Transcript
Page 1: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

MỤC LỤC

Bài 1. Phương pháp pha chế môi trường nuôi cấy mô thực vật...............................................2

Bài 2. Phương pháp khử trùng mô thực vật.............................................................................8

Bài 3. Khử trùng nuôi cấy chồi ngủ cúc và hạt cam..............................................................12

Bài 4. Vi nhân giống dứa bằng nuôi cấy chồi ngủ.................................................................15

Bài 5. Phương pháp nuôi cấy tạo mô sẹo ở thực vật..............................................................20

Bài 6. Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo.......................................................................25

Bài 7. Phương pháp tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.........................................................30

Bài 8. Phương pháp vi ghép ở thực vật..................................................................................34

Bài 9. Phương pháp thuần hoá cây ra vườn ươm...................................................................38

TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................42

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 1

Page 2: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBÀI I

PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

1 - NGUYÊN TẮC

1.1 - Nguyên tắc pha chế môi trường

Môi trường nuôi cấy mô thực vật khác với các loại môi trường nuôi cấy vi sinh là có thành phần rất phức tạp, sự hiện diện của rất nhiều loại hoá chất với hàm lượng rất nhỏ. Do vậy, để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc), người ta không cân hoá chất mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng nhiều loại dung dịch với độ đậm đặc từ X10 – X100, chỉ cần pha với nước cất hai lần hay nước vô khoáng khi sử dụng. Các dung dịch này gọi là dung dịch mẹ (stock). Dung dịch mẹ được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu. Thông thường pha các dung dịch mẹ: stock đa lượng, stock vi lượng, Fe – EDTA, stock vitamin, stock chất sinh trưởng, và các stock cần thiết khác.

1.2 - Phân loại môi trường nuôi cấy mô thực vật

Tùy theo thành phần các chất có trong môi trường, có thể phân thành 3 loại môi trường:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: như môi trường White, Knop. Môi trường này thích hợp vào các giai đoạn cuối của quy trình nuôi cấy mô thực vật khi chuẩn bị chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm. Môi trường nghèo chất dinh dưỡng cũng có thể sử dụng trong các sinh trắc nghiệm để kiểm tra đặc tính biến dưỡng của mô thực vật.

- Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: môi trường B5, Gamborg. Loại môi trường này được sử dụng đối với một số loại cây có nhu cầu các chất dinh dưỡng trong môi trường vừa phải hoặc cũng có thể sử dụng khi nuôi cấy mô thực vật dài ngày.

- Môi trường giàu chất dinh dường: môi trường MS (Murashige – Skoog). Đây là môi trường khởi đầu cho mọi quá trình nuôi cấy mô đối với mọi đối tượng nuôi cấy. Môi trường MS là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây, do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng.

2 - NGUYÊN LIỆU - HOÁ CHẤT - DỤNG CỤ

2.1 - Hoá chất

- Saccharose (sucrose)

- Agar

- NH4NO3

- KNO3

- MgSO4.7H2O

- KH2PO4

- CaCl2.5H2O

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 2

Page 3: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn- KI

- Na2MoO4.2H2O

- CoCl2.6H2O

- H3PO3

- MnSO4.4H2O

- ZnSO4.7H2O

- CuSO4.5H2O

- Thiamine HCl

- Myo-inositol

- Glycine

- NAA

- BA (6-Benzyl aminopurin)

- Na2-Ethylen diamin tetraacetat (Na2 EDTA

-Fe2(SO4)3

2.2 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bịĐơn vị

tínhSố

lượngGhi chú

1 - Bình định mức: 100 ml cái 10

2 - Bình định mức: 500 ml cái 3

3 - Ống đong: 100 ml cái 12

4 - Ống đong 500 ml cái 3

5 - Đũa khuấy cái 15

6 - Bình màu 200 ml cái 5

7 - Quả bóp cao su cái 15

8 - Bể ổn nhiệt cái 1 Dùng để pha Fe-EDTA

9 - Cốc 100 ml cái 30

10 - Cốc 200 ml cái 15

11 - Pipett: 1 ml cái 15

12 - Pipett: 5 ml cái 15

13 - Pipett: 10 ml cái 15

14 - Bình định mức 250 ml cái 15

15 - Ống nghiệm Þ 25 ống 100

16 - Bông mỡ g 200

17 - Bình màu: 1000 ml cái 2 Bảo quản các stock

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 3

Page 4: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

Học sinh chia nhóm thực hành pha chế các dung dịch mẹ (stock) của môi trường MS (Murashige – Skoog) như sau: dung dịch mẹ khoáng đa lượng (Skoog I), dung dịch mẹ Fe – EDTA (Skoog II), dung dịch mẹ khoáng vi lượng (Skoog III), dung dịch mẹ chất điều hoà sinh trưởng

4 - THỰC HÀNH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH MẸ (Stock) MÔI TRƯỜNG MS (Murashige – Skoog)

4.1. Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lần (x20)

Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khoáng đa lượng. Dùng ống đong, đong khoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lượt các muối đa lượng vào theo trình tự nhất định sau:

Tên hoá chấtNồng độ môi trường

nuôi cấy (mg/lít)Nồng độ dung dịch stock (x20) (mg/lít)

- MgSO4.7H2O 370 7.400

- KH2PO4 170 3.400

- KNO3 1.900 38.000- NH4NO3 1.650 33.000- CaCl2.2H2O 440 8.800

Mỗi lần cho một loại khoáng vào phải khuấy tan hoàn toàn và bổ sung thêm 100 ml nước cất hai lần trước khi bổ sung các khoáng khác vào (phương pháp pha thể tích tăng dần). Do CaCl2.2H2O có thể phản ứng tạo kết tủa với MgSO4.7H2O nên hai chất này phải pha tách rời nhau theo đúng trình tự ở trên, cho CaCl2.2H2O vào sau cùng.

Cho tất cả vào bình định, dùng nước cất hai lần chuẩn lại cho đúng 1000 ml. Như vậy ta có 1000 ml dung dịch mẹ khoáng đa lượng đậm đặc 20 lần. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 50 ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy.

4.2. Pha stock khoáng vi lượng nồng độ đậm đặc 1000 lần (x1000)

Do hàm lượng một số loại khoáng vi lượng trong stock khoáng vi lượng rất nhỏ, khó có thể cân đong chính xác như một số các khoáng vi lượng khác. Vì vậy ở đây, ta phải tiến hành pha riêng dung dịch các khoáng này (CuSO4.5H2O, CoCl2.6H2O) có nồng độ đậm đặc hơn 100 lần so với dung dịch mẹ và gọi là dung dịch “bà ngoại”.

Sau khi pha song các dung dịch “bà ngoại”, tiến hành pha 100 ml stock khoáng vi lượng X1000 tương tự như ở phần trên. Thành phần các khoáng như sau:

Tên hoá chấtNồng độ môi

trường nuôi cấy (mg/lít)

Nồng độ dung dịch stock (x1000)

(mg/lít)

Nồng độ dung dịch “bà ngoại “(x100)

(mg/lít)H3PO3 6,2 6200MnSO4.4H2O 22,3 22300

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 4

Page 5: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnZnSO4.4H2O 8,6 8600Na2MoO4.2H2O 0,25 250KI 0,83 830CuSO4.5H2O 0,025 25 2500CoCl2.6H2O 0,025 25 2500

4.3. Pha dung dịch mẹ Fe-EDTA nồng độ đậm đặc 200 lần (x200)

Sắt là yếu tố rất cần thiết cho thực vật. Tuy nhiên, nhu cầu của thực vật đối với sắt rất nhỏ và lượng liên tục. Vì vậy, để cung cấp đủ lượng sắt cho thực vật ta thường dùng sắt dưới dạng hợp chất Fe-DETA. Hợp chất Fe-EDTA được hình thành do sự ngậm Fe của EDTA dưới tác dụng của nhiệt độ. Ở dưới dạng hợp chất này, sắt sẽ được phóng thích ra môi trường tuỳ theo nhu cầu của thực vật. Phương pháp pha như sau:

Tên hoá chấtNồng độ môi trường

nuôi cấy (mg/lít)Nồng độ dung dịch stock

(x200) (mg/lít)FeSO4.7H2O 27,8 5560

Na2 EDTA 37,3 7460

Chuẩn bị hai becher 500 và 1000 ml. Cho vào mỗi becher 400 ml nước cất hai lần. Đun nóng hai becher trong bể ổn nhiệt khoảng 80oC. Cân chính xác 5,56 g FeSO4.7H2O cho vào becher 500 ml có 400 ml nước trên, khuấy tan hoàn toàn. Cân chính xác 7,46 g Na2 EDTA cho vào becher 1000 ml trên, khuấy tan hoàn toàn.

