lidas, durante 5 minutos a cada minuto, no leitor de Elisa a 412 nm. As
absorbâncias de diluições seriadas de uma solução padrão de glutationa reduzida foram
determinadas e GSSG, já presente na amostra, foi reduzida a GSH pela presença de GR e
NADPH (chamado de método enzimático), medido após derivação da glutationa total com
acréscimo de 2-vinilpiridina (2-VP). Após análise de regressão linear, foi determinada a
equação da reta [Concentração = a* (delta das absorbâncias) + b]. Essa equação foi utilizada
para determinar a concentração em nmoles de glutationa total em 10 μl de amostra, e esse
Materiais e Métodos
44
valor extrapolado para 1 mL de amostra. Índice de estresse oxidativo foi calculado pela razão
GSH/GSSG.
3.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
Fígado foi removido e um lóbulo foi imediatamente fixado em 10% de formol
tamponado. Após fixação, o material foi desidratado em concentrações crescentes de álcool
(70, 80, 90 e 100%), diafanizados em xilol e embebidos e incluídos em parafina. Os blocos de
parafina foram submetidos à microtomia com obtenção de cortes histológicos de 4
micrômetros de espessura e montados em lâminas de microscopia. Os cortes foram
desparafinizados em duas trocas de xilol, hidratados em concentrações decrescentes de
álcool (100, 90, 80 e 70%) e, então, lavados em água corrente. Em seguida, foram corados
pela técnica histológica de rotina da Hematoxilina & Eosina e levados à estufa a 56% para
secagem e serem montados com lamínula e Entellan.
Análises foram realizadas usando método semi-quantitativo, como previamente
descrito por Brunt et al. (1999). Degenerações foram determinadas de acordo com a
porcentagem de gordura contida em hepatócitos. Grau de vesículas esteatóticas foi dividido
em 10 grades em que foram dados os valores de 0-4 graus de acordo com a presença de
esteatose envolvida no hepatócito da biópsia (0, nenhum; 1, 10%; 2, 10 a 33%; 3, 33 a 66% e
4, >66%). As imagens foram visualizadas pela objetiva de 40x e digitalizadas através de
microcâmera no Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto.
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos em média ± desvio padrão e com apoio instrumental
do programa de análise estatística GraphPad Prism 5. Para avaliar a normalidade dos dados
utilizou-se o teste de Kolmogorov-Smirnov. A significância de qualquer diferença em
proporções ou medianas foi testada pelo teste de Kruskal-Wallis e em médias pela ANOVA
one way, seguido por teste de Dunns ou Tukey, respectivamente. As correlações entre
diferentes variáveis foram realizadas pelo coeficiente de Pearson. Um p-valor ≤ 0,05 foi
considerado estatisticamente significativo.
Resultados
45
4- RESULTADOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DO MODELO EXPERIMENTAL
4.1.1 Peso corporal, da gordura abdominal e dos órgãos, ingestão alimentar, indicadores
de função hepática e parâmetros metabólicos
Para realização do estudo, inicialmente, os animais foram selecionados de forma que
os diferentes grupos apresentassem o mesmo peso corporal. Os animais foram pesados ao
longo do experimento e não se observou diferença no peso corporal com o uso da frutose na
dieta (451,2 ± 29,5g em C versus 448,2 ± 36,9g em F). Em contraste, tratamento com dieta
rica em sal mostrou menor ganho de peso, apresentando o grupo FS10 menor
desenvolvimento ponderal (-10%) em relação aos animais dos grupos C e F. Da mesma forma
observou-se menor gordura abdominal para animais alimentados com alto conteúdo de sal.
Para os órgãos coração e rim, sal resultou em maior peso relativo desses para S e FS em
relação aos grupos sem sobrecarga de sal ao passo que o peso relativo do fígado foi maior
para os animais em uso de frutose na dieta, comparando-se aos ratos C e S (Tabela 2).
Consumo alimentar foi significativamente diferente entre todos os tratamentos. Em
relação ao grupo C, animais do grupo S, que receberam dieta com menor densidade
energética, obtiveram maior consumo de ração, e, inversamente, suplementação de frutose
conduziu para menor consumo devido seu conteúdo energético prover calorias extras nesses
grupos (F e FS10). Adicionalmente, ingestão de líquido foi aumentada (4,5 vezes) quando
acréscimo de sal foi incorporado à dieta padrão, comparada aos grupos C e F, estimulando a
sede devido ao aumento na osmolaridade plasmática sistêmica. Dessa forma, ingerir mais
frutose, devido ao sal na ração, fez FS10 consumir menos calorias da ração do que outros
grupos, enquanto que o acréscimo de sal ao tratamento com suplementação de frutose,
quando combinados, resultou em maior consumo de frutose para animais FS10. Calculando,
grupo FS10 ingeriu 3,5 vezes mais frutose do que grupo F (Tabela 2).
As determinações bioquímicas da concentração de albumina e atividade das
transaminases AST e ALT, além de ALP, constituem marcadores importantes da função
hepática. Observou-se que os animais do grupo FS10 diminuíram significativamente (-25%) os
níveis séricos de albumina em relação aos grupos C e S. Além disso, dados apresentados
mostraram que atividade de ALP foi aumentada para FS10 em relação aos animais C bem
Resultados
46
como ALT para o grupo F, enquanto AST não apresentou mudança com os tratamentos
(Tabela 2).
Resultados demonstraram que tratamento com frutose produziu hiperglicemia
(animais do grupo F e FS), com grupo FS10 aumentando, significativamente, níveis de insulina
sérica em relação aos grupos C e S. RI, indicada pelo maior valor de HOMA, foi também maior
para o grupo FS10 em relação aos outros grupos. Concentrações de leptina no grupo F foram
maiores do que as dos outros grupos. Ratos FS10 desenvolveram hipertriacilgliceridemia
como mostrado por elevação nos níveis de TG (1,5 vezes maior do que o C) com maior
conteúdo de gordura hepática para os grupos F e FS10, comparadamente aos animais dos
grupos C e S. Concentração de ácido úrico sérico aumentou 25% em ratos do grupo F em
relação ao grupo C (Tabela 2).
Tabela 2: Características dos grupos experimentais
Parâmetros Tratamentos
C S F FS10 Peso corporal inicial (g) 295 ± 21,5 295,1 ± 23,1 295,1 ± 22,2 294,4 ± 28,5 Peso corporal final (g) 451,2 ± 29,5
a 428,2 ± 28,2
ab 448,2 ± 36,9
a 412 ± 17,2
b
Gordura abdominal (g) 14,3 ± 2,3a
10,4 ± 1,5b
14,2 ± 2,7a
10,8 ± 2,0b
Peso relativo coração (mg/g) 2,4 ± 0,1b
2,5 ± 0,2a
2,3 ± 0,1b
2,6 ± 0,1a
Peso relativo fígado (mg/g) 27,8 ± 3,0b 27,4 ± 2,6b
30,6 ± 2,4a
31,0 ± 2,1a
Peso relativo rim (mg/g) 5,1 ± 0,2b
5,6 ± 0,3a
5,2 ± 0,2b
5,8 ± 0,2a
Consumo de ração (g/dia) 17,9 ± 0,8b
19,9 ± 1,8a
15,9 ± 1,1c 12,5 ± 1,6
d
Ingestão de líquido (ml/dia) 12,0 ± 2,1c 54,0 ± 7,4
a 9,2 ± 1,4
c 32,7 ± 5,2
b
Albumina (g/dL) 2,8 ± 0,2a
2,8 ± 0,3a
2,5 ± 0,5ab
2,1 ± 0,4b
AST (U/L) 56,8 ± 17,3 56,8 ± 16,3 58,3 ± 17,3 57,1 ± 16,0 ALT (U/L) 16,0 ± 5,4
b 25,2 ± 11,2
ab 28,7 ± 11,6
a 24,8 ± 7,2
ab
ALP (U/L) 50,7 ± 11,2b
60,0 ± 11,2ab
59,6 ± 16,3 ab
70,7 ± 13,1a
Glicose plasmática (mmol/L) 8,0 ± 0,9b
8,7 ± 1,1b
11,9 ± 1,8a
12,7 ± 1,6a
Insulina (μmoles/L) 20,9 ± 13,1b
27,7 ± 14,2b
34,0 ± 19,4b
45,1 ± 25,8a
HOMA (índice) 7,6 ± 5,4b
11,0 ± 7,0b
17,4 ± 11,1b
23,2 ± 16,4a
Leptina (ng/mL) 6,76 ± 2,5b
4,50 ± 1,2b
10,1 ± 3,3a
5,8 ± 2,4b
Triacilglicerol (mmol/L) 1,42 ± 0,3b
1,67 ± 0,5 ab
2,07 ± 0,6ab
2,22 ± 0,6a
Gordura hepática (mg/g de fígado) 53,3 ± 6,0b
42,5 ± 4,4b
73,4 ± 17,3a
72,6 ± 12,6a
Ácido úrico (mg/dL) 1,37 ± 0,28b
1,29 ± 0,25b
1,72 ± 0,26a
1,57 ± 0,37ab
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (dieta rica em sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS10 (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas após tratamento prévio por um período de 10 semanas com F). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. Aspartato Aminotransferase (AST); Alanina Aminotransferase (ALT); Fosfatase Alcalina (ALP) e Modelo de avaliação da homeostase (HOMA).
Resultados
47
Sensibilidade à insulina Para o TOTG realizado para avaliar sensibilidade à insulina, observou-se que a
concentração de glicose basal não foi diferente entre os grupos experimentais (variando de
96,2 ± 14,1 mg/dL para 105,1 ± 10,8 mg/dL). Porém, ao longo do teste, em comparação aos
outros grupos, o grupo F apresentou maior valor de glicemia após 30 minutos do teste,
alcançando 180,1 ± 12,5 mg/dL. Em sequência, aos 120 minutos, grupos tratados com frutose
e sal, isoladamente e em combinação, não foram capazes de retornarem glicemia para
valores semelhantes aos apresentados no tempo zero. Esse dado indica que, tanto o sal
quanto a frutose podem ter respostas atenuadas para utilização da glicose, caracterizando
uma menor ação da insulina do que o grupo controle (Figura 10).
Figura 10: Teste oral de tolerância à glicose nos grupos experimentais. Valores são expressos como
média ± desvio padrão de 8 animais/grupo. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
4.1.2 Sódio sérico
A concentração sérica de sódio nos diferentes grupos foi avaliada e notou-se que o
nível de sódio no soro foi significativamente menor no grupo S (127,6 ± 4,5 mmol/L) do que
nos tratamentos para os grupos C, F e FS10, respectivamente (142,9 ± 5,3 mmol/L; 140,8 ±
8,1 mmol/L e 135,8 ± 4,5 mmol/L). Entretanto, embora dieta rica em sal possa levar a uma
Resultados
48
alteração na excreção de sódio para equilíbrio da osmolaridade sanguínea, pôde-se constatar
que a associação de frutose e sal conduziu para mudança desse padrão resultando em
aumento da concentração sérica de sódio em relação ao tratamento com sal isoladamente
(Figura 11).
C S F FS10110
120
130
140
150
160a
a
a
b
Só
dio
se
ric
o
(mm
ol/
L)
Figura 11: Valores séricos de sódio para os grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20
semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
4.1.3 Células sanguíneas
Contagem diferencial de leucócitos no sangue dos ratos, sob o tratamento de frutose,
mostrou diminuição significativa no perfil de linfócitos em relação ao grupo controle, mas
manteve-se sem alteração a porcentagem de células PMNs. Em contrapartida, o perfil de
monócitos foi aumentado significativamente em ratos tratados com frutose na dieta, quando
comparados aos animais do grupo C (Tabela 3).
Tabela 3: Contagem de leucócitos nos grupos experimentais
C S F FS10
Células PMN (%) 11 (5-15) 13 (0-28) 8 (1-27) 17 (7-23) Linfócitos (%) 42 (19-58) 47 (8-62) 14 (4-33)
* 11 (7-20)
***
Monócitos (%) 47 (27-61) 39 (16-80) 74 (36-85)**
72 (60-83)*
Dados são apresentados em mediana e, entre parênteses, valores indicam menores e maiores porcentagens de células contadas para
os grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle +
solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de
água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 versus C pelo teste
de Kruskall Wallis seguido pelo teste de Dunns. Células Polimorfonucleares (PMN).
Resultados
49
4.1.4 Peroxidação lipídica e componentes dos sistemas antioxidantes
A peroxidação lipídica tecidual, que reflete dano celular, foi avaliada por TBARS para
os órgãos coração, fígado e rim. Os níveis de TBARS no fígado demonstraram, para ratos
tratados com frutose e sal, maior média do que no grupo controle, o qual reflete que os
tratamentos promoveram estresse oxidativo hepático. Como consequência do processo de
lipoperoxidação, mudanças na permeabilidade seletiva das membranas alterando os fluxos
iônico e de outras substâncias resultam na perda da seletividade para entrada e/ou saída de
nutrientes e de substâncias tóxicas à célula com comprometimento dos componentes da
matriz extracelular. Os outros órgãos analisados, coração e rim, se mostraram menos
sensíveis ao estresse oxidativo, podendo esses serem mais protegidos ao ataque das EROs,
uma vez que não foi observada nenhuma mudança com os tratamentos (Figura 12).
C S F FS100
5
10
15
Coração
nm
ol/
mL
C S F FS10
0
2
4
6
8
10
Fígado
a a ab
nm
ol/
mL
Rim
C S F FS100
5
10
15
nm
ol/
mL
Figura 12: Concentrações das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) no coração, no fígado e no rim dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta
enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
Resultados
50
Entre as principais enzimas responsáveis pela defesa antioxidante do organismo
destacam-se a SOD e a CAT, que constituem a primeira defesa endógena de neutralização das
EROs. A atividade da SOD apresentou-se significativamente diminuída no coração dos grupos
tratados com frutose e sal isoladamente em relação ao grupo C, porém, elevada para o grupo
FS10. Já no fígado, foi observada uma diminuição significativa da atividade de SOD apenas
para o grupo FS10, comparadamente aos animais do grupo controle. No rim, foi encontrado
aumento significativo da atividade de SOD para os diferentes tratamentos em relação aos
animais controles (Figura 13). A atividade da CAT no coração e no fígado foi acentuadamente
diminuída para o grupo FS10 em relação aos grupos F e C, respectivamente. No rim não se
observou diferença significativa entre os grupos para atividade de CAT. Os resultados estão
apresentados na figura 14.
C S F FS100.0
0.5
1.0
1.5
ab
c
c
Coração
taxa d
e i
nib
ição
(%
)
C S F FS10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5a
ab bab
Fígado
taxa d
e i
nib
ição
(%
)
C S F FS100.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
a a aab
Rim
taxa d
e i
nib
ição
(%
)
Figura 13: Atividade da enzima superóxido dismutase no coração, no fígado e no rim dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e
água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de fruto se 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
Resultados
51
C S F FS100
50
100
150
200
Coração
abab
a
b
U/m
L
C S F FS100
10
20
30
40
50
Rim
(U/m
L)
Figura 14: Atividade da enzima catalase no coração, no fígado e no rim dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F
(dieta controle + solução de frutose 20% em ve z de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
Como a atividade da GPx é regulada pela peroxidação lipídica, a fim de buscar o
controle e a redução na taxa de lipoperoxidação, ocorre aumento na sua atividade com
velocidade de oxidação de GSH por H2O2, catalisada por GPx. Nesse estudo, avaliou-se o
status da glutationa e observou-se que, comparados ao grupo controle, níveis hepáticos de
glutationa total e GSH foram diminuídos significativamente no grupo FS10, embora nenhuma
mudança significativa tenha sido observada nos níveis de GSSG, como mostrado na figura 15.
O índice de estresse oxidativo foi calculado pela razão GSH/GSSG, a qual foi demonstrada ser
menor em ratos FS10 do que nos outros três grupos, razão essa que sugere que EROs foram
geradas em quantidades acima dos valores basais.
C S F FS100
50
100
150
200
Fígado
b
a
ab
b
U/m
L
Resultados
52
Glutationa total
C S F FS100.0
0.5
1.0
1.5
2.0
aa
a
b
nm
ol/
mL
C S F FS10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
aa
a
b
GSH
nm
ol/
mL
C S F FS100.00
0.05
0.10
0.15
GSSG
nm
ol/
mL
GSH/GSSG
C S F FS100
5
10
15
20
a
a
a
b
Figura 15: Concentração de glutationa total, reduzida, oxidada e relação de glutationa reduzida para oxidada no fígado dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); S
(8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). Valores são apresentados em média ± desvio padrão. Diferentes letras indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. GSH (Glutationa reduzida); GSSG (Glutationa oxidada).
4.1.5 Histopatologia hepática
Fotomicrografias hepáticas coradas com H&E são mostradas na figura 16 (A, B, C e D)
e os resultados dos escores das variáveis histológicas são apresentados na figura 16 (E).
Ausência ou suave esteatose hepática ocorreram em ratos do grupo controle. Em ratos
tratados apenas com dieta rica em sal, predominantemente, não houve esteatose, mas vasos
hiperêmicos foram observados. Como esperado, frutose ocasionou acumulação de lipídios
em hepatócitos, evidenciados nos grupos F e FS10. Deposição de gordura no grupo F foi
classificada como macrovesicular, enquanto fígado de ratos do grupo FS10 mostrou,
principalmente, vesículas esteatóticas microvesiculares, com menor grau de acumulação do
que em ratos F. Um maior escore para esteatose foi encontrado no fígado de ratos F quando
comparado ao grupo C (p < 0,05).
Resultados
53
Figura 16: (A-D) Fotomicrografia representativa da coloração hematoxilina e eosina (H&E) de seções hepáticas de ratos nos diferentes grupos experimentais. Anormalidades nos hepatócitos não
foram observadas no grupo C (A); Vasos hiperêmicos (cabeça de seta) e parênquima com aparência normal no grupo S (B); Aspecto de esteatose macrovesicular no grupo F (C). Note hepatócitos com núcleos deslocados para a periferia da célula (seta branca); Aspecto de esteatose microvesicular no grupo FS10 (D). Note células com vacúolos citoplasmáticos sem delocamento de núcleo (seta preta) magnificação ×440. Grau de esteatose hepática de ratos nos diferentes grupos experimentais (E). Valores (n = 8-11). Grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (8% dieta enriquecida com sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em vez de água por 20 semanas) e FS10 (8% dieta enriquecida com sal e solução de frutose 20% em vez de água por 10 semanas após prévio tratamento por um período de 10 semanas com F). *p<0,05 pelo teste de Kruskall Wallis seguido pelo teste de Dunns.
*
Resultados
54
4.1.6 Pressão arterial sistólica e correlação com consumo de sal
Os valores médios da PAS ± desvio padrão, apresentados ao longo do tempo do
estudo, demonstraram que dieta rica em sal aumentou significativamente PAS (30mmHg) em
relação ao grupo controle no final do período experimental. Para o tratamento com frutose,
não foi observado modificação pressórica, apesar de leve tendência para aumento de PAS. A
mudança não foi suficientemente sustentada até o final do estudo, não alterando
significativamente os valores pressóricos. Acrescentando sal à dieta do grupo suplementado
com frutose, notou-se aumento da PAS com FS10 mostrando níveis pressóricos no final do
estudo superior ao do grupo C (Tabela 4). Adicionalmente, foi avaliada associação entre
consumo de sal e PAS (r=0,44; p<0,003). Quanto maior o consumo de sal maior PAS foi
observada. Ressalta-se que animais do grupo FS10 consumiram menos sal em relação ao
grupo S (além de menor tempo de tratamento, menor quantidade foi ingerida em g/dia, uma
vez que F na água ocasionou menor consumo de dieta sólida) (Figura 17).
Tabela 4: Registro pressórico dos grupos experimentais ao longo do experimento
Semana Pressão Arterial Sistólica (mmHg)
C S F FS10 0 127,0 ± 6,1
b - - -
9 124,2 ± 12,6b 136,1 ±
30,7
ab 142,3 ± 19,9
ab -
18 125,8 ± 12,1b 155,7 ±
20,9
a 136,8 ± 17,0
ab 150,3 ±
18,7
a
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); S (dieta rica em sal e água por 20 semanas); F (dieta controle + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS10 (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas após tratamento prévio por um período de 10 semanas com F). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
0 2 4 60
50
100
150
200
r = 0.44p < 0.003
Consumo de sal (g/dia)
PA
S (
mm
Hg
)
Figura 17: Correlação de Pearson entre valores de PAS final (mmHg) e consumo de sal (g/dia).
Resultados
55
4.2 AÇÃO DO ANTIOXIDANTE TEMPOL
4.2.1 Ganho de peso, de gordura abdominal e ingestão alimentar
Os dados demonstram que a combinação de sal e de frutose na dieta por 20 semanas
não ocasionou alteração no ganho de peso e de gordura abdominal nos animais no protocolo
B. Para os valores médios de ingestão de alimentos, observou-se que o fato da frutose, em
água, fornecer calorias extras para além das fornecidas pela dieta controle, resultou como
previsto em menor consumo de ração para os grupos FS20 e FS20T em relação aos grupos C e
CT. Como constatado no protocolo A, grupos tratados com dieta rica em sal aumentaram a
ingestão de líquido em comparação às dietas dos grupos que consumiram uma quantidade
normal de sal. Portanto, apesar dessa diferença no consumo de alimentos, não houve
diferença no ganho de peso corpóreo final e na gordura abdominal. Além do mais,
tratamento com tempol não ocasionou mudanças corporais e alteração no consumo
alimentar desses animais, independentemente do tipo de dieta (Tabela 5).
Tabela 5: Peso corporal, da gordura abdominal e ingestão alimentar nos grupos experimentais
Parâmetros Tratamentos
C CT FS20 FS20T Peso corporal inicial (g) 296,7 ± 18,2 296,4 ± 26,8 297,0 ± 25,1 299,1 ± 27,3 Peso corporal final (g) 386,4 ± 23,3 394,1 ±
24,1
395,8 ± 28,2 400,9 ±
28,5
Peso de gordura abdominal (g) 11,4 ± 2,3 12,8 ± 1,3 12,0 ± 2,2 11,9 ±
1,8
Consumo de ração (g/dia) 14,4 ± 0,9a 14,9 ± 0,9
a 10,2 ± 1,8
b 9,8 ± 1,1
b
Ingestão de líquido (ml/dia) 16,2 ± 1,8b 15,2 ± 1,1
b 40,6 ± 4,7
a 40,7 ± 6,9
a
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
4.2.2 Hematócrito, proteínas e glicose plasmática
Dosagem de hematócrito sugeriu hemoconcentração nos grupos FS20 e FS20T em
relação ao grupo C. Em relação às proteínas totais e à albumina, não se observou variação
entre os diferentes grupos estudados, ao passo que concentração de glicose foi
significativamente aumentada para os animais do grupo FS20, quando comparados aos
grupos C e CT. Entretanto, nenhuma dessas variáveis foi alterada com tempol, embora média
do grupo FS20T reduziu em 12% glicemia, atenuando glicose plasmática do grupo FS20
(Tabela 6).
Resultados
56
Tabela 6: Hematócrito, proteínas e glicose plasmática em animais experimentais
Parâmetros Tratamentos
C CT FS20 FS20T Hematócrito (%) 26,7 ± 9,3
b 31,0 ± 6,5
ab 37,1 ± 8,3
a 38,5 ± 4,0
a
Proteína total (g/dL) 8,5 ± 1,3 8,3 ± 1,4
9,0 ± 0,8 9,0 ±
1,1
Albumina (g/dL) 3,3 ± 0,3 3,3 ± ,0,2 3,6 ± 0,2 3,4 ±
0,1
Glicose (mmol/L) 7,5 ± 0,8bc
6,7 ± 0,6c 9,9 ± 2,1
a 8,8 ± 2,1
ab
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
4.2.3 Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da paraoxonase-1
Trigliceridemia foi elevada em ratos FS20 comparando-se a animais do grupo C, mas,
tratamento com tempol reduziu esse aumento em 25%. Colesterol total e colesterol-HDL
apresentaram menores concentrações em ratos FS20 do que nos grupos C e CT. Tratamento
com tempol, novamente, restabeleceu os valores embora não igualando a mesma
concentração observada no grupo C. O índice aterogênico do grupo FS20 foi aumentado em
55% quando comparado aos animais do grupo C enquanto que tempol reduziu
acentuadamente esse aumento. Já a atividade sérica da PON1 sobre o substrato paraoxon
apresentou-se 8% menor no grupo FS20 do que o observado no grupo controle, e
interessantemente, tempol aumentou 1,4 vezes a atividade de PON1 dos ratos tratados com
frutose e sal, alcançando níveis maiores do que o mostrado pelos animais controle (Tabela 7).
Tabela 7: Perfil lipídico, índice aterogênico e atividade da PON1 nos grupos experimentais
Parâmetros Tratamentos
C CT FS20 FS20T Triacilglicerol (mmol/L) 1,8 ± 0,7
b 1,8 ± 0,2
b 3,1 ± 0,8
a 2,3 ± 0,5
b
Colesterol total (mmol/L) 2,8 ± 0,2b 3,2 ±
0,1
a 1,7 ± 0,2
d 2,1 ±
0,4
c
Colesterol-HDL (mmol/L) 2,1 ± 0,2a 2,2 ±
0,3
a 1,1 ± 0,1
c 1,6 ±
0,3
b
Índice aterogênico 0,3 ± 0,1b 0,4 ± 0,1
ab 0,5 ± 0,1
a 0,3 ± 0,1
b
PON1 paraoxon (U/mL) 190,2 ± 19,8b 203,5 ± 52,4
ab 173,9 ± 41,4
b 246,0 ± 49,0
a
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento). O índice aterogênico foi calculado: colesterol total – colesterol-HDL/colesterol-HDL. Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. Paraoxonase 1 (PON1).
Resultados
57
4.2.4 Peso relativo do fígado e parâmetros de função hepática
Em relação aos animais do grupo controle, verificou-se que peso relativo do fígado foi
significativamente maior dos animais tratados com a dieta FS e com o uso de tempol. Ratos
FS20 mostraram aumento na atividade de AST, ALT e ALP quando comparadas ao grupo C,
mas, tempol reverteu valor de ALT e ALP, melhorando função hepática, já que elevações
desses valores demonstram algum nível de comprometimento hepático. Curiosamente, o
tratamento com tempol aumentou atividade de ALP em animais recebendo dieta controle
(Tabela 8).
Tabela 8: Peso relativo do fígado, atividade sérica de transaminases e fosfatase alcalina nos grupos experimentais
Parâmetros Tratamentos
C CT FS20 FS20T Peso relativo fígado (mg/g) 25,1 ± 1,5
b 28,8 ± 3,6
a 30,8 ± 1,3
a 31,3 ± 2,6
a
AST (U/L) 43,6 ± 12,7b 49,1 ±
17,5
ab 59,3 ± 11,9
a 50,6 ±
13,6
ab
ALT (U/L) 19,2 ± 5,0b 21,6 ±
8,9
ab 28,9 ± 8,9
a 18,0 ±
6,8
b
ALP (U/L) 67,4 ± 10,4b 80,0 ± 8,7
a 85,8 ± 11,6
a 66,8 ± 11,4
b
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey. Aspartato Aminotransferase (ASP); Alanina Aminotransferase (ALT); Fosfatase Alcalina (ALP).
4.2.5 Peso relativo dos rins e produtos de degradação metabólica
Evidenciou-se aumento significativo do peso relativo dos rins para o grupo FS20 em
relação ao grupo CT. Níveis séricos de ureia, de creatinina e de ácido úrico foram
acentuadamente maiores em ratos FS20 do que em ratos C. Contudo, tempol mostrou efeitos
benéficos, prevenindo aumento de ácido úrico e de ureia em ratos FS20. No caso da ureia, é
válido salientar que esse é um dos principais catabólitos dos aminoácidos produzidos no
fígado. Já a creatinina, produzida pela utilização da fosfocreatina muscular, quando no
momento da atividade muscular ocorre defosforilação das moléculas de fosfocreatina para a
obtenção de energia, sofre ciclização não enzimática e transforma-se em creatinina. De
maneira semelhante à ureia, a creatinina, em situações de normalidade do funcionamento
muscular é constantemente produzida e lançada ao sangue, sofrendo filtração renal (Tabela
9).
Resultados
58
Tabela 9: Peso relativo dos rins e produtos de degradação nos grupos experimentais
Parâmetros Tratamentos
C CT FS20 FS20T Peso relativo rim (mg/g) 5,4 ± 0,3
ab 5,2 ± 0,8
b 5,9 ± 0,3
a 5,8 ± 0,4
ab
Ureia (mg/dL) 36,9 ± 3,7b 35,2 ±
3,3
b 43,9 ± 2,6
a 38,2 ±
7,3
b
Creatinina (mg/dL) 0,9 ± 0,1b 1,0 ±
0,2
ab 1,3 ± 0,3
a 1,0 ±
0,2
ab
Ácido úrico (mg/dL) 1,5 ± 0,4b 1,4 ± 0,6
b 2,3 ± 0,8
a 1,6 ± 0,4
b
Valores apresentados como média e desvio padrão foram obtidos dos grupos C (dieta controle e água por 20 semanas); C + T (dieta controle e água + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20 + T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento). Diferentes letras dentro da mesma linha indicam diferença significativa em p<0,05 por ANOVA one way seguido pelo teste de Tukey.
4.2.6 Resposta pressórica e relação com peroxidação lipídica
Para testar se O2•− contribui ou não para alteração pressórica encontrada no modelo
estudado, avaliaram-se PAS e PAD ao longo do estudo e sua relação com peroxidação lipídica.
A figura 18 mostra resultados semelhantes de valores pressóricos e de FC para os
diferentes grupos antes do início do estudo. Porém, na fase intermediária da pesquisa, foram
encontrados maiores valores de PAS e PAD para os animais do grupo FS20 comparados aos
dos ratos C. Esse aumento pressórico se manteve até o final do estudo para o grupo FS20;
todavia, adição de tempol ao tratamento reduziu significativamente PAS (175,2 ± 26,9 mmHg
em FS20 vs. 146,8 ± 19,3 mmHg em FS20T). Para valores de PAD, ao final do estudo, FS20T
não foi diferente dos animais do grupo FS20, mas apresentou valores semelhantes aos
apresentados pelos grupos C e CT. Para FC não se observou variação com FS bem como, após
adição de tempol, para os grupos C e FS20.
Adicionalmente, foi encontrada uma relação direta, utilizando o coeficiente de
correlação linear de Pearson, entre valores de PAS e PAD final com peroxidação lipídica no
fígado, medida através de TBARS (Figura 19). Quando plotados os dados de resposta
pressórica versus TBARS mostraram uma correlação positiva (r=0,578; p<0.0001 para PAS e
r=0,58; p<0,0001 para PAD), indicando que quanto maior a PAS e PAD, mais elevados são os
valores de TBARS no fígado.
Resultados
59
Figura 18: Comparação das mudanças ao longo dos tratamentos para pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e frequência cardíaca (FC) dos diferentes grupos experimentais. C (dieta controle e água por 20 semanas); CT (dieta controle e água + tempol da 13 a 20ª semana de
tratamento); FS20 (dieta rica em sal + solução de frutose 20% em água por 20 semanas) e FS20T (dieta rica em sal e solução de frutose 20% em água por 10 semanas + tempol da 13ª a 20ª semana de tratamento).Valores são apresentados em média ± desvio padrão. *p<0,05; **p<0,01 vs C e CT;
#p<0,05 vs grupo FS20.
0 2 4 60
50
100
150
200
250
r = 0,578p < 0,0001
TBARS (nmoles/mL)
PA
S f
inal
(mm
Hg
)
0 5 10 15 20 250
50
100
150
200
r = 0,58p < 0,0001
TBARS (nmoles/mL)
PA
D f
inal
(mm
Hg
)
Figura 19: Correlação de Pearson entre valores de PAS (mmHg), PAD (mmHg) final e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (nmoles/mL).
Resultados
60
4.2.7 Correlação entre pressão arterial média e parâmetros sanguíneos
Nesse estudo foi realizado análise de correlação entre valores de pressão arterial
média (PAM) aferida ao final do estudo e parâmetros estudados para os grupos
experimentais. Os resultados apresentados mostram que mudanças na PAM foram
associadas positivamente e significativamente a alterações nos níveis de glicose (r=0,411;
p<0,01), de triacilglicerol (r=0,38; p<0,01), de proteína total (r=0,367; p<0,02), de albumina
(r=0,372; p<0,002), de ALT (r =0,431; p<0,006), de ácido úrico (r=0,514; p<0,001), de ureia
(r=0,504; p<0,0008) e de creatinina (r=0,476; p<0,002). As correlações entre PAM e colesterol
total (r=-0,439; p<0,003) e colesterol-HDL (r=-0,401; p<0,009) foram negativas. Essas relações
negativas são achados que apontam para o observado na literatura. Rato transporta TG
predominantemente pelo colesterol-HDL, e, a dislipidemia encontrada no estudo para o
tratamento com FS diminui acentuadamente colesterol total e HDL, enquanto PAM
aumentou correspondentemente. Correlações entre PAM e PON1, AST e ALP não foram
observadas (Tabela 10).
Tabela 10: Correlação entre PAM final (mm/Hg) e parâmetros sanguíneos nos grupos experimentais
Variável r p Glicose (mmol/L) 0,411 0,01 Triacilglicerol (mmol/L) 0,380 0,01 Colesterol total (mmol/L) –0,439 0,003 Colesterol-HDL (mmol/L) –0,401 0,009 PON1 (U/mL) –0,373 0,227 Proteína total (g/dL) 0,367 0,023 Albumina (g/dL) 0,372 0,002 AST (U/L) 0,270 0,086 ALT (U/L) 0,431 0,006 ALP (U/L) 0,245 0,136 Ácido úrico (mg/dL) 0,514 0,001 Ureia (mg/dL) 0,504 0,0008 Creatinina (mg/dL) 0,476 0,002
Pressão arterial média (PAM); Lipoproteína de alta densidade (HDL); Paraoxonase-1 (PON1); Aspartato Aminotransferase (AST); Alanina Aminotransferase (ALT); Fosfatase Alcalina (ALP).
Discussão
61
5- DISCUSSÃO
Muitos modelos experimentais indicam que o estresse oxidativo está envolvido na
patogênese da hipertensão arterial com aumento na produção de O2•− (DOBRIAN et al., 2001;
ZALBA et al., 2001; KAWADA et al., 2002; MENG et al., 2003; HATTORI et al., 2005;
PATTERSON et al., 2005; KOJSOVÁ et al., 2006; OHASHI et al., 2009). Os resultados
encontrados no presente estudo demonstram que ratos com RI, devido à suplementação
crônica de frutose, aumentam estresse oxidativo e PA quando mantidos sob uma dieta rica
em sal, e tratamento com tempol reverte hipertensão. Assim, embora o mecanismo do efeito
protetor do tempol não tenha sido determinado, os dados sugerem que SOD pode inibir o
desenvolvimento de hipertensão no modelo usado, com efeitos benéficos sobre desordem
metabólica encontrada.
Para melhor compreender o papel de cada elemento envolvido na fisiopatologia da
SM, pesquisadores utilizam modelos experimentais que podem determinar de maneira
controlada o papel da RI e da hipertensão. A insulina tem sido reconhecida por desempenhar
importante papel na ativação do SNS. Esse efeito pode ser mediado por um mecanismo
barorreflexo (ANDERSON et al. 1991) ou através de um efeito direto da insulina sobre a
liberação de noradrenalina a partir de terminações nervosas simpáticas (BHAGAT et al.,
1981). Por outro lado, há evidências de que o aumento da atividade simpática resulte em RI
devido ativação α1-adrenérgica causar redução no fluxo sanguíneo e, então, ocorrer
diminuição no fornecimento de glicose para o músculo esquelético (RATTIGAN et al., 1999). O
resultado é estimulação contínua do SNS devido à hiperinsulinemia compensatória em
resposta a RI. Nesse estudo, alto consumo de frutose dietética contribuiu para o
desenvolvimento e para a progressão da RI nos animais experimentais, ocasionando
hipertrigliceridemia, intolerância à glicose, hiperuricemia e estado pró-inflamatório, tal como
indicado em estudos prévios com ratos (THORBURN et al., 1989; LEE et al., 1994; KELLEY et
al., 2004 e KANNAPPAN et al., 2006). Os mecanismos de desenvolvimento de RI indicam que
o desenvolvimento de resistência à ação da insulina celular subtende o hiperinsulinismo
observado nos ratos do grupo FS, estando esse fator associado a um perfil lipídico
aterogênico.
Estudos realizados por Ouyang et al. (2008) associam a hiperuricemia à esteatose
hepática, com aumento do consumo de frutose, dados consistentes com o fato da elevação
Discussão
62
de ácido úrico ter um papel participativo na esteatose hepática no metabolismo da frutose.
Como a frutose pode acelerar o metabolismo das purinas, o aumento da concentração de
ácido úrico no soro para os animais do grupo F corrobora com o quadro de esteatose
macrovesicular observada nesse grupo, onde NAFLD é a característica mais representativa do
fígado na SM. O excesso de frutose é um componente lipogênico, o qual promove o
desenvolvimento de um perfil aterogênico lipídico. Assim, para refletir sobre as condições
alimentares modernas, o modelo experimental usado baseou-se na administração de uma
dieta indutora de RI com alto teor de frutose que se assemelha ao chamado 'fast food', que é
muito popular hoje em dia. Este tipo de dieta constitui tipicamente em estilo de vida
ocidentalizado, que inclui o consumo de alimentos processados que são ricos tanto em açúcar
quanto em sal. Nesse contexto, frutose tem sido largamente utilizada em estudos
metabólicos, embora não haja dados relativos a anormalidades do fígado associados a
regimes com sobrecarga de sal dietético associado.
A RI parece ser uma síndrome que está relacionada a agrupamento de desordens
metabólicas (DeFRONZO, 1992) sendo o termo lipotoxicidade utilizado para se referir à
condição que envolve a acumulação de TG em tecidos sensíveis à insulina, com
comprometimento de sua ação. Aumento da entrega do TG para os tecidos interfere na
utilização da glicose resultando em hiperglicemia, como mostrado nos resultados obtidos, em
que acumulação de TG nos animais pode ter contribuído para a insensibilidade à insulina
observada. O grau de RI mostrou-se mais elevado em ratos FS, como indicado por um maior
HOMA. Comparado ao índice HOMA, com base em medições de glicose e insulina basal, o
TOTG proporciona uma aproximação razoável da sensibilidade à insulina levando em
consideração tanto a sensibilidade à insulina no estado basal e após a ingestão de uma carga
de glicose. O grau de RI foi maior nos ratos alimentados com frutose e com sal, tal como
demonstrado pelos valores elevados de HOMA, bem como apresentaram menor tolerância à
glicose após o teste de glicose oral em relação ao grupo C. Outro fator encontrado em
animais alimentados com teor elevado de frutose é que estes exibem estresse hepático como
resultado da carga do metabolismo de frutose. Frutose induz dislipidemia, baixo grau de
inflamação hepática e ativação de vias sensíveis ao estresse, com evidência para
lipotoxicidade como demonstrado por Kannapan et al., (2006) e aumento do fígado em
função dos depósitos de gordura (ROSS et al., 2009). Dessa forma, geralmente o fígado pode
ser considerado o local mais comum de agressão tóxica por receber cerca de 80% do
Discussão
63
suprimento sanguíneo, através da veia porta, além de possuir enzimas com capacidade de
biotransformação de várias substâncias endógenas e exógenas para eliminação. Conforme
Fox & Campbell (2000), ALT e AST podem ser consideradas nos exames de bioquímica
sanguínea e sua elevação em conjunto pode indicar lesão hepática significativa. Evidenciou-se
em grupos tratados com frutose, aumento da atividade das ALT e ALP, indicando alteração da
função hepática que reflete dano hepatocelular. A AST ou transaminase glutâmico-
oxalacética (TGO) não é uma enzima específica para o fígado, pois pode originar-se tanto em
músculos como no tecido hepático. Já o citoplasma do hepatócito é rico em ALT, sendo que
um insulto à membrana hepatocelular resulta em aumento da ALT sérica e é, muitas vezes,
considerada um marcador de esteatose (ANGULO, 2002). Ainda em relação à doença
hepática, aumento da atividade da ALP é o resultado de maior síntese dessa enzima pelas
células que revestem os canalículos biliares, geralmente em resposta à colestase. Os maiores
aumentos de ácido graxo estão associados a desordens colestáticas difusas ou focais. Notou-
se, desse modo, com o tratamento empregado, dano hepático e, adicionalmente,
concentrações de albumina foram reduzidas em ratos FS10, provavelmente devido à menor
capacidade de síntese proteica hepática, como observado recentemente por Shinn & Moon,
(2010).
O consumo prolongado de dietas ricas em frutose pode levar ao aumento da ingestão
calórica e à contribuição para o ganho de peso e de gordura corporal com consequente
obesidade. Todavia, ingestão dietética de frutose não resultou em aumento de peso em
animais do estudo, o que possibilitou questionar a relação entre as alterações metabólicas e
o desenvolvimento da hipertensão sem as influências da confusão de obesidade ou
predisposições genéticas no modelo utilizado. Embora a ausência de ganho de peso corporal
foi relatada em vários estudos usando ratos (FAURE et al., 1997; BEZERRA et al., 2001;
D’ANGELO et al., 2005; VASDEV et al., 2007; JALAL et al., 2007; SHAPIRO et al., 2008), há
alguns poucos relatos de ganho de peso em roedores (EL MESALLAMY et al., 2010; KIM et al.,
2010). Consumo de bebidas adoçadas com frutose está ligado ao alto consumo de energia.
Estudos em ratos (SHAPIRO et al., 2008) e humanos (LÊ et al., 2006) mostram que a ingestão
crônica de frutose está correlacionada ao aumento nos níveis de leptina no plasma, e alguns
estudos mostraram que esse aumento precede a obesidade (MOORADIAN et al., 2000;
ROGLANS et al., 2007). O hormônio leptina tem um papel fundamental no equilíbrio
energético e na regulação do peso corporal, ativando núcleos do hipotálamo para reduzir a
Discussão
64
ingestão de alimentos, o que resulta em aumento do gasto de energia (FRIEDMAN & HALAAS,
1998). Tal resposta reduzida ou sua falta aos efeitos metabólicos da leptina é descrita como
resistência à leptina e é característico de seres humanos e roedores obesos (WIDDOWSON et
al., 1997; HEYMSFIELD et al., 1999). Curiosamente, essa resistência à leptina pode ser
sugerida no estudo, na ausência de qualquer variação no aumento de peso corporal, nos
animais sob alimentação rica em frutose (grupo F), comparadamente aos ratos controle. A
presença de resistência à leptina poderia, potencialmente, vir a ser um mecanismo
importante para a indução de obesidade apenas no grupo F, sem associação de sal à dieta.
Resultados demonstraram que ratos do grupo FS10 consumiram mais frutose do que ratos F,
mas apresentaram menor grau de desenvolvimento de peso devido dieta rica em sal, como
em outros estudos, mostrarem atenuação do ganho de peso em ratos (VASDEV et al., 2003;
HASEGAWA et al., 2006; CHO et al., 2007). Adicionalmente, Prada et al. (2000) encontraram
maior ganho de peso e de gordura na carcaça de ratos tratados com baixo teor de sal na dieta
do que conteúdo normal ou alto, do desmame até a fase adulta, com possibilidade de que o
gasto de energia diminui durante a restrição de sal a longo prazo. Isso leva a sugerir que o
contrário, alto consumo de sal, possa ocasionar maior consumo de energia. Apesar do
presente estudo não ter avaliado os mecanismos envolvidos nessa variação encontrada para
o peso, é possível, também, que a diminuição modesta (não significativa) de leptina no grupo
S tenha algum significado nesse menor ganho ponderal ao longo do estudo, uma vez que
leptina circula em níveis proporcionais à gordura corporal e é um sinal aferente chave ligando
nível de adiposidade corporal e estado nutricional.
Por outro lado, a ingestão de bebidas adoçadas com frutose está associada à
diminuição da ingestão de alimentos sólidos e proteína. Jurgens et al. (2005) mostraram que
a ingestão de alimento sólido por ratos alimentados com frutose na água foi diminuída, mas o
consumo de energia total era o mesmo do que dos animais controles. No presente estudo, os
dados são consistentes com essas informações prévias que mostraram que o consumo de
líquido adoçado com frutose está relacionado à diminuição do consumo de ração levando,
talvez, à menor ingestão de alguns nutrientes, dentre estes os aminoácidos sulfurados.
Deficiência de metionina, um aminoácido essencial, tem sido implicada na doença alcoólica
do fígado e cirrose hepática (KIRSCH et al., 2006), secundária ao seu importante papel como
um precursor da GSH. No entanto, o papel potencial da metionina na patogênese da
esteatose hepática não parece ter sido previamente estudada. Estudos usando bebida
Discussão
65
adoçada com frutose e estudos com esteatose usam produtos de peroxidação lipídica como
marcadores de estresse oxidativo e poucas pesquisas têm avaliado os sistemas antioxidantes
enzimáticos. Kunde et al. (2011) demonstraram que a diminuição da ingestão de aminoácidos
sulfurados, como ocorre nos modelos usados para estudar frutose-induzindo esteatose, não é
uma causa de estresse oxidativo hepático no modelo e não fornece uma explicação para a
acumulação de lipídios através do uso da frutose.
Estudos prévios (WU et al., 2000; EBENEZER et al., 2009) relatam que a insulina
plasmática é de 5 a 10 vezes superior em ratos Zucker obesos, um modelo animal que
desenvolve hipertensão moderada. Utilizando telemetria, método que facilita avaliação
precisa da PA por não se confundir ao estresse da medida ou limitar o tempo de amostragem
na aferição (CARLSON et al., 2000), há indicação de que, anormalidades metabólicas
encontradas no presente estudo e em outros são leves em comparação aos efeitos
observados no rato Zucker obeso, uma vez que esse animal apresenta aumento significativo
na PA basal. Logo, é possível que a RI mais grave pode causar hipertensão. Por outro lado,
cães alimentados com uma dieta rica em gordura desenvolvem hipertensão somente à
medida que ganham peso corporal, mas, no modelo de estudo, não houve tal ganho, nem o
peso corporal se correlacionou com PA. Isso sugere que os mecanismos envolvidos no
desenvolvimento da RI e hipertensão na pesquisa apresentada são provavelmente diferentes
dos modelos de obesidade. Na verdade, sabe-se que os indivíduos obesos apresentam
deficiência geral da sensibilidade à insulina provocada por diminuição da densidade de seus
receptores nas membranas celulares dos tecidos alvo, e, apenas uma minoria desses
indivíduos mostram um defeito em pós-receptores específicos para a captação estimulada
por insulina de glicose, semelhante ao defeito encontrado em pacientes com hipertensão
essencial (MARTINEZ et al., 1994).
Em sequência, a RI/hiperinsulinemia em ratos alimentados com frutose prejudica a
função endotelial e pode ou não contribuir para a elevação da PA. Em adição aos seus efeitos
sobre o metabolismo da glicose, a insulina tem mostrado induzir vasodilatação na vasculatura
do músculo esquelético em diabéticos sensíveis à insulina, mas não em indivíduos com RI
(BARON et al., 1993). O NO derivado do endotélio tem sido apontado como o mediador
possível do efeito vasodilatador da insulina no músculo esquelético (STEINBERG et al., 1994).
Sugere-se que esse efeito vascular desempenhe um papel fundamental na diminuição da
disponibilidade da glicose pela ação da insulina (BARON et al., 1993), já que o sistema
Discussão
66
vascular é importante para o fornecimento de nutrientes e de hormônios aos tecidos e,
então, qualquer deterioração na capacidade de resposta vascular poderia contribuir para a RI.
A disfunção vascular devido a uma dieta rica em frutose é observada em rato (TAKAGAWA et
al., 2002) e reconhece-se que a disfunção vascular na SM está associada à aumentada
sensibilidade de vasoconstrição (SHINOZAKI et al., 2004) e de produção de O2•− vascular
(DELBOSC et al., 2005). Além disso, ingestão de frutose crônica em ratos ocasiona deficiente
relaxamento endotélio-dependente (SHINOZAKI et al., 1999; 2000), com evidências de que a
insulina modula a expressão da enzima eNOS e estimula a vasodilatação causada pela
produção de NO (SCHERRER et al., 1994). Porém, em estados de RI, os efeitos sobre eNOS são
abolidos, resultando em deficiente relaxamento endotélio-dependente (KUBOKI et al., 2000).
Assim, é possível que essa ação vascular da insulina possa contribuir para exacerbar o
desenvolvimento de RI observada no estudo.
Embora resistência hormonal desperte grande atenção, tanto na pesquisa clínica,
quanto na básica, em função de sua associação com a doença cardiovascular (DeFRONZO,
1992), os mecanismos que ligam a sensibilidade à insulina à hipertensão arterial e ao
desenvolvimento e à progressão de desordens associadas, ainda não são completamente
conhecidos, apesar dos progressos alcançados. Nenhuma evidência definitiva mostra que a RI
e o hiperinsulinismo causem aumento de PA, embora também não existam dados suficientes
que mostrem que a RI não é uma consequência secundária da hipertensão. Entretanto, a
adição de clonidina (agonista adrenérgico utilizado como antihipertensivo) a água potável,
em ratos alimentados com frutose, impede o desenvolvimento de hipertensão, mas não da
RI, da hiperinsulinemia e da hipertrigliceridemia (HWANG et al., 1987). No presente estudo,
observou-se que uma dieta rica em frutose não produz isoladamente alteração na PAS,
apesar da PA aferida por pletismografia de cauda em vários estudos ser significativamente
maior em ratos tratados com frutose do que em animais controles (STORLIEN et al., 1993;
NAGAI et al., 2002; SÁNCHEZ-LOZADA et al., 2007; 2008).
Uma explicação para a dissociação aparente entre a RI e a PA pode ser aqui relatada
quanto ao grau de disfunção metabólica em ratos F que não foi suficiente para se obter um
efeito sobre a PA. Entretanto, um problema potencial que tem sido demonstrado com os
estudos em ratos relatando hipertensão é que a PA é medida, normalmente com a técnica,
não invasiva, de pletismografia de cauda. Dado que dietas com alto teor de açúcar estimulam
o SNS, uma possível consequência da dieta poderia ser uma leitura hipertensiva,
Discussão
67
especialmente uma vez que as medições são realizadas em condições diferentes daquelas em
que o rato permanece a maior parte do tempo e, assim, ter-se-ia o estresse inerente da
mudança da condição adaptada. Uma possível sugestão para esses resultados,
aparentemente contraditórios, é que a alta ingestão de açúcares simples produz somente um
modesto aumento na atividade do SNS. Esse aumento da atividade simpática não é suficiente
para elevar a PA cronicamente, mas pode aumentar labilidade da PA, eis que qualquer
estresse conduziria a um aumento agudo da FC e da PA (D’ANGELO et al., 2005). Resultados
desse estudo indicam que uma dieta com alto teor de frutose embora eleve modestamente
PA (não significativamente), não causa hipertensão. Assim, a alimentação com dieta rica em
frutose pode prejudicar a disponibilidade de glicose mediada pela insulina e aumentar a
labilidade, mas não parece causar diretamente hipertensão. No entanto, o potencial de
outros fatores tais como a linhagem do rato e o tipo de tratamento para explicar as diferentes
respostas a dietas devem ser exploradas. Dobrian et al. (2003) observaram que sobrecarga de
sal em ratos obesos induzidos por dieta rica em gordura acelera o desenvolvimento, mas, não
aumenta a gravidade da hipertensão.
Paralelamente, Rocchini et al. (1989) relataram que adolescentes obesos que
apresentavam PA elevada eram sensíveis ao sal e hiperinsulinêmicos em relação ao grupo
controle. Contudo, redução no peso desses indivíduos diminuíram concentrações plasmáticas
de insulina e eliminaram sensibilidade ao sal. Embora outros fatores, como aldosterona e
ativação simpática, possam ter influenciado o efeito do consumo do sal sobre pressão
sanguínea nesses indivíduos, esses resultados indicam que mudanças na concentração de
insulina correlacionam significativamente a sensibilidade ao sal. No presente estudo, os
dados sugerem que a resposta da PA à hiperinsulinemia em ratos FS10 pôde ser dependente
da retenção de sódio. A hipótese de que RI e hiperinsulinemia estão ligadas à elevação da PA
é sugerida pelos resultados desse estudo, uma vez que ratos FS10 apresentaram elevação
significativa da PAS similar ao grupo S, mesmo consumindo menos sal; animais do grupo FS10
receberam 10 semanas a menos de tratamento com sobrecarga de sal em relação ao grupo S,
além da frutose associada ao sal ter conduzido a uma menor ingestão de ração e,
consequentemente, menor consumo diário de sal na dieta. Comparadamente, observou-se
que a pressão para o grupo S não foi suficientemente diferente do grupo C na fase
intermediária do estudo (protocolo A), o que indica que apenas 10 semanas de tratamento
Discussão
68
com sal para o grupo FS10 é sugestivo de não aumentar significativamente PAS em relação ao
grupo controle se não houvesse o efeito adicional da frutose.
Pesquisas anteriores sugerem que indivíduos sensíveis ao sal, normotensos e
hipertensos, são hiperinsulinêmicos e apresentam RI em comparação a indivíduos resistentes
ao sal (SHARMA et al., 1993; ZAVARONI et al., 1995; FUENMAYOR et al., 1998) e sensibilidade
ao sal se relaciona a reabsorção tubular de sódio com a insulina estimulando retenção de
sódio como mostrado por Facchini et al. (1999). No presente estudo, a excreção urinária de
sódio pode ter diminuído no grupo FS, sugerido pela maior concentração de sódio sérico de
FS10 do que o encontrado no grupo S. Nesse sentido, pressão natriurese normalmente atua
para estabilizar PA, sendo que anormalidades na hemodinâmica renal ou na reabsorção
tubular podem alterar o ponto de ajuste em que a PA e a excreção de sódio são controladas.
O mecanismo da natriurese tem sido postulado como sendo um componente principal de um
sistema de realimentação para regulação a longo prazo da PA e do volume do fluido corporal.
