PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE MINAS GERAIS
Programa de Pós-graduação em Odontologia
REAÇÕES TECIDUAIS À CERÂMICA BETA-TRICÁLCIO
FOSFATO CERASORB® M DENTAL EM DEFEITOS ÓSSEOS
COBERTOS COM MEMBRANA DE COLÁGENO EM RATOS
LEONARDO AVELLAR LANZA
Belo Horizonte
2011
9
Leonardo Avellar Lanza
REAÇÕES TECIDUAIS À CERÂMICA BETA-TRICÁLCIO FOSFATO
CERASORB® M DENTAL EM DEFEITOS ÓSSEOS COBERTOS COM
MEMBRANA DE COLÁGENO EM RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Implantodontia. Orientador: Prof. Dr. Paulo Eduardo Alencar de Souza Co-orientador: Prof. Dr. Élton Gonçalves Zenóbio
Belo Horizonte
2011
FICHA CATALOGRÁFICA Elaborada pela Biblioteca da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais
Lanza, Leonardo Avellar L297r Reações teciduais à cerâmica beta-tricálcio fosfato cerasorb® m dental em
defeitos ósseos cobertos com membrana de colágeno em ratos / Leonardo Avellar Lanza. Belo Horizonte, 2011.
60f. : il. Orientador: Paulo Eduardo Alencar de Souza Co-orientador: Élton Gonçalves Zenóbio Dissertação (Mestrado) – Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais.
Programa de Pós-Graduação em Odontologia. 1. Regeneração óssea. 2. Fosfato. 3. Colágeno. I. Souza, Paulo Eduardo
Alencar de. II. Zenóbio, Elton Gonçalves. III. Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. VI. Título.
CDU: 616.314-089
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho
Aos meus pais, pelo amor, carinho e pelo incentivo que nunca me faltaram.
Às minhas irmãs Cau e Dani, pela compreensão e carinho.
Aos meus sobrinhos Tiago, Pedro e Gabriel, por alegrarem a minha vida.
À Dani, pelo amor, companheirismo e compreensão, por ter estado ao meu
lado durante toda essa jornada, amparando-me sempre nos momentos mais
turbulentos. Soube ser paciente na minha ausência e fundamental nesta conquista.
Ao Luca, pelo amor incondicional, pela alegria, por ser hoje a razão de tudo o
que faço.
9
AGRADECIMENTOS
À Deus, por iluminar sempre o meu caminho, orientando-me em todos os
momentos.
Ao Paulo Eduardo, meu orientador, pela dedicação e empenho, por ter se
entregado de corpo e alma nesse projeto, por ter realmente vestido a camisa, não
medindo esforços para a conclusão desse nosso trabalho, mesmo em um momento
importante de sua vida, o meu muito obrigado.
Aos professores do curso, pelos ensinamentos prestados.
Às funcionárias do laboratório de patologia, Reni e Andréa, pelo trabalho e
disponibilidade em me ajudar.
Aos meus colegas de turma, pelos anos de convivência, fazendo com que nos
tornássemos uma família, dividindo as alegrias e tristezas. Que continuemos sempre
fortes, nos atualizando-nos continuamente nos nossos grupos de estudo.
Aos alunos da iniciação científica Polyana, Guilherme, Cláudio e Marco, pela
dedicação e empenho neste trabalho.
Aos meus eternos gurus, meus professores vitalícios, Lincoln e Marcos
Lanza, por tudo o que fizeram e fazem por mim, que vibram com minhas vitórias e
me amparam em meus desalentos. Sou eternamente grato a vocês.
10
RESUMO
As cerâmicas beta-tricálcio fosfato (β-TCP) têm sido amplamente utilizadas como
materiais para enxertia óssea. Nos últimos anos, foram desenvolvidas cerâmicas β-
TCP cujas partículas apresentam poros de tamanhos variados e interconectados, o
que, segundo estudos, possibilita melhor invasão por células e vasos sanguíneos
contribuindo para a aceleração da neoformação óssea concomitante à degradação
das partículas. Cerasorb® M DENTAL é uma cerâmica β-TCP, disponível em
grânulos irregulares com poros interconectados e alto nível de aspereza, que tem
sido amplamente utilizada em Odontologia. Entretanto, são escassos os estudos na
literatura inglesa sobre seu comportamento em sítios ósseos de enxertia. O objetivo
desse trabalho foi realizar revisão de literatura sobre cerâmicas β-TCP e avaliar
histologicamente os efeitos do Cerasorb® M DENTAL no processo de reparo de
defeitos ósseos em ratos. Para isso, foram criados dois defeitos ósseos no fêmur de
30 ratos Wistar. Em 15 animais, os defeitos foram preenchidos com coágulo
sanguíneo e nos outros 15 com o β-TCP. Em cada animal, um dos defeitos foi
coberto com membrana de colágeno (OsseoGuard™ Biomet 3i). Os animais foram
sacrificados após 15, 30 ou 60 dias e a análise histológica revelou maior formação
óssea no grupo teste quando comparado ao controle, após 60 dias, formação óssea
ao redor das partículas do biomaterial e no interior dos poros interconectados e
ausência de células gigantes multinucleadas ao redor das partículas envoltas por
tecido ósseo. A membrana de colágeno manteve-se íntegra durante todo o tempo
experimental e inibiu a formação de tecido conjuntivo fibroso ao redor das partículas
de β-TCP, as quais ainda podiam ser observadas após 60 dias. Nossos resultados
mostram que Cerasorb® M DENTAL suporta a neoformação óssea no interior dos
poros e ao redor de suas partículas, estimula formação de matriz óssea em área de
tecido não mineralizado e sua degradação parece ocorrer por dissolução química e
não através de reabsorção por células osteoclásticas.
Palavras chave: Reparo ósseo. Beta-tricálcio fosfato. Membrana de colágeno.
Estudo histológico.
11
ABSTRACT
The ceramic beta-tricalcium phosphate (β-TCP) has been widely used as materials
for bone grafting. In recent years, ceramics have been developed whose β-TCP
particles have pores of various sizes and interconnected, which, according to studies,
allows improved cell invasion by blood vessels and contributing to the acceleration of
bone formation concomitant degradation of the particles. Cerasorb ® M DENTAL is a
β-TCP ceramic, available in irregular granules with interconnected pores and high
roughness, which has been widely used in dentistry. However, there are few studies
in English literature about their behavior at sites of bone grafting. The aim of this
study was to review literature on β-TCP ceramics and histologically evaluate the
effects of Cerasorb ® M DENTAL the repair process of bone defects in rats. For this,
two bone defects were created in the femur of 30 rats. In 15 animals the defects were
filled with blood clot and the other 15 with β-TCP. In each animal, one defect was
covered with collagen membrane (OsseoGuard™ Biomet 3i). The animals were
sacrificed after 15, 30 or 60 days and histological analysis revealed a greater area of
bone formation in the test group compared with the control after 60 days, bone
formation around the biomaterial particles and within the interconnected pores and
absence of cells multinucleated giant around the particles surrounded by bone tissue.
The collagen membrane remained intact throughout the experimental period and
inhibited the formation of fibrous connective tissue around the β-TCP particles, which
were still observed after 60 days. Our results show that Cerasorb ® M DENTAL
supports bone formation within the pores and around the particles, stimulates
formation of bone matrix in non-mineralized tissue area and its degradation appears
to occur by chemical dissolution and not through resorption by osteoclastic cell .
Key words: Bone regeneration. Beta-tricalcium phosphate. Collagen membrane.
Histological study.
LISTA DE ARTIGOS
Esta dissertação gerou as seguintes propostas de artigos:
Artigo 1:
Cerâmicas beta-tricálcio fosfato na Odontologia: revisão de literatura.
Artigo 2:
Reações teciduais ao beta-tricálcio fosfato Cerasorb® M DENTAL em defeitos
ósseos em fêmur de ratos.
8
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .........................................................................................................9
ARTIGO 1 .................................................................................................................12
ARTIGO 2 .................................................................................................................30
REFERÊNCIAS.........................................................................................................59
9
1 INTRODUÇÃO
Periodontite avançada, infecção endodôntica, traumas causados por
acidentes, defeitos congênitos, reabsorção pós-exodontia, bem como a combinação
de todos esses fatores podem causar o comprometimento do rebordo alveolar
(ALVIN et al. 2004).
Após exodontia, ocorre formação de coágulo sanguíneo no alvéolo dentário,
inflamação e estímulo para posterior formação óssea. Entretanto, o processo de
reparo não permite a restituição integral do volume inicial do osso alveolar. Além
disso, uma reabsorção fisiológica inevitavelmente conduz a uma maior diminuição
da altura e espessura ósseas. Essa perda óssea é mais pronunciada na região
vestibular do que nas regiões palatina e lingual (JOHNSON, 1969; SCHROPP et al.,
2003). Por este motivo, diferentes técnicas têm sido empregadas com o intuito de
preservar ou melhorar a dimensão e o contorno do rebordo pós-exodontia, incluindo-
se o uso de implantes, de materiais de enxerto ou membranas (DOUGLASS et al.
2005; IRINAKIS et al. 2007; ARAÚJO et al. 2008).
Os enxertos ósseos se dividem em quatro categorias principais: autógenos,
alógenos, xenógenos e aloplásticos, sendo que o osso autógeno é considerado o
padrão ouro na regeneração óssea, devido ao seu potencial osteogênico de
osteoindução e osteocondução. No entanto, o procedimento de coleta requer um
segundo sítio cirúrgico, onde complicações são relatadas e a quantidade de osso
colhida é limitada. Além disso, os enxertos de osso autógeno são altamente
reabsorvidos e frequentemente degradados antes do reparo ósseo estar completo
(BURCHARDT et al., 1987; HELM et al., 2001; RAJAN et al., 2006; ZARATE-
KALFOPULOS et al., 2006; FELLAH et al., 2008). Já os xenoenxertos, em especial o
osso bovino, também conhecido como osso mineral natural, são amplamente
utilizados, consistindo de um arcabouço ósseo inerte de estrutura tridimensional
semelhante à matriz óssea mineralizada (SCHWARZ et al., 2007).
Na tentativa de se encontrar um substituto ósseo ideal, diversos materiais
aloplásticos têm sido pesquisados. Estes devem apresentar as seguintes
propriedades físico-químicas: biocompatibilidade, reabsorbilidade, degradação
10
controlada e substituição simultânea por novo osso formado, osteocondução e
integridade mecânica, a fim de suportar a cicatrização após os procedimentos de
regeneração óssea guiada (SCHWARZ et al., 2007).