Cho từ từ dung dịch FeSO4.7H2O vào dung dịch Na2 EDTA, vừa đổ vừa khuấy đều. Cuối cùng bổ sung nước cho đủ 1000 ml. Như vậy, ta có 1000 ml dung dịch stock Fe-EDTA đậm đặc 200 lần có màu vàng nhạt, trong suốt. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ 4 ÷ 10oC, dùng 5ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy.

4.4. Pha stock hormon

Các hormon khác nhau sẽ tan trong các dung môi khác nhau. IAA, NAA, BA pha trong NaOH 1N (thêm 2-3 ml NaOH 1N và lắc cho đến khi tan hết, sau đó thêm nước đến thể tích cần). GA3, 2,4-D pha trong cồn 50o cho đủ thể tích.

Để pha các chất sinh trưởng, có hai cách khác nhau:+ Cách 1: pha theo hệ mol

Ví dụ: Pha 100 ml dung dịch stock IAA (M=176,19) có nồng độ 1 mmol (milimol) từ IAA tinh khiết.

176,19 g IAA pha trong 1000 ml nước 1000 ml dung dịch có nồng độ 1 mol/lít. Để pha dung dịch có nồng độ 1 mmol/lít cần 0,17619 g IAA. Như vậy, muốn có 100 ml dung dịch IAA nồng độ 1 mmol/lít cần 0,017619 g IAA. (MNAA: 186,2; M2,4-D: 221,04; MBA: 225,2)

+ Cách 2: pha theo hệ mg/lít: làm tương tự như cách pha khoáng.Các dung dịch stock hormon sau khi pha song được bảo quản trong các

chai màu ở nhiệt độ lạnh 4-10oC.

4.5. Pha stock vitamin môi trường MS nồng độ đậm đặc 500 lần (x500)

Dùng ống đong, đong 50 ml nước cất hai lần vào một becher 100 ml. Bổ sung các vitamin vào theo trình tự sau:

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 5

Page 6: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Tên hoá chấtNồng độ môi trường

nuôi cấy (mg/lít)Nồng độ dung dịch stock

(x500) (mg/lít) Acid nicotinic 0,5 250

Thiamin HCl 0,1 50

Pyridoxin HCl 0,5 250Myo-inositol 100 50.000Glycine 2 1.000

Cho tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất bổ sung cho đủ 100 ml. Như vậy, ta có 100 ml stock vitamin MS x500. Dung dịch này được bảo quả để dùng dần trong chai màu ở nhiệt độ dưới 0oC, dùng 2ml cho một 1000 ml môi trường nuôi cấy.

4.6. Pha môi trường làm việc (môi trường nuôi cấy)

Pha 1 lít môi trường MS cơ bản:- Dùng ống đong, đong 500 ml nước cất hai lần vào becher.- Bổ sung 30 g đường sucrose vào, khuấy tan hoàn toàn- Bổ sung 50 ml dung dịch stock đa lượng x20, khuấy đều.- Bổ sung 1 ml dung dịch stock vi lượng x1000, khuấy đều.- Bổ sung 5 ml dung dịch stock Fe-EDTA x200, khuấy đều.- Bổ sung 2 ml dung dịch stock vitamin x500.- Bổ sung stock hormon với lượng tùy mục đích nuôi cấy.- Chuyển tất cả dung dịch vào bình định mức, dùng nước cất chuẩn lại cho đủ

1000 ml- Chỉnh pH của dung dịch bằng NaOH 1N hay HCl 1N về pH=5,8.- Bổ sung 6-8 g agar.- Đun sôi cho tan agar, quấy đều. Chia hỗn hợp môi trường vào các bình nuôi

cấy, cần chia xong trước khi dung dịch môi trường MS nguội xuống 50oC. Hấp khử trùng (đối với các thành phần bị biến tính ở nhiệt độ cao sẽ được lọc vô trùng và bổ sung vào môi trường sau khi hấp). Môi trường sau khi hấp được bảo quản ở 25oC.5 - BÁO CÁO THỰC HÀNH

1. Trình bày cách pha Skoog I, Skoog II và Skoog III.

2. Quan sát hiện tượng phản ứng khi pha stock Fe-EDTA. Giải thích.

3. Từ BA tinh khiết, trình bày cách pha 100 ml stock BA có nồng độ 100 mol/lít. Biết MBA =225,2.

4. Cần bao nhiêu ml dung dịch stock IAA có nồng độ 150 mol/lít để pha môi trường làm việc có nồng độ IAA là 0,1 mol/lít.

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 6

Page 7: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBÀI 2

PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG MÔ THỰC VẬT1 - NGUYÊN TẮC

Một thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật khác với một thí nghiệm nuôi cấy vi sinh thường tiến hành trong một thời gian rất lâu dài. Với một thí nghiệm trường diễn như thế, chỉ cần một tế bào vi khuẩn, một bào tử nấm mốc rơi vào môi trường nuôi cấy, sau một thời gian ngắn sẽ sinh sôi làm hỏng môi trường, làm hỏng thí nghiệm và phải tiến hành làm lại từ đầu. Do đó việc vô trùng tức loại bỏ hết nấm khuẩn trong nuôi cấy mô thực vật vô cùng quan trọng.

Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ… tùy theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự nhiên vào môi trường nuôi cấy in vitro, mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để loại bỏ hết các mầm vi sinh vật. Tuy nhiên quá trình này phải đảm bảo là mô thực vật còn sống, có khả năng tăng trưởng, phát triển tốt.

Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta lắc mô cấy với cồn 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn.

Bảng 1. Một số tác nhân khử trùng dùng cho thực vật

Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả

Canxi hypoclorid 9 – 10 5 – 30 Rất tốt

Natri hypoclorid 2 5 – 30 Rất tốt

Hydro peroxid 10 – 12 5 – 15 Tốt

Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt

HgCl2 0,1 – 1 2 – 10 Trung bình

Chất kháng sinh 4 – 50 30 – 60 Khá tốt

Trong thời gian xử lý, mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý song, mô cấy được rửa nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần trên mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trứơc khi đặt mô cấy lên mô trường. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên chú ý để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bóc đi trước khi đặt mô cấy lên môi trường.

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 7

Page 8: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnNhư vậy, để có thể đạt được mục đích khử trùng (loại bỏ hết mầm vi sinh vật, mô

thực vật có thể tăng trưởng, phát triển), thì việc khử trùng là phải tìm ra được ba yếu tố liên quan chặt chẽ với nhau và liên quan tới mô thực vật đem khử trùng đó là:

- Chất khử trùng

- Nồng độ chất khử trùng

- Thời gian khử trùng.

Vô trùng mẫu là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy vậy, nếu kiên trì tìm nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả.

2 - VẬT LIỆU - HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ

2.1 - Vật liệu

- Cây Trầu bà

- Hạt thuốc lá

2.2 - Hoá chất

- Xà phòng bột

- Cồn 70o, 90o

- Javel

- Ca(OCl)2 (Caxi hypoclorid)

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bịĐơn vị

tínhSố

lượngGhi chú

1 - Dao mổ cái 15

2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn

3 - Ống đong: 100 ml cái 12

4 - Ống đong 500 ml cái 3

5 - Đũa khuấy cái 15

6 - Cốc 500 ml cái 15

7 - Quả bóp cao su cái 15

8 - Cốc 1000 ml cái 5

9 - Cốc 100 ml cái 30

10 - Cốc 200 ml cái 15

11 - Pipett: 1 ml cái 5

12 - Pipett: 5 ml cái 5

13 - Pipett: 10 ml cái 5

14 - Erlen 250ml cái 60

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 8

Page 9: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnSTT Tên dụng cụ, thiết bị

Đơn vị tính

Số lượng

Ghi chú

15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15

16 - Bông mỡ g 200

17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15

18 - Tủ cấy vô trùng cái 1Tủ cấy có quạt thổi vô

trùng

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

Học sinh thực hành khử trùng đốt thân cây Trầu bà, hạt thuốc lá. Sau khi vô trùng tiến hành gieo hạt thuốc lá, cấy đốt thân cây Trầu bà lên môi trường MS.

4 - THỰC HÀNH

4.1 - Khử trùng cây Trầu bà

a. Thực hiện trong phòng thí nghiệm

- Cây Trầu bà được cắt thành những đoạn nhỏ 30cm. Rửa các đoạn này dưới vòi nước máy cho sạch bụi đất.

- Cắt thành những đoạn Trầu bà này thành những đốt khoảng 3cm, mỗi đốt mang một chồi ngủ. Cắt bỏ lá, rễ.

- Rửa các đốt với nước có pha một ít xà phòng trong các erlen.

- Rửa lại bằng nước máy nhiều lần cho sạch xà phòng.

b. Thực hiện trong tủ cấy

- Lắc các đốt thân với cồn 70o trong 1 phút

- Chiết bỏ cồn. Ngâm các mẫu trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 10 phút (hay dung dịch javel được pha loãng với tỷ lệ 1:9 trong 5 phút).

- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần

- Gạn bỏ nước.