Sob a maioria das condições, esse mecanismo atua para estabilizar a PA bem como os
volumes dos fluidos corporais (GUYTON et al., 1972). Por exemplo, a formação excessiva de
hormônios antinatriuréticos ou doenças que reduzem a capacidade de excreção renal podem
deslocar a curva de natriurese da pressão a maiores valores pressóricos e tendem a causar
retenção de sódio e aumento do volume de fluido extracelular, se a ingestão permanecer
constante. Acúmulo de líquido continuaria até que a PA aumentasse o suficiente para
restaurar excreção renal ao normal através de natriurese e no estado de equilíbrio, a
excreção renal seria mantida igual ao consumo, mas à custa de hipertensão.
Deve-se reconhecer, no entanto, que outros mecanismos como regulação anormal de
receptores de insulina renais por sal podem ter contribuído para a diminuição natriurética em
FS10, incluindo mudanças no SRA, nos peptídeos natriuréticos atriais (ANP), na produção de
NO e na hemodinâmica intra-renal. Ang II ou aldosterona regulam a reabsorção de sódio e
alto consumo de sal exacerba hipertensão (HALL et al., 1990). Contudo, embora indivíduos
com rins normais possam ser capazes de excretar aumentados conteúdos de sódio sem
alterar PA, é evidente que indivíduos que desenvolvem hipertensão essencial têm um relativo
defeito na sua habilidade para excretarem sódio (GUYTON et al., 1972). Ratos do grupo S
beberam mais liquido para diluir a ingestão de NaCl juntamente com alguma atenuação da
natriurese, resultando em expansão do volume plasmático e aumento da PA. Com isso,
elevação da pressão sanguínea em resposta ao aumento do consumo de sódio na dieta é
Discussão
69
considerada um fator de contribuição importante na patogênese da hipertensão, em
particular em seres humanos ou em animais com predisposição para sensibilidade ao sal,
mas, retenção de sódio pode ter indicado alteração da função renal com capacidade
excretória de sódio renal diminuída, produzindo aumentada reabsorção de sódio tubular para
ratos do grupo FS10. Além do mais, maior filtração glomerular determinada pela sobrecarga
salina poderia ser responsável pelo aumento da massa renal, acompanhando de aumento da
creatinina e ureia sérica como observado no estudo e por Kodama et al. (1997) em ratos
Dahl-SS submetidos à sobrecarga de sal por 19 semanas, indicando injúria renal atribuída ao
sal.
Adicionalmente, uma grande quantidade de estudos experimentais e clínicos tem
enfatizado a função crucial do sódio na regulação da pressão sanguínea e nas implicações de
um balanço anormal no desenvolvimento da hipertensão em modelos experimentais. Por
exemplo, as perturbações que elevam a PA, sem prejudicarem a capacidade de excreção
renal, também tendem a aumentar a excreção de sódio e à de água por meio da natriurese e
diurese reduzindo, assim, o volume de fluido extracelular e retornando para a pressão
sanguínea normal. Hipertensão causada pelo aumento do débito cardíaco ou da resistência
periférica total não pode ser sustentada se natriurese é inalterada porque excreção de sódio
permaneceria acima da ingestão de sódio até que a PA retornasse ao normal. Da mesma
forma, reduções na PA tendem a diminuir a excreção de sódio e a aumentar o volume de
líquido extracelular até que a PA retorne ao normal. Um aspecto importante do presente
sistema de equilíbrio é que existem muitos sistemas neuro-humorais que atuam para
amplificar a sua eficácia. Por exemplo, aumento na pressão sanguínea não só tende a elevar a
excreção renal diretamente através de efeitos hidroeletrolíticos sobre o rim, mas também
inibem a formação de Ang II e aldosterona, o que eleva ainda mais a excreção renal e diminui
o volume do fluido extracelular, promovendo mais rápida recuperação da PA (HALL et al.,
1986).
Diferenças na escolha do modelo animal, níveis de açúcar e de sal utilizados, assim
como desenho experimental tornam difícil a comparação entre os resultados desse estudo
com os outros relatados. Embora concentração elevada de sal dietético (8% de NaCl)
provoque hipertensão em ratos (VASDEV et al., 2003), avaliando associação entre frutose e
sal, Vasdev et al. (2007) sugeriram que tratamento de frutose propicia um ambiente que
permite que sal na dieta comprometa integridade da membrana celular produzindo mudança
Discussão
70
vascular e sustentada hipertensão. Demonstrou-se que altos níveis de sódio intracelular
aumentam o cálcio livre citosólico e contratilidade em células vasculares do músculo liso
(MATLIB, 1991). Consequentemente, altos níveis de cálcio intracelular também podem
aumentar o estresse oxidativo (GORDEEVA et al., 2003) modificando lipídios e proteínas,
componentes das membranas que comprometem a sua integridade (GRIENDLING et al.,
2000). Além do mais, aumento no catabolismo da frutose pode resultar em depleção de
energia nas células, tornando-as mais susceptíveis à peroxidação (GIARDINO et al., 1994).
Aumento da lipoperoxidação hepática em ratos FS pode estar associado à elevação da glicose
na circulação, o que aumenta a produção de radicais livres a partir de auto- oxidação de
glicose e de glicação das proteínas.
Em ratos, ao contrário de seres humanos e coelhos, o TG e o colesterol no plasma são
transportados predominantemente pelo colesterol-HDL (BELTOWSKI et al., 2002). HDL tem
sido atribuído a um independente preditor negativo para o desenvolvimento de eventos
cardiovasculares devido à sua capacidade para promover o efluxo de colesterol celular a
partir de células periféricas e entregá-lo para o fígado para excreção, um processo conhecido
como transporte reverso de colesterol (MERTENS & HOLVOET, 2001). Além disso, HDL
também atrai atenção especial devido ao seu potencial antioxidante. Nesse estudo,
observou-se diminuição acentuada de HDL para o grupo FS20. Somado a isso, PON-1, uma
enzima antioxidante sérica presente no colesterol-HDL que combate a peroxidação lipídica de
LDL, teve sua atividade diminuída. Segundo Rosenblat et al. (2006), PON-1 protege contra
aterosclerose por sua habilidade em reduzir formação de célula espumosa via redução de
estresse oxidativo e estimulação de macrófagos. Pode-se, assim, sugerir que as LDL oxidadas
venham a prejudicar a função endotelial, estimulando a resposta inflamatória de
monócitos/macrófagos, ativando a migração e a proliferação de células do músculo liso
vascular, induzindo uma resposta imune, tal como mostrado pelo aumento do perfil de
monócitos em animais tratados com frutose nesse estudo (Tabela 3). Por conseguinte,
inativação de PON1 em ratos FS pode reduzir a capacidade de HDL para inibir a modificação
de LDL, e também diminui a capacidade de HDL para inibir as interações endoteliais
monocíticas. Ambas as condições parecem ser importantes na resposta inflamatória nas
células das paredes arteriais, como demonstrado pela mudança no perfil de linfócitos em
relação ao grupo C, uma vez que esse é um achado comum durante a resposta inflamatória
sistêmica. Estudos clínicos e em animais sugerem que a baixa contagem de linfócitos tem um
Discussão
71
suposto papel na inflamação crônica (NÚÑEZ et al., 2011). Mostrou-se também que baixa
atividade de PON1 está relacionada no modelo estudado à diminuição dos níveis de HDL
contribuindo para o fato de que PON1 esteja envolvida na preservação da HDL (DORNAS et
al., 2012). Já que PON1 exerce um efeito protetor contra o estresse oxidativo, é possível
encontrar uma associação entre essa enzima e insuficiência hepática. Assim, atividade de
PON1 diminuiu enquanto a peroxidação lipídica aumentou em ratos FS, o que confirma que
essa enzima pode estar envolvida na defesa contra a produção de radicais livres no fígado.
Ratos tratados com frutose exibem estresse oxidativo, disfunção endotelial e
hipertensão (TAKAGAWA et al., 2002; NANDHINI et al., 2005; EL MESALLAMY et al., 2010) e o
tratamento com inibidor de NADPH-oxidase foi mostrado reduzir PA (UNGER & PATIL, 2009).
Peroxidação lipídica hepática significativamente aumentou para o grupo FS, que se
manifestou pelo aumento dos níveis de TBARS, o qual é bem relatado em ratos alimentados
com frutose (LEVI & WERMAN, 1998; BUSSEROLLES et al., 2003b; KELLEY et al., 2004). O
desenvolvimento de estresse oxidativo está relacionado a RI, e notou-se um possível
desequilíbrio entre o estado pró-e antioxidante em animais do estudo. Uma diminuição de
antioxidantes enzimáticos foi mostrada no fígado e no coração de ratos tratados com frutose
e sal, uma vez que a exposição prolongada à condição dietética imposta reduziu a atividade
de enzimas antioxidantes. Inativação de CuZn-SOD por glicação de resíduos de lisina
específicos foi avaliada por ODA et al. (1994) e EROS podem também reduzir a atividade das
enzimas antioxidantes CAT e GPx (DATTA et al., 2000). Essa diminuição é sugestiva de
reduzida capacidade potencial de eliminação de radicais livres em ratos com RI participando,
desse modo, na vulnerabilidade tecidual ao estresse oxidativo.
A diminuição da atividade de GSH-Px ou CAT pode resultar em aumento na produção
de radicais hidroxil (OH•) (GUTTERIDGE, 1994). Os OH• podem danificar as membranas das
células em que a função coordenada de enzimas e receptores que eles contêm é perdida.
Como GSH é o cofator de GSH-Px, é importante notar que concentração de GSH foi diminuída
no fígado dos ratos FS10 em comparação aos outros grupos. Em particular, o tratamento de
frutose e de sal associados diminuíram substancialmente GSH/GSSG. Apesar da importância
biológica da GSH/GSSG ser muito debatida, isso confirma que o tratamento empregado
aumenta estresse oxidativo devido à oxidação de GSH ocorrer durante o processo de redução
do H2O2 (JOHNSON et al., 2012). A queda no nível de glutationa é frequentemente observada
em pacientes com diabetes e agravada quando existem complicações associadas
Discussão
72
(THORNALLEY et al., 1996). Sua redução em ratos FS10 pode ter prejudicado a proteção das
membranas celulares contra os danos por radicais livres, o que também contribui para
diminuição da sensibilidade à insulina. O conteúdo de glutationa reduzida em eritrócitos de
indivíduos diabéticos mostra correlação negativa com o controle metabólico da diabetes,
avaliada pelos níveis de hemoglobina glicosilada (HbA1) (PAOLISSO & GIARGLIANO, 1996),
sugerindo um papel importante na atividade da insulina. Por outro lado, a glutationa poderia
favorecer a transcrição do receptor da insulina. De fato, o nível GSH das células aumenta a
atividade de alguns fatores de transcrição, tais como Sp1, que está envolvido na transcrição
do receptor de insulina (ARAKI et al., 1991).
Mecanismos regulatórios de feedback de enzimas antioxidantes previnem a sua
restauração para um nível normal, protegendo a célula contra efeitos de EROs. CAT previne
dano pela rápida conversão de H2O2 à água (TOUYZ, 2004). De fato, há possíveis vias pelo qual
metabolismo celular nesse modelo pode ter sido alterado, que por sua vez pode ter acelerado
o estresse oxidativo em ratos do grupo FS; uma vez que o aumento do estresse oxidativo
pode ser devido à geração de EROs e/ou à diminuição da proteção de antioxidantes não
enzimáticos ou enzimáticos (HALLIWELL, 1996). A produção de radicais livres e H2O2
resultantes da atividade de SOD pode ter gerado radicais OH• através de reação de Fenton, e
então EROs pode reduzir a atividade das enzimas antioxidantes (DATTA et al., 2000).
Observou-se redução de CAT em fígado e coração de ratos tratados com frutose e sal e,
portanto, uma diminuição dessa atividade é sugestiva de menor capacidade de eliminação de
EROs. No entanto, no rim observou-se aumento da atividade de SOD, o qual pode ter
ocorrido em resposta ao aumento da geração de O2•−, já que atividade aumentada de
enzimas antioxidantes é relatada como um mecanismo adaptativo para proteger as células
contra a toxicidade dos radicais livres (EREJUWA et al., 2011). Uma vez que SOD converte
O2•− a H2O2, maior atividade da SOD pode levar ao turnover de H2O2, e, em caso de aumento
da geração de H2O2, a CAT pode ser incapaz de eliminar, suficientemente, os níveis elevados
de H2O2. CAT é relatada ser altamente susceptível ao aumento de O2•− (KONO & FRIDOVICH,
1982) e pode, assim, tornar-se inibida. Dessa forma, a ocorrência da atividade dessas enzimas
antioxidantes descoordenadamente nos rins de ratos com RI pode implicar que esses animais
podem não estar protegidos contra o estresse oxidativo.
Vários ensaios têm sido realizados para determinar se o tratamento com
antioxidantes pode ou não reduzir PA, embora os resultados sejam conflitantes (KIM et al.,
Discussão
73
2002; VASDEV et al., 2002; WARD et al., 2007). Como O2•− atua tanto no meio extracelular e
intracelular, onde pode ter efeitos prejudiciais, incluindo peroxidação lipídica, agregação de
proteínas e destruição do DNA (MAXWELL, 1995), investigações prévias com mecanismos que
elevam o potencial de proteção contribuem para a destoxificação do organismo ao eliminar
O2•− e reduzir inflamação e aterosclerose (HENSON & JOHNSTON, 1987). SOD desempenha
um papel fundamental em mecanismos de defesa antioxidante, particularmente em estados
hiperglicêmicos ou de RI. Normalmente, a SOD abundante e outros antioxidantes no corpo
reagem com O2•− mantendo-os a níveis muito baixos. Sempre que a produção de O2•− é
aumentada ou há uma deficiência nos sistemas antioxidantes, a repartição de NO pela O2•−
também aumenta; no rim, reabsorção de sódio elevada contribui para a progressão da
hipertensão em ratos alimentados com sobrecarga de sal. Atividade de SOD foi diminuída no
fígado de ratos FS10 e correlação negativa entre a sua atividade e a glicose no sangue em
ratos tratados com um mimético de SOD deve ser estabelecida. Dessa forma, a administração
de enzimas antioxidantes, como a SOD, pode prevenir ou tratar dano cardiovascular (BAKER
et al., 1985; JOLLY et al., 1999), embora os benefícios potenciais da administração sistêmica
de SOD sejam limitadas, porque essa não pode permear membranas biológicas e é, portanto,
incapaz de remover O2•− produzido intracelularmente. SOD nativa tem limitada
permeabilidade de membrana e provou ser decepcionante na prevenção de efeitos adversos
de O2•− ou na redução da PA. Assim, agentes alternativos com atividade semelhante à SOD
são investigados.
Miméticos da SOD melhoram função vascular em alguns estudos, mas não
significativamente em todos os casos (SCHNACKENBERG et al., 1998; ROBERTS et al., 2009;
ROSÓN et al., 2010). Alguns miméticos da SOD, tais como CuZn-SOD, são dependentes de
metais e podem se tornar ineficazes no meio intracelular devido à dissociação do metal-
ligante. Consequentemente, são preferidos compostos com atividade de SOD que tenham
baixo peso molecular, estabilidade biológica, nenhuma toxicidade e permeabilidade da
membrana para utilização in vivo. Mitchell et al. (1990) demonstraram que tempol tem um
peso molecular baixo, é independente de metal e é permeável à membrana celular. Tempol
não age como um mimético da CAT, não altera concentração de H2O2 e não liga a NO
(SAMUNI et al., 1991), sendo então específico para O2•−. No presente estudo, foi observado
que a administração de tempol pode ter inibido o aumento da geração O2•−, o que pode ter
aumentado a biodisponibilidade do NO, impedindo o desenvolvimento de disfunção
Discussão
74
endotelial. Essas observações podem apoiar a ideia de que a produção de O2•− desempenha
um papel crítico no desenvolvimento da disfunção endotelial, resultando em hipertensão.
Tempol aumenta a biodisponibilidade de NO mantendo a regulação da pressão sanguínea
normal (WILCOX & WELCH, 1999).
Permeável à membrana, tempol demonstra atenuar a hipertensão (WILCOX &
PEARLMAN, 2008). Durante a hipertensão arterial, o efeito vasodilatador endógeno de NO é
prevenido devido à sua interação com EROs, especificamente O2•−, que transforma NO em
peroxinitrito e diminui a sua biodisponibilidade, o que resulta em aumento da resistência
vascular (WILCOX & WELCH, 1999). Portanto, pode-se especular que tempol exerceu seus
efeitos benéficos restaurando os níveis de NO podendo atuar no controle direto do tônus
vascular. Schnackenberg & Wilcox (2001) relataram que tempol restaura prejudicada
dilatação mediada por NO de arteríolas aferentes renais em coelhos diabéticos. Limitação de
disponibilidade de NO pode atenuar o seu efeito sobre o tônus vascular renal e transporte de
Na+ (ORTIZ & GARVIN, 2002). Há evidências de que o NO e O2•− têm ações antagônicas que
controlam o transporte de NaCl na alça de Henle e mácula densa, (ORTIZ & GARVIN, 2002) o
que sugere que O2•− poderia promover vasoconstrição renal através do aumento do feedback
tubuloglomerular, já que há uma interação específica entre O2•− e NO (KOMERS et al., 2000;
REN et al., 2002). Assim, o balanço de NO/O2•−, que é um regulador chave da função
endotelial e níveis de O2•−, sendo elevado em muitas formas de DCV, pode ter se acumulado
no rim (indiretamente observado pelo aumento da atividade de SOD na figura 13) e ter
alterado a regulação normal da função renal, contribuindo para o desenvolvimento da
hipertensão nos animais S e FS (KOPKAN & CERVENKA, 2009).
Resumidamente, níveis aumentados de O2•− pela associação de frutose e sal na dieta
podem aumentar significativamente a PA, tal qual observado nos animais FS20. Nesse estudo,
hipotetizou-se que diminuir níveis de O2•− teria potenciais implicações no modelo estudado,
uma vez que vários estudos mostram que baixos níveis de SOD estão presentes na RI e na
hipertensão em humanos e animais experimentais (BUCZYNSKI et al. 1993; YELINOVA et al.
1999; NANDHINI et al., 2005). De fato, tempol reduziu PA em ratos FS20 em acordo com
observações de outros pesquisadores. PAS e PAD foram aumentadas, significativamente, em
ratos FS20, em comparação com os ratos C, e a principal conclusão é que a hipertensão
causada pelo aparecimento de um provável ineficiente sistema antioxidante funcionando é
bloqueado pela administração crônica de tempol. Os valores pressóricos finais, atenuados
Discussão
75
pelo tratamento com tempol, foram associados à variação glicêmica, ao perfil lipídico
aterogênico e à hiperuricemia. Além disso, o desenvolvimento de RI foi marcado por uma
menor resposta antioxidante por PON1 e administração de tempol, marcadamente, restaurou
sua ação. A figura 20 resume os efeitos da administração dietética crônica da suplementação
de frutose associada à sobrecarga de sal e pelo tratamento com tempol.
Em contraste, apesar de às vezes ser mencionada, a relação entre o estresse oxidativo
e a ação da insulina tem sido negligenciada. À luz dos resultados encontrados, podemos
traçar um paralelo entre capacidade antioxidante e mecanismo de ação sobre a hipertensão
em ratos RI alimentados com frutose sob dieta rica em sal. Alterações observadas na defesa
anti-radicalar por tempol em ratos FS20 podem influenciar a atividade de insulina e melhorar
concentrações sérica de parâmetros lipídicos e de diferentes proteínas. Já em 1997, Faure &
colaboradores demonstravam melhoria na sensibilidade à insulina em ratos alimentados com
alto teor de frutose com o uso de vitamina E, ao passo que, níveis de TBARS
significativamente aumentados no fígado em ratos FS do estudo demonstraram associação
positiva com PAS e PAD. Isso indica uma relação entre estresse oxidativo e aumento de PA,
resultando em hipertensão e anomalidades metabólicas. Adicionalmente, o fígado pode ser o
alvo e o contribuinte para alterações sistêmicas com uma condição resultante de um
aumento descontrolado de radicais livres de oxigênio ou disfunção do sistema antioxidante.
Nesse sentido, os resultados confirmam que RI pode promover danos teciduais com
sobrecarga de sal conduzindo à retenção de sódio, hipertensão e ao maior estresse oxidativo.
A geração e a ação de substâncias oxidantes e antioxidantes dependem do sistema de óxido-
redução, o que demonstra que o desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e a
capacidade de o organismo lidar com esses compostos reativos pode prevenir ou não os
efeitos adversos advindos dessas alterações. Tempol e outros eliminadores de O2•− reduzem
significativamente PA em diferentes modelos de hipertensão, como no presente estudo,
impedindo a progressão da elevação da PA. Contudo, estudos adicionais são necessários para
explorarem a participação de EROs nas DCVs, uma vez que inúmeros mecanismos estão
envolvidos com imensa variação em relação aos modelos e protocolos de pesquisas
utilizados.
Discussão
76
Figura 20: Esquema dos efeitos gerais induzidos pelo modelo dietético utilizado e pelo tratamento com tempol em ratos Fischer. Inicialmente, frutose na água é potencialmente disponibilizada pelo consumo
associado de sal e metabolizada aumentando a oxidação de lipídios que é, por si só, um potente produtor de EROs. Frutose conduz à hipertrigliceridemia e à esteatose, resultando em RI, hiperinsulinemia, peroxidação lipídica com aumento do estresse oxidativo estimulado, principalmente pela maior atividade de NADPH-oxidase produzindo O2•−. Dieta rica em sal também aumenta atividade de NADPH-oxidase por Ang II. Hiperinsulinemia ocasiona retenção de sódio potencializando estresse oxidativo quando frutose e sal estão associados na dieta. Consequentemente, há diminuição das defesas antioxidantes, com menor concentração de GSH hepática, diminuição da atividade de SOD e CAT no fígado e no coração e aumento da atividade de SOD no rim. Por outro lado, dieta rica em sal aumenta volume extracelular e eleva PA. Por fim, administração de tempol, um eliminador de O2•−, diminui PA, melhora perfil lipídico e dano hepático, aumenta atividade de PON1 e reduz ácido úrico, ureia associando-se à melhora da resposta pressórica. Angiotensina II (Ang II); Fosfatase alcalina (ALP); Alanina aminotransferase (ALT); Catalase (CAT); Espécies reativas de oxigênio (EROs); Glutationa reduzida/oxidada (GSH/GSSG); Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADPH); Ânion superóxido (O2•−); Pressão arterial (PA); Paraoxonase 1 (PON1); Resistência à insulina (RI); Superóxido dismutase (SOD); Triacilglicerol (TG).
FÍGADO COM ESTEATOSE
Tempol
Melhora do perfil lipídico e da glicemia, ↑
atividade da PON1, ↓do ácido úrico, da ureia
sérica e da atividade de ALP e ALT
↓PA
↑ingestão de água
Expansão do volume
plasmático com
retenção hídrica
↑PA ↑ O2•−
CORAÇÃO
↓ atividade SOD e
CATALASE
↑SOD
↑reabsorção e
retenção de Na+
↑atividade
NADPH-
oxidase
↑ Ang II
↑Trigliceridemia
RI/Hiperinsulinemia
RIM
Rato macho Fischer
Dieta rica em
sal
Dieta rica em
frutose ↑ consumo de frutose
na água
↑Estresse oxidativo
Βeta-oxidação
Gordura
Peroxidação lipídica
↓GSH, GSH/GSSG,
SOD, CATALASE
Conclusões
77
6- CONCLUSÕES
Em conclusão, esse estudo fornece evidências de que modelo experimental de
hipertensão com ratos tratados com alto teor de frutose associado à sobrecarga de sal na
dieta exibe RI/hiperinsulinemia resultando em retenção de sal. Isso foi consistente com dados
da literatura que discutem o papel chave da insulina na regulação do metabolismo do sódio e
na pressão sanguínea. Coletivamente os dados também indicam aumento do estresse
oxidativo na desordem metabólica encontrada em combinação à elevação da PA, enquanto
tempol administrado cronicamente exerce efeito antihipertensivo, demonstrando, assim,
participação crucial de radicais O2•− na patogênese do estresse oxidativo com alteração dos
valores pressóricos nos animais do estudo. O modelo usado recapitula muitos dos efeitos
bioquímicos e fisiológicos que marcam tendências dietéticas atuais. A implicação é que a
exposição contínua a esses refinados, dietas de baixa qualidade, tem o potencial de resultar
em efeitos adversos para a saúde que podem, em parte, explicar o aumento exponencial dos
fatores de risco para as DCVs. Os resultados também denotam a importância de uma dieta
nutricionalmente equilibrada e confirmam a associação do estresse oxidativo nos vários
fatores envolvidos no desenvolvimento da RI com a presença de hipertensão. Assim, o estudo
oferece um paradigma nutricional em que aspectos estudados podem ser úteis e
cuidadosamente explorados para iniciativas de reduzirem tanto a quantidade de sal quanto
de frutose (provinda de sacarose ou de bebidas adoçadas com HFCS) como atualmente está
sendo vastamente consumida. Uma compreensão mais completa de como essa dieta
empregada afeta os mecanismos que causam insulto cardiovascular pode auxiliar na
prevenção de doenças com novas estratégias terapêuticas para combaterem a progressão
dessas condições.
Referências Bibliográficas
78
Referências Bibliográficas
Abdelmalek, M.F.; Suzuki, A.; Guy, C.; Unalp-Arida, A.; Colvin, R.; Johnson, R.J.; Diehl, A.M. Nonalcoholic Steatohepatitis Clinical Research Network. Increased fructose consumption is associated with fibrosis severity in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 51:1961-71, 2010. Abdulla, M.H.; Sattar, M.A.; Johns, E.J. The relation between fructose-induced metabolic syndrome and altered renal haemodynamic and excretory function in the rat. Int J Nephrol. 2011:934659, 2011. Abe, H.; Yamada, N.; Kamata, K.; Kuwaki, T.; Shimada, M.; Osuga, J.; Shionoiri, F.; Yahagi, N.; Kadowaki, T.; Tamemoto, H.; Ishibashi, S.; Yazaki, Y.; Makuuchi, M. Hypertension, hypertriglyceridemia, and impaired endothelium-dependent vascular relaxation in mice lacking insulin receptor substrate- 1. J Clin Invest. 101:1784-1788, 1998. Abraha, A.; Humphreys, S.M.; Clark, M.L.; Matthews, D.R.; Frayn, K.N. Acute effect of fructose on postprandial lipaemia in diabetic and nondiabetic subjects. Br J Nutr. 80:169-75, 1998. Ackerman, Z.; Oron-Herman, M.; Rosenthal, M.G.T.; Pappo, O.; Link, G.; Sela, B-A. Fructose-induced fatty liver disease: hepatic effects of blood pressure and plasma triglyceride reduction. Hypertension. 45:1012-1018, 2005. Aebi, H. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105:121-106, 1984. Akerboom, T.; Sies, H. Assay of glutathione disulfide and glutathione mixed disulfides in biological samples. Meth enzymol. 77:373-382, 1981. AHA. American Heart Association. Shake your salt habit. 2010. Available from http://www.americanheart.org/presenter.jhtml Ambard, L., Beaujard, E. Causes de l’hypertension arterielle. Arch gen Med. 54:486-488, 1904. Ames, B.N.; Cathcart, R.; Schwiers, E.; Hochstein, P. Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: a hypothesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 78:6858-62, 1981. Anderson, E.A.; Hoffman, R.P.; Balon, T.W.; Sinkey, C.A.; Mark, A.L. Hyperinsulinemia produces both sympathetic neural activation and vasodilatation in normal humans. J Clin Invest. 87:2246-2252, 1991. Angulo, P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med. 346:1221-31, 2002. Anstee, Q.M.; Goldin, R.D. Mouse models in non-alcoholic fatty liver disease and steatohepatitis research. Int J Exp Path. 87:1-16, 2006.
Referências Bibliográficas
79
Antunes-Rodrigues, J.; de Castro, M.; Elias, L.L.; Valença, M.M.; McCann, S.M. Neuroendocrine control of body fluid metabolism. Physiol Rev. 84:169-208, 2004. Araki, E.; Murakimi, T.; Shirotani, T.; Kanai, F.; Shinohara, Y.; Shimada, F.; Mori, M.; Shichiri, M.; Ebina, Y. A cluster of four Sp1 binding sites required for efficient expression of the human insulin receptor gene. J Biol Chem. 6:3944-3948, 1991. Assy, N.; Nasser, G.; Kamayse, I.; Nseir, W.; Beniashvili, Z.; Djibre, A.; Grosovski, M. Soft drink consumption linked with fatty liver in the absence of traditional risk factors. Can J Gastroenterol. 22:811-6, 2008. Bader, M.; Ganten, D. Update on tissue rennin-angiotens systems. J Mol Med. 86:615-621, 2008. Banday, A.A.; Marwaha, A.; Tallam, L.S.; Lokhandwala, M.F. Tempol reduces oxidative stress, improves insulin sensitivity, decreases renal dopamine D1 receptor hyperphosphorylation, and restores D1 receptor-G-protein coupling and function in obese Zucker rats. Diabetes. 54:2219-2226, 2005. Banday, A.A.; Muhammad, A.B.; Fazili, F.R.; Lokhandwala, M. Mechanisms of oxidative stress–induced increase in salt sensitivity and development of hypertension in Sprague–Dawley Rats. Hypertension. 49:664-671, 2007. Barton, M.; Vos, I.; Shaw, S.; Boer, P.; D'Uscio, L.V.; Gröne, H.J.; Rabelink, T.J.; Lattmann, T.; Moreau, P.; Lüscher, T.F. Dysfunctional renal nitric oxide synthase as a determinant of salt-sensitive hypertension: mechanisms of renal artery endothelial dysfunction and role of endothelin for vascular hypertrophy and glomerulosclerosis. J Am Soc Nephrol. 11:835-846, 2000. Baker, G.L.; Corry, R.J.; Autor, A.P. Oxygen free radical induced damage in kidneys subjected to warm ischemia and reperfusion: protective effect of superoxide dismutase. Ann Surg. 202:628-641, 1985. Babior, B.M. NADPH oxidase: An update Blood. 93:1464-1476, 1999. Barretto, S.A.J.; Cyrillo, D.C. Análise da composição dos gastos com alimentação no Município de São Paulo (Brasil) na década de 1990. Rev Saúde Pública 35:52-9, 2001. Barone, S.; Fussell, S.L.; Singh, A.K.; Lucas, F.; Xu, J.; Kim, C.; Wu, X.; Yu, Y.; Amlal, H.; Seidler, U.; Zuo, J.; Soleimani, M. Slc2a5 (Glut5) is essential for the absorption of fructose in the intestine and generation of fructose-induced hypertension. J Biol Chem. 284:5056-5066, 2009. Bar-On, H.; Stein, Y. Effect of glucose and fructose administration on lipid metabolism in the rat. J Nutr. 94:95-105, 1968. Baron, A.D.; Brechtel-Hook, G.; Johnson, A.; Hardin, D. Skeletal muscle blood flow. A possible link between insulin resistance and blood pressure. Hypertension. 21:129-135, 1993. Basciano, H.; Federico, L.; Adeli, K. Fructose, insulin resistance, and metabolic dyslipidemia. Nutr Metab. (Lond), 2:5, 2005. Baum, M. Insulin stimulates volume absorption in the rabbit proximal convoluted tubule. J Clin Invest. 79:1104-1109, 1987.
Referências Bibliográficas
80
Beltowski, J.; Wojcicka, G.; Jamroz, A. Differential effect of 3-hydroxy-3- -methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors on plasma paraoxonase 1 activity in the rat. Pol J Pharmacol. 54:661-71, 2002. Beltowski, J.; Wójcicka, G.; Jamroz-Wiśniewska, A.; Borkowska, E.; Marciniak, A. Antioxidant treatment normalizes nitric oxide production, renal sodium handling and blood pressure in experimental hyperleptinemia. Life Sci. 26:1855-68, 2005. Bezerra, R.M., Ueno, M., Silva, M.S., Tavares, D.Q., Carvalho, C.R., Saad, M.J., Gontijo, J.A. A high-fructose diet induces insulin resistance but not blood pressure changes in normotensive rats. Braz J Med Biol Res. 34:1155-1160, 2001. Bhagat, B.; Burke, W.J.; Dhalla, N.S. Insulin-induced enhancement of uptake of noradrenaline in atrial strips. Br J Pharmacol. 74:325-332, 1981. Bragulat, E.; de la Sierra, A.; Antonio, M.T; Coca, A. Endothelial dysfunction in salt-sensitive essential hypertension. Hypertension. 37:444-448, 2001. Blakely, S.R.; Hallfrisch, J.; Reiser, S.; Prather, E.S. Long-term effects of moderate fructose feeding on glucose tolerance parameters in rats. J Nutr. 111:307-14, 1981. Brands, M.W.; Hildebrandt, D.A.; Mizelle, H.L.; Hall, J.E. Sustained hyperinsulinemia increases arterial pressure in conscious rats. Am J Physiol. 260:R764-R768, 1991. Brands, M.H.; Hildebrandt, D.A.; Mizelle, H.L.; Hall, J.E. Hypertension during chronic hyperinsulinemia in rats is not salt-sensitive. Hypertension. 19:183-189, 1992. Brands, M.W.; Garrity, C.A.; Holman, M.G.; Keen, H.L.; Alonso-Galicia, M.; Hall, J.E. High-fructose diet does not raise 24-hour mean arterial pressure in rats. Am J Hypertens. 7:104-9, 1994. Bray, G.A.; Nielsen, S.J.; Popkin, B.M. Consumption of high-fructose corn syrup in beverages may play a role in the epidemic of obesity. Am J Clin Nutr. 79: 537-543, 2004. Brunt, E.M.; Janney, C.G.; Di Bisceglie, A.M.; Neuschwander-Tetri, B.A.; Bacon, B.R. Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histological lesions. Am J Gastroenterol. 94:2467-2474, 1999. Buczynski, A.; Wachowicz, B.; Kedziora-Kornatowska, K.; Tkaczewski, W.; Kedziora, J. Changes in antioxidant enzymes activities, aggregability and malonyldialdehyde concentration in blood platelets from patients with coronary heart disease. Atherosclerosis. 100:223-228, 1993. Buege, J.A.; Aust, S.D. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol. 52:302-310, 1978. Busserolles, J.; Rock, E.; Gueux, E.; Mazur, A.; Grolier, P.; Rayssiguier, Y. Short-term consumption of a high-sucrose diet has a pro-oxidant effect in rats. Br J Nutr. 87:337-342, 2002a. Busserolles, J., Zimowska, W., Rock, E., Rayssiguier, Y. & Mazur, A. Rats fed a high sucrose diet have altered heart antioxidant enzyme activity and gene expression. Life Sci. 71:1303-1312, 2002b.
Referências Bibliográficas
81
Busserolles, J., Gueux, E., Rock, E., Mazur, A., Rayssiguier, Y. High fructose feeding of magnesium deficient rats is associated with increased plasma triglyceride concentration and increased oxidative stress. Magnes Res. 16:7-12, 2003a. Busserolles, J.; Gueux, E.; Rock, E.; Demigné, C.; Mazur, A.; Rayssiguier, Y. Oligofructose protects against the hypertriglyceridemic and pro-oxidative effects of a high fructose diet in rats. J Nutr. 133: 1903-1908, 2003b. Butler, R.; Morris, A.D.; Belch, J.J.; Hill, A.; Struthers, A.D. Allopurinol normalizes endothelial dysfunction in type 2 diabetics with mild hypertension. Hypertension. 35:746-51, 2000. Campese, V.M.; Karubian, F. Salt sensitivity in hypertension: implications for the kidney. J Am Soc Nephrol. 2:S53-61, 1991. Cannon, P.J.; Stason, W.B.; Demartini, F.E.; Sommers, S.C.; Laragh, J.H. Hyperuricemia in primary and renal hypertension. N Engl J Med. 275:457-464, 1966. Catena, C.; Cavarape, A.; Novello, M.; Giacchetti, G.; Sechi, L.A. Insulin receptors and renal sodium handling in hypertensive fructose-fed rats. Kidney Int. 64:2163-2171, 2003. Cai, H. Hydrogen peroxide regulation of endothelial function: origins, mechanisms, and consequences. Cardiovasc Res. 68:26-36, 2005. Cannizzo, B.; Luján, A.; Estrella, N.; Lembo, C.; Cruzado, M.; Castro, C. Insulin resistance promotes early atherosclerosis via increased proinflammatory proteins and oxidative stress in fructose-fed ApoE-KO mice. Exp Diabetes Res. 941304, 2012. Carlson, S.H.; Shelton, J.; White, C.R.; Wyss, J.M. Elevated sympathetic activity contributes to hypertension and salt sensitivity in diabetic obese Zucker rats. Hypertension. 35:403-8, 2000. Castro, G.S.; Cardoso, J.F.; Vannucchi, H.; Zucoloto, S.; Jordão, A.A. Fructose and NAFLD: metabolic implications and models of induction in rats. Acta Cir Bras. 26:45-50, 2011. CDC. National Health and Nutrition Examination Survey Data. Hyattsville, MD: US Department of Health and Human Services, CDC; 2011. Ceriello, A. Possible role of oxidative stress in the pathogenesis of hypertension. Diabetes Care. 31:S181-4, 2008. Cha, S.H.; Wolfgang, M.; Tokutake, Y.; Chohnan, S.; Lane, M.D. Differential effects of central fructose and glucose on hypothalamic malonyl–CoA and food intake. Proc Natl Acad Sci U S A. 105:16871-5, 2008. Chabrashvili, T.; Tojo, A.; Onozato, M.L.; Kitiyakara, C.; Quinn, M.T.; Fujita, T.; Welch, W.J.; Wilcox,C.S. Expression and cellular localization of classic NADPH oxidase subunits in the spontaneously hypertensive kidney. Hypertension. 39:269-74, 2002. Chabrashvili, T.; Kitiyara, C.; Blau, J.; Karber, A.; Aslam, S.; Welch, W.J.; Wilcox, C.S. Effects of ANG II type 1 and 2 receptors on oxidative stress, renal NADPH oxidase, and SOD expression. Am J Physiol. 285:R117-R124, 2003.
Referências Bibliográficas
82
Chen, P.Y.; Gladish, R.D.; Sanders, P.W. Vascular smooth muscle nitric oxide synthase anomalies in Dahl/Rapp salt-sensitive rats. Hypertension. 31:918-924, 1998. Chiolero, A.; Würzner, G.; Burnier, M. Renal determinants of the salt sensitivity of blood pressure. Nephrol Dial Transplant. 16:452-8, 2001. Cho, T.M.; Peng, N.; Clark, J.T.; Novak, L.; Roysommuti, S.; Prasain, J.; Wyss, J.M. Genistein attenuates the hypertensive effects of dietary NaCl in hypertensive male rats. Endocrinology. 48:5396-402, 2007. Choi, H.K.; Ford, E.S. Prevalence of the metabolic syndrome in individuals with hyperuricemia. Am J Med. 120:442-447, 2007. Choi, J.W.J.; Ford, E.S.; Gao, X.; Choi, H.K. Sugarsweetened soft drinks, diet soft drinks, and serum uric acid level: the Third National Health and Nutrition Examination Survey. Arthritis Rheum. 59:109-116, 2008. Cook, N.R.; Cutler, J.A.; Obarzanek, E.; Buring, J.E.; Rexrode, K.M.; Kumanyika, S.K.; Appel, L.J.; Whelton, P.K. Long term effects of dietary sodium reduction on cardiovascular disease outcomes: observational follow-up of the trials of hypertension prevention (TOHP). BMJ. 28:885-8, 2007. Cooper, S.A.; Whaley-Connell, A.; Habibi, J.; Wei, Y.; Lastra, G.; Manrique, C.; Stas, S.; Sowers, J.R. Renin-angiotensin-aldosterone system and oxidative stress in cardiovascular insulin resistance. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293:H2009-H2023, 2007. Cowley, A.W.Jr.; Mattson, D.L.; Lu, S.; Roman, R.J. The renal medulla and hypertension. Hypertension. 25:663-673, 1995. Crapo, P.A.; Kolterman, O.G. The metabolic effects of 2-week fructose feeding in normal subjects. Am J Clin Nutr. 39:525-534, 1984. Dahl, L.K.; Heine, M. Primary role of renal homografts in setting chronic blood pressure levels in rats. Circ Res. 36:692-693, 1975. Dan, Y.H.; Boini, K.M.; Friedrich, B.; Metzger, M.; Just, L.; Oswald, H.; Wulff, P.; Kuhl, D.; Vallon, V.; Lang, F. Blunted hypertensive effect of combined fructose and high-salt diet in gene targeted mice lacking functional serum- and glucocorticoid-inducible kinase SGK1. Am J Physiol. 290:R935-R944, 2006. D’Angelo, G.; Elmarakby, A.A.; Pollock, D.M.; Stepp, D.W. Fructose feeding increases insulin resistance but not blood pressure in Sprague-Dawley rats. Hypertension. 46:806-811, 2005. Datta, K.; Sinha, S.; Chattopadhyay, P. Reactive oxygen species in health Band diseases. Natl Med J India. 13:304-10, 2000. DeAngelis, K.; Senador, D.D.; Mostarda, C.; Irigoyen, M.C.; Morris, M. Sympathetic overactivity precedes metabolic dysfunction in a fructose model of glucose intolerance in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 302:R950-R957, 2012. De Bold, A.J. Atrial natriuretic factor: a hormone produced by the heart. Science. 15:767-70, 1985.
Referências Bibliográficas
83
Dekker, M.J.; Su, Q.; Baker, C.; Rutledge, A.C.; Adeli, K. Fructose: a highly lipogenic nutrient implicated in insulin resistance, hepatic steatosis, and the metabolic syndrome. Am J Physiol Endocrinol Metab. 299:E685-E694, 2010. Delbosc, S.; Paizanis, E.; Magous, R.; Araiz, C.; Dimo, T.; Cristol, J.P.; Cros, G.; Azay, J. Involvement of oxidative stress and NADPH oxidase activation in the development of cardiovascular complications in a model of insulin resistance, the fructose-fed rat. Atherosclerosis. 179:43-49, 2005. Del Maestro, R.F. An approach to free radicals in medicine and biology. Acta Physiol Scand. 40:153-168, 1980. DeFronzo, R.A.; Cooke, C.R.; Andres, R. The effect of insulin on renal handling of sodium, potassium, calcium, and phosphate in man. J Clin Invest. 55: 845-855, 1975. DeFronzo, R.A. Insulin resistance, hyperinsulinemia, and coronary artery disease: a complex metabolic web. J Cardiovasc Pharmacol. 20:S1-S16, 1992. deRichelieu, T.; Louise, Sorensen, C.M.; Holstein-Rathlou, N-H. Salomonsson, M. NO-independent mechanism mediates tempol-induced renal vasodilation in SHR. Am J Physiol Renal Physiol. 289:F1227-F1234, 2005. Despopoulos, A.; Silbernagl, S. (Eds), 2003. Color Atlas of Physiology, 5th Edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Dietz, J.R. Mechanisms of atrial natriuretic peptide secretion from the atrium. Cardiovasc Res. 68:8-17, 2005. Dobrian, A.D.; Davies, M.J.; Schriver, S.D.; Lauterio, T.J.; Prewitt, R.L. Oxidative Stress in a Rat Model of Obesity-Induced Hypertension. Hypertension. 37:554-560, 2001. Dobrian, A.D., Schriver, S.D.; Lynch, T.; Prewitt, R.L. Effect of salt on hypertension and oxidative stress in a rat model of diet-induced obesity. Am J Physiol Renal Physiol. 285:F619-F628, 2003. Doehner, W.; Schoene, N.; Rauchhaus, M.; Leyva-Leon, F.; Pavitt, D.V.; Reaveley, D.A.; Schuler, G.; Coats, A.J.; Anker, S.D.; Hambrecht, R. Effects of xanthine oxidase inhibition with allopurinol on endothelial function and peripheral blood flow in hyperuricemic patients with chronic heart failure: results from 2 placebo-controlled studies. Circulation. 105:2619-24, 2002. Dornas, W.C.; de Lima, W.G.; Dos Santos, R.C.; de Souza, M.O.; Silva, M.; Diniz, M.F.; Silva, M.E. Salt overload in fructose-fed insulin-resistant rats decreases paraoxonase-1 activity. Nutr Metab (Lond). 27:63, 2012. Ebenezer, P.J.; Mariappan, N.; Elks, C.M.; Haque, M.; Francis, J. Diet-induced renal changes in Zucker rats are ameliorated by the superoxide dismutase mimetic tempol. Obesity (Silver Spring). 17:1994-2002, 2009. Elliott, P.; Stamler, J.; Nichols, R.; Dyer, A.R.; Stamler, R.; Kesteloot, H.; Marmot, M. for the Intersalt Cooperative Research Group. Intersalt revisited: further analyses of 24 hour sodium excretion and blood pressure within and across populations. BMJ. 312:1249-53, 1996.
Referências Bibliográficas
84
Elliott, P., Brown I. Sodium intakes around the world / Background document prepared for the Forum and Technical meeting on reducing salt intake in populations (Paris 5-7th October 2006), 85pág. El Mesallamy, H.O.; El-Demerdash, E.; Hammad, L.N.; El Magdoub, H.M. Effect of taurine supplementation on hyperhomocysteinemia and markers of oxidative stress in high fructose diet induced insulin resistance. Diabetol Metab Syndr. 30:46, 2010. Emmerson, B.T. Effect of oral fructose on urate production. Ann Rheum Dis. 33:276-80, 1974. Erejuwa, O.O.; Sulaiman, S.A.; Wahab, M.S.; Salam, S.K.; Salleh, M.S.; Gurtu, S. Comparison of antioxidant effects of honey, glibenclamide, metformin, and their combinations in the kidneys of streptozotocin-induced diabetic rats. Int J Mol Sci. 12:829-43, 2011. Évora, P.R.B.; dos Reis, C.L.; Ferez, M.A.; Conte, D.A.; Li, L.V.G. Distúrbios do equilíbrio hidroeletrolítico e do equilíbrio acidobásico. Uma revisão prática. Medicina (Ribeirão Preto) 32:451-469, 1999. Facchini, F.S.; do Nascimento, C.; Reaven, G.M.; Yip, J.W.; Ni, X.P.; Humphreys, M.H. Blood pressure, sodium intake, insulin resistance, and urinary nitrate excretion. Hypertension. 33:1008-12, 1999. Farah, V.; Elased, K.M.; Chen, Y.; Key, M.P.; Cunha, T.S.; Irigoyen, M.C.; Morris, M. Nocturnal hypertension in mice consuming a high fructose diet. Auton Neurosci. 130:41-50, 2006. Farquharson, C.A.; Butler, R.; Hill, A.; Belch, J.J.; Struthers, A.D. Allopurinol improves endothelial dysfunction in chronic heart failure. Circulation. 106:221-6, 2002. Faure, P.; Rossini, E.; Lafond, J.L.; Richard, M.J.; Favier, A.; Halimi, S. Vitamin E improves the free radical defense system potential and insulin sensitivity of rats fed high fructose diets. J Nutr. 127:103-107, 1997. Faure, P.; Rossini, E.; Wiernsperger, N.; Richard, M.J.; Favier, A.; Halimi, S. An insulin sensitizer improves the free radical defense system potential and insulin sensitivity in high fructose-fed rats. Diabetes. 48:353-7, 1999. Félétou, M.; Boulanger, M.; Staczek, J.; Broux, O.; Duhault, J. Fructose diet and VEGF-induced plasma extravasation in hamster cheek pouch. Acta Pharmacol Sin. 24:207-211, 2003. Feig, D.I.; Johnson, R.J. Hyperuricemia in childhood primary hypertension. Hypertension. 42:247-52, 2003. Fink, G.D.; Takeshita, A.; Mark, A.L.; Brody, M.L. Determinants of renal vascular resistance in the Dahl strain of genetically hypertensive rat. Hypertension. 2:274-280, 1980. Folch, J.; Lees, M.; Sloane-Stanley, G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226:497-509, 1957. Forman, J.P.; Choi, H.; Curhan, G.C. Fructose and vitamin C intake do not influence risk for developing hypertension. J Am Soc Nephrol. 20:863-871, 2009.
Referências Bibliográficas
85
Forte, J.G.; Miguel, J.M.P.; Miguel, M.J.P.; de Pádua, F.; Rose, G. Salt and blood pressure – a community trial. Journal of Human Hypertension. 3:179-184, 1989. Fox, I.H.; Kelley, W.N. Studies on the mechanism of fructose-induced hyperuricemia in man. Metabolism. 21:713-21, 1972. Fox, S.M.; Campbell, S. Atualização: dois anos (1997-1998) de experiência clínica com rimadyl®. Pfizer Saúde Animal-Boletim Técnico. 1:4-6, 2000. Frederich, R.C.; Hamann, A.; Anderson, S.; Lollmann, B.; Lowell, B.B.; Flier, J.S. Leptin levels reflect body lipid content in mice: evidence for diet-induced resistance to leptin action. Nat Med. 1:1311-1314, 1995. Fridovich, I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev Biochem. 64:97-112, 1995. Friedman, J.M.; Halaas, J.L. Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature. 395: 763-770, 1998. Fuenmayor, N.; Moreira, E.; Cubeddu, L.X. Salt sensitivity is associated with insulin resistance in essential hypertension. Am J Hypertens. 4:397-402, 1998. Fujiwara, N.; Osanai, T.; Kamada, T.; Katoh, T.; Takahashi, K.; Okumura, K. Study on the relationship between plasma nitrite and nitrate level and salt sensitivity in human hypertension: modulation of nitric oxide synthesis by salt intake. Circulation. 101:856-861, 2000. Galipeau, D.; Verma, S.; Mc-Neill, J.H. Female rats are protected against fructose-induced changes in metabolism and blood pressure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283:H2478-H2484, 2002. Gang, H.; Qiao, Q.; Tuomilehto, J.; Balkau, B.; Borch-Johnsen, K.; Pyorala, K. for the DECODE Study Group. Prevalence of the metabolic syndrome and its relation to all cause and cardiovascular mortality in nondiabetic European men in women. Arch Intern Med. 164:1066-1076, 2004. Gao, X.; Qi, L.; Qiao, N.; Choi, H.K.; Curhan, G.; Tucker, K.L.; Ascherio, A. Intake of added sugar and sugar-sweetened drink and serum uric acid concentration in US men and women. Hypertension. 50:306-12, 2007. Gersch, M.S.; Mu, W.; Cirillo, P.; Reungjui, S.; Zhang, L.; Roncal, C.; Sautin, Y.Y.; Johnson, R.J.; Nakagawa, T. Fructose but not dextrose accelerates the progression of chronic kidney disease. Am J Physiol Renal Physiol. 293: F1256-F1261, 2007. Giardino, I.; Edelstein, D.; Brownlee, M. Nonenzymatic glycosylation in vitro and in bovine endothelial cells alters basic fibroblast growth factor activity. A model for intracellular glycosylation in diabetes. J Clin Invest. 94:110-7, 1994. Girman, C.J.; Rhodes, T.; Mercuri, M.; Pyörälä, K.; Kjekshus, J.; Pedersen, T.R.; Beere, P.A.; Gotto, A.M.; Clearfield, M. for the 4S Group and the AFCAPS/TexCAPS Research Group. The metabolic syndrome and risk of major coronary events in the Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S) and the Air Force/Texas Coronary Atherosclerosis Prevention Study (AFCAPS/ TexCAPS). Am J Cardiol. 93:136-141, 2004. Gleiberman, L. Sodium, blood pressure, and ethnicity: what have we learned? Am J Hum Biol. 21:679-686, 2009.
Referências Bibliográficas
86
Glinsmann, W.H.; Bowman, B.A. The public health significance of dietary fructose. Am J Clin Nutr. 58:820S-3S, 1993. Goldenfarb, P.B.; Bowyer, F.P.; Hall, E.; Brosious, E. Reproducibility in the hematology laboratory: the microhematocrit determination. Am J Clin Pathol. 56:35-9. 1971. Gordeeva, A.V.; Zvyagilskaya, R.A.; Labas, Y.A. Cross-talk between reactive oxygen species and calcium in living cells. Biochemistry (Mosc). 68:1077-80, 2003. Gordon, F.J.; Mark, A.L. Mechanism of impaired baroreflex control in prehypertensive Dahl salt-sensitive rats. Circ Res. 54: 378-387, 1984. Grattagliano, I.; Caraceni, P.; Calamita, G.; Ferri, D.; Gargano, I.; Palasciano, G.; Portincasa, P. Severe liver steatosis correlates with nitrosative and oxidative stress in rats. Eur J Clin Invest. 38:523-30, 2008. Griendling, K.K.; Sorescu, D.; Ushio-Fukai, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circ Res. 17:494-501, 2000. Grundy, S.M.; Brewer, B.J.; Cleeman, J.I.; Smith, S.C.; Lenfant, C. Definition of metabolic syndrome. Report of the National Heart, Lung and Blood Institute/American Heart Association conference on scientific issues related to definition. Circulation. 109:133-138, 2004. Gus, I.; Fischmann, A.; Medina, C. Prevalence of risk factors for coronary artery disease in the Brazilian State of Rio Grande do Sul. Arq Bras Cardiol. 78:478-90, 2002. Gutteridge, J.M.C. Biological origin of free radicals and mechanisms of antioxidant protection. Chem Biol Interact. 91:113-140, 1994. Guyton, A.C.; Coleman, T.G.; Cowley, A.V.; Scheel, K.W.; Manning, R.D. Jr.; Norman, R.A. Jr. Arterial pressure regulation. Overriding dominance of the kidneys in long-term regulation and in hypertension. Am J Med. 52:584-594, 1972. Guyton, A.C. Blood pressure control--special role of the kidneys and body fluids. Science. 28:1813-6, 1991. Hall, J.E.; Mizelle, H.L.; Woods, L.L. The renin-angiotensin system and long-term regulation of arterial pressure. J Hypertens. 4:387-397, 1986. Hall, J.E.; Mizelle, H.L.; Hildebrandt, D.A.; Brands, M.W. Abnormal pressure natriuresis. A cause or a consequence of hypertension? Hypertension. 15:547-559, 1990. Hallfrisch, J.; Ellwood, K.C.; Michaelis, O.E. Effects of dietary fructose on plasma glucose and hormone responses in normal and hyperinsulinemic men. J Nutr. 113:1819-1826, 1983. Hallfrisch, J. Metabolic effects of dietary fructose. FASEB J. 4:2652-2660, 1990. Halliwell, B. Oxidative stress, nutrition and health. Experimental strategies for optimization of nutritional antioxidant intake in humans. Free Radic Res. 25:57-74, 1996.