As cerâmicas de fosfato de cálcio são reconhecidamente biocompatíveis e
possuem propriedades bioativas. Apresentam constituição química inorgânica
semelhante à do osso natural, o que as torna substitutos ósseos promissores nos
campos ortopédico e maxilofacial (FELLAH et al., 2007). Existem várias marcas
comerciais e as diferenças entre elas são devidas a algumas propriedades, tais
como a proporção cálcio/fosfato, cristalinidade, temperatura de sinterização e outras
características físicas. A hidroxiapatita (HA) [Ca10(PO4)6(OH)2] e o beta-tricálcio
fosfato (β-TCP) [Ca3(PO4)2] são cerâmicas fosfato de cálcio largamente utilizadas.
Estes biomateriais são atóxicos e apresentam ótima atividade osteocondutiva. Eles
se diferem não apenas na composição, mas também na taxa de degradação de
suas partículas. As cerâmicas β-TCP são constituídas praticamente de cálcio e
fosfato e suas partículas são mais rapidamente reabsorvidas que as de
hidroxiapatita, as quais podem permanecer por vários anos em meio ao osso
neoformado (MANJUBALA et al., 2002; DACULSI et al., 2003). Diferentes estudos
têm mostrado que a utilização de cerâmicas β-TCP em fase pura possibilita a
preservação das dimensões dos alvéolos pós-exodontias, através da dissolução
gradativa e completa de suas partículas com concomitante substituição por tecido
ósseo neoformado (TRISI et al., 2003; ARTZI et al., 2004).
O Cerasorb® é uma cerâmica β-TCP que consiste unicamente de cálcio e
fosfato na proporção de 1:5 e tem sido amplamente utilizado como material de
enxerto em diversos sítios anatômicos. O Cerasorb® M DENTAL é um produto
relativamente novo no mercado e tem como características: a multiporosidade
aberta e interconectada com micro, meso e macroporos (5 µm a 500 µm);
porosidade total de 65%; estrutura granular poligonal e reabsorção completa
simultânea à nova formação óssea (CURASAN, 2007). Segundo informações do
fabricante, os grânulos do material apresentam elevada aspereza o que contribui de
forma significativa para a invasão por células osteoblásticas e fluidos teciduais,
acelerando o processo de ossificação (CURASAN, 2007).
Na literatura são escassos os trabalhos avaliando as reações teciduais bem
como o potencial osteocondutivo do Cerasorb® M DENTAL. O estudo da cinética de
11
degradação deste biomaterial e da qualidade, quantidade e integração dos tecidos
formados em torno de suas partículas são importantes para a avaliação do efeito
das novas alterações nas estruturas das partículas de β-TCP nos processos de
neoformação tecidual em defeitos ósseos.
12
ARTIGO 1
Cerâmicas beta-tricálcio fosfato na Odontologia: re visão de literatura.
Leonardo Avellar Lanza
Élton Gonçalves Zenóbio
Paulo Eduardo Alencar de Souza
Programa de Pós-graduação em Odontologia, Departamento de Odontologia da
Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais.
RESUMO
Fatores como exodontias, doença periodontal, traumatismos, podem levar a uma
reabsorção do osso alveolar. Diversas técnicas, descritas na literatura, tem sido
empregadas com o objetivo de minimizar o processo de reabsorção do osso alveolar
pós-exodontia. Alguns estudos comprovam a eficácia do preenchimento do alvéolo
pós-exodontia com materiais aloplásticos, preservando as dimensões do rebordo.
Estes biomateriais devem apresentar as seguintes propriedades físico-químicas:
biocompatibilidade, reabsorbilidade, degradação controlada e substituição
simultânea por novo osso formado, osteocondução e integridade mecânica a fim de
suportar a cicatrização após os procedimentos de regeneração óssea guiada. As
cerâmicas beta-tricálcio fosfato (β-TCP) têm sido amplamente utilizadas para
preenchimento de defeitos ósseos com resultados clínicos satisfatórios. Diferenças
na composição química e estrutura das partículas das cerâmicas de fosfato de cálcio
podem influenciar as respostas teciduais, a velocidade e a quantidade de
neoformação óssea. O objetivo deste trabalho foi realizar uma revisão de literatura
abordando estudos histológicos e clínicos, em modelos animais e em humanos,
sobre as reações teciduais e comportamento de diferentes cerâmicas β-TCP,
utilizadas como preenchimento para reparo ósseo.
Palavras chave: Biomaterial. β-tricálcio fosfato. Reparo ósseo.
13
ABSTRACT
Factors such as extractions, periodontal disease, trauma, may lead to alveolar bone
resorption. Various techniques, described in the literature, have been employed in
order to minimize the absorption of alveolar bone after tooth extraction. Some studies
show the effectiveness of filling the alveolus after extraction with alloplastic material,
preserving the dimensions of the ridge. These biomaterials must have the following
physicochemical properties: biocompatibility, degradability, degradation controlled
and simultaneous replacement by newly formed bone, osteoconductive and
mechanical integrity to support healing after guided bone regeneration procedures.
The ceramic beta-tricalcium phosphate (β-TCP) has been widely used to fill bone
defects with satisfactory clinical results. Differences in chemical composition and
structure of its particles can influence tissue responses and the speed and amount of
new bone formation. The aim of this study was review clinical and histological studies
in animal models and humans, on the tissue reactions and behavior of different β-
TCP ceramics, used as filling for bone repair.
Key words: Biomaterial. β-tricalcium phosphate. Bone remodeling.
14
INTRODUÇÃO
A principal alteração que ocorre para a redução do rebordo residual é a perda
óssea. Segundo Atwood (1971), estudos cefalométricos têm mostrado a perda
óssea em volume que ocorre pela face vestibular, palatina e na crista do rebordo.
Esse rebordo vai reduzindo em altura, eventualmente desaparecendo, devido à
perda óssea vertical, chegando até a formar uma depressão.
As reações teciduais que ocorrem no interior do alvéolo após a exodontia,
resultando no seu preenchimento por tecido ósseo neoformado capaz de resistir à
pressões mastigatórias, constituem o processo de reparo (CARVALHO et al., 1998;
LEONEL et al., 2003).
Os biomateriais utilizados para preenchimento de alvéolos dentários
apresentam propriedade de osteocondução, ou seja, funcionam como substrato para
a implantação de osteoblastos e deposição de matriz óssea, permitindo a formação
de trabéculas ósseas em meio às partículas do material (BALLA et al., 1991). O
processo de neoformação óssea se inicia na periferia da área de enxerto, através da
diferenciação de células mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos e sua
migração em direção ao biomaterial. As partículas dos biomateriais podem ser
dissolvidas pela ação de macrófagos através de fagocitose e redução do pH nos
fagolisossomos. Os íons cálcio e fosfato liberados do biomaterial estimulam a
nucleação secundária de hidroxiapatita favorecendo a mineralização da matriz óssea
(ORLI et al., 1989). Assim, o tecido ósseo é formado e sofre processo de
remodelação com participação de osteoblastos e osteoclastos.
A neoformação óssea pode ocorrer através dos mecanismos de osteogênese,
osteoindução ou osteocondução. A osteocondução é caracterizada pelo crescimento
ósseo por meio de aposição de osso circunjacente, porém é necessária a presença
de células ósseas ou mesenquimais diferenciadas locais (OKAMOTO e TRENTO,
2002). Dentre os materiais osteocondutores, pode-se destacar os materiais
aloplásticos e os xenógenos. A osteoindução é o processo pelo qual células
indiferenciadas são induzidas à transformação em osteoblastos, responsáveis pela
neoformação óssea, sob a influência de um ou mais agentes indutores. Os materiais
osteoindutores mais comuns são os enxertos autógenos. A osteogênese refere-se
ao crescimento ósseo derivado das células viáveis, transferidas dentro do enxerto. O
15
osso autógeno é o único material osteogênico e o melhor material para enxerto
(OKAMOTO e TRENTO, 2002). Para que estes mecanismos ocorram, se faz
necessário o uso de materiais de preenchimento, para auxiliar a união das corticais
ósseas vestibular e palatina e para estimular a regeneração ou reparo. Dentre os
materiais usados no preenchimento de defeitos ósseos destacam-se enxertos
ósseos autógenos, alógenos, xenógenos e aloplásticos (LEONEL et al., 2003).
Esses últimos são materiais sintéticos desenvolvidos para uso biomédico e têm
como função a substituição de tecidos vivos perdidos ou danificados (LEONEL et al.,
2003). Esses materiais precisam possuir características químicas, físicas e
biológicas compatíveis com os tecidos do receptor (LEONEL et al., 2003).
Atualmente, há uma grande busca pelo desenvolvimento de novos biomateriais.
COMPORTAMENTO DAS CERÂMICAS β-TCP E REAÇÕES TECIDUAIS EM SÍTIOS DE IMPLANTAÇÃO
As cerâmicas de fosfato de cálcio são reconhecidamente biocompatíveis, com
propriedades bioativas e constituição química inorgânica semelhante à do osso
natural (FELLAH et al., 2007). As diferenças entre as várias marcas comerciais se
devem a proporção cálcio/fosfato, cristalinidade, temperatura de sinterização e
outras características físicas, o que pode influenciar os resultados biológicos
(LEGEROS et al., 2003). A hidroxiapatita (HA) [Ca10(PO4)6(OH)2] e o beta-tricálcio
fosfato (β-TCP) [Ca3(PO4)] são cerâmicas fosfato de cálcio largamente utilizadas
com ótima atividade osteocondutiva (MANJUBALA et al., 2002; DACULSI et al.,
2003). Além de apresentarem diferenças na composição química, a hidroxiapatita é
pouco ou não reabsorvível, enquanto o β-TCP é mais prontamente reabsorvido
(WANG et al., 2005). Outro tipo de TCP é o α-TCP, uma modificação cristalina da
cerâmica β-TCP, com porosidade em torno de 40% e poros que não se comunicam
(WILTFANG, 2002). As cerâmicas α-TCP, quando entram em contato com fluidos
teciduais, se transformam em hidroxiapatita, não sofrendo por isso o processo
completo de reabsorção (MERTEN, 2000).
Diversos estudos têm avaliado clínica e histologicamente os efeitos da
implantação de cerâmicas de fosfato de cálcio em diferentes sítios anatômicos.