4.2 - Khử trùng hạt thuốc lá

- Thực hiện trong phòng thí nghiệm, rửa hạt thuốc lá dưới vòi nước máy.

- Lắc hạt với nước có pha một ít xà phòng.

- Rửa lại nhiều lần bằng nước máy cho sạch xà phòng

- Thực hiện trong tủ cấy, lắc hạt với cồn 70o trong 1 phút.

- Chiết bỏ cồn, ngâm hạt trong dung dịch Caxi hypoclorid 10% trong 5 phút.

- Rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-6 lần.

- Gạn bỏ nước.

4.3 - Cách cấy mẫu

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 9

Page 10: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vna. Mẫu cây Trầu bà

- Trong tủ cấy vô trùng, những đốt cây Trầu bà đã khử trùng, được đặt trên giấy cấy vô trùng. Dùng dao mổ và kẹp tách các lá.

- Ở mỗi nách lá có mang một mầm ngủ. Dùng dao mổ cắt một đoạn mẫu có kích thước khoảng 1x1 cm cấy vào môi trường MS đã hấp khử trùng trong các ống nghiệm.

- Khi cấy mẫu cần chú ý cấy đúng chiều của thân. Các ống nghiệm được đặt trong phòng lạnh nhiệt độ 25oC, cường độ ánh sáng 2500-3000 lux.

b. Mẫu hạt thuốc lá

- Hạt thuốc lá sau khi khử trùng, dùng kẹp đặt đều trên bề mặt môi trường MS trong các erlen. Khoảng cách giữa các hạt là 1cm.

- Các erlen được đặt ở nơi tối hoàn toàn.

5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

1. Trình bày phương pháp khử trùng đốt thân Trầu bà, hạt thuốc lá.

2. Vai trò và tác dụng của tác nhân khử trùng cồn, canxi hypoclorid.

3. Ghi nhận kết quả nuôi cấy.

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 10

Page 11: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBÀI 3

KHỬ TRÙNG, NUÔI CẤY CHỒI NGỦ CÚC HẠT CAM

1 - NGUYÊN TẮC

Trong các phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây trồng, bên cạnh những phương pháp đòi hỏi người làm việc phải có kỹ thuật cao như tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, vi ghép…, phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy chồi ngủ (chồi nách) là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và mang lại hiệu quả cao nhất.

Ở đa số các loài thực vật, mỗi nách lá đều mang một chồi ngủ. Các chồi ngủ này có đặc tính hoàn toàn giống với các đỉnh sinh trưởng (là một đỉnh sinh trưởng ở trạng thái tiềm sinh), có khả năng tăng trưởng phát triển thành một cơ thể thực vật toàn vẹn. Các chồi ngủ này đa số bị ức chế sự phát triển bởi các chồi đỉnh (tính ưu thế ngọn). Nếu tách riêng một đoạn thân có mang chồi nách này ra khỏi cơ thể thực vật, dưới tác động bởi những yếu tố kích thích sinh trưởng ngoại sinh như cytokinin, auxin thì từ một chồi nách này có thể cho ra một cụm chồi với rất nhiều chồi mới (từ hàng chục tới hàng trăm chồi). Với những chồi mới tạo thành, tiếp tục cấy chuyền sang những môi trường tạo chồi mới thì hệ số nhân giống rất đáng kể.

Với những loài thực vật có đỉnh sinh trưởng nhỏ (đỉnh sinh trưởng dấu hoa thị) thì việc tách lấy đỉnh sinh trưởng rất khó thực hiện. Vì vậy, với những loại thực vật này, phương pháp nhân giống vô tính hiệu quả nhất là nuôi cấy chồi nách. Chồi nách đem nuôi cấy thường gắn liền với một đoạn thân, do đó sức sống của chồi nách thường tốt hơn rất nhiều lần so với đỉnh sinh trưởng tách rời, hiệu quả tạo cụm chồi cũng thường tốt hơn so với phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Việc tách chồi nách thường thực hiện với những đoạn nhánh có mang chồi của thực vật. Những đoạn nhánh này được khử trùng trước khi cắt nhỏ thành những đoạn có mang chồi nách. Bên cạnh đó, việc tách chồi nách cũng có thể thực hiện từ những cây vô trùng trong ống nghiệm được tạo ra do việc nuôi cấy hạt giống.

Trong bài thực hành này, sẽ đề cập tới phương pháp nhân giống vô tính thực vật qua nuôi cấy chồi nách và tạo nguồn cây cho phương pháp nuôi cấy chồi nách từ hạt giống.

2- VẬT LIỆU –HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ

2.1 - Vật liệu

- Cây hoa cúc

- Hạt cam

2.2 - Hoá chất

- Cồn 70o, 90o

- Môi trường MS bổ sung 2,4 – D

- Xà phòng bột

- Cồn 70o, 90o

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 11

Page 12: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn- Javel

- NAA

- BA

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bịĐơn vị

tínhSố

lượngGhi chú

1 - Dao mổ cái 15

2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn

3 - Ống đong: 100 ml cái 12

4 - Ống đong 500 ml cái 3

5 - Đũa khuấy cái 15

6 - Cốc 500 ml cái 15

7 - Quả bóp cao su cái 15

8 - Cốc 1000 ml cái 5

9 - Cốc 100 ml cái 30

10 - Cốc 200 ml cái 15

11 - Pipett: 1 ml cái 5

12 - Pipett: 5 ml cái 5

13 - Pipett: 10 ml cái 5

14 - Erlen 250ml cái 60

15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15

16 - Bông mỡ g 200

17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15

18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15

19 - Đèn cồn cái 15

20 - Tủ cấy vô trùng cái 1Tủ cấy có quạt thổi khí vô

trùng

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

- Sinh viên tiến hành cắt đốt thân cúc, thực hiện xác định công thức khử trùng. Nuôi cấy thân cúc trên môi trường MS bổ sung.

- Sinh viên tiến hành khử trùng, tách vỏ và nuôi cấy hạt cam trên môi trường MS.

4 - THỰC HÀNH

4.1 - Khử trùng và nuôi cấy thân cúc cắt đốt

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 12

Page 13: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vna. Khử trùng

- Lựa cây cúc còn tươi, non, lá ít bị dập. Dùng dao cắt bỏ hoa và gốc. Cắt lấy một đoạn cách gốc 1015 cm.

- Rửa sạch đoạn thân cúc dưới vòi nước máy.

- Cắt thành những đoạn nhỏ. Cắt ở giữa hai chồi ngủ. Mỗi đoạn có một chồi ngủ.

- Lắc các đoạn trong nước xà phòng từ 1015 phút.

- Rửa sạch xà phòng dưới vòi nước máy.

- Lắc với cồn 70o trong 1 phút.

- Lắc với dung dịch javel/nước ở các tỷ lệ 1/9, 2/8, 3/7, 4/6, 1/1.

- Rửa sạch javel bằng nước cất vô trùng 56 lần.

b. Nuôi cấy

- Thân cúc sau khi khử trùng được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA và NAA với tỷ lệ NAA/BA <1.

- Cắm thân cúc vào môi trường sao cho chồi ngủ vẫn nằm trên bề mặt môi trường .

4.2 - Khử trùng và nuôi cấy hạt cam

a. Khử trùng hạt

- Rửa hạt cam dưới vòi nước máy.- Lắc hạt với nước xà phòng 1015 phút.

- Rửa sạch xà phòng bằng nước máy.

- Lắc với cồn 70o trong 30 giây.

- Rửa sạch cồn bằng nước cất vô trùng 56 lần.

b. Tách vỏ hạt

- Đặt hạt cam lên trên giấy cấy. Dùng kẹp giữ hạt.

- Dùng dao mổ cắt hai đường dọc theo chiều dài hạt. Hai đường này đối diện nhau. Lưỡi dao chỉ vừa đủ cắt rách lớp vỏ, không chạm vào phần thịt hạt.

- Dùng dao và kẹp tách bỏ lớp vỏ cứng (vỏ trấu) và vỏ lụa bên ngoài.

- Hạt cam là hạt đa phôi, khi tách các phôi có thể tách rời nhau. Ta vẫn có thể dùng những mảnh phôi để nuôi cấy, mỗi mảnh phôi sẽ phát triển thành một cây cam.

c. Nuôi cấy

- Đặt ngang hạt cam trên môi trường MS.

- Dùng kẹp đè nhẹ hạt lên bề mặt môi trường sao cho ½ hạt nhập vào môi trường

- Đặt bình nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng 2000 lux, nhiệt độ 25oC.

5 - BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

1. Phương pháp lựa chọn công thức khử trùng.

2. Tại sao phải tách vỏ ngoài (vỏ trấu), vỏ lụa hạt cam trước khi nuôi cấy?

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 13

Page 14: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn3. Nếu để bình nuôi cấy hạt cam trong điều kiện không có ánh sáng, phôi có nảy

mầm phát triển được không? Giải thích?