Referências Bibliográficas
87
Hanover, L.M.; White, J.S. Manufacturing, composition, and applications of fructose. Am J Clin Nutr. 58:724S-732S, 1993. Harrison, D.G. Endothelial function and oxidant stress. Clin Cardiol. 20:II-17, 1997. Hasegawa, H.; Takano, H.; Kohro, T.; Ueda, K.; Niitsuma, Y.; Aburatani, H.; Komuro, I. Amelioration of hypertensive heart failure by amlodipine may occur via antioxidative effects. Hypertens Res. 29:719-729, 2006. Hattori, Y.; Akimoto, K.; Gross, S.S.; Hattori, S.; Kasai, K. Angiotensin-II-induced oxidative stress elicits hypoadiponectinaemia in rats. Diabetologia. 48:1066-1074, 2005. Havel, P.J. Dietary fructose: implications for dysregulation of energy homeostasis and lipid/carbohydrate metabolism. Nutr Rev. 63:133-57, 2005. He, F.; MacGregor, G. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. A meta-analysis. Implication for public health. J Hypertension. 18:S126-S126, 2000. Henson, P.E.; Johnston, R.B. Tissue injury in inflammation: oxidants, proteinases, and cationic proteins. J Clin Invest. 79:669-674, 1987. Heinig, M.; Johnson, R.J. Role of uric acid in hypertension, renal disease, and metabolic syndrome. Cleve Clin J Med. 73:1059-1064, 2006. Heymsfield, S.B.; Greenberg, A.S.; Fujioka, K.; Dixon, R.M.; Kushner, R.; Hunt, T.; Lubina, J.A.; Patane, J.; Self, B.; Hunt, P.; McCamish, M. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA 282:1568-1575, 1999. Horita, S.; Seki, G.; Yamada, H.; Suzuki, M.; Koike, K.; Fujita, T. Insulin resistance, obesity, hypertension, and renal sodium transport. Int J Hypertens. 391762, 2011. Horton, T.J.; Gayles, E.C.; Prach, P.A.; Koppenhafer, T.A.; Pagliassotti, M.J. Female rats do not develop sucrose-induced insulin resistance. Am J Physiol. 272:R1571-R1576, 1997. Hwang, I.S.; Ho, H.; Hoffman, B.B.; Reaven, G.M. Fructose-induced insulin resistance and hypertension in rats. Hypertension. 10:512-6, 1987. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Pesquisa de Orçamentos Familiares 2008-2009: aquisição alimentar domiciliar per capita – Brasil e grandes regiões. Rio de Janeiro: IBGE; 2010. Ishibashi, S. The vascular renin-angiotensin system as a possible source of vascular inflammation in fructose-fed rats. Hypertens Res. 30:375-376, 2007. Jalal, R.; Bagheri, S.M.; Moghimi, A.; Rasuli, M.B. Hypoglycemic effect of aqueous shallot and garlic extracts in rats with fructose-induced insulin resistance. J Clin Biochem Nutr. 41:218-223, 2007. Jalal, D.I.; Smits, G.; Johnson, R.J.; Chonchol, M. Increased fructose associates with elevated blood pressure. J Am Soc Nephrol. 21:1543-1549, 2010. Jeppesen, J.; Chen, Y.I.; Zhou, M.Y.; Schaaf, P.; Coulston, A.; Reaven, G.M. Postprandial triglyceride and retinyl ester responses to oral fat: effects of fructose. Am J Clin Nutr. 61:787-91, 1995.
Referências Bibliográficas
88
Jolly, S.R.; Kane, W.J.; Bailie, M.B.; Abrams, G.D.; Lucchesi, B.R. Cammine myocardial reperfusion injury: its reduction by the combined administration of superoxide dismutase and catalase. Circ Res. 54:277-285, 1999. Jones, D.P.; Park, Y.; Gletsu-Miller, N.; Liang, Y.; Yu, T.; Accardi, C.J.; Ziegler, T.R. Dietary sulfur amino acid effects on fasting plasma cysteine/cystine redox potential in humans. Nutrition. 27:199-205, 2011. Johnson, R.J.; Segal, M.S.; Sautin, Y.; Nakagawa, T.; Feig, D.I.; Kang, D.H.; Gersch, M.S.; Benner, S.; Sánchez-Lozada, L.G. Potential role of sugar (fructose) in the epidemic of hypertension, obesity and the metabolic syndrome, diabetes, kidney disease, and cardiovascular disease. Am J Clin Nutr. 86:899-906, 2007. Johnson, W.M.; Wilson-Delfosse, A.L.; Mieyal, J.J. Dysregulation of glutathione homeostasis in neurodegenerative diseases. Nutrients. 9:1399-440, 2012. Jürgens, H.; Haass, W.; Castañeda, T.R.; Schürmann, A.; Koebnick, C.; Dombrowski, F.; Otto, B.; Nawrocki, A.R.; Scherer, P.E.; Spranger, J.; Ristow, M.; Joost, H.G.; Havel, P.J.; Tschöp, M.H. Consuming fructose-sweetened beverage increases body adiposity in mice. Obes. Res. 13:1146-1156, 2005. Kannel, W.B.; Wilson, P.W. Comparison of risk profiles for cardiovascular events: implications for prevention. Adv Intern Med. 42:39-66, 1997. Kang, D.H.; Park, S.K.; Lee, I.K.; Johnson, R.J. Uric acid-induced C-reactive protein expression: implication on cell proliferation and nitric oxide production of human vascular cells. J Am Soc Nephrol. 16:3553-62, 2005. Kannappan, S.; Jayaraman, T.; Rajasekar, P.; Ravichandran, M.K.; Anuradha, C. V. Cinnamon bark extract improves glucose metabolism and lipid profile in the fructose-fed rat. Singapore Med J. 47:858-63, 2006. Kanuri, G.; Spruss, A.; Wagnerberger, S.; Bischoff, S.C.; Bergheim, I. Fructose-induced steatosis in mice: role of plasminogen activator inhibitor-1, microsomal triglyceride transfer protein and NKT cells. Lab Invest. 91:885-95,2011. Kaplan, J.H. Biochemistry of Na-K-ATPase. Annu Rev Biochem. 71:511-35, 2002. Katori, M.; Majima, M. A missing link between a high salt intake and blood pressure increase. J Pharmacol Sci. 100:370-90, 2006. Kaufmann, E.E.; Owoaje, S.A.; James, S.A.; Rotini, C.N.; Cooper, R.S. Determinants of hypertension in West Africa: contribution of anthropometric and dietary factors to urban-rural and socioeconomic gradients. Am J Epidemiol. 143:1203-18, 1996. Kawada, N.; Imai, E.; Karber, A.; Welch, W.J.; Wilcox, C.S. A mouse model of angiotensin II slow pressor response role of oxidative stress. J Am Soc Neprol. 13:2860-2868, 2002.
Referências Bibliográficas
89
Kawasaki, T.; Igarashi, K.; Koeda, T.; Sugimoto, K.; Nakagawa, K.; Hayashi, S.; Yamaji, R.; Inui, H.; Fukusato, T.; Yamanouchi, T. Rats fed fructose-enriched diets have characteristics of Nonalcoholic Hepatic Steatosis. J Nutr. 139:2067-71, 2009. Kelley, G.L.; Allan, G.; Azhar, S. High dietary fructose induces a hepatic stress response resulting in cholesterol and lipid dysregulation. Endocrinology. 145:548-55, 2004. Kempner, W. Treatment of hypertensive vascular disease with rice diet. Am J Med. 4: 545-77, 1948. Khosla, U.M.; Zharikov, S.; Finch, J.L.; Nakagawa, T.; Roncal, C.; Mu, W.; U, Krotova, K.; Block, E.R.; Prabhakar, S.; Johnson, R.J. Hyperuricemia induces endothelial dysfunction. Kidney Int. 67:1739-42, 2005. Kim, M.K.; Sasaki, S.; Sasazuki, S.; Okubo, S.; Hayashi, M.; Tsugane, S. Lack of long-Term effect of vitamin C supplementation on blood pressure. Hypertension. 40, 797-803, 2002. Kim, H.Y.; Okubo, T.; Juneja, L.R.; Yokozawa T. The protective role of amla (Emblica officinalis Gaertn.) against fructose-induced metabolic syndrome in a rat model. Br J Nutr. 103:502-512, 2010. Kirsch, R.; Clarkson, V.; Verdonk, R.C.; Marais, A.D.; Shephard, E.G.; Ryfeel, B.; Hall, P.deL.M. Rodent nutritional model of steatohepatitis: Effects of endotoxin (lipopolysaccharide) and tumor necrosis factor alpha deficiency. J Gastroenterol Hepatol. 21:174-182, 2006. Kitiyakara, C.; Chabrashvili, T.; Chen, Y.; Blau, J.; Karber, A.; Aslam, S.; Welch, W.J.; Wilcox, C.S. Salt intake, oxidative stress, and renal expression of NADPH oxidase and superoxide dismutase. J Am Soc Nephrol. 14:2775-2782, 2003. Kobayashi, R.; Nagano, M.; Nakamura F.; Higaki, J.; Yoshihiko Fujioka, Y.; Ikegami, H.; Mikami, H.; Kawaguchi, N.; Onishi, S.; Toshio Ogihara, T. Role of angiotensin II in high fructose-induced left ventricular hypertrophy in rats. Hypertension. 21:1051-1055, 1993. Kodama, K.; Adachi, H.; Sonoda, J. Beneficial effects of long-term enalapril treatment and low-salt intake on survival rate of dahl salt-sensitive rats with established hypertension. J Pharmacol Exp Ther. 283:625-9, 1997. Kojsová, S.; Jendeková, L.; Zicha, J.; Kunes, J.; Andriantsitohaina, R.; Pechánová, O. The effect of different antioxidants on nitric oxide production in hypertensive rats. Physiol Res. 55:S3-S16, 2006. Komers, R.; Lindsley, J.N.; Oyama, T.T.; Allison, K.M.; Anderson, S. Role of neuronal nitric oxide synthase (NOS1) in the pathogenesis of renal hemodynamic changes in diabetes. Am J Physiol Renal Physiol. 279:F573-F583, 2000. Kone, B.C.; Baylis, C. Biosynthesis and homeostatic roles of nitric oxide in the normal kidney. Am J Physiol. 272: F561-F578, 1997. Kono, Y.; Fridovich, I. Superoxide radical inhibits catalase. J. Biol. Chem. 257:5751-5754, 1982. Kopkan, L.; Majid, D.S. Superoxide contributes to development of salt sensitivity and hypertension induced by nitric oxide deficiency. Hypertension. 46:1026-31, 2005.
Referências Bibliográficas
90
Kopkan, L.; Cervenka, L. Renal interactions of renin-angiotensin system, nitric oxide and superoxide anion: implications in the pathophysiology of salt-sensitivity and hypertension. Physiol Res. 58:S55-67, 2009. Kotchen, T.A.; Kotchen, J.M. Dietary sodium and blood pressure: interactions with other nutrients. Am J Clin Nutr. 65:708S-11S, 1997. Kotchen, T.A.; Reddy, S.; Zhang, H.Y. Increasing insulin sensitivity lowers blood pressure in the fructose-fed rat. Am J Hypertens. 10:1020-6, 1997. Kuboki, K.; Jiang, Z.Y.; Takahara, N.; Ha, S.W.; Igarashi, M.; Yamauchi, T.; Feener, E.P.; Herbert, T.P.; Rhodes, C.J.; King, G.L. Regulation of endothelial constitutive nitric oxide synthase gene expression in endothelial cells and in vivo: a specific vascular action of insulin. Circulation. 101:676-681, 2000. Kunde, S.K.; Roede, J.R.; Vos, M.B.; Orr, M.L.; Go, Y-M.; Park, Y.; Ziegler, T.R.; Jones, D.P. Hepatic oxidative stress in fructose-induced fatty liver is not caused by sulfur amino acid insufficiency. Nutrients. 3:987-1002, 2011. Lakka, H.M.; Laaksonen, D.E.; Lakka, T.A.; Niskanem, L.K.; Kumpusalo, E.; Tuomilehto, J.; Salonen, J.T. The metabolic syndrome and total and cardiovascular disease mortality in middle-aged men. JAMA. 288:2709-2716, 2002. Laursen, J.B.; Rajagopalan, B.; Galis, Z.; Tarpey, M.; Freeman, B.A.; Harrison, D.G. Role of superoxide in angiotensin II-induced but not catecholamine-induced hypertension. Circulation. 95:58893, 1997. Law, M.R.; Frost, C.D.; Wald, N.J. By how much does dietary salt reduction lower blood pressure? III--Analysis of data from trials of salt reduction. BMJ. 6:819-24, 1991. Lê, K.A.; Faeh, D.; Stettler, R.; Ith, M.; Kreis. R; Vermathen, P.; Boesch, C.; Ravussin, E.; Tappy, L. A 4-wk high-fructose diet alters lipid metabolism without affecting insulin sensitivity or ectopic lipids in healthy humans. Am J Clin Nutr. 84:1374-1379, 2006. Lê, K.A.; Ith, M.; Kreis, R.; Faeh, D.; Bortolotti, M.; Tran, C.; Boesch, C.; Tappy, L. Fructose overconsumption causes dyslipidemia and ectopic lipid deposition in healthy subjects with and without a family history of type 2 diabetes. Am J Clin Nutr. 89:1760-5, 2009. Lee, M.K.; Miles, P.D.; Khoursheed, M.; Gao, K.M.; Moossa, A.R.; Olefsky, J.M. Metabolic effects of troglitazone on fructose-induced insulin resistance in the rat. Diabetes. 43:1435-1439, 1994. Lee, Y.; Yu, X.; Gonzales, F.; Mangelsdorf, D.J.; Wang, M.Y.; Richardson, C.; Witters, L.A.; Unger, R.H. PPAR alpha is necessary for the lipopenic action of hyperleptinemia on white adipose and liver tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 99:11848-11853, 2002. Lenda, D.M.; Sauls, B.A.; Boegehold, M.A. Reactive oxygen species may contribute to reduced endothelium-dependent dilation in rats fed high salt. Am J Physiol. 279:H7-H14, 2000. Levi, B.; Werman, M.J. Long-term fructose consumption accelerates glycation and several age-related variables in male rats. J Nutr. 128:1442-1449, 1998.
Referências Bibliográficas
91
Li, Y.; Xu, C.; Yu, C.; Xu, L.; Miao, M. Association of serum uric acid level with non-alcoholic fatty liver disease: a cross-sectional study. J Hepatol. 50:1029-1034, 2009. Liu, I.M.; Tzeng, T.F.; Liou, S.S. A chinese herbal decoction, Dang Gui Bu Xue Tang, prepared from Radix Astragali and Radix Angelicae sinensis, ameliorates insulin resistance induced by a high-fructose diet in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2011:248231, 2011. MacDonald, I.; Keyser, A.; Pacy, D. Some effects, in man, of varying the load of glucose, sucrose, fructose, or sorbitol on various metabolites in blood. Am J Clin Nutr. 31:1305-11, 1978. Mascioli, S.; Grimm, R. Jr.; Launer, C.; Svendsen, K.; Flack, J.; Gonzalez, N.; Elmer, P.; Neaton, J. Sodium chloride raises blood pressure in normotensive subjects. The study of sodium and blood pressure. Hypertension. 17:I21-6, 1991. Majid, D.S.A.; Said, K.E.; Omoro, S.A.; Navar, L.G. Nitric oxide dependency of arterial pressure-induced changes in renal interstitial hydrostatic pressure in dogs. Circ Res. 88:347-351, 2001. Makino, A.; Skelton, M.M.; Zou, A.P.; Roman, R.J.; Cowley, A.W.Jr. Increased renal medullary oxidative stress produces hypertension. Hypertension. 39:667-672, 2002. Malta, D.C.; Moura, L.; Souza, F.M.; Rocha, F.M.; Fernandes, F.M. Doencas crônicas não transmissíveis: mortalidade e fatores de risco no Brasil, 1990 a 2006. In: Saúde Brasil 2008 Ministério da Saúde, Brasília. 337-62, 2009. Manning, R.D.Jr.; Meng, S.; Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179:243-250, 2003. Marchesini, G.; Babini, M. Nonalcoholic fatty liver disease and the metabolic syndrome. Minerva Cardioangiol. 54:229-239, 2006. Marklund, S.; Marklund, G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 47:469-474, 1974. Martinez, F.J.; Rizza, R.A.; Romero, J.C. High-fructose feeding elicits insulin resistance, hyperinsulinism, and hypertension in normal mongrel dogs. Hypertension. 23:456-4, 1994. Masuo, K.; Kawaguchi, H.; Mikami, H.; Ogihara, T.; Tuck, M.L. Serum uric acid and plasma norepinephrine concentrations predict subsequent weight gain and blood pressure elevation. Hypertension. 42:474-80, 2003. Matlib, M.A. Role of sarcolemmal membrane sodium-calcium exchange in vascular smooth muscle tension. Ann N Y Acad Sci. 639:531-42, 1991. Matthews, D.R.; Hosker, J.P.; Rudenski, A.S.; Naylor, B.A.; Treacher, D.F.; Turner, R.C. Homeostasis model assessment: insulin resistance and β-cells function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia. 28:412-419, 1985. Mayes, P.A. Intermediary metabolism of fructose. Am J Clin Nutr. 58:754S-765S, 1993. Maxwell, S.R.J. Prospects for the use of antioxidant therapies. Drugs. 49:345-361, 1995.
Referências Bibliográficas
92
Mazzali, M.; Kanellis, J.; Han, L.; Feng, L.; Xia, Y-Y.; Chen, Q.; Kang, D-H.; Gordon, K.L.; Watanabe, S.; Nakagawa, T.; Lan, H.Y.; Johnson, R.J. Hyperuricemia induces a primary renal arteriolopathy in rats by a blood pressure- independent mechanism. Am J Physiol Renal Physiol. 282:F991-7, 2002. McManus, M.L.; Churchwell, K.B.; Strange, K. Regulation of cell volume in health and disease. N Engl J Med 333:1260-1267, 1995. Mellen, P.B.; Bleyer, A.J.; Erlinger, T.P.; Evans, G.W.; Nieto, F.J.; Wagenknecht, L.E.; Wofford, M.R.; Herrington, D.M. Serum uric acid predicts incident hypertension in a biethnic cohort: the atherosclerosis risk in communities study. Hypertension. 48:1037-42, 2006. Meng, S.; Cason, G.W.; Gannon, A.W.; Racusen, L.C.; Davis Manning Jr, R.D. Oxidative stress in Dahl salt-sensitive hypertension. Hypertension. 41:1346-1352, 2003. Mertens, A.; Holvoet, P. Oxidized LDL and HDL: antagonists in atherogenesis. FASEB J. 15:2073-2084, 2001. Miller, C.C.; Martin, R.J.; Whitney, M.L.; Edwards, G.L. Intracerebroventricular injection of fructose stimulates feeding in rats. Nutr Neurosci. 5:359-362, 2002. Miller, A., Adeli, K. Dietary fructose and the metabolic syndrome. Current Opinion in Gastroenterology. 24:204-209, 2008. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Indicadores de mortalidade. Brasil: Ministério da Saúde; 2009. Mitchell, J.B.; Samuni, A.; Krishna, M.C.; DeGraff, W.G.; Ahn, M.S.; Samuni, U.; Russo, A. Biologically active metal-independent superoxide dismutase mimics. Biochemistry. 29:2802-2807, 1990. Mohan, S.; Campbell, N.R.C. Salt and high blood pressure. Clin Sci. 117:1-11, 2009. Monteiro, C.A.; Mondini, I.; Costa, R.B.L. Mudanças na composição e adequação nutricional da dieta familiar nas áreas metropolitanas do Brasil (1988-1996). Rev Saúde Pública. 34: 251-8, 2000. Mooradian, A.D.; Chehade, J.; Hurd, R.; Haas, M.J. Monosaccharide enriched diets cause hyperleptinemia without hypophagia. Nutrition. 16:439-441, 2000. Motoyama, C.S.M.; Pinto, M.J.S.; Lira, F.S.; Ribeiro, E.B.; do Nascimento, C.M.O.; Oyama, L.M. Gum Guar fiber associated with fructose reduces serum triacylglycerol but did not improve the glucose tolerance in rats. Diabetol Metab Syndr. 2:61, 2010. Mueller, W.M.; Gregoire, F.M.; Stanhope, K.L.; Mobbs, C.V.; Mizuno, T.M.; Warden, C.H.; Stern, J.S.; Havel, P.J. Evidence that glucose metabolism regulates leptin secretion from cultured rat adipocytes. Endocrinology. 139:551-558, 1998. Mulè, G.; Nardi, E.; Cottone, S.; Cusimano, P. Influence of metabolic syndrome on hypertension-related target organ damage. J Intern Med. 257:503-513, 2005.
Referências Bibliográficas
93
Nagai, Y.; Nishio, Y.; Nakamura, T.; Maegawa, H.; Kikkawa, R.; Kashiwagi, A. Amelioration of high fructose-induced metabolic derangements by activation of PPARα. Am J Physiol Endocrinol Metab. 282:E1180-E1190, 2002. Nakagawa, T.; Hu, H.; Zharikov, S.; Tuttle, K.R.; Short, R.A.; Glushakova, O.; Ouyang, X.; Feig, D.I.; Block, E.R.; Herrera-Acosta, J.; Patel, J.M.; Johnson, R.J. A causal role for uric acid in fructose-induced metabolic syndrome. Am J Physiol. 290:F625-F631, 2006. Nakanishi, N.; Okamoto, M.; Yoshida, H.; Matsuo, Y.; Suzuki, K.; Tatara, K. Serum uric acid and risk for development of hypertension and impaired fasting glucose or type II diabetes in Japanese male office workers. Eur J Epidemiol. 18:523-30, 2003. Nandhini, A.T.A.; Thirunavukkarasu, V.; Ravichandran, M.K.; Anuradha, C.V. Effect of taurine on biomarkers of oxidative stress in tissues of fructose-fed insulin-resistant rats. Singapore Med J. 46:82-87, 2005. Nguyen, S.; Choi, H.K.; Lustig, R.H.; Hsu, C-Y. Sugar sweetened beverages, serum uric acid, and blood pressure in adolescents. J Pediatr. 154:807-813, 2009. Nieto, F.J.; Iribarren, C.; Gross, M.D.; Comstock, G.W.; Cutler, R.G. Uric acid and serum antioxidant capacity: a reaction to atherosclerosis? Atherosclerosis. 148:131-9, 2000. Nishimoto, Y.; Tomida, T.; Matsui, H.; Ito, T.; Okumura, K. Decrease in renal medullary endothelial nitric oxide synthase of fructose-fed, salt-sensitive hypertensive rats. Hypertension. 40:190-194, 2002. Nkabyo, Y.S.; Gu, L.H.; Jones, D.P.; Ziegler, T.R. Thiol/disulfide redox status is oxidized in plasma and small intestinal and colonic mucosa of rats with inadequate sulfur amino acid intake. J Nutr. 136:1242-1248, 2006. Núñez, J.; Miñana, G.; Bodí, V.; Núñez, E.; Sanchis, J.; Husser, O.; Liàcer, A. Low lymphocyte count and cardiovascular diseases. Curr Med Chem. 18:3226–3233, 2011. Oda, A.; Bannai, C.; Yamoka, T.; Katori, T.; Matsushima, T.; Yamashita, K. Inactivation of Cu-Zn. SOD by in vitro glycosylation in erythrocytes of diabetic patients. Horm Metab Res. 26:1-4, 1994. Ogihara, T.; Asano, T.; Ando, K.; Sakoda, H.; Anai, M.; Shojima, N.; Ono, H.; Onishi, Y.; Fujishiro, M.; Abe, M.; Fukushima, Y.; Kikuchi, M.; Fujita, T. High-salt diet enhances insulin signaling and induces insulin resistance in Dahl salt-sensitive rats. Hypertension. 40:83-9, 2002. Ohashi, N.; Katsurada, A.; Miyata, K.; Satou, R.; Saito, T.; Urushihara, M.; Kobori, H. Role of activated intrarenal reactive oxygen species and rennin-angiotensin system in IgA nephropathy model mice. Clin Exp Pharmacol Physiol. 36:750-755, 2009. Oigman, W. O papel do sistema renina-angiotensina aldosterona no desenvolvimento da hipertensão arterial associada à obesidade. Rev Bras Hipertens. 2:142-8, 2000. Ortiz, P.A.; Garvin, J.L. Interaction of O(2)(-) and NO in the thick ascending limb. Hypertension. 39:591-596, 2002.
Referências Bibliográficas
94
Osei, K.; Bossetti, B. Dietary fructose as a natural sweetener in poorly controlled type 2 diabetes: a 12-month crossover study of effects on glucose, lipoprotein and apolipoprotein metabolism. Diabet Med. 6:506-11, 1989. Ouyang, X.; Cirillo, P.; Sautin, Y.; McCall, S.; Bruchette, J.L.; Diehl, A.M.; Johnson, R.J.; Abdelmalek, M.F. Fructose consumption as a risk factor for non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 48:993-999, 2008. Pacher, P.; Beckman, J.S.; Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87:315-424, 2007. Pagliassotti, M.J.; Prach, P.A.; Koppenhafer, T.A.; Pan, D.A. Changes in insulin action. Triglycerides, and lipid composition during sucrose feeding in rats. Am J Physiol. 271:R1319-1326, 1996. Paolisso, G.; Giagliano, D. Oxidative stress and insulin action. Is there a relationship? Diabetologia. 39:357-363, 1996 Paravicini, T.M.; Touyz, R.M. Redox signaling in hypertension. Cardiovasc Res. 71:247-58, 2006. Park, Y.K.; Yetley, E.A. Intakes of food sources of fructose in the United States. Am J Clin Nutr. 58:737S-747, 1993. Patterson, M.E.; Mouton, C.R.; Mullins, J.J.; Mitchell, K.D. Interactive effects of superoxide anion and nitric oxide on blood pressure and renal hemodynamics in transgenic rats with inducible malignant hypertension. Am J Physiol Renal Physiol. 289:F754-F759, 2005. Pires, P.W.; Deutsch, C.; McClain, J.L.; Rogers, C.T.; Dorrance, A.M. Tempol, a superoxide dismutase mimetic, prevents cerebral vessel remodeling in hypertensive rats. Microvasc Res. 80:445-52, 2010. Pontis, H.G.; Fischer, C.L. Synthesis of D-fructopyranose 2-phosphate and D-fructofuranose 2-fhosphate. Biochem J. 89:452-9, 1963. Prada, P.; Okamoto, M.M.; Furukawa, L.N.; Machado, U.F.; Heimann, J.C.; Dolnikoff, M.S. High- or low-salt diet from weaning to adulthood: effect on insulin sensitivity in Wistar rats. Hypertension. 35:424-9, 2000. Preiss, D.; Sattar, N. Non-alcoholic fatty liver disease: an overview of prevalence, diagnosis, pathogenesis and treatment considerations. Clin Sci. 115:141-150, 2008. Preti, S.C.; da Cunha, V.; Vassallo, D.V.; Stefanon, I. The superoxide dismutase mimetic, tempol, reduces the bioavailability of nitric oxide and does not alter L-NAME-induced hypertension in rats. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 97:29-34, 2005. Rajagopalan, S.; Kurz, S.; Munzel, T.; Tarpey, M.; Freeman, B.A.; Griendling, K.K.; Harrison, D.G. Angiotensin II-mediated hypertension in the rat increases vascular superoxide production via membrane NADH/NADPH oxidase activation. Contribution to alterations of vasomotor tone. J Clin Invest. 97:1916-1923, 1996. Rao, G.N.; Corson, M.A.; Berk, B.C. Uric acid stimulates vascular smooth muscle cell proliferation by increasing platelet-derived growth factor A-chain expression. J Biol Chem. 266:8604-8, 1991.
Referências Bibliográficas
95
Rapp, J.P.; Wang, S.M.; Dene, H. A genetic polymorphism in the renine gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243:542-543, 1989. Rattigan, S.; Clark, M.G.; Barrett, E.J. Acute vasoconstriction-induced insulin resistance in rat muscle in vivo. Diabetes. 48:564-569, 1999. Reaven, G.M.; Chang, H. Relationship between blood pressure, plasma insulin and triglyceride concentration, and insulin action in spontaneous hypertensive and Wistar-Kyoto rats. Am J Hypertens. 4:34-38, 1991. Reaven, G.M. Abnormalities of carbohydrate and lipoprotein metabolism in patients with hypertension. Relationship to obesity. Ann Epidemiol. 1:305-311, 1991. Reaven, G.M. Banting lecture 1988. Role of insulin resistance in human disease. Diabetes. 37:1595-1607, 1988. Reeves, P.G.; Nielsen, F.H.; Fahey, G.C.Jr. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition and hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr. 123:1939-51, 1993. Reiser, S.; Powell, A.S.; Scholfield, D.J.; Panda, P.; Ellwood, K.C.; Canary, J.J. Blood lipids, lipoproteins, apoproteins, and uric acid in men fed diets containing fructose or high-amylose cornstarch. Am J Clin Nutr. 49:832-9, 1989. Ren, Y.; Carretero, O.A.; Garvin, J.L. Mechanism by which superoxide potentiates tubuloglomerular feedback. Hypertension. 39:624-628, 2002. Roberts, T.J.M.; Chapman, A.C.; Cipolla, M.J. PPAR-γ agonist rosiglitazone reverses increased cerebral venous hydraulic conductivity during hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297:H1347-H1353, 2009. Rocchini, A.P.; Key, J.; Bondie, D.; Chico, R.; Moorehead, C.; Katch, V.; Martin, M. The effect of weight loss on the sensitivity of blood pressure to sodium in obese adolescents. N Engl J Med. 321:5805- 85, 1989. Roglans, N.; Vila, L.; Farre, M.; Alegret, M.; Sanchez, R.M.; Vazquez-Carrera, M.; Laguna, J.C. Impairment of hepatic Stat-3 activation and reduction of PPARalpha activity in fructose-fed rats. Hepatology. 45:778-788, 2007. Rosenblat, M.; Karry, R.; Aviram, M. Paraoxonase 1 (PON1) is a more potent antioxidant and stimulant of macrophage cholesterol efflux when present in HDL than in lipoprotein-deficient serum: relevance to diabetes. Atherosclerosis. 187:74-81, 2006. Rosón, M.I.; Dellsa Penna, S.L.; Cao, G.; Gorzalczany, S.; Pandolfo, M.; Toblli, J.E.; Fernández, B.E. Different protective actions of losartan and tempol on the renal inflammatory response to acute sodium overload. J Cell Physiol. 224:41-48, 2010. Ross, A.P.; Bartness, T.J.; Mielke, J.G.; Parent, M.B. A high fructose diet impairs spatial memory in male rats. Neurobiol Learn Mem. 92:410-6, 2009.
Referências Bibliográficas
96
Rutledge, A.C.; Adeli, K. Fructose and the metabolic syndrome: pathophysiology and molecular mechanisms. Nutr Rev. 65:S13-23, 2007. Samuni, A.; Winkelsberg, D.; Pinson, A.; Hahn, S.M.; Mitchell, J.B.; Russo, A. Nitroxide stable radicals protect beating cardiomyocytes against oxidative damage. Clin Invest. 87:1526-1530, 1991. Satoh, M.; Fujimoto, S.; Haruna, Y.; Arakawa, S.; Horike, H.; Komai, N.; Sasaki, T.; Tsujioka, K.; Makino, H.; Kashihara, N. NAD(P)H oxidase and uncoupled nitric oxide synthase are major sources of glomerular superoxide in rats with experimental diabetic nephropathy. Am J Physiol. 288:F1144-F1152, 2005. Sautin, Y.; Nakagawa, T.; Zharikov, S.; Johnson, R.J. Adverse effects of the classic antioxidant uric acid in adipocytes: NADPH oxidase-mediated oxidative/nitrosative stress. Am J Physiol Cell Physiol. 293:C58-96, 2007. Sánchez-Lozada, L.G.; Tapia, E.; Jimenez, A.; Batista, P.; Cristóbal, M.; Nepomuceno, T.; Soto, V.; Ávila-Casado, C.; Nakagawa, T.; Johnson, R.J.; Herrera-Acosta, J.; Franco, M. Fructose-induced metabolic syndrome is associated with glomerular hypertension and renal microvascular damage in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 292:F423-F429, 2007. Sánchez-Lozada, L.G.; Tapia, E.; Batista-Garcia, P.; Soto, V.; Avila-Casado, C.; Vega-Campos, I.P.; Nakagawa, T.; Zhao, L.; Franco, M.; Johnson, R.J. Effects of febuxostat on metabolic and renal alterations in rats with fructose-induced metabolic syndrome. Am J Physiol. 294:F710-F718, 2008. Santuré, M.; Pitre, M.; Marette A.; Deshaies, Y.; Lemieux, C.; Lariviere, R.; Nadeau, A.; Bachelard. H. Induction of insulin resistance by high-sucrose feeding does not raise mean arterial blood pressure but impairs haemodynamic responses to insulin in rats. Br J Pharmacol. 137:185-196, 2002. Sartorio, A.; Del, C.A.; Agosti, F.; Mazzilli, G.; Bellentani, S.; Tiribelli, C.; Bedogni, G. Predictors of nonalcoholic fatty liver disease in obese children. Eur J Clin Nutr. 61:877-883, 2007. Scherrer, U.; Randin, D.; Vollenweider, P.; Vollenweider, L.; Nicod, P. Nitric oxide release accounts for insulin’s vascular effects in humans. J Clin Invest. 94:2511-2515, 1994. Schnackenberg, C.G.; Welch, W.J.; Wilcox, C.S. Normalization of blood pressure and renal vascular resistance in SHR with a membrane permeable superoxide dismutase mimetic: role of nitric oxide. Hypertension. 32:59-64, 1998. Schnackenberg, C.G.; Wilcox, C.S. Two-week administration of tempol attenuates both hypertension and renal excretion of 8-Iso prostaglandin f2alpha. Hypertension. 33:424-8, 1999. Schnackenberg, C.G.; Wilcox, C.S. The SOD mimetic tempol restores vasodilation in afferent arterioles of experimental diabetes. Kidney Int. 59:1859-1864, 2001. Scholz, G.H. Englaro, P.; Thiele, I.; Scholz, M.; Klusmann, T.; Kellner, K.; Rascher, W.; Blum, W.F. Dissociation of serum leptin concentration and body fat content during long term dietary intervention in obese individuals. Horm Metab Res. 28:718-723, 1996.
Referências Bibliográficas
97
Sharma, A.M.; Schorr, U.; Distler, A. Insulin resistance in young salt-sensitive normotensive subjects. Hypertension. 21:273-279, 1993. Shapiro, A.; Mu, W.; Roncal, C.; Cheng, K.Y.; Johnson, R.J.; Scarpace, P.J. Fructose-induced leptin resistance exacerbates weight gain in response to subsequent high-fat feeding. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295:R1370-5, 2008. Shin, M.O.; Moon, J.O. Effect of dietary supplementation of grape skin and seeds on liver fibrosis induced by dimethylnitrosamine in rats. Nutr Res Pract. 4:369-374, 2010. Shinozaki, K.; Kashiwagi, A.; Nishio, Y.; Okamura, T.; Yoshida, Y.; Masada, M.; Toda, N.; Kikkawa, R. Abnormal biopterin metabolism is a major cause of impaired endothelium-dependent relaxation through nitric oxide/O2- imbalance in insulin-resistant rat aorta. Diabetes. 48:2437-45, 1999. Shinozaki, K.; Nishio, Y.; Okamura, T.; Yoshida, Y.; Maegawa, H.; Kojima, H.; Masada, M.; Toda, N.; Kikkawa, R.; Kashiwagi, A. Oral administration of tetrahydrobiopterin prevents endothelial dysfunction and vascular oxidative stress in the aortas of insulin-resistant rats. Circ Res. 87:566-73, 2000. Shinozaki, K.; Kashiwagi, A.; Masada, M.; Okamura, T. Stress and vascular responses: Oxidative stress and endothelial dysfunction in the insulin-resistant state. J Pharmacol Sci. 91:187-91, 2003. Shinozaki, K.; Ayajiki, K.; Nishio, Y.; Sugaya, T.; Kashiwagi, A.; Okamura, T. Evidence for a causal role of the rennin angiotensin system in vascular dysfunction associated with insulin resistance. Hypertension. 43:255-262, 2004. Singh, A.K.; Amlal, H.; Haas P.J.; Dringenberg, U.; Fussell, S.; Barone, S.L.; Engelhardt, R.; Zuo, J.; Seidler, U.; Soleimani, M. Fructose-induced hypertension: essential role of chloride and fructose absorbing transporters PAT1 and Glut5. Kidney Intern. 74:438-447, 2008. Siu, Y.P.; Leung, K.T.; Tong, M.K.; Kwan, T.H. Use of allopurinol in slowing the progression of renal disease through its ability to lower serum uric acid level. Am J Kidney Dis. 47:51-9, 2006. Soleimani, M.; Alborzi, P. The role of salt in the pathogenesis of fructose-induced hypertension. Int J Nephrol. 2011:392708, 2011. Stamler, J.; Caggiula, A.; Grandits, G.A.; Kjelsberg, M.; Cutler, J.A. Relationship to blood pressure of combinations of dietary macronutrients. Findings of the Multiple Risk Factor Intervention Trial (MRFIT). Circulation. 15:2417-23, 1996. Stanhope, K.L.; Havel, P.J. Fructose Consumption: considerations for future research on its effects on adipose distribution, lipid metabolism, and insulin sensitivity in humans. J Nutr. 139:1236S-1241S, 2009. Steinberg, H.O.; Brechtel, G.; Johnson, A.; Fineberg, N.; Baron, A.D. Insulin-mediated skeletal muscle vasodilation is nitric oxide dependent. A novel action of insulin to increase nitric oxide release. J Clin Invest. 94:1172-1179, 1994. Steinberg, G.R.; Parolin, M.L.; Heigenhauser, G.J.; Dyck, D.J. Leptin increases FA oxidation in lean but not obese human skeletal muscle: evidence of peripheral leptin resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab. 283:E187-E192, 2002.
Referências Bibliográficas
98
Stenvinkel, P.; Ottosson-Seeberger, A.; Alvestrand, A. Renal hemodynamics and sodium handling in moderate renal insufficiency: the role of insulin resistance and dyslipidemia. J Am Soc Nephrol. 5:1751-60, 1995. Storlien, L.H.; Oakes, D.N.; Pan, D.A.; Kusunoki, M.; Jenkins, A.B. Syndromes of insulin resistance in the rat: inducement by diet and amelioration with benfluorex. Diabetes. 42: 457-462, 1993. Strazzullo, P.; D'Elia, L.; Kandala, N.B.; Cappuccio, F.P. Salt intake, stroke, and cardiovascular disease: meta-analysis of prospective studies. BMJ. 339:b4567, 2009. Sun, S.Z.; Flickinger, B.D.; Williamson-Hughes, P.S.; Empie, M.W. Lack of association between dietary fructose and hyperuricemia risk in adults. Nutr Metab. 1;7, 2010 Suzuki, M.; Nomura, C.; Odaka, H.; Ikeda, H. Effect of an insulin sensitizer, pioglitazone, on hypertension in fructose-drinking rats. Jpn J Pharmacol. 74:297-302, 1997. Taghibiglou, C.; Carpentier, A.; Van Iderstine, S.C.; Chen, B.; Rudy, D.; Aiton, A.; Lewis, G.F.; Adeli, K. Mechanisms of hepatic very low density lipoprotein overproduction in insulin resistance. Evidence for enhanced lipoprotein assembly, reduced intracellular ApoB degradation, and increased microsomal triglyceride transfer protein in a fructose-fed hamster model. J Biol Chem. 275:8416-8425, 2000. Takagawa, Y.; Berger, M.E.; Tuck, M.L.; Golub, M.S. Impaired endothelial alpha-2 adrenergic receptor-médiated vascular relaxation in the fructose-fed rat. Hypertens Res. 25:197-202, 2002. Teff, K.L.; Elliott, S.S.; Tschöp, M.; Kieffer, T.J.; Rader, D.; Heiman, M.; Townsend, R.R.; Keim, N.L.; D'Alessio, D.; Havel, P.J. Dietary fructose reduces circulating insulin and leptin, attenuates postprandial suppression of ghrelin, and increases triglycerides in women. J Clin Endocrinol Metab. 89:2963-72, 2004. ter Maaten, J.C.; Bakker, S.J.L.; Serné, E.H.; ter Wee, P.M.; Donker, A.J.M.; Gans, R.O.B. Insulin’s acute effects on glomerular filtration rate correlate with insulin sensitivity whereas insulin’s acute effects on proximal tubular sodium reabsorption correlate with salt sensitivity in normal subjects. Nephrol Dial Transplant. 14:2357-2363, 1999. Thornalley, P.J.; McLellan, A.C.; Lo, T.W.; Benn, J.; Sonksen, P.H. Negative association between erythrocyte reduced glutathione concentration and diabetic complications. Clin Sci. 5:575-582, 1996. Thorburn, A.W.; Storlein, L.H.; Jemkins, A.B.; Khouri, S.; Kraegen, E.W. Fructose-induced in vivo insulin resistance and elevated plasma triglyceride levels in rats. Am J Clin Nutr. 49:1155-63, 1989. Tian, N.; Moore, R.S.; Braddy, S.; Rose, R.A.; Gu, J.W.; Hughson, M.D.; Manning, R.D. Jr. Interactions between oxidative stress and inflammation in salt-sensitive hypertension. Am J Physiol. 293:H3388-3395, 2007. Tornheim, K.; Lowenstein, J.M. Control of phosphofructokinase from rat skeletal muscle. Effects of fructose diphosphate, AMP, ATP, and citrate. J Biol Chem. 251:7322-8, 1976.
Referências Bibliográficas
99
Touyz, R.M. Reactive oxygen species in vascular biology: role in arterial hypertension. Expert Rev Cardiovasc Ther. 1:91-106, 2003. Touyz, R.M. Reactive oxygen species and angiotensin II signaling in vascular cells - implications in cardiovascular disease. Braz J Med Biol Res. 37:1263-1273, 2004. Tran, L.T.; MacLeod, K.K.; McNeill, J.H. Chronic etanercept treatment prevents the development of hypertension in fructose-fed rats. Mol Cell Biochem. 330: 219-228, 2009. Turner, J.L.; Bierman, E.L.; Brunzell, J.D.; Chait, A. Effect of dietary fructose on triglyceride transport and glucoregulatory hormones in hypertriglyceridemic men. Am J Clin Nutr. 32:1043-1050, 1979. Ueno, M.; Bezerra, R.M.; Silva, M.S.; Tavares, D.Q.; Carvalho, C.R.; Saad, M.J. A high-fructose diet induces changes in pp185 phosphorylation in muscle and liver of rats. Braz J Med Biol Res. 33:1421-1427, 2000. Unger, B.; Patil, B.M. Apocynin improves endothelial function and prevents the development of hypertension in fructose fed rat. Indian J Pharmacol. 41:208-212, 2009. Uusitupa, M.I.J. Fructose in the diabetic diet. Am J Clin Nutr. 59:753-7S, 1994. Vasan, R.S.; Larson, M.G.; Leip, E.P.; Evans, J.C.; O'Donnell, C.J.; Kannel, W.B.; Levy, D. Impact of high-normal blood pressure on the risk of cardiovascular disease. N Engl J Med. 345:1291-7, 2001. Vasankari, T.J.; Vasankari, T.M. Effect of dietary fructose on lipid metabolism, body weight and glucose tolerance in humans. Scand J Food Nutr. 50:55-63, 2006. Van Schaftingen, E. The discovery and role of fructose-2,6-bisphosphatate. Acta Gastroenterol Belg. 51:141-6, 1988. Vasdev, S.; Gill, V.; Parai, S.; Longerich, L.; Gadag, V. Dietary vitamin E and C supplementation prevents fructose induced hypertension in rats. Mol Cell Biochem. 241:107-114, 2002. Vasdev, S.; Gill, V.; Longerich, L.; Parai, S.; Gadag, V. Salt-induced hypertension in WKY rats: prevention by α-lipoic acid supplementation. Mol Cell Biochem. 254:319-326, 2003. Vasdev, S.; Gill, V.; Parai, S.; Gadag V. Fructose induced hypertension in Wistar-Kyoto rats: interaction with moderately high dietary salt. Can J Physiol Pharmacol. 85:413-421, 2007. Verma, S.; Bhanot, S.; McNeill, J.H. Antihypertensive effects of metformin in fructose-fed hyperinsulinemic, hypertensive rats. J Pharmacol Exp Ther. 271:1334-1337, 1994. Xu, X.; Zhao, C.X.; Wang, L.; Tu, L.; Fang, X.; Zheng, C.; Edin, M.L.; Zeldin, D.C.; Wang, D.W. Increased CYP2J3 expression reduces insulin resistance in fructose-treated rats and db/db mice. Diabetes. 59:997-1005, 2010. Wang, D.D.; Sievenpiper, J.L.; de Souza, R.J.; Chiavaroli, L.; Ha, V.; Cozma, A.I.; Mirrahimi, A.; Yu, M.E.; Carleton, A.J.; Di Buono, M.; Jenkins, A.L.; Leiter, L.A.; Wolever, T.M.; Beyene, J.; Kendall, C.W.; Jenkins, D.J. The effects of fructose intake on serum uric acid vary among controlled dietary trials. J Nutr. 142:916-23, 2012.
Referências Bibliográficas
100
Ward, N.C.; Wu, J.H.; Clarke, M.W.; Puddey, I.B.; Burke, V.; Croft, K.D.; Hodgson, J.M. The effect of vitamin E on blood pressure in individuals with type 2 diabetes: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J. Hypertens. 25:227-234, 2007. Welch, W.J.; Blau, J.; Xie, H.; Chabrashvili, T.; Wilcox, C.S. Angiotensin-induced defects in renal oxygenation: role of oxidative stress. Am J Physiol. 288:H22-H28, 2005. Wexler, B.C.; Greenberg, B.P. Effect of increased serum urate levels on virgin rats with no arteriosclerosis versus breeder rats with preexistent arteriosclerosis. Metabolism. 26:1309-1320, 1977. Wexler, B.C. Allantoxan amide-induced myocardial necrosis in Sprague-Dawley vs spontaneously hypertensive rats. Proc Soc Exp Biol Med. 170:476-485, 1982. World Health Organization. Reducing Salt Intake in Populations: Report of a WHO Forum and Technical Meeting, 5–7 October 2006, Paris, France; WHO: Geneva, Switzerland, 2007. World Health Organization. Creating an enabling environment for population based salt reduction strategies: report of a Joint Technical Meeting held by WHO and FSA/UK. Genebra: World Health Organization; 2010. Widdowson, P.S.; Upton, R.; Buckingham, R.; Arch, J.; Williams, G. Inhibition of food response to intracerebroventricular injection of leptin is attenuated in rats with diet-induced obesity. Diabetes. 46:1782-1785, 1997. Wilcox, C.S.; Pearlman, A. Chemistry and antihypertensive effects of tempol and other nitroxides. Pharmacol Rev. 60:418-469, 2008. Wilcox, C.S.; Welch, W.J. Interaction between nitric oxide and oxygen radicals in regulation of tubuloglomerular feedback. Acta Physiol Scand. 168:119-124, 1999. Wilcox, C.S.; Welch, W.J. Interaction between nitric oxide and oxygen radicals in regulation -of tubuloglomerular feedback. Acta Physiol Scand. 168:119-124, 2000. Williams, B. The year in hypertension. JACC. 55:66-73, 2010. Wright, E. Jr.; Scism-Bacon, J.L.; Glass, L.C. Oxidative stress in type 2 diabetes: the role of fasting and postprandial glycaemia. Int J Clin Pract. 60:308-314, 2006. Wu, S.Q.; Hopfner, R.L.; McNeill, J.R.; Wilson, T.W.; Gopalakrishnan, V. Altered paracrine effect of endothelin in blood vessels of the hyperinsulinemic, insulin resistant obese Zucker rat. Cardiovasc Res. 45:994-1000, 2000. Yelinova, V.I.; Khramtsov, V.V.; Markel, A.L. Manifestation of oxidative stress in the pathogenesis of arterial hypertension in ISIAH rats. Biochem Biophys Res Commun. 263: 450-453, 1999. Yin Q-Q.; Pei, J-J.; Xu, S.; Luo, D-Z.; Dong, S-Q.; Sun, M-H.; You, L.; Sun, Z-J.; Xue-Ping Liu X-P. Pioglitazone improves cognitive function via increasing insulin sensitivity and strengthening antioxidant defense system in fructose-drinking insulin resistance rats. PLoS One. 8:e59313, 2013.
Referências Bibliográficas
101
Yu, B.P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species. Physiol Rev. 74:139-162, 1994. Zalba, G.; San José, G., Moreno, M.U.; Fortuño, M.A.; Fortuño, A.; Beaumont, F.J.; Díez, J. Oxidative stress in arterial hypertension role of NADPH oxidase. Hypertension. 38:1395-1399, 2001. Zare, F.; Magnusson, M.; Bergström, T.; Brisslert, M.; Josefsson, E.; Karlsson, A.; Tarkowski, A. Uric acid, a nucleic acid degradation product, down-regulates dsRNA-triggered arthritis. J Leukoc Biol. 79:482-488, 2006. Zavaroni, I.; Coruzzi, P.; Bonini, L.; Mossini, G.L.; Musiari, L.; Gasparini, V.; Fantuzzi, M.; Reaven, G.M. Association between salt sensitivity and insulin concentrations in patients with hypertension. Am J Hypertens. 8:855-858, 1995. Zhao, C.X.; Xu, X.; Cui, Y.; Wang, P.; Wei, X.; Yang, S.; Edin, M.L.; Zeldin, D.C.; Wang, D.W. Increased endothelial nitric-oxide synthase expression reduces hypertension and hyperinsulinemia in fructose-treated rats. J Pharmacol Exp Ther. 328:610-20, 2009. Zou, A.P.; Li, N.; Cowley, A.W. Production and actions of superoxide in the renal medulla.
Hypertension. 37: 547-553, 2001.
Anexos
102
Anexos
Anexo 1: Contribuição científica Artigos publicados
Dornas WC, Silva ME. Animal models for the study of arterial hypertension. Journal of Biosciences. 36(4):731–737, 2011.
Dornas WC, Lima, WG, dos Santos RC, de Souza MO, Silva M, Diniz MF, Silva ME, Salt overload in fructose-fed insulin-resistant rats decreases paraoxonase-1 activity. Nutrition & Metabolism. 9:63, 2012.
Dornas WC, Lima, WG, dos Santos RC, Guerra JF, de Souza MO, Silva M, Silva LS, Diniz MF, Silva ME. High dietary salt decreases antioxidant defenses in the liver of fructose-fed insulin-resistant rats. Journal of Nutritional Biochemistry. 24:2016–2022, 2013.
Artigo aceito
Dornas WC, Lima, Silva M, Tavares R, Lima, WG, dos Santos RC, Pedrosa ML, Silva ME. Efficacy of the superoxide dismutase mimetic tempol in animal hypertension models: a meta-analysis. Journal of Hypertension.
Anexos
103
Anexo 2: Protocolos de dosagens bioquímicas Kits Labtest Ácido úrico – referência 73 Albumina – referência 19 Colesterol-HDL – referência 13 Colesterol total – referência 76 Creatinina – referência 96 Fosfatase alcalina – referência 79 Glicose – referência 85 Proteínas totais – referência 99 Transaminase oxalacética (AST) – referência 52 Transaminase pirúvica (ALT) – referência 53 Triglicérides (Triacilglicerol) – referência 87 Ureia – referência 27 Crystal Chem Downers Grove IL e Rat Leptin ELISA Kit, Linco Research Insulina - Catálogo #90060 Leptina - Catálogo #90040
Animal models for the study of arterial hypertension
WALESKA C DORNAS1and MARCELO E SILVA2,*
1Research in Biological Sciences - NUPEB, 2Department of Foods, School of Nutrition, Ouro Preto University,Minas Gerais, Brazil
*Corresponding author (Fax, +55-31-35591828; Email, [email protected])
Hypertension is one of the leading causes of disability or death due to stroke, heart attack and kidney failure. Becausethe etiology of essential hypertension is not known and may be multifactorial, the use of experimental animal modelshas provided valuable information regarding many aspects of the disease, which include etiology, pathophysiology,complications and treatment. The models of hypertension are various, and in this review, we provide a brief overviewof the most widely used animal models, their features and their importance.
[Dornas WC and Silva ME 2011 Animal models for the study of arterial hypertension. J. Biosci. 36 731–737] DOI 10.1007/s12038-011-9097-y
1. Introduction
Owing to the high occurrence of hypertension and problemsoriginating from this disease over the years, a series ofexperimental models have been developed (Doggrell andBrown 1998). The use of relevant models to mimic humancardiovascular disease may offer useful information byallowing an understanding of the cause and progression ofthe disease status as well as potential therapeutic interven-tions (Badyal et al. 2003). However, an effective study ofparticular cardiovascular alterations emerging in the courseof the developmental process requires the use of adequateanimal models. Accordingly, it should be mentioned thateach one of the studied models involves a different role inthe development of the disease (Fazan et al. 2001).
2. Genetic hypertension
2.1 Spontaneously hypertensive rat
Spontaneously hypertensive rats (SHRs) were originallyinbred from Wistar rats and their Wistar–Kyoto (WKY)
inbred non-hypertensive controls (Okamoto and Aoki1963). These rats develop hypertension at about 4–6 weeksof age without physiological, pharmacological or surgicalintervention (Zicha and Kunes 1999); however, environ-mental factors affect the development of hypertension, andthe importance of this model has been attributed to thesimilarity of its pathophysiology with essential hypertensionin humans (Trippodo and Frohlic 1981).