Embora a velocidade de neoformação óssea possa ser influenciada com a utilização
16
de biomateriais para preenchimento, clinicamente, vários trabalhos mostram que o
uso destes ou de membranas oclusivas em alvéolos frescos têm resultado em
menores perdas teciduais nos sentidos ápico-coronários e vestíbulo-linguais dos
processos alveolares, quando comparados a controles onde não foram realizadas
quaisquer das técnicas regenerativas (LEKOVIC et al., 1997; ARTZI et al., 2000;
IASELLA et al., 2003; SERINO et al., 2003). Por outro lado, alguns autores não
verificaram diferenças clínicas significativas quando comparados a alvéolos ou
defeitos ósseos preenchidos com coágulo sanguíneo apenas (CAMARGO et al.,
2000; TRISI et al., 2003; ZUBILLAGA et al., 2003). Além disso, exames histológicos
de amostras de alvéolos frescos preenchidos com biomateriais mostraram, com
freqüência, remanescentes residuais de cerâmica não degradados ou reabsorvidos,
mesmo após longos períodos de implantação (NORTON et al., 2003; FROUM et al.,
2004; THOMPSON et al., 2006; BECKER et al., 1996; ARTZI et al., 2000; FROUM et
al., 2002; CARMAGNOLA et al., 2003).
Em 2004, Kondo e colaboradores criaram defeitos ósseos na diáfise de
fêmures de ratos e os preencheram com β-TCP de fase pura. Após quatro dias,
análises histológicas mostraram presença de fibroblastos permeando partículas do
biomaterial. Formação óssea circundando a área de enxerto foi observada após sete
dias e neoformação óssea com angiogênese entre as partículas após 14 dias. A
formação de osso medular foi visualizada após 28 dias e degradação das partículas
com substituição por tecido ósseo foi evidente após 56 dias, sugerindo que β-TCP
de alta pureza apresenta ótima capacidade osteocondutiva e que sua degradação
ocorre concomitantemente à neoformação óssea.
Wiltfang et al. (2002) realizaram um estudo, em que criaram defeitos ósseos
na tíbia de mini pigs e preencheram os defeitos com α-TCP ou β-TCP. Logo em
seguida, foram instalados implantes ITI (Straumann) e, após 46 semanas, os autores
ainda observaram uma incompleta osseointegração com os implantes instalados,
com uma taxa de contato osso-implante inferior a 25%. Embora o β-TCP tenha
mostrado taxa de reabsorção mais rápida até a vigésima semana, após 86 semanas,
95-97% de α e β-TCP haviam sido reabsorvidos. Com base nesses resultados, os
autores sugerem que o ideal é a inserção dos implantes em período mais tardio,
cerca de cinco a seis meses após preenchimento com α ou β-TCP.
17
Luder e colaboradores (2006) investigaram, através de análise histológica e
de raio-X microanalítico, réplicas de raízes feitas de β-TCP colocadas em alvéolos
de porcos pós-exodontia. Os resultados mostraram que, após 60 semanas, os
grânulos de β-TCP foram completamente removidos dos compartimentos
extracelulares, embora remanescentes tenham sido encontrados no citoplasma de
células gigantes multinucleadas. As réplicas das raízes de β-TCP foram
biocompatíveis e bioabsorvíveis e o processo de neoformação óssea foi mais
evidente nos sítios contendo partículas de β-TCP quando comparados a alvéolos
preenchidos apenas por coágulo sanguíneo.
O Cerasorb® (Curasan, Kleinostheim, Alemanha) é uma cerâmica β-TCP que
consiste unicamente de cálcio e fosfato na proporção de 1:5 e tem sido amplamente
utilizada como material de enxerto em diversos sítios anatômicos em humanos.
Diversos trabalhos têm avaliado os resultados clínicos da utilização do Cerasorb®
como material de enxerto em sítios ósseos. Trisi e colaboradores (2003) observaram
bons resultados quanto à neoformação óssea com a utilização de cerâmica β-TCP
(Cerasorb®). Sítios de implantação de β-TCP na região posterior de mandíbulas
humanas mostraram, após seis meses, completa substituição das partículas do
biomaterial por tecido ósseo com volume tecidual semelhante ao grupo controle
preenchido por coágulo sanguíneo.
Artiz e colaboradores (2004) realizaram preenchimento de defeitos ósseos
criados em mandíbulas de cães com osso bovino inorgânico (Bio-Oss) e cerâmica
porosa β-TCP (Cerasorb®). Análise histológica das amostras obtidas após 12 e 24
meses mostrou neoformação óssea evidente nos sítios preenchidos com ambos os
materiais, embora as partículas de Bio-Oss tenham ocupado grande parte do volume
tecidual. Por outro lado, apenas resíduos de Cerasorb foram observados após 12
meses e nenhum sinal de suas partículas após 24 meses, indicando completa
reabsorção do biomaterial.
Em outro estudo, em humanos, Szabó e colaboradores (2005) avaliaram o
potencial da cerâmica β-TCP (Cerasorb®) como material de enxerto substituto ao
osso autógeno. Enxertos em seios maxilares, bilateralmente, foram feitos em 20
pacientes. Cerasorb foi usado no lado experimental e osso autógeno no lado
controle, randomizadamente. Em 10 dos 20 pacientes, a reconstrução da maxila
incluiu enxerto do seio maxilar e enxerto onlay. Implantes foram colocados 6 meses
18
após os procedimentos. Histológica e histomorfometricamente, não houve diferenças
significantes entre o lado experimental e o lado controle em termos de quantidade e
velocidade de ossificação. Os autores sugerem que o Cerasorb é um material de
enxerto satisfatório, apresentando características clínicas comparáveis às do osso
autógeno.
Zijderveld e colaboradores, em 2005, conduziram um estudo clínico e
prospectivo em humanos para avaliar os resultados da utilização de β-TCP
(Cerasorb®) e osso autógeno do mento, em cirurgias de elevação do seio maxilar.
Após seis meses de cicatrização, implantes ITI foram colocados. No momento da
cirurgia de implante, biópsias foram realizadas com uma broca trefina de 3,5 mm. As
características clínicas no momento da implantação diferenciavam, especialmente
em relação à aparência clínica e à resistência da broca, entre os grupos. Entretanto,
o aumento na altura, examinado radiograficamente previamente aos implantes, foi
suficiente em todos os casos.
Resultados semelhantes foram obtidos por Suba e colaboradores (2006) que
compararam os efeitos da cerâmica β-TCP (Cerasorb®) e de enxerto ósseo
autógeno como materiais de preenchimento do seio maxilar. A membrana
Schneiderian foi cirurgicamente elevada bilateralmente pela inserção dos
biomateriais. Segundo os autores, Cerasorb provou ser um efetivo substituto ao
osso autógeno, pois, após seis meses do preenchimento com o material cerâmico, o
tecido ósseo da elevação do seio maxilar estava forte e adequado para a ancoragem
de implantes, de forma semelhante aos seios preenchidos com osso autógeno.
Zerbo e colaboradores (2005) avaliaram espécimes de biópsia de seios
maxilares aumentados com β-TCP (Cerasorb®), seis meses após os procedimentos
cirúrgicos. Análise histológica revelou formação óssea em meio ao Cerasorb e
envolvimento de algumas partículas do biomaterial por tecido conjuntivo fibroso. Por
meio de reações de imunohistoquímica, os autores identificaram numerosas células
osteoblásticas em meio ao tecido conjuntivo fibroso permeando as partículas de
Cerasorb, além de ocasionais células osteoclásticas mono e binucleadas, positivas
para a enzima fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP), no tecido conjuntivo
fibroso e na superfície das partículas de Cerasorb. As frequências de ambos os tipos
celulares diminuíram apicalmente com o aumento da distância vertical da superfície
óssea maxilar. Estes dados sugerem que as partículas de Cerasorb são capazes de
19
sustentar a invasão e diferenciação de numerosas células osteoprogenitoras e que a
escassez de osteoclastos ao redor das partículas do biomaterial pode significar que
a degradação do Cerasorb ocorra predominantemente por dissolução química.
Ainda segundo os autores, a abundante presença de células osteoblásticas em meio
ao tecido conjuntivo fibroso poderia levar à substituição gradativa, em longo prazo,
desse tecido por tecido ósseo.
Zijderveld et al. (2009) avaliaram radiograficamente, por um período de cinco
anos, mudanças a longo prazo na altura dos enxertos após cirurgia de levantamento
do assoalho do seio maxilar, utilizando dois diferentes materiais para enxertia: osso
autógeno do mento e β-TCP (Cerasorb®). Embora uma redução da altura óssea
tenha sido observada nos primeiros 18 meses em todos os pacientes, não foram
observadas diferenças significativas nas medidas de altura óssea entre os dois
grupos, em todos os tempos avaliados, sugerindo que o β-TCP apresenta
capacidade de manutenção de volume ósseo semelhante ao osso autógeno.
Com o objetivo de se obter um melhor arcabouço para o ganho de volume
ósseo e consequentemente, um melhor desempenho do que a hidroxiapatita (HA) e
o β-TCP isolados, foram desenvolvidas cerâmicas de fosfato de cálcio bifásico
(BCP), que consistem de uma mistura de HA e β-TCP (LEGEROS et al. 2003;
DACULSI et al. 2003; MANJUBALA et al., 2006). O conceito da BCP é baseado no
ótimo equilíbrio entre a fase mais estável (HA) e a mais solúvel (β-TCP). Schwarz et
al. (2007) avaliaram em um estudo em cães da raça beagle, a regeneração óssea
guiada de um defeito tipo deiscência criado cirurgicamente em implantes instalados
após um período de quatro meses de cicatrização pós-exodontia, usando cerâmica
bifásica Boneceramic (hidroxiapatita + β-TCP) ou osso natural mineral (Bioss
collagen) em combinação com uma membrana de colágeno. Após quatro e nove
semanas de reparo, análises histomorfométricas mostraram diminuição significante
do tamanho do defeito residual, aumento do contato implante-osso neoformado e
aumento da área de integração entre as partículas e tecido ósseo em ambos os
grupos. Além disso, não foi observada atividade osteoclástica na superfície das
partículas dos dois biomateriais.