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 14

Page 15: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBÀI 4

VI NHÂN GIỐNG DỨA BẰNG NUÔI CẤY CHỒI NGỦ1 - NGUYÊN TẮC

Đối với một số cây như tre, mía, dứa, phương pháp nhân giống vẫn thường được sử dụng hiện nay trong nông nghiệp là nhân giống truyền thống bằng chồi nách, chồi ngầm, thân ngầm, giâm hom… Tuy nhiên đặc điểm chung của các phương pháp này là hệ số nhân giống thấp, không đáp ứng được nhu cầu về cây giống để mở rộng sản xuất.

Trước nhu cầu của việc mở rộng sản xuất, trong một số năm gần nay để nhân giống dứa thường tiến hành bằng nuôi cấy chồi ngủ (phương pháp nhân cụm chồi). Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ nhân giống cao, hệ số nhân giống lớn.

Đặc điểm của phương pháp này là chồi ngủ được tách từ cụm chồi ngủ ở ngọn dứa, sau đó được nuôi cấy tạo cụm chồi trên môi trường in vitro. Các chồi có hình dạng giống như vảy cá hoặc hạt gạo nằm ép sát vào thân (lõi), có màu trắng. Mỗi chồi được tách riêng để nuôi cấy để tạo thành cụm chồi.

2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ

2.1 - Vật liệu

Chồi ngủ được tách từ ngọn dứa dùng làm vật liệu nuôi cấy.

2.2 - Hoá chất

- Cồn 70o, 90o

- Môi trường MS bổ sung NAA, BA

- Javel

- Xà phòng bột

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bịĐơn vị

tínhSố

lượngGhi chú

1 - Dao mổ cái 15

2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn

3 - Ống đong: 100 ml cái 12

4 - Ống đong 500 ml cái 3

5 - Đũa khuấy cái 15

6 - Cốc 500 ml cái 15

7 - Quả bóp cao su cái 15

8 - Cốc 1000 ml cái 5

9 - Cốc 100 ml cái 30

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 15

Page 16: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnSTT Tên dụng cụ, thiết bị

Đơn vị tính

Số lượng

Ghi chú

10 - Cốc 200 ml cái 15

11 - Pipett: 1 ml cái 5

12 - Pipett: 5 ml cái 5

13 - Pipett: 10 ml cái 5

14 - Erlen 250ml cái 60

15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15

16 - Bông mỡ g 200

17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15

18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15

19 - Đèn cồn cái 15

20 - Tủ cấy vô trùng cái 1Tủ cấy có quạt thổi khí vô

trùng

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

- Học sinh tiến hành tách bỏ lá ở các ngọn dứa để thu chồi ngủ.

- Các chồi ngủ được tách rời, nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA và BA.

4 - THỰC HÀNH

4.1 - Phương pháp khử trùng chồi ngủ dứa

- Tách bỏ toàn bộ các lá ở phần ngọn dứa. Tách lần lượt các lá từ dưới lên trên, từ ngoài vào trong để trách làm tổn thương các chồi ngủ.

- Tách rời phần cùi (lõi) có mang chồi ngủ.

- Rửa nhẹ nhàng cùi dứa dưới vòi nước máy, tránh làm tổ thương các chồi ngủ.

- Dùng dao cắt lấy bốn mặt của cùi dứa có mang chồi ngủ.

- Lắc nhẹ nhàng các mảnh có mang chồi ngủ này trong nước xà phòng trong 10 phút.

- Rửa sạch nước xà phòng dưới vòi nước máy.

- Lắc các mảnh mô dứa trong cồn 700 trong 2 phút.

- Khử trùng với nước javel (tỷ lệ 3:7) trong 7 phút.

- Rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng 5÷6 lần.

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 16

Page 17: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Hình 1. Cắt các mặt có mang chồi ngủ từ cùi dứa

4.2 - Phương pháp nuôi cấy

- Dùng dao mổ cắt những đường dọc, ngang tách rời từng chồi ngủ muốn lấy.

- Cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ tạo thành hình tháp.

- Cắm phần đầu hình tháp ngập vào môi trường nuôi cấy.

- Đặt các bình nuôi cấy trong điều kiện ánh sáng 3000 lux, ở nhiệt độ 25oC.

4.3 - Phương pháp tạo cụm chồi

Sau thời gian nuôi cấy từ 20-30 ngày các chồi được cấy chuyền sang môi trường nuôi cấy để tạo cụm chồi. Môi trường nuôi cấy có nồng độ chất điều hoà sinh trưởng NAA 1mg/lít, BA 0,1mg/lít. Sau 30-40 ngày, các chồi nhỏ xuất hiện ở phía gốc chồi. Số lượng các chồi nhỏ tăng dần lên, sắp xếp chồng chất lên nhau thành một cụm chồi (thường là sau 3-4 tháng nuôi cấy). Các chồi nhỏ được tách và chuyển sang môi trường tái sinh cây hoàn chỉnh. Điều kiện nuôi cấy để tạo cụm chồi dứa: cường độ ánh sáng 4000 lux, thời gian chiếu sáng 10-14 giờ/ngày, nhiệt độ 25-270C.

Hình 2. Cách cắt rời chồi ngủ dứa

5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH

1. Trình bày những điểm cần lưu ý khi tách chồi ngủ dứa

2. Trình bày quy trình nhân giống dứa bằng chồi ngủ.

3. Tại sao phải cắt vát 4 cạnh dưới của miếng mô dứa có mang chồi ngủ?THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 17

Page 18: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 18

Page 19: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBÀI 5

PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẠO MÔ SẸO THỰC VẬT1 - NGUYÊN TẮC

Trong đặc tính sinh lý của cơ thể thực vật, khi bị những tổn thương về mặt vật lý (những vết cắt trên cơ thể, những tổn thương do côn trùng tấn công) thực vật có khả năng hình thành những tế bào mới để hàn kín những chỗ tổn thương đó. Những tế bào mới được hình thành đó là tế bào mô sẹo.

Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các giai đoạn hoá lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào trong vùng tượng tầng (vùng phân sinh) như tượng tầng liber –mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành. Những tế bào mô sẹo thường có hình cầu, màu trắng hoặc nâu nhạt. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo.

Nuôi cấy tạo mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Những mô của thực vật có thể dùng nuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng libe mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ, tế bào diệp nhục, lá, trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.

A B

Hình 3. Sự tái sinh chồi từ mô sẹo. A: Mô sẹo, B: Chồi tái sinh.

Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ. Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo mô sẹo. Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo. Sự tạo mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi trường nuôi cấy được bổ sung một lượng auxin (2,4-D) thích hợp.

Sự tạo mô sẹo do tác dụng của auxin do 3 quá trình:

- Sự phản phân hoá của tế bào nhu mô: xảy ra ở các tế bào nhu mô mộc và libe, nhu mô vỏ hay lõi.

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 19

Page 20: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng: các tế bào bào tượng tầng của phần lớn

cây hai lá mầm dễ dàng phân chia dưới tác động của auxin.

- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ).

2 - VẬT LIỆU – HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ

2.1 - Vật liệu

Hạt thuốc lá (Nicotiana tabacum) được gieo trên môi trường MS. Sử dụng các cây con làm vật liệu thí nghiệm.

2.2 - Hoá chất

- Cồn 70o, 90o

- Môi trường MS bổ sung 2,4 - D

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bịĐơn vị

tínhSố

lượngGhi chú

1 - Dao mổ cái 15

2 - Lưỡi dao mổ cái 15 Dùng lưỡi dao mổ nhọn

3 - Ống đong: 100 ml cái 12

4 - Ống đong 500 ml cái 3

5 - Đũa khuấy cái 15

6 - Cốc 500 ml cái 15

7 - Quả bóp cao su cái 15

8 - Cốc 1000 ml cái 5

9 - Cốc 100 ml cái 30

10 - Cốc 200 ml cái 15

11 - Pipett: 1 ml cái 5

12 - Pipett: 5 ml cái 5

13 - Pipett: 10 ml cái 5

14 - Erlen 250ml cái 60

15 - Kẹp dài 25 cm Cái 15

16 - Bông mỡ g 200

17 - Ống nghiệm Þ25 cái 15

18 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15

19 - Đèn cồn cái 15

20 - Tủ cấy vô trùng cái 1Tủ cấy có quạt thổi khí vô

trùng

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 20

Page 21: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

- Học sinh tiến hành cắt đốt thân, mảnh lá, đoạn rễ cây thuốc lá để nuôi cấy tạo mô sẹo, những đoạn có mang chồi ngủ được nuôi cấy tái sinh cây.

- Các thành phần này được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4 – D.

4 - THỰC HÀNH

4.1 - Vật liệu nuôi cấy

a. Mô cấy từ cây thuốc lá tạo ra qua nuôi cấy hạt

- Tiến hành khử trùng hạt thuốc lá.

- Nuôi cấy hạt thuốc lá trong môi trường MS.