In vivo studies have shown that in the early stages ofhypertension, SHRs have an increased cardiac output withnormal total peripheral resistance. As the SHR progressesinto the established hypertension state, the cardiac outputreturns to normal values and the hypertrophied bloodvessels produce an increase in the total peripheralresistance (Smith and Hutchins 1979). With the advanceof hypertension, the SHR progressively develops (between6 and 24 months of age) structural alterations in the heart,which are associated with progressive cardiac hypertrophy(Engelmann et al. 1987). As this is not a strictly inbredstrain, individual variations in the genetic background ofboth SHR and particularly of their control strain maysignificantly influence the resulting end-organ changes,what can be seen in figure 1.
http://www.ias.ac.in/jbiosci J. Biosci. 36(4), September 2011, 731–737, * Indian Academy of Sciences 731
Keywords. Blood pressure; cardiovascular disease; experimental models; hypertension
Abbreviations used: ANG II, angiotensin II; BHR, borderline hypertensive rat; CBF, cerebral blood flow; DOCA,11-desoxycorticosterone acetate; DR, Dahl salt-resistant rat; DS, Dahl salt-sensitive rat; EDCF, endothelium-derived constricting factor;EDRF, endothelium-derived relaxing factor; HR, heart rate; LV, left ventricle; MAP, mean arterial pressure; PRA, plasma rennin activity ;RAAS, rennin–angiotensin–aldosterone system; ROS, reactive oxygen species; RSNA, renal sympathetic nerve activity; SAD, sinoaorticbaroreceptors ; SHR, spontaneously hypertensive rat; SHRSP, stroke-prone spontaneously hypertensive rat; SOD, superoxide dismutase ;WKY, Wistar–Kyoto
Review
Stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP),bred from SHR developed with even higher levels of BPand a strong tendency to die from stroke, are extremeexamples of cerebrovascular lesions developing spontane-ously in animal models (Okamoto et al. 1974). It is the mostutilized animal model of spontaneous stroke and is regardedas a unique animal model in which prevention of stroke canbe studied experimentally as the incidence of spontaneousoccurrence of stroke lesions in these models reach 80% inmales and 60% in females, with extensive cerebral arterio-sclerosis (Yamori 1989).
Because of the high mortality rate of stroke in humans,and of the similarity of stroke in SHRSP to that observed inhuman essential hypertension, this model has been appliedto studies of stroke in human beings (Yamori et al. 1976).Hypertrophy leads to increased vascular resistance (figure 1)and wall sheer rates. As blood vessels become lessfunctionally responsive and more extensively filled withatherosclerotic plaques, there is a risk for complicationssuch as cerebral hemorrhage, thrombosis, nephrosclerosisand myocardial lesions in SHRs and especially cerebrallesions in SHRSPs (Henning et al. 2010). Therefore, thesemodels can be used to study not only the pathogenesis andtherapy but also prophylaxis in essential hypertension andits complications.
2.2 Dahl salt-sensitive rats
Another model is the Dahl salt-sensitive rat (DS), originallyderived by Dahl from the Sprague–Dawley stock on thebasis of developing hypertension with a high NaCl diet.When fed normal salt diet, these rats become hypertensive,indicating that this is a genetic model of hypertension withthe feature of salt sensitivity. On the basis of theseconsiderations, Dahl et al. (1962) selected from endo-crossings of Sprague–Dawley rats and, on the basis ofpressure levels associated with a diet high in salt (8% NaCl),
two strains of animals: the Dahl salt-sensitive rats (DS) andthe Dahl salt-resistant ones (DR).
The DS animals develop a systemic arterial hypertensionafter ingesting a high-salt diet, while the DR animals canmaintain BP within normal limits even with the same diet.The mechanisms of genetic salt-sensitive hypertension ofthe Dahl strain rats are not yet fully known. In addition, DSrats are possibly insulin resistant even before hypertensionis fully established, and salt-sensitive models of hyperten-sion manifest a decrease in afferent arteriolar resistance anda rise in glomerular pressure in response to an increase inBP (Campese 1994). This could indicate that insulinresistance and hypertension may be inherited as separatetraits that develop in a parallel but independent manner(Channa et al. 2004).
Dahl salt-hypertensive rats are prone to hypertensivenephropathy (figure 1). Hypertensive glomerular lesionswere conventionally characterized by mesangial prolifera-tion, matrix accumulation and glomerulosclerosis, in addi-tion to endothelial dysfunction (Nagase et al. 2006).
2.3 Transgenic hypertension models
Transgenic hypertension models can be generated by over-expression of a specific gene. This is an excellent model tostudy the role of a specific gene in the pathogenesis ofhypertension. A representative of this type of hypertension isthe TGR(mREN2)27 transgenic rat developed by Mullinset al. (1990), which suppresses endogenous renal renin(Bader et al. 1992). TGR develops fulminant hypertension(200 to 260 mmHg mean systolic BP) beginning at the 5thweek of age, exhibits more myocyte hypertrophy and, only toa small extent, hyperplasia, and more endothelial dysfunctionthan age- and BP-matched SHR (Mullins et al. 1990).
Structural lesions of the nephron in TGR are moderate inboth sexes at an age of 4 months, except for an overallincrease in wall thickness of the larger arterioles and arteries
Hypertension
Decreased CBF
Salt-diet
Hypertrophy
Cerebral and myocardial lesions
TGR(mREN2)27 DSSHRSHRSP
Ischaemia
BHR
Renal damage
Impaired endothelium
Proteinuria clearance
EDRF EDCF
Metabolic syndrome
Glomerulosclerosis Tubulointersticial fibrosis
Cardiac failure Risk factor for sudden death
Vascular resistance
Vascular remodelling
Figure 1. End-organ damage as affected by different experimental genetic models of hypertension: Cerebral blood flow (CBF);endothelium-derived relaxing factor (EDRF) and endothelium-derived constricting factor (EDCF).
732 Waleska C Dornas and Marcelo E Silva
J. Biosci. 36(4), September 2011
(Bachmann et al. 1992). Although the model is notrepresentative of human hypertension, it does allow in vivoanalysis of the consequences of severe, monogeneticactivation of the Ras and allows identification of the typesof hypertensive damage that can be expected from anactivated Ras (figure 1).
2.4 Borderline hypertensive rat
Investigations using the borderline hypertensive rat (BHR)have demonstrated the important role genetic factors canplay in mediating both the behavioural and cardiovascularresponses to environmental stressors.
BHR is a genetic model of environmentally inducedhypertension and it is the first filial offspring of the SHRand the normotensive WKY rat, possessing genetic infor-mation from both parents (Sanders and Lawler 1992). Themechanisms by which environmental stress produces hy-pertension in BHR have not been identified. However, thesympathetic nervous system has been implicated. Increasesin plasma norepinephrine concentration during acute envi-ronmental stress have been observed in BHR, and changesin vascular reactivity induced by stress may contribute to thedifferential hemodynamic adaptations to stress observed inWKY rats and BHR (Fuchs et al. 1998). BHR arecharacterized by a high plasma concentration of vasopres-sin, exogenous vasopressin-induced hyperpressor action andcardiac hypertrophy (figure 1).
3. Renal hypertension
3.1 Renovascular hypertension
Since 1934, when Goldblatt and his coworkers induced anelevation of BP by partial constriction of the renal artery ofdog, many renal-induced models of hypertension have beensuccessfully established. Goldblatt’s technique consists ofconstricting one or both renal arteries by use of a smalladjustable silver clamp (Goldblatt et al. 1934). Generally,renal-induced experimental hypertension includes two-kidney one-clip hypertension (2K1C; constriction of onerenal artery while the contralateral kidney is left intact), one-kidney one-clip hypertension (1K1C; one renal artery isconstricted and the contralateral kidney is removed), andtwo-kidney two-clip hypertension (2K2C; constriction ofaorta or both renal arteries).
As the clip is not severe enough to cause ischaemia inthe 2K1C Goldblatt model, hypertension is induced byunilateral stenosis of the renal artery. However, thereduced renal perfusion pressure stimulates increasedrenin synthesis and angiotensin II (ANG II), via its directvascular effects, acutely increases total peripheral resis-
tance and raises BP and also has actions on almost everyorgan system (Guyton 1991).
Constricting the renal artery of the remaining kidney inuninephrectomized rats produces 1K1C Goldblatt hyperten-sion. This hypertensive model has been generally consid-ered to be sodium-fluid volume-dependent, and is an idealmodel for studying the role of volume expansion in thedevelopment of hypertension; owing to the absence of theother normal kidney, no compensatory increase in sodiumand water excretion can occur, and hence, fluid volume isretained (Liard et al. 1974).
When of the aorta or both renal arteries are constricted, thereis severe renal ischaemia caused by renal clipping, occasioningthe activation of renin-angiotensin and the sympatheticnervous system and the elevation of serum vasopressin,leading to increased BP (Suzuki et al. 1987). The 2K2C, witha high incidence of spontaneous stroke, can be used asSHRSP independent of a genetic deficiency. The lesionedsmall artery or arteriole with thrombotic occlusion is the maincause of cerebral infarction in 2K2C, and this may be similarto lacunar infarction in the human brain (Zeng et al. 1998).
3.2 Renoprival hypertension
Significant reduction of nephron mass by subtotal nephrec-tomy in experimental animals or by various diseases inhumans triggers a chain of events that lead to glomerulo-sclerosis, tubulointerstitial injury, proteinuria and progres-sion to end-stage renal disease (Quiroz et al. 2008).
Unilateral nephrectomy causes neither hypertension norcardiovascular lesions. However, hypertension caused byrenal arterial stenosis, exacerbated by high amounts ofprotein and salt in the diet and/or by high volumes of waterconsumed, as well as removal or not of the adrenal gland,can affect the severity of renoprival hypertension. Removalof one kidney and approximately two-thirds of the other isfollowed by a slow increase in BP. In these animals,intravascular volume increases and the resulting hyperten-sion may have the same pathogenesis as renoprivalhypertension (Ledingham and Pelling 1970). Since abilateral nephrectomy leads to hypertension with vascularlesions, especially if the animal’s life is prolonged after thecomplete removal of the kidneys (Ferrario et al. 2009).
4. Endocrine hypertension
4.1 Salt and mineralocorticoids
Mineralocorticoids cause retention of sodium and water inthe body until escape diuresis occurs due to increasedpressure on the kidneys and suppression of renin secretion.The renal effects of this model are similar to hyperaldoster-
Animal models in hypertension 733
J. Biosci. 36(4), September 2011
onism in humans. 11-desoxycorticosterone acetate (DOCA)and a high-salt diet cause increase of BP within 3 weeks inisolated perfused cortical collecting ducts, and can cause a30-fold increase in sodium absorption (Garwitz and Jones1982). Moreover, there is a reduced plasma rennin activity(PRA), which is expected in a model of volume-dependenthypertension, and oxidative stress also may be involved inDOCA salt hypertension by the increase of superoxideformation (Ortiz and Garvin 2001).
DOCA salt models progress quickly to severe hypertensionand hypertrophy and are therefore not suited for long-termstudies in chronic, stable disease; there should be minimalmortality due to the procedures alone. Thereby, the majorlimitations of the DOCA salt model are: (1) the pharmacolog-ical (large) doses of drug required, (2) the requirement forsurgical reduction of renal mass and (3) the ingestion of alarge amount of NaCl required. Moreover, it is not a veryrealistic model for many human hypertensive patients(Doggrell and Brown 1998).
4.2 Psychosocial and environment-induced hypertension
It has been reported that elevation of BP resulting fromrepeated exposure to stressful situations may lead to a stateof persistent hypertension (Smith and Hutchins 1979).
Several mechanisms such as the resetting of the barore-ceptor reflexes and structural autoregulation in the periph-eral vasculature may operate to sustain BP at a high levelonce it is raised, but these account less convincingly for theinitial elevation. However, if psychosocial factors areinvolved in the development of hypertension, they are likelyto be linked with the early, triggering stages of thepathophysiological sequence (Steptoe 1986).
Chronic social stress in a modern world represents animportant risk factor for the development of cardiovasculardisease. Its deleterious effects depend on the critical periodof exposure, duration and type, as all these factors may alterfunctions of the basic autoregulatory stress responsecomponents in the hypothalamic–pituitary–adrenal axis,sympathoadrenal medullar system, rennin–angiotensin–aldosterone system (RAAS) and sympathetic nervous system(Zimmerman and Frohlich 1990; McCarty and Gold 1996;Esch et al. 2002).
Different types of stress have been applied, such asemotional stimuli, psychosocial stress, immobilizationstress, food deprivation and electric stimuli, air jet noise,flashing lights, cold, and interaction of members of a socialgroup as they compete for food and water (Henry 1975;Friedman and Dahl 1975; Papanek et al. 1991; Henry et al.1993; Tucker and Hunt 1993; Bechtold et al. 2009).
5. Neurogenic hypertension
Evidence suggests that the central nervous system partic-ipates in the genesis of hypertension. Neurogenic hyperten-sion can be defined as a permanent increase in BP resultingfrom a primarily neural change. Denervation of sinoaorticbaroreceptors (SAD) is the neurogenic model of hyperten-sion most often used. The details of these control mecha-nisms have been studied by observing steady state changesin mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR) and renalsympathetic nerve activity (RSNA) at various times aftercomplete disruption of these reflexes (DiBona and Jones2001), and in association with other models to obtain aglobal analysis of the baroreceptor-sympathetic reflex(table 1).
Table 1. Association of baroreceptor denervation and other models of experimental hypertension
Baroreceptor denervation and angiotensin-II-induced hypertensionSustained decrease in RSNA during angiotensin II infusion is baroreflex mediated (Barrett et al. 2005).
Sinoaortic denervation and administration L-NAMEBaroreflexes play an important role in the long-term control of BP, and one mediator of this control is nitric oxide (Ramchandra et al. 2003).
Sinoaortic denervation in chronic one-kidney, one-clip hypertensiveCentral and peripheral components of the baroreflex are acting efficiently at higher BP when the aortic nerve is maximally stimulated orthe activity is abolished, suggesting that baroreceptor resetting may not be complete in chronic hypertension (Trindade et al. 2009).
Sinoaortic denervation and stress in BHRBaroreflex resetting prevents a fall in BP when cardiac output is reduced during stress (Hatton et al. 1997).
Sinoaortic denervation with unilateral nephrectomy and administered NaClVasopressin and neurogenic stimuli work together in somemanner to elevate vascular resistance in salt-induced hypertension (Ryuzaki et al. 1991).
Sinoaortic denervation and administered NaClBaroreceptor reflex is required to prevent chronic salt-induced increases in arterial pressure (Osborn and Provo 1992).
734 Waleska C Dornas and Marcelo E Silva
J. Biosci. 36(4), September 2011
In rats, SAD leads to marked and sustained increase inBP, and the increase of BP in rat is not accompanied by asmarked a tachycardia as that observed in dog (Krieger1964). Thus, an increase in MAP stimulates baroreceptorsand causes a reciprocal reduction in sympathetic outflow toresistance vessels and the heart so as to restore MAP to thenormal level and, therefore, cause neurogenic hypertension(Thrasher 2002).
6. Hypertension by chronic inhibition of nitric oxide
Nitric oxide (NO) plays an important role in regulatingsystemic vascular resistance by exerting a tonic vasodilatoreffect (Török 2008).
Chronic oral administration of an inhibitor of NO synthase,L-NAME, promoted a persistent hypertension associated withrenal injury, characterized by glomerulosclerosis, glomerularischaemia and interstitial infiltration in the kidney (Baylis et al.1992; Ribeiro et al. 1992). This hypertension is associatedwith intense peripheral vasoconstriction and the consequentincrease in peripheral vascular resistance. As for the cardiacoutput, some evidence seems to indicate a reduction evenduring chronic inhibition of NO synthase. A likelysympatho-excitatory action of central origin has also beenproposed by Biancardi et al. (2007), who showed thatvasoconstriction in response to L-NAME by the sympathetictone plays an important role in the initiation and maintenanceof hypertension.
In relation to cardiac abnormalities, the level of hyper-trophy in this model is relatively minor as compared withother models with similar BP levels. L-NAME-inducedpressure overload is associated with a distinct pattern of leftventricle (LV) remodelling characterized by a decrease inLV chamber size relative to wall thickness in the absence ofan increase in LV mass (Bartunek et al. 2000).
7. Hypertension induced by ANG II
ANG II is known to play an important role in the physiologicalregulation of vascular tone and BP and in pathologicalconditions such as hypertension and heart failure, althoughthe mechanisms by which ANG II chronically exerts its effectsremain unclear. ANG II, the final mediator of the RAS, plays apivotal physiological role in cardiovascular homeostasis. It is apotent vasoconstrictor of the peripheral vasculature andinduces growth of smooth muscle cells of blood vesselsand in the heart (Itoh et al. 1993).
This ANG II infusion rate does not cause immediateincreases in systemic BP but it rather leads to a slowlydeveloping hypertension over a period of 6–10 days. ANG-II-induced hypertension produces a presumably baroreflex-mediated sympathoinhibition corresponding to the increased
BP, but with the added challenge of increased dietary salt,the sympathetic nervous system does not respond to theincrease in pressure with the appropriate inhibition(McBryde et al. 2007).
8. Dietetically induced hypertension
It is known that long-term exposure to a special diet (highsalt, fat or sugar) results in dietary hypertension in someanimals or humans (Navarro-Cid et al. 1995; Kang et al.2004; Giani et al. 2009).
High-salt intake is able to decrease both plasma levelsand urinary excretion of nitrates (Fujiwara et al. 2000) andincreased superoxide production in both vasculature andkidney blockade by superoxide dismutase (SOD)-enhancedendothelium-dependent relaxation Roberts et al. (2000)demonstrated the presence of oxidative stress and inactiva-tion of NO in rats maintained on the high-fat or high-sugardiet, which may contribute to the development of hyperten-sion by enhanced generation of reactive oxygen species(ROS). The reduction in NO availability in the high-fat andhigh-sugar diet-fed animals was associated with marked saltsensitivity, as evidenced by a significant rise in BP on thehigh-salt diet (Roberts et al. 2003).
Dietary intake of fats and carbohydrate, particularly theintake of simple sugars and the resultant effects of plasmainsulin, adipokine and lipid concentrations, may affectcardiomyocyte size and function, especially with chronichypertension (Sharma et al. 2007). High fructose consump-tion by animals produces a model of the metabolicsyndrome with hypertension, hyperlipidaemia and insulinresistance, and this greatly accelerates progression ofchronic kidney disease (Gersch et al. 2007).
9. Concluding remarks
Animal models can lead to understanding of the interactionsof the principal regulatory factors in critical developmentalperiods of hypertension. Many of these models weredeveloped by using etiologic factors responsible for humanhypertension, although the cardiovascular response can bemore easily obtained in animals than in human studies.Thus, limitations are found for a direct and simplifiedapplication of these results, which suggests that there is noevidence to support that any experimental model ofhypertension exactly mimics all the symptoms of the humandisease. Furthermore, many researches have shown thatvariables such as duration of exposure to causal factors anddose, differences in animal species, gender as well as age ofthe animal at the beginning of exposure, and the techniquefor BP monitoring greatly differ amongst the studies andmay interfere with the results.
Animal models in hypertension 735
J. Biosci. 36(4), September 2011
In this sense we suggest that the various models shouldbe increasingly investigated, providing subsidies for newfindings in the pathogenesis of hypertension, with a rationaldiscussion about the advantages and disadvantages of eachexperimental model in order to allow the best choice for thestudy in question.
Acknowledgements
We are grateful to Dr Rinaldo Cardoso dos Santos for hiscritical reading of the manuscript.
References
Bachmann S, Peters J, Engler E, Ganten D and Mullins J 1992Transgenic rats carrying the mouse renin gene: morphologicalcharacterization of a low-renin hypertension model. Kidney Int.41 24–36
Bader M, Zhao Y, Sander M, Lee MA, Bachmann J, Böhm M,Djavidani B, Peters J, Mullins JJ and Ganten D 1992 Role oftissue renin in the pathophysiology of hypertension in TGR(mREN2)27 rats. Hypertension 19 681–686
Badyal DK, Lata H and Dadhich A P 2003 Animal models ofhypertension and effect of drugs. Indian J. Pharmacol. 35 349–362
Barrett C J, Guild S J, Ramchandra R, Malpas S C 2005Baroreceptor denervation prevents sympathoinhibition dur-ing angiotensin II-induced hypertension; Hypertension46 168–72
Bartunek J, Weinberg EO, Tajima M, Rohrbach S, Katz SE,Douglas PS and Lorell BH 2000 Chronic N G-Nitro-L-Arginine methyl ester-induced hypertension novel molecularadaptation to systolic load in absence of hypertrophy.Circulation 101 423–429
Baylis C, Mitruka B and Deng A 1992 Chronic blockade of nitricoxide synthesis in the rat produces systemic hypertension andglomerular damage. J. Clin. Invest. 90 278–281
Bechtold AG, Patel G, Hochhaus G and Scheuer D A 2009 Chronicblockade of hindbrain glucocorticoid receptors reduces bloodpressure responses to novel stress and attenuates adaptation torepeated stress. Am. J. Physiol.-Reg. I. 296 R1445–R1454
Biancardi VC, Bergamaschi CT, Lopes OU and Campos RR 2007Sympathetic activation in rats with L-NAME-induced hyper-tension. Braz. J. Med. Biol. Res. 40 401–408
Campese VM 1994 Salt sensitivity in hypertension: renal andcardiovascular implications. Hypertension 23 531–550
Channa ML, Somova L and Nadar A 2004 Facets of themetabolic syndrome in Dahl hypertensive rats. Cardiovas. J.S. Afr. 15 61–63
Dahl LK, Heine M and Tassinari L 1962 Role of genetic factors insusceptibility to experimental hypertension due to chronicexcess salt ingestion. Nature (London) 194 480–482
DiBona GF and Jones SY 2001 Dynamic analysis of renal nerveactivity responses to baroreceptor denervation in hypertensiverats. Hypertension 37 1153–1163
Doggrell SA and Brown L 1998 Rat models of hypertension,cardiac hypertrophy and failure. Cardiovasc. Res. 39 89–105
Engelmann GL, Vitullo JC and Gerrity RG 1987 Morphometricanalysis of cardiac hypertrophy during development, matura-tion, and senescence in spontaneously hypertensive rats.Circ. Res. 60 487–494
Esch T, Stefano GB, Fricchione GL and Benson H 2002 Stress incardiovascular diseases. Med. Sci. Monitor 8 RA93–RA101
Fazan R Jr, da Silva VJD and Salgado HC 2001 Modelos dehipertensão arterial. Braz. J. Hypertens. 8 19–29
Ferrario CM, Varagic J, Habibi J, Nagata S, Kato J, Chappell MC,Trask AJ, Kitamura K, Whaley-Connell A and Sowers JR 2009Differential regulation of angiotensin-(1-12) in plasma andcardiac tissue in response to bilateral nephrectomy. Am. J.Physiol.-Heart C. 296 H1184–H1192
Friedman R and Dahl LK 1975 The effect of chronic conflict onthe blood pressure of rats with a genetic susceptibility toexperimental hypertension. Psychosom. Med. 37 402–416
Fuchs LC, Hoque AM and Clarke NL 1998 Vascular and hemody-namic effects of behavioral stress in borderline hypertensive andWistar-Kyoto rats. Am. J. Physiol.-Reg. I. 274 R375–R382
Fujiwara N, Osanai T, Kamada T, Katoh T, Takahashi K andOkumuraK 2000 Study on the relationship between plasma nitrite and nitratelevel and salt sensitivity in human hypertension: modulation ofnitric oxide synthesis by salt intake. Circulation 101 856–861
Garwitz ET and Jones AW 1982 Aldosterone infusion into the ratand dose-dependent changes in blood pressure and arterial ionictransport. Hypertension 4 374–381
Gersch M S, Mu W, Cirillo P, Reungjui S, Zhang L, Roncal C,Sautin YY, Johnson RJ and Nakagawa T 2007 Fructose, but notdextrose, accelerates the progression of chronic kidney disease.Am. J. Physiol.-Renal. 293 F1256–F1261
Giani JF, Mayer MA, Muñoz MC, Silberman E A, Höcht C, TairaCA, Gironacci MM, Turyn D and Dominici FP 2009 Chronicinfusion of angiotensin-(1–7) improves insulin resistance andhypertension induced by a high-fructose diet in rats. Am. J.Physiol.-Endoc. M. 296 E262–E271
Goldblatt H, Lynch J, Hanzal RF and Summerville WW 1934The production of persistent elevation of systolic bloodpressure by means of renal ischemia. J. Exp. Med. 59 347–379
Guyton AC 1991 Blood pressure control–special role of thekidneys and body fluids. Science 252 1813–1816
Hatton D C, Brooks V, Qi Y, McCarron DA 1997 Cardiovascularresponse to stress: baroreflex resetting and hemodynamics. AmJ Physiol; 272 R1588–94
Henning EC, Warach S and Spatz M 2010 Hypertension-inducedvascular remodeling contributes to reduced cerebral perfusionand the development of spontaneous stroke in aged SHRSP rats.J. Cerebr. Blood F. Met. 30 827–836
Henry JP 1975 The induction of acute and chronic cardiovasculardisease in animals by psychosocial stimulation. Int. J. Psyc.Med. 6 147–158
Henry JP, Liu YY, Nadra WE, Qian CG, Mormede P, Lemaire V,Ely D and Hendley ED 1993 Psychosocial stress can inducechronic hypertension in normotensive strains of rats.Hypertension 21 714–723
Itoh H, Mukoyama M, Pratt RE, Gibbons GH and Dzau VJ 1993Multiple autocrine growth factors modulate vascular smoothmuscle cell growth response to angiotensin II. J. Clin. Invest.91 2268–2274.
736 Waleska C Dornas and Marcelo E Silva
J. Biosci. 36(4), September 2011
Kang DG, Moon MK, Sohn EJ, Lee DH and Lee HS 2004Effects of morin on blood pressure and metabolic changes infructose-induced hypertensive rats. Biol. Pharm. Bull. 271779–1783
Krieger EM 1964 Neurogenic hypertension in the rat. Circ. Res.15 511–521
Ledingham JM and Pelling D 1970 Haemodynamic and other studiesin the renoprival hypertensive rat. J. Physiol. 210 233–253
Liard JF, Cowley AW Jr, McCaa RE, McCaa CS and Guyton AC1974 Renin, aldosterone body fluid volumes and the barore-ceptor reflex in the development and reversal of Goldblatthypertension in conscious dogs. Circ. Res. 34 549–560
McBryde FD, Guild SJ, Barrett CJ, Osborn JW and Malpas SC2007 Angiotensin II-based hypertension and the sympatheticnervous system: the role of dose and increased dietary salt inrabbits. Exp. Physiol. 92 831–840
McCarty R and Gold PE 1996 Catecholamines, stress, and disease:a psychobiological perspective. Psychosom. Med. 58 590–597
Mullins JJ, Peters J and Ganten D 1990 Fulminant hyperten-sion in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene.Nature (London) 344 541–544
Nagase M, Shibata S, Yoshida S, Nagase T, Gotoda T and Fujita T2006 Podocyte injury underlies the glomerulopathy of Dahlsalt-hypertensive rats and is reversed by aldosterone blocker.Hypertension 47 1084–1093
Navarro-Cid J, Maeso R, Perez-Vizcaino F, Cachofeiro V,Ruilope LM, Tamargo J and Lahera V 1995 Effects oflosartan on blood pressure, metabolic alterations, andvascular reactivity in the fructose-induced hypertensive rat.Hypertension 26 1074–1078
Okamoto K and Aoki K 1963 Development of a strain ofspontaneously hypertensive rats. Jpn. Circulation J. 27 282–293
Okamoto K, Yamori Y and Nagaoka A 1974 Establishment ofstroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHR). Circ. Res.34/35 143–153
Ortiz PA and Garvin JL 2001 Intrarenal transport and vasoactivesubstances in hypertension. Hypertension 38 621–624
Osborn O W, Provo B J 1992 Salt-dependent hypertension in thesinoaortic-denervated rat; Hypertension 19 658–62
Papanek PE, Wood CE and Fregly MJ 1991 Role of thesympathetic nervous system in cold-induced hypertension inrats. J. Appl. Physiol. 71 300–306
Quiroz Y, Ferrebuz A, Romero F, Vaziri ND and Rodriguez-Iturbe B2008 Melatonin ameliorates oxidative stress, inflammation,proteinuria, and progression of renal damage in rats with renalmass reduction. Am. J. Physiol.-Renal. 294 F336–F344
Ramchandra R, Barrett C J, Malpas S C 2003 Chronic blockade ofnitric oxide does not produce hypertension in baroreceptordenervated rabbits; Hypertension 42 974–77
Ribeiro MO, Antunes E, De-Nucci G, Lovisolo SM and Zatz R1992 Chronic inhibition of nitric oxide synthesis: a new modelof arterial hypertension. Hypertension 20 298–303
Ryuzaki M, Suzuki H, Kumagai K, Kumagai H, Ichikawa M,Matsumura Y, Saruta T 1991 Role of vasopressin in salt-induced hypertension in baroreceptor-denervated uninephrec-tomized rabbits; Hypertension 17 1085–91
Roberts CK, Vaziri ND, Wang XQ and Barnard RJ 2000Enhanced NO inactivation an hypertension induced by ahigh-fat, refined-carbohydrate diet. Hypertension 36 423–429
Roberts CK, Vaziri ND, Sindhu RK and Barnard RJ 2003 A high-fat, refined carbohydrate diet affects renal NO synthase proteinexpression and salt sensitivity. J. Appl. Physiol. 94 941–946
Sanders BJ and Lawler JE 1992 The borderline hypertensive rat(BHR) as a model for environmentally-induced hypertension: areview and update. Neurosci. Biobehav. R. 16 207–217
Sharma N, Okere IC, Duda MK, Chess DJ, O’Shea KM andStanley WC 2007 Potential impact of carbohydrate and fatintake on pathological left ventricular hypertrophy. Cardiovasc.Res. 73 257–268
Smith TL and Hutchins PM 1979 Central hemodynamics in thedevelopmental stage of spontaneous hypertension in theunanesthetized rat. Hypertension 1 508–517
Steptoe A 1986 Stress mechanisms in hypertension. Postgrad. Med. J.62 697–699
Suzuki H, Saruta T, Ferrario CM and Brosnihan KB 1987Characterization of neurohormonal changes following theproduction of the benign and malignant phases of two-kidney,two-clip Goldblatt hypertension. Jpn. Heart J. 28 413–426
Thrasher TN 2002 Unloading arterial baroreceptors causesneurogenic hypertension. Am. J. Physiol.-Reg. I. 282R1044–R1053
Török J 2008 Participation of nitric oxide in different models ofexperimental hypertension. Physiol. Res. 57 813–825
Trindade Jr AS, Moreira ED, Silva GJJ and Krieger EM 2009Evidence that blood pressure remains under the control ofarterial baroreceptors in renal hypertensive rats. Braz. J. Med.Biol. Res. 42 954–57
Trippodo NC and Frohlic ED 1981 Similarities of geneticspontaneous hypertension. Circ. Res. 48 309–319
Tucker DC and Hunt RA 1993 Effects of long-term air jet noiseand dietary sodium chloride in borderline hypertensive rats.Hypertension 22 527–534
Yamori Y 1989 Predictive and preventive pathology of cardiovas-cular diseases. Acta Pathol. Japon. 39 683–705
Yamori Y, Horie R, Handa H, Sato M and Fukase M 1976Pathogenetic similarity of strokes in stroke-prone spontaneouslyhypertensive rats and humans. Stroke 7 46–53
Zeng J, Zhang Y, Mo J, Su Z and Huang R 1998 Two-kidney, twoclip renovascular hypertensive rats can be used as stroke-pronerats. Stroke 29 1708–1713
Zicha J and Kunes J 1999 Ontogenetic aspects of hypertensiondevelopment: analysis in the rat. Physiol. Rev. 79 1227–1282
Zimmerman RS and Frohlich ED 1990 Stress and hypertension.J. Hypertens. 8 S103–S107
MS received 21 January 2011; accepted 16 May 2011
ePublication: 16 August 2011
Corresponding editor: ASHIMA ANAND
Animal models in hypertension 737
J. Biosci. 36(4), September 2011
BRIEF COMMUNICATION Open Access
Salt overload in fructose-fed insulin-resistant ratsdecreases paraoxonase-1 activityWaleska Cláudia Dornas1, Wanderson Geraldo de Lima1,2, Rinaldo Cardoso dos Santos3, Melina Oliveira de Souza1,Maísa Silva1, Mirla Fiuza Diniz2 and Marcelo Eustáquio Silva1,3*
Abstract
Paraoxonase 1 (PON1) is a HDL-associated esterase/lactonase and its activity is inversely related to the risk ofcardiovascular diseases. The aim of the present study was to evaluate the effect of a high-salt diet on serum PON1activity in fructose-fed insulin-resistant rats. Adult male Fischer rats were initially divided into two groups. Control(CON), which received a normal salt diet and drinking water throughout the study; high fructose (HF), whichreceived a normal salt diet and 20% fructose supplemented drinking water. After 10 weeks, half of the animals fromHF group were randomly switched to a high-salt diet and 20% fructose supplemented drinking water (HFS) formore 10 weeks. Serum PON1 activity was determined by synthetic substrate phenyl acetate. HFS rats showedmarkedly decreased PON1 activity (HFS rats, 44.3 ± 14.4 g/dL versus CON rats, 64.4 ± 13.3 g/dL, P< 0.05) ascompared to controls. In parallel, the level of oxidative stress, as indicated by thiobarbituric acid reactive substances(TBARS), was increased in HFS rats by 1.2-fold in the liver in relation to controls and was negatively correlated withPON activity. Differential leukocyte counts in blood showed a significant change in lymphocytes and monocytesprofile. In conclusion, these results show that PON1 activity is decreased in fructose-fed insulin-resistant rats on ahigh-salt diet, which may be associated with increased oxidative stress, leading to inflammation.
Keywords: Fructose-fed rats, High-salt diet, Paraoxonase, Atherosclerosis
FindingsDiabetes is a long-term disorder affecting the inner wallsof arteries and is characterized by endothelial dysfunc-tion and oxidative modification of low density lipopro-tein (LDL) which may induce atherosclerosis [1]. Incontrast, it is supposed that LDL particles can be pro-tected from free radical-induced oxidation by an HDLlinked enzyme, paraoxonase 1 (PON1).Although the precise mechanism of PON1 effect is
not yet completely known, it may possess anti-atherogenic and anti-inflammatory properties, resultingfrom its ability to destroy modified phospholipids and toprevent accumulation of oxidized lipids in lipoproteins[2-5]. In diabetes experimental models, it has beenreported that PON1 enzymatic activity is decreased [6,7]
and reduced PON1 activity was suggested to play a rolein the severity of coronary atherosclerosis [2]. Nonethe-less, oxidative stress pathways have also been proposedto act in this process, with increased reactive oxygenspecies (ROS) production and/or impaired antioxidantdefense, which may in turn lead to excessive peroxida-tion of polyunsaturated fatty acids contained in LDLparticles.Our laboratory has recently reported that a hypercho-
lesterolemic diet in rats cause a significant reduction ofPON1 activity, associated with increased oxidative stress[8]. Once rats fed a high dose of fructose are considereda nutritional model for insulin resistance [9-11], thepresent study investigated the effects of a high-salt dietin fructose-fed insulin-resistant rats on PON1 and its in-fluence in serum and oxidative parameters. In additionthe influence of the diets on the inflammatory cells pro-file was also assessed.Twenty-nine Fisher male rats, weighing about 300 g,
obtained from the School of Nutrition of the FederalUniversity of Ouro Preto, were housed in a temperature
* Correspondence: [email protected] in Biological Sciences - NUPEB, Federal University of Ouro Preto,Minas Gerais, Brazil3Department of Foods, School of Nutrition, University of Ouro Preto, MinasGerais, BrazilFull list of author information is available at the end of the article
© 2012 Dornas et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the CreativeCommons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, andreproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63http://www.nutritionandmetabolism.com/content/9/1/63
and humidity controlled room with a 12:12-h light/darkcycle (lights on at 06.00 AM). Animals were initiallydivided into two groups. The control group (CON)received the standard AIN93 diet [12] and the highfructose-fed group (HF) was given supplemented fruc-tose as a 20% solution instead of pure water ad libitumto induce insulin resistance. After 10 weeks, HF animalswere divided into 2 groups: those that continued to re-ceive only 20% fructose in water and those switched tothe high fructose regimen+ 8% NaCl in the standardAIN93 diet (HFS). After 20 weeks fasting rats wereanesthetized and sacrificed. The experiments wereapproved by the institutional Ethics Committee withprotocol number 068/2011 and were performed in ac-cordance with the principles of the Brazilian College ofAnimal Experimentation [13].To determine the levels of serum components, blood
samples were collected in test tubes and centrifuged.Serum total protein, albumin, total cholesterol, HDL-cholesterol and triglyceride were assayed with colorimet-ric or enzymatic methods using commercially availablekits Labtest (Lagoa Santa, MG, Brazil) # 99, 19, 76, 13and 87, respectively. The atherogenic index was calcu-lated as follows: total cholesterol - HDL cholesterol/HDL cholesterol.PON activity was measured by a spectrophotometric
assay using phenyl acetate as substrate as described byBeltowski et al. [14]. The enzymatic activity was calcu-lated assuming the molar extinction coefficient of phe-nylacetate to be 1310 L . mol-1 . cm-1. The results wereexpressed in units per milliliter, where 1 U of arylester-ase hydrolyzes 1 mmol of phenylacetate per minute.Basal lipid peroxidation status was measured in the liverby TBARS assay [15].A drop of blood was used to prepare blood smears,
which were stained with Panotic Fast which use essentialcomponents dyes of Romanowsky [16]. Counts of 100leukocytes were performed and the results wereexpressed as subtypes identified in polymorphonuclear(PMN), lymphocyte or monocyte cells.The normality of the sample distribution for each con-
tinuous parameter was tested with the Kolmogorov-Smirnov test. The significance of any differences in pro-portions or medians was tested with Kruskal-Wallis test,and in means analysis of variance (ANOVA) was used,followed by Dunns and Tukey test, respectively. Pear-son’s correlation coefficients were used to test the cor-relation among variables. A p-value of less than 0.05 wasconsidered statistically significant.A high-salt diet in fructose-fed insulin-resistant rats
significantly decreased serum levels of total protein, al-bumin, total cholesterol and HDL-cholesterol after 20wk of treatment in relation the control group as demon-strated in Table 1. Fructose-fed rats showed significantly
higher triglyceride concentrations in both HF and HFSgroups (P< 0.05) as compared to control rats. Theatherogenic index of each experimental group was alsocalculated and increased 66% in HFS rats as comparedto controls. PON1 activity markedly fell to 68% in thoseanimals, as compared to control and HF rats (P< 0.05and P< 0.01, respectively) (Table 1).Increased oxidative stress was noted in the liver
obtained fromHFS rats, sinceTBARS levels were raised by1.2 times (P< 0.05) as compared to controls (Figure 1A).When data from all experimental groups were analyzedtogether, the effects of all treatments on serum PON1activity were positively correlated with total protein(r = 0.7728, P< 0.001) (Figure 1B), albumin (r = 0.8142,P< 0.001) (Figure 1C), total cholesterol (r = 0.6228, P< 0.001) (Figure 1D) and HDL-cholesterol (r = 0.6145,P< 0.001) (Figure 1E). In addition, a negative correl-ation was found between serum PON1 activity andliver TBARS levels (r =− 0.6262, P< 0.01) (Figure 1F).Differential leukocyte counts in the total blood smear
in insulin-resistant rats treated or not with the high-saltdiet showed a significant decrease in the lymphocyteprofile in relation to the control group, but the percent-age of polymorphonuclear cells (PMNs) remained un-changed. Salt treatment caused a significant increase inthe monocyte profile in HF and HFS rats as comparedto the CON rats (Table 2).In this study we observed a decrease in serum PON1
activity in insulin-resistant rats on a high-salt diet andan association among PON1, oxidative stress and in-flammation, which can occur during the development ofatherosclerosis.HDL is the most powerful independent negative pre-
dictor of cardiovascular events. The protective effects of
Table 1 Serum total protein, albumin, triglyceride, totalcholesterol, HDL-cholesterol, atherogenic index andPON1 activity of experimental rats after 20 weeks oftreatment
CON HF HFS
Number of rats/group 9 10 10
Total protein (g/dL) 7,0 ± 2,0a 6,3 ± 1,8a 4,9 ± 1,5b
Albumin (g/dL) 2,8 ± 0,2a 2,6 ± 0,3a 2,1 ± 0,2b
Triglyceride (mg/dL) 126,1 ± 30,8b 183,5 ± 58,7a 197,1 ± 55,9a
Total cholesterol (mg/dL) 97,9 ± 20,9a 98,0 ± 13,3a 69,3 ± 9,0b
HDL-cholesterol (mg/dL) 66,4 ± 10,6a 65,8 ± 9,4a 43,6 ± 12,17b
Atherogenic index 0,39 ± 0,12b 0,47 ± 0,11b 0,65 ± 0,26a
PON1 (g/dL) 64,45 ± 13,36a 65,44 ± 17,29a 44,3 ± 14,43b
Values (mean ± SD) were obtained from groups CON (AIN diet and water for20 weeks); HF (AIN diet + 20% fructose solution in water for 20 weeks) andHFS (8% NaCl in AIN93 diet + 20% fructose solution in water for 10 weeks afterprevious treatment for a period of 10 weeks with HF). Different superscriptletters within the same row indicate significant difference at P< 0.05 byone-way ANOVA followed by Tukey’s test. High-density lipoprotein (HDL);paraoxonase1 activity (PON1).
Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63 Page 2 of 5http://www.nutritionandmetabolism.com/content/9/1/63
HDL have been first attributed to its capacity to pro-mote cellular cholesterol efflux from peripheral cells anddeliver it to the liver for excretion, a process known asreverse cholesterol transport [1]. Furthermore HDL hasalso attracted particular attention because of its antioxi-dative potential. Interestingly this work sustains the rela-tionship between low paraoxonase activity and diseaseswith low antioxidant defense and excessive lipid peroxi-dation since paraoxonase may act protectively in athero-genesis by hydrolyzing some products of lipidperoxidation and consequently by limiting LDL oxida-tion and foam cell formation [17].In our model, serum albumin and protein levels are
reduced probably due to protein synthesis disruption in
the liver as observed by Shinn and Moon [18]. Thedamaged hepatocytes are potent sources of reactive oxy-gen intermediates and oxidative stress is important inmany types of liver injury. Lipid peroxidation, which wasfound increased in this study, could change the proper-ties of biological membranes, resulting in severe celldamage and play a significant role in the mechanismsrelated to the alterations observed by us, as it has beenpreviously documented [19].In rats, unlike in humans and rabbits, plasma triglycer-
ides and cholesterol are transported predominantly byHDL [14] and fructose per se, after having reached theliver, may contribute to the increase in serum triglycer-ide as demonstrated in this study and by others authors[9,20,21]. We showed that low PON1 activity is asso-ciated with decreased HDL levels and this contributes tothe hypothesis that PON1 is involved in the preservationof HDL. Since PON1 exerts a protective effect againstoxidative stress, it is logical to find an association be-tween this enzyme and liver impairment. PON1 activitydecreased while lipid peroxidation increased in HFS rats,suggesting that PON1 activity may be involved in thedefense against free radical production in liver orga-nelles. Moreover, the atherogenic index of these animalsindicated them to be more susceptible to the develop-ment of atherosclerosis. However the results of thisstudy showed that PON1 activity towards synthetic
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
CON HFHFS
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
a
b b
TB
AR
S (
nm
ol/m
g p
tn)
0 5 10 150
20
40
60
80
100
r = 0.7728P < 0.001
Total protein (g/dL)
PO
N1
(g/d
L)
1.5 2.0 2.5 3.0 3.50
20
40
60
80
100
r = 0.8142P < 0.001
Albumin (mg/dL)
PO
N1
(g/d
L)
0 50 100 1500
20
40
60
80
100
r = 0.6228P < 0.001
total-cholesterol (mg/dL)
PO
N1
(g/d
L)
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
100
r = 0.6145P < 0.001
HDL-cholesterol (mg/dL)
PO
N1
(g/d
L)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.00
20
40
60
80
100
r = - 0.6262P < 0.01
TBARS (nmol/mg protein)
PO
N1
(g/d
L)
Figure 1 (A) Liver TBARS levels; scatter plots illustrating the association between (B) PON1 and total protein and (C) albumin and (D)Total cholesterol and (E) HDL-cholesterol and (F) TBARS in experimental groups. Control (dark filled circle); high-fructose (dark filled triangle)and high-fructose + salt (dark filled square) rats. High-density lipoprotein (HDL); paraoxonase1 activity (PON1).
Table 2 Polymorphonuclear cells, lymphocytes andmonocytes count of experimental rats after 20 weeks oftreatment
CON HF HFS
PMN cells (%) 5-15 3-27 7-23
Lymphocytes (%) 19-58 4-33** 7-20***
Monocytes (%) 27-76 36-85** 40-83*
Values were obtained from groups CON (AIN diet and water for 20 weeks); HF(AIN diet + 20% fructose solution in water for 20 weeks), and HFS (8% high saltin AIN93 diet + 20% fructose solution in water for 10 weeks after previoustreatment for a period of 10 weeks with HF). Kruskall Wallis test followed byDunns test. Values indicate lowest and highest percentage of cells countedrespectively. *P< 0.05; **P< 0.01; ***P< 0.001. Polymorphonuclear (PMN) cells.
Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63 Page 3 of 5http://www.nutritionandmetabolism.com/content/9/1/63
substrates reflects its relationship to oxidative stress bymeans of the marker used but this hypothesis needs sup-port by means of further investigation.A previous study has shown that PON1 protects
against atherosclerosis, by its ability to reduce macro-phage foam cell formation, via reducing oxidative stressand stimulation of cholesterol efflux from macrophages[22]. The present study proposes that oxidatively modi-fied LDL impair endothelial function, stimulate inflam-matory response of monocytes/macrophages, activatemigration and proliferation of vascular smooth musclecells and induce immune response, as indicated by theincrease of monocytes in HF and HFS groups. Therefore,inactivation of PON1 in HFS rats could reduce theability of HDL to inhibit LDL modification and alsodecrease the ability of HDL to inhibit monocytic-endothelial interactions. Both conditions appear to beimportant in the inflammatory response in arterial wallcells, as demonstrated by the change in lymphocyteprofile in relation to the control group, since this is acommon finding during the systemic inflammatory re-sponse. In addition, clinical and animal studies suggestthat low lymphocyte count plays a putative role inchronic inflammation [23].Our dietetic model was chosen due its relevance to
human nutrition because it mimics a common Westerndiet, with high consumption of sugar drinks and saltyfoods and this study is the first one to show an associ-ation between paraoxonase status and salt overload ininsulin-resistant rats. This supports the relationship be-tween low PON1 activity and diseases with low antioxi-dant defense and excessive lipid peroxidation.Paraoxonase may perform protectively in atherogenesisby hydrolyzing some products of lipid peroxidation andconsequently by limiting LDL oxidation and foam cellformation [24]. This allows us to hypothesize that para-oxonase activity may lead to failure in the protection ofLDL oxidation in insulin-resistant subjects on a high-saltdiet. Thus the lack of prevention of LDL oxidation byHDL could be explained by the quantitative alteration ofHDL, since PON1 generally seems to contribute to theantioxidant properties of HDL.In conclusion, the present study indicates that a high-
salt diet in fructose-fed rats leads to lowered serumPON1 activity, with deleterious effects on the antioxi-dant defense system. Furthermore, we suggest that achange in blood cells profile would reflect the oxidativestress detected. These findings we believe to be relevantin the field of human nutrition.
AbbreviationsHDL: High-density lipoprotein; LDL: Low-density lipoprotein;PMNs: Polymorphonuclear; PON: Paraoxonase1; ROS: Reactive oxygenspecies; TBARS: Thiobarbituric acid reactive substances.
Competing interestsThe authors declare that they have no competing interests.
Author details1Research in Biological Sciences - NUPEB, Federal University of Ouro Preto,Minas Gerais, Brazil. 2Department of Biological Sciences, Institute of Exact andBiological Sciences, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil.3Department of Foods, School of Nutrition, University of Ouro Preto, MinasGerais, Brazil.
Author’s contributionsWCD and MES participated in the design of the study, interpretation of dataand edited the manuscript. WCD, MOS, MS, MFD collected the data. RCSmade substantial contributions in revising it critically for intellectual content.WGL contributed to the discussion of data and statistical analysis. MEScoordinated the study. All authors read and approved the final version of themanuscript.
Received: 29 March 2012 Accepted: 27 June 2012Published: 27 June 2012
References1. Mertens A, Holvoet P: Oxidized LDL and HDL: antagonists in
atherogenesis. FASEB J 2001, 15:2073–2084.2. Durrington PN, Mackness B, Mackness MI: Paraoxonase and
atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001, 21:473–480.3. Navab M, Ananthramaiah GM, Reddy ST, Van Lenten BJ, Ansell BJ, Fonarow
GC, Vahabzadeh K, Hama S, Hough G, Kamranpour N, Berliner JA, Lusis AJ,Fogelman AM: The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role ofoxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res 2004, 45:993–1007.
4. Richter RJ, Jarvik GP, Furlong CE: Paraoxonase 1 status as a risk factor fordisease or exposure. Adv Exp Med Biol 2010, 660:29–35.
5. Précourt LP, Amre D, Denis MC, Lavoie JC, Delvin E, Seidman E, Levy E: Thethree-gene paraoxonase family: physiologic roles, actions and regulation.Atherosclerosis 2011, 214:20–36.
6. Silva M, Lima WG, Silva ME, Pedrosa ML: Effect of streptozotocin on theglycemic and lipid profiles and oxidative stress in hamsters. Arq BrasEndocrinol Metabol 2011, 55:46–53.
7. Alp H, Varol S, Celik MM, Altas M, Evliyaoglu O, Tokgoz O, Tanrıverdi MH,Uzar E: Protective effects of beta glucan and glicazide on brain tissueand sciatic nerve of diabetic rats induced by streptozonin. Exp DiabetesRes 2012, 2012:230342.
8. de Souza MO, Silva M, Silva ME, Oliveira Rde P, Pedrosa ML: Dietsupplementation with acai (Euterpe oleracea Mart.) pulp improvesbiomarkers of oxidative stress and the serum lipid profile in rats.Nutrition 2010, 26:804–810.
9. Thorburn AW, Storlien LH, Jenkins AB, Khouri S, Kraegen EW: Fructose-induced in vivo insulin resistance and elevated plasma triglyceride levelsin rats. Am J Clin Nutr 1989, 49:1155–1163.
10. Mayes PA: Intermediary metabolism of fructose. Am J Clin Nutr 1993,58:754S–765S.
11. Bezerra RM, Ueno M, Silva MS, Tavares DQ, Carvalho CR, Saad MJ: A highfructose diet affects the early steps of insulin action in muscle and liverof rats. J Nutr 2000, 130:1531–1535.
12. Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 purified diets for laboratoryrodents: final report of the American Institute of Nutrition and hocwriting committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. JNutr 1993, 123:1939–1951.
13. Colégio Brasileiro de Experimentação Animal: Princípios éticos naexperimentação animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal. SãoPaulo: COBEA; 1991.
14. Bełtowski J, Wójcicka G, Mydlarczyk M, Jamroz A: Cerivastatin modulatesplasma paraoxonase/arilesterase activity and oxidant-antioxidantbalance in the rat. Pol J Pharmacol 2002, 54:143–150.
15. Buege JA, Aust SD: Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol 1978,52:302–310.
16. de Oliveira RB, de Paula DA, Rocha BA, Franco JJ, Gobbo-Neto L, UyemuraSA, dos Santos WF, Da Costa FB: Renal toxicity caused by oral use ofmedicinal plants: the yacon example. J Ethnopharmacol 2011, 27:434–441.
17. Watson A, Berliner JA, Hama SY, La Du BN, Fuall KF, Fogelman AM, NavabM: Protective effect of high density lipoprotein associated paraoxonase:
Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63 Page 4 of 5http://www.nutritionandmetabolism.com/content/9/1/63
inhibition of the biological activity of minimally oxidized low densitylipoprotein. J Clin Invest 1995, 96:2882–2891.
18. Shin MO, Moon JO: Effect of dietary supplementation of grape skin andseeds on liver fibrosis induced by dimethylnitrosamine in rats. Nutr ResPract 2010, 4:369–374.
19. Camps J, Marsillach J, Joven J: Measurement of serum paraoxonase-1activity in the evaluation of liver function. World J Gastroenterol 2009,15:1929–1933.
20. Busserolles J, Gueux E, Rock E, Demigné C, Mazur A, Rayssiguier Y:Oligofructose protects against the hypertriglyceridemic and pro-oxidative effects of a high fructose diet in rats. J Nutr 2003,133:1903–1908.
21. D’Angelo G, Elmarakby AA, Pollock DM, Stepp DW: Fructose feedingincreases insulin resistance but not blood pressure in Sprague–Dawleyrats. Hypertension 2005, 46:806–811.
22. Rosenblat M, Karry R, Aviram M: Paraoxonase 1 (PON1) is a more potentantioxidant and stimulant of macrophage cholesterol efflux whenpresent in HDL than in lipoprotein-deficient serum: relevance todiabetes. Atherosclerosis 2006, 187:74–81.
23. Núñez J, Miñana G, Bodí V, Núñez E, Sanchis J, Husser O, Llàcer A: Lowlymphocyte count and cardiovascular diseases. Curr Med Chem 2011,18:3226–3233.
24. Bełtowski J, Wójcicka G, Mydlarczyk M, Jamroz A: The effect of peroxisomeproliferator-activated receptors alpha (PPARalpha) agonist, fenofibrate,on lipid peroxidation, total antioxidant capacity, and plasmaparaoxonase 1 (PON1) activity. J Physiol Pharmacol 2002, 53:463–475.
doi:10.1186/1743-7075-9-63Cite this article as: Dornas et al.: Salt overload in fructose-fed insulin-resistant rats decreases paraoxonase-1 activity. Nutrition & Metabolism2012 9:63.
