Uso de levaduras industriales
Agosto 24, 2010
Dr. Luis C. Damas BuenrostroGCM
Descripción de Levaduras
• Las levaduras son hongos cuya forma usualy dominante es unicelular. Hayaproximadamente 50 géneros con más deaproximadamente 50 géneros con más de500 especies descritas. Existen normalmenteen la naturaleza en vegetales, animales,insectos y el suelo. Con pocas excepciones(algunos géneros de la familiaCryptococcaceae como Candida,Cryptococcus, Pityrsosporum) rara vezproducen enfermedades.
Gema
Mitocondrias
Membrana
Vacuola
Célula madre
Mitocondrias
Pared celular
Cicatriz
Estructura fina de una célula de levadura
Saccharomyces cerevisiae
FASES DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA–
Núm
ero
de C
élul
as
60 – 80 mill/ml
Rep
rodu
cció
n de
la le
vadu
ra
–
Fase Lag Fase de Crecimiento Fase Estacionaria Fase de Muerte o Sedimentación
19 – 23 mill/ml
0.5 – 10 mill/ml
Levaduras IndustrialesLevadura Tipo de
levaduraUso industrial
Saccharomyces cerevisiae Ascomiceto Panificación, elaboración de bebidas fermentadas (vino,cerveza, licores, sake, etc.). Producción de etanol.Elaboración de complementos nutricionales, saborizantes,vitaminas, extractos, etc.
Candida utilis Ascomiceto Proteina unicelular, producción de alcohol.
Saccharomycopsis fibuligera Ascomiceto Proteinaunicelular,glucoamilasa,bioquimicos,alcoholSaccharomycopsis fibuligera Ascomiceto Proteinaunicelular,glucoamilasa,bioquimicos,alcohol
Yarrowia lipolytica Ascomiceto Proteina unicelular, lipasa, bioquimicos
Candida milleri Ascomiceto Pan acido (sourdough)
Kluyveromyces marxianus Ascomiceto Proteina unicelular, alcohol
Phaffia rhodozyma
Brettanomyces sp.
Basidiomiceto
Deuteromiceto
Proteina unicelular para acuacultura
Fermentación cervezas “lámbicas”
Ventajas tecnológicas de Saccharomyces cerevisiae1. Tolerancia a concentraciones elevadas de etanol (hasta 18%
vs 1-4 % otras levaduras)2. Poder acidificante y tolerancia a bajos pH (3 – 4) con la
consecuente supresión de patógenos3. Inocuidad comprobada en más de 8,000 años de uso (status
GRAS)3. Inocuidad comprobada en más de 8,000 años de uso (status
GRAS)4. Separación espontánea natural del producto (floculación) o
fácilmente filtrables o sedimentables5. Alta productividad, tanto en condiciones aerobicas (hasta 0.54
g de biomasa por gramo de glucosa) como anaerobica (hasta0.48 g de etanol por gramo de glucosa)
6. Posibilidad de manipulación genética7. Estabilidad genética8. Velocidad de generación aceptablemente rápida (1-2 hrs)
Usos Industriales de S. cerevisiae� Dirigidos a la producción de biomasa• Producción de levadura para panadería• Aditivos alimenticios agrícolas• Complementos nutricionales• Extracto de levadura para Microbiología• Extracto de levadura para Microbiología• Suministro de levadura para uso industrial
� Dirigidos a los productos de fermentación• Elaboración de vino• Elaboración de licores• Producción de alcohol industrial • Elaboración de cerveza
Variedades de uso industrial de Saccharomyces cerevisiae• Saccharomyces cerevisiae var.
cerevisiae: levadura de las fermentaciones“ale”, destilerías, panadería, vinatería,alcohol industrial, productos nutricionales.alcohol industrial, productos nutricionales.
• S. cerevisiae var. uvarum(carlsbergensis): levadura de lasfermentaciones “lager”.
• S. cerevisiae var. bayanus: levadura devinos
• S. cerevisiae var. fermentati (“flor”) :producción de jerez
Tipos de LevadurasS. cerevisiae var. uvarum S. cerevisiae var. cerevisiae
Levadura
Células muertas
• Reacción reducción azul de metileno:
N
S N(CH )(CH ) N+
Oxidado=Azul
S N(CH3)2(CH3)2 N
NADH
N
S N(CH3)2(CH3)2 N
H Reducido=Incoloro
Viabilidad por fluorescencia
Acidos Orgánicos
Acetaldehido
Alcoholes
H2S y SO2
Glucosa
Piruvato
Acetil-CoA
Ac. Graso-CoA
Sulfato
Aminoácidos
Aminoácidos
Resumen de la producción de compuestosen Fermentación
Etanol
Alcoholessuperiores
Esteres
DiacetiloVDKs
AcidosGrasos
CoA
Grasas
Metabolismo de la levadura: producción del sabor
Etanol
60
70
80
90
100
Cél
ulas
sus
pend
idas
X10
6 /mL
10
12
14
16
Células Suspendidas
Extracto
No Floculante
Curva de Fermentación
0
10
20
30
40
50
0 1 2 3 4 5 6 7
Días
Cél
ulas
sus
pend
idas
X10
0
2
4
6
8
Floculante
Etanol
Mecanismo Molecularde la FloculaciónFloculación
Saccharomyces cerevisiae
�Contiene 16 cromosomas de 200 a 2200 Kb.