- Bình nuôi cấy được đặc trong điều kiện tối, nhiệt độ 250C cho nảy mầm.

- Cây con được nuôi cấy trong điều kiện có ánh sáng.

- Sau 15-20 ngày nuôi cấy, khi cây có từ 6-8 lá, cao khoảng 10-15cm, có thể sử dụng là nguyên liệu cho nuôi cấy mô sẹo

b. Mô cấy từ cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên

Cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên có sức tăng trưởng mạnh, khả năng hình thành mô sẹo rất lớn. Những mô đặt cấy lấy từ cây thuốc lá mọc ngoài tự nhiên phải trải qua giai đoạn vô trùng mẫu để loại bỏ hết nấm, khuẩn tồn tại trong và trên mẫu cấy.

4.2 - Chuẩn bị mẫu cấy

a. Cắt đốt thân

- Dùng kẹp gắp một cây thuốc lá trong bình nuôi cấy đặt lên giấy cấy.

- Dùng dao mổ cắt rời tất cả lá, rễ ra khỏi thân.

- Cắt thân thuốc lá thành những đoạn nhỏ, mỗi đoạn là một đốt thân. Từ các đốt này, tiếp tục chia nhỏ thành các đoạn, mỗi đoạn có kích thước khoảng 0,2 – 0,4 cm. Các đoạn nhỏ này được nuôi cấy tạo mô sẹo.

- Điều lưu ý khi cắt các đoạn thân là phải bỏ tất cả các phần mắt của đốt. Các phần này không có khả năng tạo sẹo, chỉ có thể được sử dụng để nuôi cấy tạo chồi.

b. Cắt mảnh lá

- Từ các lá ở phần trên, sử dụng dao mổ cắt bỏ gân chính và rìa lá.

- Các phần lá này được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước 0,2 x 1 cm.

- Các mảnh lá này được nuôi cấy tạo mô sẹo.

c. Cắt đoạn rễ

- Sau khi cắt các đoạn thân, lá, phần rễ còn lại được rửa sạch agar trong nước cất vô trùng.

- Dùng dao cắt rễ thành các đoạn nhỏ có kích thước 0,2 - 0,4 cm. Các đoạn này được nuôi cấy tạo mô sẹo.

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 21

Page 22: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Hình 4. Phương pháp cắt mảnh lá (A), đốt thân (B), đoạn rễ (C)

4.3 - Nuôi cấy tạo mô sẹo

a. Nuôi cấy thân, lá

- Dùng kẹp gắp các đoạn thân mảnh lá cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D.

- Khoảng cách giữa các đoạn thân, mảnh lá là 1cm. Tránh cấy quá dày.

- Sử dụng môi trường MS bổ sung 2,4-D có nồng độ là 1µmol/lít môi trường.

b. Nuôi cấy đoạn rễ

- Các đoạn rễ được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2,4-D có nồng độ 0,1 µmol/lít môi trường.

Những khối mô sẹo hình thành qua quá trình nuôi cấy có thể được tách ra và chuyển sang nuôi cấy có nồng độ 2,4-D giảm (0,05µmol/lít môi trường) để tiếp tục phân chia tạo thành những khối mô sẹo mới. Thời gian cấy chuyền giữa các lần nuôi cấy là 4-6 tuần. Khối mô sẹo cũng có thể được cho tái sinh thành cây nếu môi trường nuôi cấy loại bỏ 2,4-D và bổ sung BA vào.

5. BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH

1. Khái niệm mô sẹo? Nguyên nhân của việc hình thành mô sẹo ở thực vật?

2. Vai trò của auxin đối với việc hình thành mô sẹo ở thực vật. Nồng độ thích hợp nhất kích thích tạo mô sẹo từ thân, lá, rễ cây thuốc lá.

3. Phương pháp cắt đốt thân, đoạn rễ, mảnh lá để tạo mô sẹo ở cây thuốc lá.

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 22

A

B

C

Page 23: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBÀI 6

KỸ THUẬT TẠO ÁO BAO HẠTGIỐNG NHÂN TẠO1 - Ý NGHĨA

Ở một số loại thực vật như mía, khoai tây, khoai mìm dâu tây... đều không có khả năng nhân giống bằng hạt. Bên cạnh đó có nhiều loại thực vật tạo được hạt giống nhưng hạt giống kém chất lượng hay hạt giống rất đắt. Để giải quyết tất cả các vấn đề trên, một phương pháp nhân giống mới được nghiên cứu và ứng dụng đó là phương pháp tạo hạt nhân tạo.

Hạt giống nhân tạo về cơ bản giống như hạt giống tự nhiên. Chỉ có sự khác nhau là hạt giống nhân tạo có cấu tạo là phôi được bao bọc bởi lớp áo bên ngoài thay cho nội nhũ, vỏ và phôi ở hạt nhân tạo là phôi vô tính (phôi soma) (hình 1). Hạt giống nhân tạo gồm 3 phần (hình 2):

- Phôi vô tính

- Vỏ bọc polymer như alginat

- Màng ngoài: được cấu tạo từ alginat canxi

Phôi soma ở hạt nhân tạo giống như phôi hợp tử ở hạt tự nhiên là có hai cực (đỉnh chồi và đỉnh rễ), như thế có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh tương tự như hạt nảy mầm. Cấu trúc phôi soma giống như phôi hợp tử nhưng phôi soma của hạt giống nhân tạo không có vỏ bao hạt cũng như mô dự trữ.

Hình 5 - So sánh cấu trúc hạt tự nhiên và hạt nhân tạo

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 23

Page 24: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Hình 6 - Cấu tạo hạt nhân tạo

Hạt nhân tạo thườmg có vỏ làm bằng alginat Na và alginat Ca hay B-hydrogel.

Alginat Na là một chất cao phân tử được chiết suất từ rong biển (rong Mơ Sargassum sp là một loại rong nâu). Trong rong Mơ alginat Na tồn tại dưới dạng alginit không tan là hợp chất của các axid manuronic. Để chiết tách alginat , thường tiến hành nấu rong với Na2CO3.

[(C5H7O4COO)2Ca]n + nNa2CO3 2[C5H7O4COONa]n + nCaCO3

Alginat Ca Alginat Na

Alginat Na là dạng tan trong nước. Khi Alginat Na tiếp xúc với dung dịch CaCl2, xảy ra phản ứng trao đổi ion giữa hai dung dịch này theo phản ứng:

2[C5H7O4COONa]n + nCaCl2 [(C5H7O4COO)2Ca]n + 2nNaCl

Alginat Na Alginat Ca

Ở dạng này, alginat Ca kết tủa, trở thành dạng không tan, tạo thành màng không thấm nước. Toàn bộ bề mặt của gịot hỗn hợp trên sẽ được bao bọc bằng một lớp áo alginat Ca không thấm nước và tạo thành một hạt. Phần alginat Na bên trong vẫn ở trạng thái tan. Vỏ hạt nhân tạo được tạo ra theo nguyên tắc này.

Hạt nhân tạo có thể bảo quản, tồn trữ và trồng trọt bằng những kỹ thuật canh tác truyền thống. Và đặc biệt là có thể chủ động trong sản xuất, trồng trọt, canh tác không phụ thuộc vào các điều kiện thời tiết, mùa vụ.

Trong bài thực hành này, chúng ta sẽ tìm hiểu kỹ thuật tạo áo bao cho phôi vô tính để cấu thành một hạt giống nhân tạo hoàn chỉnh.

2 - NGUYÊN LIỆU - HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ

2.1 - Nguyên liệu, hoá chất

STT Tên hoá chất, phụ liệuĐơn vị

tínhSố

lượngGhi chú

1 Alginat Na 4% ml 100

2 Môi trường MS ml 1000

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 24

Phoâi soma

Noäi nhuõ nhaân taïo

Voû nhaân taïo

Page 25: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnSTT Tên hoá chất, phụ liệu

Đơn vị tính

Số lượng

Ghi chú

3 CaCl2 2,5% ml 300

4 Nước cất ml 500

5 Giấy lọc gói 1

6 Phôi vô tính

2.2 - Dụng cụ, thiết bị cần cho một nhóm (30 sinh viên) thực hành

STTTên dụng cụ, thiết bị

Đơn vị tính

Số lượng

Ghi chú

1 Bình chiết 500ml cái 2 Tạo giọt nhỏ

2 Pipette 10 ml cái 2 Hút và chuyển phôi

3 Kẹp gắp 25cm cái 2 Gắp hạt

4 Phễu lớn cái 2

5 Erlen 500ml cái 2

6 Erlen 250 cái 2

7 Quả bóp cao su cái 2

8 Đồng hồ cá nhân cái 2

9 Đĩa petri cái 2

10 Cốc 1000 ml cái 2

11 Cốc 250ml cái 2

3. NỘI DUNG THỰC HÀNH

- Học sinh tiến hành nhỏ giọt và chuyển phôi tạo hạt

- Học sinh thực hiện ngâm hạt trong dung dịch CaCl2 và nước để tạo hạt hoàn chỉnh

4 – THỰC HÀNH

4.1 – Tạo giọt nhỏ

- Hoà tan 100 ml Alginat Na 4% vào 1 lít môi trường MS có chứa các muôi khoáng, đường, vitamin, các chất sinh trưởng. Cho hỗn hợp này vào bình chiết.