Submit your next manuscript to BioMed Centraland take full advantage of:
• Convenient online submission
• Thorough peer review
• No space constraints or color figure charges
• Immediate publication on acceptance
• Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar
• Research which is freely available for redistribution
Submit your manuscript at www.biomedcentral.com/submit
Dornas et al. Nutrition & Metabolism 2012, 9:63 Page 5 of 5http://www.nutritionandmetabolism.com/content/9/1/63
High dietary salt decreases antioxidant defenses in the liver of fructose-fedinsulin-resistant rats
Waleska Claudia Dornasa, Wanderson Geraldo de Limaa,b, Rinaldo Cardoso dos Santosc,Joyce Ferreira da Costa Guerraa, Melina Oliveira de Souzaa, Maísa Silvaa, Lorena Souza e Silvaa,
Mirla Fiuza Dinizb, Marcelo Eustáquio Silvaa, c,⁎
aResearch in Biological Sciences - NUPEB, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, BrazilbDepartment of Biological Sciences, Institute of Exact and Biological Sciences, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil
cDepartment of Foods, School of Nutrition, Federal University of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil
Received 23 November 2012; received in revised form 25 April 2013; accepted 14 June 2013
Abstract
In this study we investigated the hypothesis that a high-salt diet to hyperinsulinemic rats might impair antioxidant defense owing to its involvement in theactivation of sodium reabsorption to lead to higher oxidative stress. Rats were fed a standard (CON), a high-salt (HS), or a high-fructose (HF) diet for 10 weeksafter which, 50% of the animals belonging to the HF group were switched to a regimen of high-fructose and high-salt diet (HFS) for 10 more weeks, while theother groups were fed with their respective diets. Animals were then euthanized and their blood and liver were examined. Fasting plasma glucose was found tobe significantly higher (approximately 50%) in fructose-fed rats than in the control and HS rats, whereas fat liver also differed in these animals, producingsteatosis. Feeding fructose-fed rats with the high-salt diet triggered hyperinsulinemia and lowered insulin sensitivity, which led to increased levels of serumsodium compared to the HS group. This resulted in membrane perturbation, which in the presence of steatosis potentially enhanced hepatic lipid peroxidation,thereby decreasing the level of antioxidant defenses, as shown by GSH/GSSG ratio (HFS rats, 7.098±2.1 versus CON rats, 13.2±6.1) and superoxide dismutase(HFS rats, 2.1±0.05 versus CON rats, 2.3±0.1%), and catalase (HFS rats, 526.6±88.6 versus CON rats, 745.8±228.7 U/mg ptn) activities. Our results indicate thatconsumption of a salt-rich diet by insulin-resistant rats may lead to regulation of sodium reabsorption, worsening hepatic lipid peroxidation associated withimpaired antioxidant defenses.© 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: high-salt diet; fructose-fed rats; oxidative stress; steatosis; antioxidant defenses
1. Introduction
Increasing evidence suggests the involvement of oxidative stressin insulin resistance [1] and has generated high interest in the role offree radicals in the maintenance of adequate levels of antioxidantdefenses [2,3]. In type 2 diabetes, a significant inverse correlationexists between hepatic fat load and the antioxidant defense system[4], which may prevent generation of an adequate compensatoryresponse for restoration of cellular redox balance [5]. In particular,
changes have been demonstrated in some components of the freeradical defense system in different models [6–8].
We observed that the expression of genes encoding the antiox-idant enzymes glutathione peroxidase (GPx), gamma-glutamylcys-teine synthetase and superoxide dismutase (SOD) decreased in theliver tissue of streptozotocin-induced diabetic rats because ofincreased oxidative stress [9] associated with overproduction ofreactive oxygen species (ROS)[10]. Under normal conditions, almostall of the produced superoxide anions (O2
−) are converted tohydrogen peroxide (H2O2) by the action of SOD, which is furtherdetoxified to water by catalase (CAT) or GPx [11]. Howeverhyperglycemia induce the overproduction of O2
− [12] and dramaticchange in the oxidant/antioxidant balance has been postulated to playa role in the pathogenesis of diabetes.
Increasing the sugar intake has been reported to result indyslipidemia, as indicated by elevated levels of serum triglycerides,cholesterol, and low-density lipoproteins [13,14].These underlyingmetabolic disturbances appear to induce insulin resistance commonlyobserved in high-fructose fed human and animal models [15] whenfructose consumption causes progressive liver disease stimulated
Available online at www.sciencedirect.com
ScienceDirect
Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
Abbreviations: AST, Aspartate aminotransferase; ALT, Alanine amino-transferase; CAT, Catalase; GFR, Glomerular filtration rate; GSH, Reducedglutathione; GSSG, Oxidized glutathione; GPx, Glutathione peroxidase (GPx);HOMA, Homeostasis model assessment; ROS, Reactive oxygen species; O2
−,Superoxide anions; SOD, Superoxide dismutase; TBARS, Thiobarbituric acidreactive substances.
⁎ Corresponding author. Research in Biological Sciences - NUPEB, FederalUniversity of Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil.
E-mail addresses: [email protected] (W.C. Dornas);[email protected] (M.E. Silva).
0955-2863/$ - see front matter © 2013 Elsevier Inc. All rights reserved.http://dx.doi.org/10.1016/j.jnutbio.2013.06.006
lipogenesis [16]. Furthermore, despite recent advances in elucidatingthe pathogenesis of related conditions, studies have shown thatpresence of insulin resistance and compensatory hyperinsulinemiawould lead to sodium retention [17].
Therefore in the present study we examined whether a high-saltdiet could impair antioxidant defenses in the liver of fructose-fed ratsdue activation of enhanced renal sodium reabsorption potentiatingoxidative stress.
2. Materials and methods
2.1. Animal and diets
Forty-five male 12-week-old Fischer rats, weighing approximately 300 g, wereindividually housed in a temperature-and humidity-controlled room under a 12 hlight/dark regimen. Initially, the rats were randomly assigned to three experimentalgroups (n=10–12) as follows: the control group (CON), fed with the AIN93M diet [18]and water; the high-salt group (HS), fed with the AIN93M diet plus 8% w/w NaCl andwater; and the high-fructose group (HF), fed with the AIN93M diet and a 20% w/vfructose solution as drinking water. After 10 weeks of treatment, the animals belongingto the HF group were further divided into 2 groups: rats that continued to be fed on thefructose solution (HF) and rats that were switched to a high-fructose + high-saltregimen (HFS) for 10 more weeks. Details of the experimental diets are given inTable 1. Food and water were provided ad libitum and their intake was measured. Atthe end of the experimental period, the rats were fasted for 12 hours, anesthetized withisoflurane and euthanized by total blood collection from the brachial plexus. The bloodwas centrifuged at 1500g for 15 min. One liver lobule from each animal was separatedfor histological analysis and the rest was frozen at−80°C until further analysis. All theprocedures were approved by the Ethical Committee for Animal Care and Use of theFederal University of Ouro Preto.
2.2. Biochemical determinations
Serum aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) activitiesand plasma glucose concentration were determined using commercial kits fromLabtest Diagnostica SA (Lagoa Santa, MG, Brazil) # 108, 109 and 84, respectively, byfollowing the manufacturer’s instructions. ELISA was utilized to quantify plasmainsulin and leptin levels using commercial kits from Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA,Crystal Chem Downers Grove, IL, USA, and Rat Leptin ELISA Kit, Linco Research, USA,(Catalog #90060 and #90040, respectively). The homeostasis model assessment(HOMA), described by Matthews et al. [19] as a measure of insulin resistance, wascalculated using the formula [insulin (μmol/ml)×glucose (mM/L)/22.5]. Hepatic fatwas extracted using a chloroform-methanol mixture (2:1, v/v) according to themethod of Folch et al. [20] and the total lipids were quantified gravimetrically byevaporating the solvents in the extract. Sodium concentrations were measured byflame photometry (Olidef model C-71 apparatus; São Paulo, Brazil).
2.3. Antioxidant defenses and oxidative stress
Liver SOD activity was measured by the method of Marklund and Marklund [21].One unit of SOD activity was defined as the amount of enzyme that inhibited the rate ofautoxidation of pyrogallol by 50%, which was determined at 570 nm. Catalase activitywas measured according to Aebi [22] and was expressed in units per milligram ofprotein using the extinction coefficient of 0.0394 L/mmol/L/cm. The rate of H2O2
decomposition was followed by monitoring absorption at 240 nm in 50 mM phosphatebuffer, pH 7.0, containing 5 mM H2O2. Tissue protein content was determinedaccording to the method developed by Lowry et al. [23] using bovine serum albumin asthe standard. The total glutathione (GSH + GSSG) was measured after precipitation of
proteins with an equal volume of 4% sulfosalicylic acid using the enzymatic methodpreviously described [24]. Oxidized glutathione (GSSG) was determined afterderivatization of total GSH with 2-vinylpiridine. Oxidative stress index was calculatedfrom the GSH/GSSG ratio and by lipid peroxidation status through of levels ofthiobarbituric acid reactive substances (TBARS) as described by Buege and Aust [25].
2.4. Liver histology
After removal from each animal, the livers were immediately fixed in 10% bufferedformaldehyde, embedded in paraffin, cut (4-μm thickness) and mounted on glassslides. The sections were deparaffinized in xylene, stained with hematoxylin and eosin(H&E) using the standard technique and then examined. Histological examination ofthe slides was performed by using concentrated light microscope equipped withphotographic digital camera (DM5000; Leica) with software Qwin Plus. Scoring of theslides was performed using a semi-quantitative method reported by Brunt et al. [26].Fat degeneration was graded according to the percentage of fat-containing hepato-cytes. Grade of vesicular steatosis according to the original system involved 10 grades,whereas in this system, steatosis was graded from 0–4 based on the percentage ofhepatocytes involved in the biopsy (0, none; 1, 10%; 2, 10–33%; 3, 33–66% and 4, N66%).
2.5. Statistical analysis
Normality of the sample distribution for each continuous parameter was testedwith the Kolmogorov–Smirnov test. The significance of any differences in proportionsof medians was tested with Kruskal–Wallis test and in means by one-way analysis ofvariance (ANOVA), followed by Dunns and Tukey tests, respectively. Correlationanalysis was used tomeasure the degree to which 2 variables were related. Significancefor all measures was defined when Pb.05. GraphPad Prism version 5.00 for Windows(San Diego, CA, USA) was used for statistical analyses.
3. Results
Notably, the mean food intake was significantly different amongstdifferent dietary groups. In relation to the control group, high dietaryNaCl resulted in a lower caloric value leading to higher food intake inHS rats (Pb.01). On the other hand, fructose supplementation led tolower food intake (Pb.001) due to its energy content (Fig. 1A). Meanvalues for liquid intake were significantly higher in the high-saltgroups (Pb.001) than in the CON and HF groups (Fig. 1B). Higherfructose intake lowered the energetic demand for solid food (Pb.001)in HFS rats than in other groups (Fig. 1C). The high-salt diet led toincreased liquid intake, thus compelling HS and HFS rats to drinkapproximately 4.0 and 3.0 times the liquid volumes consumed by theCON animals, respectively, resulting in the corresponding differencesin the liquid calorie intake of HFS rats drinking the fructose solution(Pb.001) in relation to HF rats (Fig. 1D). There were no significantdifferences in the total energy intake (Fig. 1E). Moreover, plasmaleptin concentrations in HF rats was higher (Pb.01) compared to thatin other groups (Fig. 1F).
The average final body weight was lower in HFS rats than in HFand CON rats (Pb.05). Relative liver weights were higher (Pb.05) infructose-fed rats (HF and HFS) and a corresponding increase wasobserved in the liver lipid content and plasma glucose in fructose-fedrats in relation to CON (Pb.05) and HS (Pb.001). The highest insulinconcentration was found in HFS rats (Pb.05) and HOMA analysisrevealed that this group had significantly higher values than thecontrols animals (Pb.01), thereby indicating that the combination ofdietary fructose with NaCl in HFS rats impaired insulin response. Fordetermination of whether the dietary treatment induced liver injury,serum AST and ALT activities were examined, and ALT but not AST inthe HF group were found to be significantly higher than that of thecontrol group (Pb.05). Augmented natriuretic response to a high-saltdiet significantly decreased serum sodium in HS rats compared to thatin other groups (Pb.05) and particularly HFS showed a substantialincrease in relation to the HS group (Table 2).
Photomicrographs of hepatic specimens stained with H&E areshown in Fig. 2A–D, and the scores of histological variables arepresented as medians in Fig. 2E. Mild or no hepatic steatosis occurredin CON rats (Fig. 2A). HS rats did not show predominant occurrence ofsteatosis, but hyperemic vessels were observed in the parenchyma
Table 1Diets composition
Ingredient Composition (g/kg diet)
CON HS HF3 HFS3
Starch 622.5 542.5 622.5 542.5Casein 140.0 140.0 140.0 140.0Sucrose 100.0 100.0 100.0 100.0Salt - 80.0 - 80.0Cellulose 50.0 50.0 50.0 50.0Fat 40.0 40.0 40.0 40.01Minerals 35.0 35.0 35.0 35.02Vitamins 10.0 10.0 10.0 10.0Choline 2.5 2.5 2.5 2.5Energy content (kcal/kg) 3810 3490 3810 3490
1Mineral mixture for AIN93M; 2Vitamin mixture for AIN93M; 3D-Fructose (SynthLab-synth, São Paulo, Brazil).
2 W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
cells (Fig. 2B). As expected, the high fructose treatment causedhepatic lipid accumulation, which was evident in both HF and HFSrats (Fig. 2C and 2D) with no signs of necroinflammation. Fatdeposition in the HF group was classified as macrovesicular, whilelivers of HFS rats showed mainly a microvesicular pattern with lessergrade of lipid accumulation in relation to HF rats. A statisticallysignificant higher steatosis score (Pb.05) was seen in livers from HFcompared to CON animals (Fig. 2E).
Compared with the control group, the hepatic levels of totalglutathione and GSH were significantly lower in the HFS group(Pb.01), although no significant difference was observed in the GSSGlevels (Fig. 3). The GSH/GSSG ratio was calculated to determinewhether oxidative stress had been augmented and was found to belower in HFS rats than in control rats (Pb.01). Assessment of lipidperoxidation showed damage in hepatocytes, as verified throughTBARS content of HFS in relation to CON animals (Pb.05). Further-more, a progressive functional deficiency in antioxidant defenses wasalso evidenced in the HFS group, with a significant decrease in SODand CAT activities, (Pb.05; Pb.001, respectively) in relation to the CONgroup. Additionally, a negative correlation was found between TBARS
and GSH/GSGG ratio (r=−0.40, Pb.01), SOD (r=−0.56, Pb.0005) andCAT activities (r=−0.50, Pb.002) (Table 3).
4. Discussion
The present study suggested that the osmotic load caused byaugmenting dietary NaCl increased plasma osmolality, stimulatedthirst, and enhanced liquid intake, as observed by Manesh et al. [27].Studies in both rats [28] and humans [29] have reported that chronicfructose ingestion is associated with increase in plasma leptin levelsand leptin resistance, which alters the information that is relayed tothe central nervous system on energy intake and body fat stores forregulation of food intake and energy homeostasis [30]. Roglans et al.[31] reported that this increase precedes obesity, suggesting that theliver is a key organ in the development of metabolic derangementsinduced by fructose consumption. Nevertheless, in our study thisincrease of leptin levels only in HF rats occurred in the absence ofaugmented body weight: HF and control rats had the same bodyweight, although leptin potently activates cellular fuel consumptionby stimulating fatty acid oxidation and reducing lipogenesis [32].
On the other hand, while fructose is more soluble, sweeter, andless glucogenic than glucose or sucrose and has been recommendedas a replacement for these sugars in the diets of diabetic and obesepeople, it is lipogenic and usually causes greater elevation intriglyceride levels [3]. Significant differences due to fructose diet-induced development of fatty liver were observed in our experiments,as well as in other studies [33,34]. Fructose treatment-inducedincreased fatty liver and consequent hepatomegaly was found in HFand HFS animals. Fructose-fed rats served as a model for diet-inducedinsulin resistance, suggesting that pathophysiological mechanismsand lipid retention in hepatocytes (hepatic steatosis) was animportant early sign in the development of a metabolic abnormalitiesspectrum. Our model was thus proved appropriate because itreproduced histologically detectable steatosis resulting primarilyfrom the deposition of fat in hepatocytes of fructose-fed rats.However, our results demonstrated that HFS rats consumed morefructose than HF rats did, but displayed lower degree of steatosis
A B C
CON HS HF HFS0
5
10
15
20
25 a
bc
d
Fo
od
inta
ke/d
ay (
g)
CON HS HF HFS0
20
40
60
80a
b
cc
Liq
uid
inta
ke/d
ay (
mL
)
CON HS HF HFS0
20
40
60
80
100a
aa
b
En
erg
y in
take
fro
mfo
od
/day
(kc
al)
D E F
CON HS HF HFS0
10
20
30
40a
b
En
erg
y in
take
fro
mliq
uid
/day
(kc
al)
CON HS HF HFS50
60
70
80
90
To
tal e
ner
gy
inta
ke/d
ay(k
cal)
CON HS HF HFS0
5
10
15
20a
bb
b
Lep
tin
(n
g/m
L)
Fig. 1. Food, fluid, caloric intake and serum leptin of experimental rats. Symbols represent the animals in scatter plots to each group. Different letters indicate significant differences atPb.05 by one-way ANOVA followed by Tukey’s test. Control diet (CON); high-salt diet (HS); high-fructose diet (HF); high-fructose and salt (HFS) diet for 10 weeks after previoustreatment for a period of 10 weeks with HF.
Table 2Characteristics of experimental rats
Variable Treatments
CON HS HF HFS
Initial body weight, g 295.0±21.5 295.1±23.1 295.1±22.2 294.4±28.5Final body weight, g 451.2±29.5a 428.2±28.2ab 448.2±36.9a 412.0±17.2b
Absolute weight liver, g 12.6±1.8ab 11.7±1.5b 13.7±1.9a 13.0±1.3ab
Relative liver weight, mg/g 27.8±3.0b 27.0± 2.3b 30.6±2.4a 31.6±1.3a
Total fat liver, mg/g 53.3±6.0b 42.5±4.4b 73.4±17.3a 72.6±12.6a
Plasma glucose, mmol/L 8.0±0.9b 8.7±1.1b 11,9±1.8a 12.7±1.6a
Plasma insulin, μmol/ml 20.9±13.1b 27.7±14.2b 34.0±19.4b 45.1±25.8a
HOMA-IR, score 7.6±5.4b 11.0±7.0b 17.4±11.1b 23.2±16.4a
Serum AST, U/L 56.8±17.3 56.8±16.3 58.3±17.3 57.1±16.0Serum ALT, U/L 16.0±5.4b 25.2±11.2ab 28.7±11.6a 24.8±7.2ab
Serum sodium, mmol/L 142.9±5.3a 127.6±4.5b 140.8±8.1a 135.8±4.5a
Values are expressed as means±S.D. Different letters within the same row indicatesignificant differences at Pb.05 by one-way ANOVA followed by Tukey’s test.
3W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
development. This may indicate that the high-salt diet model, as inother studies, attenuated gain in body weight [35,36], which can leadto lower accumulation of fat in hepatocytes, as supported by our data.Determination of liver function parameters also revealed liverdysfunction due to fructose-feeding and hepatic damage in fruc-tose-fed rats. Fructose feeding was found to significantly enhanceserum ALT activity, indicating considerable hepatocellular injury inHF rats. ALT has been routinely measured and is considered asurrogate marker of liver fat accumulation [37]. Injury to thehepatocyte leads to disruption of the plasma membrane and leakageof the enzyme to the extracellular fluid. Thus it can be detected atabnormal levels in the serum and this condition may be a cause ofhepatocyte death.
Rats are an excellent animal model to study the effects offructose intake because their fructose metabolism closely re-
sembles that of humans [38] and studies have shown that fructoseinduces hyperglycemia and hyperinsulinemia [39,40]. The resultsdemonstrated that fructose administration produces insulin resis-tance in HFS rats consistently with previous studies carried outusing different techniques to assess insulin resistance [40,41].Insulin resistance in fructose-fed rats has been attributed to a lowlevel of insulin-stimulated glucose oxidation due to modificationsin the post-receptor cascade of insulin action [42]. Thus elevatedplasma insulin concentrations enhance the synthesis of very-low-density lipoprotein, and this may induce increase in fatty liver asobserved by us in HF and HFS rats with decreased in response ofHFS rats to glucose utilization, featuring a lower insulin action asindicated by higher HOMA values. In contrast, Nishimoto et al. [43]used fructose-fed insulin-resistant rats with a low or high-sodiumdiet and found no significant differences in plasma glucose or
Fig. 2. (A-D) Representative photomicrographs H&E staining of liver sections of experimental rats. Hepatocytes abnormalities were not observed in the CON group (A); note hyperemicvessels (arrowhead) and normal parenchyma appearance in the HS group (B); aspect of macrovesicular steatosis in the HF group (C). Note hepatocytes with a large negative image inthe cytoplasm with nucleus displaced into the periphery of the cell, large fat globule in most cases (white arrow); aspect of microvesicular steatosis in the HFS group (D). Note cellswith small cytoplasmic vacuoles without displaced nucleus (black arrow) magnification ×440. Grade of liver steatosis of rats in experimental groups (E). Values (medianne, n=8–11)(*Pb.05 vs. control rats).
4 W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
insulin among their groups, although they used a lower dosage forboth salt and fructose than in our study. This discrepancy amongstudies may be better explained by the fact that diet-inducedmodifications in metabolic and hormonal profile are probablydependent on the duration of diet treatment, on the amount ofcarbohydrate and salt in the diet besides interactions with othernutrients [44–46].
Our model was based on the administration of a high-fructose dietinducing insulin resistance that resembles the so-called ‘fast food’that is highly popular nowadays. This type of diet constitutes animportant, typically westernized lifestyle, which includes consump-tion of processed foods that are high in salt and sugar. Fructose hasbeen broadly used in metabolic studies, although there is no dataconcerning liver abnormalities associated with ‘high-salt’ regimens.In this study, the high-salt diet led to greater urinary excretion ofsodium, but hyperinsulinemia showed in HFS rats has influence onsodium retention as demonstrated by higher serum sodium concen-trations in HFS when compared with the HS group. This antina-
triuretic effect may be opposed by a concomitant decrease inproximal tubular sodium reabsorption [47] or an increase inglomerular filtration rate (GFR) [48]. Chronic hyperinsulinaemiaincreases GFR in normal dogs [48], but not in obese insulin-resistantdogs [49] which suggest that insulin could increase GFR, and thus thefiltered sodium load, only in insulin-sensitive subjects. Insulin hasbeen known to enhance sodium reabsorption in the proximal tubuleand stimulates not only sodium but also volume absorption in therabbit proximal convoluted tubule. Thus, from these stimulatoryeffects, it is clear that insulin acts on proximal tubules to reabsorbsodium filtered from the glomeruli and yet, important regulatorymechanisms exist subsequently in the Henle’s loop, distal tubule andconnecting tubule [17].
Besides, Vasdev et al. [50] showed that intracellular sodium levelsincrease cytosolic free calcium, which can increase oxidative stress andthis condition changes the membrane components compromising itsintegrity [51] because increased ROS generation has been shown toinduce cell membrane lipid peroxidation [52]. Therefore, it has beensuggested that lipid accumulation in the liver makes hepatocytes moresensitive to oxidative stress [53], which in this study, potentiallyactivated lipid peroxidation, as demonstrated by increased TBARS inHFS rats. The observed steatosis could have affected lipid compositionand fluidity of mitochondrial membranes, which increased oxidativestress in the liver. In addition, changes in liver glutathione redox statusweremonitored in this work by recording the GSH/GSSG ratio, becausesevere oxidative stress may deplete cellular GSH, and glutathione playan important function in detoxification of free radicals [54]. Glutathioneis the major intracellular non-protein antioxidant, and GPx convertsH2O2 to H2O by oxidizing glutathione to glutathione disulfide [2]. Weobserved a decrease in liver GSH levels in HFS rats aswell as in the GSH/
Total Gluthatione
CON HS HF HFS0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
aa
a
bn
mo
l/mL
CON HS HF HFS0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
aa
a
b
GSH
nm
ol/m
L
CON HS HF HFS0.00
0.05
0.10
0.15
GSSG
nm
ol/m
L
GSH/GSSG
CON HS HF HFS0
5
10
15
20
a
aa
b
CON HS HF HFS0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
aabb b
TBARS
U/m
g d
e p
tn
CON HS HF HFS0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
SOD activity
aab bab
% in
hib
itio
n
CON HS HF HFS0
200
400
600
800
1000a
b
aa
Catalase activity
U/m
g p
rote
in
Fig. 3. Antioxidant defenses and oxidative stress in the liver of experimental rats. Different letters indicate significant differences at Pb.05 by one-way ANOVA followed by Tukey’s test.
Table 3Regression analyses between TBARS (U/mg ptn) and antioxidant defenses ofexperimental rats
Variable r P
Glutathione total, nmol/ml −0.21 .1815GSH, nmol/ml −0.22 .1540GSSG, nmol/ml 0.18 .2558GSH/GSSG, ratio −0.40 .0194SOD, % inhibition −0.56 .0005Catalase, U/mg ptn −0.50 .0024
5W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
GSSG ratio, which could be a consequence of adaptation of the fattyliver, as suggested by the negative correlation of TBARS with GSH/GSSGratio. It may represent a consequence of the higher pro-oxidant statusdeveloped in HFS rats, which is likely responsible for the highconsumption of cellular and circulating antioxidants. Moreover,decreased SOD and CAT activities were observed in HFS rats thatcould participate in hepatic vulnerability to oxidative stress. Decreasedfeedback regulatory mechanisms involving these antioxidant enzymes,prevents the restoration to normal enzyme level. Thus, the suscepti-bility of the tissue to oxidative stress was dependent on the alterationin lipid composition and tissue damage. SOD play a key role in cellprotection against the deleterious effects of O2
−, and catalase preventsdamage by rapidly converting H2O2 to water [55]. There are possiblepathways by which cellular metabolism in this model may be altered,which in turn may accelerate oxidative stress. The increased oxidativestress could be due to production of oxygen free radicals [3] and H2O2
resulting from SOD activity, which can generate hydroxyl radicalsthrough the Fenton reaction, and thus, ROS can themselves reduce theactivity of antioxidant enzymes such as CAT and GPx [56]. Conse-quently, a lowering of these activities is suggestive of reducedscavenging potential in the insulin-resistant rats on high-salt diet.Another possibility is that accumulation of advanced glycation productsresulted in the production of free radicals [57]. Therefore the high-saltdiet might be regarded as an instigator that reduces antioxidantdefenses, worsening insulin sensibility in the early stage of experi-mental diabetes in rats; however, further research is needed to definethe interdependencies/interactions among fructose, salt and oxidativestress more clearly.
In conclusion, the high-salt diet reduced hepatic antioxidantdefenses in the fructose-fed rats, providing evidence to support theidea that increased oxidative stress is involved in membraneperturbation through important regulatory mechanisms. Thus, ourfindings suggest that hyperinsulinemia play a role in sodiumretention and it is therefore possible that the deleterious effects ofsalt overload on insulin- resistant subjects may be attributed, in part,to the development of a substantial pro-oxidant condition thatimpairs antioxidant defenses.
Acknowledgments
The authors would like to thank LAPAC (Pilot Laboratory of ClinicalAnalysis, School of Pharmacy, Federal University of Ouro Preto) fortechnical assistance.
References
[1] Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. Are oxidative stress activatedsignaling pathways mediators of insulin resistance and beta cell dysfunction?Diabetes 2003;52:1–8.
[2] Sies H. Strategies of antioxidant defense. Eur J Biochem 1993;215:213–9.[3] Mayne ST. Antioxidant nutrients and chronic disease: use of biomarkers of
exposure and oxidative stress status in epidemiologic research. J Nutr 2003;133:933–40.
[4] Loguercio C, De Girolamo V, De Sio I, Turccillo C, Ascione A, Baldi F, et al. Non-alcoholic fatty liver disease in an area of southern Italy: main clinical, histological,and pathophysiological aspects. J Hepatol 2001;35:568–74.
[5] Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes. EndocrRev 2002;23:599–622.
[6] Faure P, Rossini E, Lafond JL, RichardMJ, Favier A, Halimi S. Vitamin E improves thefree radical defense system potential and insulin sensitivity of rats fed highfructose diets. J Nutr 1997;127:103–7.
[7] Peixoto EB, Pessoa BS, Biswas SK, Lopes de Faria JB. Antioxidant SOD mimeticprevents NADPH oxidase-induced oxidative stress and renal damage in the earlystage of experimental diabetes and hypertension. Am J Nephrol 2009;29:309–18.
[8] Sinha-Hikim I, Sinha-Hikim AP, Shen R, KimH, French SW, Vazari ND, et al. A novelcystine based antioxidant attenuates oxidative stress and hepatic steatosis in diet-induced obese mice. Exp Mol Pathol 2011;91:419–28.
[9] Guerra JF, Magalhães CL, Costa DC, Silva ME, Pedrosa ML. Dietary açaí modulatesROS production by neutrophis and gene expression of liver antioxidant enzymesin rats. J Clin Biochem Nutr 2011;49:188–94.
[10] Ceriello A, Motz E. Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlyinginsulin resistance, diabetes and cardiovascular disease? The common soilhypothesis revisited. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004;24:816–23.
[11] Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev Biochem1995;64:97–112.
[12] Fujita H, Fujishima H, Chida S, Takahashi K, Qi Z, Kanetsuna Y, et al. Reduction ofrenal superoxide dismutase in progressive diabetic nephropathy. J Am SocNephrol 2009;20:1303–13.
[13] Stanhope KL, Havel PJ. Fructose consumption: considerations for future researchon its effects on adipose distribution, lipid metabolism, and insulin sensitivity inhumans. J Nutr 2009;139:1236S–41S.
[14] Fried SK, Rao SP. Sugars, hypertriglyceridemia, and cardiovascular disease. Am JClin Nutr 2003;78:873S–80S.
[15] Basciano H, Federico L, Adeli K. Fructose, insulin resistance, and metabolicdyslipidemia. Nutr Metab 2005;2:5.
[16] Assy N, Nasser G, Kamayse I, Nseir W, Beniashvili Z, Djibre A, et al. Soft drinkconsumption linked with fatty liver in the absence of traditional risk factors. Can JGastroenterol 2008;22:811–6.
[17] Horita S, Seki G, Yamada H, Suzuki M, Koike K, Fujita T, et al. Insulin resistance,obesity, hypertension, and renal sodium transport. Int J Hypertens 2011:391762.
[18] Reeves PG, Nielsen FH, Fahey Jr GC. AIN-93 purified diets for laboratory rodents:final report of the American Institute of Nutrition and hoc writing committee onthe reformulation of the AIN-76A rodent diet. J Nutr 1993;123:1939–51.
[19] Matthews DR, Hosker JP, Rudenski AS, Naylor BA, Treacher DF, Turner RC.Homeostasis model assessment: insulin resistance and β-cells function fromfasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia 1985;28:412–9.
[20] Folch J, Lees M, Sloane-Stanley GH. A simple method for the isolation andpurification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem 1957;226:497–509.
[21] Marklund S, Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in theautoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur JBiochem 1974;47:469–74.
[22] Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzymol 1984;105:121–6.[23] Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the
folin-phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265–75.[24] Akerboom T, Sies H. Assay of glutathione disulfide and glutathione mixed
disulfides in biological samples. Methods Enzymol 1981;77:373–82.[25] Buege JA, Aust SD. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol 1978;52:
302–10.[26] Brunt EM, Janney CG, Di Bisceglie AM, Neuschwander- Tetri BA, Bacon BR.
Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histologicallesions. Am J Gastroenterol 1999;94:2467–74.
[27] Manesh R, Hoffmann ML, Stricker EM. Water ingestion by rats fed a high-salt dietmay be mediated, in part, by visceral osmoreceptors. Am J Physiol Regul IntegrComp Physiol 2006;290:R1742–9.
[28] Mooradian AD, Chehade J, Hurd R, Haas MJ. Monosaccharide enriched diets causehyperleptinemia without hypophagia. Nutrition 2000;16:439–41.
[29] Lê KA, Faeh D, Stettler R, Ith M, Kreis R, Vermathen P, et al. A 4-wk high-fructosediet alters lipid metabolism without affecting insulin sensitivity or ectopic lipidsin healthy humans. Am J Clin Nutr 2006;84:1374–9.
[30] Porte Jr D, Baskin DG, Schwartz MW. Leptin and insulin action in the centralnervous system. Nutr Rev 2002;60:S20–9.
[31] Roglans N, Vila L, Farre M, Alegret M, Sanchez RM, Vazquez- Carrera M, et al.Impairment of hepatic Stat-3 activation and reduction of PPAR-α activity infructose-fed rats. Hepatology 2007;45:778–88.
[32] Orci L, Cook WS, Ravazzola M, Wang MY, Park BH, Montesano R, et al. Rapidtransformation of white adipocytes into fat-oxidizing machines. Proc Natl AcadSci U S A 2004;101:2058–63.
[33] Ouyang X, Cirillo P, Sautin Y, McCall, Bruchette JL, Diehl AM, et al. Fructoseconsumption as a risk factor for non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol2008;48:993–9.
[34] Sánchez-Lozada LG, Mu W, Roncal C, Sautin YY, Abdelmalek M, Reungjui S, et al.Comparison of free fructose and glucose to sucrose in the ability to cause fattyliver. Eur J Nutr 2010;49:1–9.
[35] Hasegawa H, Takano H, Kohro T, Ueda K, Niitsuma Y, Aburatani H, et al.Amelioration of hypertensive heart failure by amlodipine may occur viaantioxidative effects. Hypertens Res 2006;29:719–29.
[36] Vasdev S, Gill V, Longerich L, Parai S, Gadag V. Salt-induced hypertension in WKYrats: prevention by α-lipoic acid supplementation. Mol Cell Biochem 2003;254:319–26.
[37] Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med 2002;346:1221–31.[38] Mayes PA. Intermediary metabolism of fructose. Am J Clin Nutr 1993;58:754S–65S.[39] Liu IM, Tzeng TF, Liou SS. A Chinese Herbal Decoction, Dang Gui Bu Xue Tang,
Prepared from Radix Astragali and Radix Angelicae sinensis, ameliorates insulinresistance induced by a high-fructose diet in rats. Evid Based ComplementAlternat Med 2009.
[40] Nakagawa T, Hu H, Zharikov S, Tuttle KR, Short RA, Glushakova O, et al. A causalrole for uric acid in fructose-induced metabolic syndrome. Am J Physiol RenalPhysiol 2006;290:F625–31.
[41] Thorburn AW, Storlien LH, Jenkins AB, Khouri S, Kraegen EW. Fructose-induced invivo insulin resistance and elevated plasma triglyceride levels in rats. Am J ClinNutr 1989;49:1155–63.
6 W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
[42] El Mesallamy HO, El-Demerdash E, Hammad LN, El Magdoub HM. Effect of taurinesupplementation on hyperhomocysteinemia and markers of oxidative stress inhigh fructose diet induced insulin resistance. Diabetol Metab Syndr 2010;30:46.
[43] Nishimoto Y, Tomida T, Matsui H, Ito T, Okumura K. Decrease in renal medullaryendothelial nitric oxide synthase of fructose-fed, salt-sensitive hypertensive rats.Hypertension 2002;40:190–4.
[44] Kotchen TA, Kotchen JM. Dietary sodium and blood pressure: interactions withother nutrients. Am J Clin Nutr 1997;65:708S–11S.
[45] Vasdev S, Gill V, Parai S, Gadag V. Effect of moderately high dietary salt and lipoicacid on blood pressure in WKY rats. Exp Clin Cardiol 2007;12:77–81.
[46] Schaefer EJ, Gleason JA, Dansinger ML. Dietary fructose and glucose differentiallyaffect lipid and glucose homeostasis. J Nutr 2009;139:1257S–62S.
[47] Gans RO, Bio HJ, Donker AJ. The renal response to exogenous insulin in non-insulin-dependent diabetes mellitus in relation to blood pressure and cardiovas-cular hormonal status. Nephrol Dial Transplant 1996;11:794–802.
[48] Hall JE, Coleman TG, Mizelle HL, Smith Jr MJ. Chronic hyperinsulinemia and bloodpressure regulation. Am J Physiol 1990;258:F722–31.
[49] Hall JE, Brands MW, Zappe DH, Dixon WN, Mizelle HL, Reinhart GA, et al.Hemodynamic and renal responses to chronic hyperinsulinemia in obese, insulin-resistant dogs. Hypertension 1995;25:994–1002.
[50] Vasdev S, Gill V, Parai S, Gadag V. Fructose-induced hypertension inWistar–Kyotorats: interaction with moderately high dietary salt. Can J Physiol Pharmacol2007;85:413–21.
[51] Gordeeva AV, Zvyagilskaya RA, Labas YA. Crosstalk between reactive oxygenspecies and calcium in living cells. Biochemistry 2003;68:1077–80.
[52] Ferret PJ, Hammoud R, Tulliez M, Tran A, Trebeden H, Jaffray P, et al. Detoxificationof reactive oxygen species by a nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase curesacetaminophen- induced acute liver failure in the mouse. Hepatology 2001;33:1173–80.
[53] Grattagliano I, Caraceni P, Calamita G, Ferrid D, Gargano I, Palasciano G, et al.Severe liver steatosis correlates with nitrosative and oxidative stress in rats. Eur JClin Invest 2008;38:523–30.
[54] Lu SC. Regulation of hepatic glutathione synthesis: current concepts andcontroversies. FASEB J 1999;13:1169–83.
[55] Touyz RM. Reactive oxygen species and angiotensin II signaling in vascular cells -implications in cardiovascular disease. Braz J Med Biol Res 2004;37:1263–73.
[56] Datta K, Sinha S, Chattopadhyay P. Reactive oxygen species in health and diseases.Natl Med J India 2000;13:304–10.
[57] Levi B, Werman MJ. Long-term fructose consumption accelerates glycation andseveral age-related variables in male rats. J Nutr 1998;128:1442–9.
7W.C. Dornas et al. / Journal of Nutritional Biochemistry xx (2013) xxx–xxx
Finalidade .
Princípio .
Características do sistema .
Sistema enzimático para determinação do ácido úricopor reação de ponto final em amostras de sangue, urina e líquidos(amniótico e sinovial).
O ácido úrico é determinado de acordo com as seguintesreações:
UricaseÁcido Úrico + O + H O Alantoína + CO + H O
Peroxidase2H O + DHBS + 4-aminoantipirina Antipirilquinonimina + 4H O
O ácido úrico é oxidado pela uricase à alantoina e peróxido de hidrogênio.O peróxido de hidrogênio, na presença da peroxidase, reage com o DHBSe a 4-aminoantipirina, formando o cromogênio antipirilquinonimina.A intensidade da cor vermelha formada é diretamente proporcional àconcentração do ácido úrico na amostra.
A dosagem de ácido úricoutilizando a reação de Trinder caracteriza-se por ser um método direto,facilmente automatizável, que tem a especificidade da uricase. Muitosprodutos utilizam o fenol como reagente de acoplamento. Entretanto, abaixa sensibilidade do fenol e a incompatibilidade de pH ótimo entre auricase de origem animal e a peroxidase criam sérios obstáculos àconfiabilidade do método.
A Labtest, com o sistema Liquiform, supera estas dificuldadessubstituindo o fenol pelo ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibenzeno sulfonato(DHBS), que é 4 vezes mais sensível, permitindo uma relação adequadaentre amostra e reagentes, possibilitando obter uma sensibilidade ótimaem relação à baixa concentração do analito. Ao mesmo tempo a utilizaçãoda uricase de origem vegetal possibilita trabalhar em pH onde se obtémexcelente atividade das enzimas envolvidas no processo.
A determinação do ácido úrico é direta utilizando apenas 0,02 mL deamostra. As substâncias utilizadas na reação se encontram distribuídasadequadamente em dois reagentes para conferir maior estabilidade naforma líquida original e manutenção das condições ótimas da reação,permitindo a utilização direta dos reagentes em sistemas automáticos,facilitando a eliminação da ação de interferentes.
A metodologia monoreagente pode ser aplicada utilizando um Reagentede Trabalho estável 90 dias entre 2 e 8 ºC, obtendo-se desempenhoadequado mesmo em situações de baixas demandas do teste. O sistemapermite ainda preparar o volume de Reagente de Trabalho necessáriopara uma medição da concentração do ácido úrico.
A linearidade do método é de 20 mg/dL, o que diminui a necessidade deefetuar diluições em um número significativo de amostras.
[Somente para uso diagnóstico in vitro.]
2 2 2 2 2
2 2 2
O método proposto utiliza a técnica manual e é facilmente aplicável àmaioria dos analisadores automáticos e semi-automáticos capazes demedir uma reação de ponto final entre 490 e 540 nm.
Enzimático-Trinder.
Contém tampão 80 mmol/L pH 7,0, 4-aminoantipirina 0,82 mmol/L,peroxidase 16000 U/L, azida sódica 0,8 mmol/L e octil fenolpolioxietanol 1 g/L.
Contém tampão 80 mmol/L pH 7,0, DHBS 10 mmol/L, uricase 500 U/L,octil fenol polioxietanol 1 g/L e azida sódica 0,8 mmol/L.
Contém ácido úrico 6,0 mg/dL. Armazenar bem vedado para evitarevaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condiçõesindicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo.Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminação denatureza química e microbiana que podem provocar redução daestabilidade.
Não utilizar o Reagente quando sua absorbância medida contra água em520 nm for igual ou maior que 0,300 ou quando mostrar-se turvo ou comsinais de contaminação.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação do reagente. Os reagentes contêm azida sódica que é tóxica.Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato comos olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidade de água eprocurar auxílio médico. A azida pode formar compostos altamenteexplosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grandevolume de água para descartar os reagentes.
Cuidados com o tempo de reação, temperatura de trabalho e pipetagenssão extremamente importantes para obtenção de resultados corretos.
Os reagentes devem ser manuseados seguindo as boas práticas delaboratório que indicam evitar ingestão e contato com pele, mucosas eolhos.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nas condiçõesindicadas, são estáveis até a data de expiração impressa no rótulo.Durante o manuseio, os reagentes estão sujeitos à contaminações denatureza química e microbiana que podem provocar redução daestabilidade.
Metodologia .
Reagentes
1. -
2. -
3. -
Reagente 1 - Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Reagente 2 - Armazenar entre 2 - 8 ºC.
Padrão - Armazenar entre 2 - 8 ºC.
≥
≥
ÁCIDO ÚRICO LiquiformInstruções de Uso
Ref.: 73MS 10009010071
01 Português - Ref.: 73
Precauções e cuidados especiais
1
2
Material necessário e não fornecido1.2.
3.4.
Influências pré-analíticas .
Banho-maria ou incubador mantido à temperatura constante (37 °C).
Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre 490 e540 nm.
Pipetas para medir amostras e reagentes.
Cronômetro.
O ácido úrico está aumentado nas 24horas que sucedem à ingestão aguda de álcool.As concentrações séricas mostram grandes variações no dia a dia evariações sazonais no mesmo indivíduo. O ácido úrico sérico se elevacom o stress, estados de jejum prolongado e aumento do peso corporal.
Níveis elevados de ascorbato (vitamina C) produzem interferênciasnegativas por competição com o cromogênio na reação da peroxidase.Se houver suspeita da presença de ácido ascórbico, deixar o soro emrepouso durante 90 minutos antes de iniciar a dosagem para não obterresultados falsamente diminuídos.
Usar soro, urina e líquidos (amniótico e sinovial). O analito é estável 3 diasentre 2 - 8 ºC e 6 meses a 10 ºC negativos.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP) queestabeleça procedimentos adequados para colheita, preparação earmazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos à amostrapodem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimentoanalítico.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sanguenão transmitem infecções, todas elas devem ser consideradas comopotencialmente infectantes. Portanto, ao manuseá-las, deve-se seguir asnormas estabelecidas para biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimos aplicar asnormas locais, estaduais ou federais de proteção ambiental.
A utilização de plasma fornece resultados falsamente diminuídos.
Valores de bilirrubina até 19 mg/dL, hemoglobina até 90 mg/dL etriglicérides até 1800 mg/dL não produzem interferências significativas.
Valores de hemoglobina entre 90 e 180 mg/dL produzem resultadosfalsamente elevados que podem ser minimizados utilizando o branco daamostra.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina em umaamostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo: diluir 0,05 mLda amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e medir aabsorbância em 405 ou 415 nm acertando o zero com água deionizadaou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 601Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 467
≅≅
405
415
Branco da amostra .
Preparo do reagente de trabalho .
Este procedimento é aplicável quando houveração positiva de interferentes. Misturar 1 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) com 0,02 mL da amostra. Medir a absorbância em 520 nm,acertando o zero com água destilada ou deionizada. Subtrair aabsorbância assim obtida da absorbância do teste e calcular aconcentração. Este sistema de correção é aplicável apenas nos casos emque a amostra produz interferência fotométrica.
O conjunto de um frasco doReagente 1 e um frasco de Reagente 2 permite preparar o Reagente deTrabalho. Transferir o conteúdo de um frasco do Reagente 2 para umfrasco do Reagente 1 e homogeneizar suavemente. Anotar a data deexpiração. Estável 5 dias entre 15 - 25 °C e 90 dias entre 2 - 8 °C quandonão houver contaminação química ou microbiana. Identificar o frasco doReagente de Trabalho para evitar confusão com outros frascos doReagente 1. Para preservar seu desempenho o reagente devepermanecer fora da geladeira somente o tempo necessário para se obtero volume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta.
Opcionalmente pode-se preparar menor volume do Reagente de Trabalhoutilizando a proporção de 4 volumes do Reagente 1 para 1 (um) volumedo Reagente 2.
O Reagente de Trabalho contém tampão 80 mmol/L pH 7,0,4-aminoantipirina 0,7 mmol/L, DHBS 2,0 mmol/L, peroxidase 13300 U/L,uricase 100 U/L, azida sódica 0,8 mmol/L e octil fenol polioxietanol 1 g/L.
Ver
Homogeneizar a urina, separar 10 mL, acertar o pH entre 7,0 e 9,0com NaOH 5% e aquecer 10 minutos a 56 °C para dissolver os cristais deurato e ácido úrico. Diluir a urina 1:10 (0,1 mL de urina + 0,9 mL de águadestilada). Multiplicar o resultado obtido por 10.
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Misturar e incubar em banho-maria a 37 °C durante 10 minutos. O nível daágua no banho deve ser superior ao nível do reagente nos tubos deensaio. Determinar as absorbâncias do teste e padrão em 520 nm ou filtroverde (490-540) acertando o zero com o branco. A cor é estável 15minutos.
O procedimento sugerido para a medição é adequado para fotômetroscujo volume mínimo de solução para leitura é igual ou menor que 1,0 mL.Deve ser feita uma verificação da necessidade de ajuste do volume para ofotômetro utilizado. Os volumes de amostra e reagente podem sermodificados proporcionalmente sem prejuízo para o desempenho doteste e o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volume mínimonecessário para a leitura fotométrica. Volumes da amostra menores que0,01 mL são críticos em aplicações manuais e devem ser usados comcautela porque aumentam a imprecisão da medição.
OBSERVAÇÕES 1 e 2.
Urina .
02
Interferências
Português - Ref.: 73
Procedimento
Amostra
Branco
1,0 mL 1,0 mL
Teste0,02 mL
0,02 mL
Padrão
1,0 mLPadrão (N° 3)Reagente de Trabalho
Amostra
O resultado da medição é linear até 20 mg/dL. Quando for obtido um valorigual ou maior que 20 mg/dL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L(0,85%), realizar nova medição e multiplicar o resultado pelo fator dediluição.
Diluir a amostra (com pH entre 7,0 e 9,0 e aquecida 10 minutos a56 ºC) 1:20 ou 1:40 com água destilada ou deionizada e repetir amedição. Multiplicar o resultado obtido por 20 (vinte) ou 40 (quarenta).
Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situe entre 5 e10 mg/dL.
Sugerimos a verificação da linearidade metodológica e fotométrica, nomínimo semestralmente, utilizando amostra com valores até 20 mg/dL.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linha Qualitrol - Labtestpara controle interno da qualidade em ensaios de química clínica.
Os intervalos devem ser usados apenascomo orientação. Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, seuspróprios intervalos de referência na população atendida.
250 a 750 mg/24 horas
Unidades Convencionais (mg/dL) x 59,5 = Unidades SI( mol/L).
Em duas amostras com concentrações de ácido úricoiguais a 6,2 e 8,0 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes doanalito obtendo-se recuperações entre 96 e 98%. O erro sistemáticoproporcional médio obtido em um valor de 6,0 mg/dL foi igual a0,2 mg/dL ou 3,0%.
O método proposto foi comparado com um métodosimilar utilizando 40 amostras com valores situados entre 2,4 e11,0 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressão: y =1,030x - 0,137 e um coeficiente de correlação (r) igual a 0,996.
Urina .
Urina:
Conversão:
Controle interno da qualidade .
Intervalo de referência .
Características do desempenho
Exatidão .
Especificidade .
µ
12
O laboratório deve manter umprograma de controle interno da qualidade que defina claramente osregulamentos aplicáveis, objetivos, procedimentos, critérios paraespecificações da qualidade e limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Materiais de controle devem ser utilizados paraavaliar a imprecisão e desvios da calibração.
Sugere-se que as especificações para o coeficiente de variação e o errototal sejam baseadas nos componentes da variação biológica (VB) .9,10
Cálculos
Exemplo
Exemplo
Calibração
Absorbância do TesteÁcido Úrico (mg/dL) = x 6
Absorbância do Padrão
Absorbância do Teste = 0,175Absorbância do Padrão = 0,138
0,175Ácido Úrico (mg/dL) = x 6 = 7,6
0,138
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia, pode-se utilizar o método do fator.
6Fator de Calibração =
Absorbância do Padrão
Ácido Úrico (mg/dL) = Absorbância do Teste x Fator
6Fator = = 43,5
0,138
Ácido Úrico (mg/dL) = 0,175 x 43,5 = 7,6
mg/dL x volume urinário (mL)Urina (mg / 24 horas) =
100
O padrão é rastreável ao Standard Reference Material (SRM) 913 doNational Institute of Standards and Technology (NIST).
Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentes ou quando ocontrole interno da qualidade indicar.
Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio 150 mmol/L(0,85%);Padrões: usar calibradores protéicos. As concentrações de ácido úriconos calibradores da linha Calibra - Labtest são rastreáveis ao SRM 913 doNIST.
Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle interno da qualidadeindicar.
Rastreabilidade do sistema
Calibrações manuais
Sistemas automáticos
Intervalo de calibrações
03 Português - Ref.: 73
Linearidade
Soro (mg/dL)
Crianças11
Adultos
HomemMulherHomemMulher
2,5 a 7,00,5 a 5,01,5 a 6,0
1,5 a 6,0
O erro sistemático total (constante e proporcional) verificado no nível dedecisão (6,0 mg/dL) foi igual a 0,043 mg/dL ou 0,7%. Como as amostrasforam selecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório epacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.
Uma amostra não contendo ácidoúrico foi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendo sidoencontrado um valor igual a 0,071 mg/dL, equivalente à média de 20ensaios mais dois desvios padrão.
Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro verificou-se queo limite de detecção fotométrica é 0,034 mg/dL, correspondendo a umaabsorbância igual a 0,001.
Duas amostras com valoresiguais a 13,7 e 15,2 mg/dL foram utilizadas para avaliar a resposta dosistema nas diluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usandofatores de diluição que variaram de 2 a 8 foram encontradasrecuperações entre 91 e 103%.
Numerosas doenças, condições fisiológicas,alterações bioquímicas, fatores sociais e ambientais estão associados aelevações na concentração do urato plasmático. Entre as etiologias dahiperuricemia estão: insuficiência renal, cetoacidose, excesso de lactato,uso de diuréticos e em todas as patologias em que a destruição denucleoproteínas está aumentada. O aumento de urato está positivamenterelacionado à hiperlipidemia, obesidade, aterosclerose, diabetes mellituse hipertensão, embora os mecanismos destas alterações ainda nãosejam bem compreendidos.
A gota, manifestação clínica da hiperuricemia, é classificada comoprimária, secundária ou idiopática. É importante lembrar que a gotasecundária é uma complicação pouco comum quando relacionada àfrequência da hiperuricemia. É importante mencionar que a colchicina,utilizada nos casos de gota aguda, não modifica os valores do ácidoúrico.
São pouco freqüentes as causas da hipouricemia ocorrendo na síndromede Fanconi, doença de Wilson, acromegalia, anemia perniciosa edoenças malignas como linfoma de Hodgkin e carcinoma broncogênico.
A limpeza e secagem adequadas do material utilizado são fatoresfundamentais para a estabilidade dos reagentes e obtenção de resultadoscorretos.
Sensibilidade metodológica .
Efeitos da diluição da matriz .
Significado clínico .
Observações
1.
2.
3.
Referências
O laboratório clínico tem como objetivo fornecer resultados exatos eprecisos. A utilização de água de qualidade inadequada é uma causapotencial de erros analíticos. A água utilizada no laboratório deve ter aqualidade adequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes,usar nas medições e para uso no enxágüe final da vidraria, deve terresistividade 1 megaohm.cm ou condutividade 1 microsiemens/cm econcentração de silicatos <0,1 mg/L. Quando a coluna deionizadora estácom sua capacidade saturada ocorre produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grande poder deoxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucos dias oumesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisível. Assim, éfundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da água.
Para uma revisão das fontes fisiopatológicas e medicamentosas deinterferência nos resultados e na metodologia sugere-se consultar:<www.fxol.org/>.
1. Duncan PH, Gochman N, Cooper T, Smith E, Sayze D. Clin Chem1982;28:284-290.
2. Elin RJ, Johnson E, Chesler R. Clin Chem 1982;28:2089.
3. Inmetro - Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas de Verificaçãopara Avaliação, Qualitymark ed., Rio de Janeiro, 1997.
4. Kabasakalian P, Kalliney S, Westcott A. Clin Chem 1973; 19:522.
5. Kageyama N. Clin Chim Acta 1971;31:421.
6. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-ChilcottLaboratories, Diagnostic Reagents Division, Scarborough, Canada,1972.
7. Trivedi RC, Rebar L, Berta E, Stong L. Clin Chem 1978; 24:1908.
8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501.
12. Labtest: Dados de arquivo.
≥ ≤
9. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular,Base de Da tos de Var i ac ión B io lóg ica . D ispon íve lem:<http://www.seqc.es/ar t ic le/ar t ic leview/330/1/170>(acessoem 04/2006).
10. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica. LabtestDiagnóstica 2005.
11.Ferraz MHC, Delgado RB. Valores de Referência para ExamesLaboratoriais. In: Leão E, Corrêa EJ, Viana MB, Mota JAC (Ed).Pediatria Ambulatorial. 3a. edição Belo Horizonte: Coopmed, 1988:837-848.
04 Português - Ref.: 73
Média
6,68,4
DP0,090,07
CV (%)
1,30,8
N
2020Amostra 2
Amostra 1
Repetitividade - imprecisão intra-ensaio
Média
6,68,5
DP0,130,12
CV (%)
2,01,4
N
2020Amostra 2
Amostra 1
Reprodutibilidade - imprecisão total
Estão disponíveis aplicações
O número de testes
garante o desempenho deste produto dentro dasespecificações até a data de expiração indicada nos rótulos desde que oscuidados de utilização e armazenamento indicados nos rótulos e nestasinstruções sejam seguidos corretamente.
para sistemas automáticos e semi-automáticos.
em aplicações automáticas depende dosparâmetros de programação.