Um estudo recente em humanos comparou o volume ósseo e as reações
teciduais em alvéolos humanos preenchidos com cerâmica bifásica β-TCP
(BoneCeramic) comparando com osso bovino mineral natural (Bio-Oss) (DONOS et
20
al., 2010). Todos os alvéolos foram cobertos com membrana de colágeno e, depois
de oito meses, durante a reabertura para instalação de implantes, não foram
observadas diferenças nas dimensões horizontal e vertical da crista residual em
ambos os grupos. A análise histológica dos tecidos trefinados mostrou neoformação
óssea na parte apical do fragmento obtido em contato direto com partículas de
BoneCeramic e Bio-Oss e presença de tecido conjuntivo fibroso denso ao redor das
partículas na porção coronária. Seus resultados sugerem que ambos os materiais
apresentam capacidade semelhante de manutenção do volume ósseo alveolar.
Com o objetivo de acelerar a neoformação óssea, alguns autores têm
avaliado a conjugação de biocerâmicas com fatores de crescimento. Kovács e
colaboradores, em 2003, preencheram defeitos ósseos criados em alvéolos
dentários de cães da raça beagle com β-TCP (Cerasorb®) puro ou associado a
plasma rico em plaquetas (PRP). Análise histológica após seis e 12 semanas
mostrou que a formação óssea foi maior nos sítios contendo β-TCP associado a
PRP, sugerindo que os fatores de crescimento contidos no PRP possam acelerar a
neoformação óssea em área de preenchimento com cerâmica fosfato de cálcio.
Outro estudo, avaliando defeitos ósseos periodontais em humanos preenchidos com
β-TCP associado a fator de crescimento derivado de plaquetas humanas
recombinante (RhPDGF) mostrou que a quantidade de osso neoformado foi
significativamente maior que nos defeitos preenchidos apenas com β-TCP, após três
e seis meses (JAYAKUMAR et al, 2011).
A tentativa de associação de cerâmicas TCP com colágeno para
preenchimento e estímulo da neoformação óssea também foi investigada,
recentemente. Brkovic et al. (2011) investigaram o preenchimento de alvéolos
humanos pós extração com β-TCP associado a colágeno tipo I, recobertos com
membrana de colágeno. Após nove meses, no ato da instalação dos implantes,
amostras foram trefinadas e a análise histológica revelou produção de osso vital
suficiente para receber implantes dentários. Alvéolos não recobertos por membrana
mostraram significante redução na dimensão horizontal quando comparados àqueles
recobertos, embora não tenha sido observada diferença significativa nas dimensões
verticais entre os dois grupos.
Além da composição química das cerâmicas de fosfato de cálcio, a
conformação espacial das partículas também é determinante nas reações teciduais
21
em sítios de preenchimento com esses tipos de biomateriais. A análise
histomorfométrica de cilindros de β-TCP, com diferentes tamanhos de macroporos
em suas partículas, implantados em dorso de coelhos mostrou que o tecido
conjuntivo fibroso era mais compacto e com maior volume nas partículas com poros
menores e que poros maiores, com pelo menos 400µm eram essenciais para a
neovascularização (FENG et al., 2011).
Com o intuito de acelerar e aumentar a neoformação óssea, novas
apresentações estruturais de cerâmicas β-TCP têm sido desenvolvidas, embora os
estudos histológicos sejam bastante escassos. O Cerasorb® M DENTAL é um
produto relativamente novo no mercado e tem como características: a
multiporosidade aberta e interconectada com micro, meso e macro poros (5 µm-500
µm); porosidade total de 65%; estrutura granular poligonal e reabsorção completa
simultânea à nova formação óssea (CURASAN, 2007). Segundo informações do
fabricante, a superfície dos grânulos do material apresenta elevada aspereza o que
contribui de forma significativa para a invasão por células osteoblásticas e fluidos
teciduais, acelerando o processo de ossificação (CURASAN, 2007). Para avaliar o
efeito dessa nova cerâmica no processo de osteogênese e na proliferação celular,
Neamat e colaboradores (2009) cultivaram células estromais de medula óssea de
ratos com partículas de Cerasorb M e observaram, após duas semanas, aumento na
proliferação celular e na diferenciação de osteoblastos, quando comparado às
células controle. Ao implantarem Cerasorb M em defeitos ósseos alveolares
vestibulares em cães esses autores observaram, após três meses, proliferação de
células mesenquimais ao redor das partículas e abundante neoformação óssea.
Após seis meses, não havia remanescentes do biomaterial e toda a área havia sido
preenchida por tecido ósseo contendo células gigantes multinucleadas. Seus
resultados sugerem que Cerasorb M pode induzir a proliferação de células
mesenquimais e subsequente osteogênese com formação de matriz óssea em sítios
de enxerto.
Em um estudo mais recente, Luvizuto et al. (2011) compararam o efeito do β-
TCP Cerasorb M com outros materiais de enxerto em defeitos ósseos em calvária de
ratos. Análises por micro tomografia computadorizada e por histomorfometria
mostraram que a formação óssea foi maior com β-TCP do que com osso autógeno e
outros materiais como cimento de fosfato de cálcio e gel de ácido polilático e
22
poliglicólico. Além disso, a adição de proteína morfogenética óssea-2 (BMP-2) ao β-
TCP não foi capaz de aumentar significativamente a taxa de neoformação óssea,
sugerindo que o β-TCP apresenta propriedade máxima osteocondutiva a qual
determina a taxa de neoformação óssea.
Poucos estudos têm avaliado a implantação de outra cerâmica β-TCP,
Osferion®, desenvolvida no Japão, a qual apresenta características estruturais de
multiporosidade como o Cerasorb® M DENTAL. Massago e colaboradores, em
2007, avaliaram os efeitos de três diferentes materiais para aumento de rebordo
alveolar em maxilas de coelhos: β-TCP (Osferion®), partículas de cimento de fosfato
de cálcio (CPC) e fibras de titânio (TW) adicionadas ao plasma rico em plaquetas
(PRP). Eles observaram após cinco meses que, embora TW e CPC tenham
promovido rápida formação óssea, estes permaneceram intactos dentro da maxila, o
que, segundo os autores, poderiam constituir obstáculos para a colocação e fixação
adequada de implantes. Já os grânulos de β-TCP foram gradualmente substituídos
por um osso novo, embora demandando maior tempo para isso. Para esses autores,
o β-TCP se enquadra como um ideal substituto do osso alveolar, o qual deve
apresentar espaço adequado dentro do material para a osteocondução e a
propriedade de ser completamente substituído pelo osso neoformado.
Hirota et al. (2009) avaliaram a regeneração óssea em perfurações criadas
em mandíbulas de ratos preenchidas com β-TCP (Osferion®), osso alógeno e a
combinação de ambos, associado ou não com plasma rico em plaquetas (PRP).
Após cinco semanas, o enxerto combinado mostrou formação óssea semelhante ao
osso alógeno e maior neoformação óssea que β-TCP isolado. A associação com
PRP acelerou a degradação das partículas e β-TCP, enquanto a combinação de
osso alógeno com β-TCP retardou a degradação de suas partículas, sugerindo que
a degradação inicial da β-TCP pode ser diminuída quando utilizada em combinação
com material osteogênico.
Ioku et al. (2004) utilizaram o método hidrotermal de produção de
hidroxiapatita para a produção de β-TCP e obtiveram uma cerâmica com
microestrutura de cristais alongados de 20µm de comprimento, denominada β-TCP
Rod-shaped (RS β-TCP), diferente das demais β-TCP que apresentam
microestrutura granular. Para avaliar as respostas teciduais ao RS β-TCP, Okuda e
colaboradores (2007), implantaram cilindros de β-TCP convencional (C β-TCP) e de
23
RS β-TCP em fêmures de coelhos e avaliaram histologicamente as áreas de enxerto
após 24 semanas. Os resultados mostraram que sítios de RS β-TCP exibiram maior
formação óssea e degradação de partículas do biomaterial e que nos sítios de C β-
TCP a quantidade de osso neoformado foi menor, além desse osso mostrar maiores
áreas de medula óssea. Análise in vitro de discos de RS β-TCP e C β-TCP
incubados com células osteoclásticas de camundongo, mostraram lacunas de
reabsorção óssea em ambos os materiais, embora as concentrações de cálcio
tenham sido maiores no meio de cultura com RS β-TCP do que com C β-TCP
(OKUDA et al., 2007).
Embora as cerâmicas β-TCP convencionais permitam praticamente a
completa substituição por osso neoformado, sua microestrutura granular não suporta
forças maiores, o que limita sua utilização quando utilizada em blocos para
preenchimento de defeitos alveolares laterais sujeitos a compressão por forças
musculares (ONO et al., 2011). Na tentativa de se obter maior resistência mecânica
de blocos de enxerto, Ono et al. (2011) produziram blocos de RS β-TCP, os quais
também apresentam interconectividade dos poros essencial para a neoformação
óssea, e os implantaram em defeitos laterais de mandíbula em coelhos. Análise
histomorfométrica revelou que blocos de R β-TCP apresentaram maior estabilidade
dimensional que cerâmica β-TCP convencional (Osferion), a qual sofreu colapso do
bloco após 12 semanas. Esses resultados mostram que a microestrutura além de
afetar a atividade de células ósseas, também interfere nas propriedades mecânicas
de blocos de enxerto de β-TCP, influenciando a indicação dos biomateriais
cerâmicos nos procedimentos de enxerto ósseo odontológicos.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A utilização de cerâmicas de β-TCP como material de preenchimento de
defeitos ósseos tem mostrado ótimos resultados clínicos e radiográficos em
pacientes que necessitam de preservação da crista alveolar pós-exodontia ou de
aumento do volume ósseo maxilar através de procedimentos de levantamento de
seio maxilar (TRISI et al., 2003; ZERBO et al., 2005). Comparando os resultados
com enxertos de osso autógeno, atualmente ainda considerado padrão ouro no
preenchimento de defeitos ósseos, as cerâmicas β-TCP têm propiciado manutenção
24
de volume ósseo semelhante e propriedade de sofrer reabsorção praticamente
completa, permitindo a total substituição por osso neoformado (SZABÓ et al., 2005;
SUBA et al., 2006; ZIDJERVELD et al., 2009).
Embora os estudos clínicos sugiram que o β-TCP pode ser utilizado com
resultados satisfatórios em sítios ósseos bucais, os mecanismos e a cronologia de
reabsorção das partículas do biomaterial, bem como seus efeitos na neoformação
óssea ainda não foram completamente esclarecidos. A utilização de diferentes
modelos experimentais animais dificulta a determinação da cronologia de
degradação das partículas cerâmicas em sítios ósseos alveolares humanos (FUJITA
et al., 2003). Espécies diferentes podem apresentar metabolismo diferente e a
arquitetura do osso no sítio de preenchimento também pode levar a diferentes tipos
de estresse biomecânico e diferentes taxas de formação e remodelação óssea
(WILTFANG et al., 2002; KONDO et al., 2005). Além disso, há necessidade de
avaliação em longo prazo da estabilidade dos implantes instalados em sítios
preenchidos com β-TCP, bem como do comportamento do osso neoformado nesses
sítios.