- Mở khoá nhỏ giọt của bình chiết, nhỏ từng giọt nhẹ nhàng hỗn hợp này vào một cốc dung dịch CaCl2 2,5%. Mỗi lần nhỏ, khi giọt dung dịch vừa ló ra ở đầu ống nhỏ giọt của bình chiết, vặn khoá lại để dừng giọt dung dịch ở đầu ống nhỏ giọt

4.2 – Chuyển phôi và tạo hạt

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 25

Page 26: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn- Dùng pipette hút một phôi trong dung dịch MS chuyển vào trong giọt nhỏ đang

dừng ở đầu bình chiết.

- Mở khoá bình chiết để giọt có chứa phôi nhỏ vào trong erlen đựng CaCl2.

- Ngâm hạt này trong dung dịch CaCl2 20 phút, có thể lắc nhẹ erlen.

4.3 – Rửa và làm khô hạt

- Sau 20 phút, dùng kẹp gắp hạt nhân tạo sang một cốc đựng nước cất. Hạt được ngâm nước 5 phút để làm cứng và ngăn chận phản ứng.

- Sau 5 phút, dùng kẹp chuyển hạt ra một đĩa petri có lót giấy lọc để làm khô hạt.

- Hạt sau khi được làm khô có thể được bảo quản hay sử dụng cho gieo trồng trực tiếp.

Hình 7. Kỹ thuật tạo áo bao hạt giống nhân tạo

5 - NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý

- Tất cả mọi công việc tạo áo bao hạt nhân tạo đều phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng

- Việc vặn khoá của bình cầu nhỏ giọt phải thực hiện cẩn thận để có thể giữ được giọt dung dịch ở đầu ống.

- Thao tác chuyên phôi vào giọt nhỏ thực hiện nhẹ nhàng để không làm rơi giọt dung dịch.

- Thời gian ngâm hạt phải chính xác 20 phút.

6. TƯỜNG TRÌNH THÍ NGHIỆM

- Làm tường trình thí nghiệmTHÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 26

Hoãn hôïp alginat Na 4 % vaø moâi tröôøng MS

Chuyeån phoâi vaøo gioït nhieåu

Taïo maøng bao alginat Ca trong 20 phuùt

Ngaâm nöôùc vaø thu haït nhaân taïo

Page 27: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn- Giải thích nguyên tắc tạo áo bao hạt giống nhân tạo

- So sánh giữa vỏ hạt giống từ nhiên và hạt giống nhân tạo

- Nêu ý nghĩa và cách bảo quản hạt giống nhân tạo

BÀI 7

PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG1 - NGUYÊN TẮC

Mô phân sinh đỉnh chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng, được bao bọc bởi một lớp vỏ bề mặt có cấu tạo cutin hạn chế thấp nhất quá trình mất nước và lớp cutin này bao bọc cả chồi đỉnh.

Ở thực vật, sự hình thành mới các cơ quan bắt đầu trong các mô phân sinh đỉnh, các mô này phân hoá ngay từ những giai đoạn phát triển đầu của phôi và giữ lại trong suốt đời sống của cây. Điều này xảy ra là do mô phân sinh có sự phân hoá của những tế bào khởi sinh. Tất cả các tế bào còn lại đều xuất phát từ các tế bào khởi sinh.

Quá trình sinh trưởng của cơ quan diễn ra theo 3 giai đoạn:

- Giai đoạn thứ nhất: thường được gọi là giai đoạn phôi sinh. Trong các điểm sinh trưởng (trong các mô phân sinh đỉnh) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nó thành các mô riêng biệt.

- Giai đoạn thứ hai: giai đoạn dài ra do sự sinh trưởng nhanh chóng, mầm cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định.

- Giai đoạn thứ ba: giai đoạn kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu sự hoá gỗ các thành tế bào, xuất hiện ở trên đó những chỗ dầy lên có cấu tạo và kết quả là không còn khả năng tiếp tục sinh trưởng.

Ở mỗi nách lá đều có chồi nách. Chồi nách thực chất có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng của thân. Do hiện tượng ưu thế ngọn, chồi nách không phát triển, nhưng khi được đánh thức và bắt đầu sinh trưởng, chúng có cấu tạo lá đầy đủ như thân chính.

Quá trình sinh tổng hợp DNA của virus thực vật không xảy ra trong tế bào đỉnh sinh trưởng do một cơ chế hiện nay không rõ. Vì vậy mô đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus. Do đó trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, mô đỉnh sinh trưởng được sử dụng là vật liệu nuôi cấy mô tế bào nhằm tạo các cây không nhiễm virus và các loại vi khuẩn hay nấm gây bệnh.

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là phương pháp nhân giống quan trọng vừa tạo ra những loại cây trồng sạch vius vừa có hệ số nhân giống rất cao. Phương pháp này đã áp dụng hiệu quả đối với cây thân thảo như cúc, cẩm chướng, khoai tây, khoai lang, chuối...

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 27

Page 28: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

Hình 8. Đỉnh sinh trưởng

2 - VẬT LIỆU –HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ

2.1 - Vật liệu

- Cây hoa Dạ Yên Thảo (Petunia sp)

2.2 - Hoá chất

- Cồn 70o, 90o

- Môi trường MS bổ sung BA

- Xà phòng bột

- Cồn 70o, 90o

- Javel

- BA

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bịĐơn vị

tínhSố

lượngGhi chú

1 - Dao mổ cái 30

2 - Lưỡi dao mổ cái 30 Dùng lưỡi dao mổ nhọn

3 - Ống đong: 100 ml cái 12

4 - Ống đong 500 ml cái 3

5 - Đũa khuấy cái 15

6 - Cốc 500 ml cái 15

7 - Quả bóp cao su cái 15

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 28

Page 29: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnSTT Tên dụng cụ, thiết bị

Đơn vị tính

Số lượng

Ghi chú

8 - Cốc 1000 ml cái 5

9 - Cốc 100 ml cái 30

10 - Cốc 200 ml cái 15

11 - Erlen 250ml cái 60

12 - Kẹp dài 25 cm Cái 15

13 - Bông mỡ g 200

14 - Ống nghiệm þ25 cái 15

15 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15

16 - Đèn cồn cái 15

17 - Kính lúp hai mắt cái 1 Có đèn rọi từ trên xuống

18 - Đĩa petri 100mm cái 1

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

- Sinh viên tiến hành tách đỉnh sinh trưởng cây hoa Dạ yên Thảo.

- Sinh viên tiến hành cấy và nuôi đỉnh sinh trưởng vừa tách trên môi trường MS

4 - THỰC HÀNH

4.1 - Khử trùng mẫu tách đỉnh sinh trưởng

Chọn cây mẹ trưởng thành có phẩm chất tốt (lá không bị sâu, thân không bị dập, chồi ngọn và chồi ngủ phát triển tốt) hái búp non dài 2 ÷ 3 cm, cho vào chai hay túi nilon kín, chuyển về phòng thí nghiệm.

- Dùng dao mổ cắt bỏ bớt lá.

- Khử trùng mẫu lần lượt với nước xà phòng loãng, cồn và NaOCl 0,5% trong 5 phút. Rửa mẫu với nước cất vô trùng, làm ráo để chuẩn bị tách đỉnh sinh trưởng.

4.2 - Tách đỉnh sinh trưởng

Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng sử dụng phần nhỏ nhất ở chồi đỉnh của thân làm mẫu nuôi cấy. Phần này gồm mô phân sinh và vài phác thể lá. Việc tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm tạo các cây sạch bệnh. Mẫu cấy càng nhỏ khả năng tạo cây sạch bệnh càng cao. Ví dụ, mô phân sinh từ 0,1 đến 0,15 mm có thể có 100% sạch virus. Tuy nhiên mẫu cành nhỏ khả năng sống sót càng thấp. Do vậy người ta thường sử dụng mẫu cấy từ 0,25 đến 1 mm.

- Đỉnh sinh trưởng được tách dưới kính lúp có độ phóng đại từ 10 đến 40 lần được làm vô trùng bằng cách lau cồn thật sạch thân kính và bàn để mẫu tách. Trong quá trình tách luôn chuẩn bị một tấm bông tẩm cồn trên bàn mang mẫu để tiện việc vô trùng và làm nguội dao.

- Dùng hai dao mổ thật sắc để thao tác tách đỉnh sinh trưởng.