[Termos e Condições de Garantia]
A Labtest Diagnóstica
Informações ao consumidor
05 Português - Ref.: 73
Revisão: Novembro, 2004Ref.: 170309
Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Reprodução sob prévia autorização
Apresentação
Produto Referência Conteúdo
73-4/30
Ácido ÚricoLiquiform
73-2/100
4 x 6 mL1 x 5 mL
4 x 24 mL1
2
2 x 20 mL1 x 5 mL
2 x 80 mL1
2
CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre - CEP 33400-000Lagoa Santa . Minas Gerais Brasil - www.labtest.com.br
Labtest Diagnóstica S.A.
Serviço de Apoio ao Cliente 0800 031 34 11 (Ligação Gratuita)e-mail: [email protected]
06 Português - Ref.: 73
Símbolos utilizados com produtos diagnósticos in vitroSímbolos usados con productos diagnósticos in vitro
Symbols used with ivd devices
Representante Autorizado na Comunidade EuropeiaRepresentante autorizado en la Comunidad EuropeaAuthorized Representative in the European Community
Conteúdo suficiente para < n > testesCC
ontenido suficiente para < n > testsontains sufficient for < n > tests
Data limite de utilização (aaaa-mm-dd ou mm/aaaa)Estable hastaUse by
(aaaa-mm-dd o mm/aaaa)(yyyy-mm-dd or mm/yyyy)
Limite de temperatura (conservar a)Temperatura limiteTemperature limitation
(conservar a)(store at)
Material CalibradorMaterial CalibradorCalibrator Material
Material CalibradorMaterial CalibradorCalibrator Material
Consultar instruções de usoConsultar instrucciones de usoConsult instructions for use
Adições ou alterações significativasCambios o suplementos significativosSignificant additions or changes
LiofilizadoLiofilizadoLyophilized
Produto diagnóstico in vitroDispositivo de diagnóstico in vitroIn vitro diagnostic device
Número do catálogoNúmero de catálogoCatalog Number
Ref.: 170309
CorrosivoCorrosivoCorrosive
Controle negativoControl negativoNegative control
Controle positivoControl positivoPositive control
ControleControlControl
ControleControlControl
Marca CEMarcado CECE Mark
TóxicoTóxicoPoison
ReagenteReactivoReagent
Número do loteDenominación de loteBatch code
Risco biológicoRiesgo biológicoBiological risk
Fabricado porElaborado porManufactured by
ALBUMINA
Cat. 19
ANVISA10009010025
FINALIDADE
PRINCÍPIO
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
METODOLOGIA
REAGENTES
1. Reagente de Cor -
2. Padrão 3,8 g/dL -
Sistema para a determinação da albumina em amostras desoro por reação de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.
A albumina tem a propriedade de se ligar à uma grandevariedade de ânions orgânicos e moléculas complexas decorantes.O sistema de medição se baseia no desvio do pico deabsortividade máxima de um corante complexo (verde debromocresol) quando este se liga à albumina. A cor formada émedida colorimetricamente entre 620 e 640 nm, sendoproporcional à quantidade de albumina na amostra até aconcentração de 6,0 g/dL.
Os métodos mais comumente utilizados para a dosagem daalbumina se baseiam na ligação com corantes. Esta ligaçãoque promove um desvio do pico de absortividade do corante,permite que a cor resultante possa ser medidacolorimetricamente na presença de excesso do corante. A altaafinidade de ligação da albumina permite que todas as suasmoléculas presentes na amostra participem da reação. Osistema contém um detergente não iônico que reduz aabsorbância do branco, previne o aparecimento de turvação eaumenta a linearidade.
Vários corantes como o metilorange, HABA, verde debromocresol (VBC) e púrpura de bromocresol (PBC) têm sidoutilizados na dosagem da albumina sérica, mas o VBC é oreagente mais utilizado tendo inclusive sido recomendado pelaAACC . Este também tem sido o método de escolha doslaboratórios, pois foi utilizado por 60% dos participantes doprograma de proficiência do Colégio Americano dePatologistas no ano de 2002.
O verde de bromocresol possui especificidade para a albuminae não sofre interferência de valores elevados da bilirrubina ehemoglobina, permitindo também que a interferência devalores elevados dos triglicérides possa ser corrigidautilizando o branco da amostra.
O método tem excelente correlação com o fracionamentoeletroforético em acetato de celulose e é facilmente aplicável àmaioria dos analisadores semi-automáticos e automáticoscapazes de medir uma reação de ponto final entre 625 e640 nm.
Verde de Bromocresol.
Armazenar entre 2 - 8 ºC.Contém tampão 60 mmol/L, pH 3,8; verde de bromocresol300 mol/Le Brij 35 6,0 mmol/L.
Armazenar entre 2 - 8 ºC.Contém 3,8 g/dL de albumina bovina e azida sódica0,1%.Armazenar bem vedado para evitar evaporação.
3
� �
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos a contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação do reagente.
O padrão contém azida sódica que é tóxica. Deve-se tomarcuidado para evitar a ingestão e no caso de contato com osolhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água paradescartar o reagente.
Um forte indício de deterioração é indicado por umaabsorbância maior que 0,300 quando o Reagente de Cor émedido em 630 nm contra água.
Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre600 e 640 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.
Usar soro. A albumina é estável no soro 3 dias entre 2 - 8 ºC e7 dias a 10 ºC negativos.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las deve-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
Valores de bilirrubina até 38 mg/dL, hemoglobina até180 mg/dL e triglicérides até 250 mg/dL não produzeminterferências significativas.Valores de triglicérides maiores que 250 mg/dL produzeminterferências positivas que podem ser minimizadas utilizandoo branco de amostra.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada, pode-se proceder do seguintemodo: Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl150 mmol/L (0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nmacertando o zero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) Absorbância X 601Hemoglobina (mg/dL) Absorbância X 467
Branco da amostra: Misturar 1,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) com 0,01 mL da amostra. Medir a absorbância em
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
AMOSTRA
Não usar plasma.
INTERFERÊNCIAS
Minimização daAção de Interferentes
�
�
405
415
Instruções de Uso
630 nm, acertando o zero com água deionizada ou destilada.Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste ecalcular a concentração. Este sistema de correção é aplicávelapenas aos casos em que a amostra produz interferênciafotométrica.
Em pacientes com depressão e pessoas obesas, o valor dealbumina tende a ser mais baixo.O uso de torniquete por mais de 3 minutos provoca o aumentodo valor da albumina.Plasmas obtidos com heparina de lítio e oxalato de potássiocombinado com fluoreto de sódio fornecem resultadosfalsamente diminuídos.
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Misturar e após 2 minutos, no máximo 10 minutos, determinaras absorbâncias do teste e padrão em 630 nm ou filtrovermelho (600 a 640) acertando o zero com o branco.
O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do testee o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volumemínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes daamostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.
Absorbância do testeAlbumina (g/dL) = x 3,8
Absorbância do padrão
Absorbância do teste = 0,242Absorbância do padrão = 0,302
0,242Albumina (g/dL) = x 3,8= 3,0
0,302
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia, pode-se utilizar o método do fator.
3,8Fator de Calibração =
Absorbância do padrão
Albumina (g/dL) =Absorbância do teste x Fator
Influências Pré-Analíticas
PROCEDIMENTO
CÁLCULOS
Exemplo:
Exemplo:
CALIBRAÇÃO
Calibrações Manuais
SistemasAutomáticos
Intervalo de calibrações
LINEARIDADE
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
INTERVALO DE REFERÊNCIA
3,8Fator = = 12,6
0,302
Albumina (g/dL) = 0,242 x 12,6 = 3,0
O padrão é rastreável ao Certified Reference Material -CRM (BCR) 470 do Institute for Reference Materials andMeasurements/International Federation of Clinical Chemistry(IRMM/IFCC).
Obter semanalmente o fator de calibração.
Branco de reagentes: água ou solução de NaCl150 mmol/L (0,85%);Padrões: usar calibradores protéicos. As concentraçõesde albumina nos calibradores da linha Calibra da Labtestsão rastreáveis ao CRM (BCR) 470 do IRMM/IFCC.
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle internoda qualidade indicar.
O resultado da medição é linear até 6,0 g/dL. Para valoresmaiores, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fatorde diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontradose situe entre 3,0 e 4,5 g/dL. Sugerimos a verificação dalinearidade metodológica e fotométrica, no mínimosemestralmente, utilizando amostras com valores até 6,0 g/dL.
O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis,objetivos, procedimentos, critérios para especificações daqualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registrodas atividades. Materiais de controle devem ser utilizados paraavaliar a imprecisão e desvios da calibração. Sugere-se que asespecificações para o coeficiente de variação e o erro totalsejam baseadas nos componentes da variação biológica
(VB) .
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linhaQualitol da Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.
Os intervalos devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, napopulação atendida, seus próprios intervalos de referência.
�
�
�
�
�
5, 6,7
Reagente de Cor (nº 1) 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Padrão (nº 2) ---- ---- 0,01 mL
---- 0,01 mL ----Amostra
Branco Teste Padrão
31 a 182 dias 2,8 a 4,6
1 a 30 dias 2,6 a 4,3
Crianças e Adolescentes (g/dL)8
183 a 365 dias 2,8 a 4,8
1 a 18 anos 2,9 a 4,7
enteropatias com perda protéica (doença de Chron, coliteulcerativa), doenças inflamatórias como as doençasautoimunes, imobilização prolongada, falência cardíaca eoutros estados catabólicos crônicos. A elevação da albuminasérica é encontrada somente na desidratação.
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução, que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes medicamentosas deinterferência nos resultados e na metodologia sugere-seconsultar: <www.fxol.org/>.
1. Bartholomew RJ, Delaney AM. Proc Austral Assoc ClinBiochem 1966;1:214.
2. Basques JCA, Cabral GL, Cruz RS. Com II Congr Bras AnalClin. Janeiro, 1972.
3. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Wamer-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.
4. Peters T, Biamont GT, Doumas BT. Albumin in serum. EmFaulkner WR. Meites S, eds. Selected methods of clinicalchemistry, volume 9, Washington:AACC Press, 1982:319.
5. Westgard JO, Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501.
6.Sociedad Española de Bioquímica Clínica y PatologíaMolecular, Base de Datos de Variación Biológica.Disponívelem:<http://www.seqc.es/article/articleview/330/1/170> (acesso em 04/2006).
7.Basques JC. Especificações da QualidadeAnalítica. LabtestDiagnóstica 2005.
8.Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC: Pediatric ReferenceRanges, 5a. edição, Washington:AACC Press, 2005:5-6.
9. Labtest: Dados deArquivo.
OBSERVAÇÕES
REFERÊNCIAS
APRESENTAÇÃO
Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos.
�
�
�
�
Adultos: 3,5 a 5,5 g/dL
Conversão: Unidades Convencionais (g/dL) x 144,9 =Unidades SI (µmol/L)
Em duas amostras com concentrações de albumina iguais a2,7 e 4,2 g/dL foram adicionadas quantidades diferentes doanalito, obtendo-se recuperações entre 97 e 103%. O errosistemático proporcional médio obtido em um valor de 3,5 g/dLfoi igual a 0,04 g/dLou 1,1%.
O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 80 amostras com valores situados entre2,5 e 5,3 g/dL. A comparação resultou na equação daregressão: y = 0,09 + 0,98x e um coeficiente de correlação (r)igual a 0,994. O erro sistemático total (constante eproporcional) verificado no nível de decisão (3,5 g/dL) foi iguala 0,02 g/dL ou 0,6%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.
Uma amostra protéica não contendo albumina foi utilizadapara calcular o limite de detecção do ensaio tendo sidoencontrado um valor igual a 0,015 g/dL, equivalente a média de20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se aabsorbância do padrão como parâmetro, verificou-se queo limite de detecção fotométrica é de 0,013 g/dL,correspondendo a uma absorbância igual a 0,001.
Duas amostras com valores iguais a 6,3 e 6,7 g/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores dediluição que variaram de 2 a 8 foram encontradasrecuperações entre 95 e 103%.
A albumina é a proteína mais importante do plasma humano,representando 40 a 60% do total de proteína. Os níveisplasmáticos de albumina, devido à sua relação com o aportede proteína e à produção no fígado, são freqüentementeusados como parâmetro para avaliação do estado nutricional efunção hepática.
Diminuições da albumina ocorrem na cirrose e outras doençashepáticas incluindo o alcoolismo crônico, na gravidezassociado ao uso de contraceptivos orais, em muitas doençascrônicas incluindo neoplasias, síndrome nefrótica,
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHO
Exatidão
Especificidade
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
Reprodutibilidade - Imprecisão total
Sensibilidade metodológica
Efeitos da diluição da matriz
SIGNIFICADO CLÍNICO
6
MÉDIAN DP CV%
Amostra 1 20 3,5 0,03 0,9
Amostra 2 20 5,2 0,06 1,2
MÉDIAN DP CV%
Amostra 1 20 3,4 0,07 2,0
Amostra 2 20 5,1 0,06 1,2
19-250
1 x 250 mL1 x 1 mL
19-100
1 x 100 mL1 x 1 mL
Catálogo
Reagente de CorPadrão
Revisão: Dezembro, 2005. Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 181206 Reprodução sob prévia autorização
O número de testes em aplicações automáticas depende
dos parâmetros de programação.
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDOR
Termos e Condições de Garantia
Serviço deApoio ao Cliente
Labtest Diagnóstica S.A.
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos, desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.
Telefone 0800-31-3411 - Ligação Gratuitae-mail: [email protected]
CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000www.labtest.com.br
COLESTEROL HDLCat.13ANVISA10009010026
FINALIDADE
PRINCÍPIO
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
METODOLOGIA
REAGENTES1. Precipitante -
2. Padrão 20 mg/dL -
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
Sistema para precipitação seletiva das lipoproteínas de baixa emuito baixa densidade (LDL e VLDL) e determinação doColesterol HDLno sobrenadante, com reação de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.
As lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL) e aslipoproteínas de baixa densidade (LDL) são quantitativamenteprecipitadas e após centrifugação, o colesterol ligado àslipoproteínas de alta densidade (Colesterol HDL) édeterminado no sobrenadante.
Na seleção de um sistema para dosar o Colesterol HDL, aLabtest optou pelo ácido fosfotúngstico e cloreto de magnésioque, precipitando seletiva e quantitativamente as VLDL e LDLpermitem a obtenção de resultados comparáveis ao do métodode referência.
Após centrifugação o Colesterol HDL é determinado nosobrenadante utilizando o sistema enzimático ColesterolLiquiform - Labtest (Cat. 76).
O sistema de medida colorimétrica é facilmente adaptável àmaioria dos analisadores automáticos capazes de medir umareação de ponto final em 500 nm.
Labtest
Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém ácido fosfotúngstico 1,5 mmol/L e cloreto de magnésio54 mmol/L.
Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém Colesterol 0,52 mmol/L. Armazenar bem vedado paraevitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Não utilizar o Reagente 1 - Colesterol Liquiform - Labtest(Cat.76) quando sua absorbância medida contra a água em500 nm for igual ou maior que 0,300, ou quando mostrar-seturvo ou com sinais de contaminação.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação do reagente.
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre490 e 540 nm.Pipetas para medir amostras e reagente.Cronômetro.Centrífuga com capacidade superior a 3500 rpm.Reagente para determinação de colesterol.
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
AMOSTRA
INTERFERÊNCIAS
As concentrações do colesterol HDL medidas em um mesmoindivíduo e em diferentes ocasiões podem flutuarconsideravelmente devido as variações biológicas e tambémàs variações do método analítico.As concentrações no sanguesão fortemente influenciadas por fatores tais como dietarecente, ingestão de álcool, variações do peso corporal,atividades físicas e hábito de fumar. Os hormônios e outrasmedicações também produzem variações na concentração docolesterol HDL.
Considera-se que a variação biológica está em torno de 7,5%.Assim, em uma série de repetições da dosagem em ummesmo indivíduo, dois terços dos resultados estarão entre7,5% do valor médio. Portanto, a variação biológica se
constitui no fator mais importante da variabilidade total docolesterol HDL. Os efeitos da variação biológica podem sercontrolados até certo ponto através da padronização dascondições de preparo do paciente e da colheita da amostra,mas o colesterol HDL não pode ser estimado com confiançaatravés de um ensaio de uma única amostra. Várias amostrasdevem ser obtidas e a média dos resultados pode serconsiderada como a concentração usual do colesterol HDL ou,mais exatamente, pode ser considerada a faixa usual deresultados para o indivíduo.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.
Usar soro. O analito é estável 3 dias entre 2 - 8 °C. Obter aamostra após jejum de pelo menos 12 horas. Não utilizaramostras fortemente hemolisadas.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las, deve-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
Valores de bilirrubina até 5 mg/dL, hemoglobina até180 mg/dL e triglicérides até 750 mg/dL não produzeminterferências significativas.
Valores de bilirrubina acima de 5 mg/dL produzem resultadosfalsamente diminuídos.
Valores de triglicérides acima de 750 mg/dL produzemresultados falsamente elevados.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando ozero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 601
Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 467
�
�
�
405
415
Instruções de Uso
LIMITAÇÕES DO MÉTODO
PROCEDIMENTO
Precipitação das VLDL e LDL
Soro 0,25 mLPrecipitante 0,25 mL
Colorimetria
Manter sempre a relaçãoAmostra/Precipitante igual a 1:1.
Após a centrifugação, remover o sobrenadante límpido dentrode 15 minutos para evitar resultados falsamente elevados.
Amostras lipêmicas e ocasionalmente amostras não lipêmicaspodem apresentar o sobrenadante turvo. Neste caso diluir aamostra 1:2 com NaCI 150 mmol/L e repetir a precipitação.Multiplicar o resultado final por 2. Caso o sobrenadantepermaneça ainda turvo a amostra não pode ser utilizada paradeterminar o colesterol HDL.
Algumas amostras, principalmente lipêmicas, podemapresentar o sobrenadante límpido com uma camada na suasuperfície que não deve ser pipetado, para evitar resultadosfalsamente elevados.
Ver limitações do método.
Em um tubo 12 x 75 colocar:
Agitar vigorosamente durante 30 segundos. A agitaçãosugerida é fundamental para obtenção de resultadosconsistentes. Centrifugar a 3500 rpm por pelo menos 15minutos para obter um sobrenadante límpido. Pipetar osobrenadante límpido imediatamente após a centrifugação,tomando o cuidado para não ressuspender o precipitado, a fimde evitar resultados falsamente elevados.
Verobservações1,2e3.
Utilizar com o Reagente 1 - Colesterol Liquiform - Labtest(Cat. 76).
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Misturar e colocar no banho-maria a 37 C durante10 minutos. O nível da água no banho deve ser superior aonível do reagente nos tubos de ensaio. Determinar asabsorbâncias do teste e padrão em 500 nm ou filtro verde(490 a 540) acertando o zero com o branco. A cor é estável por60 minutos.
O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do testee o procedimento de cálculos se mantém inalterado. Em casode redução dos volumes é fundamental que se observe ovolume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumesda amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.
o
CÁLCULOS
Exemplo
Exemplo
LINEARIDADE
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
Devido a diluição 1:2 aplicada às amostras durante oprocedimento de precipitação das VLDL e LDL, o valor doPadrão para cálculo dos resultados deve ser corrigido para40 mg/dL.
Absorbância do TesteColesterol HDL(mg/dL) = x 40
Absorbância do Padrão
Absorbância do Teste = 0,290Absorbância do Padrão = 0,320
0,290Colesterol HDL(mg/dL) = x 40 = 36
0,320
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia, pode-se utilizar o método do fator.
40Fator de Calibração =
Absorbância do Padrão
Colesterol HDL(mg/dL) =Absorbância do Teste x Fator
40Fator = = 125
0,320
Colesterol HDL(mg/dL) = 0,290 x 125 = 36
O resultado da medição é linear até 200 mg/dL. Quando forobtido um valor igual ou maior que 200 mg/dL, diluir a amostra1:2 com NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar nova medição emultiplicar o resultado pelo fator de diluição.
O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter umsistema definido para monitorizar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e desvios de calibraçãodeve ser prática rotineira no laboratório clínico. Sugere-se usarum controle com um valor situado na faixa de referência ou nonível de decisão e outro controle com um valor em outra faixade significância clínica. Deve-se criar uma meta de estado decontrole para que o erro de bias seja ± 5,0%, e o erro total seja
13% e monitorar continuamente o estado de controle atravésdo sistema de regras de controle .
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da LinhaQualitrol - Labtest, para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.
�
�8
RASTREABILIDADE DO SISTEMAA calibração do sistema é rastreável ao Standard ReferenceMaterial (SRM) 911 do
(NIST).National Instituite of Standards and
Technology
Reagente 1
Branco Teste Padrão
Sobrenadante ----
----
1,0 mL
0,1 mL
----
1,0 mL
----
0,1 mL
1,0 mL
Padrão (nº2)
VALORES DESEJÁVEIS OU RECOMENDADOS
Classificação ATP III de Colesterol Total, LDL e HDL(mg/dL):
Colesterol HDL
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão
Especificidade
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, napopulação atendida, sua própria faixa de valores de referência.
Os valores desejáveis ou recomendados substituem osvalores de referência e são determinados a partir de dadosepidemiológicos, calculados estatisticamente, que relacionamos níveis do colesterol com a prevalência de doença coronariaisquêmica (DCI).
Desejável:Limiar elevado: 200-239Elevado: 240
Ótimo: < 100Limiar ótimo: 100-129Limiar elevado: 130-159Elevado: 160-189Muito elevado: 190
Baixo: < 40Elevado (desejável): 60
Em duas amostras com concentrações de colesterol HDLiguais a 28 e 54 mg/dL foram adicionadas quantidadesdiferentes do analito, obtendo-se recuperações entre 95 e100%. O erro sistemático proporcional médio obtido em umvalor de 60 mg/dL foi igual a 1,2 mg/dLou 2,0%.
O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 80 amostras com valores situados entre 7 e86 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressão:y = 1,337 + 0,932x e um coeficiente de correlação (r) igual a0,993. O erro sistemático total (constante e proporcional)verificado no nível de decisão (60 mg/dL) foi igual a2,74 mg/dL ou 4,5%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.
�
�
�
9
Crianças eAdolescentesColesterol Total
Colesterol LDL
Colesterol HDL
AdultosColesterol Total
Colesterol LDL
10
11
Idade: 2 a 19 anos: Desejável: < 170 mg/dLLimítrofe: 170 a 199 mg/dLElevado: 200 mg/dL
Idade: 2 a 19 anos: Desejável: <110 mg/dLLimítrofe: 110 a 129 mg/dLElevado: 130 mg/dL
Idade: < 10 anos: Desejável: 40 mg/dL10 a 19 anos: Desejável: 35 mg/dL
< 200
�
�
�
�
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
Reprodutibilidade - Imprecisão total
Sensibilidade metodológica
Efeitos da diluição da matriz
SIGNIFICADO CLÍNICO
COMO CALCULAR A CONCENTRAÇÃO DO COLESTEROLVLDL E LDL
Equação de Friedewald
Uma amostra protéica não contendo colesterol HDL foiutilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendosido encontrado um valor igual a 0,40 mg/dL, equivalente àmédia de 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se aabsorbância do padrão como parâmetro, o limite de detecçãofotométrica é 0,12 mg/dL, correspondendo a uma absorbânciaigual a 0,001.
Uma amostra com valor igual a 92 mg/dL foi utilizada paraavaliar a resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl150 mmol/L (0,85%). Usando fatores de diluição que variaramde 1,2 a 2,0 encontraram-se recuperações entre 93 e 103%.
Não há dúvida de que o colesterol é um fator de risco para DCIe que ele marcha - junto com o fumo, hipertensão e intolerânciaà glicose - como um dos quatro grandes fatores de DCI.Estudos prospectivos e retrospectivos não deixam dúvidas daexistência de uma interrelação curvilinear entre os níveis decolesterol sérico, mais especificamente LDL e VLDL, e aincidência de DCI.
Em 1977 ficou demonstrado que o Colesterol HDL tem umefeito protetor contra a DCI. Os estudos de Framinghanrevelaram que os níveis do Colesterol HDL são inversamenteproporcionais à prevalência de DCI.
Está bem estabelecido que níveis elevados de Colesterol LDLestão associados com risco aumentado de DCI. Também nãohá dúvida de que tanto o Colesterol Total e as frações LDL eVLDL podem ser diminuídas com dieta ou medicamento.A redução de 1% no valor do Colesterol Total diminui aprevalência de DCI em aproximadamente 2%.
As concentrações do Colesterol Total e do Colesterol HDLdependem de metabolismos distintos e não se deve fazerqualquer tentativa de buscar correlação entre seus níveis deconcentração.
A concentração do Colesterol VLDL e LDL pode ser calculadautilizando a equação de Friedewald, que é exata paraamostras cujas concentrações de triglicérides nãoultrapassem 400 mg/dL e não pertençam a pacientesportadores de lipoproteinemia do Tipo III.
Colesterol VLDL= Triglicérides / 5Colesterol LDL= Colesterol Total - (HDL+ VLDL)
MÉDIAN DP CV(%)
Amostra 1 20
20
40
59
0,60
0,49
1,5
0,8Amostra 2
MÉDIAN DP CV(%)
Amostra 1 20
20
40
58
0,83
0,99
2,0
1,7Amostra 2
Revisão: Abril, 2004. Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 300606 Reprodução sob prévia autorização
OBSERVAÇÕES
REFERÊNCIAS
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos< 0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução, que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes medicamentosas deinterferência nos resultados e na metodologia sugere-seconsultar <www.fxol.org/>.
1. III Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Diretriz dePrevenção da Aterosclerose. Sociedade Brasileira deCardiologia.Arq Bras Cardiol 2001;77(suppl III):1-48.
2. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.
3. Virella MFL, Stone P, Ellis S, Colwell G. Clin Chem 1977;23:882-884.
4. Warnick RG, Naguyent T,AlbersAA. Clin Chem 1985; 2:217-222.
5. Warnick RJ. Handbook of lipoprotein testing. Washington:AACC Press, 1997.
6. Warnick RG, Wood PD. Clin Chem 1995; 41: 1427-33.
7. NCEP - Detection, evaluation and treatment of high bloodcholesterol in adults (Adult Treatment Panel III). NIHPublication 02-5215, Bethesda, MD, 2002.
8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Growth T.1981;27:493-501.
9. Labtest. Dados deArquivo.
10. Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS,Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Riscocardiovascular: fatores metabólicos e nutricionais:diagnóstico e tratamento. São Paulo: Loyola, 1994. p.56.
11. Executive Summary of the Third report of the NationalCholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel onDetection, Evaluation, and Treatment of High BloodCholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA2001;285:2486-97.
�
�
�
�
APRESENTAÇÃO
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDORTermos e condições de garantia
Serviço de apoio ao cliente
Labtest Diagnóstica S.A.
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.
Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)e-mail: [email protected]
CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista AlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000www.labtest.com.br
13-25
1 x 25 mL
1 x 5 mL
Catálogo
Precipitante
Padrão
COLESTEROLLiquiformCat. 76ANVISA10009010068
FINALIDADE
PRINCÍPIO
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
Sistema enzimático para a determinação do colesterol total emamostras de soro, por reação de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.
O colesterol total é determinado de acordo com as seguintesreações:
Os ésteres de colesterol são hidrolisados pela colesterolesterase a colesterol livre e ácidos graxos. O colesterol livre éoxidado pela colesterol oxidase a colest-4-en-ona e peróxidode hidrogênio. Na presença de peroxidase e peróxido dehidrogênio, o fenol e a 4-aminoantipirina são oxidadosformando a antipirilquinonimina que tem absortividade máximaem 500 nm.
A intensidade da cor vermelha formada na reação final édiretamente proporcional à concentração do colesterol naamostra.
Os valores elevados do colesterol, principalmente ocolesterol ligado às lipoproteínas de baixa densidade, são umdos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimentoda doença arterial coronariana. O National CholesterolEducation Program (NCEP) recomenda que os sistemas demedição do colesterol apresentem características dedesempenho capazes de atingir os requisitos de exatidão eprecisão necessários para que os resultados tenham utilidademédica.
Os dados de exatidão, repetitividade e reprodutibilidadeobtidos com o sistema Colesterol Liquiform demonstram que ométodo é capaz de fornecer resultados que superam asexigências do NCEP, fazendo com que possa ser consideradocomo bastante seguro para a medição confiável do colesteroltotal nos níveis de decisão mais importantes. Adicionalmente,a comparação entre as imprecisões encontradas narepetitividade e na reprodutibilidade demonstra que o sistemade medição é bastante robusto nas regiões de concentraçõessignificativas para uso clínico, indicando um desempenhoestável no dia a dia.
O sistema é composto de um único reagente pronto para uso,com estabilidade que garante desempenho consistente emsua forma líquida original e manutenção das condições ótimasda reação.
Colesterol Liquiform possui um sistema clarificador de altaeficiência que elimina as interferências positivas produzidaspor valores de triglicérides até 2600 mg/dL.
ColesterolÉsteres do colesterol Colesterol + Ácidos graxos
Esterase
ColesterolColesterol + O Colest-4-en-ona + H O
Oxidase
Peroxidase2 H O + Fenol + 4-Aminoantipirina Antipirilquinonimina + 4 H O
2 2 2
2 2 2
6
O sistema é facilmente aplicável em analisadores automáticose semi-automáticos capazes de medir uma reação de pontofinal em 500 nm e pode ser usado para medição do colesterolHDLapós precipitação seletiva das LDLe VLDL.
Enzimático-Trinder.
Armazenar entre 2 - 8°C.Contém tampão 50 mmol/L, pH 7,0; fenol 24 mmol/L; colato desódio 500 mol/L; azida sódica 15 mmol/L; 4-aminoantipirina500 mol/L; colesterol esterase 250 U/L, colesterol oxidase250 U/Le peroxidase 1000 U/L .
Para preservar o desempenho, o reagente deve permanecerfora da geladeira somente o tempo necessário para se obter ovolume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta.
Armazenar entre 2 - 30°C.Contém azida sódica 15 mmol/L. Após o manuseio sugere-searmazenar bem vedado para evitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Não utilizar o Reagente 1 quando sua absorbância, medidacontra a água em 500 nm, for igual ou maior que 0,300 ouquando mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação do reagente. O Reagente 1 e o Padrão contémazida sódica que é toxica. Deve-se tomar cuidado para evitar aingestão e no caso de contato com os olhos deve-se lavarimediatamente com grande quantidade de água e procurarauxílio médico. A azida pode formar compostos altamenteexplosivos com tubulações de chumbo e cobre. Portanto,utilizar grandes volumes de água para descartar o reagente.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Banho-maria mantido à temperatura constante (37°C).Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre490 e 510 nm.Pipetas para medir amostras e reagente.Cronômetro.
A postura durante a colheita da amostra deve ser padronizadaporque pode ter efeitos significativos nos resultados. Se asamostras são obtidas com o paciente na posição sentada,deve-se padronizar para que o indivíduo esteja sentadodurante 15 minutos e não mais que 30 minutos. Umgarroteamento maior que 1 minuto produz hemoconcentração,o que pode aumentar os valores do colesterol em 5,0% após2 minutos e 10,0 a 15,0% após 5 minutos. Portanto, é muitoimportante obter a amostra de sangue após liberar o torniquetedevendo-se padronizar todo o procedimento da colheita.
METODOLOGIA
REAGENTES1. Reagente 1 -
2. Padrão - 200 mg/dL -
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
�
� �
� �
Instruções de Uso
A variação biológica do colesterol, decorrente da variaçãotambém biológica das lipoproteínas transportadoras docolesterol, é observada quando a dosagem do colesterol érepetida em um mesmo laboratório no espaço mínimo de umasemana. Ela ocorre independentemente do erro analítico epode variar entre 1,7 e 11,6% com uma média de 6,1% devido,principalmente, à variação biológica da LDL que é a principallipoproteína transportadora de colesterol.
Níveis elevados de ascorbato (vitamina C) produzeminterferências negativas por competição com o cromogênio nareação da peroxidase. Se houver suspeita da presença deácido ascórbico deixar o soro em repouso durante 90 minutosantes de iniciar a dosagem para minimizar a ação dointerferente.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.
De modo geral, a amostra de sangue pode ser obtida com ousem jejum, mas é altamente recomendável que todos osensaios dos lípides sanguíneos, incluindo o colesterol, sejamrealizados em amostras colhidas em jejum. As vantagens dautilização de amostras colhidas em jejum são decorrentes dapadronização da colheita, pois permitem a realização dadeterminação de outros lípides que requerem o jejum eminimizam a interferência da lipemia pós prandial que estáfreqüentemente presente em amostras obtidas sem o jejum.
Usar soro. Anticoagulantes como citrato, oxalato ou EDTAproduzem resultados falsamente diminuídos. O analito éestável 7 dias entre 2 - 8°C e 6 meses a 20°C negativos .Homogeneizar bem as amostras lipêmicas antes de iniciar adosagem. Não utilizar amostras fortemente hemolisadas.
Como o volume de amostra é pequeno, deve-se pipetar comcuidado para minimizar a imprecisão do sistema de medição.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las, deve-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico, sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
Valores de bilirrubina até 5 mg/dL, hemoglobina até 180 mg/dLe triglicérides até 2600 mg/dL não produzem interferênciassignificativas. Valores de bilirrubina entre 5 e 38 mg/dLproduzem resultados falsamente diminuídos proporcionais àconcentração da bilirrubina.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando ozero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 601
Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 467
AMOSTRA
INTERFERÊNCIAS
6
�
�
4 0 5
4 1 5
PROCEDIMENTO
CÁLCULOS
Exemplo:
Exemplo:
CALIBRAÇÃORastreabilidade do Sistema
Calibrações manuais
Ver observações 1, 2 e 3.
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Misturar e incubar em banho-maria a 37°C durante 10minutos. O nível de água no banho deve ser superior ao nívelde reagentes nos tubos de ensaio. Determinar asabsorbâncias do teste e padrão em 500 nm ou filtro verde(490 a 510), acertando o zero com o branco.Acor é estável por60 minutos.
O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do testee o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volumemínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes daamostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.
Absorbância do TesteColesterol (mg/dL) = x 200
Absorbância do Padrão
Absorbância do Teste = 0,290Absorbância do Padrão = 0,345
0,290Colesterol (mg/dL) = x 200 = 168
0,345
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia, pode-se utilizar o método do fator.
200Fator de Calibração =
Absorbância do Padrão
Colesterol (mg/dL) =Absorbância do Teste x Fator
200Fator = = 580
0,345
Colesterol (mg/dL) = 0,290 x 580 = 168
O padrão é rastreável ao (SRM)911 do (NIST).
Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentesou quando o controle interno da qualidade indicar.
Standard Reference MaterialNational Institute of Standards and Technology
�
Branco Teste Padrão
Amostra -- 0,01 mL --
Reagente 1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
Padrão (N 2) -- -- 0,01 mL°
Crianças eAdolescentesColesterol
Colesterol HDL
Colesterol LDL
10
Idade: 2 a 19 anos: Desejável: <170 mg/dLLimítrofe: 170 a 199 mg/dLElevado: 200 mg/dL
Idade: <10 anos: Desejável: 40 mg/dL10 a 19 anos: Desejável: 35 mg/dL
Idade: 2 a 19 anos: Desejável: <110 mg/dLLimítrofe: 110 a 129 mg/dLElevado: 130 mg/dL
Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,026 =Unidades SI (mmol/L).
Em duas amostras com concentrações de colesterol iguais a146 e 245 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes doanalito, obtendo-se recuperações entre 94 e 110%. O errosistemático proporcional médio obtido em um valor de200 mg/dL foi igual a 4,0 mg/dLou 2,0%.
O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 60 amostras com valores situados entre 96 e495 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressão:y = 6,92 + 0,96x e um coeficiente de correlação (r) igual a0,996. O erro sistemático total (constante e proporcional)verificado no nível de decisão (200 mg/dL) foi igual a1,08 mg/dL ou 0,54%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.
Uma amostra protéica não contendo colesterol foi utilizadapara calcular o limite de detecção do ensaio tendo sidoencontrado um valor igual a 1,04 mg/dL, equivalente a médiade 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se aabsorbância do padrão como parâmetro verificou-se que olimite de detecção fotométrica é de 0,06 mg/dL,correspondendo a uma absorbância igual a 0,0001.
Duas amostras com valores iguais a 330 e 400 mg/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores dediluição que variaram de 2 a 8 encontraram-se recuperaçõesentre 99 e 113%.
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão
Especificidade
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
Reprodutibilidade - Imprecisão total
Sensibilidade metodológica
Efeitos da diluição da matriz
9
Sistemas automáticos
Intervalo de calibrações
LINEARIDADE
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
VALORES RECOMENDÁVEIS OU DESEJADOS
Classificação ATP III de LDL, Colesterol Total e HDL(mg/dL):
Adultos
�
�
�
�
Branco de reagentes: água deionizada ou destilada, ousolução de cloreto de sódio 150 mmol/L (0,85%);Padrões: usar calibradores protéicos. As concentraçõesde Colesterol nos calibradores da linha Calibra Labtestsão rastreáveis ao SRM 1951 do NIST.
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle internoda qualidade indicar.
O resultado da medição é linear até 500 mg/dL. Quando forobtido um valor igual ou maior que 500 mg/dL, diluir a amostracom NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar nova medição emultiplicar o resultado pelo fator de diluição. Diluir a amostra detal modo que o valor encontrado se situe entre150 e 300 mg/dL. Sugerimos a verificação da linearidademetodológica e fotométrica, no mínimo semestralmente,utilizando amostras com valores até 500 mg/dL.
O laboratório deve manter um programa de controleinterno da qualidade que defina claramente os objetivos,procedimentos, normas, critérios para limites de tolerância,ações corretivas e registro das atividades. Ao mesmo tempodeve-se manter um sistema definido para monitorar avariabilidade analítica que ocorre em todo o sistema demedição. Portanto, o uso de controles para avaliar aimprecisão e desvios de calibração deve ser prática rotineirano laboratório clínico. Sugere-se usar um controle com umvalor situado na faixa de referência ou no nível de decisão eoutro controle com um valor em outra faixa de significânciaclínica. Deve-se criar uma meta de estado de controle paraque o erro de bias seja 3,0%, o coeficiente de variação seja
3,0% e o erro total seja 8,9%. Sugere-se realizar amonitoração contínua do estado de controle através dosistema de sistema de regras de controle .
Sugere-se utilizar os produtos da linha Qualitrol da Labtest,para controle interno da qualidade em ensaios de químicaclínica.
Os valores abaixo substituem os valores de referência e foramdeterminados a partir de dados epidemiológicos tratadosestatisticamente, que relacionam os níveis do colesterol com aprevalência de doença coronariana isquêmica (DCI).
6,9
8
�
� �
11
Colesterol Total
Colesterol HDL
Colesterol LDL
Desejável: < 200Limiar elevado: 200-239Elevado: 240
Baixo: < 40Elevado (desejável): 60
Òtimo: <100Limiar ótimo: 100-129Limiar elevado: 130-159Elevado: 160-189Muito elevado: 190
�
�
�
Amostra 3 10 357 4,23 1,2
MÉDIAN DP CV(%)
Amostra 1 10 175 2,69 1,5
Amostra 2 10 255 3,08 1,2
Amostra 3 10 353 8,46 2,1
MÉDIAN DP CV(%)
Amostra 1 10 173 4,23 2,4
Amostra 2 10 253 5,77 2,2
Revisão: Abril, 2006 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 190606 Reprodução sob prévia autorização
SIGNIFICADO CLÍNICO
OBSERVAÇÕES
REFERÊNCIAS
O grande dilema da aterosclerose é que ela é um processosilente. Está ativa em todos os indivíduos e permanece semqualquer manifestação por décadas e, subitamente semanifesta através de dor torácica, infarto agudo do miocárdioou morte súbita. Estudos populacionais longitudinais como osde Tecumset,Albany, Framinghan, Evans, Chicago, Oslo entreoutros, e também dados epidemiológicos e estudosexperimentais em animais, demonstraram uma correlaçãopositiva entre os níveis do colesterol, mais especificamente docolesterol LDL e o risco de doença arterial coronariana (DAC).Ao mesmo tempo foi evidenciado que os níveis de colesterolHDLsão inversamente proporcionais ao risco de DAC.
Valores aumentados de colesterol são encontrados nanefrose, hipotireoidismo, doenças colestáticas do fígado e nashiperlipoproteínemias dos tipos IIa, IIb e III.
Níveis diminuídos são encontrados no hipertireoidismo,doenças consumptivas e desnutrição crônica.
Além do nível do colesterol sérico, a hipertensão e o fumoconstituem fatores de risco de aterosclerose e DAC.
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos< 0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar Young DS.
, 3ª edição, Washington: AACCPress, 1990.
1. Alain CA, Poon LS, Cahn CSG, Richmond W, Fu PC. ClinChem 1974;20:470.
2. Bergmeyer HU. Methods of Enzymatic Analysis, 3ª edição,Verlag Chemie:Weinhein, 1984;8:141-8.
3. Bull Org Mond Santé. 1970;43:891.
4. Fredrickson DS, Levy RJ, Lee RS. New Engl J Med 1967;276:24, 94, 148, 215, 276.
5. Good NE, Winger GD, Winter W, Connoly TN, Izawa S,Singh RMM. Biochemistry 1966;5:467.
�
�
�
�
Effects of Drugson Clinical Laboratory Tests
6. Rifai N, Warnick GR, Dominiczak MH. Handbook oflipoprotein testing.AACC Press: Washington, 1997:75-97.
7. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostics Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.
8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem1981;27:493-501.
9. Labtest: Dados de arquivo.
O número de testes em aplicações automáticas depende dosparâmetros de programação.
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.
Telefone 0800-31-3411 - Ligação Gratuitae-mail: [email protected]
Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos.
CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000www.labtest.com.br
APRESENTAÇÃO
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDORTermos e Condições de Garantia
Serviço deApoio ao Cliente
Labtest Diagnóstica S.A.
10. Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS,Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Risco cardiovascular:fatores metabólicos e nutricionais: diagnóstico etratamento. São Paulo: Loyola, 1994. P.56.
11. Executive Summary of the Third report of the NationalCholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel onDetection, Evaluation and Treatment of High BloodCholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA2001;285:2486-97.
76-2/100
2 x 100 mL
1 x 5 mL
76-2/250
2 x 250 mL
1 x 5 mL
Catálogo
Reagente 1
Padrão
CREATININAK
Sistema para a determinação da creatinina em soro, plasma,urina e líquido amniótico por cinética de dois pontos.Somente para uso diagnóstico in vitro.
A creatinina reage com o picrato alcalino formando umcomplexo de cor vermelha. A quantidade da cor formada éproporcional à concentração de creatinina na amostra.
Creatinina + Picrato alcalino Picrato de Creatinina
A metodologia é bastante simples e facilmente aplicável emaparelhos automáticos e semi-automáticos capazes de mediruma reação em modo cinético de 2 pontos em um tempo totalde 90 segundos. A interferência das proteínas plasmáticas,que ocorre na reação de Jaffé, introduz um erro constante namedição o qual é minimizado pela utilização de um índice decorreção (0,25 mg/dL) .
Os estudos realizados demonstraram que é possível eliminartambém as interferências causadas pela bilirrubina e lipemia .Os procedimentos propostos utilizam a adição do ferricianetode potássio que oxida a bilirrubina e a desproteinização queelimina a interferência da lipemia equivalente a umaconcentração de triglicérides de 1800 mg/dL.
O Picrato Alcalino mantém o desempenho analítico quandoarmazenado tampado e refrigerado durante 15 dias,permitindo o preparo de um volume maior de Reagente deTrabalho de acordo com a rotina do laboratório.
O desenvolvimento do método foi direcionado para automaçãonão sendo recomendada a utilização em técnicas manuais, anão ser que o laboratório disponha de facilidades para realizarmedições em cubetas termostatizadas utilizando pequenosintervalos de tempo.
Labtest.
Armazenar entre 15 - 30 °C.Contém hidróxido de sódio 200 mmol/L. Reagente corrosivo.
Armazenar entre 15 - 30 °C.Contém ácido pícrico 22,2 mmol/L.
Armazenar entre 2 - 30 °C.Contém creatinina 4,0 mg/dL. Após o manuseio sugere-searmazenar bem vedado para evitar evaporação.
Armazenar entre 15 - 30 °C.Contém ferricianeto de potássio 11 mmol/L. Não refrigerar.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos a contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Cat 96ANVISA10009010058
FINALIDADE
PRINCÍPIO
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
METODOLOGIA
REAGENTES1. NaOH -
2. Ácido Pícrico -
3. Padrão 4,0 mg/dL -
4. Ferricianeto -
1 ,2 ,9
5
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
AMOSTRA
INTERFERÊNCIAS
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação dos reagentes, os quais não devem serpipetados com a boca.
O NaOH (N° 1) é corrosivo e pode produzir irritação,queimaduras na pele e olhos e ulcerações quando ingerido. Nocaso de ingestão oferecer grande quantidade de água comsuco de limão ou vinagre. Não provocar vômitos. Procurarauxílio médico. Quando houver contato com os olhos, deve-selavar imediatamente com grande quantidade de água eprocurar auxílio médico.
Caso ocorra ingestão do Ácido Pícrico (N° 2), oferecer 4 coposde água e, se o indivíduo estiver consciente, provocar vômitose procurar auxílio médico.
Um forte indício de deterioração dos reagentes é indicadoquando o Picrato Alcalino, medido em 510 nm contra a água,apresentar uma absorbância maior que 0,200.
Fotômetro com cubeta termostatizada capaz de medirabsorbância em modo cinético.Analisador automático capaz de processar 1 ou 2 reagentes(para aplicações automáticas).Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro (para medições manuais).
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.
Soro ou plasma (heparina, EDTA, fluoreto, oxalato e citrato). Oanalito é estável 7 dias entre 2 - 8 °C. O anticoagulante Glistab -Labtest (Cat. 29) permite a colheita de uma só amostra desangue para as dosagens de creatinina, glicose e uréia.
Urina de 24 horas e líquido amniótico devem ser centrifugados.A amostra de urina não deve receber preservativos ouconservantes e deve ser refrigerada durante o período dacolheita e depois de recebida no laboratório.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde material biológico humano não transmitem infecções, todaselas devem ser consideradas como potencialmenteinfectantes. Portanto, ao manuseá-las, devem-se seguir asnormas estabelecidas para biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
As proteínas presentes na amostra produzem umainterferência positiva introduzindo um erro sistemáticoconstante. Este erro pode ser minimizado aplicando um índicede correção. Como a urina não contém proteínas que podemproduzir interferências, o índice de correção não é aplicado nocálculo da concentração em amostras de urina. Ver a aplicaçãodo índice de correção no item Cálculos.
A determinação da creatinina na urina pode ser afetada poração de grandes quantidades de substâncias redutoraspresentes nos casos de cetoacidose. A fervura da amostra deurina por um minuto elimina parcialmente a interferênciadessas substâncias.
Instruções de Uso
Concentrações de bilirrubina maiores que 5 mg/dL interferemnegativamente na reação. Concentrações de hemoglobina até180 mg/dL e triglicérides até 900 mg/dL não interferem nareação.
Para avaliar a concentração aproximada de hemoglobina emuma amostra, proceder do seguinte modo: diluir 0,05 mL daamostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e medir aabsorbância em 405 ou 415 nm, acertando o zero com águadeionizada ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 601
Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 467
Nas amostras em que a concentração de bilirrubina está entre5 e 19 mg/dL, a interferência pode ser eliminada através doseguinte procedimento: adicionar 0,05 mL de Ferricianeto(N° 4) a 0,5 mL da amostra. Misturar e aguardar 5 minutos.Determinar a creatinina, multiplicar o resultado obtido por 1,1 eaplicar o índice de correção.
Quando a concentração de bilirrubina for maior que 19 mg/dL emenor que 38 mg/dL, diluir a amostra 1:2 com NaCl150 mmol/L (0,85%).Adicionar 0,05 mLde Ferricianeto (N° 4) a0,5 mL da amostra diluida. Misturar e aguardar 5 minutos.Determinar a creatinina, multiplicar o resultado por 2,2 e aplicaro índice de correção.
Para concentrações de triglicérides entre 900 mg/dL e1800 mg/dL a interferência da lipemia pode ser eliminadaatravés do procedimento com desproteinização. Quando aconcentração de triglicérides for maior que 1800 mg/dL emenor que 3500 mg/dL, diluir a amostra 1:2 com NaCl150 mmol/L (0,85%), seguir o procedimento comdesproteinização para determinar a creatinina e multiplicar oresultado por 2.
Uma diluição da amostra, maior que 1:2, não é aconselhávelporque, em amostras com baixas concentrações da creatinina,obtêm-se resultados com erros significativos devido aoaumento da imprecisão analítica.
Misturar 4 volumes de NaOH (N° 1) com 1 volume de ÁcidoPícrico (N° 2). Estável 15 dias entre 2 - 8 °C em frasco plásticobem vedado. Um forte indício de deterioração é indicado poruma absorbância maior que 0,200 quando o Picrato Alcalino émedido em 510 nm contra a água.
O CO atmosférico altera significativamente a estabilidade doNaOH (N° 1) e do Picrato Alcalino, quando os reagentes sãomantidos em recipientes abertos. A modificação daestabilidade é influenciada pelo tempo de exposição econdições ambientais. Sugerimos manter na bandeja doanalisador somente o volume suficiente para a realização deuma corrida analítica ou usar as informações do controle daqualidade como indicador da necessidade de realizar novacalibração.
Para a dosagem na urina diluir a amostra 1:25 (0,2 mL de urina+ 4,8 mL de água destilada ou deionizada). Multiplicar oresultado obtido por 25.
�
�
4 0 5
4 1 5
2
Eliminação da ação de interferentes
Não aplicar o índice de correção quandoutilizar o procedimento com desproteinização.
PREPARO DO PICRATOALCALINO
PROCEDIMENTO
O controle da temperatura é absolutamente indispensávelpara a reprodutibilidade dos resultados. Como o tempo dereação é muito pequeno, é necessário utilizar um equipamentocom cubeta termostatizada a 37 °C.
É fundamental que as operações com amostras e padrõessejam realizadas sempre de modo idêntico, mantendo-seconstante, ao máximo possível, o intervalo de tempo entre amistura da amostra ou Padrão com o reagente e o início damedição fotométrica.
Caso os volumes propostos não atendam às necessidades doinstrumento para realizar a leitura fotométrica, aumentarproporcionalmente os volumes de Picrato Alcalino e amostraou Padrão.
Ajustar o fotômetro a zero em 510 nm (490 a 520 nm) comágua. Adicionar 0,10 mL de Padrão ou amostra a 1,0 mL doPicrato Alcalino. Misturar e aspirar imediatamente para acubeta. Disparar o cronômetro e medir as absorbâncias aos30 e 90 segundos.
Misturar 0,2 mL de soro a 0,4 mL de Ácido Pícrico (N° 2), agitare centrifugar durante 10 minutos. Acertar o zero do fotômetroem 510 nm (490 a 520 nm) com água. Em outro tubo pipetar0,8 mL de NaOH (N° 1) e adicionar 0,3 mL do sobrenadantelímpido. Misturar e aspirar imediatamente para a cubeta.Disparar o cronômetro e medir as absorbâncias aos 30 e 90segundos. O Padrão deve ser ensaiado utilizando oprocedimento direto. Não aplicar o índice de correção.
Ado Teste ou Padrão =A segundos -A segundos
Ado TesteCreatinina (não corrigida) = x 4 mg/dL
Ado Padrão
A Teste = 0,118 A Padrão = 0,092A Teste = 0,130 A Padrão = 0,139
Creatinina (corrigida) = 1,02 mg/dL - 0,25 mg/dL= 0,77 mg/dL
A interferência das proteínas plasmáticas, que ocorre nareação de Jaffé , introduz um erro constante na medição o qualé minimizado pela utilização do índice de correção(0,25 mg/dL).
A utilização do índice de correção em medições automáticas éapresentada nas aplicações dos produtos Labtest parasistemas automáticos.
Procedimento direto
Procedimento com desproteinização
CÁLCULOS
Exemplo
Aplicaçãodoíndicedecorreção
Exemplo
�
�
�
9 0 3 0
3 0 3 0
9 0 9 0
0,130 - 0,118Creatinina (não corrigida) = x 4 mg/dL = 1,02 mg/dL
0,139 - 0,092
Creatinina(corrigida)=Creatinina(nãocorrigida)-Índicedecorreção(0,25mg/dL)
2
Exemplo
LINEARIDADE
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
VALORES DE REFERÊNCIA
Creatinina na urina (mg/dL) = 105Creatinina (corrigida) no soro (mg/dL) = 0,95Volume de 24 horas = 1520Volume minuto = 1520/1440 = 1,055
105Depuração (mL/minuto) = x 1,055 = 116
0,95
Peso = 60 Kg Altura = 165 cm
Superfície corporal = 1,66 m
116 x 1,73
Depuração corrigida = = 121 mL/minuto/1,73 m1,66
A reação é linear entre 0,2 mg/dL e 12 mg/dL. Para valoresmaiores diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%) erepetir a determinação. Multiplicar o resultado obtido pelo fatorde diluição e aplicar o índice de correção. Diluir a amostra de talmodo que o valor encontrado se situe entre 2,0 e 6,0 mg/dL.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linhaQualitrol - Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça na populaçãoatendida sua própria faixa de valores de referência.
Conversão mg/dLpara Unidades SI: mol/L= mg/dLx 88,4.
2
2
�
O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis,objetivos, procedimentos, critérios para especificações daqualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registrodas atividades. Materiais de controle devem ser utilizados paraavaliar a imprecisão e desvios da calibração. Sugere-se que asespecificações para o coeficiente de variação e o erro totalsejam baseadas nos componentes da variação biológica
(VB) .8 ,1 0 ,11
Creatinina Urinária
Como as amostras de urina não contêm proteínas emconcentrações capazes de introduzir erros constantesnas medições, não é necessário aplicar o índice decorreção.
CALIBRAÇÃORastreabilidade do Sistema
Calibrações manuais
Sistemas automáticos
Intervalos de calibração
DEPURAÇÃO DACREATININAENDÓGENA
CreatininaurináriaCreatininaUrinária(mg/24h)= xVolumedeurina(mL/24h)
100
mg/kg peso = mg/24 horas dividido pelo peso corporal
A concentração de creatinina no Padrão (N° 3) e noscalibradores da linha Calibra é rastreável ao
(SRM) 914 do(NIST).