As características físico-químicas das cerâmicas de fosfato de cálcio
influenciam consideravelmente na capacidade de estimulação da neoformação
óssea, por determinarem as propriedades osteocondutoras, funcionando como
arcabouço para invasão de células osteoblásticas, dando início ao processo de
formação óssea (LUVIZUTO et al., 2011).
Recentemente, estudos têm mostrado que a estrutura das partículas de β-
TCP e sua porosidade interna afetam significativamente a invasão tecidual, a taxa
de degradação do biomaterial e a taxa de neoformação óssea (OKUDA et al., 2007;
NEAMAT et al., 2009; FENG et al., 2011). Dessa forma, novas apresentações de
cerâmicas β-TCP têm surgido no mercado estimulando a realização de estudos
celulares e teciduais com o objetivo de se conhecer melhor as interações entre as
partículas e os tecidos do hospedeiro e os processos envolvidos na degradação
dessas partículas.
O maior entendimento sobre a cinética de formação óssea e sobre a
qualidade desse osso neoformado em sítios de preenchimento com cerâmicas β-
TCP é fundamental para o adequado planejamento cirúrgico e protético em
diferentes modalidades de reconstrução tecidual e reabilitação dentária.
25
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30
ARTIGO 2
Reações teciduais ao beta-tricálcio fosfato Cerasor b® M DENTAL em defeitos
ósseos em fêmur de ratos cobertos por membrana de c olágeno
Histological evaluation of beta-tricalcium phosphat e Cerasorb® M DENTAL in
femoral bone defects in rats with collagen barrier membrane
Leonardo Avellar Lanza
Polyana Cardoso Araújo
Guilherme Campos Luz
Elton Gonçalves Zenóbio
Paulo Eduardo Alencar de Souza
Programa de Pós-graduação em Odontologia, Departamento de Odontologia da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais.
31
RESUMO
Após cirurgias nos maxilares, defeitos ósseos são relativamente comuns, o que
pode dificultar a reabilitação do paciente. O objetivo deste estudo foi avaliar os
efeitos biológicos de uma cerâmica de beta-tricálcio fosfato (β-TCP) de multiporos
interconectados, desenvolvida recentemente, em defeitos ósseos criados em
fêmures de ratos, com ou sem barreira de membrana de colágeno. Foram criados
dois defeitos em cada fêmur de ratos Wistar machos e estes divididos em: grupo
teste (T) preenchidos com Cerasorb® M DENTAL (n=15) e grupo controle (C)
preenchido com coágulo sanguíneo (n=15). Em cada animal um defeito foi coberto
com membrana de colágeno e outro não. Os animais foram sacrificados após 15, 30
e 60 dias e as amostras submetidas à análise histológica. Nossos resultados
mostraram formação óssea ao redor das partículas do biomaterial e no interior dos
poros interconectados nos três tempos avaliados. O tecido conjuntivo fibroso que
penetrou nos poros e envolveu partículas superficiais do biomaterial aos 15 dias foi
substituído por tecido ósseo aos 30 e 60 dias. Nos defeitos não cobertos por
membrana, células gigantes multinucleadas foram observadas em contato com as
partículas de β-TCP apenas no tecido conjuntivo fibroso. Essas células não foram
observadas no tecido ósseo ao redor das partículas. Aos 60 dias, β-TCP promoveu
neoformação óssea em maior área que o grupo controle e suas partículas, ainda
presentes, induziram formação óssea dentro do tecido hematopoiético do canal
medular. A membrana de colágeno manteve-se íntegra durante todo o tempo
experimental e inibiu a formação de tecido conjuntivo fibroso ao redor das partículas
de β-TCP. Concluindo, Cerasorb® M DENTAL suporta a neoformação óssea no
interior dos poros e ao redor de suas partículas, estimula formação de matriz óssea
em área de tecido não mineralizado e sua degradação parece ocorrer por dissolução
química e não através de reabsorção por células osteoclásticas.
Palavras chave: Reparo ósseo, beta-tricálcio fosfato, membrana de colágeno,
estudo histológico.
32
ABSTRACT
After jaw surgery, bone defects are relatively common, which can hinder
rehabilitation. The objective of this study was to evaluate the biological effects of a
ceramic beta-tricalcium phosphate (β-TCP) of interconnected multiporos recently
developed in bone defects created in femurs of rats, with or without collagen
membrane barrier. Two defects were created in each femur of male Wistar rats and
these divided into test group (T) filled with Cerasorb ® M DENTAL (n = 15) and
control group (C) filled with blood clot (n = 15). In each animal, one defect was
covered with collagen membrane and the other not. The animals were sacrificed after
15, 30 and 60 days and samples submitted for histological analysis. Our results
showed bone formation around the biomaterial particles and within the
interconnected pores in the three evaluated times. The fibrous connective tissue that
penetrated into the pores and particles involved in biomaterial surface at 15 days
were replaced by bone tissue at 30 and 60 days. In the not covered defects,
multinucleated giant cells were observed in contact with particles of β-TCP only
fibrous connective tissue. These cells were not observed in the bone tissue around
the particles. At 60 days, β-TCP bone neoformation promoted a greater area than the
control group and its particles are still present, induced bone formation within the
hematopoietic tissue of the spinal canal. The collagen membrane remained intact
throughout the experimental period and prevented the formation of fibrous connective
tissue around the β-TCP particles. In conclusion, Cerasorb ® M DENTAL supports
bone formation within the pores and around the particles, stimulates formation of
bone matrix in non-mineralized tissue area and its degradation appears to occur by
chemical dissolution and not through resorption by osteoclastic cells.
Key words: bone regeneration, beta-tricalcium phosphate, collagen membrane,
histological study.
33
INTRODUÇÃO
Diversos procedimentos odontológicos cirúrgicos, como exodontias, remoções
de lesões osteolíticas e tumorais, resultam em perda óssea alveolar. Após
exodontia, coágulo sanguíneo preenche o alvéolo e estimula o processo de
formação óssea. Entretanto, esse processo nunca resulta na reconstituição total do
volume ósseo do rebordo, pois uma reabsorção óssea é iniciada imediatamente
causando cerca de 40 a 60% de diminuição das dimensões horizontais e verticais do
rebordo, durante os primeiros dois anos pós-exodontia (SCHROPP et al., 2003;
TALLGREN, 2003). Estudos clínicos e radiográficos mostram que a perda óssea é
mais evidente na face vestibular do processo alveolar e ocorre principalmente dentro
dos três primeiros meses (SCHROPP et al., 2003).
Volumes adequados de osso alveolar são necessários para a reabilitação
protética dos pacientes e para o sucesso em longo prazo de implantes dentais. Isto
exige que os cirurgiões-dentistas utilizem técnicas para prevenir a reabsorção ou
para aumentar o volume de osso perdido. Enxertos de osso autógeno ainda são
considerados padrão ouro para muitos procedimentos de regeneração óssea, devido
às suas propriedades osteoindutoras, osteocondutoras e osteogênicas
(KAINULAINEN et al. 2005; PAPE et al., 2010). Entretanto, a morbidade causada no
sítio doador, o maior número de sítios cirúrgicos e a limitada quantidade de osso
disponível, estimularam o desenvolvimento de substitutos ósseos como alternativa
ao osso autógeno (CLAVERO, 2003). Esses materiais devem permitir a invasão por
células e vasos sanguíneos, suportar o crescimento e a diferenciação de células
osteoblásticas, além de permitir a deposição de matriz óssea no interior de seu
arcabouço com posterior e gradativa substituição do biomaterial por tecido ósseo
(ZERBO et al., 2001).
Por muitos anos, a técnica da regeneração óssea guiada (ROG) tem sido
amplamente usada para deiscência em rebordos ósseos. Ela consiste na instalação
de uma membrana, com a finalidade de servir como uma barreira mecânica, para
proteger o coágulo sanguíneo e criar um espaço seguro em volta do defeito ósseo
para o processo de formação óssea, evitando que células do tecido conjuntivo
fibroso proliferem rapidamente, ocupando o espaço destinado ao preenchimento
34
ósseo (SCULEAN et al., 2008). O uso de biomaterial nesses sítios impede o colapso
da membrana e estimula a neoformação óssea através da osteoindução ou
osteocondução (SCULEAN et al., 2008). Membranas de colágeno têm se mostrado
comparáveis às membranas não reabsorvíveis em procedimentos cirúrgicos para
redução da profundidade de sondagem e preenchimento ósseo (ZELLIN et al., 2005;
SCULEAN et al., 2008). Além disso, membranas de colágeno são semipermeáveis,
facilitando a difusão de nutrientes, e reabsorvíveis, o que elimina a necessidade de
um segundo procedimento cirúrgico, o que é necessário quando se usa membranas
não-reabsorvíveis (SCULEAN et al., 2008). Segundo alguns autores, a composição
e a morfologia das superfícies interna e externa são importantes para prevenir a
migração de tecido epitelial e conjuntivo e permitir a instalação de células
osteogênicas para o crescimento ósseo (KASAJ et al., 2008).
As cerâmicas de fosfato de cálcio são reconhecidamente biocompatíveis e
possuem propriedades bioativas. Apresentam constituição química inorgânica
semelhante à do osso natural, o que as torna substitutos ósseos promissores nos
campos ortopédico e maxilofacial (FELLAH et al., 2007). Existem várias marcas
comerciais e as diferenças entre elas são devidas a algumas propriedades, tais
como a proporção cálcio/fosfato, cristalinidade, temperatura de sinterização e outras
características físicas. O beta-tricálcio fosfato (β-TCP) é um dos biomateriais
reabsorvíveis mais utilizados com resultados clínicos comparáveis aos do osso
autógeno (SZABÓ et al., 2005; SUBA et al., 2006; ZIDJERVELD et al., 2009), capaz
de preservar as dimensões dos alvéolos pós-exodontias, através da dissolução
gradativa e completa de suas partículas com concomitante substituição por tecido
ósseo neoformado (TRISI et al., 2003; ARTZI et al., 2004).