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 29

Page 30: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn- Gắp mẫu lên bàn đặt mẫu, dùng mũi dao mổ tách bỏ hết những lá ngoài, chỉ để lại

hai lá nguyên thủy. Tách các lá lần lượt từ ngoài vào trong, trách để lưỡi dao làm tổn thương phần chồi đỉnh.

- Sau khi tách bỏ hết các là ngoài, dùng mũi dao mổ nhọn cắt lấy phần đỉnh sinh trưởng có hai phác thể lá có kích thước 0,6mm. Giữ nguyên đỉnh sinh trưởng trên mũi dao để chuyển vào môi trường nuôi cấy.

4.3 - Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Đối với những loại cây tiết nhiều phenol thường nên được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung than hoạt tính. Môi trường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Dạ Yên Thảo thường bổ sung BA 2mg/lít, NAA 0,1mg/lít. Môi trường có thể là đặc hoặc lỏng (có cầu giấy).

- Đỉnh sinh trưởng sau khi tách xong để nguyên trên lưỡi dao mổ.

- Đưa lưỡi dao mổ vào môi trường nuôi cấy, đâm xuyên lưỡi dao mổ vào bề mặt môi trường, đỉnh sinh trưởng sẽ được giữ ngay ngắn trên bề mặt môi trường nuôi cấy.

- Đỉnh sinh trưởng được nuôi cấy ở nhiệt độ 250C , ánh sáng 3000 lux.

Nếu đỉnh sinh trưởng tiết nhiều phenol thì nên cấy chuyền liên tục trong quá trình nuôi cấy.

5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH

1. Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng?

2. Nếu đặt đỉnh sinh trưởng không ngay ngắn lên môi trường (mặt cắt không tiếp xúc được với bề mặt môi trường) đỉnh sinh trưởng có tăng trưởng được không? Giải thích?

3. Để loại bỏ virus ở cây trồng, thường có những phương pháp gì?

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 30

Page 31: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBÀI 8

PHƯƠNG PHÁP VI GHÉP Ở THỰC VẬT1 - NGUYÊN TẮC

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một phương pháp nhân giống quan trọng nhằm thu được một số lượng lớn cây giống và cây sạch bệnh virus. Tuy nhiên đối với một số loại thực vật, đặc biệt là cây thân gỗ, đỉnh sinh trưởng rất khó có thể sinh trưởng trên môi trường nhân tạo. Do vậy đối với những loại cây này, vi ghép là một phương pháp quan trọng có thể áp dụng.

Mặt khác, việc làm sạch bệnh virus cho cây trồng, đặc biệt cây ăn quả có múi thuộc họ cam chanh đang là nhu cầu lớn đối với nhiều nơi trên thế giới. Trong khi chưa tạo được những giống kháng virus thì việc tạo ra những khu vực cây mẹ sạch virus để cung cấp mắt ghép và cành chiết đầu dòng là cần thiết. Bên cạnh những biện pháp tẩy virus như cấy mô xử lý nhiệt, tạo cây trong nuôi cấy phôi tâm… phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đang được áp dụng rộng rãi và có hiệu quả vào việc làm sạch virus đối với nhiều cây trồng khác nhau.

Trong trường hợp cây ăn quả lâu năm, kỹ thuật ghép đang chiếm vị trí hàng đầu trong nhân giống vì kết hợp được khả năng chống chịu của gốc cây hoang dã với ưu điểm năng suất và phẩm chất của mắt ghép. Tuy nhiên, trong lúc ghép theo kỹ thuật truyền thống do thời gian trồng gốc ghép kéo dài và kích thích mắt ghép khá lớn, nên bệnh virus có thể lây truyền.

Để khắc phục những nhược điểm trên, kỹ thuật ghép đỉnh sinh trưởng gọi tắt là vi ghép được thử nghiệm và mang lại kết quả tốt. Về nguyên tắc, vi ghép là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, nhưng thông qua dinh dưỡng tự nhiên của gốc ghép. Đỉnh sinh trưởng làm mắt ghép có kích thước 0,2÷0,5 mm, được tách từ búp non đang sinh trưởng mạnh của cây mẹ trưởng thành, gốc ghép là mầm giá mới nảy từ hạt của giống hoang dại, toàn bộ cây ghép được nuôi dưỡng trong điều kiện ống nghiệm vô trùng. Những cây ghép thu được bằng phương pháp này hoàn toàn sạch bệnh và mang đặc điểm di truyền của cây mẹ cho mắt ghép.

2 - VẬT LIỆU –HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ

2.1 - Vật liệu

- Cây cam nuôi cấy từ hạt trong ống nghiệm là nguyên liệu dùng làm gốc để vi ghép.

- Cành cam lấy từ cây cam có chất lượng quả cao được sử dụng làm nguyên liệu để tách đỉnh sinh trưởng.

2.2 - Hoá chất

- Cồn 70o, 90o

- Môi trường MS bổ sung BA

- Xà phòng bột

- Javel

- BA, NAA

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 31

Page 32: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (30 sinh viên) thực hành

STT Tên dụng cụ, thiết bịĐơn vị

tínhSố

lượngGhi chú

1 - Dao mổ cái 30

2 - Lưỡi dao mổ cái 30 Dùng lưỡi dao mổ nhọn

9 - Cốc 100 ml cái 30

10 - Cốc 200 ml cái 15

11 - Erlen 250ml cái 15

12 - Kẹp dài 25 cm Cái 15

13 - Bông mỡ g 200

14 - Ống nghiệm þ25 cái 15

15 - Giá ống nghiệm lỗ lớn cái 15

16 - Đèn cồn cái 15

17 - Kính lúp 2 mắt cái 15Kính lúp có đèn rọi từ trên

xuống

18 - Đĩa petri 100mm cái 1

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

- Sinh viên tiến hành tách đỉnh sinh trưởng cây cam nuôi cấy trong ống nghiệm.

- Sinh viên tiến hành ghép đỉnh sinh trưởng vừa tách vào gốc ghép.

4 - THỰC HÀNH

4.1 - Chuẩn bị gốc ghép

Tách hạt cam từ quả chín, rửa sạch và để khô trong vòng 24 giờ, cất giữ trong tủ lạnh ở 4oC, dùng dần.

- Hạt được khử trùng 5÷10 phút bằng dung dịch HgCl 0,1%.

- Tiến hành tách bỏ vỏ trấu, vỏ lụa.

- Gieo hạt trên môi trường MS chứa 2% đường và 0,8% agar để ở 25oC nơi tối hoàn toàn, sau 10 ngày cây mầm dài 5÷8 cm được chọn làm gốc ghép.

4.2 - Tách đỉnh sinh trưởng

Chọn cây mẹ trưởng thành có năng suất và phẩm chất tốt, hái búp non dài1,5 ÷ 3 cm, cho vào chai hay túi nilon kín, chuyển về phòng thí nghiệm.

- Cắt bỏ bớt lá, khử trùng bằng NaOCl 0,5% trong 5 phút.

- Dùng kim nhọn gạt bỏ những lá non, sau đó dùng lưỡi dao mổ nhọn cắt đỉnh sinh trưởng 0,5 mm để nguyên trên lưỡi dao để chuyển vào vi trí ghép.

4.3 -. Tiến hành ghép

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 32

Page 33: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnĐối với gốc ghép, dùng dao mổ cắt bỏ đầu rễ, trụ trên lá mầm và hai lá mầm, để

lại ở phần rễ chừng 2÷3 cm và phần thân chừng 2 cm. Tùy theo cách ghép sẽ tiến hành xử lý gốc ghép khác nhau.

a. Ghép lên mặt cắt

- Dùng dao mổ cắt ngang thân gốc ghép tạo thành một mặt phẳng vuông góc với trục thân gốc ghép.

- Dưới kính lúp, xác định vòng tượng tầng libe-mộc. Đặt mắt ghép trực tiếp lên bề mặt nhát ghép, trên vòng tượng tầng.

b. Ghép chữ T ngược

- Dùng đầu nhọn của lưỡi dao mổ, cắt tạo thành hình chữ T ngược trên gốc ghép cách mặt cắt bên trên khoảng 0,1-0,3cm. Vết cắt đi hết vùng vỏ của gốc ghép. Chân của chữ T là mặt cắt để dễ tiếp bộc lộc vùng tượng tầng libe-mộc.

- Dùng mũi kim hay đầu dao mổ đặt đỉnh sinh trưởng vừa tách được ở trên vào mặt cắt của chữ T (chân của chữ T ngược) sao cho mặt cắt của đỉnh sinh trưởng tiếp xúc với vùng tượng tầng.

c. Ghép hàm ếch

- Khoét trên thân mềm cách mặt cắt 5 mm một vết lõm hình hàm ếch, chiều sâu vết lõm bằng chiều dày lớp vỏ.

- Dùng kim nhọn hay đầu dao mổ nhọn đặt đỉnh sinh trưởng vừa tách vào đáy hàm ếch.

