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La possibilita’ di conoscere i genideriva dalla capacita’di manipolarli:
-isolare un gene (enzimi di restrizione)
-clonaggio (amplificazione) vettori
-sequenziamento
-funzione
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Il gene o la sequenza genica isolata deve
essere inserita all’interno di un vettore chepermette l’amplificazione (aumento delnumero di copie) della sequenza stessa, inmodo che il gene diventi manipolabile
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COSTRUZIONE DI VETTORI DI
CLONAGGIO
- Plasmidi (fino a 10kb)
- Vettori fagici (fino a 15 Kb)- Vettori cosmidici (fino a 45 Kb)
- BAC (basati sul fattore F di E.Coli, insertofino a 300 Kb)
- PAC (basati sul genoma fagico P1, fino a
120 Kb)- YAC cromosomi artificiali di lievito (inserto
fino a 2 Mb)
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Proprieta’ di un vettore di clonaggio
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Vettore d’espressione
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Vettori
fagicie cosmidi
Alta afficienzadi infezione e quindidi trasferimento delgene clonato
all’internodella cellula batterica
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YAC, cromosomi artificiali di lievito o minicromosomi,
inseriti nelle cellule attraverso microiniezione o liposomi,ospitano fino a500 Kb di DNA
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BACcromosomibatterici
artificiali
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Genotecao libreriagenomica
-amplificare frammentio geni
-identificare geni
-determinare nuovi geni-contiene geni nellaloro forma nativa consequenze regolative ed
introni-ogni vettore porta unpezzo del genoma, etutti i vettori insieme
rappresentano tutto ilgenoma
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Genoteca di c-DNA:genoteca di sequenze
espresse
-ogni vettore portaun c-DNA, quindiun trascritto genico,
e tutti i vettoriinsiemerappresentano tuttoil trascrittoma
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Caso 1. Si conosce la funzione del gene ma non
la sequenza genica ne’ la proteina
IDENTIFICAZIONE DEI CLONI PERCOMPLEMENTAZIONE
La complementazione funzionale è ilprocesso mediante il quale una particolaresequenza di DNA è in grado di compensare
la mancanza di una funzione in una cellulamutante, ripristinando così il fenotipoWild-type.
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Yeast to human: rescue
CDK=chinasi
ciclinadipendente
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Poiche’ conosco le sequenze a monte e a valle del pezzo digenoma clonato, mi posso costruire dei primers che
permettono di amplificre e sequenziare l’inserto
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Caso 2: se e’ nota la sequenza delgene posso costruire una sonda diDNA / RNA che andra’ ad ibridare con
la sequenza genica
Caso 3: non conosco la sequenzagenica ma conosco la sequenzaaminoacidica anche qui
costruisco una sonda a DNA/RNA,tenendo conto della degenerazione del
codice genetico
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SAGGI DI IBRIDAZIONESTANDARD E SAGGI INVERSI
• STANDARDCOLONY-BLOT
SOUTHERN BLOT
NORTHERN BLOTIBRIDAZIONE IN SITU SU TESSUTO O CROMOSOMI
• INVERSI (MARCATURA DEL TARGET)MICROARRAY DI DNA
MICROARRAY DI OLIGONUCLEOTIDI
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L’IMPIEGO DI SONDE BASATE SU ACIDI NUCLEICI E’
UNO STRUMENTO FONDAMENTALE PER LA GENETICAMOLECOLARE
SI SFRUTTA LA CAPACITA’ DELLE MOLECOLE DIACIDO NUCLEICO A SINGOLO FILAMENTO DI
FORMARE MOLECOLE A DOPPIO FILAMENTO
IBRIDAZIONE
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I SAGGI PIU’ COMUNI DI IBRIDAZIONE PREVEDONO L’USO DISONDE
SONDE:MOLECOLE DI ACIDO NUCLEICO A SINGOLO O DOPPIOFILAMENTO MARCATE
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sequenza di DNA genomico o di c-DNA
Sonda (probe) marcata di 15-100 nt
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- PER INDIVIDUARE LA PRESENZA DEL GENE CHE SI STA
CERCANDO
- PER OSSERVARE LA PRESENZA DI UN TRANSGENE INSERITO NEI
CROMOSOMI (PRESENZA O ASSENZA)
- PER OSSERVARE TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE
- PER OSSERVARE LE DIMENSIONI DEL TARGET (NON OSSERVABILI
CON ALTRE TECNICHE)
- PER OSSERVARE LA COLLOCAZIONE SUBCROMOSOMICA O NEL
TESSUTO O NELLA CELLULA DEL TARGET
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COLONY-BLOT
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Chromosome walkingIl risultato dello screening di una libreria di cDNA ma,
specialmente di una libreria genomica è quasi sempre
un clone che non comprende l’intero gene. Per isolare ilgene intero si utilizza una tecnica chiamata chromosomewalking. Questa tecnica presuppone che la libreria siaformata da cloni parzialmente sovrapposti tra loro. Latecnica consiste nell’utilizzare il cDNA isolato comesonda con cui si sonda una nuova libreria (di solitogenomica) Il risultato di questo screening dovrebbe daredei nuovi cloni una parte dei quali si estenderàulteriormente verso il 5’, il 3’ o entrambe le direzioni. I
cloni più esterni saranno nuovamente utilizzati comesonde per isolare nuovi cloni che si estendono al 5’ o al3’ ecosì via fino ad isolare l’intero gene.
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La reazione di amplificazione del
DNA o PCR