As características físico-químicas das cerâmicas de fosfato de cálcio
influenciam consideravelmente na capacidade de estimulação da neoformação
óssea, por determinarem as propriedades osteocondutoras, funcionando como
arcabouço para invasão de células osteoblásticas, dando início ao processo de
formação óssea (LUVIZUTO et al., 2011). Recentemente, estudos têm mostrado que
a estrutura das partículas de β-TCP e sua porosidade interna afetam
significativamente a invasão tecidual, a taxa de degradação do biomaterial e a taxa
de neoformação óssea (OKUDA et al., 2007; NEAMAT et al., 2009; FENG et al.,
2011). Dessa forma, novas apresentações de cerâmicas β-TCP têm surgido no
35
mercado estimulando a realização de estudos celulares e teciduais com o objetivo
de se conhecer melhor as interações entre as partículas e os tecidos do hospedeiro
e os processos envolvidos na degradação dessas partículas.
O Cerasorb® M DENTAL é uma cerâmica β-TCP de fase pura, relativamente
nova, que apresenta grânulos de tamanhos variados com múltiplos poros
interconectados e estrutura granular poligonal. Seus micro, meso e macroporos (5
µm a 500 µm) aumentam a área de superfície permitindo maior contato com plasma,
fluidos teciduais e proteínas autólogas, facilitando sua reabsorção, e possibilitam a
migração de células osteoblásticas e vasos sanguíneos, acelerando o processo de
ossificação (PALM, 2004; TADIC and EPLLE, 2004; NEAMAT et al., 2009). Embora
seja amplamente utilizada em procedimentos odontológicos, são escassos os
estudos avaliando os efeitos biológicos do Cerasorb® M DENTAL, bem como o
mecanismo e a cinética de degradação de suas partículas, em sítios de enxerto
ósseos (NEAMAT et al., 2009; LUVIZOTU et al., 2011).
O objetivo deste trabalho foi avaliar as reações teciduais ao Cerasorb® M
DENTAL utilizado como preenchimento de defeitos ósseos criados em fêmur de
ratos, cobertos ou não com membrana de colágeno, através de análise histológica.
36
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais
Neste estudo foram utilizados 30 ratos Wistar (Rattus novergicus) machos, de
quatro meses de idade, pesando de 300 a 400g, os quais foram mantidos no Biotério
Central da Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais (PUC Minas) com água
filtrada e ração para roedores (Nuv-Lab – Purina) à vontade. Esta pesquisa foi
aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da PUC Minas e
conduzida de acordo com as diretrizes deste comitê.
Procedimentos cirúrgicos
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia geral, com
injeção intramuscular de cetamina e xilazina. Primeiramente, foi injetado cloridrato
de xilazina 2% (Xilazin - Syntec), na proporção de 0,1ml/100g de peso corporal,
cujos efeitos são analgésico, anestésico, miorrelaxante e sedativo. Imediatamente
após, foi injetado cloridrato de cetamina 10% (Cetamin - Syntec), na proporção de
0,1ml/100g de peso corporal, cujo efeito é anestésico.
A técnica cirúrgica consistiu em uma incisão linear na pele da face interna da
coxa do animal, seguida de divulsão do tecido muscular até a superfície do osso
fêmur. Após descolamento do periósteo, foram criados dois defeitos ósseos
padronizados com 2 mm de diâmetro cada, distantes 3 mm um do outro. Para isso
foi utilizada broca esférica diamantada estéril de 2 mm sob irrigação com solução
salina estéril resfriada. Os animais foram divididos em dois grupos: teste e controle.
No grupo teste, ambos os defeitos foram preenchidos com Cerasorb® M DENTAL
(partículas de 500-1000 µm) (Curasan, Kleinostheim, Alemanha), acomodando-se as
partículas do biomaterial sem condensá-las, conforme instruções do fabricante (Fig.
1A). Nos animais do grupo controle os defeitos foram preenchidos apenas por
coágulo sanguíneo. Aleatoriamente, em cada animal, um dos defeitos foi recoberto
com membrana de colágeno Osseoguard (Biomet 3i, USA) medindo 4 x 4 mm. O
periósteo e o tecido muscular foram cuidadosamente reposicionados sobre os dois
defeitos ósseos e, em seguida, a pele incisada foi suturada com fio de nylon 5-0
Vycril por meio de pontos isolados.
37
Os 15 animais de cada grupo (teste e controle) foram divididos em três
subgrupos de cinco animais cada e sacrificados 15, 30 e 60 dias após o
procedimento cirúrgico.
Para eutanásia de todos os animais, foram realizadas injeções
intramusculares de cloridrato de xilazina 2% (Xilazin - Syntec), na proporção de
0,1ml/100g de peso corporal e de cloridrato de cetamina 10% (Cetamin - Syntec), na
proporção de 0,1ml/100g de peso corporal. Sob anestesia, os animais foram
decapitados e a pele dos membros inferiores operados foi removida.
Análise histológica
Para processamento histológico, as peças foram fixadas em solução de
formaldeído a 10% tamponado, por 48 horas à temperatura ambiente e, em seguida,
desmineralizadas em solução de EDTA a 10%, pH 7,3. As peças foram avaliadas
semanalmente até apresentarem consistência macia, indicando correta
desmineralização óssea. Em seguida, com auxílio de uma lâmina de bisturi, os
tecidos que recobrem o fêmur foram removidos cuidadosamente para preservar o
tecido ósseo e o fêmur foi seccionado transversalmente nas áreas correspondentes
aos defeitos ósseos criados (Fig. 1B). As peças foram desidratadas gradativamente
em soluções de concentração crescente de etanol, diafanizadas em xilol e
embebidas em parafina (Histosec® pastilhas, Merck). Foram obtidos cortes seriados
de 4 µm de espessura, em micrótomo, e estes foram corados com hematoxilina-
eosina. Foi realizada análise histológica descritiva dos cortes histológicos dos
defeitos ósseos, quanto ao aspecto e degradação das partículas de beta-tricálcio
fosfato, integração com tecidos adjacentes, neoformação óssea, presença de
infiltrado inflamatório e células gigantes multinucleadas, estrutura e degradação das
membranas de colágeno. As análises foram realizadas em microscópio óptico
(Olympus BX51) com objetivas planocromáticas e as imagens foram capturadas
utilizando-se câmera digital (Olympus SC30).
38
Fig. 1 - (A) Fotografia dos defeitos ósseos preenchidos com Cerasorb® M DENTAL e cobertos com membrana durante cirurgia. (B) fêmur dissecado mostrando área de defeito coberta por membrana e preenchida com Cerasorb® M DENTAL, após 60 dias.
A B
39
RESULTADOS
Os cinco animais do grupo controle de 15 dias sofreram complicações no
período pós-operatório, como infecção e morte. Dessa forma, este subgrupo foi
excluído da análise. Trinta dias após cirurgia, os defeitos ósseos do grupo controle
exibiram formação de delgadas trabéculas ósseas na entrada do defeito, com
amplos espações medulares preenchidos por tecido hematopoiético (Fig. 2A e B).
Na cortical óssea próxima ao defeito, notou-se reação periosteal (Fig. 2A e B). A
membrana de colágeno encontrava-se em contato íntimo com o tecido ósseo
subjacente, permitindo neoformação óssea além do diâmetro do fêmur, em toda
área coberta pela membrana (Fig. 2B). Sessenta dias após cirurgia, o grupo controle
mostrou deposição de osso mais compacto e espesso na região cortical do defeito
do fêmur (Fig. 2C). Defeitos cobertos por membrana exibiram, também, trabéculas
ósseas espessas permeadas por tecido hematopoiético dentro do canal medular
(Fig. 2D).
Os cortes histológicos dos defeitos ósseos preenchidos com β-TCP
mostraram, após 15 dias, tecido conjuntivo fibroso frouxo e pouco celularizado
envolvendo as partículas do biomaterial na porção mais superficial dos defeitos e
delicadas trabéculas ósseas em contato com partículas do biomaterial na porção
mais profunda do defeito, de forma semelhante nos defeitos cobertos e não cobertos
por membrana (Fig. 3A e B). Tanto o tecido conjuntivo fibroso (Fig.4A) quanto o
tecido ósseo (Fig. 4B) invadiram provavelmente os espaços correspondentes aos
poros interconectados dentro das partículas de β-TCP, formando uma rede tecidual
em continuidade aos tecidos que envolviam as partículas. Trinta dias após a cirurgia,
nos defeitos do grupo teste não cobertos por membrana, as partículas mais
superficiais do biomaterial continuavam envolvidas por tecido conjuntivo fibroso (Fig.
3C), o qual se mostrava mais denso, celularizado e vascularizado, contendo
numerosas células gigantes multinucleadas em contato com as partículas de β-TCP
(Fig. 4C). Esse tecido conjuntivo fibroso exibia numerosas células de morfologia
semelhante a fibroblastos. Já nos defeitos cobertos por membrana, o tecido
conjuntivo fibroso frouxo na porção superficial foi substituído por trabéculas ósseas
permeadas por medula óssea (Fig. 3D).
40
Grupo controle sem membrana Grupo controle com membrana
A B
C D
Fig. 2 - Características histológicas dos defeitos ósseos preenchidos com coágulo sanguíneo. A e C: defeitos não cobertos com membrana de colágeno aos 30 e 60 dias, respectivamente. Presença de trabéculas ósseas neoformadas e amplos espaços medulares aos 30 dias (A) e maior formação óssea cortical aos 60 dias, mas com amplos espaços preenchidos por medula hematopoiética (C) (H.E. 40x). B e D: defeitos cobertos com membrana de colágeno aos 30 e 60 dias, respectivamente. A membrana de colágeno determina a extensão de formação óssea (B). Aos 60 dias, observa-se trabéculas ósseas mais espessas e interconectadas, permeadas por espaços medulares amplos, ocupando área original de osso cortical e parte do canal medular (D) (H.E. 40x).
41
Fig. 3 - Características histológicas dos defeitos ósseos preenchidos com Cerasorb® M DENTAL. A, C e E: defeitos não cobertos com membrana de colágeno aos 15, 30 e 60 dias, respectivamente. Observa-se invasão superficial por tecido conjuntivo fibroso envolvendo as partículas do biomaterial em todos os tempos avaliados e formação óssea ao redor das partículas mais profundas, com trabéculas mais espessas aos 30 e 60 dias. (HE 40x). B, D e F: defeitos cobertos com membrana de colágeno aos 15, 30 e 60 dias, respectivamente. O tecido conjuntivo frouxo que envolvia as partículas mais superficiais do biomaterial aos 15 dias (B) foi substituído por tecido ósseo aos 30 e 60 dias (C e F)(HE 40x). Reação periosteal evidente no osso cortical próximo ao defeito criado aos 15 dias (A e B). Tecido ósseo neoformado com espaços medulares aos 30 e 60 dias (C, D, E e F) e formação de tecido ósseo dentro das partículas do biomaterial no tecido hematopoiético no canal medular, aparentemente sem continuidade com o tecido ósseo cortical.