Hình 9. Ba kiểu vi ghép

4.4 - Nuôi cây ghép

Cây ghép được đặt vào ống nghiệm lớn (200 x 25 mm) chứa 6 ml môi trường MS lỏng có hàm lượng đường cao là 7,5%. Đặt ống nghiệm có chứa cây ghép ở nhiệt độ 25oC, chiếu sáng 12 giờ/ ngày, cường độ chiếu sáng từ 3000-5000 lux.

5 - BÀI TƯỜNG TRÌNH

1. Giải thích cơ chế liên kết giữa gốc ghép và mắt ghép (đỉnh sinh trưởng)?

2. Trình bày những phương pháp vi ghép và những điểm cần lưu ý cho từng phương pháp?THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 33

Page 34: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn3. Có thể sử dụng phương pháp vi ghép cho những đối tượng cây trồng nào (cây thân

gỗ, thân thảo…), giải thích?

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 34

Page 35: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vnBÀI 9

PHƯƠNG PHÁP THUẦN HOÁ CÂY RA VƯỜN ƯƠM1 - NGUYÊN TẮC

Sự thành công của một kỹ thuật nhân giống thực vật thể hiện qua số cây con sống được ngoài vườn ươm. Tỉ lệ cây nuôi cấy sống được ngoài vườn ươm phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật thuần hoá. Do đó, việc thuần hoá cây nhằm mục đích cho cây nuôi cấy thích nghi được với những điều kiện của môi trường tự nhiên:

+ Nhiệt độ

+ Độ ẩm

+ Ánh sáng

+ Chế độ dinh dưỡng

+ Dịch bệnh

Giữa điều kiện môi trường bình nuôi cấy, phòng tăng trưởng và môi trường tự nhiên (môi trường vườn ươm) có sự khác biệt căn bản về tất cả các yếu tố, do đó điểm cấu trúc và sinh lý giữa cây nuôi cấy có sự khác biệt với cây tự nhiên. Như vậy, mục đích của việc thuần hoá là chuẩn bị cho cây nuôi cấy có được những tính chất như cây tự nhiên để có thể thích nghi và sống được ngoài môi trường tự nhiên. Những tính chất này được hình thành dựa trên nguyên tắc có sự thay đổi dần dần các điều kiện môi trường ngoài bình nuôi cấy để bằng được với các điều kiện môi trường tự nhiên:

- Nhiệt độ: thay đổi từ 26oC đến 32-34oC

- Độ ẩm: thay đổi từ 80-90% đến 50-60%

- Ánh sáng: thay đổi từ 3.000-5.000 lux đến 12.000 đến 15.000 lux

- Chế độ dinh dưỡng: thay đổi từ phương thức dị dưỡng thành phương thức tự dưỡng.

2 - VẬT LIỆU –HOÁ CHẤT – DỤNG CỤ

2.1 - Vật liệu

- Cây lan Hồ Điệp đã tái sinh hoàn chỉnh

- Cây Bạch đàn đã tái sinh hoàn chỉnh

2.2 - Hoá chất, nguyên liệu

- Dung dịch KMnO4: 0,5%

- Giá thể hỗn hợp để ươm cây Bạch đàn

- Giá thể dớn, rêu biển để ươm cây lan Hồ Điệp

2.3 - Dụng cụ – Thiết bị cần cho 1 nhóm (3 sinh viên) thực hành

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 35

Page 36: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

STT Tên dụng cụ, thiết bịĐơn vị

tínhSố

lượngGhi chú

1 - Khay ươm cái 1

2 - Thau nhựa cái 1

3 - Rổ vuông 30x50cm cái 1

4 - Cốc 200 ml cái 1

5 - Erlen 250ml cái 1

6 - Kẹp dài 25 cm Cái 1

3 - NỘI DUNG THỰC HÀNH

- Sinh viên tiến hành gắp cây khỏi bình môi trường nuôi cấy, xử lý và trồng vào giá thể trên khay ươm.

- Sinh viên tiến hành chăm sóc, thay đổi các điều kiện môi trường vườn ươm để thuần hoá cây.

4 - THỰC HÀNH

4.1 – Chuẩn bị giá thể ươm cây

* Giá thể ươm cây Bạch đàn

- Tỉ lệ giá thể: Đất (70%) + Phân chuồng ủ hoai (10%) + tro trấu (20%)

- Độ ẩm giá thể: 70%

- Giá thể được xử lý tiệt trùng bằng cách hấp hoặc bằng một số loại hoá chất (24 giờ trước khi trồng):

+ Vantox M12: 0,5%

+ Zinep: 0,4%

+ Formaline: 40% (phun 2-3 ngày trước khi trồng.

* Giá thể ươm cây lan Hồ điệp

- Tỉ lệ giá thể: Dớn hoặc rêu đá (60%) + Hạt xốp (40%)

- Độ ẩm giá thể: 70%

- Giá thể được xử lý tiệt trùng bằng cách hấp hoặc bằng một số loại hoá chất (24 giờ trước khi trồng):

+ Vantox M12: 0,5%

+ Zinep: 0,4%

+ Formaline: 40% (phun 2-3 ngày trước khi trồng.

4.2 – Chuyển cây ra khỏi bình nuôi cấy

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 36

Page 37: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn- Bình cây nuôi cấy mô đã mở nút đậy được 1 tuần

- Dùng kẹp inox, gắp cây khỏi giá thể agar. Trách làm tổn thương lá và rễ cây nuôi cấy

- Đặt cây vào thau nhựa, dùng vải mềm hoặc bông thấm nước rửa sạch agar và dưỡng chất trên bề mặt cây. Tráng lại 3 lần bằng nước sạch.

- Ngâm cây vào dung dịch KMNO4 0,5% trong 20 phút để diệt vi sinh vật.

- Vớt cây vào rổ nhựa, để ráo 1-2 giờ.

4.3 -. Tiến hành trồng cây vào giá thể

- Giá thể sau khi đã trộn đều theo tỉ lệ và khử trùng, được phân đều vào các lỗ của khay ươm, dùng tay nén chặt vừa phải.

- Đối với cây Bạch đàn cấy mô, dùng 1 thanh tre, soi một lỗ nhỏ vào giữa khối giá thể, đặt 1 cây con Bạch đàn vào lỗ soi và dùng tay ấn nhẹ giá thể xung quanh gốc để giữ cố định.

- Đối với cây lan Hồ điệp, dùng một ít giá thể cuộn xung quanh phần rễ của cây (không quá cổ rễ). Đặt cây vào giữa lỗ khay ươm, chèn thêm một ít giá thể để giữ cố định. Lưu ý, tránh bó quá chặt hoặc làm tổn thương rễ trong quá trình trồng.

4.4 – Chăm sóc, thuần hoá cây con cấy mô

Khay ươm cây con cấy mô được chuyển vào vườn ươm, điều kiện môi trường được điều chỉnh như sau:

- Nhiệt độ 30oC

- Ánh sáng:

+ Một tuần đầu: ½ ánh sáng tự nhiên (7.000 lux)

+ Tuần thứ 2: 70% ánh sáng tự nhiên (10.000 – 12.000 lux)

+ Từ tuần thứ 3: 100% ánh sáng tự nhiên

- Độ ẩm:

+ Tuần đầu: phun sương ẩm 90%

+ Tuần 2: 70%

+ Từ tuần 3: 60%

Sau 1 tháng, tiến hành đánh giá số lượng cây con sống được ngoài vườn ươm. Mô tả đặc điểm sinh trưởng của cây con như: chiều cao cấy, số lá, màu sắc lá…

5 – BÀI TƯỜNG TRÌNH

1. Giaûi thích sự khác biệt về đặc điểm giữa cây trong bình nuôi cấy và cây ngoài tự nhiên?

2. Trình bày phương pháp thuần hoá cây con và chuyển cây con ra vườn ươm?

3. Báo cáo kết quả về tỉ lệ cây con sống được ngoài vườm ươm, đặc điểm sinh trưởng của cây con cấy mô khi được chuyển ra vườn ươm?

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 37

Page 38: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 38

Page 39: Bai Giang Thuc Hanh _ Nuoi Cay Mo TBTV

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Dương Công Kiên, 2000. Nuôi cấy mô thực vật. NXB Trường ĐH Khoa Học Tự nhiên.

2. Kenneth C. Torres, 1957. Tissue culture techniques for horticultural crops. Chapman & Hall, New York - London

3. Nguyễn Đức Lượng, 2002. Công nghệ tế bào. NXB ĐH Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh.

4. Nguyễn Văn Minh, 1998. Công nghệ tế bào. NXB ĐH Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh

5. Nguyễn Văn Uyển, 1993. Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống cây trồng. NXB Nông nghiệp.

6. Bùi Trang Việt, 2000. Tài liệu học tập Nuôi cấy mô thực vật. NXB ĐH Y dược Tp. Hồ Chí Minh

THÖÏC HAØNH NUOÂI CAÁY MOÂ THÖÏC VAÄT Trang 39