BD Diagnostics Preanalytical Systems
Becton Dickinson ProteomicsMunich / Germany
Becton Dickinson ProteomicsMunich / Germany
Dipl. Biol. Monika HauptmannDipl. Biol. Monika Hauptmann
BD Diagnostics Preanalytical Systems
BD™ Free Flow Electrophoresis SystemBD™ Free Flow Electrophoresis System
Des particules aux molécules:Séparation en haute résolution dans un milieu
liquide
Des particules aux molécules:Séparation en haute résolution dans un milieu
liquide
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Les paramètres de séparation
Les Les paramparam èètrestres de de ssééparationparation : : charge, dimension, charge, dimension, poidpoid molmol ééculaireculaire , , solubilitsolubilit éé
Gel de Gel de polyacrylamidepolyacrylamide
MatriceMatricede de chromatographiechromatographie
Sans Sans matricematrice
Cen
trifu
gatio
n
Sans Sans matricematrice
Chr
omat
ogra
phie
HPLCHPLC
Fre
e F
low
Ele
ctro
phor
èse
ZE ZE -- FFEFFEIEF IEF -- FFEFFEITP ITP -- FFEFFE
Gel
-É
lect
roph
orès
eIEF IEF –– PAGEPAGESDS SDS -- PAGEPAGE(2D (2D -- PAGE)PAGE)
4
� Electrophorèse dans un flotcontinu liquide sans matricesolide
� Conditions du flot
- Solutions aqueuses
- Flot continu
- Film fin / conditions laminaires
- Entre deux plaques parallèles
� Champ électrique perpendiculaireau flot laminaire
- Chambre de séparation encadréedes électrodes
� Séparation: déflexion des molécules chargésperpendiculairement au flot
Principe du FFE
5
ZE-FFE(charge)
Zone Electrophoresis
pH
Séparation des organelles et
protéines selon leursdensités de charge
pH
ITP-FFE(mobilité électrophoretique)Isotacho- Electrophoresis
Méthode spécifique pour protéines, peptides et
organelles
Les différents modes de separation du FFE
IEF-FFE (point isoélectrique) Isoelectric Focusing
Séparation des protéines et peptides
selon le pI
pH
6
Séparation des molécules chargées et chargeable
Protéines solublesProtéines complexesProtéines membranairesIsoformes de protéinesPeptidesOrganellesCellules/VirusParticules chargéesAutres
Échantillons complexes(liquides corporels, extraitscellulaires, tissus de toute
origine, protéinesrecombinées)
Séparation, purification,enrichissement
Une technologie à haute résolution: séparation des diverses molécules d’un échantillon complexe
Analyse(Compatibilité avec
les différentestechniques d’analyse)
Essai immunologique(ELISA)Essai enzymatiqueGel – ÉlectrophorèseChromatographieSpectroscopieSpectrométrie de masseCytrométrie en flux
7
Caractéristiques
• Séparation en vrai milieu liquide
• Fractionnement dans uneplaque de 96 puits
• Conditions natives oudénaturantes
• Application permanente de l’échantillon
• Séparation de toutesmolécules chargées et chargeable
• Conditions de séparationstables
Avantages
Pas d’interaction avec une matrice solide� pas de pertes non spécifiques� Gain de temps
Haute résolution(p.ex. pour séparation des isoformes)
Préservation des activités biologiques en utilisant des conditions natives
Échantillon en quantités analytiques et préparatives
Beaucoup d’applications possible:organites, protéines membranaires, phospho-peptides, complexes de protéines, etc…
Bonne reproductibilité
BD™ Free Flow Electrophoresis
8
The BD™ Free Flow Electrophoresis System
Application: Exemples et Résultats
1. Séparation des organelles (ZE – FFE)Amélioration de la pureté et de l’intégrité des mitochiondriesSéparation des sous-populations (mitochondries, peroxisomes)
2. Séparation des protéines (IEF – FFE / ZE – FFE)Séparation de mixture complexeDouble séparation par le FFE: 1) séparation des protéines (dépletion d’albumine),2) séparation des peptides (2D – FFE)Séparation des protéines membranairesSéparation des isoformes
3. Séparation des peptides (IEF – FFE)
9
1. Les avantages du FFE pour la séparation des organelles
FFE
Centrifugation