Obter novo fator de calibração ao usar novo lote dereagentes ou quando o controle da qualidade indicar.
Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio150 mmol/L (0,85%);Padrão: usar calibradores da linha Calibra;
Calibração do branco ao usar novos frascos dereagentes;Calibração de 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 3 pontos quando o controle da qualidadeindicar.
Instruir o paciente para que faça corretamente a colheita daurina de 24 horas .
Dosar a creatinina no soro e na urina utilizando asmetodologias propostas. O soro pode ser obtido em qualquermomento durante o período de colheita da urina.
Aplicar os resultados obtidos na equação abaixo:
UDepuração = x VM (mL/minuto)
S
U: creatinina na urina (mg/dL)S: creatinina (corrigida) no soro (mg/dL)VM: volume minuto (volume urinário de 24 horas, em mL,dividido por 1440).
OBS.: A depuração deverá ser corrigida para a superfíciecorporal do paciente, que é obtida através do nomogramacorrelacionando peso e altura, ou usando a equação abaixo:
A= P x H x 0,007184
A= superfície corporal (m )P = peso (kg)H = altura (cm)
Multiplicar o valor da depuração por 1,73 e dividir pelasuperfície corporal do paciente.
StandardReference Material National Institute ofStandards and Technology
�
�
�
�
�
�
4
0 ,4 2 5 0 ,7 2 5
2
Soro/Plasma (mg/dL)
< 1 meses 0,4 - 0,7
Recém- nascidos 0,5 - 1,2
1 - 12 meses � 0,7
1 - 3 anos
4 - 7 anos
8 - 10 anos
11 - 12 anos
13 - 17 anos
Adulto
� 0,7
� 0,8
� 0,9
� 1,0
� 1,2
� 1,3
> 3 anos
Homem
Mulher
12 - 30
21 - 26
16 - 22
2 - 3 anos 6 - 22
Urina (mg/kg/24 h)
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão
Especificidade
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
Reprodutibilidade - Imprecisão total
Sensibilidade metodológica
Efeitos da diluição da matriz
SIGNIFICADO CLÍNICO
1 0
Em duas amostras com concentrações de creatinina iguais a2,7 mg/dL e 8,7 mg/dL foram adicionadas quantidadesdiferentes do analito, obtendo-se recuperações entre 97 e100%. O erro sistemático proporcional médio estimado nonível de decisão (1,6 mg/dL) é igual a 0,0232 mg/dLou 1,45%.
O método proposto foi comparado com um métodoenzimático (rastreável ao método definitivo) utilizando20 amostras de soro com valores situados entre 0,52 e11,0 mg/dL. A comparação resultou na equação da regressãoy = 1,007x + 0,028 e um coeficiente de correlação (r) igual a0,998. O erro sistemático total (constante e proporcional)estimado no nível de decisão (1,6 mg/dL) é igual a0,0354 mg/dL ou 2,2%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.
Uma amostra não contendo creatinina foi utilizada paracalcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontradoum valor igual a 0,14 mg/dL, equivalente à média de 20 ensaiosmais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância dopadrão como parâmetro verificou-se que o limite de detecçãofotométrica foi 0,12 mg/dL, correspondendo a uma diferençade absorbância igual a 0,001.
Duas amostras com valores iguais a 8,6 e 10,0 mg/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Utilizando fatores dediluição que variaram de 2 a 5 foram encontradasrecuperações entre 96,2 e 105%.
Aconstância na formação e excreção da creatinina faz dela ummarcador muito útil de função renal, principalmente da filtraçãoglomerular, em virtude da sua relativa independência defatores como dieta, grau de hidratação e metabolismo protéico.
A determinação da creatinina plasmática é um teste de funçãorenal mais seguro do que a uréia. Nas doenças renais acreatinina se eleva mais vagarosamente do que a uréia e sereduz mais vagarosamente com a hemodiálise.
Fatores extras renais como insuficiência cardíaca congestiva,choque e obstrução mecânica do trato urinário provocamelevação da creatinina plasmática.
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar: www.fxol.org/
1. Cook JGH. Clin ChimicaActa 1971;32:485-6.
2. Heinegard D, Tiderström G. Clin ChimActa 1973;43:305-10.
3. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Clinical Chemistry,Principles and Technics, 2nd ed, New York, Harper &Row,1974.
4. Infotec Labtest,Ano II N° 2.
5. Knapp ML, Mayne PD. Clin ChimActa 1987;168:239-46.
6. O'Leary N, Pembroke A, Duggan PF. Clinical Chemistry1992;38:1749-51.
7. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories. Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.
8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR,Groth T. Clin Chem 1981;27:493-501.
9. Yatzidis H. Clin Chem 1974,20:1131-34.
OBSERVAÇÕES
REFERÊNCIAS
�
�
�
�
10. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y PatologíaMolecular, Base de Datos de Variación Biológica.Disponível em:<http://www.seqc.es/article/articleview/330/1/170> (acesso em 04/2006).
11. Basques JC. Especificações da Qualidade Analítica.Labtest Diagnóstica 2005.
12. Soldin SJ, Brugnara C, Wong EC: Pediatric ReferenceIntervals, 5.ed. Washington:AACC Press, 2005. P.3-4.
MÉDIAN DP CV(%)
Amostra 1 20 0,66 0,027 4,10
Amostra 2 20 2,04 0,038 1,86
Amostra 3 20 7,49 0,273 3,64
MÉDIAN DP CV(%)
Amostra 1 20 0,66 0,013 1,97
Amostra 2 20 2,04 0,016 0,78
Amostra 3 20 7,49 0,144 1,92
Homens
Mulheres
97 - 137
88 - 128
Crianças 70 - 140
Depuração de Creatinina (mL/minuto/1,73 m )2
13. Ferraz MHC, Delgado RB. Valores de Referência paraExames Laboratoriais. In: Leão E, Corrêa EJ, Viana MB,Mota JAC (Ed). Pediatria Ambulatorial. 3.ed. BeloHorizonte: Coopmed, 1988. p.837-848
14. Labtest: Dados deArquivo.
Algumas apresentações podem ser disponibilizadas somentemediante consulta.
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos, desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.
Telefone 0800-31-3411 - Ligação GratuitaE-mail: [email protected]
CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000www.labtest.com.br
APRESENTAÇÃO
Estão disponíveis aplicações para sistemas automáticos.
O número de testes em aplicações automáticas dependedos parâmetros de programação.
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDORTermos e Condições de Garantia
Serviço deApoio ao Cliente
Labtest Diagnóstica S.A.
96-300
1 x 60 mL
1 x 5 mL
1 x 5 mL
1 x 240 mL
Catálogo
NaOH
Ácido Pícrico
Padrão
Ferriacianeto
Revisão: Junho, 2005. Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 200706 Reprodução sob prévia autorização
FOSFATASEALCALINALiquiformCat. 79ANVISA10009010050
FINALIDADE
PRINCÍPIO(FALC)
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
METODOLOGIA
REAGENTES:1. Reagente 1 -
Sistema para determinação em modo cinético da FosfataseAlcalina no soro.Somente para uso diagnóstico in vitro.
A fosfatase alcalina do soro, em pH alcalino,hidrolisa o p-nitrofenilfosfato liberando p-nitrofenol e fosfatoinorgânico, segundo a reação seguinte:
FALCp-Nitrofenilfosfato + H O p-Nitrofenol + fosfato
A quantidade produzida de p-nitrofenol que tem elevadaabsorbância em 405 nm é diretamente proporcional àatividade enzimática da fosfatase alcalina na amostra.
O substrato p-nitrofenilfosfato foi selecionado porque éprontamente hidrolisado pela fosfatase alcalina. O produto dahidrólise possui elevada absortividade molar, permitindoutilizar pequeno volume de amostra e curto tempo dereação porque utiliza um tampão transfosforilante queaumenta a velocidade do sistema.
O sistema se baseia no método de referência da AACC queotimiza todas as condições da reação, incluindotemperatura, pH, concentração dos reagentes e volumefracional da amostra. Este método, com pequenasmodificações, está sendo considerado por váriasorganizações nacionais e internacionais interessadas emestabelecer um método de referência para a fosfatase alcalina.
As substâncias utilizadas na reação se encontram distribuídasadequadamente em dois reagentes para conferir maiorestabilidade na forma líquida original e manutenção dascondições ótimas da reação, permitindo a utilização direta dosreagentes em sistemas automáticos.
A metodologia monoreagente pode ser aplicada utilizando umReagente de Trabalho estável por 30 dias sob refrigeraçãoobtendo-se desempenho adequado mesmo em situações debaixas demandas do teste. O sistema permite ainda preparar ovolume de Reagente de Trabalho necessário para apenas umamedição da atividade enzimática da fosfatase alcalina.
O sistema é simples e utiliza medidas em modo cinéticocontínuo, podendo ser facilmente aplicado em analisadoresautomáticos e semi-automáticos capazes de medirabsorbância em 405 nm.
Bowers e Mc Comb modificado.
Armazenar entre 2 - 8°C.Contém tampão pH 10.4, HEDTA 2.0 mmol/L, sulfato de zinco1.2 mmol/L, acetato de magnésio 2.5 mmol/L, azida sódica8 mmol/L.
2
2. Reagente 2 -
RASTREABILIDADE DO SISTEMA
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
AMOSTRA
INTERFERÊNCIAS
Armazenar entre 2 - 8°C.Contém p-Nitrofenilfosfato 60 mmol/L, fenol 50 mmol/L.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio os reagentes estãosujeitos a contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
A absortividade molar do p-nitrofenol, produto da reação, éutilizada como sistema de referência para a calibração doensaio.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação do reagente.
O Reagente 1 contém azida sódica, que é tóxica. Deve-setomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato comos olhos deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água paradescartar o reagente.
Não utilizar o Reagente de Trabalho quando sua absorbância,medida contra a água em 405 nm, for igual ou maior que 1.2 ouquando mostrar-se turvo ou com sinais de contaminação.
Fotômetro com cubeta termostatizada capaz de medir comexatidão a absorbância em 405 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.
A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo8 horas.Soro ou plasma (heparina).Aamostra é estável por 7 dias entre2 - 8°C. Quando a amostra é armazenada na temperaturaambiente obtém-se resultados falsamente elevados.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las, deve-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
Citrato, fluoreto ,oxalato e EDTA são inibidores da atividade dafosfatase alcalina porque formam complexos com o magnésio.
Valores de Bilirrubina até 32 mg/dLnão interferem na reação.
Amostras ligeiramente hemolisadas, com hemoglobina até30 mg/dL, podem ser toleradas, mas hemólises maisacentuadas não devem ser aceitas porque produzemresultados falsamente diminuídos.
� �
Instruções de Uso
Valores de Triglicérides acima de 1800 mg/dL produzemresultados falsamente elevados.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0.05 mL da amostra em 2.0 mL de NaCl 150 mmol/L(0.85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando ozero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 601Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 467
O conjunto de um frasco do Reagente 1 e um frasco doReagente 2 permite preparar o Reagente de Trabalho.Transferir o conteúdo de um frasco do Reagente 2 para umfrasco do Reagente 1 e homogeneizar por inversão. Anotar adata de expiração.
Estável 5 dias entre 15 - 25°C e 30 dias entre 2 - 8°C quandonão houver contaminação química ou bacteriana. Identificar ofrasco do Reagente de Trabalho, para evitar confusão comoutros frascos do Reagente 1. Para preservar o desempenho,o Reagente de Trabalho deve permanecer fora da geladeirasomente o tempo necessário para se obter o volume a serutilizado. Evitar exposição à luz solar direta.
Opcionalmente pode-se preparar menor volume do Reagentede Trabalho utilizando a proporção de 4 (quatro) volumes doReagente 1 e 1 (um) volume do Reagente 2. Ex.: Para preparar1 mL do Reagente de Trabalho misturar 0.8 mL do Reagente 1com 0.2 mLdo Reagente 2.
O Reagente de Trabalho contém tampão pH 10.4, sulfato dezinco 1.0 mmol/L, fenol 10 mmol/L, HEDTA 1.6 mmol/L,acetato de magnésio 2.0 mmol/L, p-nitrofenil fosfato12 mmol/L, azida sódica 6.4 mmol/L.
1. Em um tubo rotulado Teste pipetar 1.0 mL do Reagente deTrabalho.
2. Adicionar 0.02 mL da amostra, homogeneizar e transferirimediatamente para a cubeta termostatizada a 37 ± 0.2°C.Esperar 1 minuto.
3. Fazer a leitura da absorbância inicial (A ) disparandosimultaneamente o cronômetro. Repetir a leitura após 2minutos (A ).
Para avaliar a linearidade da reação verificar se asabsorbâncias medidas em intervalos de 1 minuto sãocomparáveis.
Calcular o ( A/minuto) subtraindoA deA e dividindo por 2.
Ver linearidade.
A -AATeste =
2
Atividade da FosfataseAlcalina = ATeste x 2764
�
�
�
�
�
�
�
405
415
1
2
1 2
2 1
PREPARO DO REAGENTE DE TRABALHO
PROCEDIMENTOCondições da reação: comprimento de onda 405 nm;cubeta termostatizada a 37 ± 0.2°C, com 10 mm deespessura de solução, banda de passagem de 8 nm oumenos e luz espúria menor que 0.1%.
CÁLCULOS
O fator 2764 foi calculado para as condições acima propostas.Recalcular o fator quando for efetuada qualquer modificaçãoem um dos parâmetros utilizados para calculá-lo.Ver método para cálculo do fator.
A Teste = 0.610
A Teste = 0.660
0.660 - 0.610A/minuto = = 0.025
2
FosfataseAlcalina (U/L) a 37°C = 0.025 x 2764 = 69
VT x 1000Fator =
x VAx d
VT = volume total do ensaio (1.02 mL)VA= volume da amostra (0.02 mL)1000 = conversão de U/mLpara U/Ld = espessura da solução (1 cm)
= absortividade milimolar do p-nitrofenol em 405 nm (18.45)
1.02 x 1000Fator = = 2764
18.45 x 0.02 x 1
A reação é linear até 1500 U/L. Para valores maiores diluir aamostra 1:10 com NaCl 150 mmol/L (0.1 mL de soro + 0.9 mLde NaCl 150 mmol/L), repetir a determinação e multiplicar oresultado obtido por 10.Sugerimos a verificação da linearidade metodológica efotométrica no mínimo semestralmente utilizando amostrascom atividades até 1500 U/L.
O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter umsistema definido para monitorizar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e inexatidão dasdeterminações deve ser prática rotineira no laboratório clínico.Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa dereferência ou no nível de decisão e outro controle com um valorem outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma metade estado de controle para que a variação máxima encontradaseja de 10% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas deWestgard para verificar a estabilidade do sistema de medição.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas Qualitrol 1 eQualitrol 2 da Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.
Estes valores podem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça a sua própriafaixa de valores de referência da população atendida.
Exemplo:
Método para cálculo do fator
Exemplo:
LINEARIDADE
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
VALORES DE REFERÊNCIA
1
2
�
�
�
5
Efeitos da diluição da matriz:
SIGNIFICADO CLÍNICO
OBSERVAÇÕES
REFERÊNCIAS
Uma amostra com valor igual a 850 U/L foi utilizada para avaliara resposta do sistema nas diluições da matriz com NaCl150 mmol/L. Usando fatores de diluição que variaram de 2 a 8encontrou-se recuperações entre 101 e 104%.
A fosfatase alcalina é produzida por muitos tecidos,principalmente por ossos, fígado, intestino e placenta, e éexcretada pela bile. A dosagem sérica desta enzima éparticularmente útil na investigação das doençashepatobiliares e ósseas.Níveis elevados de fosfatase alcalina ocorrem em pacientescom doenças ósseas caracterizadas por um aumento daatividade osteoblástica, como a osteite deformante,raquitismo, osteomalácia, hiperparatireoidismo, metástaseóssea, sarcoma osteogênico e doença de Paget.
Níveis elevados de fosfatase alcalina ocorrem também empacientes com doenças obstrutivas das vias biliares,metástases hepáticas, doenças granulomatosas e na cirrosehepática. Nas doenças hepatocelulares como a hepatiteaguda viral, em geral ocorre um ligeiro aumento da enzima .
Níveis diminuídos da fosfatase alcalina são encontrados nadesnutrição crônica, na hipofosfatasemia e ocasionalmente nohipotireoidismo e anemia perniciosa.
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0.1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0.1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.
3. Como ocorre em toda medição da atividade enzimática, arigorosa observação do tempo e da temperatura de incubaçãoé de grande importância para a qualidade dos resultadosobtidos.
4. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar Young DS.
, 3ª edição, Washington: AACCPress, 1990.
1. IFCC Methods for the measurement of catalyticconcentration of enzymes-Part 5, IFCC method for AlkalinePhosphatase. J Clin Chem Clin Biochem 1983;21:731-47.
2. McComb RB, Bowers GN, Upretti A. Clin Chem1981;27:135-41.
3. Tietz NW, Burtis CA, Ducan P et al. Clin Chem 1983;29: 751-761.
�
�
�
�
Effects of Drugson Clinical Laboratory Tests
*(incluindo adolescentes até 16 anos)
Conversão de U/Lpara Unidades SI: kat/L= U/Lx 0.0167
A tabela abaixo permite converter a atividade medida em umadeterminada temperatura para o valor que seria obtido namedição realizada em outras temperaturas.
a atividade enzimática obtida em 37°C deve sermultiplicada por 0.70 para se obter a atividade em 30°C ou por0.48 para se obter a atividade em 25°C.
Em 2 amostras com concentrações de Fosfatase Alcalinaiguais a 59 e 200 U/L foram adicionadas quantidadesdiferentes do analito, obtendo-se recuperação entre 94 e102%.
O método proposto foi comparado com método similarutilizando 40 amostras de soro com valores situados entre 47 e707 U/L. A avaliação estatística dos resultados resultou naequação da regressão y = 1.091x - 10.926 e um coeficiente decorrelação (r) igual a 0.999. O erro sistemático total (constantee proporcional) verificado no nível de decisão (100 U/L) foiigual a 2 U/L ou 2.0%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.
Uma amostra protéica não contendo fosfatase alcalina foiutilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendosido encontrado um valor igual a 2.4 U/L, equivalente à médiade 20 ensaios mais dois desvios padrão.
�
TEMPERATURA
Exemplo:
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão
Especificidade
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
Reprodutibilidade - Imprecisão total
Sensibilidade metodológica
6
25 ºC 30 ºC 37 ºC
25 ºC ---- 1.45 2.08
30 ºC 0.69 ---- 1.43
37 ºC 0.48 0.70 ----
Fatores de correção da temperaturaTemperaturade trabalho
MÉDIAN DP CV (%)
Amostra 1 10 92 1.1 1.2
Amostra 2 10 174 1.6 0.9
Amostra 3 10 451 2.4 0.5
MÉDIAN DP CV (%)
Amostra 1 10 89 2.0 2.2
Amostra 2 10 175 2.8 1.6
Amostra 3 10 447 6.3 1.4
37 ºC
27 - 100Adultos (U/L)
Crianças* (U/L) 75 - 390
Revisão: Outubro, 2001 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 230306 Reprodução sob prévia autorização
4. Tonks DB Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.
5. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem1981;27:493-501.
6. Labtest: Dados deArquivo.
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.
Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)e-mail: [email protected]
CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br
APRESENTAÇÃO
Estão disponíveis as aplicações para sistemasautomáticos.
O número de testes em aplicações automáticas dependedos parâmetros de programação.
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDORTermos e Condições de Garantia
Serviço deApoio ao Cliente
Labtest Diagnóstica S.A.
79-4/30Catálogo
4 x 24 mLReagente 1
4 x 6 mLReagente 2
GLICOSE HK LiquiformCat. 85ANVISA10009010052
FINALIDADE
PRINCÍPIO
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
METODOLOGIA
Sistema enzimático para determinação da Glicose porfotometria ultravioleta de ponto final, em amostras de sangue,urina, líquor e líquidos ascítico, pleural e sinovial.Somente para uso diagnóstico in vitro
A adenosina trifosfato promove a fosforilação da glicose emuma reação catalisada pela hexoquinase (HK), de acordo coma seguinte reação:
HKGlicose + ATP Glicose-6-fosfato + ADP
A glicose-6-fosfato produzida na reação anterior é oxidada a6-fosfogluconato na presença da nicotinamida adeninadinucleótide (NAD), em reação catalisada especificamentepela glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH). Ocorre aprodução de um mol de NADH para cada mol de glicose-6-fosfato que é oxidado. A absorbância resultante, medida em340 nm, é diretamente proporcional à concentração da glicosena amostra.
G-6-PDHGlicose-6-fosfato + NAD 6-Fosfogluconato + NADH
A hexoquinase é uma enzima que catalisa a transferência dofosfato do ATP não somente para a glicose, mas também paraa D-frutose, D-manose, D-glucosamina e 2-deoxi-D-glicose.Como a G-6-PDH tem elevada especificidade para a glicose-6-fosfato, outras hexoses ou ésteres de pentose que sãofosforilados não participam da reação. Assim, o ensaio éextremamente específico para a glicose.
A especificidade da reação proporcionada pela G-6-PDHpossibilita a determinação da glicose urinária com um grauelevado de exatidão, o que não é conseguido quando seempregam sistemas utilizando outras enzimas comoreagentes.
Os dados da repetitividade e da reprodutibilidadedemonstram de modo inequívoco que o sistema Glicose HKLiquiform possui uma robustez extremamente desejável evaliosa para um sistema analítico.
As substâncias utilizadas na reação se encontram distribuídasadequadamente em dois reagentes, para conferir maiorestabilidade na forma líquida original e manutenção dascondições ótimas da reação, permitindo a utilização direta dosreagentes em sistemas automáticos.
A metodologia monoreagente pode ser aplicada utilizando umReagente de Trabalho estável 60 dias sob refrigeração,obtendo-se desempenho adequado mesmo em situações debaixas demandas do teste. O sistema permite ainda preparar ovolume do Reagente de Trabalho necessário para umamedição da atividade enzimática da glicose.
O sistema é facilmente aplicável a analisadores automáticos esemi-automáticos, capazes de medir com exatidão aabsorbância em 340 nm.
Bondar e Mead modificado.
REAGENTES1. Reagente 1 -
2. Reagente 2 -
3. Padrão 100 mg/dL -
RASTREABILIDADE DO SISTEMA
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
AMOSTRA
Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém tampão 90 mmol/L pH 7,4, ATP 4,1 mmol/L,NAD 3,3 mmol/L, cloreto de magnésio 10 mmol/L e azidasódica 7 mmol/L.
Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém Hexoquinase 4100 U/L; G-6-PDH 12500 U/L eazida sódica 15 mmol/L.
Armazenar entre 2 - 30 °C.Após o manuseio armazenar bem vedado para evitarevaporação.O estabilizador do padrão pode precipitar-se em baixastemperaturas, o que não interfere em seu desempenho.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
A calibração do sistema é rastreável ao Standard ReferenceMaterial 917a do National Institute of Standards andTechnology.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação do reagente.
Os reagentes de Glicose HK Liquiform contêm azida sódica,que é toxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingestão eno caso de contato com os olhos, deve-se lavar imediatamentecom grande quantidade de água e procurar auxílio médico. Aazida pode formar compostos altamente explosivos comtubulações de chumbo e cobre. Portanto, utilizar grandesvolumes de água para descartar o reagente.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Não utilizar o Reagente de Trabalho quando a sua absorbânciamedida a 340 nm contra a água for maior que 0,350.
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância em340 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.
Nas 24 horas que se sucedem à ingestão aguda de álcool,ocorre significativa redução da glicemia. As reduções podemtambém ser significativas nos indivíduos submetidos a jejumprolongado ou em obesos tratados com dietas com baixo valorcalórico.Pacientes diabéticos em uso continuado de clorpropamida(Diabinese) podem desenvolver hipoglicemias importantesque são muito difíceis de corrigir
Usar plasma, soro ou urina tomando as precauções a seguir. Aamostra de sangue deve ser obtida após jejum de no mínimo8 horas ou de acordo com recomendação médica.
� �
Instruções de UsoDIAGNÓSTICA
Pagina: 1
Realizar a colheita do sangue utilizando um anticoagulantecontendo um inibidor da glicólise. O uso do anticoagulanteGlistab (Labtest Cat.29) permite a colheita de uma só amostrapara as dosagens de creatinina, glicose e uréia.As amostras de sangue não contendo antiglicolítico devem sercentrifugadas imediatamente após a colheita e o plasma ousoro, separados das células ou coágulo.Nas amostras de sangue tratadas com antiglicolítico, aconcentração da glicose permanece estável até 8 horas. Noplasma, soro e outros líquidos separados das células, a glicosepermanece estável 3 dias entre 2 - 8 °C se não ocorrercontaminação microbiana .Se houver suspeita da presença de ácido ascórbico, deixar oplasma ou soro em repouso durante 90 minutos antes de iniciara dosagem para não obter resultados falsamente diminuídos.
Em outros líquidos biológicos (líquor e líquidos ascítico, pleurale sinovial), adicionar anticoagulante contendo antiglicolítico namesma proporção usada para a amostra de sangue ecentrifugar antes da dosagem.
As amostras de urina devem ser armazenadas entre 2 - 8 °Cpara evitar interferências por contaminação microbiana.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde material biológico humano não transmitem infecções, todaselas devem ser consideradas como potencialmenteinfectantes. Portanto, ao manuseá-las deve-se seguir asnormas estabelecidas para biossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
Valores de Bilirrubina até 16 mg/dL, Hemoglobina até100 mg/dL e Triglicérides até 350 mg/dL não produzeminterferências significativas.Valores de Bilirrubina até 32 mg/dL, Hemoglobina até160 mg/dL e Triglicérides até 1800 mg/dL produzeminterferências positivas que podem ser minimizadas utilizandoo branco da amostra.Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm, acertando ozero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 601Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 467
este procedimento é aplicável quandohouver ação positiva de interferentes. Misturar 1,0 mL de NaCl150 mmol/L (0,85%) com 0,01 mL da amostra. Medir aabsorbância em 340 nm acertando o zero com águadeionizada ou destilada. Subtrair a absorbância assim obtidada absorbância do teste e calcular a concentração.
O conjunto de um frasco do Reagente 1 e um frasco doReagente 2 permite preparar o Reagente de Trabalho.Transferir o conteúdo de um frasco de Reagente 2 para umfrasco de Reagente 1 e homogeneizar por inversão. Anotar adata de expiração. Estável 5 dias entre 15 - 25 °C e 60 diasentre 2 - 8°C quando não houver contaminação química oubacteriana. Identificar o frasco do Reagente de Trabalho paraevitar confusão com outros frascos do Reagente 1. Parapreservar seu desempenho o reagente deve permanecer forada geladeira somente o tempo necessário para se obter ovolume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta.
6
INTERFERÊNCIAS
Branco da amostra:
PREPARO DO REAGENTE DE TRABALHO
�
�
405
415
Opcionalmente pode-se preparar menor volume do Reagentede Trabalho utilizando-se da proporção de 4 (quatro) volumesdo Reagente 1 para 1 (um) volume do Reagente 2.Ex.: Para preparar 1,0 mL do Reagente de Trabalho, misturar0,8 mLdo R1 com 0,2 mLdo R2.
O Reagente de Trabalho contém tampão 72 mmol/L pH 7,4,ATP 3,3 mmol/L, NAD 2,6 mmol/L, Hexoquinase 820 U/L,G-6-PDH 2500 U/L, cloreto de magnésio 8,0 mmol/L, azidasódica 9 mmol/L.
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Misturar e incubar em banho maria a 37 ºC durante 5 minutos.O nível da água no banho deve ser superior ao nível dosreagentes nos tubos de ensaio. Determinar as absorbânciasdo teste e padrão em 340 nm, acertando o zero com o branco.Aabsorbância é estável 60 minutos.
O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste,e o procedimento de cálculos se mantém inalterado. Em casode redução dos volumes é fundamental que se observe ovolume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumesda amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.
Ver linearidade.
Absorbância doTesteGlicose (mg/dL) = x 100
Absorbância do Padrão
ATeste = 0,322APadrão = 0,357
0,322Glicose (mg/dL) = x 100 = 90
0,357
Devido à grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia, o método do fator pode ser empregado
100Fator de calibração =
Absorbância do Padrão
Glicose (mg/dL) =Absorbância do Teste x Fator
100Fator = = 280
0,357
Glicose (mg/dL) = 0,322 x 280 = 90
�
�
PROCEDIMENTO
CÁLCULOS
Exemplo:
Exemplo:
DIAGNÓSTICA
Pagina: 2
Amostra ---- 0,01 mL ----
Reagente de Trabalho 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
---- ---- 0,01 mLPadrão
Branco Teste Padrão
Plasma (jejum de 8 horas):
Líquor: 2/3 da glicemia quando a medição é realizada emamostras colhidas simultaneamente.Urina: menor que 20 mg/dLou até 250 mg/24 horas
Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,0556 =Unidades SI (mmol/L).
Em duas amostras com concentrações de glicose iguais a118 e 320 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes doanalito, obtendo-se uma recuperação entre 96 e 108%. O errosistemático proporcional médio obtido em um valor de120 mg/dL foi igual a 2,4 mg/dLou 2,0%.
O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 40 amostras com valores situados entre25 e 590 mg/dL. A comparação resultou na equação daregressão y = 0,995x + 1,01 e um coeficiente de correlação (r)igual a 0,999. O erro sistemático total (constante eproporcional) verificado no nível de decisão (120 mg/dL) foiigual a 0,41 mg/dL ou 0,34%. Como as amostras foramselecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório epacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método temuma especificidade metodológica adequada.
Uma amostra protéica não contendo glicose foi utilizada paracalcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontradoum valor igual a 2,9 mg/dL, equivalente à média de 20 ensaiosmais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância dopadrão como parâmetro verificou-se que o limite de detecçãofotométrica é de 0,0277 mg/dL, correspondendo a umaabsorbância igual a 0,0001.
Três amostras com valores iguais a 500, 700 e 1000 mg/dLforam utilizadas para avaliar a resposta do sistema nasdiluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usandofatores de diluição que variaram de 2 a 8, encontrou-se umarecuperação entre 95 e 103%.
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão
Especificidade
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
Reprodutibilidade Imprecisão total
Sensibilidade metodológica
Efeitos da diluição da matriz
8
mg/dLx volume (mL)urina (mg/24 horas) =
100
O padrão é rastreável ao (SRM)917a do(NIST).
Obter o fator de calibração ao usar novo lote dereagentes ou quando o controle interno da qualidadeindicar.
Branco de reagentes: água ou solução de cloreto desódio 150 mmol/L (0,85%);Padrões: usar cal ibradores protéicos. Asconcentrações de Glicose no Calibra 1 e Calibra 2 sãorastreáveis ao SRM 965 do NIST.
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:Calibração do branco ao usar novo frasco dereagente;Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controleinterno da qualidade indicar.
A reação é linear até 700 mg/dL. Para valores maiores, diluir aamostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%), realizar novadeterminação e multiplicar o resultado obtido pelo fator dediluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado sesitue entre 80 e 200 mg/dL. Sugerimos a verificação dalinearidade metodológica e fotométrica, no mínimosemestralmente, utilizando amostras com valores até700 mg/dL.
O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve manter umsistema definido para monitorizar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e inexatidão dasdeterminações deve ser prática rotineira no laboratório clínico.Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa dereferência ou no nível de decisão e outro controle com um valorem outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma metade estado de controle para que a variação máxima encontradaseja de 5% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas deWestgard para verificar a estabilidade do sistema de medição.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas Qualitrol 1 eQualitrol 2 da Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.
Os valores abaixo substituem os valores de referência. Estesvalores foram determinados pela American DiabetesAssociation (ADA) a partir de dados epidemiológicostratados estatisticamente e relacionam os níveis deglicose com o risco de desenvolver diabetes mellitus(Diabetes Care 2004; 27 (SUPPL 1): S5-S10 ou
CALIBRAÇÃO
Calibrações manuais
Sistemas automáticos
Intervalo de calibrações
LINEARIDADE
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
VALORES DESEJÁVEIS OU RECOMENDADOS
Standard Reference MaterialNational Institute of Standards and Technology
�
�
�
�
�
�
�
7
http://care.diabetesjournals.org/cgi/content/full/27/suppl_1/s5).
Pagina: 3
DIAGNÓSTICA
MÉDIAN DP CV%
Amostra 1 10 86 1,08 1,25
Amostra 2 10 165 1,62 0,98
Amostra 3 10 302 3,78 1,25
MÉDIAN DP CV%
Amostra 1 10 88 2,52 2,90
Amostra 2 10 169 3,78 2,20
Amostra 3 10 300 5,04 1,70
70 a 99 mg/dL Glicemia de jejum normal
� a 126 mg/dL Provável Diabetes Mel l i tus:O diagnóstico de diabetes deveser confirmado em nova amostracolhida em dia subseqüente.
Glicemia de jejum alterada100 a 125 mg/dL
Revisão: Outubro, 2001 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 150604 Reprodução sob prévia autorização
SIGNIFICADO CLÍNICO
OBSERVAÇÕES
Valores elevados de glicose ocorrem nos vários tipos dediabetes primários, nos estados de intolerância à glicose e nodiabetes secundário a várias doenças (hipertireoidismo,hiperpituitarismo, hiperadrenocorticismo, etc.). Para umarevisão dos critérios diagnósticos e classificação dodiabetes mellitus consultar Diabetes Care 2004; 27 (SUPPL 1):S5-S10 ou:
Valores diminuídos de glicose ocorrem nas hipoglicemias quepodem ser devidas a várias causas. Quando a ocorrência desintomas de hipoglicemia é relacionada à alimentação, duasformas de hipoglicemia podem ser definidas: hipoglicemia dojejum e pós-prandial.As causas mais comuns de hipoglicemia do jejum são:hiperinsulinismo endógeno (insulinoma e sulfonilurea),hiperinsulinismo exógeno (factício), tumores extrapancreáticos,síndrome auto imune ( formação expontânea de anticorpospara receptores da insulina), insuficiência supra-renal e ouhipofisária, doença hepática grave e alcoolismo.A hipoglicemia pós-prandial, dependendo da história clínica eda resposta ao teste oral de tolerância à glicose, é classificadaem hipoglicemia alimentar, do diabético tipo II, do paciente comintolerância à glicose, funcional ou reativa.
Para uma revisão dos critérios diagnósticos e classificação dodiabetes mellitus consultar Diabetes Care 2004; 27 (SUPPL 1):S5-S10 ou:
A redução da concentração de glicose nos líquidos corporaisencontra-se usualmente relacionada a processosinflamatórios ou infecciosos.
A determinação da concentração de glicose no líquorrepresenta um dos parâmetros para a distinção entremeningite bacteriana e virótica tendo, porém, sensibilidadeinferior à avaliação da celularidade no mesmo material.
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos< 0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar Young DS
, 3ª edição, Washington:AACC Press,1990.
http://care.diabetesjournals.org/cgi/content/full/27/suppl_1/s5).
http://care.diabetesjournals.org/cgi/content/full/27/suppl_1/s5).
�
�
�
�
Effects of Drugs onClinical Laboratory Tests
REFERÊNCIAS
APRESENTAÇÃO
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDORTermos e Condições de Garantia
SERVIÇO DEAPOIOAO CLIENTE
Labtest Diagnóstica S.A.
1. Bergmeyer HU. Methods of Enzimatic Analisys, 3ed, vol 6,Deerfield Beach: Verlag Chemie,1984;163-172.
2. Bjorkem I, Blomstrand R, Falk O, and Ohman G. Clin ChimActa 1976;72:353-62.
3. Bondar RJL, Mead D. Clin Chem 1974;20:586-90.
4. Inmetro - Boas Práticas de Laboratório Clínico e Listas deVerificação paraAvaliação, Qualitymark eds, Rio de Janeiro,1997.
5. Kaplan LA, Pesce AJ.: Methods in Clinical Chemistry, St.Louis: The C.V. Mosby Co., 1987;105-11.
6. Tietz NW. Fundamentals of Clinical Chemistry, Philadelphia:W.B. Saunders Co, 1970;155.
7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem1981;27:493-501.
8. Labtest : Dados deArquivo.
O número de testes em aplicações automáticas depende dosparâmetros de programação.
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos, desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.
Telefone 0800-31-3411 - Ligação Gratuitae-mail: [email protected]
Estão disponíveis as aplicações para sistemas automáticos.
CGC: 16.516.296 / 0001 - 38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br
Pagina: 4
DIAGNÓSTICA
85-4/50
1,0 mL
4 x 10 mL
200
4 x 40 mL
1 x 5 mL
Catálogo
Nº de testes
Volume/teste
Reagente 1
Reagente 2
Padrão
PROTEÍNAS TOTAISCat. 99ANVISA10009010080
FINALIDADE
PRINCÍPIO
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
METODOLOGIA
1. Reagente Biureto - Reagentepronto para uso.
2. Padrão 4,0 g/dL -
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Sistema para a determinação colorimétrica das ProteínasTotais em amostras de sangue e líquidos pleural, sinovial eascítico por reação de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.
Os íons cobre (Cu ) em meio alcalino (Reagente de Biureto)reagem com as ligações peptídicas das proteínas séricasformando cor púrpura, que tem absorbância máxima em545 nm, proporcional à concentração das proteínas naamostra.
O sistema Proteínas Totais da Labtest é um método direto erápido que tem elevada sensibilidade, associada com aespecificidade da reação de biureto que é uma das reaçõesmais simples e exatas para determinação das proteínas emlíquidos biológicos. O reagente possui excelente estabilidade eresposta semelhante para todas as proteínas do soro.
Concentrações moderadas de bilirrubina e hemoglobinapresentes na amostra não provocam erros significativos. Asconcentrações de triglicérides maiores que 500 mg/dLproduzem interferências positivas que podem ser minimizadasutilizando branco de amostra ou aplicando fotometria de leiturabicromática com filtro primário em 545 nm e filtro secundárioem 700 nm.
O sistema é facilmente aplicável em analisadores semi-automáticos e automáticos capazes de medir com exatidão aabsorbância entre 530 e 550 nm.
Biureto.
REAGENTESArmazenar entre 15 - 30 °C.
Contém hidróxido de sódio 600 mmol/L, sulfato de cobre12 mmol/L, estabilizador e antioxidante. Manusear comcuidado. Reagente corrosivo. Não pipetar com a boca.
Armazenar entre 15 - 30 °C. Armazenarbem vedado para evitar evaporaçãoContém albumina bovina 4 g/dLe azida sódica 14,6 mmol/L.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação dos reagentes que não devem ser pipetados coma boca. O Reagente Biureto contém hidróxido de sódio que écorrosivo e pode produzir queimaduras. No caso de contatocom os olhos deve-se lavar imediatamente com grandequantidade de água e procurar auxílio médico. Em caso deingestão oferecer grande quantidade de água com suco delimão ou vinagre. Não provocar vômitos. Procurar auxíliomédico. Devem-se utilizar os equipamentos de proteçãoadequados para manipular reagentes corrosivos.
+2
O Padrão contém azida sódica, que é tóxica. Deve-se tomarcuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato com osolhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar oreagente.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas e manuseados de acordo com as boaspráticas de laboratório, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre530 e 550 nm e opcionalmente entre 700 e 800 nm.Analisador automático capaz de processar 1 reagente (paraaplicações automáticas).Pipetas para medir amostras e reagentes (aplicaçõesmanuais).Cronômetro (para aplicações manuais).
Em amostras colhidas durante a manhã, as concentrações dasproteínas são 3% maiores que em amostras colhidas noperíodo da tarde. A mudança da posição em pé para a posiçãodeitada, provoca uma passagem de líquido do espaçoextravascular para os espaços intravasculares, que podereduzir as concentrações relativas das proteínas e dos analitosligados às proteínas em até 10%. No período de gestação,devido ao aumento do líquido intravascular, a proteína totaldiminui significativamente podendo apresentar reduções deaté 14%.
Quando o torniquete é mantido por mais de 3 minutos durantea colheita da amostra, ocorre um aumento de até 5% no valorda proteína total no sangue. Exercícios físicos aumentam asconcentrações das proteínas.
Soros fortemente hemolisados ou contendo expansores deplasma (Dextran, PVP e Hemacel) nas amostras leva aobtenção de resultados falsamente elevados.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.
Usar soro e líquidos (pleural, sinovial e ascítico). As proteínassão estáveis 3 dias entre 2 - 8 °C e 7 dias a 10 °C negativos.
A metodologia não é adequada para a dosagem das proteínasna urina ou no líquor. Para estas amostras deve ser utilizada ametodologia proposta por Meulemans e Pennock , ou utilizaro produto Sensiprot Labtest, (Cat. 36).
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
AMOSTRA
5 6
Instruções de Uso
INTERFERÊNCIAS
Minimização daAção de InterferentesBranco da Amostra:
PROCEDIMENTO
CÁLCULOS
As concentrações de bilirrubina até 32 mg/dL, hemoglobina até130 mg/dL e triglicérides até 500 mg/dL não produzeminterferências significativas.
Concentrações de triglicérides entre 500 mg/dL e 1100 mg/dLproduzem interferências positivas que podem ser minimizadasutilizando o Branco da Amostra ou fotometria de leiturabicromática com filtro primário em 545 nm e filtro secundárioem 700 nm.
Concentrações de hemoglobina maiores que 130 mg/dLproduzem interferências positivas que não podem serminimizadas utilizando o Branco da Amostra.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando ozero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 601Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 467
Misturar 1,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) com 0,02 mL da amostra. Medir a absorbância em 545nm, acertando o zero com água destilada ou deionizada.Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste ecalcular a concentração. Este sistema de correção só pode seraplicado nos casos em que a amostra produz umainterferência fotométrica como ocorre nas amostras lipêmicasou com concentração de bilirrubina maior que 32 mg/dL.
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Misturar e incubar a 37 °C durante 10 minutos. Determinar asabsorbâncias do teste e padrão em 545 nm (530 a 550),acertando o zero com o branco.Acor é estável durante 1 hora.
O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do teste.O procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volumemínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes daamostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.
Ver linearidade.
Absorbância do testeProteínas Totais = x (4 g/dL)
Absorbância do padrão
�
�
405
415
Exemplo:
Exemplo:
CALIBRAÇÃO
Calibrações manuais
Sistemas automáticos
Intervalo de calibrações
LINEARIDADE
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
Absorbância do teste = 0,405Absorbância do padrão = 0,238
0,405Proteínas Totais = x 4 g/dL= 6,80 g/dL
0,238
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia, pode-se utilizar o método do fator para calcularas concentrações das amostras com absorbância dentro dointervalo de linearidade.
4 g/dLFator de calibração =
Absorbância do padrão
Proteínas Totais =Absorbância do teste x Fator (g/dL)
4 g/dLFator = = 16,80 g/dL
0,238
Proteínas Totais = 0,405 x 16,80 g/dL= 6,80 g/dL
A concentração de proteínas no Padrão (No. 2) e noscalibradores da serie Calibra é rastreável ao
(SRM) 927 do(NIST).
Obter o fator de calibração ao usar novo lote de reagentesou quando o controle interno da qualidade indicar.
Branco de reagentes: água ou solução de cloreto de sódio150 mmol/L (0,85%);Usar os calibradores da linha Calibra Labtest.
Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle internoda qualidade indicar.
O resultado da medição é linear entre 1,0 e 14,0 g/dL. Paravalores maiores diluir a amostra com NaCI 150 mmol/L(0,85%) e repetir a medição. Multiplicar o resultado obtido pelofator de diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valorencontrado se situe entre 4,0 e 8,0 g/dL. Sugerimos averificação da linearidade metodológica e fotométrica, nomínimo semestralmente, utilizando amostras com valores até14,0 g/dL.
O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os regulamentos aplicáveis,objetivos, procedimentos, critérios para especificações daqualidade e limites de tolerância, ações corretivas e registrodas atividades. Ao mesmo tempo deve manter um sistemadefinido para monitorar a variabilidade analítica que ocorre emtodo o sistema de medição. Portanto, o uso de controles paraavaliar a imprecisão e inexatidão das determinações deve serprática rotineira no laboratório clínico. Sugere-se usar umcontrole com um valor situado na faixa de referência ou nonível de decisão e outro controle com um valor em outro nívelde significância clínica. Deve-se criar uma meta de estado decontrole para que o coeficiente de variação máximo seja
2,0% com um erro total em relação ao valor real 5,2 % ouentão utilizar um sistema de regras de controle para verificar aestabilidade do sistema de medição.
StandardReference Material National Institute ofStandards and Technology
�
�
�
�
�
�
� �7
TESTEBRANCO PADRÃO
Amostra 0,02 mL--- ---
0,02 mL------Padrão (n° 2)
---
1,0 mL
---
1,0 mL
0,02 mL
1,0 mL
Água destiladaOu deionizada
Reagente Biureto
Especificações de erro máximo baseadas na VariaçãoBiológica: Imprecisão (CV%) 2,0%; Bias: ± 1,8%; Erro total:
5,2%.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linhaQualitrol Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, napopulação atendida, sua própria faixa de valores de referência.
6,0 a 8,0 g/dL.Conversão: Unidades Convencionais (g/dL) x 10 = UnidadesSI (g/L).
Em duas amostras com concentração de Proteína igual a6,3 g/dL foram adicionadas quantidades diferentes do analito,obtendo-se recuperações entre 99,4 e 99,6%. O errosistemático proporcional médio obtido em um valor de 6,0 g/dLé igual a 0,03 g/dLou 0,5%.
O método Proteínas Totais Labtest foi comparado com outrométodo utilizando tecnologia similar, sendo obtidos osseguintes resultados:
O erro sistemático médio é igual a 1,75% no nível de decisão6,0 g/dL e 0,44% no nível de decisão 8,0 g/dL. Os erros sãomenores que o erro sistemático analítico da especificaçãobaseada na variação biológica que é 1,8%. Confirma-se ahipótese nula de que as diferenças entre o método ProteínasTotais Labtest e o método comparativo não se desviam emmais que o desvio provocado pelas imprecisões inerentes,caracterizando a identidade ou relação funcional entre osmétodos. O erro total (erro aleatório + erro sistemático)estimado em um nível de decisão igual a 6,0 g/dL, é igual a0,11 g/dL ou 3,55%. O método Labtest é substancialmenteequivalente ao método comparativo. O coeficiente decorrelação (0,999) confirma a força da relação entre osmétodos.
� �
�
�
VALORES DE REFERÊNCIA
Soro:
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão
Estudos de comparação de métodos
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
8
Reprodutibilidade - Imprecisão total
Sensibilidade Metodológica
Efeitos da Diluição da Matriz
SIGNIFICADO CLÍNICO
OBSERVAÇÕES
Utilizando-se a absorbância do padrão como parâmetro, olimite de detecção fotométrica é 0,0168 g/dL, correspondendoa uma absorbância igual a 0,001.
Duas amostras com valores iguais a 12,3 e 15,1 g/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L. Usando um fator de diluiçãoigual a 2, foram encontradas recuperações entre 100,5% e101,3%. Os erros sistemáticos encontrados sãosignificativamente menores que o bias analítico daespecificação baseada nos componentes da variaçãobiológica.
A dosagem isolada da proteína total tem pouco valor, porque aalteração em uma das frações pode ser compensada poralteração oposta de outra fração, como ocorre nas doençascrônicas em que há diminuição de albumina com aumento degamaglobulina. Ocorrência similar pode ser observada emrespostas de fase aguda, tais como infecções ou traumas,ocasião em que muitas proteínas plasmáticas produzidas nofígado aumentam sua concentração, enquanto a albumina sereduz, mantendo a concentração protéica total praticamenteinalterada.
As proteínas estão aumentadas em algumas neoplasias,especialmente em mieloma múltiplo; na macroglobulinemia;doenças autoimunes, como artrite reumatóide e lupuseritematoso sistêmico; doenças granulomatosas como asarcoidose, leishmaniose visceral; endocardite bacterianasub-aguda e linfogranuloma; em alguns casos de doençahepática crônica, como hepatite autoimune e na desidratação.As proteínas estão diminuídas na gravidez; hiperhidratação,desnutrição grave, cirrose e outras doenças hepáticas,incluindo alcoolismo crônico; imobilização prolongada;insuficiência cardíaca; nefrose e insuficiência renal;hipertireoidismo; deficiência de cálcio e vitamina D e nasíndrome de má absorção.
Adosagem de proteína no líquido sinovial tem sensibilidade de52% e especificidade de 56% nas doenças inflamatórias. Adeterminação da concentração de proteínas no líquido pleuralé de pouco valor, exceto quando combinada com outrosparâmetros que permitam fazer a diferença entre exsudato etransudato. Em 15 a 20% dos indivíduos com hepatopatiasacompanhadas de ascite, a concentração de proteína nolíquido ascítico é superior a 2,5 g/dL. Nos pacientes com ascitede etiologia neoplásica, as concentrações de proteínas sãomenores que 2,5 g/dL.
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para usar nas medições,
Média das estimativas (g/dL)
Equação da regressão
Coeficiente de correlação
Erro sistemático médio (g/dL)
Intervalo de concentração (g/dL)
2020Número de amostras
MétodoComparativo
Proteínas TotaisLabtest
2,68 a 12,352,53 a 12,45
7,72
0,999
0,05
Método Labtest =0,965xComparativo + 0,315 g/dL
7,77
MÉDIAN DP (g/dL) CV%
Amostra 1 20 4,68 0,03 0,64
Amostra 2 20 6,40 0,04 0,63
Amostra 3 20 8,20 0,05 0,61
MÉDIAN DP (g/dL) CV%
Amostra 1 20 4,68 0,05 1,07
Amostra 2 20 6,40 0,07 1,09
Amostra 3 20 8,20 0,06 0,73
Labtest Diagnóstica S.A.CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600Lagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br
Revisão: Agosto, 2005. Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 180805 Reprodução sob prévia autorização
deve ter resistividade 1 megaohm ou condutividade1 microsiemens e concentração de silicatos < 0,1 mg/L (água
tipo II). Para o enxágüe da vidraria a água pode ser do tipo III,com resistividade 0,1 megaohms ou condutividade
10 microsiemens. No enxágüe final utilizar água tipo II.Quando a coluna deionizadora está com sua capacidadesaturada ocorre a produção de água alcalina com liberação devários íons, silicatos e substâncias com grande poder deoxidação ou redução que deterioram os reagentes em poucosdias ou mesmo horas, alterando os resultados de modoimprevisível. Assim, é fundamental estabelecer um programade controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar: www.fxol.org/
1. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook of ClinicalC h e m i s t r y , 2 a . E d i ç ã o , W B S a u n d e r sCompany:Philadelphia, 1986, 695-700.
2. Faulkner WR, Meites S. Selected Methods for theS m a l l C l i n i c a l C h e m i s t r y L a b o r a t o r y ,AACC:Washington,1982;9:317-320.
3. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Clinical Chemistry,Principles and Technics, 2a. Edição. Harper & Row:NewYork, 1974,405-435.
4. Inmetro - Boas Praticas de Laboratório Clínico e Listas deVerificação para Avaliação, Qualitymark eds:Rio de Janeiro,1997.
5. Meulemans O. Clin ChimActa 1960;5:757.
6. Pennock CA., Passant LP, Bolton FG. J Clin Path1968;21:518.
7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem1981;27:493-501.
8. Labtest: Dados deArquivo.
O número de testes em aplicações automáticas depende dosparâmetros de programação.
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.
Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)e-mail: [email protected] Estão disponíveis aplicações parasistemas automáticos.
�
�
�
�
REFERÊNCIAS
APRESENTAÇÃO
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDORTermos e Condições de Garantia
Serviço deApoio ao Cliente
Catálogo
Reagente Biureto
Padrão
99-100
1 x 3 mL
1 x 100 mL
99-250
1 x 250 mL
1 x 3 mL
TRANSAMINASEOXALACÉTICACat. 52ANVISA10009010031
FINALIDADE
PRINCÍPIO
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
METODOLOGIA
REAGENTES1. TGO Substrato
2. Reagente de Cor
3. NaOH - Estoque -
4. Padrão
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Sistema para medida da atividade da TransaminaseOxalacética (TGO) em amostra de sangue por método cinéticode tempo fixo e medição de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.
A transaminase oxalacética promove a transferência degrupamentos amina de -aminoácidos para -cetoácidos.
TGOL-Aspartato + -cetoglutarato Glutamato + Oxalacetato
O oxalacetato formado é medido através da formação dehidrazona, a qual tem intensa cor em meio alcalino.
O sistema Transaminase Oxalacética Labtest contém todos osreagentes necessários a uma segura determinação, utilizandoum processo em 4 etapas e permitindo que a fotometria sejarealizada em qualquer fotômetro que tenha filtros com emissãoentre 490 a 540 nm.
Os reagentes são rigorosamente padronizados e estabilizadosvisando à manutenção de rígidas e ótimas condições para aação enzimática.
O hidróxido de sódio é preparado e titulado em condições derigoroso controle, o que elimina a presença de carbonato eassegura uma ação correta do reagente.
Reitman e Frankel.
-Armazenar entre 2 - 8 ºC.Contém tampão 67 mmol/L, pH 7,4; ácido -cetoglutárico2,0 mmol/L, ácido L-aspártico 99 mmol/L e azida sódica15,4 mmol/L.
- Armazenar entre 2 - 8 ºC. Não congelar.Contém 2,4-dinitrofenilhidrazina 1,0 mmol/L e ácido clorídrico1,0 mol/L.
Armazenar entre 15 - 25 ºC.Contém hidróxido de sódio 1,25 mol/L. Reagente corrosivo.
-Armazenar entre 2 - 8 ºC.Contém piruvato de sódio 2 mmol/L. Após o manuseiosugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação de reagentes.
� �
�
�
O NaOH - Estoque contém hidróxido de sódio que é corrosivo epode produzir queimaduras.
O TGO Substrato contém azida sódica que é tóxica. Deve-setomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato comos olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar oreagente.
Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosaobservação do tempo e da temperatura de incubação é degrande importância para a qualidade dos resultados obtidos. Adiferença de 1 minuto no tempo de incubação desta dosagemintroduz um erro de 3,3% nos resultados.
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 ºC)Fotômetro capaz de medir, com exatidão, a absorbância entre490 e 540 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.
Amostras hemolisadas produzem interferência positiva devidoà elevada concentração de TGO nas hemácias.
O alcoolismo crônico aumenta a atividade da TGO de 18 a100%.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.