Grupo teste sem membrana Grupo teste com membrana
A B
C D
E F
42
Independentemente da cobertura por membrana, trabéculas ósseas mais
espessas envolviam as partículas de β-TCP, após 30 dias (Fig. 3C e D). No interior
das partículas de β-TCP, maior quantidade de tecido ósseo foi observada com
consequente degradação do biomaterial aos 30 (Fig. 4D) e 60 dias (Fig. 4F), sem
presença de células gigantes osteoclásticas em contato com o β-TCP. Após 60 dias,
houve formação de osso compacto na região cortical do defeito ósseo (Fig. 3E e F) e
partículas de β-TCP ainda permaneciam nos sítios de implantação, exibindo maior
degradação, tanto superficial quanto internamente, com concomitante neoformação
óssea (Fig. 4F). Resquícios de partículas do biomaterial, exibindo avançado estado
de degradação, envoltas por tecido conjuntivo fibroso denso e celularizado contendo
numerosas células gigantes multinucleadas em íntimo contato com β-TCP (Fig. 4E),
também estavam presentes na superfície dos defeitos não cobertos por membrana,
após 60 dias. Maior degradação das partículas de β-TCP com substituição por tecido
ósseo maduro contendo medula óssea foi observada aos 60 dias (Fig. 4F e H). β-
TCP em meio ao tecido hematopoiético do canal medular nas porções profundas
dos defeitos (Fig. 3E e F) exibiram formação de tecido ósseo no interior de suas
partículas (Fig. 4G), aparentemente sem continuidade com as trabéculas ósseas
neoformadas e com o tecido ósseo cortical. Também, não foram encontradas células
gigantes multinucleadas em contato com partículas de β-TCP envoltas por tecido
ósseo aos 60 dias (Fig. 4H). A neoformação óssea ocorreu em toda a extensão do
defeito ocupada por partículas de b-TCP no grupo teste (Fig. 3E e F), diferentemente
do grupo controle onde a formação óssea ocorreu principalmente na área cortical do
defeito (Fig. 2).
As características histológicas da membrana de colágeno Osseoguard™
posicionada sobre defeitos ósseos após 15, 30 e 60 dias foram avaliadas. Em todos
os tempos estudados, as membranas mostraram-se constituídas por feixes
espessos de colágeno dispostos paralelamente entre si formando camadas
sobrepostas. Aos 15 dias, foi observado envolvimento da membrana por delicadas
fibrilas de colágeno em arranjo bastante frouxo lembrando tecido mixoide (Fig. 5A).
Após 30 dias, a membrana encontrava-se colonizada superficialmente por células de
morfologia alongada, semelhante a fibroblastos, além de vasos sanguíneos (Fig.
5B). A porção mais central da membrana encontrava-se acelular. Aos 60 dias, foi
possível observar quantidade moderada de células com morfologia semelhante a
43
fibroblastos em toda a espessura da membrana (Fig. 5C). Essas células
encontravam-se dispostas paralelamente às fibras espessas de colágeno da
membrana, em contato íntimo com as mesmas (Fig. 5C). Nenhum sinal de
inflamação nas membranas foi observado durante todo o tempo de experimentação,
nem características evidentes de degradação ou perda de estrutura das mesmas,
tendo em vista a manutenção de sua espessura, mesmo após 60 dias de
implantação nos sítios de defeito ósseo.
44
Fig. 4 - Características histológicas das partículas de b-TCP em contato com os tecidos do hospedeiro. A, C e E: tecido conjuntivo fibroso envolvendo partículas e preenchendo seus poros interconectados, na porção mais superficial dos defeitos não cobertos por membrana aos 15, 30 e 60 dias, respectivamente. (HE 200x). Tecido conjuntivo frouxo e pouco celularizado aos 15 dias (A) e bastante celularizado aos 30 (C) e 60 dias (E). No detalhe, células gigantes multinucleadas em contato com as partículas. B, D e F: neoformação óssea ao redor das partículas e no interior de seus poros interconectados (HE 200x). Notar ausência de células gigantes multinucleadas nas partículas envolvidas por tecido ósseo. G:formação óssea no interior dos poros do biomaterial dentro do tecido hematopoiético no canal medular (HE 200x). H: imagem em maior aumento da neoformação óssea ao redor e no interior das partículas. Ausência de células osteoclásticas em contato com as partículas (HE 400x).
A B
C D
E F
G H
45
Fig. 5 - Características histológicas das membranas de colágeno aos 15 (A), 30 (B) e 60 (C) dias, com fibras espessas e dispostas paralelamente. Imagens mostram colonização superficial, aos 30 dias, e em toda a espessura da membrana, aos 60 dias, por células de morfologia semelhante a fibroblastos. Notar ainda presença de vasos sanguíneos no interior da membrana aos 30 dias e preservação das fibras de colágeno das membranas em todos os tempos avaliados. (Coloração em H.E. 400x).
A
B
C
46
DISCUSSÃO
Recentemente, estudos têm mostrado que a estrutura das partículas de β-
TCP e sua porosidade interna afetam significativamente a invasão tecidual, a taxa
de degradação do biomaterial e a taxa de neoformação óssea (OKUDA et al., 2007;
NEAMAT et al., 2009; FENG et al., 2011). Dessa forma, novas apresentações de
cerâmicas β-TCP têm surgido no mercado estimulando a realização de estudos
celulares e teciduais com o objetivo de se conhecer melhor as interações entre as
partículas e os tecidos do hospedeiro e os processos envolvidos na degradação
dessas partículas.
O Cerasorb® M DENTAL é uma cerâmica β-TCP, relativamente nova no
mercado, que apresenta multiporosidade aberta e interconectada, porosidade total
de 65% e estrutura granular poligonal (TADIC e EPPLE, 2004; NEAMAT et al.,
2009). Segundo informações do fabricante, os grânulos do material apresentam
elevada aspereza o que contribui de forma significativa para a invasão por células
osteoblásticas e fluidos teciduais, acelerando o processo de ossificação. Entretanto,
na literatura são escassos os trabalhos avaliando as reações teciduais bem como o
potencial osteocondutivo de cerâmicas β-TCP de multiporosidade interconectada
(HIROTA et al., 2009; NEAMAT et al., 2009; LUVIZUTO et al., 2011).
O presente estudo avaliou as reações teciduais ao Cerasorb® M DENTAL em
defeitos ósseos em fêmures de ratos e nossos resultados mostraram envolvimento
das partículas superficiais de β-TCP por tecido conjuntivo fibroso frouxo e das
partículas mais profundas por trabéculas ósseas após 15 dias. Embora a membrana
de colágeno não tenha conseguido impedir completamente a invasão superficial do
tecido conjuntivo fibroso frouxo nos primeiros dias, este foi parcialmente substituído
por tecido ósseo aos 30 e 60 dias, o que não ocorreu nos defeitos não cobertos por
membrana. Nesses defeitos, o tecido conjuntivo fibrosos tornou-se mais denso,
celularizado e vascularizado, envolvendo as partículas do biomaterial até os 60 dias.
Kondo et al. (2005), utilizando β-TCP convencional para preenchimento de defeitos
na epífise de fêmures de ratos, também observaram formação de tecido conjuntivo
fibroso ao redor do biomaterial após sete dias e gradativa substituição deste por
tecido ósseo aos 14 e 28 dias. Substituição gradativa de tecido fibroso por osso
também foi observada ao redor de partículas de β-TCP de multiporosidade
47
interconectada implantadas em músculo de cães, após 56 dias (KONDO et al.,
2006). Outro estudo em seio maxilar humano mostrou presença de numerosas
células osteoblásticas dentro do tecido conjuntivo fibroso que envolvia partículas de
Cerasorb® convencional, sugerindo potencial de formação óssea na área
preenchida por tecido fibroso (ZERBO et al., 2005).
Nossos resultados também mostraram que após 15 dias, o tecido ósseo
neoformado em contato íntimo com Cerasorb® M DENTAL penetrou os poros das
partículas, formando delgados septos interconectados. Após 30 e 60 dias, esses
septos mostraram-se mais evidentes e com presença de vários osteócitos.
Cerâmicas β-TCP convencionais apresentam estrutura mais condensada e a análise
histológica mostra formação óssea apenas ao redor das partículas (KONDO et al.,
2005). A microestrutura das partículas de β-TCP influencia a atividade de células
ósseas e subsequente neoformação óssea (WILTFANG et al. 2002; FUJITA et al.
2003, OKUDA et al. 2007; FENG et al. 2011). Os poros aumentam a superfície e
podem permitir o crescimento interno de tecido vascularizado, preferencialmente
naqueles com diâmetro mínimo de 400 micrômetros (FENG et al., 2011). Já os poros
menores permitem a invasão por tecido ósseo e fluidos teciduais, favorecendo a
dissolução do biomaterial (YUAN et al., 1999).
O processo de degradação do β-TCP ainda não foi totalmente esclarecido e é
provável que diferenças na estrutura das partículas afetem esse processo.
Cerâmicas de fosfato de cálcio podem sofrer reabsorção biológica através de
dissolução química pelos fluidos teciduais ou degradação por células macrofágicas e
osteoclásticas (JARCHO, 1981). Alguns estudos mostraram presença de células
macrofágicas e osteoclásticas em contato com partículas de β-TCP de estruturas
diferentes, implantadas em ossos de ratos (KONDO et al. 2005; HIROTA et al.,
2010), cães (NEAMAT et al., 2009) e coelhos (OKUDA et al., 2007), sugerindo que
essas células tenham papel central na degradação do biomaterial. Entretanto, o
presente trabalho e outros estudos em ossos de coelhos (LU et al., 1998), de cães
(KOVÁCS et al., 2003) e em alvéolos humanos (BRKOVIC et al., 2011), não
detectaram células gigantes ao redor das partículas de β-TCP envoltas por osso
neoformado em diferentes tempos de estudo, sugerindo degradação por dissolução
química.