Extrait cellulaire
Le FFE permet la purification et l’enrichissement des organelles intactes et de leurs sous-populations donnant accès à une analyse des so us-protéomes
Enrichisse-ment
Purité Intégrité
Accès aux sous-populations
10
1. FFE – Amélioration de la pureté et de l’intégrité de s mitochiondries
contamination mitochondries purifiées
FFE
Résumé:� La séparation native maintient le contexte biologique et permet des recherches
fonctionelles� Haute pureté: Dépletion de protéines non-mitochondriales et tronquées� Reduction significative des protéines degradées grace à l’élimination des
protéases endogènes
� Enrichissement des organelles due à l’application continue de l’échantillon
Zischka et al., Proteomics 2003
Un concentré des mitochondriesaprès centrifugation
FFE fraction 41: organitespures, intactes et enrichies
F41
11
L’Hétérogénéité des mitochondries cardiaques
Traitement des mitochondriesintactes avec du calcium
Centrifugation
FFE
Professor Peipei Ping & Dr. Oliver DrewsCardiac Proteomics & Signaling Laboratory, David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA
Résumé: �Des sous-populations dont l’état physiologique est modifié sont séparées par
FFE�Une séparation en haute résolution des mitochondries intactes dont l’activité
biologique est préservée
EM 19,000x
FFE fraction I FFE fraction II
12
La composition protéique de la membraneextérieure détermine la migration des mitochondries
Fractionnement (Lac = Lactate, Glu = Glucose)
Zischka et al.; MCP 2006
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63
Glu
Lac
Glumitochondrie: respiration diminuée
Lac mitochondrie:respiration élevée
OD
260
nm
Résumé:� Le FFE sépare différentes populations mitochondriales
13
Séparation des sous-populations de peroxisome
FFE
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94
Fraction No.
Cat
alas
e as
say
BU
/ml
Résumé:� Séparation en haute résolution des sous-populations qui diffèrent en structure, en contenu protéique et en
activité biologique� Les conditions de séparation natives conservent la structure et la fonctionnalité des organelles� L’hétérogénéité des organelles pourrait être un marqueur de pathologies
peroxisomes du foie de rat après centrifugation
Deux sous-populations de peroxisome séparées et purifiées
Détection des sous-populations par l’utilisation de l’activité d’un marqueurendogène peroxisomal (catalase)
Sous-population I
Sous-population II
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2. Les étapes essentielles de la protéomique
Prélèvement&
Préservation del‘échantillon
SéparationIdentification etCaractérisationdes Protéines
Analyses des données&
Bioinformatique
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Séparation des mixtures complexes avec des gradients de pH linéaires: Accéder aux protéines peu abondantes
2D-PAGE (pH 3-10)
Extrait entier surun gelenv. 2000 spots
Extrait cellulaire
FFE
Analyse de 2D-PAGE des fractions acides du FFE (pH 3- 10)
F35 F37 F38 F39 F40F36
chaquechaque fraction fraction contientcontient envenv . 50 . 50 protéinesprotéines
16
MS
FFE "Dépletion d’albumine"
FFE Peptides
Le plasma d’origine humaine – séparation en 2D avec le FFE
0
2
4
6
8
10
12
14
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
FFE fraction number
pH
Exp 1
Exp 2
Exp 3
Plasma
0
2
4
6
8
10
12
14
1 11 21 31 41 51 61 71 81 91
FFE fraction number
pH
Exp 1
Exp 2
Exp 3
Digestion
Albumine
17
Identification de protéines peu abondantes du plasma(pH 4 - 5)
17 ng/mL
30 ng/mL
94 ng/mL
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IM enrichment
Enrichissement des protéines membranaires
Enrichissement des membranes de plaquettes selon leur c omposition en protéines membranaires
Comparaison de 3 methodes différentes pour enrichir les protéines membranaires