Usar soro ou plasma (EDTA, heparina) e líquor. A atividadeenzimática é estável 4 dias entre 2 - 8 ºC e 2 semanas a 10 ºCnegativos.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
Valores de Bilirrubina até 5 mg/dL e Triglicérides até 170 mg/dLnão produzem interferências significativas.
Amostras hemolisadas produzem interferência positiva devidoà elevada concentração de TGO nas hemácias.
Valores de Triglicérides entre 170 e 900 mg/dL produzeminterferência positiva que pode ser minimizada utilizando oBranco deAmostra.
Misturar 3,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) com 0,05 mL da amostra. Medir a absorbância em505 nm ou filtro verde (490 a 540), acertando o zero com águadestilada ou deionizada. Subtrair a absorbância assim obtidada absorbância do teste e obter a atividade da transaminaseoxalacética utilizando a curva de calibração. Este sistema decorreção é aplicável apenas nos casos em que a amostraproduz interferência fotométrica.
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
AMOSTRA
INTERFERÊNCIAS
Minimização daAção de InterferentesBranco de Amostra:
Instruções de Uso
PREPARO DO REAGENTE
NaOH de Uso:
CURVADE CALIBRAÇÃO
TRAÇADO DACURVADE CALIBRAÇÃO
PROCEDIMENTO
Ver observações 1 e 2.
Transferir quantitativamente o conteúdo do frasco nº 3(160 mL) para um balão volumétrico ou proveta, completarpara 500 mL com água destilada ou deionizada livre de CO ehomogeneizar. Estável 12 meses em recipiente de plásticoentre 15 - 25 ºC.
A água utilizada deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos< 0,1 mg/L.
Como o sistema de medida Reitman-Frankel (Unidades/mL)não segue a lei de Beer, é impossível utilizar o método do fatorpara cálculo, sendo necessária a preparação de curva decalibração.
Tomar 5 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 5 minutos.Determinar as absorbâncias ou T% em 505 nm ou filtro verde(490 a 540), acertando o zero com água destilada oudeionizada.Acor é estável por 60 minutos.
Traçar a curva de calibração correlacionando as leiturasobtidas com os valores em Unidades/mL expressos na tabelaabaixo, utilizando papel linear (para absorbâncias) ou monolog(para T%).
Ver observação 3.
Tomar 1 tubo de ensaio e proceder como a seguir:
Incubar em banho-maria a 37 ºC durante 2 minutos. O nível daágua no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nostubos de ensaio.
Misturar e incubar em banho-maria a 37 ºC exatamente 60minutos.
Misturar e deixar a temperatura ambiente 20 minutos.
2
�
�
Misturar e esperar 5 minutos. Determinar as absorbâncias ouT% em 505 nm ou filtro verde (490 a 540), acertando o zerocom água destilada ou deionizada.Acor é estável 60 minutos.
Obter o valor de TGO usando a curva de calibração (verDesempenho do Sistema).
O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 3,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do testee o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volumemínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes daamostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.
Quando for obtido um valor igual ou maior que 190Unidades/mL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fatorde diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontradose situe entre 50 e 150 Unidades/mL. Sugerimos a verificaçãodo desempenho do sistema no mínimo semestralmente,utilizando amostras com valores até 190 Unidades/mL.
O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve manter umsistema definido para monitorar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e inexatidão dasdeterminações deve ser prática rotineira do laboratório clínico.Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa dereferência ou no nível de decisão e outro controle com um valorem outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma metade estado de controle para que a variação máxima encontradaseja de 10% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas deWestgard para avaliação do estado de controle.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linhaQualitrol da Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, napopulação atendida, sua própria faixa de valores de referência.
Soro: 4 a 36 Unidades/mL
UI = Unidades/mLx 0,482
Em duas amostras com concentrações de transaminaseoxalacética iguais a 22 e 129 Unidades/mL foram adicionadasquantidades diferentes da enzima obtendo-se recuperaçõesentre 104 e 108%. O erro sistemático proporcional médioobtido em um valor de 60 Unidades/mL foi igual a 3,6Unidades/mLou 6,0%.
DESEMPENHO DO SISTEMA
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
VALORES DE REFERÊNCIA
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão
7
8
mLmL mLmL mLmL mLmL mLmL
Tubo nºTubo nº 11 22 33 44 55
Água destilada ou deionizada 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Reagente de Cor (nº 2) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Padrão (nº 4) --- 0,1 0,2 0,3 0,4
TGO Substrato (nº 1) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6
NaOH de Uso 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0
Zero 24 61 114 190TGO (Unidade/mL)
Tubo nº 1 2 3 4 5
0,25 mLTGO Substrato (nº 1)
Teste
Amostra 0,05 mL
Reagente de Cor (nº 2) 0,25 mL
NaOH de Uso 2,5 mL
Várias drogas comumente usadas encontram-se relacionadasao aumento da AST: isoniazida, fenotiazinas, eritromicina,progesterona, esteróides, opiáceos, indometacina, halotano emetildopa.
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes medicamentosas deinterferência nos resultados e na metodologia, sugere-seconsultar Young, DS.
, 3 edição, Washington:AACC Press, 1990.
1. KarmenA. J Clin Invest 1955;34:131.
2. Reitman S, Frankel S.Am J Clin Path 1957;28:56.
3. Tietz NW. Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B.Saunders Co, 1970.
4. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.
5. Varley H. Practical Clinical Biochemistry, Willian HeinemannMedical Book Ltd. 1967.
6. Wroblewski F, Cabaud P.Am J Clin Path 1957;27:235.
7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Growth T.1981;27:493-501.
8. Labtest: Dados de arquivo.
Termos e Condições de Garantia A Labtest Diagnósticagarante o desempenho deste produto dentro dasespecificações até a data de expiração indicada nos rótulos,desde que os cuidados de utilização e armazenamentoindicados nos rótulos e nestas instruções sejam seguidoscorretamente.
OBSERVAÇÕES
REFERÊNCIAS
APRESENTAÇÃO
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDOR
�
�
�
�
Effects of Drugs on Clinical LaboratoryTests
a
Especificidade
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
Reprodutibilidade Imprecisão total
Sensibilidade metodológica
Efeitos da diluição da matriz
SIGNIFICADO CLÍNICO
O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 80 amostras com valores situados entre 11 e 174Unidades/mL. A comparação resultou na equação daregressão: y = 0,895x - 6,818 e um coeficiente de correlação (r)igual a 0,99. O erro sistemático total (constante e proporcional)verificado no nível de decisão (60 Unidades/mL) foi igual a 13Unidades/mL ou 22%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.
Uma amostra protéica não contendo transaminase oxalacéticafoi utilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendosido encontrado um valor igual a 5,0 Unidades/mL, equivalenteà média de 20 ensaios mais dois desvios padrão.
Duas amostras com valores iguais a 149 e 165 Unidades/mLforam utilizadas para avaliar a resposta do sistema nasdiluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usandofatores de diluição que variaram de 2 a 8 foram encontradasrecuperações entre 88 e 100%.
Elevações das transaminases ocorrem na hepatite (viral etóxica), na mononucleose, cirrose, colestase, carcinomahepático primário ou metatástico, pancreatite, traumatismoextenso e no choque prolongado. Nas hepatopatias agudas,geralmente, o valor da transaminase pirúvica (ALT) excede oda oxalacética (AST).
Atransaminase oxalacética quase sempre está elevada após oinfarto agudo do miocárdio, fato incomum para a pirúvica. Atransaminase oxalacética começa a elevar-se 6 a 12 horasapós o infarto para alcançar o pico máximo entre 24 a 48 horas,normalizando-se pelo 5º ou 6º dia. Deve-se ressaltar que asensibilidade e especificidade da dosagem de AST nodiagnóstico do infarto agudo do miocárdio são baixas,tornando a determinação desta enzima a menos indicada paraeste diagnóstico.
Auremia encontra-se associada à queda da AST.
Elevações significativas da atividade daAST no líquor têm sidoobservadas em pacientes com acidentes cerebrovasculares.Se o nível sérico da enzima encontra-se também elevado,trata-se provavelmente de dano maciço ao parênquimacerebral. Neoplasias envolvendo o cérebro e a medulaespinhal são acompanhadas de vários graus de elevação naatividade da AST no líquor.
Nos indivíduos com meningite bacteriana observam-se,usualmente, valores dentro da faixa de referência.
MÉDIAN DP CV%
Amostra 1 20 19 1,53 7,9
Amostra 2 20 61 2,66 4,4
MÉDIAN DP CV%
Amostra 1 20 20 2,86 14,7
Amostra 2 20 59 3,85 6,53
1 x 50 mL
1 x 4 mL
1 x 50 mL
1 x 160 mL
TGO Substrato
Reagente de Cor
NaOH - Estoque
Padrão
Catálogo
Nº de testes
Volume/Teste
52-200
3,0 mL
200
Revisão: Outubro, 2004 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 181104 Reprodução sob prévia autorização
Serviço deApoio ao Cliente
Labtest Diagnóstica S.A.
Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)e-mail: [email protected]
CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600Lagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br
TRANSAMINASEPIRÚVICACat. 53ANVISA10009010027
FINALIDADE
PRINCÍPIO
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
METODOLOGIA
REAGENTES1. TGP Substrato
2. Reagente de Cor
3. NaOH - Estoque
4. Padrão
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Sistema para medida da atividade da Transaminase Pirúvica(TGP) em amostra de sangue por método cinético de tempofixo e medição de ponto final.Somente para uso diagnóstico in vitro.
A transaminase pirúvica promove a transferência degrupamentos amina de -aminoácidos para -cetoácidos.
TGPL- Alanina + -cetoglutarato Glutamato + Piruvato
O piruvato formado é medido através da formação dehidrazona, a qual tem intensa cor em meio alcalino.
O sistema Transaminase Pirúvica Labtest contém todos osreagentes necessários a uma segura determinação, utilizandoum processo em 4 etapas e permitindo que a fotometria sejarealizada em qualquer fotômetro que tenha filtros com emissãoentre 490 a 540 nm.
Os reagentes são rigorosamente padronizados e estabilizadosvisando à manutenção de rígidas e ótimas condições para aação enzimática.
O hidróxido de sódio é preparado e titulado em condições derigoroso controle, o que elimina a presença de carbonato eassegura uma ação correta do reagente.
Reitman e Frankel.
-Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém tampão 67 mmol/L, pH 7,4; ácido -cetoglutárico2,0 mmol/L; L-alanina 100 mmol/Le azida sódica 15,4 mmol/L.
- Armazenar entre 2 - 8 °C. Não congelar.Contém 2,4-dinitrofenilhidrazina 1,0 mmol/L e ácido clorídrico1,0 mol/L.
-Armazenar entre 15 - 25 °C.Contém hidróxido de sódio 1,25 mol/L. Reagente corrosivo.
-Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém piruvato de sódio 2 mmol/L. Após o manuseiosugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação de reagentes.
� �
�
�
O NaOH - Estoque contém hidróxido de sódio que é corrosivo epode produzir queimaduras.
O TGP Substrato contém azida sódica que é tóxica. Deve-setomar cuidado para evitar a ingestão e, no caso de contato comos olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar oreagente.
Como ocorre com toda reação enzimática, a rigorosaobservação do tempo e da temperatura de incubação é degrande importância para a qualidade dos resultados obtidos. Adiferença de 1 minuto no tempo de incubação desta dosagemintroduz um erro de 3,3% nos resultados.
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C)Fotômetro capaz de medir, com exatidão, absorbância entre490 e 540 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.
Exercícios em excesso (alta atividade) diminuem a atividadedaALT.
Em pessoas do sexo feminino de todas as idades, a atividadedaALT é mais baixa que em indivíduos do sexo masculino.
Esteróides anabólicos, andrógenos, cloranfenicol,clorotiazida, uso prolongado de aspirina, gentamicina, entreoutros, podem provocar um aumento da atividade da TGP.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.
Usar soro ou plasma (EDTA, heparina) e líquor. A atividadeenzimática é estável 4 dias entre 2 - 8 °C e 2 semanas a 10 °Cnegativos.
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las devem-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
Valores de Bilirrubina até 5 mg/dL, Hemoglobina até 90 mg/dLe Triglicérides até 250 mg/dL não produzem interferênciassignificativas.
Valores de Hemoglobina até 180 mg/dL e Triglicérides entre250 e 750 mg/dL produzem resultados falsamente elevadosque podem ser corrigidos utilizando o branco de amostra.
Valores de Bilirrubina acima de 5 mg/dL e Triglicérides acimade 750 mg/dL produzem resultados falsamente elevados.Neste caso o branco de amostra não é aplicável.
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
AMOSTRA
INTERFERÊNCIAS
Instruções de Uso
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando ozero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 601Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 467
Misturar 3,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) com 0,05 mL da amostra. Medir a absorbância em505 nm, acertando o zero com água deionizada ou destilada.Subtrair a absorbância assim obtida da absorbância do teste eobter a atividade da transaminase pirúvica utilizando a curvade calibração. Este sistema de correção é aplicável apenasnos casos em que a amostra produz interferência fotométrica.
Ver observações 1 e 2.
Transferir quantitativamente o conteúdo do frasco nº 3(160 mL) para um balão volumétrico ou proveta, completarpara 500 mL com água destilada ou deionizada livre de CO ehomogeneizar. Estável 12 meses em recipiente de plásticoentre 15 - 25 °C.
A água utilizada deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos0,1 mg/L.
Como o sistema de medida Reitman-Frankel (Unidades/mL)não segue a lei de Beer, é impossível utilizar o método do fatorpara cálculo, sendo necessária a preparação de curva decalibração.
Tomar 5 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 5 minutos.Determinar as absorbâncias ou T% em 505 nm ou filtro verde(490 a 540), acertando o zero com água destilada oudeionizada.Acor é estável 60 minutos.
Traçar a curva de calibração correlacionando as leiturasobtidas com os valores em Unidades/mL expressos na tabelaabaixo, utilizando papel linear (para absorbâncias) ou monolog(para T%).
�
�
�
�
405
415
2
Minimização daAção de InterferentesBranco de Amostra:
PREPARO DO REAGENTE
NaOH de Uso:
CURVADE CALIBRAÇÃO
TRAÇADO DACURVADE CALIBRAÇÃO
PROCEDIMENTO
DESEMPENHO DO SISTEMA
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
Ver observação 3.
Tomar 1 tubo de ensaio e proceder como a seguir:
Incubar em banho-maria a 37 °C durante 2 minutos. O nível daágua no banho deve ser superior ao nível dos reagentes nostubos de ensaio.
Misturar e incubar em banho-maria a 37 °C por exatamente 30minutos.
Misturar e deixar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
Misturar e esperar 5 minutos. Determinar as absorbâncias ouT% em 505 nm ou filtro verde (490 a 540), acertando o zerocom água destilada ou deionizada.Acor é estável 60 minutos.
Obter o valor de TGP usando a curva de calibração (verDesempenho do Sistema).
O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 3,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do testee o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volumemínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumes daamostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.
Quando for obtido um valor igual ou maior que 150Unidades/mL, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),realizar nova medição e multiplicar o resultado pelo fator dediluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado sesitue entre 50 e 120 Unidades/mL. Sugerimos a verificação dodesempenho do sistema, no mínimo semestralmente,utilizando amostras com valores até 150 Unidades/mL.
O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve manter umsistema definido para monitorar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e inexatidão dasdeterminações deve ser prática rotineira do laboratório clínico.Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa dereferência ou no nível de decisão e outro controle com um valorem outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma metade estado de controle para que a variação máxima encontradaseja de 10% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas deWestgard para avaliação do estado de controle.7
mLmL mLmL mLmL mLmL mLmL
Tubo nºTubo nº 11 22 33 44 55
Água destilada ou deionizada 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Reagente de Cor (nº 2) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Padrão (nº 4) --- 0,1 0,2 0,3 0,4
TGP Substrato (nº 1) 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6
NaOH de Uso 10,0 10,0 10,0 10,0 10,0
Zero 28 57 97 150TGP (Unidades/mL)
Tubo nº 1 2 3 4 5
0,25 mLTGP Substrato (nº 1)
Teste
Amostra 0,05 mL
Reagente de Cor (nº 2) 0,25 mL
NaOH de Uso 2,5 mL
No infarto agudo do miocárdio, os valores de ALT encontram-se dentro da faixa de referência ou ligeiramente aumentados.Elevações da ALT também são relatadas na polimiosite,dermatomiosite e rabdomiólise.
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar Young, DS.
, 3ª edição, Washington: AACCPress, 1990.
1. KarmenA. J Clin Invest 1955;34:131.
2. Reitman S, Frankel S.Am J Clin Path 1957;28:56.
3. Tietz NW. Fundamentals of Clinical Chemistry, W.B.Saunders Co, 1970.
4. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott Laboratories, Diagnostic Reagents Division,Scarborough, Canada, 1972.
5. Varley H. Practical Clinical Biochemistry, Willian HeinemannMedical Book Ltd. 1967.
6. Wroblewski F, Cabaud P.Am J Clin Path 1957;27:235.
7. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Growth T.1981;27:493-501.
8. Labtest: Dados de arquivo.
Termos e Condições de GarantiaA Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos, desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.
OBSERVAÇÕES
REFERÊNCIAS
APRESENTAÇÃO
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDOR
�
�
�
�
Effects of Drugson Clinical Laboratory Tests
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linhaQualitrol da Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça, napopulação atendida, sua própria faixa de valores de referência.
Soro: 4 a 32 Unidades/mL.
UI = Unidades/mLx 0,482
Em duas amostras com concentrações de transaminasepirúvica iguais a 9 e 75 Unidades/mL foram adicionadasquantidades diferentes da enzima obtendo-se recuperaçõesentre 94 e 104%. O erro sistemático proporcional médio obtidoem um valor de 60 Unidades/mL foi igual a 1,8 unidades/mL ou3,0%.
O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 80 amostras com valores situados entre 2 e 140Unidades/mL. A comparação resultou na equação daregressão: y = 0,817x - 0,241 e um coeficiente de correlação (r)igual a 0,99. O erro sistemático total (constante e proporcional)verificado no nível de decisão (60 Unidades/mL) foi igual a 11Unidades/mL ou 18%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada.
Uma amostra protéica não contendo transaminase pirúvica foiutilizada para calcular o limite de detecção do ensaio tendosido encontrado um valor igual a 3,0 Unidades/mL, equivalenteà média de 20 ensaios mais dois desvios padrão.
Duas amostras com valores iguais a 112 e 154 Unidades/mLforam utilizadas para avaliar a resposta do sistema nasdiluições da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usandofatores de diluição que variaram de 2 a 4 foram encontradasrecuperações entre 91 e 100%.
Elevações das transaminases ocorrem na hepatite (viral etóxica), na mononucleose, cirrose, colestase, carcinomahepático primário ou metastático, pancreatite, traumatismoextenso e no choque prolongado. Valores de ALT são iguais ousuperiores aos de AST na maioria dos pacientes com hepatiteviral, icterícia pós-hepática ou colestase intra-hepática. Noscasos de cirrose hepática, hepatite alcóolica ou carcinomametastático, os valores deALT são inferiores aos deAST.
VALORES DE REFERÊNCIA
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão
Especificidade
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
Reprodutibilidade - Imprecisão total
Sensibilidade metodológica
Efeitos da diluição da matriz
SIGNIFICADO CLÍNICO
8
MÉDIAN DP CV%
Amostra 1 20 21 0,91 4,3
Amostra 2 20 43 1,24 2,9
MÉDIAN DP CV%
Amostra 1 20 22 1,42 6,5
Amostra 2 20 42 2,20 5,3
1 x 50 mL
1 x 4 mL
1 x 50 mL
1 x 160 mL
TGP Substrato
Reagente de Cor
NaOH - Estoque
Padrão
Catálogo
Nº de testes
Volume/Teste
53-200
3,0 mL
200
Revisão: Outubro, 2004 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 181104 Reprodução sob prévia autorização
Serviço deApoio ao Cliente
Labtest Diagnóstica S.A.
Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)e-mail: [email protected]
CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600Lagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br
TRIGLICÉRIDES LiquiformCat. 87ANVISA10009010070
FINALIDADE
PRINCÍPIO
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
Sistema enzimático para determinação dos triglicérides porreação de ponto final em amostras de soro ou plasma (EDTA).Somente para uso diagnóstico in vitro.
Os triglicérides são determinados de acordo com as seguintesreações:
A lipase da lipoproteína promove a hidrólise dos triglicéridesliberando glicerol, que é convertido, pela ação daglicerolquinase, em glicerol-3-fosfato. Este é oxidado adihidroxiacetona e peróxido de hidrogênio na presença daglicerolfosfato oxidase. Em seguida, ocorre uma reação deacoplamento entre peróxido de hidrogênio, 4-aminoantipirina e4-clorofenol, catalisada pela peroxidase, produzindo umaquinoneimina que tem máximo de absorbância em 505 nm.A intensidade da cor vermelha formada é diretamenteproporcional à concentração dos triglicérides na amostra.
Triglicérides Liquiform utiliza metodologia colorimétricaenzimática que confere boa reprodutibilidade e grandeespecificidade ao sistema.
O reagente é disponibilizado sob a forma líquida, facilitandoassim sua aplicação e eliminando a possibilidade de seintroduzir erros durante as preparações de reagentes.
A necessidade de se repetir o teste em amostras de valoreselevados é minimizada pela grande linearidade do sistema quese estende até 1100 mg/dL.
Os dados de repetitividade e reprodutibilidade obtidos com osistema Triglicérides Liquiform demonstram que o método écapaz de fornecer resultados que superam as metas dedesempenho para as medidas dos triglicérides estabelecidaspelo (NCEP). Acomparação entre as imprecisões encontradas narepetitividade e na reprodutibilidade demonstra que o sistemade medição é bastante robusto nas regiões de concentraçõessignificativas para uso clínico, indicando que tem umdesempenho muito estável no dia a dia.
O sistema é facilmente aplicável a analisadores automáticos esemi-automáticos capazes de medir com exatidão aabsorbância em 505 nm.
1-5
Lipase daTriglicérides Glicerol + Ácidos Graxos
Lipoproteína
GlicerolquinaseGlicerol + ATP Glicerol-3-Fosfato + ADP
Mg
Glicerol-3-FosfatoGlicerol-3-Fosfato + O Dihidroxiacetona + H O
Oxidase
Peroxidase2 H O + 4-Aminoantipirina + 4-Clorofenol Quinoneimina+ 4 H O
+2
2 2 2
2 2 2
National Cholesterol Education Program
METODOLOGIA
REAGENTES1. Reagente 1
2. Padrão -
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
Enzimático-Trinder .
-Armazenar entre 2 - 8 °C.Contém tampão 50 mmol/L, pH 6,9; acetato de magnésio4 mmol/L; 4-clorofenol 5 mmol/L; 4-aminoantipirina300 mol/L; ATP 1,0 mmol/L; lipase da lipoproteína 1400 U/L;glicerolquinase 1000 U/L; glicerolfosfato oxidase 1500 U/L;peroxidase 900 U/Le azida sódica 7 mmol/L.
Para preservar o desempenho, o reagente deve permanecerfora da geladeira somente o tempo necessário para se obter ovolume a ser utilizado. Evitar exposição à luz solar direta. Oreagente tem uma tonalidade rósea.
Armazenar entre 2-30 °C.Contém triglicérides 200 mg/dLe azida sódica 7 mmol/L.Após o manuseio armazenar bem vedado para evitarevaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos a contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução do tempo de estabilidade.
Para preservar o desempenho, os reagentes devempermanecer fora da geladeira somente o tempo necessáriopara se obter o volume a ser utilizado. Evitar exposição à luzsolar direta.
Não utilizar o Reagente 1 quando sua absorbância medidacontra água em 505 nm for igual ou maior que 0,300 ou quandomostrar-se turvo ou com sinais de contaminação. O reagentetem uma tonalidade rósea.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação dos reagentes.
Os reagentes contêm azida sódica que é tóxica. Deve-setomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato comos olhos deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Utilizar grandes volumes de água para descartar osreagentes.
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre490 e 520 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.
Como a concentração de triglicérides é influenciada porhábitos dietéticos recentes, como consumo de álcool e porvariações do peso corporal e exercício físico, os valores dostriglicérides em um mesmo indivíduo são bastante variáveis.Os dados obtidos dentro de um mês, usando um método comCV analítico de 3,0%, mostraram que a variação biológicapode ser maior que 90% da variação intra-individual total.Mesmo nos estados de jejum, ocorre considerável variaçãobiológica, podendo mostrar diferenças de 21% em mediçõesrepetidas no mesmo indivíduo. Portanto, ao compararresultados repetidos de triglicérides com intervalos desemanas ou meses deve-se considerar o efeito da variaçãobiológica.
6
� �
� �
�
5, 7, 8
Instruções de Uso
Na ausência de jejum a concentração plasmática dostriglicérides modifica-se consideravelmente no mesmoindivíduo apresentando diferenças de até 1000%.
Amostras colhidas com heparina podem fornecer resultadosfalsamente diminuídos.
Obter a amostra com o paciente assentado. O torniquete nãodeve ser mantido por tempo maior que um minuto. Liberar otorniquete antes de aspirar o sangue.
A contaminação do material utilizado ou da amostra comglicerol fornece valores falsamente elevados. Assim, osresultados obtidos em pacientes recebendo alimentaçãoparenteral devem ser interpretados com cautela porque estaalimentação contém elevados teores de glicerol.
Níveis elevados de ácido ascórbico (vitamina C) produzeminterferências negativas por competição com o cromogênio nareação da peroxidase. Se houver suspeita da presença deácido ascórbico, deixar o soro em repouso durante 90 minutosantes de iniciar a dosagem para evitar resultados detriglicérides falsamente diminuídos. Este procedimentominimiza os valores de ácido ascórbico, podendo não sereficiente caso a concentração deste esteja elevada naamostra.
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.
A amostra de sangue deve ser obtida após jejum de 12-14horas. Deve-se enfatizar ao paciente a necessidade do jejumno tempo recomendado. A falta de padronização nas colheitasdas amostras para a dosagem dos triglicérides tem geradoenormes conflitos entre pacientes, médicos clínicos e oslaboratórios, porque, em muitos casos, não se toma o cuidadode enfatizar aos pacientes a necessidade do jejum de 12-14horas antes da colheita da amostra.
Usar soro ou plasma com EDTA. O analito é estável por doisdias entre 2-8 °C. O armazenamento prolongado da amostranão é recomendado. Os triglicérides podem ser hidrolisados,liberando glicerol, o que leva à obtenção de resultadosfalsamente diminuídos quando o ensaio utiliza branco paraeliminar a interferência do glicerol livre.
A heparina promove a ativação in vivo ou in vitro da lipase dalipoproteína, fazendo com que a concentração dos triglicéridesse reduza gradativamente em amostras contendo heparina.Este fenômeno ocorre também em amostras de soro obtidasem pacientes recebendo doses terapêuticas de heparina.
Estas orientações para obtenção e conservação da amostraestão padronizadas segundo as recomendações do NCEP .
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las, devem-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico, sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
Valores de bilirrubina até 10 mg/dL e hemoglobina até200 mg/dL não produzem interferências significativas. Valoresde bilirrubina maiores que 10 mg/dL produzem resultadosfalsamente diminuídos.
AMOSTRA
INTERFERÊNCIAS
9
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm, acertando ozero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 601Hemoglobina (mg/dL) Absorbância x 467
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Misturar e incubar em banho-maria a 37 °C durante 10minutos. O nível da água no banho deve ser superior ao níveldos reagentes nos tubos de ensaio. Determinar asabsorbâncias do teste e padrão em 505 nm ou filtro verde(490 a 520), acertando o zero com o branco. A cor é estável 60minutos.
O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 1,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente, sem prejuízo para o desempenho do teste,mantendo-se inalterado o procedimento de cálculo. Em casode redução dos volumes, é fundamental que se observe ovolume mínimo necessário para a leitura fotométrica. Volumesde amostra menores que 0,01 mL são críticos em aplicaçõesmanuais e devem ser usados com cautela porque aumentam aimprecisão da medição.
Ver linearidade.Absorbância do Teste
Triglicérides (mg/dL) = x 200Absorbância do Padrão
Absorbância do Teste = 0,174Absorbância do Padrão = 0,202
0,174Triglicérides (mg/dL) = x 200 = 172
0,202
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia, pode-se utilizar o método do fator.
200Fator de Calibração =
Absorbância do Padrão
Triglicérides (mg/dL) =Absorbância do Teste x Fator
200Fator = = 990
0,202
Triglicérides (mg/dL) = 0,174 x 990 = 172
O padrão é rastreável ao (SRM)1951 do(NIST).
�
�
405
415
PROCEDIMENTO
CÁLCULOS
Exemplo:
Exemplo:
CALIBRAÇÃOStandard Reference Material
National Institute of Standards and Technology
Amostra ---- 0,01 mL ----
Reagente 1 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
---- ---- 0,01 mLPadrão
Branco Teste Padrão
Valores desejáveis ou recomendados pediátricos
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão
Especificidade
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
Reprodutibilidade - Imprecisão total
Sensibilidade metodológica
Efeitos da diluição da matriz
12
Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,0113 =Unidades SI (mmol/L).
A recuperação foi obtida utilizando diluições de amostras comvalores elevados de triglicérides. As recuperações variaramentre 100 e 102%.O erro sistemático proporcional médioobtido em um valor de 200 mg/dLé igual a 4 mg/dLou 2%.
O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 40 amostras com valores situados entre38 e 652 mg/dL medidas em duplicata. A comparação resultouna equação da regressão: y = 1,035x -1,4 e um coeficiente decorrelação (r) igual a 0,998. O erro sistemático total (constantee proporcional) verificado no nível de decisão (200 mg/dL) éigual a 7,0 mg/dL ou 3,5%. O erro total no mesmo nível dedecisão é 5,0%. Como as amostras foram selecionadasaleatoriamente em pacientes de ambulatório e pacienteshospitalizados, pode-se inferir que o método tem umaespecificidade metodológica adequada e atende aosrequisitos especificados pelo NCEP .
Uma amostra protéica não contendo triglicérides foi utilizadapara calcular o limite de detecção do ensaio tendo sidoencontrado um valor igual a 1,72 mg/dL, equivalente à médiade 20 ensaios mais dois desvios padrão. Utilizando-se aabsorbância do padrão como parâmetro, verificou-se que olimite de detecção fotométrica é de 0,99 mg/dL,correspondendo a uma absorbância igual a 0,001.
Duas amostras com valores iguais a 977 e 1051 mg/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores dediluição que variaram de 2 a 8 foram encontradasrecuperações entre 100 e 102%.
13
9
Calibrações manuais
Sistemas automáticos
Intervalo de calibrações
LINEARIDADE
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
VALORES DESEJÁVEIS OU RECOMENDADOS
�
�
�
�
�
�
Obter o fator de calibração ao usar novo lote dereagentes ou quando o controle interno da qualidadeindicar.
Branco de reagentes: água ou solução de cloreto desódio 150 mmol/L (0,85%);Padrão: usar calibradores protéicos. As concentraçõesde triglicérides na linha Calibra são rastreáveis ao SRM1951do NIST.
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:Calibração do branco ao usar novo frasco dereagente;Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controleinterno da qualidade indicar.
O resultado da medição é linear até 1100 mg/dL. Para valoresmaiores, diluir a amostra com NaCl 150 mmol/L (0,85%),realizar nova medição e multiplicar o resultado obtido pelo fatorde diluição. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontradose situe entre 100 e 250 mg/dL. Sugerimos a verificação dalinearidade metodológica e fotométrica, no mínimosemestralmente, utilizando amostras com valores até1100 mg/dL.
O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter umsistema definido para monitorar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e desvios de calibraçãodeve ser prática rotineira no laboratório clínico. Sugere-se usarum controle com um valor situado na faixa de referência ou nonível de decisão e outro controle com um valor em outra faixade significância clínica. Deve-se criar uma meta de estado decontrole para que o erro de bias seja 5,0%, o coeficiente devariação seja 5,0% e o erro total 15,0%, conformeestabelecido pelo NCEP . Sugere-se realizar a monitorizaçãocontínua do estado de controle através do sistema de regrasde controle.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas da linhaQualitrol da Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.
São valores que substituem os valores de referência. Foramdeterminados a partir de dados epidemiológicos tratadosestatisticamente e estabelecem a concentração detriglicérides como fator de risco independente para doençacoronariana isquêmica .
� �
� � � �9
11
Amostra 1 15180 1,59 1,06
Amostra 3 41280 4,30 1,04
19780 2,59 1,31Amostra 2
MÉDIAN DP CV(%)
Amostra 1 15180 2,89 1,92
Amostra 3 41280 6,58 1,60
19780 3,80 1,93Amostra 2
MÉDIAN DP CV(%)
Desejável <150
Elevado 200 - 499
Muito Elevado >500
150 - 199Limiar Alto
Triglicérides (mg/dL)
Desejável �130
10 a 19 anos
�100
< 10 anos
>130>100Elevado
Triglicérides (mg/dL)
Revisão: Novembro, 2004. Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 200606 Reprodução sob prévia autorização
SIGNIFICADO CLÍNICO
OBSERVAÇÕES
Recentes meta-análises de estudos prospectivos indicam queos triglicérides elevados são também um fator de riscoindependente para doença coronariana isquêmica (DCI).Fatores que contribuem para valores elevados de triglicéridesna população em geral incluem obesidade e sobrepeso,inatividade física, tabagismo, consumo excessivo de álcool edietas com elevado conteúdo de carboidratos.Os achados de que valores triglicérides elevados representamum fator de risco independente para DCI sugerem quealgumas lipoproteínas ricas em triglicérides sejamaterogênicas, principalmente as VLDL parcialmentedegradadas, comumente chamadas lipoproteínasremanescentes.
Na prática clínica, o colesterol VLDL (Triglicérides 5) é a maissimples medida das l ipoproteínas aterogênicasremanescentes. Assim, o colesterol VLDL pode ser tambémum alvo da terapêutica para redução do colesterol. O
(ATP) III proposto pelo NCEP identifica asoma dos valores de colesterol LDL+VLDL [
(colesterol total - colesterol HDL)] como alvo secundárioda terapêutica em pessoas com triglicérides elevados( 200 mg/dL). A meta para o colesterol não HDL, em pessoascom valores elevados de triglicérides, pode ser estabelecidacomo sendo o valor do colesterol LDL mais 30 mg/dL (VLDL),com base na premissa de que valores de colesterol VLDLmenores que 30 mg/dLsão considerados desejáveis .
São causas de elevação dos triglicérides as várias doenças delípides chamadas hiperlipidemias ou hiperlipoproteinemias.Nestas, sejam de causa primária ou secundária, ocorreelevação dos triglicérides nos tipos I, IIb, III, IV e V.
As hiperlipidemias ocorrem secundariamente no diabetes,pancreatite, doença do armazenamento de glicogênio,síndrome nefrót ica, insuf ic iência renal crônica,hipotireoidismo, gravidez e mieloma múltiplo.
Várias mulheres em uso de estrógenos ou contraceptivos oraisapresentam aumento nas concentrações de triglicérides. Ahipertrigliceridemia também encontra-se associada ao uso debloqueadores beta-adrenérgicos, corticosteróides, diuréticostiazídicos e retinóides.
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas, alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.
�
�
�
�
�
�
AdultTreatment Panel
Colesterol nãoHDL
11
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar: Young, DS.
, 3ª edição, Washington: AACCPress, 1990.
1. Bucolo G, David H. Clin Chem 1973;19:475.
2. Fossati P, Prencipe L. Clin Chem 1982;28:2077.
3. Mc Gowan MW, Artiss JD, Strandbergh DR, Zak B. ClinChem 1983;29:538.
4. Nagele V, Hagele EO, Sauer G, Wiedeman E, Lehmann P,Wahlefeld AW, Gruber W J Clin Chem Clin Biochem1984;22:165.
5. Stein EA, Myers Gl. Clin Chem 1995;41:1421-26.
6. Trinder P.Ann Clin Biochem 1969;6:24.
7. Narayanan S. Indian J Clin Biochem 1996;11:12-16.
8. Rifai N, Warnick GR, Dominiczak MH. Handbook oflipoprotein testing., Washington:AACC Press, 1997:75-97.
9. NCEP - Recommendations on Lipoprotein Measurement.NIH Publication 95-3044, Bethesda, MD, 1995.
10. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem1981;27:493-501.
11. Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment ofHigh Blood Cholesterol inAdults. JAMA2001;285:2486-97.
12. Leite PF, Martinez TLR, Halpeen A, Cendoroglo MS,Novazzi JP, Fonseca FAH, Dias JCA. Risco cardiovascular:fatores metabólicos e nutricionais: diagnóstico etratamento. São Paulo: Loyola, 1994.p.56.
13. Labtest: Dados de arquivo.
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos, desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.
Telefone: 0800 31-3411 (Ligação gratuita)e-mail: [email protected]
CNPJ: 16.516.296/0001-38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista AlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000www.labtest.com.br
Effects of Drugson Clinical Laboratory Tests
REFERÊNCIAS
APRESENTAÇÃO
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDORTermos e Condições de Garantia
Serviço deApoio ao Cliente
Labtest Diagnóstica S.A.
Catálogo
Reagente 1
87-2/100
2 x 100 mL
1 x 5 mL
87-2/250
2 x 250 mL
1 x 5 mL
87-2/500
2 x 500 mL
1 x 5 mL
87-1/100
1 x 100 mL
1 x 5 mLPadrão
URÉIACECat. 27ANVISA10009010011
FINALIDADE
PRINCÍPIO
CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA
METODOLOGIA
REAGENTES1. Urease -
2. Tampão - Estoque -
3. Oxidante - Estoque -
4. Padrão 70 mg/dL -
PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS
Sistema enzimático-colorimétrico para a determinação dauréia em amostras de sangue e urina, por reação de pontofinal.Somente para uso diagnóstico in vitro.
A uréia é hidrolisada pela urease à íons amônio e CO . Os íonsamônio reagem em pH alcalino com salicilato e hipoclorito desódio, sob a ação catalisadora do nitroprussiato de sódio paraformar azul de indofenol.
A intensidade da cor formada é proporcional à quantidade deuréia na amostra.
O sistema Uréia CE Labtest enzimático-colorimétrico utilizaconcentrações otimizadas de reagentes, principalmente aurease, permitindo operar com cinética de ordem zero até umaconcentração de 300 mg/dL.
Consegue-se obter uma faixa dinâmica bastante extensa,reduzindo-se acentuadamente a repetição de testes emvalores elevados.
O método utiliza a técnica manual e é facilmente aplicável emanalisadores semi-automáticos e automáticos capazes depipetar dois reagentes e medir com exatidão a absorbânciaentre 580 e 620 nm.
Por todas estas razões, a Uréia CE Labtest é o método deescolha quando se deseja utilizar uma metodologiaenzimática-colorimétrica para a determinação da uréia.
Urease-Labtest.
Armazenar entre 2 - 8 oC. Contém tampão fosfato10 mmol/Le urease 268 KU/L.
Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contémtampão fosfato 100 mmol/L, pH 6,9; salicilato de sódio312 mmol/Le nitroprussiato de sódio 16,8 mmol/L.
Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contémhidróxido de sódio 2,8 mol/Le hipoclorito de sódio 121 mmol/L.
Armazenar entre 2 - 8 ºC. Contém azidasódica 7,7 mmol/L.Armazenar bem vedado para evitar evaporação.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Não armazenar os reagentes nas proximidades de soluçõesde amônia.
2
�
Como o volume da amostra é pequeno, deve-se pipetardiretamente no fundo do tubo de ensaio realizando umamedição cuidadosa para minimizar problemas de imprecisão.
Contaminação da água, vidraria e ambiente com amônia podeproduzir resultados falsamente elevados. Deve-se evitar fumarpróximo ao local das dosagens.
Os cuidados habituais de segurança devem ser aplicados namanipulação de reagentes.
O padrão de uréia contém azida sódica que é toxica. Deve-setomar cuidado para evitar a ingestão e no caso de contato comos olhos, deve-se lavar imediatamente com grande quantidadede água e procurar auxílio médico. A azida pode formarcompostos altamente explosivos com tubulações de chumbo ecobre. Portanto, utilizar grandes volumes de água paradescartar o reagente.
Os reagentes não abertos, quando armazenados nascondições indicadas, são estáveis até a data de expiraçãoimpressa no rótulo. Durante o manuseio, os reagentes estãosujeitos à contaminações de natureza química e microbianaque podem provocar redução da estabilidade.
Banho-maria mantido à temperatura constante (37 °C).Fotômetro capaz de medir com exatidão a absorbância entre580 e 620 nm.Pipetas para medir amostras e reagentes.Cronômetro.
Os níveis de uréia no soro ou plasma aumentamconsideravelmente após exercícios físicos e com a idade.
Em mulheres grávidas, os níveis de uréia no soro e na urinadiminuem consideravelmente.
A alimentação aumenta os níveis de uréia no soro ou plasma,principalmente em mulheres.
Para controle terapêutico, é aconselhável colher a amostrasempre no mesmo horário devido a variações circadianas dauréia.
Deve ser criado um procedimento Operacional Padrão (POP)que estabeleça procedimentos adequados para colheita,preparação e armazenamento da amostra. Enfatizamos queos erros devidos à amostra podem ser muito maiores que oserros ocorridos durante o procedimento analítico.
Usar soro ou plasma (fluoreto, oxalato, heparina, EDTA) eurina. Não usar anticoagulantes contendo amônia. Aconcentração de fluoreto na amostra não deve ser maior que3 mg/mL pois o fluoreto em altas concentrações é inibidor daurease.
O uso de anticoagulante Glistab da Labtest (Cat.29) permite acolheita de uma só amostra para as dosagens de uréia, glicosee creatinina.
A uréia é estável no soro ou plasma por 12 horas entre15 - 25 ºC e vários dias entre 2 - 8 ºC. Não utilizar amostras comsinais de contaminação microbiana.
A urina de 24 horas deve ser colhida em frasco contendo2,0 mL de HCI 50% e centrifugada antes de usar. Não utilizarformol como preservativo para a urina.
MATERIAL NECESSÁRIO E NÃO FORNECIDO
INFLUÊNCIAS PRÉ-ANALÍTICAS
AMOSTRA
Instruções de UsoDIAGNÓSTICA
Pagina: 1
Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostrasde sangue não transmitem infecções, todas elas devem serconsideradas como potencialmente infectantes. Portanto, aomanuseá-las deve-se seguir as normas estabelecidas parabiossegurança.
Para descartar os reagentes e o material biológico sugerimosaplicar as normas locais, estaduais ou federais de proteçãoambiental.
Valores de Bilirrubina até 32 mg/dL, Hemoglobina até 80 mg/dLe Triglicérides até 900 mg/dL não produzem interferênciassignificativas.
Valores de Hemoglobina maiores que 80 mg/dL e Triglicéridesmaiores que 900 mg/dL produzem interferências positivas quenão podem ser minimizadas com o uso do branco da amostra.
Para avaliar a concentração aproximada da hemoglobina emuma amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo:Diluir 0,05 mL da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L(0,85%) e medir a absorbância em 405 ou 415 nm acertando ozero com água deionizada ou destilada.
Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 601Hemoglobina(mg/dL) Absorbância x 467
Ver observações 1 e 2.
Adicionar o conteúdo do frasco nº 2 (100 mL) a 400 mL de águadestilada ou deionizada e misturar. Estável 12 meses emfrasco âmbar entre 2 - 8 ºC.
Adicionar o conteúdo do frasco nº 3 (25 mL) a 475 mL de águadestilada ou deionizada e misturar. Estável 12 meses emfrasco plástico entre 2 - 8 ºC.
A água deve ter uma resistividade 1 megaohm ou umacondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos< 0,1 mg/L.
Adicionar 1,0 mL de Urease (nº 1) a 20 mL do Tampão de Uso.Estável 21 dias em frasco de vidro âmbar entre 2 - 8 ºC.
Não armazenar os reagentes nas proximidades de soluçõesde amônia.
Ver Precauções e Cuidados Especiais.
Para a dosagem de uréia na urina, diluir a amostra 1:50 (0,1 mLde urina + 4,9 mL de água destilada ou deionizada). Multiplicaro resultado obtido por 50.
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Misturar e incubar a 37 ºC durante 5 minutos.
INTERFERÊNCIAS
PREPARO DE REAGENTES
Tampão de Uso:
Oxidante de Uso:
Urease Tamponada:
PROCEDIMENTO
�
�
�
�
405
415
Misturar e incubar a 37 ºC durante 5 minutos. Determinar asabsorbâncias do teste e padrão em 600 nm (580 a 620),acertando o zero com o branco.Acor é estável 2 horas.
O procedimento sugerido para a medição é adequado parafotômetros cujo volume mínimo de solução para leitura é igualou menor que 2,0 mL. Deve ser feita uma verificação danecessidade de ajuste do volume para o fotômetro utilizado.Os volumes de amostra e reagente podem ser modificadosproporcionalmente sem prejuízo para o desempenho do testee o procedimento de cálculo se mantém inalterado. Em caso deredução dos volumes é fundamental que se observe o volumemínimo necessário para a leitura fotométrica.
Ver Linearidade.
Absorbância do testemg/dL= x 70
Absorbância do padrão
Absorbância do teste = 0,269Absorbância do padrão = 0,610
0,269Uréia (mg/dL) = x 70 = 31
0,610
Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com ametodologia pode-se utilizar o método do fator.
70Fator de calibração =
Absorbância do padrão
mg/dL=Absorbância do teste x Fator
70Fator = = 114,8
0,610
Uréia (mg/dL) = 0,269 x 114,8 = 31
mg/dLx volume de 24 horas (mL)Urina (mg/24 horas) =
100
O padrão é rastreável ao Standard Reference Material (SRM)912a do National Institute of Standards and Technology (NIST).
Obter semanalmente o fator de calibração.
Branco de reagentes: água ou solução de NaCl 150 mmol/L(0,85%);Padrões: usar calibradores protéicos. As concentrações deUréia no Calibra 1 e Calibra 2 da Labtest são rastreáveis aoSRM 912a do NIST.
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situações:Calibração de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;Calibração de 2 ou 3 pontos quando o controle interno daqualidade indicar.
CÁLCULOS
Exemplo:
Exemplo:
CALIBRAÇÃO
Calibrações Manuais
SistemasAutomáticos
Intervalo de calibrações
�
�
�
�
�
�
DIAGNÓSTICA
Pagina: 2
TESTEBRANCO PADRÃO
Amostra 0,01 mL--- ---
0,01 mL------Padrão (nº 4)
1,0 mL1,0 mL1,0 mLUrease Tamponada
TESTEBRANCO PADRÃO
Oxidante de Uso 1,0 mL1,0 mL 1,0 mL
Reprodutibilidade - Imprecisão total
Sensibilidade metodológica
Efeitos da diluição da matriz
SIGNIFICADO CLÍNICO
OBSERVAÇÕES
Uma amostra protéica não contendo uréia foi utilizada paracalcular o limite de detecção do ensaio tendo sido encontradoum valor igual a 2,03 mg/dL, equivalente à média de 20 ensaiosmais dois desvios padrão. Utilizando-se a absorbância dopadrão como parâmetro, verificou-se que o limite de detecçãofotométrica é de 0,11 mg/dL, correspondendo a umaabsorbância igual a 0,001.
Duas amostras com valores iguais a 74 e 264 mg/dL foramutilizadas para avaliar a resposta do sistema nas diluições damatriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando fatores dediluição que variaram de 2 a 16 foram encontradasrecuperações entre 99 e 108%.
Fisiologicamente a uréia se eleva devido à dieta hiperprotéicaou com a idade, particularmente após 40 anos. Sua diminuiçãoocorre na gravidez normal e nos indivíduos em dietas combaixo valor protéico e alto teor glicídico.
Elevações da uréia ocorrem também por catabolismo elevado(febre, septicemia) e hemorragias internas, principalmente dotrato gastrointestinal.
As elevações da uréia por defeito de excreção se devem àcausas pré-renais (insuficiência cardíaca congestiva), causasrenais (nefrites, pielonefrites e insuficiência renal aguda oucrônica). A uréia começa a se elevar no sangue quando avelocidade de filtração glomerular é menor que 10 mL/minuto.As causas pós-renais são obstruções no trato urinário(cálculos, carcinomas ou pólipos).
Diminuições da uréia não têm expressão clínica e sãoencontradas na soroterapia com carboidratos devido aproblemas de diluição, redução do catabolismo protéico eaumento da diurese.
A dosagem sérica de creatinina é considerada mais específicapara a avaliação da função glomerular, mas pode ser menossensível em algumas doenças renais precoces. A disfunçãorenal é melhor avaliada através das dosagens de uréia ecreatinina associadas.
1. A limpeza e secagem adequadas do material utilizado sãofatores fundamentais para a estabilidade dos reagentes eobtenção de resultados corretos.
2. A água utilizada no laboratório deve ter a qualidadeadequada a cada aplicação. Assim, para preparar reagentes eusar nas medições, deve ter resistividade 1 megaohm oucondutividade 1 microsiemens e concentração de silicatos<0,1 mg/L (água tipo II). Para o enxágüe da vidraria a águapode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms oucondutividade 10 microsiemens. No enxágüe final utilizarágua tipo II. Quando a coluna deionizadora está com suacapacidade saturada ocorre a produção de água alcalina comliberação de vários íons, silicatos e substâncias com grandepoder de oxidação ou redução, que deterioram os reagentesem poucos dias ou mesmo horas alterando os resultados demodo imprevisível. Assim, é fundamental estabelecer umprograma de controle da qualidade da água.
�
�
�
�
LINEARIDADE
CONTROLE INTERNO DAQUALIDADE
VALORES DE REFERÊNCIA
CARACTERÍSTICAS DO DESEMPENHOExatidão
Especificidade
Repetitividade - Imprecisão intra-ensaio
O resultado da medição é linear até 300 mg/dL. Quando aabsorbância do teste for maior que 1,0, diluir o produto coradoe o branco 1:5 com água destilada ou deionizada, fazer novaleitura e multiplicar o resultado obtido por 5. Se após a diluiçãofor obtido um valor igual ou maior que 300 mg/dL, diluir aamostra com NaCl 150 mmol/L (0,85 %), realizar novamedição e multiplicar o resultado obtido pelo fator de diluição.Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se situeentre 50 e 100 mg/dL.
O laboratório deve manter um programa de controle interno daqualidade que defina claramente os objetivos, procedimentos,normas, critérios para limites de tolerância, ações corretivas eregistro das atividades. Ao mesmo tempo deve-se manter umsistema definido para monitorar a variabilidade analítica queocorre em todo o sistema de medição. Portanto, o uso decontroles para avaliar a imprecisão e inexatidão dasdeterminações deve ser prática rotineira do laboratório clínico.Sugere-se usar um controle com um valor situado na faixa dereferência ou no nível de decisão e outro controle com um valorem outra faixa de significância clínica. Deve-se criar uma metade estado de controle para que a variação máxima encontradaseja de 5% ou então utilizar o sistema de regras múltiplas deWestgard para avaliação do estado de controle.
Sugere-se utilizar as preparações estabilizadas Qualitrol 1 eQualitrol 2 da Labtest para controle interno da qualidade emensaios de química clínica.
Estes valores devem ser usados apenas como orientação.Recomenda-se que cada laboratório estabeleça sua própriafaixa de valores de referência na população atendida.
Soro ou plasma: 15 a 40 mg/dL.Urina: 26 a 43 g/24 horas.Conversão: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,166 =Unidades SI (mmol/L).
Em duas amostras com concentrações de uréia iguais a 20 e50 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes do analitoobtendo-se recuperações entre 97 e 100%. O erro sistemáticoproporcional médio obtido em um valor de 60 mg/dL foi igual a0,9 mg/dLou 1,5%.
O método proposto foi comparado com um método similarutilizando 40 amostras com valores situados entre17 e 116 mg/dL. A comparação resultou na equação daregressão: y = 1,147 + 0,973x e um coeficiente de correlação(r) igual a 0,998. O erro sistemático total (constante eproporcional) verificado no nível de decisão (60 mg/dL) foi iguala 0,47 mg/dL ou 0,78%. Como as amostras foramselecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatório epacientes hospitalizados, pode-se inferir que o método temuma especificidade metodológica adequada.
5
6
Pagina: 3
DIAGNÓSTICA
MÉDIAN DP CV%
Amostra 1 20 24 0,30 1,3
Amostra 2 20 60 0,57 0,9
MÉDIAN DP CV%
Amostra 1 20 24 0,12 0,5
Amostra 2 20 60 0,48 0,8
Revisão: Agosto, 1999 Copyright by Labtest Diagnóstica S.A.Ref.: 260104 Reprodução sob prévia autorização
3. Para uma revisão das fontes fisiopatológicas emedicamentosas de interferência nos resultados e nametodologia sugere-se consultar Young DS. Effects of Drugson Clinical Laboratory Tests. 3ª edição, Washington DC: AACCPress, 1990.
1. Bergmeyer HU. Methods of Enzymatic Analisis, Volume 9,pag 449-453, VCH Publishers, Florida, 1985.
2. Bollet WT, Bushman CJ, Tidwell PT. Anal Chem1961;33:592-594.
3. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories.Diagnostic Reagents Division, Ontario, 1970.
4. Weatherburn MW.Anal Chem 1967;39:971-974.
5. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR Clin Chem 1981;27:493-501.
6. Labtest: Dados deArquivo.
REFERÊNCIAS
APRESENTAÇÃO
*O número de testes em aplicações automáticas dependedos parâmetros de programação.
INFORMAÇÕESAO CONSUMIDORTermos e Condições de Garantia
Serviço deApoio ao Cliente
Labtest Diagnóstica S.A.
A Labtest Diagnóstica garante o desempenho deste produtodentro das especificações até a data de expiração indicadanos rótulos, desde que os cuidados de utilização earmazenamento indicados nos rótulos e nestas instruçõessejam seguidos corretamente.
Telefone 0800-31-3411 - Ligação Gratuitae-mail: [email protected]ão disponíveis aplicações para sistemas automáticos.
CGC: 16.516.296 / 0001 - 38Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - VistaAlegreLagoa Santa - Minas Gerais - Brasil - 33400-000Telefone (31) 3681-9288Fax (31) 3681-9344www.labtest.com.br
Pagina: 4
DIAGNÓSTICA
27-500
2,0 mL
1 x 100 mL
500
1 x 25 mL
1 x 25 mL
1 x 3 mL
Catálogo
Nº de testes*
Volume/teste
Urease
Tampão - Estoque
Oxidante - Estoque
Padrão