� 6183 marcos de lectura abiertos �5800 corresponden a genes que
codificaban para proteínas. codificaban para proteínas. �Tamaño promedio de los genes es
de 1.45 kb, o 483 codones
Expresión Global
Genoma
Transcriptoma
Proteoma
1 2 3 4 5 6 7 8
Figure 1. PCR products of FLO genes from S. diastaticus strain. Lanes: 1, 100-1000 bp ladder; 2, Lg-FLO (312 bp); 3, FLO5 (423 bp); 4, FLO9 (347 bp); 5, FLO8 (920 bp); 6, FLO10 (270 bp); 7, FLO11 (749 bp); 8, FLO1 (596 bp)
Strain FLO1 FLO5 FLO8 FLO9 FLO10 FLO11 Lg-FLO # FLO Genes
Flocculation (mL)
Baker's + + - - - + - 3 0.0 Lager 790 + - + - - + + 4 2.5 Lager BRY - - + - + + + 4 3.8 Lager J-2036 - - + + + + + 5 3.6 Lager J-2036 - - + + + + + 5 3.6 Lager 820 + - + - + + + 5 4.5 Lager KJ8 - - + + + + + 5 5.5 Lager LAW + - + + + + + 6 5.0 S. diastaticus - + + + + + w 6 NA S. pastorianus + + + - - + - 4 NA S. willianus - + + + + + - 5 NA
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
2 3 4 5 6 7Number of FLO genes
Flo
ccul
atio
n (m
L, H
elm
Tes
t)
R2 = 0.75
Baker's
790
BRY
J-2036
820
KJ8 LAW
Mar
cado
r
Mar
cado
r
C F
R1*
*C
FR
2C
FR
3C
FR
4
C F
R5
C F
R6
MF
R1*
*M
FR
2
MF
R3
MF
R4
MF
R5
MF
R6
Ctr
l(-)
F
R1*
*C
trl(
-) F
R2
Ctr
l(-)
FR
3C
trl(
-) F
R4
Ctr
l(-)
FR
5C
trl(
-) F
R6
992
992
966 966
1005
1005
998 998
1017
1017
1002
**NOTA: FR1 descartado
1.5% Agarose
Detección de mutaciones por HRM
Levadura
Extracción
DNA RT
qPCR
CPCPHRMHRM
Microarreglos
Análisis de microarreglos
FLO 5
FLO 11FLO 11
FLO 1
Herramientas de análisis de microarreglos
-Spot finder: conversión de imagenes .tiff a valores numericos de intensidad (medido por pixeles).
-GenArise: Determinación de valor Z para detección de genes con represión/inducción relevante
-FatiGo: Determinación, mediante ontología, de posibles funciones de los genes seleccionados como relevantes por microarrays.de los genes seleccionados como relevantes por microarrays.
Expresión global de genes. Análisis Ontológico Base de datos Saccharomyces Genome Database
DISEÑO EXPERIMENTAL
2.- Extracción de RNA
1.- Diseñar diferentes condiciones de
fermentación
3.- Análisis de microarreglos
Genes regulatorios relacionados a floculación
Nombre común Descripción Procesos biológicos Expresión
CLB1 Ciclina B, específica para G2/M Ciclo celular InducidaCLB2 Ciclina B, específica para G2/M Ciclo celular InducidaSWE1 Cinasa de especificidad dual, inhibe Cdc28p Ciclo celular ReprimidaBCK2 Supresor de mutaciones de PKC1, su sobreexpresión estimula
transcripción de ciclina BEstrés osmótico Inducida
MSN1 Activador transcripcional involucrado en regulación de expresión invertasa y glucoamilasa, crecimiento invasivo y diferenciación pseudohifal (FLO11) y respuesta a estrés osmótico. Via MAPK
Estrés osmótico Inducida
PKC1 Protein cinasa C, con actividad choque hipotónico. Via MAPK Estrés osmótico Reprimida
PTC2 Fosfoprotein fosfatasa tipo 2C, defosforila Hog1p y Cdc28p. Inactiva vía MAPK al finalizar estrés osmótico
Estrés osmótico InducidaInactiva vía MAPK al finalizar estrés osmótico
RGD2 GTPasa proteina activadora para Cdc42p y Rho5p. Via PKC1/MAPK
Estrés osmótico Inducida
SLG1/WSC1 Sensor requirido para integridad de pared celular y respuesta a estrés hipoosmótico, via señalización Ras, PKC1/ MAPK