• Lectin affinity chromatography (WGA)
• Biotin/NA affinity chromatography
• Free Flow Electrophoresis
221
0
3515 5
352910
316520
PMIM
other
Total 23 55 190
Résumé:
� Le FFE permet l’identificationd’un plus grand nombre de protéinesmembranaires� La séparation des protéinesmembranaires plasmatiques et des protéines membranaires internes nepeut se faire que par l’utilisation du FFE
WCL: controlPM: plasma membraneIM: inner membrane
Senis et al. (2007) Mol. Cell Proteomics. Copyright by the Am Soc Biochem Mol Biol, Inc. Reproduced with permission
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Séparation des complexes membranaires
Résumé: • La seule méthode pour séparer
des complexes membranairesen quantité suffisante et en étatintact en solution
• Compatibilité avec toutes les méthodes en aval due a des tampons sans détergent
• Nouvelle approche (ZE – FFE) pour une solubilité amélioréeet une résolution optimisée
• Flexibilité pour combiner diverses conditions de pH et garantir une isolation optimaledes complexes
S 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
I (1000)V (700)III (490)
IV (200)
II (130)
a-e
pH 7.6
I (1000)V (700)III (490)
IV (200)
II (130)
a-e
S 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66
pH 4.5
Legend:I (NAD Dehydrogenase), II (Succinate Dehydrogenase), III (Cytochrome bc 1), IV (Cytochrome c Oxidase), V (F0F1-ATP-Synthase), a-e (supercomplexes (I 1III2IV0-4))
II (Succinat Dehydrogenase)
V (FoF1 ATP-Synthase)
IV (Cytochrom c Oxidase)
Séparation des complexes de la chaîne respiratoire en pH 7.6 et 4.5� Les solutions natives permettent de conserver des complexes membranaires intactes� Les complexes qui ont différentes densités de charges migrent de façon distincte sous
deux conditions de pH
FFE Fractions
FFE Fractions
20
Résumé:
� La séparation en haute résolutiondes isoformes d’anticorps estfacilitée par un gradient de pH étroit
� Des gradients sont disponibles pour des applications spécifiques (acide, neutre et basique)
La Séparation des Isoformes
pH 6.89 pH 7.03
Fraction: 28 30 32 34 36 38 40 42 44
avantFF
E
Anticorps purifiés IEF-FFEpH- Gradient 6-8
IEF-Native-PAGE
-
+
Point isoélectrique
21
Enrichissement des Isoformes
6,0--
pI
5,3--
4,5--
4,2--
3,5--
M S 49 52 54 56 59
IEF-FFEGradient pH 3-4
Amyloglucosidase (90 kDa)
IEF-Native-PAGE
Amylogucosidaseisoformes
+
-
point isoélectrique
before FF
E
Résumé:
� Gradient de 1 unité de pH en région acide (pH 3 – 4)
� Séparation de plusieursisoformes d’une protéine acide
22
Les avantages du FFE pour la séparation des protéines
� Accès aux protéines peu abondantes (FFE: une dimension supplémentaire avant le 2D-PAGE et la chromatographie )
� Séparation en haute résolution de protéines en utilisa ntdivers gradients de pH étroits
� Séparation de protéines aux propriétés extrêmes:- protéines très acides et basiques- isoformes avec des points isoélectriques similaires- protéines avec des hauts poids moléculaires- protéines membranaires hydrophobes
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3. Préfractionnement de peptides avec le FFE pour un emeilleure identification par MS
HPLC(IEX)
In-gel Digest
FFE
HPLC(RP)
HPLC(RP)
Digest
FFE HPLC(RP)
LC-MALDI
ElectrosprayDigest
Conventional workflowfor in-solution digest
FFE workflow forin-solution digest
FFE workflow forin-gel digest
HPLC(IEX)
In-gel Digest
FFE
HPLC(RP)
HPLC(RP)
Digest
FFE HPLC(RP)
LC-MALDI
ElectrosprayDigest
Conventional workflowfor in-solution digest
FFE workflow forin-solution digest
FFE workflow forin-gel digest
Protocole de pré-fractionnement
Le préfractionnement avec le FFE permet l’identificat ion de plus de peptides: ~ 10 000 peptides uniques
Malmström et al.; 2006
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Conclusions
� La réduction de la complexitédes échantillons