48
Interessantemente, nossos resultados mostraram presença de células
gigantes multinucleadas em contato com Cerasorb® M DENTAL apenas nas áreas
superficiais, onde o tecido conjunto fibroso envolveu suas partículas. Após 60 dias,
foi possível observar degradação mais evidente das partículas do biomaterial
envoltas pelo tecido conjuntivo fibroso do que pelo tecido ósseo, sugerindo que as
células gigantes possam contribuir no processo de degradação do β-TCP.
A composição e a microestrutura do β-TCP podem influenciar a velocidade de
degradação de suas partículas (OKUDA et al., 2007; ONO et al., 2011). Blocos de β-
TCP convencional apresentaram degradação mais rápida que blocos de β-TCP de
microestrutura alongada em enxertos em mandíbula de coelhos (ONO et al., 2011).
Resquícios de β-TCP de multiporosidade interconectada ainda permaneceram em
meio ao tecido ósseo quando implantados em músculo de cães após mais de cinco
meses (KONDO et al., 2006). Partículas de β-TCP convencionais encontravam-se
em avançado estado de degradação após 56 dias em epífises de fêmur (KONDO et
al., 2005) e em calvária de ratos (FUJITA et al., 2003; TAKEUCHI et al., 2009). Em
nosso estudo, partículas de Cerasorb® M DENTAL ainda podiam ser observadas em
meio ao tecido ósseo, após 60 dias. É possível que a cinética de degradação do β-
TCP seja diferente em tecidos e espécies animais diferentes, o que dificulta a
comparação entre estudos.
Embora a maioria dos autores sugira que a atividade biológica do β-TCP se
limite às propriedades osteocondutoras (WILTFANG et al., 2002; TRISI et al. 2003;
LUVIZUTO et al., 2011), alguns estudos sugerem que essa cerâmica pode
apresentar também propriedades osteoindutoras (YUAN et al., 1999; KONDO et al.,
2005 e 2006). Um estudo em cães mostrou que a implantação de β-TCP com
multiporosidade interconectada no músculo dorsal estimulou a formação de tecido
ósseo lamelar, após cerca de três meses, através de ossificação intramembranosa,
com concomitante degradação das partículas do biomaterial e presença de tecido de
medula óssea dentro dos macroporos do β-TCP (KONDO et al., 2006). Assim, β-
TCP pode induzir formação óssea em músculo dorsal de cães sem o uso
concomitante de células da medula óssea ou fatores de crescimento ósseo-
indutivos. As propriedades indutoras das cerâmicas de fosfato de cálcio dependem
da espécie animal e do tipo de tecido não osteoide do local de implantação.
Cerâmicas foram capazes de induzir formação de tecido ósseo em músculo e tecido
49
subcutâneo de porco e cães, após 45 e 60 dias, respectivamente, mas não em
cabras, coelhos e ratos, mesmo após 120 dias (RIPAMONTI, 1996; YANG et al.,
1996). Outro dado importante, é que a estrutura dos poros interconectados parece
ser um fator chave para indução óssea. Cerâmicas de hidroxiapatita contendo
microporos interconectados induziram a formação de tecido ósseo em músculo
dorsal de cães, o que não ocorreu com cerâmicas de mesma composição química,
mas de microestrutura mais condensada (YUAN et al., 1999). Ainda segundo esses
autores, o tamanho dos macroporos e a temperatura de sinterização não afetam as
propriedades osteoindutoras da cerâmica. Segundo informações do fabricante, uma
das principais diferenças do Cerasorb® M DENTAL para os demais β-TCP, incluindo
o Cerasorb® convencional, é a sua multiporosidade (65%), com poros de tamanhos
variados e interconectados.
Nossos resultados mostraram formação de tecido ósseo no interior das
partículas de Cerasorb® M DENTAL presentes no canal medular e circundadas pela
medula óssea, aos 60 dias. A diáfise do fêmur do rato é constituída por uma camada
de osso cortical espessa e pequena quantidade de osso esponjoso circundando o
canal medular, o qual contém a medula óssea formada por tecido hematopoiético,
tecido adiposo e células mesenquimais indiferenciadas. Na ausência do biomaterial,
no grupo controle, foi observada a reconstituição da medula óssea, enquanto no
grupo teste houve formação óssea dentro das partículas do biomaterial,
aparentemente sem continuidade com trabéculas ósseas neoformadas ou osso
cortical. Isto sugere que o Cerasorb® M DENTAL, além de apresentar propriedades
osteocondutoras, pode apresentar também características osteoindutoras,
possivelmente através da indução da diferenciação de células mesenquimais de
medula óssea em osteoblastos capazes de sintetizar matriz óssea mineralizada.
O mecanismo da osteoindução pelos biomateriais ainda é desconhecido,
embora algumas hipóteses tenham sido propostas. Alguns autores acreditam que a
superfície das cerâmicas de fosfato de cálcio serve como substrato para a absorção
e estocagem de fatores de crescimento e proteínas morfogenéticas do osso (BMPs),
os quais podem se ligar a células indiferenciadas estimulando sua diferenciação em
osteoblastos produtores de matriz óssea (DE GROOT et al., 1998; KUZNETSOV et
al., 2001). A estrutura de microporos da cerâmica de fosfato de cálcio bifásica induz
a precipitação de cristais biológicos de apatita formada in vivo por dissolução e
50
reprecipitação no biomaterial (DALCUSI et al., 2003). Segundo esses autores,
células osteoprogenitoras poderiam reconhecer a camada de apatita e iniciarem a
produção de matriz óssea. Estudos sobre as sinalizações moleculares decorrentes
das interações células-biocerâmicas são necessários para a compreensão das
propriedades bioativas desses biomateriais.
Membranas de colágeno reabsorvíveis são utilizadas como barreira
mecânica, impedindo a invasão do tecido conjuntivo fibroso em alvéolos e defeitos
ósseos, durante o processo de neoformação óssea (TATAKIS et al., 1999). Embora
a membrana de colágeno OsseoGuard™ seja usada em vários procedimentos
cirúrgicos odontológicos, não foram encontrados na literatura inglesa trabalhos
avaliando as reações teciduais e a cinética de degradação desse tipo de membrana.
Durante os procedimentos cirúrgicos de implantação da membrana
OsseoGuard™, notamos dificuldade em adaptá-la sobre alguns defeitos ósseos,
devido à sua rigidez mesmo após hidratação prévia. Durante a dissecação das
amostras de fêmur, após 30 dias, observamos que as membranas mantinham ainda
certa rigidez. A dificuldade de adaptação da membrana em algumas amostras pode
ter contribuído para o seu deslocamento, permitindo a invasão de tecido conjuntivo
fibroso na porção superficial do defeito ósseo. Schwartz et al. (2007) relataram
dificuldade semelhante na adaptação de outra membrana de colágeno, Bio-Guide,
sobre defeitos tipo deiscência em cães. Em nosso trabalho, a análise histológica das
membranas de colágeno implantadas sobre os defeitos ósseos, tanto no grupo
controle quanto no grupo teste, mostrou que sua integridade estrutural foi mantida
até o final do experimento, ou seja, 60 dias após implantação. Não foi observada
reação inflamatória nas membranas em nenhum dos tempos avaliados, indicando
biocompatibilidade do material.
A principal limitação do uso de colágeno nativo em membranas é sua rápida
biodegradação pela ação de enzimas produzidas por macrófagos e neutrófilos,
resultando em uma membrana de baixa resistência e rápida degradação, incapaz de
impedir a invasão de tecidos moles por tempo suficiente para que ocorra o reparo
ósseo (TATAKIS et al., 1999). Com o objetivo de retardar o processo de degradação
das membranas de colágeno, várias técnicas têm sido desenvolvidas para realizar
ligações cruzadas entre as fibras de colágeno tais como, aplicação de radiação
ultravioleta e tratamentos químicos com glutaraldeído e outras substâncias
51
(QUTEISH e DOLBY, 1992; ZAHEDI et al., 1998). ROTHAMEL et al. (2005)
mostraram que membranas de colágeno com ligação cruzada apresentaram
degradação significativamente mais lenta que membranas sem ligação cruzada,
quando implantadas no tecido subcutâneo de ratos. Membrana sem ligação cruzada
Bio-Guide mostrou quase completa vascularização após 15 dias e praticamente total
degradação após 30 dias, enquanto as membranas com ligação cruzada Biomend e
Biomend Extend mostraram vascularização apenas após 30 dias e degradação
avançada apenas após 60 dias, com presença de infiltrado inflamatório. Nesse
mesmo trabalho, a membrana Ossix também com ligação cruzada ainda se
mantinha íntegra e com vascularização inicial após 60 dias.
Nossos resultados mostraram que, em cobertura de defeitos ósseos em ratos,
a invasão da membrana OsseoGuard™ por vasos sanguíneos e células
fibroblásticas inicia-se em torno dos 30 dias. Após 60 dias, a membrana mostrava-se
morfologicamente íntegra e com colonização por células em toda sua espessura,
sugerindo que a remodelação das fibras de colágeno da membrana deve ocorrer
lentamente a partir da reabsorção do colágeno bovino da membrana com
subseqüente formação de tecido conjuntivo fibroso celularizado. A colonização e
proliferação de fibroblastos têm sido reportadas como processo necessário a
integração da membrana com os tecidos adjacentes durante sua degradação
(SOMERMAN et al. 1991). Embora seu fabricante não informe se a membrana é
constituída por fibras de colágeno com ligação cruzada, nem o tipo de tratamento
utilizado em sua produção, nossos resultados in vivo mostraram que a
OsseoGurad™ foi eficiente em inibir a invasão de tecido conjuntivo fibroso,
sugerindo que ela deve apresentar estabilidade estrutural em tempo suficiente para
ocorrência de neoformação óssea em humanos.
Concluindo, nossos resultados mostram que Cerasorb® M DENTAL
apresenta biocompatibilidade, capacidade osteocondutora com formação óssea ao
redor e no interior dos poros de suas partículas e degradação provavelmente por
dissolução química. A membrana OsseoGuard™ é capaz de manter-se como
barreira mecânica íntegra por tempo suficiente para permitir adequada formação
óssea em defeitos cirúrgicos. Estudos adicionais são necessários para se avaliar a
cinética de degradação da membrana de colágeno OsseoGuard™ e do Cerasorb®
52
M DENTAL, por períodos de tempo maiores, bem como para determinar o
mecanismo de degradação das partículas de β-TCP.
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