Estrés osmótico Inducida
STE20 Protein cinasa de la vía MAPK participa en respuesta a feromonas, choque osmotico, y falta de nutrientes
Estrés osmótico Reprimida
HIR1 Regulador de transcripción de histonas, correpresor Factores de transcripción ReprimidaSNF12 Componente SWI/SNF activador global de transcripción,
respuesta a estrésFactores de transcripción Reprimida
ESC1 Establece silenciamiento de cromatina en telómeros uniendose a Sir4p
Silenciamiento de genes Inducida
ESC4 Establece silenciamiento de cromatina, regula transposición Silenciamiento de genes Inducida
HHF1 Histona H4. Interactua con Sir4p para silenciamiento de telomeros
Silenciamiento de genes Inducida
HHF2 Histona H4. Interactua con Sir4p para silenciamiento de telomeros
Silenciamiento de genes Inducida
HHT2 Histona H3. Interactua con Sir4p para silenciamiento de telomeros
Silenciamiento de genes Inducida
HTZ1 Variante de histona H2AZ. Regula extensión de silenciamiento Silenciamiento de genes Inducida
TAF60 Factor transcripcional TFIID y subunidad SAGA, similar a histona H4
Silenciamiento de genes Inducida
Estrés osmótico
LgFLO1pSLG1
CDC28 (1.13) SNF12 MSN1
Eliminación de estrés osmótico
PTC2
SLN1 (1.02)
IRE1 (1.0)
Alta concentración de nutrientes
CLB1,2
SWE1
MOSTO
Lg-FLO1
ESC1 ESC4TAF60 HTZ1HHF1 HHF2
HHT1
Lg-FLO1 RNAm
BCK2RGD2
PSA1MNN1GMH1END3OCH1GUK1
CDC28 (1.13)
HOR2RHR2
PKC1
Remodelaciónpared celular
SNF12 MSN1
Síntesis de glicerol
Chaperonas
SIR4 (1.24)
Silenciamientode genes
Subtelomericos
Divisióncelular
SWE1
HIR1
5'-adenylyl sulfate
3 phospho 5 adenylyl sulfate (PAPS)
Met14APS KINASE
SO32-
NADPH
PAP + NADP+
Met16PAPS REDUCTASE
3 NADPH
3 NADP+
Met5 Met10Sulfite reductase
S2-
Met3
ATP
sulfurylase
SO42-
ATP
PPi
adenosine
MUP3
Low affinity
Methionine
permease
DNACbf1
Met28 Me31 Met32Met4
S2-
Sulfuro
Met25Homocysteine synthase
O-acetyl homoserine
Met2
Homoserine trans-acetylase
HomoserineAspartate
Met6
Homocysteine
metyl-transferase
CH3
Met13
Methionine
S-AdenosylMethionine
(AdoMet)
ATP
PPi + PiMHT1
S-Adenosyl
Homocysteine
CH3
adenosine
820
790
Acetohidroxiacido reductoisomerasa
Glicolisis
Piruvato
ILV6
2-acetolactato
L-valina
ILV5
2,3 – Dihidroxi-isovalerato
ILV3
2- cetoisovaleratoBAT1
Acetaldehido
PDC1
ILV2
BAT 2
PDC5
PDC6
Piruvato Descarboxilasa
Acetolactato sintetasa
Dihidroxyacido dehidratasa
Alcohol etílico
ADH1
Acetato de etilo
ADH4
ADH2 ADH3
ADH5 ATF2
Alcohol deshidrogenasa
Acetil transferasa
SFA1
ATF1
790820
BAT1 BAT 2
LEU9
L-valina2- cetoisovaleratoBAT1
L-Leucine 2- cetoisocaproato
2- isopropilmalato
LEU 1 3- isopropilmalato
LEU 2
BAT 2
LEU4
AminotransferasaAlfa-isopropilmalato
sintetasa
Isopropilmalato isomerasa.
Beta-IPM-dehidrogenasa
ARO10
THI33 metyl butanol Alcohol isoamilico
Acetato de
isoamilo
ADH4
ADH2 ADH3
ADH5
ADH1
ATF2ATF1
DescarboxilasaSFA1
820
CoenzymeA
Acetyl- CoA
FLO Cepa
1 5 8 9 10 11 Lg
#Genes FLO
Flocula- ción(mL)
Bmax (fmol/cel) Kd
820 + - + - + + + 5 4.5 0.06445 1.337 790 + - + - - + + 4 2.5 0.04259 7.262 7754 + + - - - + - 3 0 0.001178 0.6071
820 = 38.82 millones sitios / cel790 = 25.65 millones sitios / cel7754 = 0.71 millones sitios / cel