� De creuser plus profondementdans le sous-protéome
� L‘enrichissement de protéinespeu abondantes
� La séparation et le maintien du contexte biologique
BD™ Free Flow Electrophoresis System permet:
BD and BD Logo are trademarks of Becton, Dickinson and Company. ©2006 BD
Le FFE est une méthode de séparation polyvalente
25
26
27
Versatility and Compatibility
PeptidesModified peptidesProteinsProtein complexesProtein isoformsOrganelles
Nanoparticlesetc……
pH rangeResolutionDenaturingNativeetc……
LC-MSMALDI-TOFELISAEnzyme assaysHPLCetc……
DifferentFFE Protocols
DifferentSamples
DifferentAnalyses
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Compatibility – Native separations
• Native separations:• Media components
• Prolytes
• HPMC
• Glycerol
FFESample Preparation
Sample Preparation
Further Separation
orAnalysis
Further Separation
orAnalysis
• Directly compatible with:• Gel-based analysis
• ELISA assays
• Enzyme activity assays
• Flow cytometry
Sample types: protein complexes, protein purification, plasma, isoforms, etc.
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Compatibility – Denaturing separations
• Denaturing separations:• Media components
• Prolytes• Mannitol• Urea/Thiourea
FFESample Preparation
Sample Preparation
Further Separation
orAnalysis
Further Separation
orAnalysis
• Compatible with:• LC-MS/MS
• MALDI-TOF
Sample types: peptides, plasma, cell lysates, complex protein mixtures, etc.
FFE Fractions Red/Alk Digestion Clean-up MS
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Protein Concentration Range
Normally 1-5mg/ml, as low as 50µg/ml possible.
Normal Run Time
30 minutes per sample, as low as 5 minutes possible.
Minimum Sample Volume
50-100µl.
Dilution Factor
1 in 1, but dependent on set-up (pH range, sample load etc).
Technical Notes
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Resolution (IEF mode)
0.1 pH units, 0.03 pH units possible.
Number of wells per protein
1 or 2, dependent on set-up.
Recovery Rate
Typically >90%, each protein has unique adsorption properties.
Technical Notes
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The chemical and physical properties of the sample and separation media should be as similar as possible:
� Density
� Viscosity
� Conductivity
� Temperature
Solution:
Dissolve the sample in separation media
OR
Dilute the sample with separation media
Sample Preparation: General Considerations
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Rule of thumb (IEF):
Total salt concentration of sample < 25mM
Solution:
Dilute or desalt your sample if the conductivity is too high!
Sample Preparation: Salt Concentration
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Tolerable Additives:
� 8M Urea or 7M thiourea/2M urea
� Nonionic or zwitterionic detergents like CHAPS, CHAPSO, Digitonin, DDM, Octyl-β-D-glucoside, Triton-X-100
� Lower concentrations of salts
� Sucrose
� DTT
� ….. and many more….
Sample Preparation: Additives
35
Reproducibility
0
2
4
6
8
10
12
14
9686766656463626166
FFE fraction number
pH
4455p2
4455p3
4455p4
4455p5
4455p6
• 3 experiments at three different days (all within one week)• Gradient: pH 3-8 urea, mannitol• pI-marker test: 35 min, 2h, 3h, 4h, 5h• Liver lysate separated at: 35 min, 2h, 3h, 4h, 5h
36
M S 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 M S
188
98
6249
3828
1714
6
3
kDa
M S 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 M S
188
98
6249
38
28
1714
6
3
kDa
M S 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 M S
188
98
6249
3828
1714
6
3
kDa
M S 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 M S
188
98
6249
3828
1714
6
3
kDa
M S 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 M S
188
98
6249
3828
1714
6
3
kDa
4465 35min
4465 2h
4465 3h
4465 4h
4465 5h
Reproducibility (cont.)